KR20190078965A

KR20190078965A - 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법

Info

Publication number: KR20190078965A
Application number: KR1020170180805A
Authority: KR
Inventors: 오민규; 이정헌
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-07-05

Abstract

본 발명은 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 공기가 제한된 조건에서 세포의 성장에 억제되는 요인들을 대사공학적 접근으로 해결하여 세포의 성장증가를 유도함으로써 고분자 단량체, 의료산업, 산업수지 등 산업적으로 다양하게 활용가능한 1,3-프로판디올을, 고효율로 생산할 수 있다.

Description

세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법{Recombinant microorganism for increased 1,3-propanediol producing ability by accelerating cell mass and Method for preparing 1,3-propanediol using the Same}

본 발명은 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.

1,3-프로판디올은 고분자 합성을 위한 단량체, 의료 약품, 산업 수지 등 산업적으로 다양한 활용적 가치가 있는 화학물이다. 이에 따라 매년 1,3-프로판디올 시장의 규모가 급속히 확장되고 있으며, 여러 산업체에서 관심을 기울이고 있다. 1,3-프로판디올은 석유화학 공정을 통한 생산방법과 미생물 발효를 통한 생산방법이 알려져 있으며, 석유화학공정을 이용한 생산이 주류를 이루어 왔다. 그러나 화석 연료 사용으로 인한 환경오염과 매장 한계에 따른 경제적 문제, 매장의 편향성으로 인해 발생되는 국제적 문제들로 인해, 미생물 발효를 통한 1,3-프로판디올 생산에 대한 관심이 대두되고 있다.

아울러, 바이오디젤 산업 발전으로 인해, 바이오디젤 생산 부산물로 글리세롤이 대량 생산되면서 글리세롤 가격은 급격히 하락하였다. 글리세롤은 미생물 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산시 필요한 대표적인 탄소원으로 사용되기 때문에, 경제적인 원료인 글리세롤을 이용한 미생물 발효를 통한 1,3-프로판디올 생산의 경제성이 높아지고 있다.

한편, 발효 조건 최적화와 미생물 대사회로 조작은 미생물 발효를 통한 특정 대사산물 생산성 향상을 위해 주로 수행되며, 그 중에서도 대사공학적인 관점에서 미생물의 대사 경로와 역할을 이해하고 목표하는 대사산물의 향상을 위하여 유전자를 과발현시키고, 미생물 게놈 상의 특정 유전자를 제거하는 방법은 대사공학 분야에서 가장 근본적인 접근이라 할 수 있다.

미생물은 발효 과정에서 목적하는 대사산물을 포함하여 여러 부산물을 동시에 생산한다. 이러한 부산물의 생산은 목적산물의 수율과 생산성을 감소시키고, 생산에 필요한 조요소의 접근을 제한하며, 과량 생산시 세포의 성장을 저해한다. 따라서 미생물 발효를 통한 목적산물 생산시에는 부산물을 제거하기 위한 노력이 수반되며, 이러한 노력 중 하나로, 게노믹스를 기반으로 특정 부산물 생산에 관여한 유전자를 찾고, 이를 유전자 제거기술을 통해 게놈 상에서 제거하는 방법이 사용된다. 목적산물의 생산능을 향상시키기 위해 생산에 직접적 또는 간접적으로 관련된 유전자를 플라스미드를 기반으로 클로닝하여 과발현시켜 목적산물로의 대사회로를 활성화시키는 연구가 진행되어 왔다.

기존에 사용되는 1,3-프로판디올 생산균주인 클렙시엘라 뉴모니에는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase)를 코딩하는 유전자 dhaB를 이용하여 글리세롤을 3-하이드록시프로피온알데하이드(3-HB)으로 산화시키고, 1,3-프로판디올옥시도리덕타아제(1,3-propanedioloxidoreductase)를 코딩하는 유전자 dhaT를 이용하여 1 몰의 NADH를 소비하면서 3-HB를 1,3-PDO(1,3-프로판디올)로 감소시킨다.

그러나, 클렙시엘라라 뉴모니에를 비롯한 1,3-프로판디올 생산균주는 발효 과정에서 2,3-부탄디올, 아세트산, 숙신산, 에탄올, 락틱산, 3-하이드록시 프로피온산 등의 부산물을 동시에 생산한다. 이러한, 부산물은 1,3-프로판디올을 분류 정제하는데 있어서 역시 많은 어려움을 야기한다. 특히, 2,3-부탄디올은 1,3-프로판디올과 끓는점이 비슷하고, 물리적 특성이 비슷해 1,3-프로판디올 분류 정제 작업에 많은 경제적 비용을 요구하며, 이는 전체 발효공정 비용의 50% 이상을 차지한다 (Z.L Xiu and A.P Zeng, Appl Microbiol Biotechnol,78. 917. 2008). 이러한 부산물의 생산은 1,3-프로판디올 생산의 수율을 감소시킬 뿐만 아니라, 1,3-프로판디올 생산에 사용될 조요소를 감소시키고, 배지의 산성화를 진행하는 등의 부작용을 야기한다. 이에 따라 1,3-프로판디올 생산 균주의 부산물 생산을 제거하기 위한 여러 노력이 진행되었다.

