KR20170058471A - 2,3-부탄디올 생산능이 제거된 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 리포폴리사카라이드 생합성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, dhaT 오페론 및 폴메이트디하이드로케네이즈가 과발현되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 고분자 단량체, 의료산업, 산업수지 등 산업적으로 다양하게 활용가능한 1,3-프로판디올을, 부산물인 2,3-부탄디올의 생성없이 글리세롤로부터 고효율로 생산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 고분자 단량체, 의료산업, 산업수지 등 산업적으로 다양하게 활용가능한 1,3-프로판디올을, 부산물인 2,3-부탄디올의 생성없이 글리세롤로부터 고효율로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 리포폴리사카라이드 생합성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, dhaT 오페론 및 폴메이트디하이드로케네이즈가 과발현되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
1,3-프로판디올은 고분자 합성을 위한 단량체, 의료 약품, 산업 수지 등 산업적으로 다양한 활용적 가치가 있는 화학물이다. 이에 따라 매년 1,3-프로판디올 시장의 규모가 급속히 확장되고 있으며, 여러 산업체에서 관심을 기울이고 있다. 1,3-프로판디올은 석유화학 공정을 통한 생산방법과 미생물 발효를 통한 생산방법이 알려져 있으며, 석유화학공정을 이용한 생산이 주류를 이루어 왔다. 그러나 화석 연료 사용으로 인한 환경오염과 매장 한계에 따른 경제적 문제, 매장의 편향성으로 인해 발생되는 국제적 문제들로 인해, 미생물 발효를 통한 1,3-프로판디올 생산에 대한 관심이 대두되고 있다.
아울러, 바이오디젤 산업 발전으로 인해, 바이오디젤 생산 부산물로 글리세롤이 대량 생산되면서 글리세롤 가격은 급격히 하락하였다. 글리세롤은 미생물 발효에 의한 1,3-프로판디올 생산시 필요한 대표적인 탄소원으로 사용되기 때문에, 경제적인 원료인 글리세롤을 이용한 미생물 발효를 통한 1,3-프로판디올 생산의 경제성이 높아지고 있다.
한편, 발효 조건 최적화와 미생물 대사회로 조작은 미생물 발효를 통한 특정 대사산물 생산성 향상을 위해 주로 수행되며, 그 중에서도 대사공학적인 관점에서 미생물의 대사 경로와 역할을 이해하고 목표하는 대사산물의 향상을 위하여 유전자를 과발현시키고, 미생물 게놈 상의 특정 유전자를 제거하는 방법은 대사공학 분야에서 가장 근본적인 접근이라 할 수 있다.
미생물은 발효 과정에서 목적하는 대사산물을 포함하여 여러 부산물을 동시에 생산한다. 이러한 부산물의 생산은 목적산물의 수율과 생산성을 감소시키고, 생산에 필요한 조요소의 접근을 제한하며, 과량 생산시 세포의 성장을 저해한다. 따라서 미생물 발효를 통한 목적산물 생산시에는 부산물을 제거하기 위한 노력이 수반되며, 이러한 노력 중 하나로, 게노믹스를 기반으로 특정 부산물 생산에 관여한 유전자를 찾고, 이를 유전자 제거기술을 통해 게놈 상에서 제거하는 방법이 사용된다. 목적산물의 생산능을 향상시키기 위해 생산에 직접적 또는 간접적으로 관련된 유전자를 플라스미드를 기반으로 클로닝하여 과발현시켜 목적산물로의 대사회로를 활성화시키는 연구가 진행되어 왔다.
1,3-프로판디올 생산균주는 발효 과정에서 2,3-부탄디올, 아세트산, 숙신산, 에탄올, 락틱산, 3-하이드록시프로피온산 등의 부산물을 동시에 생산한다. 이러한, 부산물은 1,3-프로판디올을 분류 정제하는데 있어서 역시 많은 어려움을 야기한다. 특히, 2,3-부탄디올은 1,3-프로판디올과 끓는점이 비슷하고, 물리적 특성이 비슷해 1,3-프로판디올 분류 정제 작업에 많은 경제적 비용을 요구하며, 이는 전체 발효공정 비용의 50% 이상을 차지한다 (Z.L Xiu and A.P Zeng, Appl Microbiol Biotechnol,78. 917. 2008). 이러한 부산물의 생산은 1,3-프로판디올 생산의 수율을 감소시킬 뿐만 아니라, 1,3-프로판디올 생산에 사용될 조요소를 감소시키고, 배지의 산성화를 진행하는 등의 부작용을 야기한다. 이에 따라 1,3-프로판디올 생산 균주의 부산물 생산을 제거하기 위한 여러 노력이 진행되었다.
그 중, 1,3-프로판디올 생성균주에서 락틱산이나 에탄올 생산경로를 제거하여 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(G Yang et al., Appl Microbiol Biotechnol 73:1017, 2007; YZ Xu et al., Biotechnology and Bioenginee ring, 104(5):1,2009 ; Y Zhang et al., Metabolic Engineering 8:578, 2006), dhaT 오페론을 과발현시켜 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(J Hao et al., J Ind Microbiol Biotechnol 35:735, 2008; MY Seo et al., Appl Microbiol Biotechnol, 84:527, 2009), 부산물인 2,3-부탄디올 생산만을 제거하여 1,3-프로판디올의 생산성을 향상시킨 연구(G Zhang et al., Appl Biochem Biotechnol, 168:116, 2012) 등이 있다.
하지만 이러한 노력들은 목표 대사산물인 1,3-프로판디올의 생산성 뿐만아니라 다양한 부산물의 생산성 역시 향상시킴으로써 그 목적을 달성하지 못했다. 아울러, 2,3-부탄디올 생산 관련 유전자의 제거는 세포의 성장을 크게 저해했으며 이에 따라 목표 대사산물인 1,3-프로판디올의 생산성 역시 감소되었고, 2,3-부탄디올을 제외한 다양한 부산물의 생산성을 역시 향상시켰다. 또한, 목적산물인 1,3-프로판디올은 글리세롤 환원대사회로를 통해 생산되며 조요소로써 NADH 를 소모한다. 하지만 현재까지 유전적 방법으로 NADH를 공급하려는 노력이 없었다.
