ES2828707T3

ES2828707T3 - Método para producir un microorganismo recombinante

Info

Publication number: ES2828707T3
Application number: ES15743463T
Authority: ES
Inventors: David Jeffrey Fraser Walker; Michael Koepke
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2021-05-27
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: US20150211022A1; KR102320074B1; CA2936251C; CA2936251A1; PT3099779T; AU2015211015B2; EP3099779A1; KR20160111947A; WO2015116734A1; US9315830B2; AU2015211015A1; EP3099779B1; CN105940099A; EP3099779A4; SG11201605775UA; HUE051262T2

Abstract

Un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende: (a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende un ácido nucleico diana T1, un ácido nucleico diana T2 y un ácido nucleico diana T3, en el orden 5'-T3-T1-T2-3'; (b) proporcionar una construcción de ADN que comprende un brazo de homología izquierdo LHA1 homólogo a T1, un brazo de homología derecho RHA1 homólogo a T2, un brazo de homología derecho RHA2 homólogo a T3 y un ácido nucleico de inserción IS1, en el orden 5'-LHA1-RHA2-IS1-RHA1-3', que comprende además un marcador de contraselección CS1 cadena arriba de LHA1 y (i) un marcador de selección positiva PS1 y un marcador de contraselección CS2 entre LHA1 y RHA2; o (ii) un marcador de selección positiva PS1 entre LHA1 y RHA2; (c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3'; y (d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T3-IS1-T2-3', de manera que T1 se reemplaza por IS1 en el elemento genético.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir un microorganismo recombinante

Antecedentes de la invención

Existen herramientas genéticas sofisticadas y variadas para manipular los genomas de microorganismos modelo establecidos, tal como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, para muchos otros microorganismos de interés biotecnológico, sólo se dispone de herramientas genéticas extremadamente básicas, lo que dificulta la evaluación y optimización dichos microorganismos para aplicaciones médicas, químicas o industriales.

Por ejemplo, faltan herramientas genéticas para el género Clostridium, que incluye bacterias Gram-positivas, formadoras de esporas, anaerobias. Especies tales como Clostridium difficile, Clostridium botulinum, y Clostridium perfringens son patógenas y/o tienen importantes aplicaciones médicas. Adicionalmente, especies tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium celluloyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium butyricum, y Clostridium autoethanogenum fermentan azúcares, biomasa y gases para producir diversos biocombustibles y productos bioquímicos.

Las herramientas genéticas existentes para Clostridium, tales como ClosTron (Heap, J Microbiol Meth, 70:452-464, 2007), intercambio de alelos acoplados (ACE, por sus siglas en inglés) (Heap, Nucleic Acids Res, 40: e59, 2012) y marcadores de contraselección (Ng, PLoS ONE, 8: e56051, 2013; Al-Hinai, Appl Environ Microbiol, 78: 8112-8121, 2012; Cartman, Appl Environ Microbiol, 78: 4683-4690, 2012; documento WO 2010/084349), permiten solamente una manipulación genética rudimentaria en comparación con las herramientas genéticas para microorganismos modelo como Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. Además, las herramientas genéticas que existen con frecuencia requieren múltiples etapas para lograr la modificación deseada, engorrosos procesos de exploración de mutantes y etapas de transformación volubles. Por consiguiente, existe una gran necesidad de herramientas y métodos genéticos fuertes para manipular los genomas de microorganismos no modelo, tales como bacterias Clostridium.

Sumario de la invención

La invención proporciona herramientas genéticas para insertar, reemplazar, eliminar, o manipular de otro modo, una secuencia de un ácido nucleico en un microorganismo para producir un microorganismo recombinante. En particular, la invención proporciona un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende un ácido nucleico diana T1, un ácido nucleico diana T2 y un ácido nucleico diana T3, en el orden 5'-T3-T1-T2-3';

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende un brazo de homología izquierdo LHA1 homólogo a T1, un brazo de homología derecho RHA1 homólogo a T2, un brazo de homología derecho RHA2 homólogo a T3 y un ácido nucleico de inserción IS1, en el orden 5'-LHA1-RHA2-IS1-RHA1-3', que comprende además un marcador de contraselección CS1 cadena arriba de LHA1 y

(i) un marcador de selección positiva PS1 y un marcador de contraselección CS2 entre LHA1 y RHA2; o (ii) un marcador de selección positiva PS1 entre LHA1 y RHA2;

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3'; y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T3-IS1-T2-3', de manera que T1 se reemplaza por IS1 en el elemento genético.

Cuando la construcción de ADN de (b) comprende además un marcador de contraselección CS1 cadena arriba de LHA1 y un marcador de selección positiva PS1 y un marcador de contraselección CS2 entre LHA1 y RHA2, en una realización adicional, (c) va seguido de una etapa de selección para la expresión de PS1 y contra la expresión de CS1 y (d) va seguido de una etapa de selección contra la expresión de CS2. CS1 y CS2 pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en pheS*, upp, sacB, tetAR, thyA, ccdB, lacY, rpsL, codA, pyrE, HSTK (thiK), gatA-1, y mazF; y PS1 puede seleccionarse del grupo que consiste en catP, tetA(C), tetM, aad9, aadA, aadA2, y ermB.

Cuando la construcción de ADN de (b) comprende además un marcador de contraselección CS1 cadena arriba de LHA1 y un marcador de selección positiva PS1 entre LHA1 y RHA2, en una realización adicional, (c) va seguido de una etapa de selección para la expresión de PS1 y contra la expresión de CS1. CS1 puede seleccionarse del grupo que consta de pheS*, upp, sacB, tetAR, thyA, ccdB, lacY, rpsL, codA, pyrE, HSTK (thiK), gatA-1, y mazF; y PS1 puede seleccionarse del grupo que consiste en catP, tetA(C), tetM, aad9, aadA, aadA2, y ermB.

En una realización, LHA1 es más largo que RHA2. En particular, LHA1 puede ser igual o mayor que aproximadamente 1000 pares de bases de longitud y RHA2 puede ser igual o menor que aproximadamente 300 pares de bases de longitud.

En una realización, LHA1 y RHA1 son cada uno más largo que RHA2. En particular, LHA1 y RHA1 pueden ser cada uno igual o mayor que aproximadamente 1000 pares de bases de longitud y RHA2 puede ser igual o inferior a aproximadamente 300 pares de bases de longitud.

En una realización, el microorganismo es una bacteria, arquea, virus u hongo. Por ejemplo, el microorganismo puede pertenecer al género Clostridium, Acetobacterium, Moorella, Butyribacterium, Blautia, Oxobacter, Thermoanaerobacter, Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Citrobacter, Enterobacter, Salmonella, Serratia, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus, Saccharomyces, Pichia, Candida Hansenula, Yarrowia, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lipomyces, Aspergillus, trichoderma, Exophila, Mucor, Cladosporium, Phanerochaete, Cladiophilalophora, Paecilomyces, Scedosporium, Ophistoma, Bacillus, Oligotropha, Pseudomonas, Carbophilus, Hydrogenophaga, Mycobacterium, Zavarzinia, Cupravidus, Senechocystis, Chloroflexus, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylosphera, Methylocaldum, Methylocystis, Methylosinus, Methanobacterium, Methanococcus, Methanogenium, Methanosarcina, Methanoshera, Methanothermobacter, Methanotrix, Corynebacterium, Acinetobacter, Actinomyces, Bacteriodes, Burkholderia, Brevibacterium, Pyrococcus, Geobacter, Geobacillus, Paenibacillus, Mycobacterium, Rhodopseudomonas, Thermatoga, Thermoanaerobacter, Streptomyces, Rhodobacter, Rhodococcus, Peptococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Fusobacterium, Campylobacter, Veillonella, Aquincola, Arthrobacter, Moraxella, o Psychrobacter.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama que muestra una porción de ADN en un elemento genético eliminado usando una construcción de ADN.

La Fig. 2 es un diagrama que muestra una realización en la que una porción de ADN en un elemento genético se elimina y se reemplaza por una secuencia de inserción que usando una construcción de ADN.

La Fig. 3 es un diagrama que muestra una porción de ADN en un elemento genético eliminado usando una construcción de ADN.

La Fig. 4 es un diagrama que muestra una porción de ADN insertada en un elemento genético usando una construcción de ADN.

La Fig. 5 es un diagrama que muestra una porción de ADN en un elemento genético eliminado usando una construcción de ADN.

La Fig. 6A es un diagrama que muestra la primera ronda de la estrategia de ciclo de inserción de múltiples secuencias en la que se insertan múltiples porciones de ADN en un elemento genético usando una construcción de ADN. La Fig. 6B es un diagrama que muestra la segunda ronda de la estrategia de ciclos de inserción de múltiples secuencias. La Fig. 6C es un diagrama que muestra la tercera ronda de la estrategia de ciclos de inserción de múltiples secuencias. La Fig. 6D es un diagrama que muestra la ronda final de la estrategia de ciclos de inserción de múltiples secuencias. En este caso, la ronda final comprende la inserción de una secuencia final y la eliminación del marcador y la primera secuencia del ácido nucleico diana.

La Fig. 7 es un diagrama que muestra una construcción de ADN y un gen represor integrados en un elemento genético y donde la expresión del gen represor está controlada por la selección prolongada de PS1.

La Fig. 8 es un diagrama que muestra la construcción de ADN que carece de un segundo marcador de contraselección.

La Fig. 9 es un diagrama que muestra la construcción de ADN que comprende un plásmido no replicante y que carece del primer marcador de contraselección.

La Fig. 10 es un diagrama que muestra la construcción de ADN que comprende ADN lineal transformante y que carece del primer marcador de contraselección.

La Fig. 11 es un diagrama que muestra la construcción de ADN que comprende brazos de homología más cortos apropiados para su uso en el sistema de recombinación lambda-red.

La Fig. 12 es un diagrama que muestra las características del plásmido TXp3.

La Fig. 13 es un diagrama que muestra la organización del genoma para su uso con una construcción de ADN tal como un plásmido TXp3.

La Fig. 14 es un diagrama que muestra un genotipo de recombinación de doble entrecruzamiento.

La Fig. 15 es un diagrama que muestra un genotipo de recombinación de triple entrecruzamiento.

La Fig. 16 es un conjunto de diagramas que muestran una arquitectura de plásmido de ejemplo para el reemplazo alélico (A) y la inserción de ADN (B).

La Fig. 17 es una imagen de gel que muestra los resultados de la exploración de recombinantes de doble entrecruzamiento usando el plásmido TXp3.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona herramientas genéticas para insertar, reemplazar, eliminar, o manipular de otro modo, una secuencia de un ácido nucleico en un microorganismo para producir un microorganismo recombinante. De manera destacable, la invención hace uso de recombinación homóloga, un tipo de recombinación genética en la que las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas de ADN similares o idénticas. Sin embargo, a diferencia de los enfoques clásicos, que implican un marcador de selección positivo y uno negativo con 2 brazos de homología, la invención utiliza generalmente un marcador de selección positivo y dos negativos con tres brazos de homología. Al igual que con los enfoques clásicos, la invención requiere solo dos etapas de selección, pero en lugar de explorar un primer entrecruzamiento en la primera etapa y un segundo entrecruzamiento con reciclaje de marcadores en la segunda etapa, la invención fuerza un entrecruzamiento doble directamente en la primera etapa usando una combinación de un marcador de selección positiva en un ácido nucleico insertado y un marcador de selección negativa en la estructura de la construcción. En la segunda etapa, los marcadores de selección pueden reciclarse a través del tercer brazo de homología y el segundo marcador contraseleccionable en un tercer evento de entrecruzamiento. Debido a que la invención implica tres eventos de recombinación homóloga, puede denominarse método de "triple cruzamiento".

