CN103397055A - 利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法 - Google Patents

利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法。使用微生物生产羟基羧酸，所述微生物通过使微生物内部的nadR基因缺失、变异、或取代、或者通过导入编码烟酸磷酸核糖转移酶的基因，使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力提高。

Description

利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法
本申请是中国发明专利申请号200780016224.X的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的微生物和使用微生物的生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的方法。
背景技术
羟基羧酸类作为聚合物原料或药物中间体有用，故人们谋求其高效的生产方法。
作为其一例，可以举出乙醇酸(α-羟基乙酸)。乙醇酸已逐渐用作洗涤剂或化妆品原料，但近年作为用作气体隔离性聚合物或医疗用聚合物的聚乙醇酸原料受到关注。作为气体隔离性材料受到关注的原因在于，聚乙醇酸层具有较高的氧气隔离性，具有作为用于包装在氧存在下易变质的食品或碳酸饮料的材料的性能。
目前市场上销售的化学合成品的乙醇酸含有很多杂质，作为聚合物原料存在纯度方面的问题。其原因在于，上述杂质不仅阻碍乙醇酸的脱水缩合反应，而且作为杂质之一的甲氧基乙酸是怀疑具有致癌性的化合物，故不希望包含在食品或饮料的包装材料中。当然从技术上讲可以通过精制除去杂质，但实际上，上述精制品的价格升高，作为廉价的包装材料原料并不现实。
为了避免化学合成品的乙醇酸中出现的上述问题，人们正在尝试通过以乙二醇作为原料的生物学方法来制造乙醇酸。
专利文献1及专利文献2中公开了通过微生物生产乙醇酸的方法，其特征在于，在含有乙二醇的培养基中培养属于毕赤酵母(Pichia)属、红酵母(Rhodotorula)属、掷孢酵母(Sporobolomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、球拟酵母(Torulopsis)属的酵母、属于诺卡氏菌(Nocardia)属的菌株、属于红球菌(Rhodococcus)属的菌株、或大肠杆菌B(Escherichia coli B)株，从培养液中分离·采集乙醇酸。
专利文献1及专利文献2的实施例记载的乙醇酸生产方法中，乙醇酸蓄积浓度最高的是使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的方法，经30小时的反应可以得到35.3g/L的乙醇酸。非专利文献1中指出，对于使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的乙醇酸生产，进一步改善反应条件，经120小时的反应可以得到105g/L的乙醇酸。
专利文献3中公开了将编码乳醛还原酶(lactaldehyde reductase)的基因和编码乳醛脱氢酶(lactaldehyde dehydrogenase)的基因以质粒的形态导入微生物，由此赋予或强化它们的酶活性，通过使用上述微生物，将以乙二醇为代表的末端具有羟基的脂肪族多元醇作为原料，可以生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸，进而通过破坏微生物具有的编码乙醇酸氧化酶的基因、使该酶活性钝化，由此提高乙醇酸的生产率。
在利用上述现有方法生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的反应中，由于供给到反应中的菌体量多，所以存在以下问题，即，随着菌体量多而导致制造成本升高或夹杂来自菌体的杂质，进而在羟基羧酸类制造后为了废弃菌体而耗费大量劳力和成本。
在微生物中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物合成路径，已知存在由天冬氨酸经喹啉酸进行生物合成的路径(从头(de novo)路径)、和将通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等的代谢生成的烟酰胺再循环的路径(再循环路径)，以埃希氏菌(Escherichia)属、志贺氏菌(Shigella)属、沙门氏菌(Salmonella)属、欧文氏菌(Erwinia)属、耶尔森氏菌(Yersinia)属、光杆状菌(Photorhabdus)属为代表的肠内细菌科中的上述生物合成路径，已知被nadR(因文献不同有时也称为nadI)基因编码的蛋白质(以下写成NadR)所控制。即，已知NadR抑制由天冬氨酸开始的从头(de novo)路径中的L-天冬氨酸氧化酶基因和喹啉酸合成酶基因、及再循环路径中的烟酸磷酸核糖转移酶(nicotinic acid phosphoribosyltransferase)基因(以下称为pncB)的表达。
另一方面，NadR为多功能蛋白质，对于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成也具有以下重要的功能。即，已知也具有转运成为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸前体的烟酰胺单核苷酸的功能，并且具有作为催化由ATP和烟酸核糖核苷酸生产作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸前体的脱酰胺(Deamido)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应的酶的功能、作为烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的功能。
非专利文献2中已经报道了破坏基因nadR的微生物，但尚未报道利用上述微生物生产羟基羧酸。
非专利文献3中报道了通过向大肠杆菌中导入pncB的表达载体，提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。
专利文献1：特开平10-174593号公报
专利文献2：特开平10-174594号公报
专利文献3：国际公开第2005/106005号说明书
非专利文献1：Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vo1.65(10)，pp.2265-2270，(2001)
非专利文献2：J.Bacteriol.，Vol.187(8)，pp.2774-2782，(2005)
非专利文献3：Metabolic Engineering，Vol.4，pp.238-247，(2002)
发明内容
本发明所要解决的课题在于提供一种能够用少量菌体高效地生产羟基羧酸类的、利用微生物进行的羟基羧酸类的生产方法、及适用于该生产方法的微生物。
为了解决上述课题，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，在使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的方法中，通过使用强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物能够高效地生产羟基羧酸类。
即，本发明如以下〔1〕至〔19〕所述。
〔1〕一种羟基羧酸的生产方法，所述方法使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇制造羟基羧酸，其特征在于，使用强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物。
〔2〕如〔1〕的生产方法，其特征在于，微生物是通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作而强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物中导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶的基因的质粒。
〔3〕如〔1〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的微生物。