그 중, 1,3-프로판디올 생성균주에서 락틱산이나 에탄올 생산경로를 제거하여 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(G Yang et al., Appl Microbiol Biotechnol 73:1017, 2007; YZ Xu et al., Biotechnology and Bioenginee ring, 104(5):1,2009 ; Y Zhang et al., Metabolic Engineering 8:578, 2006), dhaT 오페론을 과발현시켜 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(J Hao et al., J Ind Microbiol Biotechnol 35:735, 2008; MY Seo et al., Appl Microbiol Biotechnol, 84:527, 2009), 부산물인 2,3-부탄디올 생산만을 제거하여 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(G Zhang et al., Appl Biochem Biotechnol, 168:116, 2012) 등이 있다.

하지만 이러한 노력들은 목표 대사산물인 1,3-프로판디올의 생산성 뿐만아니라 다양한 부산물의 생산성 역시 향상시킴으로써 그 목적을 달성하지 못했다. 아울러, 2,3-부탄디올 생산 관련 유전자의 제거는 세포의 성장을 크게 저해했으며 이에 따라 목표 대사산물인 1,3-프로판디올의 생산성 역시 감소되었고, 2,3-부탄디올을 제외한 다양한 부산물의 생산성을 역시 향상시켰다.

이에, 본 발명자들은 보다 경제적으로 1,3-프로판디올을 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니에 균주에서 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)(167번째 아미노산 서열)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환되거나, 이에 더하여 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA)가 결실되어 있는 경우, 클렙시엘라 뉴모니에 균주의 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올의 생산 수율이 현저하게 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 세포량 증가를 통해 1,3-프로판디올의 수율이 향상되도록 대사공학적으로 설계된 1,3-프로판디올을 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 1,3-프로판디올을 생산용 재조합 미생물을 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 공기가 제한된 조건에서 세포의 성장에 억제되는 요인들을 대사공학적 접근으로 해결하여 세포의 성장증가를 유도함으로써 고분자 단량체, 의료산업, 산업수지 등 산업적으로 다양하게 활용가능한 1,3-프로판디올을, 고효율로 생산할 수 있다.

도 1은 KMK-23M, KMK-50 및 KMK-51 균주의 시간에 따른 OD₆₀₀의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 KMK-23M, KMK-50 및 KMK-51 균주의 시간에 따른 1,3-프로판디올의 생성량을 나타낸 것이다.
도 3은 KMK-23M, KMK-50 및 KMK-51 균주의 세포 내 ATP 농도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 종래 개발된 1,3-프로판디올 생산균주와 비교하여, 공기가 제한된 조건에서 세포의 성장에 억제되는 요인들을 대사공학적 접근으로 해결하여 세포의 성장증가가 유도된 재조합 클렙시엘라 뉴모니에 균주를 제조하였으며, 상기 제조된 재조합 균주는 우수한 1,3-프로판디올 수율 및 생산성을 나타낸다.

이를 위해, 본 발명은 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서는 시트르산에 결합하여 효소의 활성을 저해하여 세포의 성장을 저해하는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (NADH)의 결합을 저해하기 위하여 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)(167번째 아미노산 서열)을 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환하였다.

이때, 상기 gltA 유전자는 하기 서열번호 1로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 혐기조건하에서 호기조건에서 발현하는 유전자들의 발현을 억제하는 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA)를 추가로 결실시킴으로써 세포의 성장 억제 요인을 제거하였다.

또한, 본 발명의 일 양태에서는 상기 1,3-프로판디올 생산용 미생물로 클렙시엘라 뉴모니에를 사용하였으며, 폴메이트 아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(pflB), 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(wabG), 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ldhA), α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(budA), 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자(dhaD), 글리세롤 키나아제를 코딩하는 유전자(glpK)가 결실되어 있고, 만니톨 업테이크에 관여하는 포스포트랜스퍼라아제 시스템 만니톨-특이 트랜스포터(phosphotransferase system mannitol-specific transporter)를 코딩하는 유전자(mtlA)의 발현을 21~98% 감소시키기 위하여 상기 mtlA 유전자를 변이시킨 것을 사용하였다(KMK-23M, 특허출원 제10-2017-0163026호 참조).

이때, 상기 mtlA의 유전자의 발현을 62% 감소시키기 위하여 변이시킨 것을 사용하는 것이 가장 바람직하며, 상기 mtlA의 변이 유전자는 서열번호 2로 표시될 수 있다.