아울러, 기존에 사용되는 1,3-프로판디올 생산균주인 클렙시엘라 뉴모니에는 병원성을 지니는 균주로서 산업적으로 사용되는데는 그 한계가 있다. 병원균을 이용한 화학물 생성은 그 생산물 사용에도 제한이 있지만, 발효 후 균주의 완벽한 살균을 요구하기 때문에 많은 경제적 비용이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 보다 경제적으로 1,3-프로판디올을 생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 1,3-프로판디올 생산 균주인 클렙시엘라 뉴모니에 균주의 병원성을 제거하고, 부산물인 락틱산과 2,3-부탄디올 생산을 제거하고, 1,3-프로판디올 생산에 필요한 조요소를 공급하는 유전자와 1,3-프로판디올 생산에 관련된 유전자를 과발현시키는 경우, 클렙시엘라 뉴모니아의 1,2-프로판디올의 수율이 현저하게 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 1,3-프로판디올의 수율이 향상되도록 대사공학적으로 설계된 1,3-프로판디올을 생산용 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 용하여, 1,3-프로판디올을 생산용 재조합 미생물을 이용한 경제적인 1,3-프로판디올 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 리포폴리사카라이드 생합성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, dhaT 오페론 및 폴메이트디하이드로케네이즈가 과발현되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 (a) 상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 고분자 단량체, 의료산업, 산업수지 등 산업적으로 다양하게 활용가능한 1,3-프로판디올을, 부산물인 2,3-부탄디올의 생성없이 글리세롤로부터 고효율로 생산할 수 있다.
도 1은 클렙시엘라 뉴모니에 균주의 2,3-부탄디올 생산 대사회로와 관련된 유전자를 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 KMK-11 균주의 미량호기성 조건에서 유가배양발효 결과를 나타낸 것으로, X 축은 시간 (h), Y 축은 농도 (g/L) 를 의미한다.
도 3은 본 발명의 KMK-11 균주의 미량호기성 조건에서 유가배양발효 시 생산된 부산물을 나타낸 것으로, X 축은 시간(h), Y 축은 농도(g/L)를 의미한다.
도 4는 본 발명의 KMK-11BT 균주의 혐기성 조건에서 유가배양발효 결과를 나타낸 것으로, X 축은 시간 (h), Y 축은 농도 (g/L) 를 의미한다.
도 5는 본 발명의 KMK-11BT 균주의 혐기성 조건에서 유가배양발효 시 생산된 부산물을 나타낸 것으로, X 축은 시간(시), Y 축은 농도(g/L)를 의미한다.
도 6은 본 발명에서 개발된 대사회로가 공정된 1,3-프로판디올 생산 균주의 대사회로를 나타낸 것으로, 엑스표시는 제거된 유전자를 의미하고, 붉은색 화살표는 과발현된 동종 유전자를 의미하며, 보라색 박스는 발현된 외래 유전자를 의미한다.
도 2는 본 발명의 KMK-11 균주의 미량호기성 조건에서 유가배양발효 결과를 나타낸 것으로, X 축은 시간 (h), Y 축은 농도 (g/L) 를 의미한다.
도 3은 본 발명의 KMK-11 균주의 미량호기성 조건에서 유가배양발효 시 생산된 부산물을 나타낸 것으로, X 축은 시간(h), Y 축은 농도(g/L)를 의미한다.
도 4는 본 발명의 KMK-11BT 균주의 혐기성 조건에서 유가배양발효 결과를 나타낸 것으로, X 축은 시간 (h), Y 축은 농도 (g/L) 를 의미한다.
도 5는 본 발명의 KMK-11BT 균주의 혐기성 조건에서 유가배양발효 시 생산된 부산물을 나타낸 것으로, X 축은 시간(시), Y 축은 농도(g/L)를 의미한다.
도 6은 본 발명에서 개발된 대사회로가 공정된 1,3-프로판디올 생산 균주의 대사회로를 나타낸 것으로, 엑스표시는 제거된 유전자를 의미하고, 붉은색 화살표는 과발현된 동종 유전자를 의미하며, 보라색 박스는 발현된 외래 유전자를 의미한다.
본 발명에서는 종래 개발된 1,3-프로판디올 생산균주와 비교하여, 병원성이 제거되고, 1,3-프로판디올 분류/정제 과정에 많은 비용을 요구하는 2,3-부탄디올의 생산이 완벽하게 제거되고, 혐기발효를 통해 락틱산, 에탄올, 아세트산, 숙신산 등의 당양한 부산물 생성을 동시에 감소시킨 재조합 크립시엘라 뉴모니에 균주를 제조하였으며, 상기 제조된 재조합 균주는 야생종 및 종래 개발된 균주에 비해 우수한 1,3-프로판디올 수율 및 생산성을 나타낸다(도 6).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 리포폴리사카라이드 생합성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, dhaT 오페론 및 폴메이트디하이드로케네이즈가 과발현되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 1,3-프로판디올 생산용 군주로는 크립시엘라 뉴모니에를 사용하였으며, 크립시엘라 뉴모니에 균주가 병원성을 야기하는 요인인 리포폴리사카라이드의 생서을 억제하기 위하여, wab 오페론 내의 wabG 유전자를 결실시켰다.
또한, 1,3-프로판디올의 부산물인 락테이트의 생성을 억제하기 위하여, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ldhA)를 결실시켰다.
아울러, 1,3-프로판디올과 물리적으로 물성이 유사하여, 정제시에 어려움을 초래하는 부산물인 2,3-부탄디올의 생성을 억제하기 위하여, α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(budA)를 결실시켰다.
