KR101229525B1

KR101229525B1 - 1,2-프로판디올을 생산하기 위한 개량형 미생물

Info

Publication number: KR101229525B1
Application number: KR1020067014050A
Authority: KR
Inventors: 이사벨 메이니알-살레스; 벤자민 곤잘레즈; 필립 소우카일레
Original assignee: 메타볼릭 익스플로러
Priority date: 2004-01-12
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2013-02-04
Also published as: DK1704230T3; ATE440135T1; RU2006129295A; ZA200605440B; CN1910278B; PL1704230T3; JP4613177B2; EP1704230A2; JP2007517517A; CA2547695A1; KR20060123490A; PT1704230E; EP2192180A1; US20070072279A1; FR2864967B1; DE602005016073D1; BRPI0506790A; WO2005073364A2; WO2005073364A3; BRPI0506790B1

Abstract

본 발명은 선택 압력 하에 단순 탄소원을 함유하는 적절한 배양 배지에서 메틸글리옥살 (프로파날)을 젖산염의 전환과 관련된 유전자 1종 이상 및 유전자 tpiA가 결실된 초기 박테리아 균주를 생장시켜, 상기 균주 중에서 DHAP로부터 메틸글리옥살로, 이어서 1,2-프로판디올로의 생체 전환에 관련된 유전자 1종 이상을 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖는 개량형 유전자로 개량시키고, 이어서 이렇게 생성된 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖는 미생물의 개량형 균주 또는 균주류를 선별하고 분리하는 것을 포함하는, 단순 탄소원의 신진 대사에 의하여 1,2-프로판디올을 생산하도록 개량시킨 미생물 균주의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 생성된 개량형 미생물 및 초기 미생물, 그리고 상기 개량형 미생물을 배양함으로써 1,2-프로판디올 및 가능한 경우 아세톤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

1,2-프로판디올, 단순 탄소원, 내인성 단백질

Description

1,2-프로판디올을 생산하기 위한 개량형 미생물 {ADVANCED MICROORGANISM FOR PRODUCING 1,2-PROPANEDIOL}

본 발명은 1,2-프로판디올을 생산하기 위한 개량형 미생물의 신규한 제조 방법과, 이로 인하여 생성되는 개량형 미생물 및 1,2-프로판디올을 제조하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜, 즉 C3 디알코올은 화학적으로 널리 사용되고 있다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액상 계면 활성제, 냉각제, 비행기용 재빙액 및 부동액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 1993-1994년 이래로 프로필렌 유도체보다 더 독성이 있다고 인식되어 있는 에틸렌 유도체의 대체물로서 그 사용이 증가되고 있다.

1,2-프로판디올은 현재 많은 양의 물을 소비하는 산화 프로필렌 수화법을 이용하는 화학적 방법에 의하여 생산되고 있다. 산화 프로필렌은 에피클로르하이드린을 이용하는 공정과 하이드로퍼옥사이드를 이용하는 공정의 두 가지 공정에 의하여 생산될 수 있다. 양쪽 경로 모두 매우 독성이 강한 물질을 사용한다. 또한, 하이드로퍼옥사이드 공정은 ter-부탄올 및 1-페닐 에탄올 등의 부산물을 생성한다. 프로필렌의 생성 공정이 수익성을 가지기 위해서는 이러한 부산물에 대한 용도를 모색하여야 한다. 화학적 공정은 일반적으로 라세미 1,2-프로판디올을 생산하는데, (R)1,2-프로판디올과 (S)1,2-프로판디올의 두 가지 입체이성질체 각각은 일정한 용도에 중요하다.

1,2-프로판디올을 화학적으로 합성하는 상기 방법의 단점은 생물학적 생산 공정을 더 유리한 대체 방법으로 만들어 준다. 여러 미생물은 해당 과정에서 신진 대사되는 글루코스 또는 자일로스 등의 당으로부터 천연적으로 (S)1,2-프로판디올 또는 (R)1,2-프로판디올을 (S)1,2-프로판디올을 생산할 수 있거나, 또는 데옥시헥소스로부터 (S)1,2-프로판디올을 생산할 수 있다 (Cameron D.C. et coll (1998)Biotechnol. Prog.). 가장 성능이 좋은 미생물에는 클로스트리디움 스페노이데스 (Clostridium sphenoides; Tran Din K. et al. 1986) 및 써모아나에로비움 써모사카롤리티쿰 (Thermoanaerobium thermosaccharolyticum; Altaras N. E. & Cameron D.C. 2001.)이 있다. 후자는 여러 종류의 당을 (R)1,2-프로판디올로 발효시킬 수 있는데, 그 수득량은 소비되는 글루코스 1 그램당 1,2-프로판디올 0.13 내지 0.28 g의 범위이다. 상기 두 가지 미생물 중에서 1,2-프로판디올을 합성하는 것을 담당하는 효소는 동정되지 않았고, 이용 가능한 유전자 툴이 부족하기 때문에 이들의 성능 개선에는 한계가 있다. 또한, 이. 콜라이(E. coli)가 자연적으로 1,2-프로판디올을 생산하지 않는다 하더라도, 이. 콜라이(E. coli)는 1,2-프로판디올의 생산에 필요한 모든 유전자를 함유하고 있다. 현재 1,2-프로판디올은 낮은 농도에서도 세포에 매우 치명적인 물질인 메틸글리옥살로부터 생산된다. 또한, 일반적으로 1,2-프로판디올을 생산하도록 유전자 변형된 이. 콜라이(E. coli) 균주를 이용하는 공정은 특히 US 6 303 352, US 6 087 140 및 WO 98/37204에 기재되어 있다. 상기 공정은 특히 플라스미드 중에서 자신의 유전자를 클로닝함에 의한 대사성 1,2-프로판디올 생산 경로 중에 관여하는 1종 이상의 효소를 과발현시키는 과정을 이용하기 때문에, 항생제를 이용한 선택 압력 (selection pressure)을 필요로 한다. 균주의 성능을 개선시키기 위하여, 일정한 내인성 유전자도 결실시킨다 (예를 들어 Alfaras N. E. & Cameron D. C. (2000) Biofechnol. Prog. 16, 940-946 : Alfaras N. E. & Cameron D. (1999) Appl. Env. Microb., 65, 1180-1185 참조).

두 가지 유용한 산물인 1,2-프로판디올과 아세톤을 함께 생산하는 개량형 미생물을 이용하는 방법은 현재까지 개시된 바 없었다.

본 발명은 선택 압력 하에 단순 탄소원을 함유하는 적절한 배양 배지에서 메틸글리옥살 (프로파날)을 젖산염으로 전환시키는 것에 관여하는 1종 이상의 유전자 가 결실되고 유전자 tpiA가 결실된 초기 박테리아 균주를 생장시켜, 상기 균주 중에서 DHAP로부터 메틸글리옥살로, 이어서 1,2-프로판디올로의 생체 전환을 담당하는 1종 이상의 유전자를 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖는 변화된 유전자로 개량시키고, 이어서 이렇게 생성된 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖는 미생물의 개량형 균주 또는 균주류를 선별하고 분리하는 단계를 포함하는, 단순 탄소원의 신진 대사에 의하여 1,2-프로판디올을 생산하기 위한 개량형 미생물 균주의 제조 방법에 관한 것이다.

유전자 tpiA는 DHAP를 글리세르알데히드 3-포스페이트로 생체 전환시키는 것을 촉매하는 삼탄당인산 이소머라제를 코딩한다. 상기 유전자를 결실시킨 이유는 메틸글리옥살을 충분한 양으로 합성하기 위함이다. 이론적으로, 유전자 tpiA를 결실시키면 세포에 의하여 신진 대사되는 글루코스의 탄소의 50%가, 디하이드록시 아세톤 포스페이트로부터 메틸글리옥살을 제조하는 데에 할당되도록 한다.

메틸글리옥살 (프로파날)을 젖산염으로 전환시키는 데 관여하는 적어도 1종의 유전자를 결실시키는 목적은 메틸글리옥살이 젖산염으로 전환되는 것을 억제하여, 상기 균주의 세포 기구가 초기 균주 및 생성된 개량형 균주에 의하여 생산되고 존재하는 메틸글리옥살을 1,2-프로판디올을 제조하는 데에 전부 이용할 수 있도록 하기 위함이다.

메틸글리옥살을 젖산염으로 전환시키는 것에 관여하는 유전자는 글리옥실라제 I (메틸글리옥살로부터 락토일 글루타티온의 합성을 촉매)을 코딩하는 유전자 gloA 또는 락트알데히드 데하이드로게나제 ((S)락트알데히드로부터 (S) 젖산염의 합성을 촉매)를 코딩하는 유전자 aldA 및 aldB일 수 있다. 상기 세 가지 유전자 gloA, aldA 및 aldB를 모두 초기 균주에서 결실시키는 것이 좋다.

1,2-프로판디올 생성 과정과 경쟁하는 대사 경로를 제거하기 위해서, NADH의 환원 등가물을 소비하는 천연 글루코스 발효 경로를 억제하도록 초기 균주에 추가 변형을 가하는 것이 유리하다.

특히, 피루베이트로부터 젖산염을 합성하는 것을 촉매하는 락테이트 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자 ldhA를 결실시키고, 아세틸-CoA로부터 에탄올을 합성하는 것을 촉매하는 알코올-알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 adhE 유전자를 결실시키는 것이 유리하다.

