KR20230147948A - 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 DHG 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 균주를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주는 유전체 조작을 통해 글루코스, 자일로스 및 아라비노스를 동시에 대사할 수 있으며, 대사를 통해 젖산을 생산할 수 있는바, 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 DHG 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 균주를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.
최근 수십 년 동안 목질계 바이오매스(예: 스위치그래스, 수수)를 화학 물질로 효율적으로 전환하는 것은 높은 당 함량과 풍부함으로 인해 광범위하게 연구되었다. 대장균(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 다양한 미생물이 주요 당(즉, 포도당, 자일로스 및 아라비노스)에 대한 이화 활성을 개선하기 위해 사용 및 조작되었다. 이러한 노력은 다양한 부가가치 화학 물질의 지속 가능한 생산을 위한 미생물 공정의 잠재력을 성공적으로 입증했다.
공정 효율은 숙주 미생물의 타고난 대사 활동에 의해 크게 영향을 받기 때문에 목질계 바이오매스(예: 포도당, 자일로스 및 아라비노스)로부터의 당을 효율적이고 신속하게 활용할 수 있는 숙주를 이용하는 것이 필수적이다. 이와 관련하여 Vibrio 종은 기존의 숙주 플랫폼에 비해 다양한 당에서 우수한 성장으로 인해 최근 새로운 강력한 플랫폼으로 제안되었다. 또한 삼투압 스트레스에 대한 높은 내성은 생화학적 생산을 개선하는 데 도움이 될 것으로 기대된다. 실제로, 최근 연구에서는 바이오매스 당으로부터 광범위한 생화학물질(예: 에탄올, 2,3-부탄디올, 리코펜)이 높은 비율로 생산될 수 있음을 보여주었다. 이러한 연구는 Vibrio 종의 사용이 바이오매스로부터의 생화학적 생산을 크게 촉진할 것이라고 제안한다.
목질계 바이오매스 전환에 대한 적용을 확장하려면 몇 가지 문제를 해결해야 한다. 몇 가지 Vibrio 종(예: Vibrio sp. dhg 및 Vibrio natriegens)은 리그노셀룰로오스에서 두 번째로 풍부한 당인 자일로오스에서 재배할 때 감지할 수 있는 성장이나 당 소비를 보이지 않는다. 실제로 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 기탁된 Vibrio 게놈의 0.43%(14,153개 중 61개)만이 완전한 자일로스 이화 유전자 세트를 가지고 있다. 대조적으로, E. coli 균주의 10% 이상(3,366개 중 338개)이 유전자를 가지고 있다. 또한, 다른 많은 미생물과 유사하게 탄소 이화 산물 억제에 의한 당의 우선적 이용은 생물 공정의 효율성을 낮출 것이다.
이에 본 발명자들은 목질계 바이오매스 공정을 위해 탄소원을 동시에 대사할 수 있는 미생물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA(xylose isomerase) 유전자가 도입된, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG) 및 이를 이용한 젖산 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA(xylose isomerase) 유전자가 도입된, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 젖산 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주는 유전체 조작을 통해 글루코스, 자일로스 및 아라비노스를 동시에 대사할 수 있으며, 대사를 통해 젖산을 생산할 수 있는바, 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 당분야에 알려진 자일로스 대사 경로(이성화 경로, 산화 환원 효소 경로, Weimberg 경로, Dahms 경로)를 나타낸 도이다.
도 2a는 VXA38 균주에 존재할 것으로 예상되는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스에 대한 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 2b는 적응 진화 중 서로 다른 시점에 분리된 균주의 성장 속도 및 자일로스 대사 속도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 적응 진화 결과로 발생된 돌연변이; 및 상기 돌연변이가 적응 진화 균주에 존재하는지 확인한 결과;를 나타낸 도이다.