또한, 글리세롤 환원대사회로의 흐름을 향상시키고, 1,3-프로판디올 생산성을 향상시키기 위해 폴메이트 디하이드로게나아제 유전자(fdh)와 dhaB 오페론 및 dhaT 오페론을 플라스미드에 각각 클로닝하여 과발현 시켰다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일양태에서는 재조합 균주인 KMK-11TF 균주를 사용하여, 26시간 발효에서 26시간 발효에서 67 g/L 의 1,3-프로판디올이 생성되었으며, 이 수치는 현재까지 2,3-부탄디올이 제거된 균주에서 생산된 최고 수준의 1,3-프로판디올 생산성과 생산속도이다. 또한, 유가배양발효에서 생산된 부산물은 미량호기성 조건에서와 비교해 크게 감소되었다. 미량호기성 조건에서 주요 부산물이었던 숙신산은 4 g/L 정도가 생산되었고 이는 75% 감소된 수치이다. 또한 피루브산은 완전히 생산되지 않았다. 미량호기성 조건에서 13g/L가 생산된 에탄올은 16 g/L로 다소 증가하였고, 아세트산의 생산은 6 g/L 로 다소 크게 증가되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: wabG 유전자, ldhA 유전자 및 budA 유전자가 제거된 돌연변이 균주 개발
클렙시엘라 뉴모니에 균주가 병원성을 야기하는 요인들 중에 세포막에 형성되어 있는 리포폴리사카라이드는 병원성 전달에 큰 기여를 한다 (SG Jung et al., Appl Microbiol Biotechnol, 97:1997, 2013). 이 리포폴리사카라이드는 wab 오페론 내의 유전자 발현으로 구성되며, 그 중 wabG 유전자는 중심적인 역할을 한다. 따라서 생산균주의 병원을 제거하기 위해 클렙시엘라 뉴모니에 균주 게놈 상에 wabG 유전자(Genbank : AEK00461.1)는 제거되었으며, 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-01로 명명하였다.
wabG 유전자 및 이후의 다른 유전자의 제거는 람다 레드 리콤비네이션 방법을 이용하였으며(Jung et al. Applied and environmental microbiology 80 (19), 6195-6203, 2014), 1,3-프로판디올 생산 균주로는 크렙시엘라 뉴모이에 균주(Klebsiella pneumoniae KCTC 2242)를 사용하였다.
클랩시엘라 뉴모니에의 wabG 유전자를 제거하기 위해 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용하였다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환 시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 wabG 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 wabG 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.
다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 클렙시엘라 뉴모니에를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈 (L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머가 제작되었다. wabG 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 wabG_con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.
야생종의 클렙시엘라 뉴모니에 균주 발효시 주요 부산물로써 락틱산이 생산된다. 락틱산은 1,3-프로판디올과 생산에 필요한 NADH 사용에 있어 경쟁 관계에 있을 뿐만 아니라, 과도한 락틱산의 생산은 발효 배지의 산성화를 유도해 세포 성장 저해를 야기함으로 락틱산을 생산하는데 관련된 유전자인 ldhA 유전자(GenBank: AEJ97914.1)는 상기 제조된 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-01 균주에서 제거되었고, 크렙시엘라 뉴모니에 KMK-02 라 명명하였다.
KMK-01의 ldhA 유전자를 제거하기 위해 역시 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환 시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 ldhA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 ldhA 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.
다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-01 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈 (L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머가 제작되었다. ldhA 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 ldhA con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.
부산물로써 생산되는 2,3-부탄디올은 섭취되는 글리세롤의 18%의 탄소흐름을 소비할 뿐만아니라, 발효 후 1,3-프로판디올 분리 정제 과정시 많은 비용을 소요하므로 2,3-부탄디올 생산을 제거하기 위하여, budA 유전자는 제거하였다.
KMK-02의 budA 유전자를 제거하기 위해 역시 람다 레드(Lambda red) 재조합 방법을 사용했다. 우선 세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합(homologous recombination)의 효율을 높이기 위한 효소 엑소, 감마, 베타의 발현 벡터를 컴피턴트 세포로 준비된 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 형질전환 시켰다. BAD 프로모터를 가지고 테트라사이클린 저항성이 있는 pRedET 벡터를 본 발명에 사용하였고, 형질전환을 확인하였다. 다음으로 상동재조합을 위한 선형 유전자를 제작하였다. FRT-카나마이신-FRT 카세트를 가진 pKD4 벡터를 주형으로 사용하였다. 상동재조합이 발생하는 위치인 클렙시엘라 뉴모니에의 budA 유전자 양 옆의 상동한 50개의 염기쌍과 주형으로 쓰는 pKD4의 FRT-카나마이신-FRT 카세트를 중합하기 위한 20개의 염기쌍, 총 70개의 염기쌍을 프라이머로 제작하였고 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 budA 유전자를 제거하기 위한 선형 유전자를 제작하였다. 카나마이신은 상동재조합이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위한 항 의약(anti drug)이고, FRT 부위는 목표 유전자가 제거 된 후 다른 유전자의 제거를 위해 항 의약을 제거해 주는 역할을 한다.
다음 단계로 pRedET 벡터가 형질전환 된 것이 확인된 KMK-02 균주를 30℃에서 배양하였다. pRedET 벡터는 온도에 민감한 벡터로써 37℃이상이 되면 그 활성을 잃기 때문에 30℃에서 배양하였다. 또한 배양 1시간 후 OD600이 0.1 정도 되었을 때 10%의 아라비노즈 (L-arabinose)로 pRedET의 레드 람다 재조합 효소 발현 유도를 시켜주었다. 1시간 더 배양시켜 OD600이 0.6정도가 되었을 때 전기천공법을 위한 컴피턴트 세포로 만든 후 제작한 선형유전자를 형질전환 하였다. LB 배지에 37℃에서 1시간 배양 후 카나마이신이 12.5 ㎎/㎖ 첨가된 LB 고체배지에 스프레딩하고 12시간 배양시켰다. 상동재조합의 성공 여부를 확인하기 위해 2가지의 프라이머가 제작되었다. budA 유전자 양옆의 상동한 20-24개의 염기쌍을 budA con_A 와 _B로 명칭하였다. 이 2가지 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR 을 수행하였을 때 PCR 생산물의 길이를 통해 상동재조합의 여부를 확인하였다.