유사하게, 미생물이 피루베이트로부터 아세틸-CoA 및 NADH를 혐기성으로 생산하도록 하기 위하여, 피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 이용하도록 유발시키는 것도 가능하다. 이는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflA 및 pflB 유전자를 결실시키는 것에 의하여 달성될 수 있다.

그러므로 특정 실시 상태에 있어서, 초기 균주의 유전자 IdhA, pflA, pflB 및 adhE 중에 1종 이상을 제거하고, 바람직하게는 4개의 유전자 IdhA, pflA, pflB 및 adhE를 모두 제거한다.

또한 더욱 유리하게는, 본 발명의 초기 균주는 피루베이트를 아세트산염으로 혐기 대사시키는 것을 촉진하는 효소를 코딩하는 적어도 1종의 유전자를 함유할 것이다.

좋기로는, 상기 효소는 피루베이트가 아세틸-CoA 및 NADH를 생산하는 쪽으로 혐기 대사되도록 촉진한다. 더욱 좋기로는, 상기 효소는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체이다.

유리하게는, 피루베이트를 아세트산염으로 혐기 대사시키는 것을 촉진하는 효소를 코딩하는 상기 유전자는 NADH에 의한 억제에 대한 감수성이 감소되어 있다.

상기 유전자는 내인성 단백질을 코딩하는 내인성 유전자이거나, 내인성 또는 외인성 효소를 코딩하는 외인성 또는 이종 유전자일 수 있다.

NADH에 의한 억제에 대해 민감한 내인성 단백질을 코딩하는 내인성 유전자의 경우, 본 발명에 의한 개량 공정은 피루베이트를 아세트산염으로 혐기 대사시키는 것을 촉진하는 효소를 코딩하는 상기 유전자가 NADH에 의한 억제에 대한 감소된 감수성을 나타내는 개량형 효소를 코딩하는, 개선된 '1,2-프로판디올 합성 효소' 활성을 갖는 균주를 선별할 수 있게 한다.

본 발명의 또 다른 실시 상태에 따르면, 이종 유전자를 초기 균주에 도입하는 것이 가능한데, 상기 이종 유전자는 NADH에 의한 억제에 대한 감수성이 감소된 효소를 코딩하거나 본 발명의 개량 공정을 실행하여 감수성을 낮추게 한 민감 효소를 코딩한다.

또한, 글루코스가 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트로 직접 대사하는 것을 차단하여, 글루코스가 1,2-프로판디올 및 아세트산염으로 전환되는 것을 유도하기 위하여, 엔트너-두오도로프 경로 (Entner Doudoroff pathway)에 관여하는 첫번째 6-포스포-글루코네이드 데하이드라타제를 코딩하는 유전자 edd를 결실시키는 것이 유리하다.

아세틸-CoA 및 아세트산염을 아세톤으로 전환하는 것에 관련된 1종 이상의 효소를 코딩하는 1종 이상의 이종 유전자를 본 발명에 따른 개량 공정에 의하여 얻은 이미 분리해 둔 개량형 균주로 도입하여, 변형된 개량형 균주를 생산하는 것이 유리하다.

상기 새로운 변형은 유용한 부산물인 1,2-프로판디올과 아세톤을 생산하게 한다. 또한, 상기 변형은 1,2-프로판디올 생산 성능을 개선시키는 장점이 있다. 아세트산염은 낮은 농도 (15 g/ℓ)에서 박테리아 성장의 억제제이고, 혐기성 조건의 케모스탯에서 성장한 균주 성능의 개량을 빠르게 차단한다.

아세트산염을 아세톤으로 전환시키는 것을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자를 개량형 균주로 도입하면 케모스탯에서 성장하는 도중 잔여 아세트산염의 농도를 떨어뜨린다. 생산되는 아세톤은 아세트산염보다 성장 억제 효과가 훨씬 낮다. 이렇게 하여, 균주의 생장과 1,2-프로판디올의 생산을 촉진하는 것이다.

유리하게는 아세틸-CoA와 아세트산염의 전환에 관여하는 1종 이상의 효소를 코딩하는 이종 유전자 또는 유전자류는 씨. 아세토부틸리쿰 (C.acetobutylicum)에서 유래된다. 아세틸-CoA와 아세트산염의 아세톤으로의 전환에 관여하는 1종 이상의 효소를 코딩하는 유전자는 염색체 또는 염색체외적으로 발현될 수 있다. 염색체적으로 (chromosomically), 1 이상의 카피(copies)를 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 알려진 재조합 방법을 이용하여 게놈으로 도입할 수 있다. 염색체외적으로 (extrachromosomically), 복제 기점(起点), 복제 수 및 세포에서의 안정성이 다른 다양한 유형의 플라스미드로 유전자를 운반할 수 있다. 그들은 낮은 복제수와 엄격한 복제형인 플라스미드 (pSC101, RK2), 복제 수가 낮은 플라스미드 (pACYC, pRSF1010), 복제 수가 높은 플라스미드 (pSKbluescript11)에 대응하여, 1 내지 5 카피, 또는 20 카피 또는 500 카피 이상이 존재할 수 있다. 이 유전자들은 유도성 또는 비유도성의 상이한 길이의 프로모터를 사용하여 발현시킬 수 있다. 이 프로모터는 예를 들어, 프로모터 Ptrc, Ptac 또는 Plac, 또는 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 알려진 다른 프로모터일 수 있다. 표적 유전자의 발현은 메신저 RNA (Carrier & Keasling (1998) Biotechnol. Prog., 15, 58-64) 또는 단백질 (예컨대, GSTtags, Amersham Biosciences)을 안정화시키거나 불안정하게 하는 인자에 의하여 증가되거나 감소될 수 있다.

본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 이전에 얻은 변형된 개량형 균주는 선택 압력 하에 단순 탄소원을 함유하는 적절한 성장 배지 중에서 생장시켜서, 아세틸-CoA 및 아세트산염을 아세톤으로 전환시키는 것에 관여하는 1종 이상의 유전자가 상기 변형되고 개량된 균주 중에서 '아세톤 합성효소 활성'을 가지는 방향으로 개량되도록 유발시킨다. 그 다음 개선된 '1,2-프로판디올 합성 효소 활성' 및 개선된 '아세톤 합성 효소 활성'을 갖는 개량형 균주의 제2세대를 선별하고 분리한다.

또한, 본 발명은 전술하는 바와 같은, 또 후술하는 바와 같은, 그리고 실시예에 기재한 바와 같은 본 발명에 따른 초기 균주에 관한 것이다.

또한, 실시예에 기재한 바와 같은 본 발명의 방법에 의하여 얻을 수 있는 개선된 '1,2-프로판디올 합성 효소 활성'을 갖는 개량형 균주와 '개선된 아세톤 합성 효소 활성'을 더 갖는 개량형 균주의 제2세대에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 본 발명에 의한 개량형 균주를 단순 탄소원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 생장시킴에 의한 1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것인데, 그 이후 생산된 1,2-프로판디올과, 함께 생산될 수 있는 아세톤을 회수하고, 필요한 경우 정제할 수 있다.

본 발명에 의한 미생물의 초기 변형되고 개량된 균주는 1,2-프로판디올과 가능한 경우 아세톤을 생산할 수 있도록 전환되어 배양될 수 있는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.

당해 기술 분야에서 숙련된 자는 세포 생물학과 분자 생물학의 일반적인 지식에 의거하여 상기 미생물을 선별할 수 있고, 필요하다면 전술한 이. 콜라이(E. coli)의 유전자에 대응하는 상기 미생물의 유전자를 동정할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 '미생물 균주'라는 용어는 같은 종에 속하는 일련의 미생물로서 같은 종들 중에 적어도 1종의 미생물을 포함하는 것을 뜻한다. 따라서, 균주에 관하여 기재한 특성은 상기 균주의 미생물 각각에 적용된다. 균주의 미생물들 중 어느 하나에 관하여 기재한 특성은 상기 균주의 모든 미생물에게 상호 호환적으로 적용된다.

본 발명에 의하여 변형된 미생물은 박테리아, 효모 또는 곰팡이일 수 있고, 특히 다음의 종들 중 어느 하나일 수 있다: 아스퍼길루스 종 (Aspergillus sp.), 바실루스 종 (Bacillus sp.), 브레비박테리움 종 (Brevibacterium sp.), 클로스트리디움 종 (Clostridium sp.), 코리네박테리움 종 (Corynebacterium sp.), 에스체리키아 종 (Escherichia sp.), 글루코노박터 종 (Gluconobacter sp.), 수도모나스 종 (Pseudomonas sp.), 로도코커스 종 (Rhodococcus sp.), 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp.), 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.), 크산토모나스 종 (Xanthomonas sp.), 칸디다 종 (Candida sp.).

양호한 실시 상태에 있어서, 박테리아 균주는 에스체리키아 (Escherichia), 특히 이. 콜라이(E. coli)이다. 또 다른 실시 상태에 있어서, 박테리아 균주는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 균주, 특히 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)이다.

또 다른 실시 상태에 있어서, 효모 균주는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 균주, 특히 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)이다.

본 발명은 앞서, 아래에 그리고 실시예에서 이. 콜라이(E. coli)에 관하여 기재하고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 개량형 균주에서 결실시키거나 과발현시킬 수 있는 유전자는 주로 이. 콜라이(E. coli)의 유전자의 명칭을 이용하여 정의한다. 그러나, 상기 정의는 본 발명에 따르면 좀 더 포괄적인 의미이고, 다른 미생물의 대응 유전자도 포함하는 것이다. 이. 콜라이(E. coli)의 유전자의 유전자 은행 (GenBank)을 참조하여, 당해 기술 분야에서 숙련된 자가 이. 콜라이(E. coli) 외에 다른 박테리아 균주 중에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다.