도 2d는 자일로스 최소 배지에서 VXA38Y, VXA38D 및 VXA38C 균주의 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 2e는 VXA38C 균주 및 VXA38D 균주에서 xylB 전사체 양을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2f는 야생형 xylA 및 돌연변이 xylA의 효소 활성 (kcat/Km in min-1 mM-1)을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2g는 기존 프로모터 및 돌연변이 프로모터 하에 xylA-sgfp 융합 단백질을 발현했을 때의 형광세기를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 자일로스 최소 배지에서 VXA1-1, VXA1-2, VXA15-1 및 VXA15-3를 배양했을 때의 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 4는 야생형 자일로스 이성화 효소 및 돌연변이 자일로스 이성화 효소의 활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 I-TASSER 서버를 활용하여 예측된 야생형(분홍), 돌연변이(청록) XylA의 단백질 구조 예측 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 돌연변이 및 자연형의 XylA의 융합을 통해 XylA의 양을 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스의 동시 대사를 위한 모식도를 나타낸 도이다.
도 7b 내지 e는 각각 야생형 비브리오 dhg 균주, VXA38-1 균주, VXA38P 균주 및 VXA38PG 균주의 성장 곡선 및 탄소원 대사 결과를 나타낸 도이다.
도 8a는 VXA38PGL 균주의 젖산 생산 경로를 나타낸 도이다.
도 8b는 VXA38PGL 균주의 성장 곡선 및 탄소원 대사 결과를 나타낸 도이다.
도 8c는 VXA38PGL 균주의 젖산 및 부산물 생산량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 VXA38 균주에 존재할 것으로 예상되는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스에 대한 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 2b는 적응 진화 중 서로 다른 시점에 분리된 균주의 성장 속도 및 자일로스 대사 속도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 적응 진화 결과로 발생된 돌연변이; 및 상기 돌연변이가 적응 진화 균주에 존재하는지 확인한 결과;를 나타낸 도이다.
도 2d는 자일로스 최소 배지에서 VXA38Y, VXA38D 및 VXA38C 균주의 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 2e는 VXA38C 균주 및 VXA38D 균주에서 xylB 전사체 양을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2f는 야생형 xylA 및 돌연변이 xylA의 효소 활성 (kcat/Km in min-1 mM-1)을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2g는 기존 프로모터 및 돌연변이 프로모터 하에 xylA-sgfp 융합 단백질을 발현했을 때의 형광세기를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 자일로스 최소 배지에서 VXA1-1, VXA1-2, VXA15-1 및 VXA15-3를 배양했을 때의 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 4는 야생형 자일로스 이성화 효소 및 돌연변이 자일로스 이성화 효소의 활성을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 I-TASSER 서버를 활용하여 예측된 야생형(분홍), 돌연변이(청록) XylA의 단백질 구조 예측 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 돌연변이 및 자연형의 XylA의 융합을 통해 XylA의 양을 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스의 동시 대사를 위한 모식도를 나타낸 도이다.
도 7b 내지 e는 각각 야생형 비브리오 dhg 균주, VXA38-1 균주, VXA38P 균주 및 VXA38PG 균주의 성장 곡선 및 탄소원 대사 결과를 나타낸 도이다.
도 8a는 VXA38PGL 균주의 젖산 생산 경로를 나타낸 도이다.
도 8b는 VXA38PGL 균주의 성장 곡선 및 탄소원 대사 결과를 나타낸 도이다.
도 8c는 VXA38PGL 균주의 젖산 및 부산물 생산량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA(xylose isomerase) 유전자가 도입된, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주(Vibrio sp. DHG)를 제공한다.
본 발명에서 사용한 비브리오 속 DHG 균주는 탄소원 고성능 대사 회로를 갖는다. 비브리오 속 DHG 균주는 해조류 슬러지로부터 분리 및 동정된 것으로, 상기 비브리오 속 DHG 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 4월 6일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13239BP를 부여받았다. 상기 비브리오 속 DHG 균주는 최소배지/영양배지 등에서 대장균 등과 같은 미생물에 비하여 성장속도가 매우 높으며, 높은 초기 당/염 농도에서 저항성을 보인다.