〔4〕如〔3〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是通过导入质粒而强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的微生物，所述质粒是组入了NADH脱氢酶基因的质粒。
〔5〕如〔1〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性的微生物。
〔6〕如〔3〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性的微生物。
〔7〕如〔1〕、〔3〕、〔5〕或〔6〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来活性降低了的微生物。
〔8〕如〔1〕～〔7〕中任一项所述的生产方法，其特征在于，末端具有羟基的脂肪族多元醇为乙二醇，羟基羧酸为乙醇酸。
〔9〕一种微生物，是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性且通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作而强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物中导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶的基因的质粒。
〔10〕如〔9〕所述的微生物，其特征在于，强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力。
〔11〕一种微生物，是强化了NADH脱氢酶的活性且通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物内导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶基因的质粒。
〔12〕如〔9〕或〔10〕所述的微生物，其特征在于，将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了。
〔13〕如〔11〕所述的微生物，其特征在于，将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了。
〔14〕如〔1〕～〔8〕中任一项所述的生产方法，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
〔15〕如〔14〕所述的生产方法，其中，微生物为大肠杆菌。
〔16〕如〔9〕、〔10〕、〔12〕中任一项所述的微生物，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
〔17〕如〔11〕或〔13〕所述的微生物，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
〔18〕如〔16〕所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌。
〔19〕如〔17〕所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌。
根据本发明能够以较少的菌体量高效地生产羟基羧酸类。另外，根据本发明能够提供适于羟基羧酸类生产的微生物。
附图说明
根据下述优选实施方案及附带的以下附图进一步详细说明上述目的及其他目的、特征及优点。
[图1]为表示参考例3中细胞内的NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)的经时变化的曲线图。图中的□表示△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的NADH/NAD比。图中的○表示△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的NADH/NAD比。
[图2]为表示实施例9中的乙醇酸蓄积量的经时变化的曲线图。图中的○表示在30℃下的反应结果。图中的□表示在35℃下的反应结果。图中的△表示在37℃下的反应结果。图中的×表示在40℃下的反应结果。
[图3]为表示实施例10中的乙醇酸蓄积量的经时变化的曲线图。图中○表示在pH7.7下的反应结果。图中△表示在pH7.2下的反应结果。图中□表示在pH6.5下的反应结果。图中×表示在pH6.0下的反应结果。图中◇表示在pH4.3下的反应结果。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本实施方案是羟基羧酸的生产方法。此方法在使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇制造羟基羧酸的方法中使用强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物。
所谓微生物，是指无论本来是否具有由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的能力，只要通过使用某些方法可以获得由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的能力的微生物即可，可以为任意微生物。优选举出属于埃希氏菌(Escherichia)属、志贺氏菌(Shigella)属、沙门氏菌(Salmonella)属、欧文氏菌(Erwinia)属、耶尔森氏菌(Yersinia)属、光杆状菌(Photorhabdus)属的微生物等，较优选举出大肠杆菌(Escherichia coli)。
另外，所谓末端具有羟基的脂肪族多元醇，只要是在碳链末端具有羟基、且分子内具有2个以上羟基的脂肪族化合物即可，对其结构没有特殊限制，但作为上述化合物，可以举出乙二醇、二甘醇、丙三醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2，4-丁三醇等。
另外，所谓羟基羧酸，是指上述末端具有羟基的脂肪族多元醇分子内的一个具有羟基的末端碳被氧化形成羧酸的化合物。作为上述化合物，可以举出乙醇酸、羟基乙氧基乙酸、甘油酸、3-羟基丙酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、2，4-二羟基丁酸等。
本实施方案中，作为末端具有羟基的脂肪族多元醇，可以优选使用乙二醇。另外，作为羟基羧酸，可以优选使用乙醇酸。
本实施方案涉及的微生物，通过进行下述(1)及(2)中至少一个基因操作，强化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力。
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代。
(2)向微生物中导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶的基因的质粒。
此处，所谓烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，只要没有标明氧化型及还原型，则指二者中任意一个。
所谓强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力，是指微生物内的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有时简称为NAD)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有时简称为NADH)的含量的总和相对于微生物的野生株(或重组前的微生物)显著提高的状态，优选NAD、NADH的总含量是强化前的微生物的1.2倍至10倍。
另外，所谓nadR基因，如果以大肠杆菌MG1655株为例，则在大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全部碱基序列(GenBank登录号U00096)中从第4625317个碱基至第4626570个碱基中nadR基因被编码。另外，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)的nadR基因如GenBank登录号M85181所示。除上述微生物以外，在以志贺氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属为代表的肠内细菌科中也存在nadR基因(Gerasimova，AV.，et.al.，Journal of Bioinformatics and Computational Biology，Vol.3，pp.1007-1019(2005))。