본 발명에서 gltA 유전자 서열 편집 및 mtlA 유전자의 발현 조절은 CRISPR/Cas9 기반 유전체 교정법을 이용하였으나, 상기 방법에 한정하지 않는다. 일 예로 gltA 유전자 서열 편집은 기존의 미생물의 유전자상의 절단하고자 하는 염기서열을 Addgene (MA, USA)에서 구매한 pgRNA plasmid (#44251)에 클로닝하고 이와 함께 Cas9 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 미생물에 형질전환하여 목표 염기서열을 절단하였다. 또한, 원하는 염기서열을 포함하는 선형 DNA를 형질전환하여 미생물에 목표하는 염기서열을 편집하였다.

본 발명에서, "Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있다. Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 가이드 RNA와 함께 표적 특이적 뉴클레아제 활성을 가질 수 있는 것이라면 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

또한, Cas9 단백질은 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자에 의해 추가적인 도메인이 적절하게 연결될 수 있다.

또한, 상기 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만 아니라, 불활성화된 Cas9 (dCas9), 또는 Cas9 니케이즈 (nickase)와 같은 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 불활성화된 Cas9은 dCas9에 FokI 뉴클레아제 도메인을 연결한 RFN (RNA-guided FokI Nuclease), 또는 dCas9에 전사활성인자 (transcription activator) 또는 억제자 도메인 (repressor domain)을 연결한 것일 수 있고, 상기 Cas9 니케이즈는 D10A Cas9 또는 H840A Cas9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 Cas9 단백질은 그 유래에도 제한되지 않는다. 예컨대 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans) 유래일 수 있다.

본 발명에서 형질전환에 사용된 미생물의 예로는 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 초산균(Acetobacter) 속, 메탄자화균(methylotrophic bacillus), 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실린(Penicillium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 그로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속 등을 예시할 수 있으며, 클렙시엘라(Klebsiella)속인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 클랩시엘라 뉴모니에에서 특정 유전자를 제거하기 위해 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용하였다.

본 발명에서는 특허출원 제10-2017-0163026호에 기재된 균주 즉 폴메이트 아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(pflB), 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(wabG), 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ldhA), α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(budA), 글리세롤을 글리세롤 3-포스페이트로 전환하는데 관련된 유전자인 glpK 및 글리세롤을 다이하이드록시아세톤으로 전환하는데 관련된 유전자인 dhaD가 결실되어 있고, 포스포트랜스퍼라아제 시스템 만니톨-특이 트랜스포터(phosphotransferase system mannitol-specific transporter)를 코딩하는 유전자(mtlA)의 발현을 21~98% 감소시키기 위하여 상기 mtlA 유전자를 변이한 재조합 균주(KMK-23M)에서, 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환되고, 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA)가 추가로 결실되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 균주를 이용하여 1,3-프로판디올을 고수율로 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양에서는 수크로오스(Sucrose), 자일로오스(Xylose), 락토오스(Lactose), 이노시톨(Inositol), 만노오스(Mannose), 만니톨(Mannitol), 람노어스(Rhamnose), 솔비톨(Sorbitol), 갈락토오스(Galactose), 아라비노오스(Arabinose), 과당(Fructose), 아미그달린(Amygdalin), 말토오스(Maltose), 락테이트(Lactate), 글리세롤(Glycerol), 글루코네이트(Gluconate), 멜리비오스(Melibiose)를 탄소원으로 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

KMK -23M 균주의 제조

특허출원 제10-2017-0163026호에 기재된 방법에 따라 pflB 유전자, wabG 유전자, ldhA 유전자, budA 유전자, glpK 유전자 및 dhaD 유전자가 결실되어 있고, mtlA의 발현을 21~98% 감소시키기 위하여 상기 mtlA 유전자를 변이시킨 재조합 균주(KMK-23M) 균주를 제조하였다.

1,3-프로판디올 생산 균주로는 크렙시엘라 뉴모이에 균주(Klebsiella pneumoniae KCTC 2242)를 사용하였으며, 유전자 조작에 따른 균주명을 하기 표 1에 나타내었다.