La invención proporciona una serie de ventajas sobre los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la invención permite la modificación de un genoma en cualquier sitio. Por el contrario, los métodos tales como ACE se limitan a la modificación de un genoma en sitios predeterminados específicos (por ejemplo, en un locus pyrE/pyrF o en un sitio en un genoma previamente modificado). La invención también permite la integración, eliminación y/o mutación (p. ej., marco de lectura, SNP) utilizando un único sistema, mientras que los métodos existentes requieren la combinación de múltiples sistemas para lograr resultados similares, tales como ClosTron/recombinación homóloga o FRT/Cre-Lox. La invención permite la modificación "sin cicatrices" de un genoma, sin dejar artefactos tales como pares de bases residuales o marcadores de selección. Además, la invención no requiere preparación o "cebado" del genoma del microorganismo, de manera que se pueda realizar directamente en un genoma de tipo silvestre, a diferencia de los métodos tales como los descritos en Argyos, Appl Environ Microbiol, 77: 8288-8294, 2011. Adicionalmente, la invención da como resultado integraciones no deseadas nulas o mínimas en sitios no diana, que puede ser un problema con los métodos existentes, tales como ClosTron. Por último, la invención alcanza una eficacia de casi el 100 % en la mayoría de las condiciones. En otras palabras, casi todos los microorganismos preparados y seleccionados según la invención presentan la recombinación deseada, en comparación con una eficacia tan baja como el 10 % para los métodos existentes.

En general, la divulgación proporciona un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende: (a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende un ácido nucleico diana T1, un ácido nucleico diana T2 y un ácido nucleico diana T3,

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende un brazo de homología izquierdo LHA1 homólogo a T1, un brazo de homología derecho RHA1 homólogo a T2, y un brazo de homología derecho RHA2 homólogo a T3, en donde RHA2 está ubicado entre LHA1 y RHA1,

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2, y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2.

Se pueden utilizar variaciones de este método para insertar, reemplazar, eliminar o manipular de otro modo una secuencia de un ácido nucleico en un microorganismo para producir un microorganismo recombinante.

La divulgación puede usarse para eliminar un ácido nucleico (por ejemplo, T1) de un microorganismo. Se divulga un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-T1-T2-3',

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende 5-LHA1-RHA2-RHA1-3',

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y t 2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-T1-RHA2-T2-3', y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-T2-3', de manera que T1 se elimina del elemento genético.

Esto se muestra en la Figura 1. Cualquier par de bases ubicado entre RHA2 y RHA1 se insertará en el elemento genético. Cuando RHA1 y RHA2 son inmediatamente adyacentes entre sí en la construcción de ADN, T1 puede eliminarse sin dejar pares de bases residuales en la secuencia de ADN resultante. Este proceso se denomina eliminación "sin cicatrices". La construcción de ADN puede contener opcionalmente uno o más marcadores de selección, tales como CS1, PS1 y CS2. La selección contra CS1 y para PS1 después de la etapa (c) selecciona microorganismos con integración de la porción deseada de la construcción de ADN en el elemento genético. La selección contra CS2 después de la etapa (d) selecciona los microorganismos que han experimentado la recombinación auto homóloga deseada. La porción de la construcción de ADN ubicada entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1 se pueden denominar secuencia de casete de ácido nucleico (NS1). En la Fig. 1, NS1 comprende 5'-PS1-CS2-RHA2-3'.

La invención puede usarse para reemplazar un ácido nucleico en un microorganismo (por ejemplo, T1) con un ácido nucleico diferente (por ejemplo, IS1). En una realización, la invención proporciona un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende 5'-LHA1-RHA2-IS1-RHA1-3' en la que IS1 es un ácido nucleico de inserción,

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3', y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-IS1-T2-3', de manera que T1 se reemplaza por IS1 en el elemento genético.

Esta realización se muestra en la Fig. 2. Cualquier par de bases ubicado entre RHA2 y RHA1 se insertará en el elemento genético. Cuando IS1 está ubicado inmediatamente adyacente a RHA2 en la construcción de ADN, esta realización puede usarse para eliminar T1 e insertar de forma simultánea IS1 (es decir, reemplazar T1 con IS1) sin dejar ningún par de bases residual en la secuencia de ADN resultante (sin cicatrices). La construcción de ADN puede contener opcionalmente uno o más marcadores de selección, tales como CS1, PS1 y CS2. La selección contra CS1 y para PS1 después de la etapa (c) selecciona microorganismos con integración de la porción deseada de la construcción de ADN en el elemento genético. La selección contra CS2 después de la etapa (d) selecciona los microorganismos que han experimentado la recombinación auto homóloga deseada. La porción de la construcción de ADN ubicada entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1 se pueden denominar secuencia de casete de ácido nucleico (NS1). En la Fig. 2, NS1 comprende 5'-PS1-CS2-RHA2-IS1-3'.

En una variación de esta realización, el microorganismo intermedio que comprende tanto T1 como IS1 puede conservarse mediante la selección constante de PS1. Este método permite observar el efecto de T1 e IS1 sobre el fenotipo del microorganismo. La selección constante de PS1 significa que cualquier microorganismo que experimente el tercer evento de recombinación autohomóloga no podrá sobrevivir. T1 puede ser un gen cuya expresión conduce a la producción de una forma de un producto e IS1 comprende un gen cuya expresión conduce a la producción de una forma diferente del producto. Por ejemplo, las diferentes formas del producto pueden ser diferentes estereoisómeros, tener diferentes grupos funcionales, o tener diferentes especificidades de cofactor o sustrato. Cuando el microorganismo comprende un elemento genético que comprende ambos genes, se pueden observar los efectos de tener ambos productos en la mezcla de reacción. T1 puede codificar un gen que codifica el estereoisómero R de 2,3-butanodiol e IS1 codifica un gen que codifica un estereoisómero de meso-2,3-butanodiol. La expresión "meso-2,3-butanodiol" se refiere tanto a los estereoisómeros (S,R) como (R,S) del 2,3-butanodiol. Cuando el elemento genético comprende ambos genes, se pueden observar los efectos de tener ambos estereoisómeros en la mezcla de reacción. La eliminación de la selección constante de PS1 permitirá que el microorganismo experimente el tercer evento de recombinación autohomóloga.

En otra variación de esta realización, un cultivo de microorganismos que expresan T1 puede pasar a carecer de expresión de T1. Inicialmente, T1 se puede conservar mediante la selección de PS1 y después, más adelante, T1 puede eliminarse mediante recombinación autohomóloga cesando la selección de PS1. Un cultivo de microorganismos pasará de una población en la que todos los microorganismos expresan T1, a una población en la que algunos microorganismos expresan T1, a una población en la que ningún microorganismo expresa T1. Esto sucederá en un biorreactor con el tiempo si la eliminación de T1 no es significativamente perjudicial para el crecimiento de los microorganismos, incluso en ausencia de una segunda etapa de contraselección. Si la eliminación de T1 es perjudicial para el crecimiento de los microorganismos, entonces, los microorganismos que conserven T1 superarán el genotipo cambiado y pueden seguir siendo la cepa dominante en el reactor. Al considerar el tamaño de los brazos de homología, RHA2 debe ser lo suficientemente grande para permitir la recombinación con T3 a una frecuencia lo suficientemente alta como para permitir el paso de un genotipo a otro con el tiempo. Además, sin embargo, RHA2 debe ser lo suficientemente pequeño como para que la recombinación no se produzca con la frecuencia suficiente para destruir una gran proporción de células al seleccionar PS1. En general, un tamaño de RHA1/IHA1 de aproximadamente 1.000 pb junto con un tamaño de RHA2 de aproximadamente 300 pb proporciona un buen equilibrio de eficacia y crecimiento celular. La selección de PS1 puede interrumpirse en cualquier momento que se desee. Por ejemplo, la selección de PS1 puede cesar cuando un cultivo alcanza una densidad celular particular o una fase particular de crecimiento (por ejemplo, cuando el cultivo se aparta del crecimiento en fase estacionaria y entra en crecimiento en fase exponencial). Como tal, un gen puede eliminarse cuando ya no confiere una ventaja de crecimiento, optimización del uso de recursos.

La invención también puede usarse para suprimir una ruta usando un sistema promotor inducible. En este caso, la construcción de ADN puede comprender un represor que se inserta en el elemento genético del microorganismo como parte de NS1. La selección de PS1 seleccionaría microorganismos que comprenden NS1 (que comprenden el represor). El cese de selección de PS1 permitiría que se produjera el tercer evento de recombinación autohomóloga, eliminando no solo PS1, y opcionalmente CS2, sino también el gen represor. Esto se muestra en la Fig. 7, donde NS1 comprende LHA1, PS1, represor tetR, RHA2, un promotor inducible suprimido por tetR que transcribe IS1 (un gen de interés) y RHA1.

La invención puede usarse para eliminar un ácido nucleico (por ejemplo, T4) de un microorganismo. Se divulga un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-T4-T2-3' en donde T1 abarca T3 y T4 es un ácido nucleico diana,

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende 5'-LHA1rha²-RHA2-RHA1-3' en donde LHA1 abarca RHA2,

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 (T1t³) se alinea con LHA1 (LHA1rha²) y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 (LHA1 RHA2) y Rl l \^1, incluyendo Rl l^\2, en el elê nento genético entre T1 (T 1t³) y T2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-RHA2-T2-3' y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-T2-3', de manera que T4 se elimina del elemento genético.

Esto se muestra en la Figura 3. El subíndice de LHA1 (LHA1rha²) indica que la secuencia de LHA1 abarca la secuencia de RHA2, de manera que una porción de LHA1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a T3. El subíndice de T1 (T1 T3) indica que la secuencia de T1 abarca la secuencia de T3, de manera que una porción de T1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a RHA2. La presencia de estas secuencias anidadas permite variaciones adicionales del método. En particular, esto permite la eliminación de T4 cuando está flanqueado por T1 y T2 sin eliminar T1 o T2. Cualquier par de bases ubicado entre RHA2 y RHA1 se insertará en el elemento genético. Cuando RHA2 está inmediatamente adyacente a RHA1 en la construcción de ADN, este se puede usar para eliminar T4 sin dejar ningún par de bases residuales en la secuencia de ADN resultante (sin cicatrices). La construcción de ADN puede contener opcionalmente uno o más marcadores de selección, tales como CS1, PS1 y CS2. La selección contra CS1 y para PS1 después de la etapa (c) selecciona microorganismos con integración de la porción deseada de la construcción de ADN en el elemento genético. La selección contra CS2 después de la etapa (d) selecciona los microorganismos que han experimentado la recombinación auto homóloga deseada. La porción de la construcción de ADN ubicada entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1 se pueden denominar secuencia de casete de ácido nucleico (NS1). En la Fig. 3, NS1 comprende 5'-PS1-CS2-RHA2-3'.

La invención puede usarse para insertar un ácido nucleico (por ejemplo, IS1) en un microorganismo. Se divulga un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(a) proporcionar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-T2-3' en donde T1 abarca T3,

(b) proporcionar una construcción de ADN que comprende 5'-LHA1rha²-RHA2-IS1-RHA1-3' en donde LHA1 abarca a RHA2 e IS1 es un ácido nucleico de inserción,

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 (T1t³) se alinea con LHA1 (LHA1rha²) y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 (LHA1 RHA2) y Rl IA1, incluyendo Rl l^\2, en el elê nento genético entre T1 (T 1t³) y T2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-RHA2-IS1-T2-3' y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-IS1-T2-3', de manera que IS1 se inserta en el elemento genético.