상동 서열 및 그들의 상동성 비율을 동정하는 방법은 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 잘 알려져 있고, 특히 웹사이트에 표시된 디폴트 파라미터를 포함하는 웹사이트 http : //www. ncbi . nlm . nih . gov / BLAST / 상에서 이용될 수 있는 BLAST 프로그램을 포함한다. 예를 들어 웹사이트 상에 나타난 디폴트 파라미터를 포함하는 CLUSTALW (http : //www. ebi . ac . uk / clustalw /) 프로그램 또는 MULTALIN (http ://prodes. toulouse . inra . fr / multalin / cgi - bin / multalin . pl)을 이용하여 생성된 서열을 활용 (얼라인먼트)할 수 있다.

공지된 유전자에 관한 유전자 은행 (GenBank)을 참조하여, 당해 기술 분야에서 숙련된 자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 곰팡이, 포유류 및 식물 등에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다. 이렇게 일상적인 작업은 유리하게는 다른 미생물의 유전자로 서열을 정렬하여 측정되는 일치 서열을 이용하여 실시되고, 또 다른 유기체에서 클로닝될 수 있는 대응 유전자에 의하여 축퇴성 프로브를 설계하는 것에 의하여 실시된다. 상기 분자 생물학의 보통 기술은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 예컨대 문헌 [Sambrook et al. (1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)]에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 '결실(deletion)'이라는 용어는 유전자의 활성을 억제하는 것을 나타내고, 이 과정에 의하여 유전자는 '결실된' 상태라고 말한다. 상기 활성의 억제는 발현되지 않도록 (예를 들어, 발현에 필요한 프로모터의 모든 영역 또는 부분적인 영역을 제거) 또는 발현 산물이 그 기능을 상실하도록 (예를 들어, 관련 유전자의 코딩 부위를 제거), i) 관련 유전자의 발현 산물을 적절한 방법에 의하여 불활성화시키는 것, ii) 관련 유전자의 발현을 억제하는 것, iii) 관련 유전자의 적어도 한부분을 제거하는 것일 수 있다. 좋기로는, 유전자를 결실시키면 해당 유전자를 본질적으로 억제하는데, 상기 유전자는 본 발명에 따른 개량형 균주의 동정, 분리 및 정제를 용이하게 하는 선별 마커 유전자로 치환할 수 있다.

유전자는 좋기로는 상동 제조합에 의하여 불활성화된다 (Datsenko, K. A. ; Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 : 6640-6645). 요약하면, 불활성 프로토콜은 다음과 같을 수 있다: DNA의 선형 조각을 단편 (fragment)을 세포에 도입한다. 이 단편은 시험관내에서 얻은 것으로, 이 단편에는 유전자를 플랭킹하는 두 개의 영역과, 상기 두 개의 영역 사이에 배치된 선별 유전자 1개 이상 (일반적으로 항생제 내성 유전자)가 있다. 따라서, 상기 단편은 불활성화된 유전자를 포함한다. 세포를 재조합 과정을 거치게 하고, 통합시키고, 도입된 단편을 선별 배지에 플레이팅함으로써 선별한다. 본래 (nature) 유전자가 불활성화된 유전자로 치환되는 이중 재조합 과정을 거친 세포를 선별한다. 상기 프로토콜은 이중 재조합 과정의 검출 속도를 높이기 위해서, 양성 선별 시스템 및 음성 선별 시스템을 이용하여 변형시킬 수 있다.

상기 유전자들을 균주에 도입하기 위하여 이용되는 바람직한 기술에는 당해 기술 분야에서 숙련된 자에게 잘 알려진 전기 천공법이 있다. 요약하면, 전기 천공 프로토콜은 다음과 같을 수 있다: 해당 이종 유전자를 발현 벡터 중에서 프로모터와 종결자 사이에 클로닝한다. 상기 벡터는 항생제 내성 유전자를 함유하는 세포를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자를 포함하고 있고, 숙주 균주 중에서 유지될 수 있도록 하는 기능적인 복제 기점을 포함하고 있다. 상기 프로토콜은 벡터에 의하여 전기 천공법으로 전환되는 일렉트로컴피턴트 (electrocompetent) 숙주 세포를 제조하는 것을 필요로 한다.

본 발명에 따르면, 전기 천공법에 의하여 도입되는 유전자로는, 매우 강력한 생물학적 아세톤 생산자로 인지되어 있는 미생물인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)의 천연 아세톤 생산 경로 중 아세토아세테이트 카르복실라제, 코엔자임 A 트랜스퍼라제 및 티올라제를 각각 코딩하는 유전자 adc, ctfA 및 B, thl이 좋다.

본 발명에 의한 개량 공정은 대사 경로를 변형시킴에 의한 개량형 미생물의 제조 방법으로서, 좋기로는 다음의 단계를 포함한다.

a) 초기 미생물 세포를 세팅된 배지에서 배양하는 경우 다른 방법으로 생산되거나 소비되는 대사 산물의 소비나 생산을 억제하는 방법으로 초기 미생물을 얻기 위해 미생물을 변형시키는 단계와,

b) 개량형을 유발시키기 위하여 상기 세팅된 배지 상에서 얻은 초기의 변형된 미생물을 생장시키는 단계로서, 이 대 세팅된 배지는 개량에 필요한 공동 기질도 함유할 수 있는 단계와,

c) 필요한 경우, 첨가된 공동 기질을 사용하여 세팅된 배지 상에서 생장할 수 있는 변형된 미생물의 세포를 선별하는 단계.

상기 유형의 개량 공정은 특히 특허 출원 WO 04/076659에 기재되어 있고, 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다.

개량된 대사 경로는 1,2-프로판디올 합성 경로이고, 특히 적절한 경우 아세톤 합성 경로이다.

본 발명에 따른 '세팅된 배지 (set medium)'라는 용어는 미생물을 생장시키도록 채용되는 기지의 분자 조성으로 이루어진 배지를 나타낸다. 세팅된 배지는 필수적으로 대사 산물, 변형에 의하여 억제되는 소비 또는 생산이 없는 것이다.

본 발명에 따른 '공동 기질'이라는 용어는 유기 또는 무기일 수 있고, 기질과는 서로 상이하고, 반응에 참여하여 기질에 1종 이상의 원자를 제공하여 최종 산물을 생성시키는 물질을 나타낸다. 공동 기질은 기지의 돌연변이 발생 특성을 보유하지 않는다.

본 발명에 따른 '선택, 선별'이라는 용어는 배양 배지에서 부여된 희석 비율과 동등하거나 더 높은 성장율을 나타내는 미생물만을 보존하는 방법으로 희석율을 높임으로써 수행되는 연속적일 수 있는 성장 과정을 의미한다. 이러한 방법에서 보존된 미생물은 변형이 더 이상 성장에 영향을 주지 않는다.
본 발명에 따른 '개량형 유전자'라는 용어는 선별 후에 초기 서열과 적어도 1개의 아미노산이 다른, 개시 코돈과 정지 코돈 사이의 핵산 서열을 나타낸다.

본 발명에 따른 '개량형 단백질'이라는 용어는 선별 후에 초기 서열과 적어도 1종의 아미노산이 다른 아미노산 서열 (단백질 서열)을 나타낸다.

유전자와 단백질은 그들의 1차 서열에 의하여 동정될 수 있고, 또한 단백질군을 한정하는 서열 상동성 또는 서열 얼라인먼트 (alignment)에 의하여 동정될 수 있다.

PFAM 데이터베이스 (얼라인먼트의 단백질 패밀리 데이터베이스 및 숨겨진 마코프 모델 http ://www. sanger. ac.uk/Software/Pfam/)는 단백질 서열의 얼라인먼트를 대규모로 수집한 것이다. 각각의 PFAM은 복수의 얼라인먼트를 가시화하고, 단백질 도메인을 제시하며, 유기체 중의 분배를 측정하고, 다른 데이터베이스에 대하여 접근을 허용하고 기지의 단백질 구조를 가시화할 수 있게 해 준다.

COGs (단백질의 오르토로거스군 무리 http://www. ncbi . nlm . nih . gov / COG /)은 30 가지의 주요 계통 발생학계를 대표하는 43 전장 서열 게놈으로부터 유래된 단백질 서열과 비교함으로써 얻는다. 각각의 COG는 적어도 3 가지 계 (line)로부터 유래되고, 고대 보존 도메인을 동정할 수 있게 한다.

본 발명에 따른 '배양', '성장' 및 '발효'라는 용어들은 단순 탄소원을 함유하는 적절한 배양 배지 상에서 박테리아를 성장시키는 것을 나타내기 위하여 상호 교환하며 사용된다.

본 발명에 따른 '단순 탄소원'이라는 용어는 미생물, 특히 박테리아의 정상적인 성장을 뒷받침하기 위하여 당해 기술 분야에서 숙련된 자에 의하여 사용될 수 있는 모든 종류의 탄소원을 나타내며, 이는 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 자일로스일 수 있다. 가장 양호한 단순 탄소원은 글루코스이다.

본 발명에 따른 미생물의 배양 조건 (발효)은 당해 기술 분야에서 숙련된 자에 의하여 이미 밝혀져 있다. 특히, 박테리아는 20℃ 내지 55℃ 범위의 온도에서, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 온도에서, 그리고 씨. 글루타민 (C.glufamicum) 및 에스. 세레비지애 (S.cerevisiae)의 경우 바람직하게는 30℃에서, 이. 콜라이(E. coli)의 경우 약 34℃에서 발효된다.