Strain or plasmid	Description	Source
Strains
KCTC 2242	Wild-type K. pneumoniae, Ap^r trpR	Kroean Collection for Type Culture
KMK-01	KCTC 2242 ㅿwabG	Jung et al, 2014
KMK-02	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA	Jung et al, 2014
KMK-05	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿpflB	Jung et al, 2014
KMK-11	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿbudA	제10-2017-0163026호
KMK-12	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿpflB ㅿbudA	제10-2017-0163026호
KMK-21	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿpflB ㅿbudA ㅿdhaD	제10-2017-0163026호
KMK-22	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿpflB ㅿbudA ㅿglpK	제10-2017-0163026호
KMK-23	KCTC 2242 ㅿwabG ㅿldhA ㅿpflB ㅿbudA ㅿdhaD ㅿglpK	제10-2017-0163026호
KMK-23M2	KMK-23 mtlA expression level 98%	제10-2017-0163026호
KMK-23M4	KMK-23 mtlA expression level 62%	제10-2017-0163026호
KMK-23M6	KMK-23 mtlA expression level 43%	제10-2017-0163026호
KMK-23M8	KMK-23 mtlA expression level 21%	제10-2017-0163026호
Plasmids
pRedET	λphage red γ,β,α-producing vector, pBAD_promoter; ori101 Tet^r	Gene Bridges
707-FLP	Flp recombinase-producing vector; Psc101 ori cI1578 Tet^r	Gene Bridges
pKD4	FRT-flanked resistance cassette-involved vector; oriR γKm^r	Datsenko KA and Wanner BL, 2000
pZA31::MCS	Expression vector, Cm^R,p15Aori	Expressys
pZS21::MCS	Expression vector, Km^R,pSC101ori	Expressys
pZA-Cas9	pZA31MCS, but P_LtetO _-1::cas9-PsacB::sacB	MJ Heo et al., 2017
pZS-CRISPR	pZS21MCS, but P_LtetO _-1::TracerRNA-PsacB::sacB	MJ Heo et al., 2017
pZS-CRISPR mtlA	pZS21MCS, but P_LtetO-1::TracerRNA-5'UTR(mtlA)-PsacB::sacB	제10-2017-0163026호

(1) wabG 유전자 결실

클렙시엘라 뉴모니에 균주가 병원성을 야기하는 요인들 중에 세포막에 형성되어 있는 리포폴리사카라이드는 병원성 전달에 큰 기여를 한다(SG Jung et al., Appl Microbiol Biotechnol, 97:1997, 2013). 이 리포폴리사카라이드는 wab 오페론 내의 유전자 발현으로 구성되며, 그 중 wabG 유전자는 중심적인 역할을 한다. 따라서 생산균주의 병원을 제거하기 위해 클렙시엘라 뉴모니에 균주 게놈 상에 wabG 유전자(Genbank : AEK00461.1)는 제거되었으며, 클렙시엘라 뉴모니에 KMK-01로 명명하였다.

클랩시엘라 뉴모니에의 wabG 유전자를 제거하기 위해 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용하였다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에

균주에 형질전환 시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 wabG 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 wabG 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.

다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 클렙시엘라 뉴모니에를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃ 이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈 (L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다.

LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머를 제작하였다. wabG 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 wabG_con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.

(2) ldhA 유전자 결실

야생종의 클렙시엘라 뉴모니에 균주 발효시 주요 부산물로써 락틱산이 생산된다. 락틱산은 1,3-프로판디올과 생산에 필요한 NADH 사용에 있어 경쟁 관계에 있을 뿐만 아니라, 과도한 락틱산의 생산은 발효 배지의 산성화를 유도해 세포 성장 저해를 야기함으로 락틱산을 생산하는데 관련된 유전자인 ldhA 유전자

(GenBank: AEJ97914.1)는 상기 제조된 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-01 균주에서 제거되었고, 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-02 라 명명하였다.

KMK-01의 ldhA 유전자를 제거하기 위해 역시 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 ldhA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 ldhA 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.

다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-01 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃ 이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈(L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머를 제작하였다. ldhA 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 ldhA con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.

(3) budA 유전자 결실

부산물로써 생산되는 2,3-부탄디올은 섭취되는 글리세롤의 18%의 탄소흐름을 소비할 뿐만아니라, 발효 후 1,3-프로판디올 분리 정제 과정시 많은 비용을 소요하므로 2,3-부탄디올 생산을 제거하기 위하여, budA 유전자는 제거되었고, KMK-11 라 명명하였다.

KMK-02의 budA 유전자를 제거하기 위해 역시 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 budA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 budA 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.

다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-02 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃ 이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈(L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머를 제작하였다. budA 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 budA con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2 가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.

(4) pflB 유전자 결실

아세테이트 및 숙신산을 생산하는데 관련된 유전자인 pflB 유전자(GenBank: AEJ97463.1)는 상기 제조된 KMK-11 균주에서 제거하였고, 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-12 라 명명하였다.

KMK-11의 pflB 유전자를 제거하기 위해 역시 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 ldhA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 pflB 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.

다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-11 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃ 이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈(L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머를 제작하였다. pflB 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 pflB con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2 가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.

(5) glpK 및 dhaD 유전자 결실

글리세롤을 글리세롤 3-포스페이트로 전환하는데 관련된 유전자인 glpK(GeneBank: AEK00501.1) 및 글리세롤을 다이하이드록시아세톤으로 전환하는데 관련된 유전자인 dhaD(GeneBank: AEJ99991.1)는 상기 제조된 KMK-12 균주에서 제거하였고, 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-23 이라 명명하였다.

KMK-12의 glpK 및 dhaD 유전자를 제거하기 위해 역시 상기 방법과 동일한 방법으로 형질전환 시켰다.

(6) mltA 유전자 변이

mltA는 만니톨-특이 트랜스포터의 발현에 관여하는 유전자이다. 상기 KMK-23 균주의 만니톨-특이 트랜스포터 발현량을 약 90, 60, 40, 20% 발현양을 줄였고 이 균주들을 각각 KMK-23M2, M4, M6 및 M8이라 명명하였다.