Esto se muestra en la Figura 4. El subíndice de LHA1 (LHA1 rha2) indica que la secuencia de LHA1 abarca la secuencia de RHA2, de manera que una porción de LHA1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a T3. El subíndice de T1 (T1 T3) indica que la secuencia de T1 abarca la secuencia de T3, de manera que una porción de T1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a RHA2. La presencia de estas secuencias anidadas permite variaciones adicionales del método. En particular, esto permite la inserción de IS1 sin eliminar T1. Cualquier par de bases ubicado entre RHA2 y RHA1 se insertará en el elemento genético. Cuando IS1 está ubicado inmediatamente adyacente a RHA2 en la construcción de ADN, IS1 puede insertarse sin dejar ningún par de bases residuales en la secuencia de ADN resultante (sin cicatrices). La construcción de ADN puede contener opcionalmente uno o más marcadores de selección, tales como CS1, PS1 y CS2. La selección contra CS1 y para PS1 después de la etapa (c) selecciona microorganismos con integración de la porción deseada de la construcción de ADN en el elemento genético. La selección contra CS2 después de la etapa (d) selecciona los microorganismos que han experimentado la recombinación auto homóloga deseada. La porción de la construcción de ADN ubicada entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1 se pueden denominar secuencia de casete de ácido nucleico (NS1). En la Fig. 4, NS1 comprende 5'-PS1-CS2-RHA2-IS1-3'.

La invención puede usarse para reemplazar un ácido nucleico en un microorganismo (por ejemplo, T4) con un ácido nucleico diferente (por ejemplo, IS1). Se divulga un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 (T1t³) se alinea con LHA1 (LHA1rha²) y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 (LHA1 RHA2) y Rl IA1, incluyendo Rl l^\2, en el elê nento genético entre T1 (T 1ts) y T2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-RHA2-IS1-T2-3' y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2 para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5'-T1t³-IS1-T2-3', de manera que T4 se reemplaza por IS1 en el elemento genético.

Esto se muestra en la Figura 5. El subíndice de LHA1 (LHA1rha²) indica que la secuencia de LHA1 abarca la secuencia de RHA2, de manera que una porción de LHA1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a T3. El subíndice de T1 (T1 T3) indica que la secuencia de T1 abarca la secuencia de T3, de manera que una porción de T1 (por ejemplo, la porción 3') es homóloga a RHA2. La presencia de estas secuencias anidadas permite variaciones adicionales del método. En particular, esto permite la eliminación de T4 y la inserción simultánea de IS1 (es decir, el reemplazo de T4 con IS1) en el elemento genético. Cualquier par de bases ubicado entre RHA2 y RHA1 se insertará en el elemento genético. Cuando IS1 está ubicado inmediatamente adyacente a RHA2 en la construcción de ADN, IS1 puede insertarse sin dejar ningún par de bases residuales en la secuencia de ADN resultante (sin cicatrices). La construcción de ADN puede contener opcionalmente uno o más marcadores de selección, tales como CS1, PS1 y CS2. La selección contra CS1 y para PS1 después de la etapa (c) selecciona microorganismos con integración de la porción deseada de la construcción de ADN en el elemento genético. La selección contra CS2 después de la etapa (d) selecciona los microorganismos que han experimentado la recombinación auto homóloga deseada. La porción de la construcción de ADN ubicada entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1 se pueden denominar secuencia de casete de ácido nucleico (NS1). En la Fig. 5, NS1 comprende 5'-PS1-CS2-RHA2-IS1-3'.

Se ha encontrado que esto tiene una utilidad particular cuando la secuencia a eliminar (T4) tiene una alta homología con la secuencia a insertar (IS1). Si IS1 y T1 tienen una alta homología (p. ej., si IS1 y T1 son genes que codifican estereoisómeros), puede estar presente una mezcla de elementos recombinantes, algunos con la secuencia correcta incorporada (IS1) y otros con un entrecruzamiento no deseado entre IS1 y T1. Adicionalmente, donde la secuencia de alta homología es más larga que LHA1 o RHA1, la probabilidad del entrecruzamiento no deseado será mayor debido a la mayor eficacia que se obtiene al usar una secuencia homóloga más larga.

Después del primer y segundo eventos de recombinación homóloga (es decir, después de la etapa (c)), se logra una producción de alta eficacia de los heterodúplex deseables, donde RHA1 se ha cruzado con T2 y LHA1 se ha cruzado con T1. Cuando IS1 y LHA1 tienen la misma longitud, en teoría, se logra una relación de entrecruzamiento entre IS1 y RHA1 de 1:1. Mediante la exploración por PCR para el tamaño de integración correcto, el entrecruzamiento en LHA1 y RHA1) se puede identificar y utilizar para el triple entrecruzamiento posterior (reemplazo alélico). La PCR puede ser útil para analizar cualquier realización, pero es de particular utilidad cuando los genes comparten una alta homología.

Los métodos de la invención se pueden realizar de forma iterativa. Por ejemplo, la invención se puede utilizar para insertar secuencialmente más de una secuencia de ácido nucleico de inserción (IS1, IS2, IS3, IS4, etc.) en el elemento genético de un microorganismo. Esta estrategia permite el reciclaje rápido de marcadores de selección, haciendo posible volver a utilizar marcadores de selección anteriores en el siguiente ciclo. Esto proporciona ventajas considerables sobre la técnica anterior al reducir drásticamente los tiempos de selección y permitir eventos de integración secuencial rápidos. Por ejemplo, utilizando métodos de la técnica anterior, insertar tres genes en un genoma podría llevar hasta dos semanas para cada gen y los ciclos se limitarían al número de marcadores de selección positiva disponibles. Si solo hubiera tres marcadores disponibles, sólo se podrían realizar tres ciclos de integración. El método de la invención, por el contrario, requiere sólo unos seis días por integración génica y permite que los ciclos se repitan indefinidamente mediante la reutilización de marcadores.

Esto se muestra en las Fig. 6a-6d.

La Fig. 6a muestra la primera ronda de inserciones donde IS2 y un PS2 se integran en el elemento genético por recombinación homóloga seguida de selección de PS2 y contra CS1. Las designaciones PS2 e IS2 se utilizan para distinguir los componentes utilizados en esta divulgación de los componentes utilizados en otras divulgaciones.

La Fig. 6b muestra la segunda ronda de inserciones en la que la construcción de ADN comprende RH1 que es homólogo a la secuencia IS2 insertada anteriormente. La construcción de ADN también comprende PS3 e IS3. Se produce un evento de recombinación homóloga de doble entrecruzamiento donde LHA1 se recombina con T1 y RHA1 se recombina con IS2, dando como resultado un microorganismo recombinante que comprende las dos secuencias insertadas, así como PS3. La selección de PS3 y contra CS1 dará como resultado un cultivo sustancialmente puro de microorganismos con las secuencias de inserción deseadas. Aunque en este caso se utiliza la designación CS1, se apreciará que se puede utilizar un marcador de contraselección diferente en comparación con el marcador de contraselección utilizado en rondas anteriores de este método.

La Fig. 6c muestra el producto de la tercera ronda de inserciones, donde IS4 y PS4 estaban presentes en la construcción de ADN (no se muestra).

La Fig. 6d muestra la ronda final de inserciones, donde RHA2 se inserta junto con PS1 y CS2. RHA2 es homólogo a una tercera secuencia T3 diana en el elemento genético. También se muestra una secuencia de inserción IS1 adicional. Para esta ronda, RHA1 está diseñado para ser homólogo a la última secuencia de inserción a integrar (IS4). Un evento de recombinación homóloga da como resultado la integración de PS1, RHA2, IS1 y (opcionalmente) CS2 al elemento genético. Esta secuencia se somete a una recombinación autohomóloga (es decir, RHA2 se recombina con T3) para producir un microorganismo con la secuencia T1 eliminada y múltiples secuencias (IS1-4) insertadas. La selección opcional contra CS2 permite el aislamiento de microorganismos con las integraciones deseables. Aunque las Fig. 6a-6d muestran la eliminación de T1 y el reemplazo con IS1-IS4, se apreciará que cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se puede realizar de manera iterativa para lograr una eliminación, inserción, reemplazo u otra manipulación del elemento genético deseados.

Se divulga una bacteria recombinante producida usando los métodos de la invención.

Se divulga un kit para realizar los métodos de la invención. El kit puede comprender, por ejemplo, una construcción de ADN y/o uno o más compuestos para seleccionar microorganismos que expresan marcadores de selección positiva o de contraselección.

Aunque existen desacuerdos en la bibliografía sobre el proceso exacto de iniciación de la recombinación homóloga, en general, se acepta que al menos una de las hebras tanto del elemento genético como de la construcción de ADN debe estar "mellada" y la estructura de doble hebra debe deshacerse hasta cierto punto. Esto da como resultado que los brazos de homología (LHA1 y RHA1) y las regiones diana (T1 y T2) se conviertan en monocatenarios y se "expongan". La homología entre la cadena 3' en el elemento genético y la cadena 5' complementaria en la construcción de ADN, o viceversa, da como resultado un apareamiento de bases complementarias entre LHA1:T 1 y RHA1:T2. Este proceso a veces se conoce como "entrecruzamiento" y da como resultado un intermedio de cadena cruzada conocido como unión de Holliday compuesto por las dos moléculas de ácido nucleico de doble cadena. La unión de Holliday intermedia se puede resolver cortando y volviendo a unir las hebras cruzadas para producir heterodúplex recombinantes y no recombinantes.

El primer evento de recombinación homóloga (recombinación de LHA1 con T1) y el segundo evento de recombinación homóloga (recombinación de RHA1 con T2) están seguidos por un tercer evento de recombinación (auto) homóloga dentro del elemento genético resultante. En particular, el tercer evento de recombinación homóloga implica la recombinación de RHA2 con T3 para dar como resultado un heterodúplex recombinante adicional.

Cuando el método de la invención se realiza utilizando un cultivo de microorganismos, los microorganismos recombinantes que contienen un heterodúplex que ha experimentado un tercer evento de recombinación homóloga eventualmente predominarán en la población debido a la inestabilidad natural causada por regiones de homología en el elemento genético y la tendencia asociada a que se produzca la recombinación homóloga. Debido a que el heterodúplex resultante carece de regiones de homología, el tercer/último evento de recombinación homóloga es irreversible.

La expresión "elemento genético" se refiere a un ácido nucleico de un microorganismo. Generalmente, el elemento genético comprende ADN bicatenario. El elemento genético está ubicado generalmente en un cromosoma, plásmido, megaplásmido u otro ADN extracromosómico dentro del microorganismo. El elemento genético puede comprender, por ejemplo, un gen, una porción de un gen, una región promotora, una región intergénica, una región no codificante, una región reguladora, múltiples genes, o cualquier combinación de los mismos. Como se describe en el presente documento, el elemento genético puede comprender uno o más ácidos nucleicos definidos como "T" (por ejemplo, T1, T2, T3, T4).

La expresión "ácido nucleico diana" se refiere a una secuencia de ácido nucleico ubicada dentro del elemento genético. El ácido nucleico diana puede comprender, por ejemplo, un gen, una porción de un gen, una región promotora, una región intergénica, una región no codificante, una región reguladora, múltiples genes, o cualquier combinación de los mismos. Como se describe en el presente documento, los ácidos nucleicos diana pueden incluir uno o más de T1, T2, T3, T4, etc. Específicamente, T1 es un ácido nucleico diana en el elemento genético homólogo a LHA1, T2 es un ácido nucleico diana en el elemento genético homólogo a RHA1, y T3 es un ácido nucleico diana en el elemento genético homólogo a RHA2.