본 발명에 있어서, “탄소원”은 생체에 흡수되어 생체구성탄소로서 이용되는 탄소화합물을 의미하며, 균주의 배양에 있어서, 영양원과 생리학적 관계를 규명하기 위하여 탄소원을 이용하며, 이에 따른 균주의 분리 및 생장 특성을 확인한다.
상기 탄소원은 당류 또는 당알코올일 수 있으며, 보다 상세하게는 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 포도당, 만니톨, 알긴산, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “탄소원 고성능 대사 회로”는 다양한 당류 또는 당알코올을 대사할 수 있는 효소를 포함하는 대사 회로를 의미하며, 탄소원 고성능 대사회로를 갖는 미생물은 1종 이상의 당류 또는 당알코올을 포함하는 혼합당을 탄소원으로 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 비브리오 속 DHG 균주는 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 16S rDNA 유전자를 포함한다.
본 발명에 있어서, "유전자"는 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
상기 xylA 유전자가 도입된 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주는 균주 내 자일로스 이성화 경로를 구축하기 위하여 대장균 유래 xylA 유전자를 이종적으로 발현시킨 것이다. 또한 xylA 유전자의 안정적이고 일정한 발현을 위해서 선형 연구를 통해서 검증된 프로모터(VP13(서열번호 12), PJ23100(서열번호 13))와 UTR designer를 통해서 생성된 최적화된 5’UTR 서열(서열번호 14)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 dns(Extracellular deoxyribonuclease) 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
위와 같이 구축된 균주를 VXA0 균주로 명명하였다. 구축된 VXA0 균주는 자일로스를 유일 탄소원으로 하여 성장할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 자일로스 최소 배지에서 적응진화(adaptive evolution)시킨 것이 바람직하다. 38회 반복 배양을 통해 적응진화된 균주는 각각 VXA1, VXA3, VAX15 및 VXA38로 명명하였다. 또한 분리 순서에 따라 VXA1-1, VXA1-2, VXA1-3과 같이 명명하였다.
특히, VXA38-1 균주는 적응진화됨에 따라 다음과 같은 변이 (1)-(4)를 포함한다.
(1) 2개의 인접한 유전자(NADH 산화 환원 효소를 암호화하는 yrkL 유전자와 만니톨 대사 관련 효소에 대한 전사 인자를 암호화하는 deoR 유전자)에 생긴 1423개의 염기 서열을 하나의 T로 대체하는 돌연변이: 비브리오 dhg 2번 염색체 (genbank accession No. CP028944)의 1,846,276번 염기부터 1,847,699번 염기가 결손되고, 이 위치에 티민 (Thymine, T)이 삽입되었다. 이에 따라 YrkL의 55번째 아미노산인 트레오닌 (Threonine, Thr)이 종결코돈으로 변이되었고, DeoR의 55번째 아미노산인 발린 (Valine, Val)이 히스티딘 (Histidine, His)으로 변이되었다. 또한 본 돌연변이로 인해 frame shift가 발생하여 DeoR의 57번째 아미노산 위치에 종결코돈이 형성되었다.
(2) 이중 기능성 diguanylate cyclase/phospho diesterase를 암호화하는 scrC 유전자에 생긴 단일 염기 변이 돌연변이: 비브리오 dhg 2번 염색체 (genbank accession No. CP028944)의 1,409,023번째 사이토신 (Cytosine, C)이 티민으로 변이되었다. 이에 따라 ScrC의 32번째 아미노산인 트레오닌이 이소류신 (Isoleucine, Ile)으로 변이되었다.
(3, 4) xylA 유전자의 프로모터 및 코딩 서열에 생긴 단일 염기 변이 돌연변이: 대장균의 xylA 유전자 카세트가 도입된 비브리오 dhg 1번 염색체 (genbank accession No. CP028943)의 2,768,325번째 사이토신이 아데닌 (Adenine, A)으로 변이되었다. 즉, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA 유전자의 8번째 위치가 C에서 A로 변이되었다. 이에 따라 XylA의 3번째 아미노산인 알라닌 (Alanine, Ala)이 아스파트산 (Aspartic acid, Asp)으로 변이되었다.