발효는 일반적으로 적어도 1종의 단순 탄소원 및 필요한 경우 대사 산물의 생산에 필요한 보조 인자를 함유하는, 이용되는 박테리아에 적용되는 공지된 조성을 갖는 미네랄 배양 배지가 포함되어 있는 발효통에서 수행된다.

특히, 이. 콜라이(E. coli)를 위한 미네랄 배양 배지의 조성은 M9 배지 (Anderson,1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32 : 120-128), M63 배지 (Miller, 1992 ; A Short Course in Bacterial Genetics : A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) 또는 Schaefer 등에 의하여 정의된 것과 같은 배지 (1999, Anal. Biochem. 270 :88-96)의 조성과 유사하거나 동일할 수 있고, 특히 아래에 설명되어 있는 최소 배양 배지의 조성과 유사하거나 동일할 수 있다.

K₂HP0₄	1 g/ℓ
N.T.A	0.2 g/ℓ
미량 성분 용액^*	10 m/ℓ
(NH₄)₂S0₄	1 g/ℓ
NaCl	0.2 g/ℓ
NaHCO₃	0.2 g/ℓ
MgSO₄	0.2 g/ℓ
글루코스	20 내지 100 g/ℓ
질산나트륨	0.424 g/ℓ
티아민	10 mg/ℓ
FeSO₄	50 mg/ℓ
효모 추출물	4 g/ℓ
스펙티노마이신	100 mg/ℓ

배지의 pH는 수산화나트륨으로 7.4로 조절하였다.

^* 미량 성분 용액 : 시트르산 4 g/ℓ, MnS0₄ 3 g/ℓ, NaCl 1 g/ℓ, CoCl₂ 0.1 g/ℓ, ZnSO₄ 0.10 g/ℓ, CuSO₄ 10 mg/ℓ, H₃BO₃ 10 mg/ℓ, NaMoO₄ 10 mg/ℓ.

유사하게, 씨. 글루타미쿰 (C.glufamicum)용 미네랄 생장 배지 또한 BMCG 배지 (Liebl et al.,1989, Appl, Microbiol. Biotechnol. 32 : 205-210) 또는 Riedel 등에 의하여 정의되는 것과 같은 배지 (2001, J.Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 : 573-583)의 조성과 유사하거나 동일할 수 있다.

발효는 혐기성 방식으로 케모스탯에서, 즉 고정된 희석율에서, 고정된 농도의 탄소원을 함유하는 상기 최소 생장 배지를 계속 공급하고 질소로 가스를 제거하면서 수행하는 것이 좋다.

발효 공급 배지 중에서 탄소원의 농도는 잔여 탄소원 농도에 의하여 제한되는 영구적인 섭생에 이른 경우에만 증가하고, 며칠 동안 안정한 상태를 유지하였다.

배양 방식은, 변형된 균주에 의하여 1,2-프로판디올 생산 성능 및 성장을 촉진하고 개량형 미생물을 분리시키기 때문에 케모스탯 배양 방식이 좋다.

본 발명에 따른 개선된 '1,2-프로판디올 합성 효소 활성'이라는 용어는 DHAP를 1,2-프로판디올로 전환시키는 경로에 관여하는 모든 효소 활성을 개선시키는 것을 의미한다. 개량형 미생물에서 개선된 효소 활성은 동일한 배양 조건에서 대응하는 초기 미생물에 의하여 생산되는 양에 비하여, 개량형 미생물에 의하여 생산되는 1,2-프로판디올의 양을 증가시켰다.

본 발명에 따른 개선된 '아세톤 합성 효소 활성'이라는 용어는 아세트산염과 아세틸-CoA를 아세톤으로 전환시키는 과정에 관여하는 모든 효소 활성의 개선을 의미한다. 제2세대 개량형 미생물 중에서 개선된 효소 활성은 동일한 배양 조건에서 대응하는 개량형 변형 미생물과 비교하여, 제2세대 개량형 미생물에 의하여 생산되는 아세톤의 양을 증가시켰다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 공정에 의하여 얻은 개량형 균주의 개량형 유전자 및 상기 개량형 유전자에 의하여 코딩되는 개량형 단백질의 분리 및 특징에 관한 것이다. 이어서 상기 개량형 유전자는 대응하는 개량형 단백질을 생산하기 위하여, 상기 유기체 중에서 그 발현을 위한 적절한 조절 인자의 조절하에 숙주 세포에 도입될 수 있다.

케모스탯 배양 과정에서 개량형 미생물, 특히 균주 이. 콜라이(E. coli) MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana,ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 성능이 개선된 것은, 혐기성 조건, 즉 NADH가 풍부하게 생산되는 조건 하에서 기능적인 내인성 피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 선별할 수 있게 해 준다는 것을 암시하는 것이다. NADH를 방출하면서 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체는 오직 호기성 조건에서 기능하는 반면에, 피루베이트를 아세틸-CoA와 포르메이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 포르메이트 리아제는 혐기성 조건에서 작용한다는 사실이 알려져 있다 (Snoep J.L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993). 1,2-프로판디올의 생산을 위하여 제작된 이. 콜라이(E. coli)의 변형된 균주 상에서 피루베이트의 탈카르복실화에 의하여 NADH를 생산하기 위한 변형 중 한 가지는 피루베이트 포르메이트 리아제 활성을 코딩하는 유전자 pflA와 pflB가 결실된 것이다. 변형된 세포를 위한 유일한 가능성은 1 당량의 NADH를 생산하는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체에 의하여 피루베이트를 아세틸-CoA로 신진 대사하는 것이다. 변형되고 개량된 균주의 피루베이트 데하이드로게나제 복합체는 야생 균주의 피루베이트 데하이드로게나제 복합체보다 NADH에 덜 민감하고 특징적이다.

본 발명은 혐기성 조건에서 기능적이고 글리세르알데히드-3-포스페이트를 아세트산염으로 산화하여 2 당량의 NADH를 생산하는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 선별할 수 있게 해 준다. 상기 NADH 등가물은 디하이드록시아세톤-포스페이트를 1,2-프로판디올로 환원시키는 경로에 의하여만 재산화될 수 있다. NADH에 대해 감수성이 낮은 효소 복합체의 선별은 1,2-프로판디올을 고비율로 생산하는데 유리하다.

본 발명은 유리하게도 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 리포아미드 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자 lpd (http://genolist.pasteur.fr/Colibri에 공지된 야생형 서열)의 돌연변이 선별을 가능하게 해 준다. 특히, 알라닌 55를 발린으로 치환시키는 점 돌연변이의 존재를 확인하였다. 상기 효소는 NADH에 의하여 피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 상기 변형된 효소는 본 발명의 목적이다.

본 발명은 변형된 미생물, 특히 균주 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana,ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 성능을 개선하고, 또한 혐기성 케모스탯 배양 중에서 DHAP를 1,2-프로판디올로 전환시키는 과정에 관여하는 내인성 효소의 성능을 개선시키도록 한다. 상기 효소들의 개선은 성장율을 증가시키고 1,2-프로판디올의 최종 농도를 더 높인다.

본 발명에 따르면, 개량형 균주는 유전자 gldA의 개량을 포함하지 않는 것이 좋다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 유전자 gldA는 개량형 균주에서 결실되어 있다.

도 1: 본 발명에 의한 1,2-프로판디올 및 아세톤의 생산을 위하여 변형된 이. 콜라이(E. coli)의 균주의 신진 대사의 도.

표제:

LDH : 락테이트 데하이드로게나제

ADH : 알데히드-알코올 데하이드로게나제

PFL : 피루베이트 포르메이트 리아제

PDHc : 피루베이트 데하이드로게나제 복합체

도 2: 글루코스 상에서 케모스탯 배양 동안에 균주 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana,ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 개량 : 글루코스의 농도 (도 2a) 및 다른 물질 (도 2b).

도 3: NADH 농도가 증가하는 것에 대한 야생형 균주와 본 발명에 의한 개량형 균주의 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 효소 활성의 비교.

다음의 구체적인 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범 위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 글루코스의 발효에 의하여 1,2- 프로판디올과 아세트산염만을 생산할 수 있는 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ tpiA , ㅿ pflAB , ㅿ adhE , ldhA :: kana,ㅿgloA, ㅿ aldA , ㅿ aldB 의 변형 균주 제작

a) 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ tpiA :: cm 의 변형된 균주 제작

클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자 대부분을 결실시킴으로써 유전자 tpiA를 불활성화시켰다. 사용되는 기술은 문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl Acad Sci USA 97 : 6640-6645]에 기재되어 있다.

다음의 두 개의 올리고뉴클레오티드를 유전자 tpiA를 치환하는데 이용하였다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur. fr / Colibri /) 상의 참고 서열인 유전자 tpiA (서열 4108320 내지 4109087)의 서열 (4109007- 4109087)과 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3의 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자) (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in EscherichiacoliK-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci USA 97 : 6640-6645)을 포함하는

100개의 염기로 이루어진 DtpiAr (SEQ ID NO 1):

atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgtaCATATGAATATCCTCCTTAG.

2. - tpiA의 서열 (4108320- 4108400)에 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3에 의하여 운반되는 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자)을 포함하는

100개의 염기로 이루어진 DtpiAf (SEQ ID NO 2):

cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG.