La expresión "construcción de ADN" se refiere a un ácido nucleico diseñado para experimentar una recombinación homóloga con el elemento genético. Generalmente, la construcción de ADN es ADN bicatenario. La construcción de ADN puede ser un plásmido o un vector. La construcción de ADN puede contener regiones de ácido nucleico y/o marcadores de selección. Como se describe en el presente documento, el elemento genético puede comprender uno o más ácidos nucleicos definidos como LHA (por ejemplo, LHA1), RHA (p. ej., RHA1, RHA2) e IS (p. ej., iS1, IS2, IS3, IS4). Específicamente, LHA1 es un brazo de homología izquierdo en la construcción de ADN homólogo a T1, RHA1 es un brazo de homología derecho en la construcción de ADN homólogo a T2, y RHA2 es un brazo de homología derecho en la construcción de ADN homólogo a T3. La construcción de ADN puede comprender uno o más marcadores de selección definidos como CS (p. ej., CS1, CS2) y PS (por ejemplo, PS1). Adicionalmente, la construcción de ADN puede comprender uno o más elementos reguladores, orígenes de replicación o sitios de clonación múltiple. La construcción de ADN puede ser un ácido nucleico desnudo, un ácido nucleico metilado o no metilado, o un ácido nucleico formulado con uno o más agentes para facilitar el suministro al microorganismo. Adicionalmente, la construcción de ADN puede replicarse o no replicarse.

La "estructura" de la construcción de ADN se refiere a una porción de la construcción de ADN diseñada para excluirse de eventos de integración o recombinación homólogas. En una realización, la construcción de la estructura comprende un marcador de contraselección para permitir la selección frente a los microorganismos en los que se integró la estructura. La estructura puede contener un replicón Gram-negativo para permitir la replicación del plásmido en bacterias Gram-negativas. Adicionalmente o como alternativa, la estructura puede contener un replicón Gram-positivo para permitir la replicación del plásmido en bacterias Gram-positivas. La estructura puede contener replicones tanto Gram positivos como Gram negativos para permitir la replicación del plásmido en bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas.

La construcción de ADN puede describirse como que comprende una "secuencia de casete de ácido nucleico", que se refiere a la porción de la construcción de ADN entre, aunque sin incluir, LHA1 y RHA1. Por ejemplo, la secuencia de casete de ácido nucleico puede comprender 5'-RHA2-3' o 5'-RHA2-IS1-3' o 5'-Ps 1-RHA2-3' o 5'-PS1-CS2-RHA2-3' o similares. Generalmente, RHA1 está ubicado inmediatamente adyacente al extremo 3' de la secuencia de casete de ácido nucleico y LHA1 está ubicado inmediatamente adyacente al extremo 5' de la secuencia de casete de ácido nucleico.

La expresión "brazo de homología" se refiere a una porción de la construcción de ADN que permite la recombinación homóloga entre la construcción de ADN y el elemento genético. Generalmente, los brazos de homología están ubicados en un plásmido artificial que experimenta una recombinación homóloga con un cromosoma bacteriano del hospedador. Los brazos de homología tienen preferentemente un 100 % de complementariedad con las regiones diana en el elemento genético. Sin embargo, los brazos de homología pueden tener menos del 100 % de complementariedad con las regiones diana en el elemento genético, siempre que tengan suficiente complementariedad para permitir la recombinación homóloga. Pueden diseñarse brazos de homología apropiados basándose en la información de secuencia disponible públicamente para un microorganismo diana dado.

El tamaño de los brazos de homología puede afectar a la eficacia de los métodos de la invención.

En una realización, RHA2 comprende menos pares de bases que LHA1 y RHA1, lo que aumenta la probabilidad de que se produzcan las recombinaciones LHA1/T1 y RHA1/T2 deseadas. Aunque un RHA2 más pequeño reduce la probabilidad de que se produzca la recombinación RHA2/T3 deseada, las etapas de selección positiva y de contraselección garantizan que un número suficiente de microorganismos se sometan a todas las etapas de recombinación deseadas. Debido a que la recombinación final es estable e irreversible, una población de microorganismos se moverá de manera natural hacia este equilibrio. La integración de CS2 en el elemento genético permite la selección frente a células que no han experimentado la recombinación RHA2/T3. Si todos los brazos de homología tienen la misma longitud, la recombinación RHA2/T3 se producirá con aproximadamente la misma frecuencia que la recombinación LHA1/T1 y RHA1/T2, de manera que un gran porcentaje de los microorganismos (~ 50 %) no integrarán PS1 o CS2 debido a la recombinación RHA2/T3 en lugar de la recombinación LHA1/T1 y RHA1/T2. Estos microorganismos después se destruirán mediante las etapas de selección posteriores.

Puede haber una relación de pares de bases aumentada entre RHA2 y RHA1 o LHA1 (expresada en el presente documento como RHA2:RHA1 o RHA2:LHA1) en comparación con la relación LHA1:RHA1 y esta relación más alta, hasta cierto punto, dará como resultado que se favorezca el entrecruzamiento LHA1/RHA1. Por ejemplo, RHA2 puede comprender aproximadamente un tercio del número de pares de bases de LHA1 o RHA1, es decir, la relación de pares de bases para RHA2:RHA1 o RHA2:LHA1 es aproximadamente 1:3.

Al menos uno de LHA1 y RHA1 puede comprender una secuencia de un ácido nucleico de aproximadamente 50 pb a 4.000 pb. En una realización preferida, RHA1 y LHA1 comprenden aproximadamente 1.000 pb. En general, cuanto más largo sea el brazo de homología, mayor será la eficacia de la recombinación. Los brazos de homología de una longitud aproximada de 1.000 pb o más facilitan la recombinación y la selección homólogas eficaces al mismo tiempo que permiten que la secuencia de casete de ácido nucleico de la construcción de ADN sea adecuadamente grande. El tamaño de los brazos de homología podría aumentarse a 2000 pb o más, aunque aumentar el tamaño de los brazos de homología aumenta el tamaño del plásmido en su conjunto, lo que limita el tamaño de otros ácidos nucleicos en la construcción de ADN, tal como la secuencia de casete de ácido nucleico.

Cuando RHA2 es más corto que los otros brazos de homología, LHA1 y RHA1 tendrán una frecuencia más alta de integración correcta debido a la mayor probabilidad/eficacia de recombinación para brazos de homología más grandes. Por lo tanto, una porción más alta de las células integrará los marcadores de selección positiva y contraselección en el elemento genético y posteriormente sobrevivirá a los procesos de selección. Aunque teóricamente podría usarse cualquier longitud de RHA2, se prefiere un tamaño de aproximadamente 50-500 pb. Por ejemplo, RHA2 puede tener aproximadamente 300 pb de longitud.

En ausencia de una diferencia en la longitud de RHA2, puede ser necesario un proceso de selección de tres etapas para obtener un cultivo sustancialmente puro del microorganismo recombinante en un período de tiempo razonable. Este proceso puede incluir la selección de PS1, selección de PS1 contraselección de CS1 y contraselección de CS2. La etapa de selección de PS1 generalmente se requiere para enriquecer el cultivo en recombinantes deseados para lograr la mayor densidad celular requerida para superar la menor frecuencia de recombinación correcta. Sin embargo, si existe una probabilidad inicial razonablemente alta de una recombinación correcta que da como resultado un cultivo con una frecuencia más alta de células que han experimentado el doble entrecruzamiento correcto, esta etapa puede omitirse. Por consiguiente, el proceso puede incluir solo selección de PS1 contraselección de CS1 y contraselección de CS2.

La construcción de ADN puede ser un plásmido no replicante, p. ej., un vector suicida. Los sistemas de vectores suicida son bien conocidos en la técnica y permiten la selección directa por reemplazo de genes en bacterias Gramnegativas (Quandt, Gene, 127: 15-21, 1993). Como se muestra en la Fig. 9, la construcción de ADN puede diseñarse de manera que cualquier microorganismo que no incorpore una secuencia de casete de ácido nucleico (por ejemplo, NS1) que comprenda al menos PS1 y RHA2 sea incapaz de sobrevivir y/o reproducirse. Como se muestra en la Fig. 10, la construcción de ADN puede comprender ADN lineal. En este caso, no se requiere CS1 porque la selección de PS1 permite una selección eficiente de microorganismos que comprenden el casete de secuencia del ácido nucleico deseado.

La construcción de ADN comprende además uno o más marcadores de selección, que confieren un rasgo o rasgos adecuados para la selección artificial e indican el éxito de una transfección u otro procedimiento destinado a introducir ADN extraño en una célula. Los marcadores de selección pueden ser marcadores de selección positiva (PS), que confieren una ventaja selectiva al microorganismo hospedador (p. ej., resistencia a antibióticos, que permite que el microorganismo hospedador sobreviva a la selección con antibióticos). Como alternativa o adicionalmente, los marcadores de selección pueden ser marcadores de contraselección (CS), que eliminan o inhiben el crecimiento del microorganismo hospedador tras la selección (p. ej., timidina cinasa, que hace que el hospedador sea sensible a la selección con ganciclovir). Los marcadores de selección pueden tener codones optimizados para la expresión en un género o especie particular, p. ej., Clostridium o Clostridium autoethanogenum. Los marcadores de selección positiva y de contraselección y los métodos de selección positiva y de contraselección son bien conocidos en la técnica.

El marcador de selección positiva se puede elegir entre cualquier marcador de selección positiva conocido en la técnica. Por ejemplo, los marcadores de selección positiva pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en catP, tetA(C), tetM, aad9, aadA, aadA2, y ermB. Sin embargo, el marcador de selección positiva también puede ser cualquier otro marcador de resistencia a antibióticos, casete de toxina/antitoxina, gen esencial (por ejemplo, genes de biosíntesis de tiamina o biosíntesis de uracilo), etc. Las secuencias de marcadores de selección positiva generalmente están disponibles públicamente. Por ejemplo, GenBank WP_002570989 proporciona la secuencia de catP, GenBank YP_007078965 proporciona la secuencia de ermB, y GenBank NP_957551.1 proporciona la secuencia de tetA. Los microorganismos que expresan marcadores de selección positiva pueden identificarse y seleccionarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los microorganismos pueden cultivarse en o sobre un medio que contiene una toxina (por ejemplo, un antibiótico) que destruye los microorganismos que no expresan el marcador de selección positiva (por ejemplo, un gen/proteína de resistencia a antibióticos). El marcador de selección positiva puede estar ubicado en la secuencia de casete de ácido nucleico, de tal modo que sea posible seleccionar microorganismos en donde la secuencia de casete de ácido nucleico de la construcción de ADN se integre satisfactoriamente en el elemento genético del microorganismo.

El marcador de contraselección puede elegirse de cualquier marcador de contraselección conocido en la técnica. Por ejemplo, los marcadores de contraselección pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en pheS*, upp, sacB, tetAR, thyA, ccdB, lacY, rpsL, codA, pyrE, HSTK (thiK), gatA-1, y mazF. El marcador de contraselección puede ser cualquier componente antitoxina de un sistema antitoxina de toxina bacteriana, en donde el microorganismo puede comprender un gen de toxina en donde un gen de antitoxina correspondiente es esencial para la supervivencia del microorganismo. El gen de la antitoxina puede introducirse en un microorganismo positivo a la toxina, en donde se selecciona el gen de la antitoxina hasta que el gen de la toxina ya no está presente. En una realización, la construcción de ADN comprende al menos dos marcadores de contraselección diferentes para acelerar el aislamiento y la selección de un cultivo con un genotipo homogéneo. Los microorganismos que expresan marcadores de contraselección pueden identificarse y seleccionarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los microorganismos pueden cultivarse en o sobre un medio que contenga un componente que sea tóxico solo para aquellos microorganismos que expresen el marcador de contraselección. El marcador de contraselección puede ser HSTK y el método de contraselección puede implicar el cultivo de microorganismos en o sobre un medio que contenga un análogo de guanosina, tal como ganciclovir. Los microorganismos que contienen y expresan un ácido nucleico que codifica HSTK no sobrevivirán en presencia del análogo de guanosina. Por consiguiente, los microorganismos que sobreviven se seleccionan por no expresar HSTK.