使nadR基因缺失或变异、或取代的微生物，可以采用本领域技术人员熟知的常法获得。作为使nadR基因缺失或变异、或取代的微生物的一例，例如可以举出大肠杆菌MT-11032株。
羟基羧酸的生产方法中，可以使用大肠杆菌MT-11032株。大肠杆菌MT-11032株中，nadR基因被取代为卡那霉素耐性基因，且作为编码下述乙醇酸氧化酶的基因的glcDEF被取代为四环素耐性基因，由此使乙醇酸氧化酶活性钝化。本菌株基于国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，保藏于茨城县筑波市东1段1番1号的中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-10773。需要说明的是，本保藏是从平成18年(2006年)2月14日保藏的FERM P-20797移管的。
此处，所谓烟酸磷酸核糖转移酶，是指属于以国际生物化学联合(以下称为“I.U.B.”)酶委员会报告为基准的酶编号2.4.2.11，可逆地催化由烟酸和5-磷酸核糖基-1α-二磷酸生成烟酸单核苷酸的反应的酶的总称。
可以使用导入了质粒的微生物，由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸，所述质粒组入了烟酸磷酸核糖转移酶的基因(以下，有时简称为pncB)。向微生物中导入基因时使用的基因组DNA的配制、质粒的配制、DNA的切断及连接、转化、PCR(聚合酶链反应)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。上述方法记载于Sambrook，J.，et.al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。
另外，本实施方案涉及的微生物强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力。此处，所谓强化NAD再生能力，是指催化将NADH变为NAD的反应的酶的活性，与强化前相比显著提高的状态，所述NADH是通过末端具有羟基的脂肪族多元醇的氧化反应生产羟基羧酸时生成的。作为上述酶，可以举出谷氨酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、NADH氧化酶、NADH脱氢酶。强化NAD再生能力时，在之后的精制等工序中成为负荷的化合物不增加，较为理想。作为催化将NADH变为NAD的反应的酶，优选NADH脱氢酶。以催化将NADH变为NAD的反应的酶为来自大肠杆菌的NADH脱氢酶的情况为例，其活性与野生株(或重组前的微生物)相比提高2倍以上，较理想。
提高了上述酶活性的微生物，可以采用下述方法制作，例如，使用基因重组技术向野生型的微生物(或重组前的微生物)中导入编码该酶的基因的方法，或在基因组内，向编码该酶的基因的启动子中导入变异等的方法。作为向野生型微生物(或重组前的微生物)中导入该基因的方法，可以举出以质粒的形态将该基因导入微生物。在向微生物中导入基因时使用的基因组DNA的配制、质粒的配制、DNA的切断及连接、转化、PCR、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。上述方法记载于上述Sambrook，J.等的文献中。
另外，本实施方案涉及的微生物，通过导入组入了NADH脱氢酶基因的质粒，强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力。此处，所谓NADH脱氢酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.6.5.3、1.6.99.3、或1.6.99.5，可逆地催化以泛醌、二甲基维生素K2类(dimethyl menaquinone)、维生素K2类等醌类作为电子受体，由NADH生成NAD的反应的酶的总称。优选为属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.6.99.3的NADH脱氢酶，以大肠杆菌为例时，可以举出由GenBank登录号V00306报道的ndh基因编码的NADH脱氢酶。
本实施方案中，可以使用导入了质粒的微生物，由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸，所述质粒组入了NADH脱氢酶基因。必要的质粒的构建或向微生物中的导入可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。
另外，本实施方案涉及的微生物强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中的至少一个的酶活性。此处，所谓乳醛还原酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.1.1.77，可逆地催化在作为辅酶的NAD的存在下由1，2-丙二醇生成乳醛的反应的酶的总称。
另外，所谓乳醛脱氢酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.2.1.22，催化在作为辅酶的NAD的存在下由乳醛生成乳酸的反应的酶的总称，且也指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.2.1.21，催化在作为辅酶的NAD的存在下由乙醇醛生成乙醇酸的反应的酶乙醇醛脱氢酶(Glycolaldehyde dehydrogenase)的总称。其原因在于，在使用大肠杆菌的在先文献中已经报道了乳醛脱氢酶和乙醇醛脱氢酶为相同的酶(Caballero，E.，et.al.，J.Biol.Chem.，Vol.258，pp.7788-7792(1983))。
另外，所谓强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性，以大肠杆菌为例时，优选上述酶中至少一个的酶活性为野生株(或重组前的微生物)的20倍以上，较优选为100倍以上。上述酶活性提高的微生物，可以使用下述方法制作，例如，使用基因重组技术将编码该酶的基因导入野生型的微生物(或重组前的微生物)中的方法，或在基因组内向编码该酶的基因的启动子中导入变异等方法。作为向野生型微生物(或重组前的微生物)中导入该基因的方法，可以举出以质粒的形态将该基因导入微生物。在向微生物中导入基因时所用的基因组DNA的配制、质粒的配制、DNA的切断及连接、转化、PCR、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。上述方法记载于上述Sambrook，J.等的文献中。
例如，乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性提高的大肠杆菌，可以如下制作。
大肠杆菌的乳醛还原酶的基因(以下有时简称为fucO)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号M31059)。另外，大肠杆菌的乳醛脱氢酶的基因(以下，有时简称为aldA)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号M64541)。
为了获取fucO，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用成为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到fucO片段。
另外，为了获得aldA，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用成为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到aldA片段。
进而，为了获取甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用成为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到编码GAPDH启动子的DNA片段。
将上述3个DNA片段和通过用限制酶消化质粒得到的片段结合后，转化至大肠杆菌中，得到生长在LB琼脂培养板中的转化体。在LB液体培养基中培养所得菌落，从所得菌体中回收质粒。通过将本质粒导入任意的宿主大肠杆菌中，能够制作乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性提高的大肠杆菌。