KMK-23균주의 mtlA 유전자를 변이시키기 위하여 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을 이용하여 mtlA 5‘-UTR 서열을 획득하였다. KMK-23M2, M4(서열번호 1), M6, M8의 mtlA 5‘UTR 서열은 RBS calculator(http://www.denovodna.com/software/forward)에 의해 디자인 하였다(Iman F et al., Efficient search, mapping, and optimization of multi-protein genetic systems in diverse bacteria. Molecular Systems Biology. 10:731, 2014; Tian T and Howard M S., A predictive biophysical model of translational coupling to coordinate and control protein expression in bacterial operons, Nucleic Acids Research. 43(14):7137-7151, 2015; A. Espah Borujeni et al., Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites. Nucleic Acid Research. 42(4):2646-2659, 2013; Howard M Salis et al., Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27(10):946-952), 2009). 게놈 편집은 CRISPR/Cas9 게놈 편집 기술을 사용하였다(Jiang, W. Y et al., Nat Biotechnol. 31, 233-239, 2013; Qi, L. S et al., Cell 152. 1173-1183, 2013).

절단하고자 하는 염기서열을 코딩하는 CRISPR RNA(crRNA)가 trans activating crRNA와 결합체를 이루며, 이 결합체는 tracrRNA에 의해 Cas9 단백질과 결합하여 CRISPR/Cas9 복합체를 만든다. 이 복합체의 Cas9 단백질이 절단하고자 하는 염기서열의 NGG 서열을 인식하여 균주의 유전자를 자르게 되고 균주는 죽는다. 하지만 균주의 유전자 변이를 유도하고자 하는 돌연변이 서열을 포함 하면서 NGG서 열이 없는 염기서열을 포함하는 구조 DNA를 균주에 형질전환 하여 상동재조합이 된다면 균주는 죽지 않고 살아남을 것이다. 이 기술을 본 발명에 적용하였다. 플라스미드는 pZA-Cas9 및 pZS-CRISPR(MJ Heo et al., Controlling citrate synthase expression by CRISPR/Cas9 genome editing for n-butanol production in Escherichia coli. ACS synth. Biol. 6(2):182-189, 2017)를 사용하였으며, pZSCRISPR에 사용되는 제한효소는 BsaI을 사용하였다. mtlA- 표적화 crRNA를 암호화하는 합성 DNA 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝시킨 후, 이를 pZS-CRISPR mtlA로 명명하였다. RBS calculator에서 얻은 4 개의 게놈을 표 2에 구조 DNA로 사용하여 일련의 mtlA F/R로 표시하였다. 상기 방법의 게놈 편집을 통해 KMK-23M2, M4, M6 및 M8을 얻었으며 이는 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

Primer Name	Sequence (5'-3')	서열번호
budA F	GTCAACATTTATTTAACCTTTCTTATATTTGTTGAACGAGGAAGTGGTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	서열번호 3
budA R	GCGCCGTGCGCCCACTGGCGTACCGGATACTGTTTGTCCATGTGACCCCCGTCCATATGAATATCCTCCT	서열번호 4
budA con A	ACGGAGGCTGTGAAATACCC	서열번호 5
budA con B	TTCGTGGCGTACCGGAATA	서열번호 6
pflB F	GGTTGTTTCAGGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	서열번호 7
pflB R	CCCCACTGATGTGGGGCCTTTATTGTACGCCTTTTCAGTCAGACAGGGAAGTCCATATGAATATCCTCCT	서열번호 8
pflB con A	GGGTTGACATACTGGGTCATTT	서열번호 9
pflB con B	GCGTCGAGTCTGTTTTGACA	서열번호 10
dhaD F	ACGCCAGGGCTCATCATGTCTACATGCGCACTTATTTGAGGGTGAAAGGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	서열번호 11
dhaD R	GGGGAGAAAGAAAAACCGCTGACCTGGGCCAGCGGTTTAGCCACCGCGAAGTCCATATGAATATCCTCCT	서열번호 12
dhaD con A	AAAAATTAACCTGTGTTTCATATCAG	서열번호 13
dhaD con B	GTTTCGCGCTGCATAAACTT	서열번호 14
glpK F	CCACCGCTCAACATAAAGCTTCGCTGTAATCTGACTACGGGACACCGACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	서열번호 15
glpK R	GTAGCCCGGCTAAGGCGTTTACGCCGCAAGCCGGGAATAACTTCACAATCGTCCATATGAATATCCTCCT	서열번호 16
glpK con A	GGCGGCAAAGATATTCCTTA	서열번호 17
glpK con B	GTTTCACCGCTTTCTTCCAG	서열번호 18
glpK con C	CGAAGAACTCCAGCATGAGA	서열번호 19
mtlA CRISPR F	AAACAAGCCTGCGCGCTACGCAAAACAGAAGAAGG	서열번호 20
mtlA CRISPR R	TTTTGGAAGAAGACAAAACGCATCGCGCGTCCGAA	서열번호 21
mtlA rescue 2 F	TGCCGCCACATTAACAACAAACCTCGGGCTTTAAGCCTGCGCGCTACGCACAAACCAATAAGGATTCCGAC	서열번호 22
mtlA rescue 2 R	CTGAGGAAACGACCAAAGCTTTGCACTTTGATCTTGATATCGGATGACATGTCGGAATCCTTATTGGTTTG	서열번호 23
mtlA rescue 4 F	CCGGCTACCTCTGCCGCCACATTAACAACAAACCTCGGGCTTTAAGCCTGTAGACAGAGTCTAACAGACCATCGAG	서열번호 24
mtlA rescue 4 R	CTGAGGAAACGACCAAAGCTTTGCACTTTGATCTTGATATCGGATGACATACGTTCCTCGATGGTCTGTTAGACTC	서열번호 25
mtlA rescue 6 F	GGCCCGGCTACCTCTGCCGCCACATTAACAACAAACCTCGGGCTTTAAGCACAAAACAAAAAAATTTACATCAAATAGGT	서열번호 26
mtlA rescue 6 R	CTGAGGAAACGACCAAAGCTTTGCACTTTGATCTTGATATCGGATGACATTATATACCTATTTGATGTAAATTTTTTTGTT	서열번호 27
mtlA rescue 8 F	GGCCCGGCTACCTCTGCCGCCACATTAACAACAAACCTCGGGCTTTAAGCATTCTACGTTTACAATTAGATAGAGAGGC	서열번호 28
mtlA rescue 8 R	CTGAGGAAACGACCAAAGCTTTGCACTTTGATCTTGATATCGGATGACATTTTAACGCCTCTCTATCTAATTGTAAACG	서열번호 29