PheS es la subunidad alfa de la proteína fenilalanina ARNt sintetasa de dos subunidades, que es responsable de la aminoacilación del ARNtPhe con fenilalanina, un proceso que es crítico para la producción de proteínas en un microorganismo. La enzima cataliza la acilación de fenilalanina a su ARNt afín. El ARNtPhe resultante se suministra a un ribosoma por factores de elongación y después se une posteriormente a su anti codón afín presente en el ARNm. Una vez unido, el aminoácido se fija covalentemente a su aminoácido precedente, aumentando así la cadena peptídica.

pheS* codifica una proteína PheS modificada con un cambio de un solo par de bases a partir del tipo silvestre pheS, dando como resultado una sustitución de aminoácidos. Se describen detalles completos del gen, proteína pheS* modificados, y el método de uso/producción en la Solicitud de Patente de EE.UU. 61/877.272. Los PheS* pueden derivar de C. autoethanogenum y tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. Un PheS* modificado tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3. También se pueden utilizar variantes funcionalmente equivalentes de pheS* o PheS*.

Al usar PheS* como marcador de contraselección, la selección de microorganismos que no expresan PheS* implica cultivar los microorganismos en o sobre un medio que contiene p-clorofenilalanina u otro análogo de fenilalanina. El análogo de fenilalanina se puede elegir entre clorofenilalanina, fluorofenilalanina y bromofenilalanina. El análogo de fenilalanina se puede elegir entre DL-4-clorofenilalanina, p-clorofenilalanina, p-fluoro-L-fenilalanina, p-fluoro-DL-fenilalanina y p-bromo-L-fenilalanina. Los microorganismos que contienen y expresan un ácido nucleico que codifica PheS* no sobrevivirán en presencia de p-clorofenilalanina o análogo de fenilalanina.

HSTK es una proteína que cataliza la reacción: Thd ATP ^ TMP ADP, en donde Thd es desoxitimidina, ATP es adenosina 5'-trifosfato, TMP es desoxitimidina 5'-fosfato y ADP es adenosina 5'-difosfato. HSTK también puede denominarse HS-tk, HSTK, HStk y thiK, todos los cuales se refieren a la misma proteína. HSTK cataliza la fosforilación de desoxitimidina. La HSTK puede derivar de cualquier organismo apropiado. Por ejemplo, la HSTK puede derivar del virus del herpes simple 1 o del virus del herpes simple 2 (HS-TK), v Zv , CMV, HHV7, HHV7, Hh V8 o EBV. Como alternativa, HSTK puede ser una variante funcionalmente equivalente a cualquiera de estas proteínas HSTK. Las proteínas HSTK incluyen las descritas en bases de datos públicas tales como GenBank (por ejemplo, GenBank AB009254.2). La HSTK puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4. También se puede utilizar variantes funcionalmente equivalentes de hstk o HSTK.

Los marcadores de selección pueden estar bajo el control de uno o más promotores. El promotor puede ubicarse dentro de un ácido nucleico que codifica el marcador de selección o el promotor puede estar separado del ácido nucleico que codifica el marcador de selección mediante la intervención de nucleótidos. El promotor puede ser constitutivo o inducible. Se puede utilizar cualquier promotor conocido en la técnica. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor del bacteriófago T7, promotor del bacteriófago T3, promotor del bacteriófago T5, un promotor bacteriano, un promotor sintético o cualquier otro promotor. La construcción de ADN puede comprender un promotor fuerte que impulsa la expresión de los marcadores de selección, p. ej., un promotor de T3, un promotor de T7, un promotor de ARNPr, un promotor Ptrc, o cualquier otro promotor fuerte. Además del promotor, la construcción de ADN puede comprender otros elementos reguladores, como operadores y/o potenciadores.

Las etapas de selección se pueden realizar de forma simultánea o consecutiva. Por ejemplo, los microorganismos con un solo evento de entrecruzamiento podrían seleccionarse utilizando un fabricante de selección positiva y, posteriormente, los microorganismos con un evento de doble entrecruzamiento podrían seleccionarse usando un marcador de contraselección. Como alternativa, la selección positiva y la contraselección se puede realizar de forma simultánea. Cuando el marcador de selección positiva se coloca en la construcción de ADN fuera de los brazos de homología (en la estructura de la construcción de ADN), los microorganismos con un solo evento de entrecruzamiento podrían seleccionarse utilizando un fabricante de selección positiva y, posteriormente, los microorganismos con un evento de doble entrecruzamiento podrían seleccionarse usando un marcador de contraselección. Cuando el marcador de selección positiva se coloca en la construcción de ADN entre los brazos de homología (en la secuencia de casete de ácido nucleico), la selección positiva y la contraselección se pueden realizar de forma simultánea, ya que cualquier microorganismo que tenga el marcador de selección positiva integrado en su elemento genético y sea resistente al marcador de contraselección habrá experimentado un evento de doble entrecruzamiento.

En una realización, la construcción de ADN comprende un marcador de contraselección CS1. Preferentemente, CS1 está ubicado en la estructura de la construcción de ADN. La selección contra CS1 selecciona microorganismos con los componentes deseables de la construcción incorporados solamente (p. ej., el casete de secuencia del ácido nucleico, pero no la estructura de la construcción de ADN). Las Fig. 1-5 muestran una construcción de ADN que comprende CS1 ubicado en la estructura de la construcción de ADN.

En una realización, la construcción de ADN comprende además el marcador de contraselección CS2. Preferentemente, CS2 está ubicado entre LHA1 y RHA2. Las Fig. 1-5 muestran una construcción de ADN que comprende CS2 ubicado en la construcción de ADN entre LHA1 y RHA2.

En una realización, la construcción de ADN comprende un marcador de selección positiva PS1. Preferentemente, PS1 está ubicado entre LHA1 y RHA2.

En una realización, la construcción de ADN comprende marcadores de contraselección CS1 y CS2 y un marcador de selección positiva PS1. Preferentemente, CS1 está ubicado cadena arriba de LHA1 (en la estructura de la construcción de ADN) y CS2 y PS1 están ubicados entre LHA1 y RHA2. CS2 y PS1 se pueden organizar en cualquier orden. Por ejemplo, la construcción de ADN puede comprender 5'-CS2-PS1-3'o 5'-PS1-CS2-3'. En una realización, la etapa de permitir que el elemento genético experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN está seguida por una etapa de selección para la expresión de PS1 y contra la expresión de CS1 y la etapa de permitir que el elemento genético experimente una recombinación autohomóloga está seguida por una etapa de selección contra la expresión de CS2. En esta realización, CS2 se incorpora al microorganismo intermedio, pero se pierde en el microorganismo final.

Se apreciará que la inclusión de CS2 en la construcción de ADN no es esencial para permitir que el método produzca un microorganismo recombinante de la invención, ya que la naturaleza irreversible del tercer/último evento de recombinación homóloga/final dicta que el microorganismo recombinante que carece de regiones homólogas eventualmente predominará de todos modos.

Se apreciará que el orden de los componentes (por ejemplo, LHA1, RHA1, RHA2, PS1, CS1, CS2) en la construcción de ADN es variable. Generalmente, la construcción de ADN comprende los componentes ordenados, p. ej., 5'-LHA1-RHA2-RHA1-3'. Sin embargo, el orden de los componentes puede invertirse, p. ej., 5'-RHA1-RHA2-LHAl'-3'. Si el elemento genético comprende, p. ej., 5'-T1-T2-T3-3', la inversión de los componentes de la construcción de ADN dará como resultado la eliminación/reemplazo de T2 en lugar de T1.

Además, a diferencia del orden de los brazos de homología, el orden de los marcadores de selección positiva y de contraselección no es esencial para la funcionalidad del sistema. La construcción de ADN puede comprender PSl y CS2 en cualquier orden, p. ej., 5'-PS1-CS2-3' o 5'-CS2-PS1-3'.

La construcción de ADN puede comprender además al menos una secuencia de un ácido nucleico de inserción definida como IS (p. ej., IS1, IS2, IS3, IS4, etc.) para su integración en el elemento genético. La secuencia del ácido nucleico de inserción puede incluir, por ejemplo, uno o más genes, promotores, secuencias reguladoras u otros elementos genéticos y pueden ser codificantes o no codificantes. Puede incluir una secuencia de un ácido nucleico diseñada para introducir una modificación genética en una secuencia de un ácido nucleico diana en el elemento genético, incluyendo una eliminación, adición o sustitución de uno o más nucleótidos. La secuencia del ácido nucleico de inserción puede diseñarse para dar como resultado la eliminación de un gen presente en el elemento genético, por ejemplo, mediante la asociación del gen con la secuencia del ácido nucleico de inserción para las etapas posteriores del proceso de eliminación.

El uno o más de los eventos de recombinación homóloga puede proceder de acuerdo con el sistema de recombinación del bacteriófago lambda red (Murphy, J Bacteriol, 180: 2063-2071, 1998 y Murphy, Gene, 246: 321-330, 2000). El uso de este sistema para integrar el casete deseado en el elemento genético da como resultado una alta eficacia de integración y elimina la necesidad de CS1, ya que el ADN será lineal. Además, los brazos de homología LHA1 y RHA1 solo necesitan tener una longitud de 30-70 pb. La Fig. 11 muestra una construcción de ADN que comprende brazos de homología apropiados para su uso en el sistema de recombinación lambda red. Se conocen en la técnica métodos y protocolos ejemplares para el uso del sistema de recombinación lambda red (Sharan, Nat Protoc, 4: 206-223, 2009).

"Endógeno" se refiere a un ácido nucleico o proteína que está presente o se expresa en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que deriva el microorganismo recombinante. Por ejemplo, un gen endógeno es un gen que está presente de forma natural en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que deriva el microorganismo recombinante. La expresión de un gen endógeno puede estar controlada por un elemento regulador exógeno, tal como un promotor exógeno.

"Exógeno" se refiere a un ácido nucleico o proteína que no está presente en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que deriva el microorganismo. Un gen o enzima exógeno puede derivar de una cepa o especie heteróloga e introducirse al o expresarse en el microorganismo. Un gen o enzima exógeno puede crearse de forma artificial o de forma recombinante e introducirse al o expresarse en el microorganismo. Los ácidos nucleicos exógenos pueden adaptarse para integrarse en el genoma de la bacteria o permanecer en un estado extracromosómico en el microorganismo, por ejemplo, en un plásmido.

"Mutado" se refiere a un ácido nucleico o proteína que se ha modificado en el microorganismo en comparación con el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que deriva el microorganismo. La mutación puede ser una eliminación, inserción o sustitución en un gen que codifica una enzima. La mutación puede ser una eliminación, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos en una enzima.

La expresión "modificación genética" se refiere ampliamente a la manipulación del genoma o de los ácidos nucleicos de un microorganismo. Los métodos de modificación genética incluyen la expresión de genes heterólogos, inserción o eliminación de genes o promotores, expresión génica alterada o inactivación, ingeniería enzimática, evolución dirigida, diseño basado en el conocimiento, métodos de mutagénesis aleatoria, reordenación de genes y optimización de codones. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Pleiss, Curr Opin Biotechnol, 22: 611-617, 2011; Park, Protein Engineering and Design, CRC Press, 2010.