올리고뉴클레오티드 DtpiAr와 DtpiAf를 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 사용하였다. 전기 천공법을 사용하여, 생성된 PCR 산물을, 발현된 시스템 λ 레드 (γ, β, exo)가 상동 재조합을 크게 촉진하는 균주인 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 내성 카세트가 삽입되었는지의 여부를 올리고뉴클레오티드 cdh 및 YIIQ를 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

cdh (SEQ ID NO 3) :

ggtgatgatagttatcgccg (41 07536 내지 4107555의 서열에 상동)

YIIQ (SEQ ID NO 4) :

cgtgccatcgacagcagtcc (4109599 내지 4109580의 서열에 상동)

그 다음 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여, 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주로 도입하였다 (Cheperanov P. P. & Wackernagel W. (1995) Gene disruption in Escherichia coli : TC^R and Km^R cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, gene, 158, 9-14). 42℃에서 계대 배양한 후에, 이전에 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 항생제 내성 카세트가 손실되었는지의 여부를 PCR 분석법에 의하여 검사하였다.

b) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿpflAB :: cm의 변형된 균주 제작

클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자 대부분을 제거함으로써 유전자 pflA 및 pflB를 불활성화시켰다. 사용되는 기술은 문헌 [Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)]에 기재되어 있다.

다음의 두 개의 올리고뉴클레오티드를 유전자 pflA 및 pflB를 치환하는데 이용하였다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 pflB (서열 950495 내지 952777)의 서열 (952235-952315)과 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3의 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자) (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci USA 97 : 6640-6645)을 포함하는

100개의 염기로 이루어진 DplfB r (SEQ ID NO 5):

ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtggccgtatcatcggtgaCATATGAATATCCTCCTTAG.

2. - 상기 유전자 pflA (949563 내지 950303의 서열)에 위치한 서열 (949470- 949550)에 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3에 의하여 운반되는 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자)를 포함하는

100개의 염기로 이루어진 DtplfAf (SEQ ID NO 6):

gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaa gttgccgCTGGAGCTGCTTCG.

플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 pflAB1과 pflAB2를 사용하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 생성된 PCR 산물을, 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소를 상동 재조합시키는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 pflAB1과 pflAB2를 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

pflAB 1 (SEQ ID NO 7) :

agacattaaaaafatacgtgcagctacccg (948462 내지 948491의 서열에 상동)

pflAB 2 (SEQ ID NO 8) :

gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (953660 내지 983689의 서열에 상동)

c) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB의 변형된 균주 제작

파지 P1으로 형질 도입하는 기술에 의하여 균주 MG1655 ㅿtpiA 중에서 클로람페니콜 내성 카세트로 유전자 pflA 및 pflB를 치환함으로써 상기 유전자를 결실시켰다. 상기 프로토콜은 (i) 균주 MG1655 ㅿpflAB ::cm 중에서 파지 용해물(lysate)을 제조하는 단계와, (ii) 상기 파지 용해물에 의하여 균주 MG1655 ㅿtpiA에 도입시키는 단계로 이루어졌다.

파지 용해물의 제조

- LB 10 ㎖ + Cm 30 ㎍/㎖ + 글루코스 0.2% + CaC1₂ 5 mM 중에서 균주 MG1655 (ㅿpflAB ::cm)을 밤새 배양하여 100 ㎕를 시딩 (seeding)한다.

- 37℃에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션한다.

- 야생 균주 MG1655 (약 1 x 10⁹ 파지/㎖) 상에서 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕를 첨가한다.

- 세포가 용해될 때까지 37℃에서 3시간 동안 진탕시킨다.

- 클로로포름 200 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.

- 10분 동안 4500 g으로 원심분리하여 세포 조직파편을 제거한다.

- 무균 튜브에 상징액을 옮기고 클로로포름 200 ㎕를 첨가한다.

- 용해물을 4℃에서 보관한다.

형질 도입

- LB 배지 중에서 밤새 배양한 균주 MG1655 (ㅿ tpiA) 5 ㎖를 10분 동안 1500 g로 원심 분리한다.

- 10 mM MgS0₄, 5 mM CaCl₂ 2.5 ㎖중에 세포 펠릿 (pellet)을 현탁한다.

- 대조군 튜브 : 세포 100 ㎕

균주 MG1655 (ㅿpflAB ::cm)의 파지 P1 100 ㎕

- 튜브 실험 : 세포 100 ㎕ + 균주 MG1655 (ㅿpflAB ::cm)의 파지 P1 100 ㎕

- 진탕하지 않으면서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.

- 각 튜브에 1M의 구연산나트륨 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱한다.

- LB 1 ㎖를 첨가한다.

- 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.

- 튜브를 3분 동안 7000rpm으로 원심분리한 후에 LB + Cm 30 ㎍/㎖ 접시 상에 플레이팅한다.

- 37℃에서 밤새 인큐베이션한다.

균주의 검증

그 다음 항생제 내성 형질전환주를 선별하고, 또한 균주 ㅿpflAB::cm 중에 유전자 tpiA가 결실되었는지 여부를 검사하기 위하여 (i) 올리고뉴클레오티드 pflAB1와 pflAB2, 및 (ii) cdh와 YIIQ를 이용하여 PCR 분석함으로써, (ㅿpflAB ::cm)을 함유하는 영역이 삽입되었는지를 검사하였다. 생성된 균주는 MG1655 (ㅿpflAB::cm, ㅿtpiA)라고 명명하였다.

전술한 바와 같이, 이어서 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서 계대 배양한 후에, 항생제 내성 카세트의 손실 여부를 앞서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 분석하여 검사하였다. 생성된 균주는 MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB라고 명명하였다.

d) 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ adhE :: cm 의 변형된 균주 제작

전술한 바와 같이, 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 제거함으로써 유전자 adhE를 불활성화시켰다.

다음의 두 가지 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결실을 수행하였다.

1. - 사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 adhE (서열 1294669 내지 1297344)의 서열 (1297263 - 1297343)과 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3의 클로람페니콜 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자) (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))을 포함하는

100개의 염기로 이루어진 DadhE r (SEQ ID NO 9):

atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactCATATGAATATCCTCCTTAG

2. - 상기 유전자 adhE의 서열 (1294694 - 1294774)에 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 DadhEf 염기 (SEQ ID NO 10):

caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtcaaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG.

플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 DadhEr과 DadhEf를 사용하였다. 이어서 전기 천공법을 사용하여 생성된 PCR 산물을 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합을 허용하는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 ychGf 및 adhECr을 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

ychGf (SEQ ID NO 11) :

ggctcattgcaccaccatccag (1294357 내지 1294378의 서열에 상동)

adhECr (SEQ ID NO 12) :

gaaaagacgcgctgacaatacgcc (1297772 내지 1297749의 서열에 상동)

e) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE의 변형된 균주 제작

파지 P1으로 형질 도입하는 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여 전술한 바와 같이 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB 중에서 유전자 adhE를 결실시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 adhE::cm 상에서 얻어, 상기 용해물을 이용하여 균주 MG1655 ㅿtpiAㅿpflAB의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 adhE의 돌연변이를 확인하기 위하여 올리고뉴클레오타이드 ychCf 및 adhECr을 이용하고, 또한 균주 ㅿadhE::cm 중에서 유전자 pflA 및 B, 그리고 tpiA가 제거되었는지 검사하기 위하여 (i) 올리고뉴클레오티드 pflAB1와 pflAB2, 및 (ii) cdh와 YIIQ를 이용하여, 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검증하였다. .

전술한 바와 같이, 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서 계대 배양한 후에, 항생제 내성 카세트의 손실 여부를 앞서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 분석하여 검사하였다. 생성된 균주는 MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE라고 명명하였다.

f) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana의 변형된 균주 제작

전술한 바와 같이 파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여, 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE 중에서 유전자 ldhA(1439878 내지 1440867에 결합)를 불활성화시켰다. 파지 용해물을 Clark D. P. (Bunch P. K., Mat-Jan F. and Clark D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli: Microbiology, 143,187-195.)에 의하여 제공되는 균주 E.coli K12 NZN11 ㅿpfl :: cam, ldhA ::kana를 사용하여 얻었다. 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE의 형질 도입은 균주 E.coli K12 NZN11 ㅿpfl :: cam, ldhA ::kana의 파지 용해물을 이용하여 수행하였다. 형질 도입체를 카나마이신 상에서 선별하여, 유전자 ldhA 중에 카나마이신 카세트가 삽입되었는지 여부를 올리고뉴클레오티드 hslJC 및 ldhAC2를 이용하여 검사하였다.

hslJC (SEQ ID NO 13) :

gccatcagcaggcttagccg (서열 1439345 내지 1439767에 상동)

ldhAC2 : (SEQ ID NO 14) :

gggtattgtggcatgtttaaccg (서열 1441007 내지 1441029에 상동)

생성된 균주는 MG1655 ㅿ tpiA , ㅿ pflAB , ㅿ adhE , ldhA :: kana라고 명명하였다.

g) 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ gloA :: cm 의 변형된 균주 제작

전술한 바와 같이, 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 유전자 gloA를 불활성화시켰다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 gloA (서열 1725861 내지 1726268)의 서열 (1725861 - 1725941)과 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 GLOAD f (SEQ ID NO 15):

atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcgatttttataccaaagtgctgggcatgaaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

2. - 상기 유전자 gloA (1725861 - 1726268)의 서열 (1726188 - 1726268)에 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 GLOA D R (SEQ ID NO 16):

ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgtaaccgtccggatcttccacaaacgcgaCATATGAATATCCTCCTTAG.