本实施方案涉及的微生物也将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低。
此处，所谓乙醇酸氧化酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.1.3.15，可逆地催化由乙醇酸生成乙醛酸的反应的酶的总称。
所谓乙醇酸氧化酶活性的钝化，是指其酶活性完全消失。另外，所谓乙醇酸氧化酶活性的降低，是指其酶活性的一部分消失，优选相对于野生株(或重组前的微生物)具有的微生物本来的乙醇酸氧化酶活性为2分之1以下，较优选为10分之1以下。为了使乙醇酸氧化酶活性钝化、或减低，有下述方法：向编码其蛋白质的基因(以下有时简称为glcDEF基因)中导入变异或使其缺失、或者添加使其蛋白质特异地钝化的试剂、照射紫外线等方法。对于向基因中导入变异或缺失之类的基因操作，可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。具体而言，可以举出大肠杆菌MT-11032株作为通过将glcDEF基因取代为四环素耐性基因，使其乙醇酸氧化酶活性钝化的微生物。
本实施方案中，所谓向微生物中导入编码某靶酶的基因时的“以质粒的形态”，是指将该基因与载体连接，制成重组质粒，采用转化等方法将其导入该微生物。
另外，将在微生物内恒久地发挥功能的强启动子和靶基因功能性地连接时，根据质粒具有的复制子的性质，即使使用据说是每个微生物细胞的拷贝数通常较少的质粒，也能实现本发明的目的。作为上述具有复制子的质粒，可以举出pACYC184(GenBank登录号X06403)等。
实施本实施方案的生产方法时，通常情况下使用培养基，培养微生物使其增殖，得到必要量的微生物菌体。
用于培养的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子及根据需要的其他有机微量成分的培养基即可，没有特殊的限制。作为碳源，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸，甲醇、乙醇、丙三醇等醇类及其他。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、氨水、蛋白质水解物等无机及有机的氮源及其他。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子、锰离子、硫酸根离子及其他。作为有机微量成分，可以适当地使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆、酪蛋白分解物及其他。
作为用于培养的培养基，从供给工业生产方面考虑时，优选液体培养基。
另外，培养基组成优选为聚胨0.5g/L以上10g/L以下、Fe2SO40.02g/L以上0.3g/L以下、K2HPO40.5g/L以上5g/L以下、KH2PO40.5g/L以上5g/L以下、MgSO4·7H2O0.5g/L以上5g/L以下、(NH4)2SO40.3g/L以上15g/L以下(溶剂为水)。
在本实施方案涉及的微生物的培养时，培养条件没有特殊的限制，一边适当地控制pH和温度，一边进行培养。可以为需氧条件、也可以为厌氧条件，但优选为需氧条件。通气量优选每1L培养基为0.2L/min以上3L/min以下，较优选为0.5L/min以上2L/min以下。另外，搅拌速度优选为200rpm以上1000rpm以下，较优选为500rpm以上800rpm以下。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。另外，也可以使用能够实现与上述通气、搅拌条件相当的溶存氧供给的气泡塔等进行培养。
pH优选为5以上8以下，较优选pH为7.0以上7.4以下，最优选pH为7.2。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。
另外，温度优选为25℃以上40℃以下，较优选为33℃以上37℃以下，最优选为35℃。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。
培养所需时间为12小时以上50小时以下。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。
作为本实施方案的生产方法中使用的溶剂，可以举出磷酸钾缓冲液等缓冲液、或上述微生物培养中使用的培养基、及纯水。另外，可以使作为原料的脂肪族多元醇和溶剂的混合液与事先培养得到的微生物菌体接触，进行反应。对于微生物菌体，可以举出直接使用培养结束的培养液的方法，或从培养液中只回收菌体进行使用的方法。
在本实施方案的生产方法的反应时，反应条件没有特殊限制，一边适当地控制pH和温度，一边反应。
例如，优选pH为6以上9以下，较优选pH为7.0以上8.0以下，最优选pH为7.2。由此，能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。
另外，温度优选为20℃以上45℃以下的范围内，特别优选为30℃以上40℃以下，最优选为35℃。由此能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。
另外，反应优选为需氧条件。通气量优选每1L反应液为0.1L/min以上2.0L/min以下，较优选为0.2L/min以上1.0L/min以下。另外，搅拌速度优选为200rpm以上1000rpm以下，较优选为400rpm以上800rpm以下。由此，能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。另外，也可以使用能够实现与上述通气、搅拌条件相当的溶存氧供给的气泡塔等进行反应。
另外，通过使反应时间为12小时以上96小时以下，能够以80％以上的收率得到羟基羧酸。
作为回收如上所述得到的反应液中蓄积的作为产物的羟基羧酸的方法，没有特殊的限制，但是例如可以采用经离心等从反应液中除去菌体后使用合成吸附树脂的方法或使用沉淀剂的方法，采用其他常用收集分离方法进行分离的方法。
(制造例1)大肠杆菌MG1655nadR缺失株的制作
大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全部碱基序列在GenBank登录号U00096中为公知，该碱基序列中，在从第4625317个碱基至第4626570个碱基中nadR基因被编码。根据大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的nadR基因附近区域的基因信息制作下述序列号所示的寡核苷酸：序列号1(AGGAAGTGCCATTCTGATTGG)及序列号2(GGAATTCGTATATCTCATTATAAGTCGTCG)及序列号3(GGAATTCGTGATGAAACTGCTCAAAGG)及序列号4(TTGGTACCTGATGACCTGAGCTTCTCG)，使用上述寡核苷酸，以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板进行PCR。通过将所得DNA片段分别用限制酶NdeI和EcoRI、EcoRI和KpnI消化，分别得到约850bp、970bp的片段。
将此DNA片段与用NdeI、KpnI消化温度敏感性克隆载体pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000))得到的片段混合，使用连接酶结合后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一晚，从所得的菌体中回收质粒。将回收的质粒用EcoRI消化，使用连接酶与用EcoRI消化pUC4K质粒(GenBank登录号X06404)(Pharmacia)得到的卡那霉素耐性基因连接。
于30℃下将上述所得的质粒转化至大肠杆菌MG1655株中，于30℃下在含有10μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养板中培养一晚，得到转化体。将所得转化体接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一晚。然后，为了得到上述培养菌体，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养板上，得到于42℃下生长的菌落。将所得菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中于30℃下培养一晚，进而涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养板上，得到于42℃生长的菌落。