El término "variantes" incluye ácidos nucleicos y proteínas cuya secuencia varía de la secuencia de un ácido nucleico y una proteína de referencia, tal como una secuencia de un ácido nucleico y una proteína de referencia divulgados en la técnica anterior o ejemplificados en el presente documento. La invención puede practicarse usando ácidos nucleicos o proteínas variantes que realizan sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o la proteína de referencia. Por ejemplo, una proteína variante puede realizar sustancialmente la misma función o catalizar sustancialmente la misma reacción que una proteína de referencia. Un gen variante puede codificar la misma o sustancialmente la misma proteína que un gen de referencia. Un promotor variante puede tener sustancialmente la misma capacidad para promover la expresión de uno o más genes como un promotor de referencia.

Tales ácidos nucleicos o proteínas pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico pueden incluir variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes mutados, polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también son ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Estos incluyen genes homólogos en especies tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, o Clostridium Ijungdahlii, cuyos detalles están disponibles públicamente en sitios web tales como Genbank o NCBI. Las variantes funcionalmente equivalentes también incluyen ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un organismo particular. Una variante de un ácido nucleico funcionalmente equivalente preferentemente tendrá al menos aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98% o más de identidad de secuencia del ácido nucleico (porcentaje de homología) con el ácido nucleico de referencia. Una variante de una proteína funcionalmente equivalente preferentemente tendrá al menos aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente 98% o más de identidad de aminoácidos (porcentaje de homología) con la proteína de referencia. La equivalencia funcional de un ácido nucleico o proteína variantes puede evaluarse usando cualquier método conocido en la técnica.

Una variante funcionalmente equivalente de un marcador de selección ejemplificado en el presente documento no necesita tener el mismo nivel de actividad que el marcador de selección del que es una variante. Todo lo que se requiere es que se conserve determinado nivel de la actividad deseada. Los ensayos para evaluar la actividad de los marcadores de selección ejemplificados en el presente documento son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la función o actividad de pheS* se puede probar midiendo la aminoacilación. Pueden usarse velocidades de aminoacilación y parámetros cinéticos de pheS* para probar variaciones de actividad de pheS* en la utilización de fenilalanina (Kast, J Mol Biol, 222: 99-124, 2991).

Los ácidos nucleicos, incluyendo la construcción de ADN, se pueden suministrar a un microorganismo usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden suministrarse como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes (por ejemplo, liposomas). Los ácidos nucleicos puede ser ADN, ARN, ADNc, o combinaciones de los mismos, como sea apropiado. Se pueden utilizar inhibidores de restricción (Murray, Microbiol Molec Biol Rev, 64: 412-434, 2000). Los vectores adicionales pueden incluir plásmidos, virus (incluyendo bacteriófagos), cósmidos y cromosomas artificiales.

A modo de ejemplo, la transformación (incluida la transducción o transfección) de la construcción de ADN u otros ácidos nucleicos se puede lograr mediante electroporación, ultrasonidos, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química o natural, transformación de protoplastos, inducción de profagos, o conjugación (véase, p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se ha informado del uso de electroporación para varios acetógenos carboxidotróficos, incluyendo Ciostrídiumijungdahiii (Koepke, PNAS, 107:13087-13092, 2010; documento WO 2012/053905), Ciostridium autoethanogenum (documento WO/2012/053905), Ciostridium aceticum (Schiel-Bengelsdorf, Synthetic Biol, 15: 2191-2198, 2012) y Acetobacterium woodii(Stratz, Appl Environ Microbiol, 60: 1033-1037, 1994). El uso de electroporación también se ha informado en Ciostridia, incluyendo Ciostridium acetobutyiicum (Mermelstein, Biotechnol, 10: 190-195, 1992) y Ciostridium ceiiuioiyticum (Jennert, Microbiol, 146: 3071-3080, 2000). Se ha demostrado la inducción de profagos para acetógenos carboxidotróficos, incluyendo Ciostridium scatoiogenes (Parthasarathy, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project, Western Kentucky University, 2010), y la conjugación se ha descrito para muchos Ciostridia, incluyendo Ciostridium difficiie (Herbert, FEMs Microbiol Lett, 229: 103-110, 2003) y Ciostridium acetobuyiicum (Williams, J Gen Microbiol, 136: 819-826, 1990).

Puede ser necesario metilar un ácido nucleico antes de la introducción del ácido nucleico en la bacteria. Puede producirse un microorganismo recombinante usando un microorganismo lanzadera que facilita la metilación de la construcción de ADN. Por ejemplo, el microorganismo lanzadera puede ser Escherichia coii, Baciio 26roducto26, o Lactococcus iactis negativos para la restricción. La metilación de la construcción de ADN se puede lograr introduciendo en un microorganismo lanzadera (i) una construcción de ADN para introducirla en un microorganismo precursor y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa; expresando el gen de la metiltransferasa; aislando la construcción de ADN del microorganismo lanzadera; e introduciendo la construcción de ADN en el microorganismo precursor. La construcción/vector de metilación comprende un gen de metiltransferasa. La expresión del gen de metiltransferasa puede ser constitutiva o inducida. La inducción puede ser por cualquier promotor adecuado, tal como un promotor lac inducible que se induce mediante la adición de lactosa o un análogo de la misma, tal como isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen el ara, tet, T7, ARNPt, ARNPr, Ppta/ack, o cualquier promotor transcripcionalmente activo que sea inducible, condicional o constitutivo. La construcción/vector de metilación puede tener un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera, de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de metilación se exprese en el microorganismo lanzadera. La expresión de metiltransferasa da como resultado la metilación de los genes presentes en la construcción de ADN, que después puede aislarse del microorganismo lanzadera usando cualquier método conocido en la técnica. Tanto la construcción/vector de metilación como las construcciones de ADN de la invención pueden aislarse al mismo tiempo. Adicionalmente o como alternativa, se puede recoger y usar una metiltransferasa in vitro para metilar la construcción de ADN, que después puede introducirse en el microorganismo precursor. El gen de la metiltransferasa puede introducirse en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de la introducción de la construcción de ADN, el aislamiento de la construcción de ADN del microorganismo lanzadera y la introducción de la construcción de ADN en el microorganismo precursor. La construcción/vector de metilación puede ser un plásmido. La metiltransferasa puede ser cualquier metiltransferasa conocida en la técnica. Por ejemplo, la metiltransferasa puede ser metiltransferasa del fago OT1 de Baciiius subtiiis o la metiltransferasa descritas en el documento WO 2012/053905. Además, se puede usar cualquier tipo de construcción/vector conocido en la técnica para generar la construcción/vector de metilación, incluyendo, por ejemplo, las construcciones/vectores de metilación descritos en el documento WO 2012/053905.

Un "microorganismo" es un organismo microscópico, especialmente una bacteria, arquea, virus u hongo. El microorganismo es preferentemente una bacteria. Como se usa en el presente documento, la recitación de "microorganismo" debe considerarse que abarca "bacteria".

El término "recombinante" indica que un ácido nucleico, proteína o microorganismo es el producto de una modificación genética o recombinación. En general, el término "recombinante" se refiere a un ácido nucleico, proteína o microorganismo que contiene o está codificado por material genético derivado de múltiples fuentes, tal como dos o más cepas o especies diferentes de microorganismos. Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" también puede usarse para describir un microorganismo que comprende un ácido nucleico o proteína mutados, incluyendo una forma mutada de un ácido nucleico o proteína endógenos.

Un "microorganismo precursor" es un microorganismo utilizado para generar un microorganismo. El microorganismo precursor puede ser un microorganismo de origen natural (es decir, un microorganismo de tipo silvestre) o un microorganismo que se ha modificado previamente (es decir, un microorganismo mutante o recombinante). El microorganismo puede modificarse para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el microorganismo precursor. De manera similar, el microorganismo puede modificarse para que contenga uno o más genes que no se encontraban en el microorganismo precursor. En particular, el microorganismo precursor puede transformarse con una construcción de ADN de acuerdo con los métodos de la presente invención para producir un microorganismo recombinante.

La expresión "derivado de" indica que un ácido nucleico, proteína, o microorganismo se modifica o se adapta a partir de un ácido nucleico, proteína o microrganismo (por ejemplo, precursor o de tipo silvestre) diferentes, para producir un nuevo ácido nucleico, proteína o microorganismo. Tales modificaciones o adaptaciones generalmente incluyen inserción, eliminación, mutación o sustitución de ácidos nucleicos o genes. En general, el microorganismo deriva de un microorganismo precursor.

El microorganismo precursor puede ser cualquier tipo de microorganismo, tal como una bacteria, arquea, virus u hongo.

El microorganismo precursor puede ser una bacteria ABE, que es una bacteria Clostridial grampositiva capaz de producir butanol, etanol y acetona o isopropanol (véase, p. ej., Keis, Int J Syst Evol Microbiol, 51: 2095-2103, 2001). La bacteria precursora puede ser una bacteria ABE seleccionada del grupo que comprende Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharobutylicum, y Clostridium saccharoperbutylacetonicum. El microorganismo precursor puede ser Clostridium acetobutylicum ATCC824 (DSM792) o EA 2018 (c Ct CC M 94061). El microorganismo precursor puede ser Clostridium beijerinckii NCIMB8052 (ATCC51743) y NRRL B-593 (DSM 6423).

El microorganismo precursor puede ser un Enterobacterium, que tiene forma de varilla, bacterias gramnegativas pertenecientes al orden Enterobacteriacea y capaces de fermentar azúcares para producir ácido láctico, etanol, acetoína, 2,3-butabediol y/u otros productos. La bacteria precursora puede ser una Enterobacterium seleccionada del grupo que comprende Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Citrobacter, Enterobacter, Salmonela, y Serratia. El microorganismo precursor puede ser Escherichia coli, Zymononas mobilis, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxtoca, Enterobacter cloacae, o Serratia marcescens.

El microorganismo precursor puede ser un Lactobacillus, que es una bacteria del ácido láctico gram-positiva que pertenece al orden Lactobacillales y capaz de fermentar azúcares para producir ácido láctico, 2,3-butabediol, metil etil cetona (MEK), 2-butanol y/u otros productos. La bacteria precursora puede ser un Lactobacillus seleccionado del grupo que comprende Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus y Streptococcus. El microorganismo precursor es Lactobacillus brevis, Enterococcus faecalis, o Lactococcus lactis.

El microorganismo precursor puede ser un hongo o una levadura. Los hongos son microorganismos eucariotas, de los cuales las levaduras son un subconjunto específico, capaces de fermentar azúcares para producir etanol, acetoína y/u otros productos. El microorganismo precursor puede ser un hongo seleccionado del grupo que comprende Aspergillus, Trichoderma, Exophila, Mucor, Cladosporium, Phanerochaete, Cladiophilalophora, Paecilomyces, Scedosporium y Ophistoma. El microorganismo precursor puede ser Aspargillus niger o Trichderma resei. El microorganismo precursor puede ser una levadura seleccionada del grupo que comprende Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Yarrowia, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lipomyces, Aspergillus, Trichoderma, Exophila, Mucor, Cladosporium, Phanerochaete, Cladiophilalophora, Paecilomyces, Scedosporium y Ophistoma. El microorganismo precursor puede ser Saccharomyces cerevisiae, Candidia tropicalis, Candidia albicans, Yarrowia lipolytica, Aspargillus niger o Trichderma resei.