올리고뉴클레오티드 GLOADr과 GLOADf를 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 사용하였다. 그 다음, 전기 천공법을 사용하여, 생성된 PCR 산물을, 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합시키는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 Nem A C 및 Rnt C r을 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

NemAQd (SEQ ID NO 17) :

gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (서열 1725331 내지 1725361에 상동)

Rnt Cr (SEQ ID NO 18) :

gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (서열 1726765 내지 1726795에 상동)

h) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿ pfl AB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA의 변형된 균주 제작

전술한 바와 같이, 파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana 중에서 유전자 gloA를 불활성화시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 gloA::cm 상에서 얻어, 이 용해물을 이용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 gloA의 돌연변이를 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 NemAQd 및 Rnt Cr을 이용하고, 또한 균주 ㅿgloA::cm 중에서 유전자 pflA 및 B, tpiA, adhE 및 ldhA가 결실되었는지 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 pflAB1와 pflAB2, cdh와 YIIQ, ychCf를 이용하여 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검증하였다.

이어서, 전술한 바와 같이 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서 전기 천공법을 사용하여 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서 계대 배양한 후에, 카세트의 손실을 앞서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 분석하여 검사하였다. 생성된 균주는 MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA라고 명명하였다.

i) 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ aldA :: cm 의 변형된 균주 제작

클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 제거함으로써 유전자 aldA를 불활성화시켰다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 aldA (서열 1486256 내지 1487695)의 서열 (1486256 - 1486336)과 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 AldA D f (SEQ ID NO 19):

atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

2. - 상기 유전자 aldA (1486256 - 1487695)의 서열 (1487615 - 1487695)에 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 aldAD r (SEQ ID NO 20):

ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG.

플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 AldA D r과 aldAD f를 사용하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 생성된 PCR 산물을, 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합을 허용하는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 클로람페니콜 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 Ydc F C f 및 gapCCr을 이용하여 PCR 분석에 의하여 확인하였다.

Ydc F C f (SEQ ID NO 21) :

tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (서열 1485722 내지 1485752에 상동)

gapCCr (SEQ ID NO 22) :

cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (서열 1488195 내지 1488225에 상동)

h) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA의 변형된 균주 제작

파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여 전술한 바와 같이 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿglo A 의 유전자 aldA를 불활성화시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 ㅿaldA::cm 상에서 얻어, 이 용해물을 이용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿglo A 의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 aldA의 돌연변이를 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 Ydc F C f 및 gapCCr을 이용하고, 또한 균주 ㅿadhA::cm 중에서 유전자 glo A, pflA 및 B, tpiA, adhE가 각각 결실되었는지 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 NemAQd 및 Rnt Cr, pflAB1과 pflAB2, cdh와 YIIQ, ychCf와 adhECr, hslJC 와 IdhAC2를 이용하여 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검증하였다.

이어서, 전술한 바와 같이 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서 전기 천공법에 의하여 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서 계대 배양한 후에, 항생제 내성 카세트의 손실 여부를 앞서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 분석하여 검사하였다. 생성된 균주는 MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿadhA라고 명명하였다.

g) 이. 콜라이 ( E. coli ) MG1655 ㅿ aldB :: cm 의 변형된 균주 제작

클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 유전자 aldB를 불활성화시켰다.

두 가지 올리고뉴클레오티드를 이용하여 결실을 수행하였다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 aldB (서열 3752603 내지 3754141)의 서열 (3752603 - 3752683)과 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 AldB D f (SEQ ID NO 23):

tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttggtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

2. - 상기 유전자 aldB (3752603 내지 3754141)의 서열 (3754061 - 3754141)에 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 aldBD r (SEQ ID NO 24):

atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttccccctcaagttaaaagcccgctatgacaaCATATGAATATCCTCCTTAG.

플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 AldB D r과 aldB D f를 사용하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 생성된 PCR 산물을 전기 천공에 의하여 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합을 허용하는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 클로람페니콜 내성 카세트의 삽입을 올리고뉴클레오티드 aldB C f 및 YiaYCr을 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

aldB C f (SEQ ID NO 25) :

catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (서열 3752057 내지 3752095에 상동)

YiaYCr (SEQ ID NO 26) :

tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (서열 3754644 내지 3754674에 상동)

h) 이. 콜라이(E. coli) MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 변형된 균주 제작

전술한 바와 같이 파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 사용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB , ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, aldA 중에서 유전자 aldB를 불활성화시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 ㅿaldB::cm 상에서 얻어, 이 용해물을 사용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB , ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 aldB의 돌연변이를 검사하기 위하여 aldB C f 및 YiaYCr을 이용하고, 또한 균주 ㅿaldB::cm 중에서 유전자 glo A, pflA 및 B, tpiA, adhE, aldA가 각각 결실되었는지 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 NemAQd 및 Rnt Cr, pflAB1과 pflAB2, cdh와 YIIQ, ychCf와 adhECr, hslJC와 ldhAC2, Ydc F C f 및 gapCCr를 이용하여 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검증하였다.

이어서, 전술한 바와 같이 클로람페니콜 내성 카세트를 제거하였다. 이어서 전기 천공법을 사용하여 클로람페니콜 내성 카세트의 FRT 부위에 작용하는 FLP 재조합효소를 운반하는 플라스미드 pCP20을 재조합 균주에 도입하였다. 42℃에서 계대 배양한 후에, 항생제 내성 카세트의 손실 여부를 앞서 사용한 것과 동일한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 분석하여 검사하였다. 생성된 균주는 MG16555 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB라고 명명하였다.

실시예 2: 케모스탯 배양에서 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 개량 및 배양

균주 이. 콜라이(E. coli) MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB에 의하여 글루코스로부터 1,2-프로판디올의 생산을 최적화하기 위하여, 균주를 질산나트륨과 효모 추출액이 첨가된 최소 배양 배지 중에서 혐기성 조건하에 몇 주간 케모스탯에서 배양하였다.

배양 초기에, 배양 급수 탱크 (culture feed tank) 중의 초기 글루코스의 농도는 20 g/ℓ이었고, 희석율은 0.04^-1이며 연속적인 질소유량은 혐기성 조건을 확보할 만큼 유지하였다. 세포 농도 및 1,2-프로판디올과 아세트산염의 생산량은 낮았다. 배양 수 주 후에, 증가된 산물의 농도 및 성장, 그리고 규칙적인 섭생은 잔여 글루코스 농도 및 산물의 일정한 농도를 보이는 것이 특징이다 (도 2).

실시예 3: NADH에 대한 감수성이 낮은 개량형 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 특성

피루베이트 데하이드로게나제 복합체 (PDHc)가 NADH에 대한 감수성이 낮은 PDHc로 개량된 것은 시험관내에서 개량된 효소 활성을 분석함으로써, 그리고 야생형 PDHc의 유전자를 갖는 개량형 PDHc의 리포아미드 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자 (lpd) 중 하나의 서열과 비교함으로써 증명하였다.

a) 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 효소 활성 분석

균주 이. 콜라이(E. coli) MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 PDHc의 시험관내에서의 효소 활성 분석은 문헌 [Schwartz E. R. and Reed L. J. (1970) Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli, Biochemistry, 6,1434-1439]에 기재된 프로토콜을 이용하여 수행하였다.

세포 배양의 분취액 100 ㎖를 케모스탯 발효기로부터 미리 혐기성 후드에서 탈기 처리해 둔 작은 병 (vial)으로 회수하였다. 세포 현탁액은 6000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 펠렛은 pH 7.9의 50 mM의 인산칼슘 버퍼, 0.5 mM의 티아민 파이로포스페이트 약 100 ㎖ 중에서 재현탁하고, 6000 rpm에서 10분 동안 다시 원심 분리하였다. 동일한 조건으로 두 번 세척하였다. 세포 펠릿을 버퍼 800 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액은 얼음 상에서 각 사이클 사이에 2분의 쉬는 시간이 있는 4회 (30%에서 30초간) 처리 주기로 초음파 기구를 이용하여 세포 펠렛을 분쇄하였다. 세포 조직 파편은 13400 rpm에서 5분 동안 원심 분리함으로써 제거하였다. 상징액은 정제되지 않은 (crude) 세포 무함유 추출액이었다. 효소 분석을 방해할 수 있는 세포 무함유 추출액 중에 존재하는 염은 pH 7.9의 인산칼슘 버퍼, 0.5 mM의 티아민 파이로포스페이트으로 조정된 PD10 컬럼에 추출액을 전개시켜 제거하였다. 추출액은 전술한 것과 동일한 버퍼 3.5 ㎖로 용출하였다. 회수된 용출액은 정제되지 않은 세포 무함유 추출액이었다.

정제되지 않은 세포 무함유 추출액의 효소 활성은 먼저 NADH가 없는 상태에서 측정하고, 이어서 0.14 mM부터 2.7 mM로 NADH의 농도를 증가시키면서 측정하였다. 얻어진 결과는 도 3에서 이. 콜라이(E. coli)의 야생 균주에 대한 문헌에서 보고된 바와 비교하였다 (Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A. Teixeira de Mattos M. J. and Neijssel O. M. (1993) Differences in sensitivity to NADH of purified pyruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Laetococcus lactis, Azotobacter vinelandii and Escherichia coli: implications for theiractivity in vivo, FEMS microbiology Letters, 114,279-284).