2,3-부탄디올을 생산하는 유전자는 bud 오페론으로 도 1에 나타낸 바와 같이 구성되어 있다. 아세토락테이트는 아미노산인 아이소류신과 발린 생산에 필요한 전구체이므로 budB 유전자는 제거하지 않았고, budC 유전자를 제거할 시 2,3-부탄디올 대신 아세토인이 과량 생산되므로 budB 유전자가 2,3-부탄디올 생산 제거를 위해 선택되었다. budA 유전자(AEJ98545.1)는 KMK-02 균주에서 제거되었으며, KMK-11 로 명명하였다.
본 발명에서 사용된 프라이머를 표 2에 나타내었고, 본 발명에서 개발된 돌연변이 재조합 균주와 유전적 특징을 표 3에 나타내었다.
Primer name | Primer sequence ( 5' → 3 ') |
wabG_FKF_fw (서열번호 4) |
GATTTAATCCCTACCGACGCGGTCATCGCGGCGGCGAAAAAGGTACTGGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
wabG _FKF_rv (서열번호 5) |
TTCCGCGCCGCCGCCCGGCAGGCCATCGATAACAAACAATATGCGCATCGGTCCATATGAATATCCTCCT |
wabG _con_A (서열번호 6) |
TTCCGGGAACACTACATCGT |
wabG _con_B (서열번호 7) |
CCGAGATAGGAGGCAGAGAA |
ldhA_FKF_fw (서열번호 8) |
ATTATTTTAAATATGCTACCGTGACGGTATAATCACTGGAGAAAAGTCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
ldhA _FKF_rv (서열번호 9) |
GATTATCTGAATGTGCTCCCCCCGGGAGAGGAGCACAAAAGGGAAAGGCAGTCCATATGAATATCCTCCT |
ldhA _con_A (서열번호 10) |
GAATTAGGATTAGCACCCTCTCA |
ldhA _con_B (서열번호 11) |
CCAAGCCAGTGTAACGGTATC |
budA_FKF_fw (서열번호 12) |
GTCAACATTTATTTAACCTTTCTTATATTTGTTGAACGAGGAAGTGGTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC |
budA _FKF_rv (서열번호 13) |
GCGCCGTGCGCCCACTGGCGTACCGGATACTGTTTGTCCATGTGACCCCCCCTCCTTAGTTCCTATTCC |
budA _con_A (서열번호 14) |
ACGGAGGCTGTGAAATACCC |
budA _con_B (서열번호 15) |
TTCGTGGCGTACCGGAATA |
pZS21_dhaB_fw (서열번호 16) |
TTTAAGCTTATGAAAAGATCAAAACGATTTGC |
pZS21_dhaB_rv (서열번호 17) |
TTTACGCGTCCGTTTAATTCGCCTGACC |
pZS21_fdh_fw (서열번호 18) |
TATAAGCTTATGAAAATTGTTCTGGTGCTG |
pZS21_fdh_rv (서열번호 19) |
ATACCCGGGTTATTTTTTATCGTGTTTACCGTACG |
pZA31_dhaT_fw (서열번호 20) |
TTTAAGCTTATGGCGGGCGACAAAATA |
pZA31_dhaT_rv (서열번호 21) |
AAAGGATCCTCAAGCGCAAGCATCAGG |
a Underlined sequences are the homologous sequence with the target genes of K. pneumoniae. b Restriction sites highlighted in bold
상기 제조된 재조합 균주 KMK-01, KMK-02, KMK-11과 야생종 크립시엘라 뉴모니에를 배양하여, 1,3-프로판디올 생성과 부산물 생성을 확인하였다.
플라스크 배양은 50ml의 발효액이 포함된 250ml 삼각플라스크에서 수행하였고, 37℃, 250rpm에서 수행하였다. 또한 발효기를 이용한 발효에서는 1L 발효액이 포함된 3L 발효기에서 수행하였고, 5M NaOH 를 이용하여 pH7을 유지하고, 300rpm에서 수행하였다. 미량호기성 발효에서는 공기를 0.2 vvm 주입하였고, 혐기 발효시에는 질소 가스를 0.2 vvm 주입하였다.
본 실시예 및 이후 실시예에서 사용한 발효배지의 조성은 1L 당 3 g KH2PO4, 6.8 g Na2HPO4, 0.75 g KCl, 5.35 g (NH4)2SO4, 0.28 g Na2SO4, 0.26 g MgSO4ㅇ7H2O, 0.42 g citric acid, 5 g yeast extract, 10 g Casamino Acids 가 포함되었고, 1ml 씩의 Fe 솔루션과 Trace element 솔루션 이 포함되고, 각 솔루션의 구성 성분은 표 4에 나타내었다. 탄소원으로 사용된 글리세롤과 메니톨은 필요에 따라 농도를 조절하여 발효 배지에 포함되었다. 배지 조성에 사용된 모든 시약들은 시그마 알드리치에서 구입되었다.
대사과정을 통하여 생산된 1,3-프로판디올을 비롯한 글리세롤, 솔비톨, 글루코네이트, 글루코즈 등의 탄소원과 락틱산, 숙신산, 피루브산, 아세트산, 에탄올, 3-하이드록시프로피오닉산 등의 부산물을 모두 HPLC를 통해 분석하였으며 운행조건 및 이동상은 표 5에 나타내었다.
품 목 | 조 건 |
HPLC 모델 | Waters HPLC1500 series |
컬럼 | Sugar SH1011 column (Shodex, Japan) |
유속 | 0.6 ml/min |
주입부피 | 10ul |
이동상 | 5mM 황산 |
오븐 온도 | 60℃ |
작동 시간 | 25분 |
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 wabG 유전자가 제거된 KMK-01 균주는 야생형 균주에 비하여, 글리세롤 섭취와 1,3-프로판디올 생산성을 약 50% 향상되었다. 대부분의 부산물 생산량은 크게 차이가 없었으나 락틱산의 생산력은 약 50% 감소하였다. 추가적으로 ldhA 균주가 제거된 KMK-02 균주는 락틱산을 거의 생성하지 않았으며, 1,3-프로판디올 생산량은 약 40% 향상되었으나, 수율은 크게 증가하지 않았다. 이러한 결과의 원인은 락틱산 생산의 중단으로 발효 배지의 산성화가 그 부모종에 비해 감소되었고, 이는 세포성장 향상과 대사회로 활성활를 야기한 결과로 보인다.
budA 유전자가 추가적으로 제거된 KMK-11 균주의 경우, 야생형에 비하여 1,3-프로판디올 생산량을 약 50% 감소시킨 결과를 초래했으나, 2,3-부탄디올의 생산은 완벽히 제거되었다.