从出现的菌落中随机挑取100个菌落，使各菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中生长，选取只在含有卡那霉素的LB琼脂培养板中生长的氯霉素敏感性的克隆体。进而由上述目标克隆体的染色体DNA通过PCR使野生株MG1655中含有nadR基因的nadR基因附近区域的约3.3kbp断片扩增，对扩增后的断片用在nadR基因中不存在其识别序列、在卡那霉素耐性基因中存在其识别序列的限制酶HindIII进行处理，由此选出nadR基因被取代为卡那霉素耐性基因的菌株，将所得菌株命名为MG1655nadR基因缺失株(以下有时简称为△nadR株)。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可以从美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获得。
(制造例2)大肠杆菌MG1655glcDEF缺失株的制作
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列已公知(GenBanak登录号U00096)，大肠杆菌的乙醇酸氧化酶的基因(以下，有时简称为g1cDEF)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号L43490)。
根据大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的glcDEF附近区域的基因信息制成下述序列号所示的寡核苷酸：序列号5(TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG)及序列号6(TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG)及序列号7(GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG)及序列号8(AACT GCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC)，使用上述寡核苷酸进行PCR。通过将所得DNA片段分别用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化，分别得到约670bp、790bp的片段。将此DNA片段与用KpnI、PstI消化温度敏感性克隆载体pTH18cs1(GenBank登录号AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000))所得的片段混合，使用连接酶结合后，于30℃下转化至DH5α株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中生长的转化体。
将所得菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中于30℃下培养一晚，从所得菌体中回收质粒。将回收的质粒用XbaI消化，用T4DNA聚合酶进行末端平滑处理。以易位子Tn10(GenBank登录号J01830)为模板，使用序列号9(CAGCTGACTCGACATCTTGGTTACCG)和序列号10(CAGCTGCAAGAGGGTCATTATATTTCG)的寡核苷酸，进行PCR得到四环素耐性基因，将此DNA断片进行T4DNA多聚核苷酸激酶处理，与之前经末端平滑处理的质粒连接。
在30℃下将所得质粒转化至大肠杆菌MG1655株中，在含有10μg/ml氯霉素和30μg/ml四环素的LB琼脂培养板中于30℃下培养一晚，得到转化体。将所得转化体接种至含有30μg/m1四环素的LB液体培养基中，于30℃下培养一晚。然后，为了得到上述培养菌体，涂布在含有30μg/ml四环素的LB琼脂培养板上，得到于42℃下生长的菌落。将所得菌落在含有30μg/ml四环素的LB液体培养基中于30℃下培养一晚，进而涂布在含有30μg/ml四环素的LB琼脂培养板上，得到于42℃下生长的菌落。
从出现的菌落中随机挑取100个菌落，将各菌落在含有30μg/ml四环素的LB琼脂培养板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中培养，选出只在含有四环素的LB琼脂培养板上生长的氯霉素敏感性克隆体。进而由上述目标克隆体的染色体DNA通过PCR使含有glcDEF的glcDEF附近区域扩增。
通过进行该PCR，在以野生株MG1655株为代表的glcDEF未被取代为四环素耐性基因的菌株中，约4.0kbp断片被扩增，另一方面，在glcDEF区域被四环素耐性基因取代的菌株中，约2.2kbp断片被扩增。选择通过PCR扩增了约2.2kbp断片的菌株，命名为MG1655g1cDEF缺失株(以下有时简称为△glcDEF株)。
(制造例3)大肠杆菌MG1655nadR&glcDEF缺失株的制作
与制造例2相同地使制造例1所得的△nadR株缺失glcDEF。将所得菌株命名为MG1655nadR&glcDEF缺失株(以下有时简称为△nadR△glcDEF株)。
(制造例4)乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体的构建
大肠杆菌的乳醛还原酶的基因(以下有时简称为fucO)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号M31059)。另外，大肠杆菌的乳醛脱氢酶的基因(以下有时简称为aldA)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号M64541)。
为了获得fucO，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，使用序列号11(GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG)和序列号12(GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG)所示的寡核苷酸，采用PCR法进行扩增，将所得DNA片段用限制酶XbaI及HindIII消化，由此得到约1.2kbp的fucO片段。
为了得到aldA，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，使用序列号13(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGT TCAACATCC)和序列号14(GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAG ACTG)所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，将所得DNA片段用限制酶EcoRI及XbaI消化，由此得到约1.5kbp的aldA片段。
进而，为了得到甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，使用序列号15(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC)和序列号16(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，将所得DNA片段用限制酶EcoRI消化，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。
使用连接酶将上述3个DNA片段和通过用限制酶EcoRI及HindIII消化质粒pUC18(东洋纺织社制)得到的片段结合，然后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中于37℃下培养一晚。从所得菌体中回收质粒，将此质粒命名为pGAPfucO-aldA。
(实施例1)利用乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体进行的△nadR△glcDEF株转化体的构建
将制造例4所得的质粒pGAPfucO-aldA转化至制造例3所得的△nadR△glcDEF株中，通过在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中于37℃下培养一晚，得到△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株。