도출된 결과는 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 PDHc의 NADH에 대한 감수성은 이. 콜라이(E. coli)의 야생 균주에 비하여 낮다는 것을 나타낸다. 비율 [NAD+]/[NADH]이 약 33인 경우, 야생 균주의 PDHc의 활성은 모두 억제되는 것으로 관찰되는 반면에, 개량형 PDHc의 활성은 80%인 것을 알 수 있었다.

b) 개량형 균주 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 리포아미드 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자 lpd의 서열 결정

LB 중에서 밤새 배양한 것에서 균주 이. 콜라이(E. coli) MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 염색체 DNA 1 ㎖를 추출하였다. 원심 분리 후에, 세포를 증류수로 세척하고, 94℃에서 5분 동안 열충격을 가하였다. 원심 분리 후에 상징액 중에서 염색체 DNA를 회수하였다. 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 리포아미드 데하이드로게나제 (E3)을 코딩하는 유전자 lpd(서열 127912 내지 129336)를 다음의 두 가지 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의하여 증폭시켰다.

AceEf (SEQ ID NO 27):

cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (서열 127504 내지 127532에 상동)

YacH r (SEQ ID NO 28):

aagttcaggagagccgccc (서열 127513 내지 129531에 상동)

유전자 lpd에 대응하는 2000 염기쌍을 갖는 PCR 산물을 얻고 서열분석하였다. 도출된 결과는 알라닌 55가 발린으로 치환된 점 돌연변이를 일으켰다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 개량형 균주 이. 콜라이 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 메틸글리옥살의 1,2-프로판디올로의 전환 경로에는 글리세롤 데하이드로게나제가 관여하지 않는다.

개량형 균주 이. 콜라이 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 개선된 성능이 유전자 gldA에 의하여 코딩된 글리세롤 데하이드로게나제의 개량 때문이 아니라는 것을 증명하기 위하여, 유전자 gldA가 결실된 개량형 균주 이. 콜라이 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB를 설계하였다.

a) 변형 균주 MG1655 ㅿ gldA :: cm 의 제작

실시예 1에 기재한 바와 같이 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 유전자 gldA를 불활성화시켰다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 gldA (서열 413552 내지 4136615)의 서열 (4135512 내지 4135592)과 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 gldA D f (SEQ ID NO 29):

2. - 상기 유전자 gldA (4135512 내지 4136615)의 서열 (4136535 - 4136615)에 상동인 영역 (소문자), 및

- 플라스미드 pKD3에 의하여 운반되는 클로람페니콜 항생제 내성 카세트의 증폭을 위한 영역 (대문자)를 포함하는

100개의 염기로 이루어진 gldA D r (SEQ ID NO 30):

atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgtgattaatcgtctgggcgaatacctgaagccCATATGAATATCCTCCTTAG.

올리고뉴클레오티드 gldA D r과 gldA D f를 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 사용하였다. 이어서, 전기 천공법을 사용하여 생성된 PCR 산물을, 전기 천공에 의하여 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합을 허용하는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 클로람페니콜 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 YijF D 및 TalCr을 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

YijF D (SEQ ID NO 31) :

gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (서열 4135140 내지 4135174에 상동)

TalCr (SEQ ID NO 32) :

cacgcatattccccattgccgggg (서열 4137216 내지 4137239에 상동)

2100 염기쌍으로 이루어진 PCR 산물은 야생형 유전자 및 결실된 유전자에서 생성하고, 클로람페니콜 내성 유전자로 치환하였다. 이렇게 하여 생성된 PCR 산물을 SalI 제한 효소를 사용하여 분해하였다. 야생형 PCR 산물에서 약 1000 염기쌍인 2개의 단편을 얻은 반면에, 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 PCR 산물은 분해되지 않았다.

b) 개량형 변형 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿgldA :: cm의 제작

개량형 균주 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 유전자 gldA 를 실시예 1과 같이 파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여 불활성화시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 ㅿgldA::cm로 얻어, 이 용해물을 사용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿglo A , ㅿaldA의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 gldA의 돌연변이를 검사하기 위하여 올리고뉴클레오티드 YijF D 및 TalCr을 이용하여 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검사하였다.

c) 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿgldA :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 배양

두 가지의 개량형 변형 균주 이. 콜라이 ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿgldA :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB를 조절되지 않은 pH에서 초기 글루코스 농도를 20 g/ℓ로 하고 나트륨 및 효모 추출액이 첨가된 최소 배양 배지 중에서 혐기성 조건 하에 10일 동안 배양하였다. 생성된 발효 산물의 프로파일은 유전자 gldA의 결실이 1,2-프로판디올의 산물을 전혀 감소시키지 않았음을 나타낸다 (표 1).

표 1: 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿgldA :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 10일 배양 후의 발효 산물 및 기질의 농도 비교

균주	최적 밀도	소비된 글루코스 (g/ℓ)	메틸글리옥살 (g/ℓ)	아세트산 (g/ℓ)	1,2- 프로판디올 (g/ℓ)
이. 콜라이(E. coli) ^MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE,* ldhA :: kana , ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, *ㅿgldA ::* cm	1.5	7.3	1.2	2.1	1.7
이. 콜라이(E. coli) ^MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE,* ldhA :: kana , ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿ aldB	1.9	9.6	1.4	1.9	1.2

실시예 5: 개량형 균주 이. 콜라이 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB 중에서 6-포스포-글루코네이트 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자 edd의 결실에 의한 글루코스의 1,2-프로판디올로의 전환 수율의 개선

a) 변형 균주 MG1655 ㅿ edd :: cm 의 제작

실시예 1에 기재한 바와 같이 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입하고 문헌 [Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. (2000)]에 기재된 기술을 이용하여 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 유전자 edd를 불활성화시켰다.

1. - 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) 상의 참고 서열인 유전자 edd (서열 1930817 내지 1932628)의 서열 (1930817 내지 4)과 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 edd D f (SEQ ID NO 33):

ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgcaaggcgctgaataattcacgtcctgttcGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

2. - 상기 유전자 edd (1930817 내지 1932628)의 서열 (1932548 -1932628)에 상동인 영역 (소문자), 및

100개의 염기로 이루어진 edd D r (SEQ ID NO 34):

atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatCATATGAATATCCTCCTTAG.

플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 내성 카세트를 증폭시키기 위하여 올리고뉴클레오티드 edd D r과 edd D f를 사용하였다. 그 다음, 전기 천공법을 사용하여, 생성된 PCR 산물을, 발현된 효소 레드(Red) 재조합 효소가 상동 재조합을 허용하는 균주 MG1655 (pKD46)로 도입하였다. 이어서 항생제 내성 형질전환주를 선별하고 내성 카세트의 삽입 여부를 올리고뉴클레오티드 eda d 및 zwf r을 이용하여 PCR 분석에 의하여 검사하였다.

Eda d (SEQ ID NO 35) :

CCCCGGAATCAGAGGAATAGTCCC (서열 1930439 내지 1930462에 상동)

Zwf r (SEQ ID NO 36) :

GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (서열 1932968 내지 1932996에 상동)

b) 개량형 변형 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm의 제작

실시예 1과 같이 파지 P1 기술 (프로토콜 c 참조)을 이용하여 개량형 균주 MG 1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 유전자 edd 를 불활성화시켰다. 파지 P1의 용해물을 균주 MG1655 ㅿedd::cm 상에서 얻어, 이 용해물을 이용하여 균주 MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿglo A , ㅿaldA, ㅿaldB의 형질 도입을 수행하였다. 유전자 edd의 돌연변이를 검사하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 eda d 및 zwf r을 이용하여 클로람페니콜 내성 형질 도입체를 검증하였다.

c) 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 배양

두 가지의 개량형 변형 균주 이. 콜라이 ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB를 조절되지 않은 pH에서 초기 글루코스 농도를 20 g/ℓ로 하고 질산나트륨 및 효모 추출액이 첨가된 최소 배양 배지 중에서 혐기성 조건 하에 10일 동안 배양하였다. 생성된 발효 산물의 프로파일은 유전자 edd의 결실이 글루코스의 1,2-프로판디올로의 전환 수율을 0.13 g/g에서 0.35 g/g로 증가하도록 유도하였음을 나타낸다 (표 2). 따라서, 개량형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB 중의 유전자 edd의 결실은 균주의 성능을 개선하였다.

표 2: 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB의 10일 배양 후의 발효 산물 및 기질의 농도 비교

균주	최적 밀도	소비된 글루코스 (g/ℓ)	메틸글리옥살 (g/ℓ)	아세트산 (g/ℓ)	1,2- 프로판디올 (g/ℓ)	Y 1,2- 프로판디올/글루코스 (g/ℓ)
이. 콜라이(E.coli)^* ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, *ㅿedd :: cm*	1.2	5	0.2	1.5	1.8	0.35
이. 콜라이(E.coli)^* ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB	1.9	9.6	1.4	1.9	1.2	0.13

실시예 6: 1,2- 프로판디올 및 아세톤을 생산할 수 있는 변형 균주 이. 콜라 이( E. coli ) ^* MG1655 ㅿ tpiA , ㅿ pflAB , ㅿ adhE , ldhA :: kana , ㅿ gloA , ㅿ aldA , ㅿaldB, ㅿ edd :: cm ( pSOS95T ) 의 제작

pSOS95T라 명명된 플라스미드는 티올라제 프로모터의 의존하에 아세토아세테이트 카르복실라제, 코엔자임 A 트랜스퍼라제 및 티올라제를 각각 코딩하는 4개의 유전자 adc, ctfA, ctfB, thl로 이루어진 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum)의 아세톤 오페론을 포함하는 이. 콜라이(E. coli)/씨. 아세토부틸리쿰 (C.acetobutylicum)에 대한 셔틀 발현 벡터이다. 상기 세 가지 효소는 아세틸-CoA와 아세트산염을 아세톤과 이산화탄소로 전환시키는 것을 촉매한다. 플라스미드 pSOS95T는 티올라제 프로모터와 유전자 ctfA 사이에 위치한 BamH1 부위에서, 티올라제를 코딩하는 씨. 아세토부틸리쿰 (C.acetobutylicum)의 유전자 thl의 플라스미드 pSOS95 (유전자 은행 기탁 번호 AY1876868) 중에 삽입함으로써 얻었다. 플라스미드 pSOS95T를 전기 천공법을 사용하여 개량형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 으로 도입하였다.