Strain	Edited mtlA 5'-UTR sequence	Expected translationrate	서열번호
KMK-23	AAGCCTGCGCGCTACGCAAAACAGAAGAAGGGGTGTTTTATG	19860.8	서열번호 30
	↓(Modified by CRISPR/Cas9)	↓
KMK-23M2	CAAACCAATAAGGATTCCGACATG	19547.55	서열번호 31
KMK-23M4	TAGACAGAGTCTAACAGACCATCGAGGAACGTATG	12463.51	서열번호 2
KMK-23M6	ACAAAACAAAAAAATTTACATCAAATAGGTATATAATG	8716.05	서열번호 32
KMK-23M8	ATTCTACGTTTACAATTAGATAGAGAGGCGTTAAAATG	4265.22	서열번호 33

본 발명에 따른 KMK -50 및 KMK -51 균주의 제조

상기 제조된 KMK-23 균주 중, mltA의 유전자 발현률이 62%로 조절된 KMK-23M4 균주에서 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환되고, 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA)가 추가로 결실되어 있는 재조합 균주를 제조하였으며, 유전자 조작에 따른 균주명, 사용된 플라스미드 및 프라이머를 하기 표 4에 나타내었다.

	Description	Source
Strains
KCTC 2242	Wild-type K. pneumoniae, Ap^r trpR	Kroean Collection for Type Culture
KMK-23M4	K. pneumoniae KCTC 2242 ΔwabG ΔldhA ΔpflB ΔbudA ΔdhaD ΔglpK mtlA expression level 62%	제10-2017-0163026호
KMK-50	KMK-23M4 gltAK167A	This study
KMK-51	KMK-23M4 ΔarcA	This study
Plasmids
pRedET	λphage red γ,β,α-producing vector, pBAD_promoter; ori101 Tet^r	Gene Bridges
707-FLP	Flp recombinase-producing vector; Psc101 ori cI1578 Tet^r	Gene Bridges
pKD4	FRT-flanked resistance cassette-involved vector; oriR γKm^r	Gene Bridges
pZA31::MCS	Expression vector, Cm^R,p15Aori	Expressys
pZA-Cas9	pZA31MCS, but P_LtetO _-1::cas9-PsacB::sacB	Expressys
pgRNA	sgRNA backbone vector , P_J23119L; ColE1 ori Am^R	Addgene
pgRNA::gltAK167A	pgRNA::gltA-CRISPR	This study
Primer Name	Sequence (5'-3')	서열번호
gltA For	ATATATACTAGTGGCTGCCATGGTTGGCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT	서열번호 34
gltA Rev	ATATATAAGCTTCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTT	서열번호 35
gltA-CRISPR	ACTAGTGGCTGCCATGGTTGGCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAAGCTT	서열번호 36
gltA-167GCT	ACGTGAATAACCCGCGTCACCGCGAGATTGCCGCCTACCGTCTGCTGTCCGCTATGCCAACCATGGCAGCCATGTGTTACAAATATTCTATCGGCCAGCCGTT	서열번호 37
arcA For	GGACTTTGGTACTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC	서열번호 38
arcA Rev	CGGCGCCCCTGGGGCGCCGTTTTCGCATCATGGCTGCGGAATAAATCGTAGTCCATATGAATATCCTCCT	서열번호 39

(1) gltA 유전자의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)(167번째 아미노산 서열)을 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환(KMK-50)

gltA 유전자는 시트르산 합성효소의 정보를 담고있는 유전자이며, 시트르산에 대사물질인 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (NADH) 가 결합하면 효소의 활성을 저해하고, 이로 인해 세포의 성장이 저해될 수 있다.