본 발명에서 개발된 돌연변이 균주의 플라스크 배양 결과를 표 6에 나타내었다.
실시예 2: KMK-11 균주의 미량호기성 조건에서 유가배양발효
플라스크 발효에서 KMK-11 균주의 2,3-부탄디올 생산은 완벽히 제거되었으므로 미량호기성 조건에서 유가배양발효를 통해 1,3-프로판디올 생산성을 향상시키고자 하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 42시간 배양에서 47.26g/L 의 1,3-프로판디올이 생산되었고, 2,3-부탄디올의 생산은 여전히 중단되었다.
본 발효에서 부산물의 생산 경향을 확인해본 결과를 도 3에 나타내었으며, 발효 초기에 아세트산이 급속히 생산되기 시작하며 약 6g/L 생산 후 점차 감소되었다. 숙신산은 약 20g/L 가 생산되어 주요 부산물로써 생산되었으며, 피루브산과 에탄올은 각각 13g/L 씩 생산되었다.
실시예 3: 폴메이트 디하이드로게나아제, dhaB 오페론 및 dhaT 오페론이 과발현된 재조합 미생물의 제작
1,3-프로판디올 생산시 사용되는 NADH 는 글리세롤 산화대사회로에서 생산되므로 글리세롤 산화대사회로 흐름 감소시 1,3-프로판디올 생산 역시 감소되는 문제점을 야기한다. 따라서 캔디다 보이디니 (Candida boidinii) 균주의 폴메이트 디하이드로겐에이즈를 발현시켜 이 문제점을 극복하고자 하였다. 폴메이트 디하이드로겐에이즈는 폴메이트를 기질로 사용해서 이산화탄소로 전환하는 과정에서 NAD+ 를 NADH 로 전환시키므로 생산된 NADH 는 1,3-프로판디올 생산에 이용될수 있다.
아울러, 글리세롤 환원대사회로의 흐름을 향상시키고 1,3-프로판디올 생산성을 향상시키기 위해 1,3-프로판디올 생산에 관련된 dhaB 오페론과 dhaT 오페론은 pZS31MCS 와 pZA31MCS 플라스미드에 각각 클로닝하였다.
크렙시엘라 뉴모니에 균주에서 발현 가능한 플라스미드를 선정하기 위해 대장균에서 사용되는 다양한 플라스미드에 녹색형광단백질을 클로닝하여 렙시엘라 뉴모니에 균주 내에서의 발현을 시도했으며, 그 결과 tetO-1 프로모터를 가지는 pZA31MCS(EXPRESSYS, 독일)와 pZS21MCS(EXPRESSYS, 독일) 플라스미드가 원활히 발현됨을 확인하고, 크렙시엘라 뉴모니에 내에 특정 유전자를 과발현하기 위해 사용되었다.
클로닝을 위한 dhaB 오페론과 dhaT 오페론 유전자의 template 는 클렙시엘라 뉴모니에 KCTC2242 균주의 크로모좀이 사용되었다. 클렙시엘라 뉴모니에 KCTC2242 균주의 크로모좀을 추출하기 위해 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, WI, USA)를 이용하였다. 폴메이트 디하이드로게나아제의 template는 candida boidinii 균주의 크로모좀이 이용되었으며, 역시 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, WI, USA)를 이용하였다.
우선 dhaB 오페론(서열번호 1)은 pZS21_dhaB_fw와 pZS21_dhaB_rv 프라이머를 이용하여 어닐링 온도 63도에서 PCR 을 통해 증폭되었다. PCR 은 Phusion DNA polymerase (NEB, MA, USA)를 이용하였고, 조합은 제품의 설명서를 따랐다. 증폭된 dhaB 오페론 유전자와 pZS21MCS 벡터는 HindIII 와 MluI 제한효소를 이용하여 유전자를 절단한 후 DNA Ligation Kit Mighty Mix (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) 를 이용하여 접합되었다. DH5a 대장균은 재조합된 유전자의 증폭과 클로닝 확인을 위해 이용되었고, DNA sequencing 을 통해 클로닝을 확인하였다.
dhaT 오페론(서열번호 2)은 pZA31_dhaT_fw와 pZA31_dhaT_rv 프라이머를 이용하여 어닐링 온도 66도에서 PCR 을 통해 증폭되었다. PCR 은 Phusion DNA polymerase (NEB, MA, USA)를 이용하였고, 조합은 제품의 설명서를 따랐다. 증폭된 dhaT 오페론 유전자와 pZA31MCS 벡터는 HindIII 와 BamHI 제한효소를 이용하여 유전자를 절단한 후 DNA Ligation Kit Mighty Mix (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) 를 이용하여 접합되었다. DH5a 대장균은 재조합된 유전자의 증폭과 클로닝 확인을 위해 이용되었고, DNA sequencing 을 통해 클로닝을 확인하였다.
폴메니트 디하이드로겐에이즈 유전자(서열번호 3)는 pZS21_fdh_fw와 pZS21_fdh_rv 프라이머를 이용하여 어닐링 온도 65도에서 PCR 을 통해 증폭되었다. PCR 은 Phusion DNA polymerase (NEB, MA, USA)를 이용하였고, 조합은 제품의 설명서를 따랐다. 증폭된 폴메이트 디하이드로겐에이즈 유전자와 pZS21MCS 벡터는 HindIII 와 BamHI 제한효소를 이용하여 유전자를 절단한 후 DNA Ligation Kit Mighty Mix (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan) 를 이용하여 접합되었다. DH5a 대장균은 재조합된 유전자의 증폭과 클로닝 확인을 위해 이용되었고, DNA sequencing 을 통해 클로닝을 확인하였다.