El microorganismo precursor puede ser un carboxidotrofo aeróbico, que es una bacteria que se encuentra de manera ubicua en la naturaleza y aislada de varios ambientes, incluyendo como seres humanos (King, Nat Rev Microbiol, 5: 107-118, 2007). A nivel taxonómico, este grupo fisiológico es bastante diverso, comprendiendo diferentes filos tales como a-proteobacterias, firmicutes o actinobacterias (King, Nat Rev Microbiol, 5: 107-118, 2007). Se demostró que todos estos organismos crecían a niveles de CO> 1 % en presencia de aire (King, Nat Rev Microbiol, 5: 107-118, 2007). Una mezcla de gas típica consiste en CO al 50 % y aire al 50 % (Cypionka, Appl Environ Microbiol, 69: 1980 1989, 2003). El microorganismo precursor puede ser un carboxidotrofo aerobio seleccionado del grupo que comprende Bacillus, Oligotropha, Pseudomonas, Carbophilus, Hydrogenophaga, Mycobacterium, y Zavarzinia. El microorganismo precursor puede ser Oligotropha carboxydovorans, Carbophilus carboxidus, Hydrogenophaga pseudoflava, Mycobacterium sp., Pseudomonas carboxydohydrogena, Pseudomonas sp., Zavarzinia compransoris o Bacillus schlegelii.

El microorganismo precursor puede ser un microorganismo fijador de CO2 aeróbico, que es una bacteria capaz de fijar CO2 con H2 o mediante fotosíntesis en presencia de oxígeno. El microorganismo precursor puede ser un microorganismo fijador de CO2 aerobio seleccionado del grupo que comprende Cupravidus, Senechocystis, y Chloroflexus. El microorganismo precursor puede ser Cupravidus necator, Senechocystis sp. o Chloroflexus auranticus.

El microorganismo precursor puede ser un metilotrofo, que es un microorganismo capaz de utilizar sustratos reducidos de un carbono, tal como metano o metanol, como fuente de carbono para el crecimiento. El microorganismo precursor puede ser un metilotrofo seleccionado del grupo que comprende Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylosphera, Methylocaldum, Methylocystis, y Methylosinus. El microorganismo precursor puede ser Methylococcus capsulatus o Methylosinus trichosporium.

El microorganismo precursor puede ser un metanógeno, que es un Archeae que es capaz de reducir CO2 en metano. El microorganismo precursor puede ser un metanógeno seleccionado del grupo que comprende Methanobacterium, Methanococcus, Methanogenium, Methanosarcina, Methanoshera, Methanothermobacter, y Methanotrix. El microorganismo precursor puede ser Methanothermobacter marburgensis o Methanosarcina bakeri.

El microorganismo precursor puede ser un carboxitrofo, que es un microorganismo capaz de tolerar una alta concentración de monóxido de carbono (CO). El microorganismo precursor puede ser capaz de utilizar CO como única fuente de carbono y energía. El microorganismo precursor puede seleccionarse del grupo de carboxidotróficos Clostridia que comprende las especies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, y aislados relacionados, incluyendo, pero sin limitación, cepas Clostridium autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), Clostridium autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200), Clostridium autoethanogenum LZ1561 (DSM23693), Clostridium ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), Clostridiumljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (Patente de EE. UU.

5.593.886), Clostridiumljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (Patente de EE. UU. 6.368.819), Clostridiumljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (Patente de EE. UU. 6.368.819), Clostridium ragsdalei P11T (ATCC BAA-622) (documento WO 2008/028055), aislados relacionados tales como "Clostridium coskatii" (Publicación de EE. UU. 2011/0229947), o cepas mutadas tal como Clostridiumljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, Universidad Estatal de Carolina del Norte, 2010).

Estas cepas forman un subgrupo dentro del grupo I de ARNr Clostridial, y su gen de ARNr 16S es más del 99 % idéntico con un bajo contenido en GC similar de alrededor del 30 %. Sin embargo, la reasociación de ADN-ADN y los experimentos de huella de ADN, mostraron que estas cepas pertenecían a especies distintas (documento WO 2008/028055). Las cepas de este grupo se definen por características comunes, teniendo ambas un genotipo y un fenotipo similares, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Adicionalmente, las cepas de este grupo carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo Rnf. Todas las especies de este grupo tienen una morfología y tamaño similares (el crecimiento logarítmico de las células varía de 0,5-0,7 x 3-5 pm), son mesófilas (temperatura óptima de crecimiento entre 30-37 °C) y estrictamente anaerobias (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993; y el documento WO 2008/028055). Además, todas ellas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como el mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), un fuerte crecimiento autotrófico en gases que contienen CO con tasas de crecimiento similares, y un perfil metabólico similar con etanol y ácido acético como productos finales de fermentación principal, y pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formadas en determinadas condiciones (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994; Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011; Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993; y el documento WO 2008/028055). La producción de indol también se observó con las tres especies.

Sin embargo, las especies se diferencian en la utilización del sustrato de varios azúcares (p. ej., ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej., gluconato, citrato), aminoácidos (p. ej., arginina, histidina) u otros sustratos (p. ej., betaína, butanol). Además, se encontró que algunas de las especies eran auxótrofas a ciertas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras que otras no. La organización y el número de genes de la vía Wood-Ljungdahl, responsable de la absorción de gases, se ha encontrado que son los mismos en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de los ácidos nucleicos y aminoácidos (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011). Además, se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos en sus correspondientes alcoholes en una variedad de estos organismos (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Por lo tanto, estos rasgos no son específicos de un microorganismo, similar a Clostridium autoethanogenum o Clostridium ljungdahlii, sino rasgos generales para Clostridia carboxidotróficos, que sintetizan etanol y se puede anticipar que los mecanismos funcionan de manera similar entre estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento.

El microorganismo precursor puede seleccionarse del género Clostridium, Acetobacterium, Moorella, Butyribacterium, Blautia, Oxobacter, Thermoanaerobacter, Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Citrobacter, Enterobacter, Salmonella, Serratia, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus, Saccharomyces, Pichia, Candida Hansenula, Yarrowia, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lipomyces, Aspergillus, trichoderma, Exophila, Mucor, Cladosporium, Phanerochaete, Cladiophilalophora, Paecilomyces, Scedosporium, Ophistoma, Bacillus, Oligotropha, Pseudomonas, Carbophilus, Hydrogenophaga, Mycobacterium, Zavarzinia, Cupravidus, Senechocystis, Chloroflexus, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylosphera, Methylocaldum, Methylocystis, Methylosinus, Methanobacterium, Methanococcus, Methanogenium, Methanosarcina, Methanoshera, Methanothermobacter, Methanotrix, Corynebacterium, Acinetobacter, Actinomyces, Bacteriodes, Burkholderia, Brevibacterium, Pyrococcus, Geobacter, Geobacillus, Paenibacillus, Mycobacterium, Rhodopseudomonas, Thermatoga, Thermoanaerobacter, Streptomyces, Rhodobacter, Rhodococcus, Peptococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Fusobacterium, Campylobacter, Veillonella, Aquincola, Arthrobacter, Moraxella, o Psychrobacter.

El microorganismo precursor puede ser una bacteria acetogénica carboxidotrófica. Un acetógeno es un microorganismo que genera o es capaz de generar acetato como producto de la respiración anaeróbica. Generalmente, Los acetógenos son bacterias obligadamente anaerobias que utilizan la vía Wood-Ljungdahl como su mecanismo principal para la conservación de energía y para la síntesis de acetil-CoA y productos derivados de acetil-CoA, tales como acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). El microorganismo precursor puede ser una bacteria acetogénica carboxidotrófica seleccionada del grupo que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium coskatii, Clostridium aceticum, Clostridium magnum, Clostridium sp., Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii, y Thermoanaerobacter kiuvi. El microorganismo precursor puede ser Clostridium autoethanogenum depositado bajo el registro de DSMZ DSM10061, Clostridium autoethanogenum depositado bajo el registro de DSMZ DSM13528 (ATTC 55383), o Clostridium autoethanogenum depositado bajo el registro de DSMZ DSM23693 (conocido como Clostridium autoethanogenum LZ1561).

El microorganismo puede cultivarse para producir uno o más productos, tales como etanol (documento WO 2007/117157), acetato (documento WO 2007/117157), butanol (documento WO 2008/115080 y documento WO 2012/053905), butirato (documento WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (documento WO 2009/151342), lactato (documento WO 2011/112103), buteno (documento WO 2012/024522), butadieno (documento WO 2012/024522), metiletilcetona (2-butanona) (documento WO 2012/024522 y documento WO 2013/185123), etileno (documento w O 2012/026833), acetona (documento WO 2012/115527), isopropanol (documento w O 2012/115527), lípidos documento(WO 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (documento WO 2013/180581), isopreno (documento WO 2013/180584), ácidos grasos (documento WO 2013/191567), 2-butanol (documento WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (documento WO 2014/0369152) y 1-propanol (documento WO 2014/0369152).

Generalmente, el cultivo se realiza en un biorreactor. El término "biorreactor" incluye un dispositivo de cultivo/fermentación que consiste en uno o más recipientes, torres, o estructuras de tuberías, tal como un reactor de tanque agitado continuo (CSTR, por sus siglas en inglés), reactor de células inmovilizadas (ICR, por sus siglas en inglés), reactor de lecho percolador (TBR, por sus siglas en inglés), columna de burbujeo, fermentador de elevación de gases, mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de cultivo/fermentación. El sustrato se puede proporcionar a uno o ambos de estos reactores. Como se usa en el presente documento, los términos "cultivo" y "fermentación" se utilizan indistintamente. Estos términos abarcan tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis del producto del proceso de cultivo/fermentación.

El cultivo generalmente se mantiene en un medio de cultivo acuoso que contiene nutrientes, vitaminas y/o minerales suficientes para permitir el crecimiento de la bacteria. Preferentemente, el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaeróbico mínimo. El medio también puede ser medio mínimo de Clostridia, medio mínimo definido (MDM, por sus siglas en inglés), medio definido complementado (SDM, por sus siglas en inglés o medio definido completo (CDM, por sus siglas en inglés). El medio puede ser medio p Et C. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. 5.173.429, en la Patente de EE.UU.

5.593.886 y en el documento WO 2002/008438.

Es deseable que el cultivo/fermentación se lleve a cabo en condiciones apropiadas para la producción del producto diana. Las condiciones de reacción a considerar incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH de los medios, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato y concentraciones máximas de producto.

El término "sustrato" se refiere a una fuente de carbono y/o energía para el microorganismo. El tipo de sustrato requerido dependerá de la naturaleza del microorganismo. El sustrato puede comprender un gas, tal como CO, CO2, H2, O2, y/o N2. El sustrato puede comprender un carbohidrato, tales como glucosa, fructosa, lignocelulosa, celulosa o almidón.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no debe interpretarse como una limitación de su alcance de ninguna manera.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe materiales y métodos generales.

C. autoethanogenum DSM10061 y DSM23693 (un derivado de DSM10061) y C. Ijungdahlii DSM13528 se obtuvieron de la DSMZ (The German Collection of Microorganismo and Cell Cultures, Inhoffenstrape 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania). C. ragsdalei ATCC BAA-622 se obtuvo de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA 20108, EE. UU.). E coli DH5a se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA 92008, EE. UU.).

E. coli se cultivó en condiciones aeróbicas a 37 °C en medio LB (Luria-Bertani). Los medios sólidos contenían agar al 1,5 %.

Las cepas de Clostridium se cultivaron a 37 °C en medio PETC a pH 5,6 utilizando técnicas anaeróbicas convencionales(Hungate, Methods Microbiol, 3B: 117-132, 1969; Wolfe, Adv Microbiol Physiol, 6: 107-146, 1971). Se utilizó como sustrato fructosa (crecimiento heterótrofo) o gas de acería que contenía 30 psi de CO (recogido del New Zealand Steel site in Glenbrook, NZ; composición: 44 % de CO, 32 % de N2, 22 % de CO2, 2 % de H2) en el espacio vacío (crecimiento autótrofo). Para medios sólidos, se añadió agar bacto al 1,2 % (BD, Franklin Lakes, NJ 07417, EE. UU.).

continuación

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la eliminación de genes o la inserción de genes en marco en el genoma de C. autoethanogenum.