(制造例5)利用乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体进行的△glcDEF株转化体的构建
将制造例4所得的质粒pGAPfucO-aldA转化至制造例2所得的△glcDEF株中，通过于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，得到△glcDEF/pGAPfucO-aldA株。
(实施例2)利用△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的乙醇酸生产
作为前培养，将实施例1中所得的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-a1dA株植菌到加入三角烧瓶中的25mL LB Broth，Miller培养液(Difco 244620)中，在培养温度35℃、120rpm的条件下搅拌培养一晚。将全部前培养液移到加入475g具有如下组成的培养基的1L容量培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中，进行培养。培养在大气压下、通气量0.5L/min、搅拌速度800rpm、培养温度35℃、pH7.2(用NH3水溶液调整)的条件下进行。在上述条件下最初的葡萄糖完全耗尽后，在剩余时间内以培养基中的葡萄糖浓度低于0.1g/L的可变速度，供给总量40g的葡萄糖。
<培养基组成>
聚胨：          7g/L
葡萄糖：        30g/L
Fe2SO4：        0.09g/L
K2HPO4：        2g/L
KH2PO4：        2g/L
MgSO4·7H2O：   2g/L
(NH4)2SO4：     5g/L
溶剂：水
将培养开始后24小时的菌体通过离心(8000rpm、20分钟)集菌。秤量4.5g集菌后的湿菌体，与65g乙二醇一同悬浮于蒸馏水中，使最终液体量为500mi。将悬浮液移至ABLE公司制培养装置BMJ-01的培养槽中，进行反应70小时。反应在大气压下、通气量0.25L/min、搅拌速度550rpm、反应温度35℃、pH7.2(用NH3水溶液调整)的条件下进行。使用日立制作所制高效液相色谱，按照以下设定，对所得反应液中的乙醇酸蓄积量进行定量。
色谱柱：ULTRON PS-80H(信和化工社制)
洗脱液：高氯酸水溶液(pH2.1)
流速：1.0mL/min
检测器：UV检测器
测定波长：280nm
另外，根据在50℃下使部分湿菌体干燥后的干燥重量求出用于反应的菌体的干燥菌体重量。
每1g△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株干燥菌体的乙醇酸生产量为27.1g。
另外，确认△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的生长速度与比较例1中△glcDEF/pGAPfucO-aldA株相同，不会引起由nadR基因破坏导致的生长延迟。
(比较例1)利用△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的乙醇酸生产
对制造例5所得的△glcDEF/pGAPfucO-aldA株，与实施例2相同地进行培养及生产乙醇酸。每1g△glcDEF/pGAPfucO-aldA株干燥菌体的乙醇酸生产量为20.2g。
(参考例1)△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株、△glcDEF/pGAPfucO-aldA株中的细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的测定
将△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株、及△glcDEF/pGAPfucO-aldA株与实施例2相同地进行培养。
将培养开始后24小时的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株及△glcDEF/pGAPfucO-aldA株各取1mL分别置于2个微量沉淀管中，于4℃下离心、集菌。2个沉淀管中1个用于NAD测定、1个用于NADH测定，分别进行下述处理。
向NAD测定用样品中，每1.5mg集菌后的湿菌体加入400μL的0.04mol/L盐酸水溶液，使其悬浮。将悬浮液在90℃下加热3分钟后，于冰上骤冷。使用此处理液的上清液，制成具有如下所示组成的反应液。需要说明的是，作为1mol/L Tris-HCl使用pH为9.0的溶液。另外，作为醇脱氢酶，使用将SIGMA公司制醇脱氢酶(A3263)溶解于10mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)中形成的400单位/mL(其中，1单位是在pH8.8、25℃的条件下、1分钟内将1μmol乙醇变为乙醛所需的酶量)溶液。根据TetraColor ONE(生化学工业社制)的方案测定反应液在450nm处的吸光度。需要说明的是，测定对SIGMA公司制NAD的溶液进行相同处理后的溶液，由此制作标准曲线，求出样品的NAD浓度。
向NADH测定用样品中，每1.5mg集菌后的湿菌体加入400μL的0.04mol/L氢氧化钾水溶液，使其悬浮。将悬浮液在90℃下加热3分钟后，在冰上骤冷。使用此处理液的上清液，制成如下所示组成的反应液。需要说明的是，作为1mol/L Tris-HCl，使用pH8.8的溶液。另外，作为醇脱氢酶，使用将SIGMA公司制醇脱氢酶(A3263)溶解于10mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)中形成的400单位/mL(其中，1单位是在pH8.8、25℃的条件下、1分钟内将1μmol乙醇变为乙醛所需的酶量)溶液。
根据TetraColor ONE(生化学工业社制)的方案测定反应液在450nm处的吸光度。需要说明的是，测定对SIGMA公司制NADH的溶液进行相同处理后的溶液，由此制作标准曲线，求出样品的NADH浓度。
其结果，△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的NAD量、NADH量与△glcDEF/pGAPfucO-aldA株相比，分别增加1.7倍、1.6倍。由此确认使nadR基因缺失的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株中，NAD及NADH即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产能力被强化。
<反应液组成>
样品上清液：        25μL
1mol/L Tris-HCl：   25μL
25％乙醇：          10μL
纯水：              20μL
TetraColor ONE(生化学工业社制)：10μL
醇脱氢酶：10μL
(制造例6)乳醛还原酶、乳醛脱氢酶、NADH脱氢酶同时表达载体的构建
大肠杆菌的NADH脱氢酶的基因(以下有时简称为ndh)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号V00306)。
为了获取ndh，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号17(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGACTACGGCATTGAAAAAGATTGTG)和序列号18(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTCAAACG)所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，由此得到约13kbp的ndh片段。将所得ndh片段进行T4DNA多聚核苷酸激酶处理。将此DNA片段与将制造例4制成的pGAPfucO-aldA质粒用HindIII消化进行末端平滑处理、脱磷酸化处理后的片段混合，用连接酶结合后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚，从所得菌体中回收质粒，将所得质粒命名为pGAPfucO-aldA-ndh。
(实施例3)利用乳醛还原酶、乳醛脱氢酶、NADH脱氢酶同时表达载体构建△nadR△glcDEF株转化体