또한 대장균의 xylA 유전자 카세트가 도입된 비브리오 dhg 1번 염색체 (genbank accession No. CP028943)의 2,768,285번째 사이토신이 아데닌으로 변이되었다. 즉, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 xylA 프로모터의 28번째 위치가 C에서 A로 변이되었다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 16 내지 19로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 yrkL(NAD(P)H oxidoreductase) 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 yrkL이 도입된 균주를 VXA38Y로 명명하였다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 deoR(DNA-binding transcriptional repressor) 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 deoR이 도입된 균주를 VXA38D로 명명하였다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 ptsG(glucose-specific PTS enzyme IIBC component) 유전자가 결실된 것일 수 있으며, 해당 균주는 VXA38P로 명명하였다. 즉, 상기 균주 VXA38P는 VXA38-1 균주에서 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 ptsG 유전자가 결실된 것이다. 이에 따라 상기 VXA38P 균주는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스를 동시에 대사하는 것이 바람직하다.
세포 내의 cAMP 농도를 조절하는 adnylate cyclase의 활성이 phosphotransferase system(PTS)에 의해 조절되기 때문에, PTS에서 중요한 역할을 하는 PtsG(EIIBC)의 제거를 통해 여러 탄소원의 동시 대사를 가능케하였다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 GalP(galactose:H(+) symporter) 유전자를 포함하는 것일 수 있고, 구축된 균주를 VXA38PG로 명명하였다.
GalP는 우선적인 기질은 갈락토스임에도 불구하고, 해당 수송 단백질은 cAMP 농도에 영향없이 글루코스도 운반할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 이에, 글루코스 운반을 회복하기 위해서 PTS와 관련이 없는 대체적인 수송 단백질을 균주 내에 도입한 것이다.
본 발명의 보다 더 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 frdA(fumarate reductase A) 유전자, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 frdB 유전자, 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 frdC 유전자, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 frdD(Formate acetyltransferase 1) 유전자 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 pflB 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유전자가 결실된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 상기 유전자 frdA, frdB, frdC, frdD 및 pflB 유전자가 모두 결실된 것일 수 있다. 상기 유전자 frdA, frdB, frdC, frdD 및 pflB 유전자가 모두 결실된 균주를 VXA38PGL 균주라 명명하였다. 젖산을 효율적으로 생산하기 위하여, 상기 VXA38PGL 균주는 부산물 생산 경로와 관련된 유전자 frdABCD 및 pflB가 제거된 것이다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자가 추가적으로 도입된 것이 바람직하며, 해당 균주를VXA38PGL로 명명하였다. 상기 유전자 ldhA는 젖산 생산을 위하여 도입된 유전자이다.
또한, 상기 언급한 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 언급된 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 언급된 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주는 72시간 동안 83 g/L의 젖산이 생산되는 것을 실험을 통해 확인하였다. 특히, 부산물 형성이 최소화되어 이론적 최대 수율의 80%에 해당하는 높은 수율(0.8 g/g)을 달성했다. 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 이용한 젖산 생산은 1.15 g/L/h의 생산성에 해당하는데, 대장균을 활용하여 동일한 탄소원 조성에서 수행한 이전 연구 결과에 비해서 1.4 배 더 높은 수치이다. 따라서 본 발명에 따른 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주는 미생물을 이용한 고부가가치 화합물의 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 젖산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양조건은 통상의 비브리오 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있으나, 본 발명의 미생물의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 배지는 탄소원으로서 당류 또는 당알코올을 포함할 수 있으며, 보다 상세하게는 포도당, 만니톨, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스, 글리세롤, 자일로오스, 만노오스, 프락토오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 알긴산, 셀룰로오스, 덱스트린, 글리코겐, 히알루론산, 렌티난, 자이모산, 키토산, 글루칸, 리그닌 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 포도당, 만니톨, 알긴산, 수크로오스, 아라비노스, 갈락토오스 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃로 설정할 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 화합물은 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 미생물 또는 배양물로부터 젖산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 비브리오 dhg 균주에서의 자일로스 이성화 경로 구축
비브리오 dhg 균주(Lim et al., 2019, KCTC13239BP)의 유전체 분석을 통해서 자일로스 대사에 필요한 경로를 자연적으로 지니고 있는지 확인하였다.