따라서, NADH와의 결합 저해를 통해 세포의 성장 증가를 유도하기 위해, 서열번호 1로 표시되는 시트르산 합성효소의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)(167번째 아미노산 서열)을 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환하였다. 구체적으로 균주의 절단을 목표하는 유전자의 염기서열이 클로닝된 플라스미드 (pgRNA::gltAK167A)와 Cas9 단백질이 코딩되어있는 플라스미드 (pZA-Cas9), 원하는 염기를 포함하는 선형 DNA 서열 (gltA-167GCT)을 균주에 형질전환하여 gltA 유전자의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)을 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환하였으며, 제조된 돌연변이 균주를 KMK-50으로 명명하였다.

(2) arcA 유전자의 결실(KMK-51)

arcA 단백질은 혐기조건에서 호기조건에서 발현하는 유전자들의 발현을 억제한다. 세포성장과 관련된 유전자들은 호기조건에서 발현하는 유전자들이 많다. 따라서 세포성장 억제 요인을 제거하기 위해, arcA 유전자(GeneBank:AEJ96404.1)를 상기 제조된 클렙시엘라 뉴모니아 KMK-50 균주에서 제거하였고, KMK-51이라 명명하였다.

KMK-50의 arcA 유전자를 제거하기 위해 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신 저항성유전자-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 ldhA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신 저항성유전자-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 arcA 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신 카세트는 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항생제저항성 유전자이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 카나마이신 저항성 유전자를 제거를 위한 주는 역할을 하는 유전자이다.

다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-02 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃ 이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈(L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 이 후 성공여부를 확인하기 위해 콜로니 PCR을 진행하였다. 콜로니 PCR은 앞서 배양이 진행된 고체배지에 생성된 콜로니를 채취하여 진행했다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머를 제작하였다. arcA 유전자 양옆의 상동한 200 여개의 염기쌍에 대한 PCR을 진행하였다. 콜로니 PCR 을 수행하였을 때PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.

균주의 회분발효 , 세포의 생성량, 1,3- 프로판디올 생성량 및 세포 내 ATP 농도 측정

상기 제조된 재조합 균주 KMK-23M4, KMK-50 및 KMK-51을 배양하여, 세포의 생성량, 1,3-프로판디올 생성량 및 세포 내 ATP 농도를 확인하였다.

(1) 배지 조성

본 실시예에서 사용한 발효배지의 조성은 1L 당 0.75 g KH2PO4, 1.7 g Na2HPO4, 0.75 g KCl, 5.35 g (NH4)2SO4, 0.28 g Na2SO4, 0.26 g MgSO4·7H2O, 0.42 g citric acid, 10 g yeast extract, 10 g Casamino Acids 가 포함되었고, 1ml 씩의 Fe 솔루션과 Trace element 솔루션이 포함되었다. 각 솔루션의 구성 성분은 아래 표 5에 나타내었으며, 탄소원으로 사용된 글리세롤과 메니톨은 1L 당 각각 40 g 과 20 g 이 포함되었다. 배지 조성에 사용된 모든 시약들은 시그마 알드리치에서 구입하였다.

(2) 플라스크배양

전술한 배지 조성하에서 플라스크 배양을 진행하였다. 플라스크 배양을 위한 균주들은 4ml 씩 시험관에 밤새 접종하였으며, 모든 플라스크 배양은 250 rpm 및 37 ℃의 미세 혐기 조건하에 실리콘 마개로 밀봉 한 100ml 삼각 플라스크에 총 부피 30ml 씩 48시간 배양을 진행하였다. 전체 배양은 적어도 3번 이상 수행하였다.

(3) 대사물 분석

균주의 세포밀도는 UV-visibility 스펙트로미터(시마즈 UV mini 1240; 시마즈, 도쿄, 일본)를 이용하여 OD600에서 모니터링하였다. 1 ml의 배양액을 마이크로센트리퓨즈 튜브에 옮기고 4 ℃, 13,000rpm에서 10 분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 미세 원심 분리 관으로 옮기고 대사물을 분석하는데 사용하였다.

대사과정을 통하여 생산된 1,3-프로판디올을 비롯한 글리세롤, 솔비톨, 글루코네이트, 글루코즈 등의 탄소원과 락틱산, 숙신산, 피루브산, 아세트산, 에탄올, 3-하이드록시프로피오닉산 등의 부산물을 모두 HPLC 를 통해 분석하였으며, 운행조건 및 이동상은 하기 표 6과 같다.