La eliminación o inserción en marco de un gen en el genoma de C. autoethanogenum se logró utilizando dos marcadores de contraselección, dos etapas de selección y tres eventos de entrecruzamiento mediados por homólogos.

La Fig. 12 muestra la construcción de ADN (plásmido TXp3) que comprende CS1 (tet3nO-mazF), LHA1, catP, pheS*, RHA2 y RHA1. La Fig. 13 muestra la organización de un elemento genético en el genoma de C. autoethanogenum. Los brazos de homología LHA1 y RHA1 se diseñaron para recombinarse con T1 y T2, respectivamente, para integrar el ADN entre LHA1 y RHA1 en el genoma de C. autoethanogenum entre T1 y T2. Seleccionando el marcador de selección positiva (catP) y contra el marcador de contraselección 1 (tet3nO-mazF), se seleccionó el evento de recombinación de doble entrecruzamiento deseado con muy alta eficacia (Fig. 14 y Fig. 17).

Una vez que el mutante de doble entrecruzamiento se purificó y enriqueció, se permitió que T3 se recombinara con RHA2 para eliminar el gen diana T1. La selección para el evento de recombinación entre T3 y RHA2 se realizó seleccionando contra CS2 (seleccionando contra pheS* mediante la adición de clorofenilalanina) (Fig. 15).

Este sistema se puede modificar para reemplazar (A) o insertar (B) ADN alélico en el genoma de C. autoethanogenum dependiendo de la posición del brazo de homología RHA2 (Fig. 16).

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la eliminación de un gen de la 2,3-butanodiol deshidrogenasa (2,3-BDH) (SEQ ID NO: 9) de C. autoethanogenum LZ1561.

PheS* (SEQ ID NO: 1) se usó como marcador de contraselección en la estructura de la construcción de ADN y tet3nO-mazF (SEQ ID NO: 6) se usó como marcador de contraselección entre los brazos de homología LHA1 (SEQ ID NO: 7) y RHA2 (SEQ ID NO: 8). La construcción de ADN se sintetizó y después se transformó en C. autoethanogenum LZ1561 mediante conjugación. Para esto, el vector de expresión se introdujo primero en la cepa donante conjugativa E. coli CA434 (el "donante") usando transformación por choque térmico convencional. Las células donantes se recuperaron en medio SOC a 37 °Cdurante 1 h antes de sembrarse en placas con LB que contenían 100 pg/ml de espectinomicina y 25 pg/ml de cloranfenicol. Las placas con LB se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, se inocularon alícuotas de 5 ml de LB que contenían 100 pg/ml de espectinomicina y 25 pg/ml de cloranfenicol con varias colonias de donantes y se incubaron a 37 °C, agitando durante aproximadamente 4 h, o hasta que el cultivo fue visiblemente denso pero aún no había entrado en fase estacionaria. Se recogieron 1,5 ml del cultivo donante en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente mediante centrifugación a 4000 rpm durante 2 min, y se desechó el sobrenadante. Las células donantes se resuspendieron suavemente en 500 pl de PBS estéril y se centrifugaron a 4000 rpm durante 2 min y se desechó el sobrenadante de PBS. El sedimento se introdujo en una cámara anaeróbica y se resuspendió suavemente en 200 pl durante el cultivo de C. autoethanogenum (el "receptor") en fase exponencial tardía. La mezcla de conjugación (la mezcla de células receptoras y donantes) se colocó en manchas sobre placas de agar con PETC-MES fructosa y se dejó secar. Cuando las manchas ya no estaban visiblemente húmedas, las placas se introdujeron en un recipiente a presión, presurizado con gas de síntesis a 25-30 psi y se incubó a 37 °C durante ~ 24 h. Después de 24 h de incubación, la mezcla de conjugación se retiró de las placas raspándola suavemente usando un asa de inoculación de 10 pl. La mezcla eliminada se suspendió en 200-300 pl de PETC-MES. Se sembraron alícuotas de 100 pl de la mezcla de conjugación en placas de agar con PETC-MES complementadas con 15 pg/ml de tiamfenicol para seleccionar catP y 10 pg/ml de trimetoprima y mediante la adición de 31 ng/ml de tetraciclina anhidra para inducir la expresión de mazF y seleccionar el entrecruzamiento doble. Las placas se volvieron a introducir en el recipiente a presión, presurizado a 25-30 psi de gas de síntesis y se incubaron a 37 °C durante 3-4 días. Después de esta contraselección de una sola etapa de tet3nO-mazF y la selección positiva de catP, se identificaron integrantes de doble entrecruzamiento en los 16 integrantes analizados.

Usando un conjunto de cebadores para amplificar a través del sitio 2,3-BDH, se demostró que la recombinación de entrecruzamiento doble y triple se produce a una frecuencia lo suficientemente alta como para aislarse con la contraselección correcta. El control positivo era una colonia que se había demostrado previamente que era una cepa A 2,3-BDH pura identificada mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento tradicional mediante la exploración de un gran número de colonias.

En algunos casos, en esta primera etapa ya se observó triple entrecruzamiento (y posteriormente eliminación de 2,3-BDH) para parte de la población (Fig. 17). Al realizar un subcultivo adicional, se produciría la etapa de triple entrecruzamiento (sin necesidad de una segunda etapa de selección).

Para seleccionar la recombinación de triple entrecruzamiento y, posteriormente, la eliminación de 2,3-BDH, la cepa se sembró en placa sobre clorofenilalanina seleccionando la recombinación de triple entrecruzamiento con el segundo marcador negativo pheS* con posterior eliminación de la 2,3-BDH. Para explorar la ausencia del plásmido, se utilizaron cebadores contra ColE1 de origen Gram-negativo. Para explorar la eliminación positiva del gen de triple cruce, se realizó una exploración con cebadores en los brazos de homología para confirmar el tamaño correcto del gen eliminado.

Para seleccionar la recombinación de triple entrecruzamiento y la posterior eliminación de 2,3-BDH) en una segunda etapa, la cepa se sembró en placa en 2 g/l de clorofenilalanina seleccionando la recombinación de triple entrecruzamiento con el segundo marcador negativo pheS*. Para explorar la ausencia del plásmido, se utilizaron cebadores contra ColE1 de origen Gram-negativo. Para explorar la eliminación positiva del gen de triple cruce, se realizó una exploración con cebadores en los brazos de homología para confirmar el tamaño correcto del gen eliminado.

La secuenciación confirmó la eliminación exitosa, sin cicatrices del gen del 2,3-butanodiol. Se proporcionan secuencias de nucleótidos de la región genómica correspondiente en C. autoethanogenum LZ1561 (SEQ ID NO: 10), el doble entrecruzamiento (SEQ ID NO: 11) y el triple entrecruzamiento (SEQ ID NO: 12).

El mismo procedimiento también se ha aplicado con éxito para desactivar el gen secundario de la alcohol deshidrogenasa de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 13).

La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debería tomarse como, un reconocimiento de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en el campo de la actividad en cualquier país.

Se ha de interpretar que el uso de los términos "un", "uno/una" y "el/la" y las referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende/n", "que tiene/n", "que incluye/n" y "que contiene/n" se han de interpretar como

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un microorganismo recombinante, que comprende:

(i) un marcador de selección positiva PS1 y un marcador de contraselección CS2 entre LHA1 y RHA2; o

(ii) un marcador de selección positiva PS1 entre LHA1 y RHA2;

(c) permitir que el elemento genético de (a) experimente una recombinación homóloga con la construcción de ADN de (b), por la cual T1 se alinea con LHA1 y T2 se alinea con RHA1 para insertar la porción de la construcción de ADN entre LHA1 y RHA1, incluyendo RHA2, en el elemento genético entre T1 y T2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3'; y

(d) permitir que el elemento genético de (c) experimente una recombinación autohomóloga, por la cual T3 se alinea con RHA2 para eliminar la porción del elemento genético entre T3 y RHA2, para formar un microorganismo que comprende un elemento genético que comprende 5-T3-IS1-T2-3', de manera que T1 se reemplaza por IS1 en el elemento genético.

2. El método de la reivindicación 1(b)(i), en donde (c) va seguido de una etapa de selección para la expresión de PS1 y contra la expresión de CS1 y (d) va seguido de una etapa de selección contra la expresión de CS2.

3. El método de la reivindicación 1(b)(i), en donde CS1 y CS2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en pheS* upp, sacB, tetAR, thyA, ccdB, lacY, rpsL, codA, pyrE, HSTK (thiK), gatA-1, y mazF; y PS1 se selecciona del grupo que consiste en catP, tetA(C), tetM, aad9, aadA, aadA2, y ermB.

4. El método de la reivindicación 1(b)(ii), en donde (c) va seguido de una etapa de selección para la expresión de PS1 y contra la expresión de CS1.

5. El método de la reivindicación 1(b)(ii), en donde CS1 se selecciona del grupo que consiste en pheS* upp, sacB, tetAR, thyA, ccdB, lacY, rpsL, codA, pyrE, HSTK (thiK), gatA-1, y mazF; y PS1 se selecciona del grupo que consiste en catP, tetA(C), tetM, aad9, aadA, aadA2, y ermB.

6. El método de la reivindicación 1, en donde LHA1 es más largo que RHA2.

7. El método de la reivindicación 6, en donde LHA1 es igual o mayor que aproximadamente 1000 pares de bases de longitud y RHA2 es igual o menor que aproximadamente 300 pares de bases de longitud.

8. El método de la reivindicación 1, en donde LHA1 y RHA1 son cada uno más largo que RHA2.

9. El método de la reivindicación 8, en donde LHA1 y RHA1 son cada uno igual o mayor que aproximadamente 1000 pares de bases de longitud y RHA2 es igual o menor que aproximadamente 300 pares de bases de longitud.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es una bacteria, arquea, virus u hongo.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el microorganismo pertenece al género Clostridium, Acetobacterium, Moorella, Butyribacterium, Blautia, Oxobacter, Thermoanaerobacter, Escherichia, Klebsiella, Zymomonas, Citrobacter, Enterobacter, Salmonella, Serratia, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus, Saccharomyces, Pichia, Candida Hansenula, Yarrowia, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lipomyces, Aspergillus, trichoderma, Exophila, Mucor, Cladosporium, Phanerochaete, Cladiophilalophora, Paecilomyces, Scedosporium, Ophistoma, Bacillus, Oligotropha, Pseudomonas, Carbophilus, Hydrogenophaga, Mycobacterium, Zavarzinia, Cupravidus, Senechocystis, Chloroflexus, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylosphera, Methylocaldum, Methylocystis, Methylosinus, Methanobacterium, Methanococcus, Methanogenium, Methanosarcina, Methanoshera, Methanothermobacter, Methanotrix, Corynebacterium, Acinetobacter, Actinomyces, Bacteriodes, Burkholderia, Brevibacterium, Pyrococcus, Geobacter, Geobacillus, Paenibacillus, Mycobacterium, Rhodopseudomonas, Thermatoga, Thermoanaerobacter, Streptomyces, Rhodobacter, Rhodococcus, Peptococcus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Fusobacterium, Campylobacter, Veillonella, Aquincola, Arthrobacter, Moraxella, o Psychrobacter.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el microorganismo es Clostridium autoethanogenum.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la construcción de ADN es un plásmido.