상기 제조된 플라스미드를 KMK-11 균주에 클로닝하여, KNK-11F, KNK-11TF 및 KNK-11BT를 제조하였다.
실시예 4: 1,3-프로판디올 생산에 관련된 유전자 발현과 혐기성 조건에서 유가배양발효
글리세롤은 세포내에서 산화대사회로와 환원대사회로를 통해 이용된다. 실시예 2에서 생산된 숙신산, 피루브산, 에탄올, 아세트산은 모두 산화대사회로를 통해 생산되므로 글리세롤 산화대사회로의 흐름을 감소시킬 필요가 있다. 글리세롤 산화대사회로는 산소가 존재할시 활성화대고 혐기발효시 글리세롤 산화대사회로는 억제되고, 환원대사회로는 활성화되므로 혐기 조건에서의 발효를 진행하였다.
KMK-11 균주에 fdh, dhaB 오페론, dhaT 오페론이 발현된 균주의 플라스크 배양 결과를 표 7에 나타내었다.
폴메이트 디하이드로겐에이즈의 단독 발효는 대조군에 비하여, 1,3-프로판디올 생산에 큰 영향을 주지 못했다. 하지만 dhaT 오페론과 함께 발현되었을 때 1,3-프로판디올의 생산성은 약 22% 증가하였다. 반면 dhaB 오페론과 dhaT 오페론이 함께 발현되었을 때는 1,3-프로판디올 생산성이 약 58% 감소하였다. 1,3-프로판디올은 dhaB 오페론에 의해 3-하이드록시프로피온알데하이드로 전환되고, 이는 다시 dhaT 오페론에 의해 1,3-프로판디올로 전환된다. 1,3-프로판디올의 전구체인 3-하이드록시프로피온알데하이드는 항미생물제로 사용될만큼 세포에 큰 독성을 지닌다. dhaB 오페론을 발현시켰을시에 3-하이드록시프로피온알데하이드의 축적으로 인해 세포의 성장 저해가 예상되며, 반면 dhaT 오페론의 발현은 3-하이드록시프로피온알데하이드가 축적되기 전에 빠른 전환으로 세포의 성장 저해를 완화한 것으로 보인다.
고농도의 1,3-프로판디올 생산을 위해 혐기조건에서 유가배양발효가 진행되었다. 균주는 플라스크 배양에서 좋은 표현형을 보였던 KMK-11BT 균주를 사용하였다. 도 4와 같이 26 시간 발효에서 67 g/L 의 1,3-프로판디올은 생산되었다. 이 수치는 현재까지 2,3-부탄디올이 제거된 균주에서 생산된 최고 수준의 1,3-프로판디올 생산성과 생산속도이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 유가배양발효에서 생산된 부산물은 아래 그래프에서와 같이 미량호기성 조건에서와 비교해 크게 감소되었다. 미량호기성 조건에서 주요 부산물이었던 숙신산은 4 g/L 정도가 생산되었고 이는 75% 감소된 수치이다. 또한 피루브산은 완전히 생산되지 않았다. 미량호기성 조건에서 13g/L 가 생산된 에탄올은 16 g/L 로 다소 증가하였고, 아세트산의 생산은 6 g/L 로 다소 크게 증가되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea University Research & Business Foundation
<120> Recombinant Micororganism for Producing 1,3-Propanediol Without
Ability of Producing 2,3-Butanediol
<130> P15-B295
<160> 21
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 4529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dhaB operon
<400> 1
atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca ggacgggctg 60
attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120
tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gagctggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180
gacatgatcg accgatttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240
atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt cagtcgggag 300
gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360
atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420
aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgctgc tgacgccgcc 480
gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctatgcg 540
ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgccccgg cgttttgacg 600
cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660
gccgagacgg tgtcggtcta cggcaccgaa gcggtattta ccgacggcga tgatactccg 720
tggtcaaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780
tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840
gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca aaacggcgcg 900
gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt gctggcggaa 960
aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020
cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccgacttt 1080
attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140
gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200
ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260
caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt ggaggccgcc 1320
acctacgcgc acggtagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga tctgagtgcg 1380
gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gctgagccgc 1440
agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg ggtcaccggc 1500
gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag tgcggtcaac 1560
gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga acgctgggcg 1620
gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ttgaataagg cggtattcct 1680
gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga gggcggggta 1740
gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc cttcgataaa 1800
caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga gctgattgcc 1860
ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac gtccgacgtc 1920
tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat cggtatccag 1980
tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa cctggagctg 2040
ttctcccagg cgccgctgct gacgctggaa acctaccggc agattggcaa aaacgccgcg 2100
cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca gatggtgcgg 2160
ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca tgtggtgcag 2220
gacgccgagc ccgtcaccct gcacgtcgac ttagtaaggg agtgaccatg agcgagaaaa 2280
ccatgcgcgt gcaggattat ccgttagcca cccgctgccc ggagcatatc ctgacgccta 2340
ccggcaaacc attgaccgat attaccctcg agaaggtgct ctctggcgag gtgggcccgc 2400
aggatgtgcg gatctcctgc cagacccttg agtaccaggc gcagattgcc gagcagatgc 2460
agcgccatgc ggtggcgcgc aatttccgcc gcgcggcgga gcttatcgcc attcctgacg 2520
agcgcattct ggctatctat aacgcgctgc gcccgttccg ctcctcgcag gcggagctgc 2580
tggcgatcgc cgacgagctg gagcacacct ggcatgcgac agtgaatgcc gcctttgtcc 2640
gggagtcggc ggaagtgtat cagcagcggc ataagctgcg taaaggaagc taagcggagg 2700
tcagcatgcc gttaatagcc gggattgata tcggcaacgc caccaccgag gtggcgctgg 2760
cgtccgacga cccgcaggcg agggcgtttg ttgccagcgg gatcgtcgcg acgacgggca 2820
tgaaagggac gcgggacaat atcgccggga ccctcgccgc gctggagcag gccctggcga 2880
aaacaccgtg gtcgatgagc gatgtctctc gcatctatct taacgaagcc gcgccggtga 2940
ttggcgatgt ggcgatggag accatcaccg agaccattat caccgaatcg accatgatcg 3000