품 목	조 건
HPLC 모델	Younglin Instrument ACME-9000
컬럼	Sugar SH1011 column (Shodex, Japan)
유속	0.6 ml/min
주입부피	10ul
이동상	5mM 황산
오븐 온도	60℃
작동 시간	25분

(4) 세포 내 ATP 농도 측정

ATP는 세포의 성장기인 7.5시간에 trichloroacetic acid (TCA)를 추출용매로 하여 추출하였고 ATP Assay kit (ENLITEN(R) ATP Assay System, Promega, USA)로 측정하였다.

(5) 실험 결과

하기 도 1은 KMK-23M4, KMK-50, KMK-51의 시간별 OD₆₀₀을 나타낸 것이다. 측정 결과, KMK-50의 OD₆₀₀이 6.94로 KMK-23M4의 6.58 보다 증가하였고 KMK-51의 OD₆₀₀이 8.89로 KMK-50보다 증가하였으며, KMK-23M4보다는 약 28% 증가한 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명에 따를 경우 세포의 생성량이 현저히 증가한다는 것을 확인하였다.

다음으로, 하기 도 2는 KMK-23M4, KMK-50, KMK-51의 시간별 1,3-프로판디올의 생성량을 나타낸 것이다. 측정 결과, 1,3-프로판디올의 생성량이 KMK-23M4, KMK-50, KMK-51에서 각각 9.687, 11.652, 17.807 g/L인 것으로 나타났으며, 특히 KMK-51의 경우 1,3-프로판디올의 생성량이 KMK-23M4보다 약 84% 증가한 것으로 나타났는바, 이를 통해 본 발명에 따른 세포량의 증가를 통해 1,3-프로판디올의 생성량이 현저히 증가한다는 것을 확인하였다.

다음으로, 하기 도 3은 KMK-23M4, KMK-50 및 KMK-51 균주의 세포 내 ATP 농도를 나타낸 것이다. 이를 통해 본 발명에 따를 경우 세포 내 ATP 농도가 현저히 증가하는 것으로 나타났는바, 본 발명에 따른 균주에 의한 세포량 증가가 세포 내 ATP 농도 증가에 의해 뒷받침되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Recombinant microorganism for increased 1,3-propanediol producing ability by accelerating cell mass and Method for preparing 1,3-propanediol using the Same <130> JKP-0936 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1284 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Klebsiella pneumoniae KCTC 2242 <220> <221> gene <222> (1)..(1284) <223> gene coding aerobic respiration control response regulator(arcA) <400> 1 atgtctgatg ctaaagcaaa aatcaccctg ggtggtgaca ctgctattga actggatgtg 60 ctaaaaggca cgctcggtca ggatgttatt gatattcgta gtcttggttc aaaaggcgta 120 tttacctttg acccaggttt cacatcaacg gcttcttgtg aatctaaaat tacgtttatc 180 gacggtgacg aggggatcct gctgcaccgc ggcttcccga tcgaccagtt agcgaccgaa 240 tctaattatc ttgaagtctg ttatatcctg ctgtacggcg aaaagccgac tcaggccgaa 300 tatgacgaat tcaaaactac cgtcacccgc cacaccatga ttcatgagca gatcacccgt 360 ctgttccacg cgttccgtcg cgattcccac ccgatggcgg tgatgtgcgg gatcactggc 420 gcgctggcgg cgttctatca tgattccctc gacgtgaata 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Claims

1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 시트르산 합성효소를 코딩하는 유전자(gltA)의 502 내지 504번의 라이신 코딩 서열(AAA)이 알라닌 코딩 서열(GCT)로 치환된 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물.

제1항에 있어서,
상기 gltA 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물.

제1항에 있어서,
호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

제1항에 있어서,
상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물은 클렙시엘라 뉴모니에인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

제1항에 있어서,
상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물은 폴메이트 아세틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(pflB), 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자(wabG), 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ldhA), α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(budA), 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자(dhaD), 글리세롤 키나아제를 코딩하는 유전자(glpK)가 결실되어 있고, 만니톨 업테이크에 관여하는 포스포트랜스퍼라아제 시스템 만니톨-특이 트랜스포터(phosphotransferase system mannitol-specific transporter)를 코딩하는 유전자(mtlA)의 발현을 21~98% 감소시키기 위하여 상기 mtlA 유전자를 변이시킨 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

제5항에 있어서,
상기 mtlA의 유전자의 발현을 62% 감소시키기 위하여 변이시킨 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

제6항에 있어서,
상기 mtlA의 변이 유전자는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.

다음 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법:
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.

제8항에 있어서,
상기 (a) 단계의 배양은 글리세롤, 솔비톨, 만니톨, 글루코네이트, 글루코스, 자일로오스 및 갈락토오스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.