将制造例6所得的质粒pGAPfucO-aldA-ndh转化至制造例3所得的△nadR△glcDEF株中，通过于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，得到△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株。
(实施例4)利用△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生产
对实施例3所得的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株，与实施例2相同地进行培养及乙醇酸生产。需要说明的是，与实施例2中培养的结果相比，此菌株未呈现出由强化ndh导致的生长延迟。每1g△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的干燥菌体的乙醇酸生产量与比较例1及实施例2的结果一同示于表1。
由比较例1和实施例2的比较可知，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的强化，使得乙醇酸的生产率提高至1.3倍。
另外，由比较例1和实施例4的比较可知，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的强化及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的强化，使得乙醇酸的生产率提高至3.6倍。
[表1]
Figure BSA0000093194270000221
(制造例7)乳醛还原酶、乳醛脱氢酶、烟酸磷酸核糖转移酶同时表达载体的构建
大肠杆菌的烟酸磷酸核糖转移酶的基因(pncB)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号J05568)。
为了获取pncB，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号19(CGTGCAATTGCCGGAGAAAGTCTTATGACACAATTCGCTTCTC)及序列号20(CGCTCTAGATTAACTGGCTTTTTTAATATGCG)所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，由此得到约1.2kbp的pncB片段。进而，将所得pncB片段进行T4DNA多聚核苷酸激酶处理。将此DNA片段和将制造例4制成的pGAPfuco-aldA质粒用HindIII消化，进行末端平滑处理，混合脱磷酸化处理后的片段，用连接酶结合后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚，从所得菌体中回收质粒，将该质粒命名为pGAPfucO-aldA-pncB。
(实施例5)利用乳醛还原酶、乳醛脱氢酶、烟酸磷酸核糖转移酶同时表达载体构建△glcDEF转化体
将制造例7所得的质粒pGAPfucO-aldA-pncB转化至制造例2所得的△glcDEF株中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养-晚，由此得到△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株。
(实施例6)利用△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株的乙醇酸生产
对于实施例5所得的△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株，与实施例2相同地进行培养及乙醇酸生产。每1g△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株的干燥菌体的乙醇酸生产量为26.7g。与比较例1的每1g△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的干燥菌体的乙醇酸量(20.2g)相比，pncB的强化，使得生产率提高至1.3倍。
(参考例2)△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株中的细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的测定
对于实施例5所得的△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株及作为对照的△glcDEF/pGAPfucO-aldA，与参考例1相同地进行培养及测定细胞内NAD量、NADH量。其结果，在△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株中，NAD量、NADH量分别为△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的2.6倍、2.1倍。由此，确认强化了pncB的△glcDEF/pGAPfucO-aldA-pncB株中，NAD及NADH、即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生产能力被强化。
(参考例3)△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株、△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株中的细胞内NAD及NADH含量测定
对于△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株、及△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株，与实施例2相同地进行培养及乙醇酸生产。对于乙醇酸生产时的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株、及△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA株，在一定时间内取样，与参考例1相同地测定细胞内NAD量、NADH量。图1表示此时NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)。横轴表示反应时间(hr)，纵轴表示NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)。
在△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株中，通常情况下NADH/NAD比的值小，表示由NADH再生为NAD。
(制造例8)NADH脱氢酶表达载体的构建
大肠杆菌的NADH脱氢酶的基因(以下有时简称为ndh)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号V00306)。为了获取ndh，用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号17和序列号21(AAAATAAGCTTCGATTAATGCAACTTCAAACG)所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，将所得的DNA片段用限制酶EcoRI及HindIII消化，由此得到约1.3kbp的ndh片段。
将上述DNA片段、和将质粒pUC18(东洋纺织社制)用限制酶EcoRI及HindIII消化而得到的片段用连接酶结合后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚。从所得菌体中回收质粒，确认准确地插入ndh的DNA片段后，用限制酶EcoRI处理，进而进行脱磷酸化处理。
另外，为了获取GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号15和序列号16所示的寡核苷酸，采用PCR法扩增，将所得的DNA片段用限制酶EcoRI消化，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。用连接酶将此DNA片段与上述经EcoRI处理、脱磷酸化处理的质粒结合后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚。由所得菌体回收质粒，确认准确地插入GAPDH启动子的片段，将此质粒命名为pGAPndh。
(实施例7)利用NADH脱氢酶表达载体构建△nadR株转化体及△nadR△glcDEF株转化体