gtcataaccc gcagacgccg ggcggggtgg gcgttggcgt ggggacgact atcgccctcg 3060
ggcggctggc gacgctgccg gcggcgcagt atgccgaggg gtggatcgta ctgattgacg 3120
acgccgtcga tttccttgac gccgtgtggt ggctcaatga ggcgctcgac cgggggatca 3180
acgtggtggc ggcgatcctc aaaaaggacg acggcgtgct ggtgaacaac cgcctgcgta 3240
aaaccctgcc ggtggtagat gaagtgacgc tgctggagca ggtccccgag ggggtaatgg 3300
cggcggtgga agtggccgcg ccgggccagg tggtgcggat cctgtcgaat ccctacggga 3360
tcgccacctt cttcgggcta agcccggaag agacccaggc catcgtcccc atcgcccgcg 3420
ccctgattgg caaccgttca gcggtggtgc tcaagacccc gcagggggat gtgcagtcgc 3480
gggtgatccc ggcgggcaac ctctacatta gcggcgaaaa gcgccgcgga gaggccgatg 3540
tcgccgaggg cgcggaagcc atcatgcagg cgatgagcgc ctgcgctccg gtacgcgaca 3600
tccgcggcga accgggcact cacgccggcg gcatgcttga gcgggtgcgc aaggtaatgg 3660
cgtccctgac cgaccatgag atgagcgcga tatacatcca ggatctgctg gcggtggata 3720
cgtttattcc gcgcaaggtg cagggcggga tggccggcga gtgcgccatg gaaaatgccg 3780
tcgggatggc ggcgatggtg aaagcggatc gtctgcaaat gcaggttatc gcccgcgaac 3840
tgagcgcccg actgcagacc gaggtggtgg tgggcggcgt ggaggccaac atggccatcg 3900
ccggggcgtt aaccactccc ggctgtgcgg cgccgctggc gatcctcgac ctcggcgccg 3960
gctcgacgga tgcggcgatc gtcaacgcgg aggggcagat aacggcggtc catctcgccg 4020
gggcggggaa tatggtcagc ctgttgatta aaaccgagct gggcctcgag gatctttcgc 4080
tggcggaagc gataaaaaaa tacccgctgg ccaaagtgga aagcctgttc agtattcgtc 4140
acgagaatgg cgcggtggag ttctttcggg aagccctcag cccggcggtg ttcgccaaag 4200
tggtgtacat caaggagggc gaactggtgc cgatcgataa cgccagcccg ctggaaaaaa 4260
ttcgtctcgt gcgccggcag gcgaaagaga aagtgtttgt caccaactgc ctgcgcgcgc 4320
tgcgccaggt ctcacccggc ggttccattc gcgatatcgc ctttgtggtg ctggtgggcg 4380
gctcatcgct ggactttgag atcccgcagc ttatcacgga agccttgtcg cactatggcg 4440
tggtcgccgg gcagggcaat attcggggaa cagaagggcc gcgcaatgcg gtcgccaccg 4500
ggctgctact ggccggtcag gcgaattaa 4529
<210> 2
<211> 2639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dhaT operon
<400> 2
atggcgggcg acaaaataac gctgacaaaa ataaagcaag ccaaccgaat ggtaatagtt 60
ttttactatc gccccctact gactattcgc gccagcgtta tcctggtgcg ggagagaatg 120
atgaacaaga gccaacaagt tcagacaatc accctggccg ccgcccagca aatggcggcg 180
gcggtggaaa aaaaagccac tgagatcaac gtggcggtgg tgttttccgt ggttgaccgc 240
ggaggcaaca cgctgcttat ccagcggatg gacgaggcct tcgtctccag ctgcgatatt 300
tccctgaata aagcctggag cgcctgcagc ctgaagcaag gtacccatga aattacgcca 360
gcggtccagc caggacaatc tctgtacggt ctgcagctta ccaaccaaca gcgaattatt 420
atttttggcg gcggcctgcc agttattttt aatgagcagg taattggcgc cgtcggcgtt 480
agcggcggta cggtcgagca ggatcaatta ttagcccagt gcgccctgga ttgtttttcc 540
gcattataac ctgaagcgag aaggtatatt atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg 600
ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg 660
ctggggggga aaaaagccct gctggtcacc gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc 720
gcggtggaca aaaccctgca ttatctgcgg gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac 780
ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc 840
gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc 900
atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg 960
accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc 1020
acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg 1080
cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat ccgctgctga tgatcggtaa accggccgcc 1140
ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg acccacgccg tagaggccta tatctccaaa 1200
gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac 1260
ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat ctgcaggcgc gggaatacat ggcctatgcc 1320
tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg 1380
caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg cacggcgtgg ccaacgctgt cctgctgccg 1440
catgtggcgc gctacaacct gatcgccaac ccggagaaat tcgccgatat cgctgaactg 1500
atgggcgaaa atatcaccgg actgtccact ctcgacgcgg cggaaaaagc catcgccgct 1560
atcacgcgtc tgtcgatgga tatcggtatt ccgcagcatc tgcgcgatct gggggtaaaa 1620
gagaccgact tcccctacat ggcggagatg gctctgaaag acggcaatgc gttctcgaac 1680
ccgcgtaaag gcaacgagca ggagattgcc gcgattttcc gccaggcatt ctgagtgtta 1740
acgaggggac cgtcatgtcg ctttcaccgc caggcgtacg cctgttttac gatccgcgcg 1800
ggcaccatgc cggcgccatc aatgagctgt gctgggggct ggaggagcag ggggtcccct 1860
gccagaccat aacctatgac ggaggcggtg acgccgctgc gctgggcgcc ctggcggcca 1920
gaagctcgcc cctgcgggtg ggtattgggc tcagcgcgtc cggcgagata gccctcactc 1980
atgcccagct gccggcggac gcgccgctgg ctaccggaca cgtcaccgat agcgacgatc 2040
atctgcgtac gctcggcgcc aacgccgggc agctggttaa agtcctgccg ttaagtgaga 2100
gaaactgaat gtatcgtatc tatacccgca ccggggataa aggcaccacc gccctgtacg 2160
gcggcagccg catcgagaaa gaccatattc gcgtcgaggc ctacggtacc gtcgatgaac 2220
tgatatccca gctgggcgtc tgctacgcca cgacccgcga cgccgggctg cgggaaagcc 2280
tgcaccatat tcagcagacg ctgttcgtgc tgggggctga actggccagc gatgcgcggg 2340
gcctgacccg cctgagccag acgatcggcg aagaggagat caccgccctg gagcggctta 2400
tcgaccgcaa tatggccgag agcggcccgt taaaacagtt cgtgatcccg gggaggaatc 2460
tcgcctctgc ccagctgcac gtggcgcgca cccagtcccg tcggctcgaa cgcctgctga 2520
cggccatgga ccgcgcgcat ccgctgcgcg acgcgctcaa acgctacagc aatcgcctgt 2580
cggatgccct gttctccatg gcgcgaatcg aagagactag gcctgatgct tgcgcttga 2639
<210> 3
<211> 1095
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fdh1