균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 의 일렉트로컴피턴트 세포는 LB 중에서 균주를 밤새 배양하여 제조하였다. 원뿔 플라스크에서 LB 10 ㎖에 씨딩(1/100)한 뒤 밤새 배양하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 550nm에서 배양의 광학 밀도값이 0.4 내지 0.6에 이르렀을 때, 배양액 1 ㎖를 취하여 원심 분리하였다. 세포를 물과 10% 글리세롤 용액으로 세척한 후, 10% 글리세롤 용액 0.05 ㎖ 중에서 재현탁시켰다. 제조된 플라스미드 pSOS95T 5 ㎕ (Qiagen, Hilden germany)와 함께 세포를 즉시 전기 천공 (25 ㎌, 200 Ω, 2.5 KV) (Gene Pulser, Biorad) 하였다. SOC 배지 중에서 37℃에서 표현형 발현 1시간 후에, 형질 도입체를 37℃에서 카르베니실린 100 ㎍/㎖으로 아가 배지 상에서 선별하였다.

형질 도입체는 플라스미드 pSOS95T의 존재를 검사하고 충분히 효소 분해되고 있는지 확인하기 위하여 밤새 카르베니실린의 존재 하에 플라스미드 DNA (Qiagen, Hilden germany)를 추출하여 액상 배양하였다.

실시예 7: 1,2-프로판디올 및 아세톤을 생산할 수 있는 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm (pSOS95T)의 배양

개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm (pSOS95T)를 조절되지 않은 pH에서 초기 글루코스 농도를 20 g/ℓ로 하고 질산나트륨 및 효모 추출액이 첨가된 최소 배양 배지 중에서 혐기성 조건 하에 배양하였다 (표 3). 발효 산물의 분석은 개량형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm (pSOS95T)가 1,2-프로판디올, 아세트산염 및 아세톤의 혼합물을 생산하였다는 것을 나타내었다.

표 3: 개량형 변형 균주 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 및 이. 콜라이(E. coli) ^*MG1655 ㅿtpiA, ㅿpflAB, ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿgloA, ㅿaldA, ㅿaldB, ㅿedd :: cm 의 10일 배양 후의 발효 산물 및 기질의 농도 비교

균주	최적 밀도	소비된 글루코스 (g/ℓ)	메틸글리옥살 (g/ℓ)	아세트산 (g/ℓ)	1,2- 프로판디올 (g/ℓ)	아세톤 (g/ℓ)
이. 콜라이(E.coli)^* ㅿtpiA, ㅿ pflAB , ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿ gloA , ㅿaldA, ㅿ aldB , *ㅿedd ::* cm ( pSOS95T )	1.4	4.8	0.3	1.3	1.6	0.1
이. 콜라이(E.coli)^* ㅿ tpiA , ㅿ pflAB , ㅿadhE, ldhA :: kana, ㅿ gloA , ㅿaldA, ㅿ aldB , ㅿ *edd* :: cm	1.2	5	0.2	1.5	1.8	/

참조 문헌

<110> Metabolic Explorer <120> Evolved micro-organism for the Production of 1,2-propanediol <130> KP-CH-066841 <150> PCT/FR 0400214 <151> 2004-01-12 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 1 atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac 60 gagctggttt ctaacctgcg tacatatgaa tatcctcctt ag 102 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 2 cttaagcctg tttagccgct tctgcagctt taacgattac tgcgaaggcg tcagctttca 60 gagaagcacc accaaccagc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 3 ggtgatgata gttatcgccg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 4 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 5 ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc 60 cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag 100 <210> 6 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 6 gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg 60 gcaactcaat aaagttgccg ctggagctgc ttcg 94 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 7 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 8 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210> 9 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 9 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60 cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 10 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 10 caataacgaa tgatagcaat tttaagtagt taggaggtga aaaatgctgt caaaaggcgt 60 attgtcagcg cgtcttttca tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 11 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 12 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 13 gccatcagca ggcttagccg 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 14 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 15 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 15 atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60 accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 16 ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc 60 cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 100 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 17 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 18 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <210> 19 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 19 atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga 60 gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210> 20 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 20 ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc 60 tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 21 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 22 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <210> 23 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 23 tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta 60 atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 24 atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag 60 ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag 100 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 25 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 26 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 27 cgcgtgatcg acggtgctga tggtgcccg 29 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 28 aagttcagga gagccgccc 19 <210> 29 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 29 gttattccca ctcttgcagg aaacgctgac cgtactggtc ggctaccagc agagcggcgt 60 aaacctgatc tggcgtcgcg gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 30 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 30 atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60 ctgggcgaat acctgaagcc catatgaata tcctccttag 100 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 31 gcctggattt gtaccacggt tggtggaacg gcggg 35 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 32 cacgcatatt ccccattgcc gggg 24 <210> 33 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 33 ttaaaaagtg atacaggttg cgccctgttc ggcaccggac agtttttcac gcaaggcgct 60 gaataattca cgtcctgttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 34 atgaatccac aattgttacg cgtaacaaat cgaatcattg aacgttcgcg cgagactcgc 60 tctgcttatc tcgcccggat catatgaata tcctccttag 100 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 35 ccccggaatc agaggaatag tccc 24 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Other information : synthetic oligonucleotide <400> 36 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29

Claims

선택 압력 하에 단순 탄소원을 함유하는 배양 배지에서 메틸글리옥살을 젖산염으로 전환시키는 데 관여하는 gloA, aldA 및 aldB 로부터 선택되는 유전자 1종 이상 및 유전자 tpiA가 결실된 초기 균주를 생장시켜, 상기 균주에서 DHAP로부터 메틸글리옥살로 이어서 1,2-프로판디올로의 생합성 경로가, 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖도록 개량시키고, 이어서 이렇게 생성된 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성을 갖는 미생물의 개량형 균주 또는 균주류를 선별하고 분리하는 단계를 포함하는, 단순 탄소원의 신진 대사에 의하여 1,2-프로판디올을 생산하도록 개량시킨 미생물 균주의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 초기 균주는 유전자 gloA, aldA, aldB 및 tpiA를 결실시킨 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 초기 균주는 유전자 ldhA, pflA, pflB, adhE 및 edd를 더 결실시킨 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 초기 균주는 피루베이트를 아세트산염으로 신진 대사하는 것을 촉진하는 효소인 피루베이트 데하이드로게나제 복합체를 구성하는 효소들을 코딩하는 유전자도 역시 1종 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 피루베이트 데하이드로게나제 복합체는 NADH에 의한 억제에 대한 감수성이 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 피루베이트 데하이드로게나제 복합체는 아세틸-CoA와 NADH가 생산되는 쪽으로 피루베이트의 신진 대사를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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제5항에 있어서, 상기 피루베이트 데하이드로게나제 복합체는 내인성 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 아세틸-CoA와 아세트산염을 아세톤으로 전환시키는 데 관여하는 효소 1종 이상을 코딩하는 이종 유전자 adc, ctfA, ctfB 및 thl 중 1종 이상을 개량형 균주에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 아세틸-CoA와 아세트산염의 전환에 관여하는 1종 이상의 효소를 코딩하는 이종 유전자 adc, ctfA, ctfB 및 thl 중 1종 이상은 씨. 아세토부틸리쿰 (C.acetobutylicum)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 개선된 변형 균주 중에서 아세틸-CoA와 아세트산염을 아세톤으로 전환시키는 데 관여하는 adc, ctfA, ctfB 및 thl 중 1종 이상의 유전자가, 개선된 "아세톤 합성 효소" 활성을 갖도록 유발시키는 방향으로 개량되도록 하기 위하여, 제10항에 의하여 얻은 개선된 변형 균주를 단순 탄소원을 함유하는 배양 배지 중에서 선택 압력하에 배양시키고, 이어서 개선된 "1,2-프로판디올 합성 효소" 활성과 개선된 "아세톤 합성 효소" 활성을 갖는 상기 개량형 미생물의 제2 세대를 선별하고 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 초기 균주는 박테리아, 효모 또는 곰팡이인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 균주는 에스체리키아 (Escherichia), 이. 콜라이(E. coli) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium), 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제3항 내지 제7항, 제9항 중 어느 하나의 항에 의하여 정의된 초기 균주.
제1항, 제3항 내지 제7항, 제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 얻을 수 있는 개량형 균주.
제16항에 있어서, 상기 개량형 균주는 유전자 lpd가 점 돌연변이되어 알라닌 55가 발린으로 치환된 균주.
제16항에 기재된 개량형 균주를 단순 탄소원을 함유하는 배양 배지 중에서 배양하고, 생산된 1,2-프로판디올을 회수하는, 1,2-프로판디올의 제조 방법.
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