将制造例1所得的△nadR株及制造例3所得的△nadR△glcDEF用制造例8所得的质粒pGAPndh转化，于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，由此得到△nadR/pGAPndh株及△nadR△glcDEF/pGAPndh株。
(制造例9)利用NADH脱氢酶表达载体的MG1655株转化体构建
通过制造例8所得的质粒pGAPndh转化大肠杆菌野生株MG1655株，于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，由此得到MG1655/pGAPndh株。
(实施例8)利用△nadR/pGAPndh株、△nadR△glcDEF/pGAPndh株的乙醇酸生产
在加入5mL培养基的试验管中分别植菌实施例7所得的△nadR/pGAPndh株、△nadR△glcDEF/pGAPndh株及作为对照的△nadR株、MG1655/pGAPndh、野生株MG1655株，所述培养基在LB Broth，Miller培养液(Difco244620)中添加葡萄糖使终浓度为0.2％，在培养温度37℃、200rpm的条件下搅拌培养一晚。将全部培养液离心，测定所得湿菌体的重量后，制成1ml如下所示的反应液，使用试验管在30℃、200rpm下搅拌，进行48小时的乙醇酸生产。
<反应液组成>
1mol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)：250μL
乙二醇：50μL
菌体：由培养液回收的全部菌体
用纯水调至1ml
各个菌株的每1g湿菌体的乙醇酸生产量如表2所示。表明△nadR/pGAPndh株、△nadR△glcDEF/pGAPndh株中乙醇酸的生产率显著地提高。
[表2]
Figure BSA0000093194270000261
(实施例9)探讨利用△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生产反应的温度条件
对于实施例3所得的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株，与实施例2相同地进行培养。其中，使培养基中聚胨的浓度为1g/L。对于所得的菌体，与实施例2相同地进行乙醇酸生产反应。其中，使加入反应中的湿菌体量为7g、搅拌速度为750rpm、反应时间为24小时，分别在反应温度为30℃、35℃、37℃、及40℃的条件下实施。图2表示此时的乙醇酸蓄积量。横轴表示反应时间(hr)，纵轴表示乙醇酸蓄积量(g/L)。
通过△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株，在上述条件下也能生产充分量的乙醇酸。
(实施例10)探讨利用△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生产反应的pH条件
对于实施例3所得的△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株，与实施例2相同地进行培养。其中，使培养基中聚胨的浓度为1g/L。对于所得菌体，与实施例2相同地实施乙醇酸生产反应。其中，在将反应液pH分别控制为pH7.7、pH7.2、pH6.5、pH6.0、pH4.3的条件下实施。图3表示此时的乙醇酸蓄积量。横轴表示反应时间(hr)，纵轴表示乙醇酸蓄积浓度(g/L)。
利用△nadR△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生产在pH为6.0以上的条件可以实现。
产业上的可利用性
本发明的羟基羧酸的生产方法及微生物，可以用于作为聚合物原料或药物中间体有用的乙醇酸等羟基羧酸类的制造。
Figure ISA0000093194290000011
Figure ISA0000093194290000021
Figure ISA0000093194290000031
Figure ISA0000093194290000041
Figure ISA0000093194290000071

Claims (19)

1.一种羟基羧酸的生产方法，所述方法使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇制造羟基羧酸，其特征在于，使用强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，微生物是通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作而强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物中导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶的基因的质粒。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的微生物。
4.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于，微生物是通过导入质粒而强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的微生物，所述质粒是组入了NADH脱氢酶基因的质粒。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性的微生物。
6.如权利要求3所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性的微生物。
7.如权利要求1、3、5或6所述的生产方法，其特征在于，微生物是将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了的微生物。
8.如权利要求1～7中任一项所述的生产方法，其特征在于，末端具有羟基的脂肪族多元醇为乙二醇，羟基羧酸为乙醇酸。
9.一种微生物，是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性且通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作而强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物中导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶的基因的质粒。
10.如权利要求9所述的微生物，其特征在于，强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力。
11.一种微生物，是强化了NADH脱氢酶的活性且通过进行下述(1)及(2)中的至少一个基因操作强化了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产能力的微生物，
(1)使微生物内的nadR基因缺失、变异、或取代；
(2)向微生物内导入质粒，所述质粒是组入了微生物内的烟酸磷酸核糖转移酶基因的质粒。
12.如权利要求9或10所述的微生物，其特征在于，将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了。
13.如权利要求11所述的微生物，其特征在于，将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了。
14.如权利要求1～8中任一项所述的生产方法，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
15.如权利要求14所述的生产方法，其中，微生物为大肠杆菌。
16.如权利要求9、10、12中任一项所述的微生物，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
17.如权利要求11或13所述的微生物，其中，微生物为埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属、光杆状菌属中的任一种。
18.如权利要求16所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌。
19.如权利要求17所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌。
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