<400> 3
atgaagatcg ttttagtctt atatgatgct ggtaagcacg ctgctgatga agaaaaatta 60
tatggttgta ctgaaaataa attaggtatt gctaattggt taaaagatca aggtcatgaa 120
ctaattacta cttctgataa agaaggtgaa acaagtgaat tggataaaca tatcccagat 180
gctgatatta tcatcaccac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagacttgac 240
aaggctaaga acttaaaatc agtcgttgtc gctggtgttg gttctgatca cattgattta 300
gattatatta atcaaacagg taagaaaatc tcagtcctgg aagttacagg ttctaatgtt 360
gtctctgttg ctgaacacgt tgtcatgacc atgcttgtct tggttagaaa tttcgttcca 420
gcacatgaac aaattattaa ccacgattgg gaggttgctg ctatcgctaa ggatgcttac 480
gatatcgaag gtaaaactat cgctaccatt ggtgctggta gaattggtta cagagtcttg 540
gaaagattac tcccatttaa tccaaaagaa ttattatact acgattatca agctttacca 600
aaagaagctg aagaaaaagt tggtgctaga agagttgaaa atattgaaga attagttgct 660
caagctgata tcgttacagt taatgctcca ttacacgcag gtacaaaagg tttaattaat 720
aaggaattat tatctaaatt taaaaaaggt gcttggttag tcaataccgc aagaggtgct 780
atttgtgttg ctgaagatgt tgcagcagct ttagaatctg gtcaattaag aggttacggt 840
ggtgatgttt ggttcccaca accagctcca aaggatcacc catggagaga tatgagaaat 900
aaatatggtg ctggtaatgc catgactcct cactactctg gtactacttt agacgctcaa 960
acaagatacg ctgaaggtac taaaaatatt ttggaatcat tctttaccgg taaatttgat 1020
tacagaccac aagatattat cttattaaat ggtgaatacg ttactaaagc ttacggtaaa 1080
cacgataaga aataa 1095
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gatttaatcc ctaccgacgc ggtcatcgcg gcggcgaaaa aggtactggc gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ttccgcgccg ccgcccggca ggccatcgat aacaaacaat atgcgcatcg gtccatatga 60
atatcctcct 70
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ttccgggaac actacatcgt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
ccgagatagg aggcagagaa 20
<210> 8
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
attattttaa atatgctacc gtgacggtat aatcactgga gaaaagtctt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gattatctga atgtgctccc cccgggagag gagcacaaaa gggaaaggca gtccatatga 60
atatcctcct 70
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gaattaggat tagcaccctc tca 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
ccaagccagt gtaacggtat c 21
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
gtcaacattt atttaacctt tcttatattt gttgaacgag gaagtggtat gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
gcgccgtgcg cccactggcg taccggatac tgtttgtcca tgtgaccccc cctccttagt 60
tcctattcc 69
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
acggaggctg tgaaataccc 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ttcgtggcgt accggaata 19
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tttaagctta tgaaaagatc aaaacgattt gc 32
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
tttacgcgtc cgtttaattc gcctgacc 28
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
tataagctta tgaaaattgt tctggtgctg 30
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
atacccgggt tattttttat cgtgtttacc gtacg 35
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
tttaagctta tggcgggcga caaaata 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
aaaggatcct caagcgcaag catcagg 27
Claims (7)
1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에서, 리포폴리사카라이드 생합성에 관여하는 글루코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 α-아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, dhaT 오페론 및 폴메이트디하이드로케네이즈가 과발현되어 있는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 크립시엘라 뉴모니에인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 dhaT 오페론은 클렙시엘라 뉴모니에, 클렙시엘라 옥시토카 (klebsiella oxytoca) 및 클로스트리디움 부틸리쿰 (clostridium butyrricum)로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 폴메이트디하이드로케네이즈는 캔디다 보이디니 (candida boidinii), 안실로박터 아쿠아티구스 (ancylobacter aquaticus), 세리포리옵시스 서브베르미스포라 (Ceriporiopsis subvermispora), 모라셀라 종 (Moraxella sp.), 파라코쿠스 종 (Paracoccus sp.) 및 씨오바실러스 종 (Thiobacillus sp.)로 구성된 군에서 선택되는 균주 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 1,3-프로판디올의 제조방법:
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.
제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 회분발효 또는 유가발효인 것을 특징으로 하는 방법.
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KR1020150157398A KR101747285B1 (ko) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 2,3-부탄디올 생산능이 제거된 1,3-프로판디올 생산용 재조합 미생물 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR20190063899A (ko) * | 2017-11-30 | 2019-06-10 | 고려대학교 산학협력단 | 1,3-프로판디올 생성능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조방법 |
CN111996157A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-27 | 齐鲁工业大学 | 一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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2015
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---|---|---|---|---|
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CN111996157A (zh) * | 2020-09-08 | 2020-11-27 | 齐鲁工业大学 | 一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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Legal Events
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AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
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X091 | Application refused [patent] | ||
AMND | Amendment | ||
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GRNT | Written decision to grant |