그 결과, 비브리오 dhg 균주가 글루코스 대사를 위한 EMP 경로 및 아라비노스 대사를 위한 PP 경로를 자연적으로 가지고 있음을 확인했지만, 알려진 네 가지 자일로스 대사 경로(도 1)(이성화 경로, 산화 환원 효소 경로, Weimberg 경로, Dahms 경로)의 완성을 위한 유전자 세트를 지니지 않음을 확인했다.
상기 이성화 경로, 산화 환원 효소 경로, Weimberg 경로 및 Dahms 경로의 탄소 수율 및 에너지 생성 수율은 표 1에 나타내었다.
| Product | Theoretical maximum yield(molproduct/molxylose) | |||
| Isomerase | Oxidoreductase | Weimberg | Dahms | |
| Pyruvate | 1.67 | 1.67 | 1 | 1 |
| Ethanol | 1.67 | 1.67 | 1 | 1 |
| 2,3-Butanediol | 0.83 | 0.83 | 0.5 | 0.5 |
| Malate | 0.83 | 0.83 | 1 | 1 |
| ATP | 26.67 | 26.67 | 25 | 24 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 네가지 경로 중 자일로스 이성화 경로가 가장 높은 탄소 수율 및 에너지 생성 수율을 가지는바, 후술되는 실험에서는 비브리오 dhg 균주에 자일로스 이성화 경로를 도입했다.
자일로스 이성화 경로의 구축을 위해서, 비브리오 dhg 균주에서 대장균 유래의 xylA 유전자(서열번호 1)를 이종적으로 발현시켰다. xylA 유전자의 안정적이고 일정한 발현을 위해서 선형 연구를 통해서 검증된 프로모터(VP13(서열번호 12), P
J23100
(서열번호 13)) 와 UTR designer를 통해서 생성된 최적화된 5’UTR 서열(서열번호 14)을 활용했다. 더불어, 발현 카세트는 세포 외부에 작용하는 핵산가수분해효소를 암호화하는 dns 유전자를 서열번호 15로 표시되는 dns 유전자로 교체하여 유전체에 삽입되었다. 구축된 균주는 VXA0로 명명하였다.
구축된 VXA0 균주를 배양한 결과, 자일로스만 첨가된 최소 배지에서 성장을 보이는 것을 확인하였다. 이는 VXA0 균주는 자일로스 이성화 경로가 구축되어 있음을 의미한다. 하지만, 해당 균주는 긴 유도기(lag pahse)와 낮은 성장 속도(0.01 h
-1
)를 보여, 추가적인 개량이 필요하다. 이후 사용한 균주의 자세한 유전형과 플라스미드에 대한 정보는 표 2와 같다.
| Name | Relevant characteristics | Source |
| Strains | ||
| Mach-T1R | E. coli F-  |
Invitrogen |
| Vibrio sp. dhg | A novel alginate-metabolizing microorganism | Balat, M.(2011). |
| Escherichia coli W | Source of xylose isomerase gene(xylA) | ATCC 9637 |
| VXA0 | Vibrio sp. dhg Δdns::xylA; the parental strain of evolved strain | 본 발명 |
| VXA1-1 | 1st isolated strain from 1st passage | 본 발명 |
| VXA1-2 | 2nd isolated strain from 1st passage | 본 발명 |
| VXA1-3 | 3rd isolated strain from 1st passage | 본 발명 |
| VXA3-1 | 1st isolated strain from 3rd passage | 본 발명 |
| VXA3-2 | 2nd isolated strain from 3rd passage | 본 발명 |
| VXA3-3 | 3rd isolated strain from 3rd passage | 본 발명 |
| VXA15-1 | 1st isolated strain from 15th passage | 본 발명 |
| VXA15-2 | 2nd isolated strain from 15th passage | 본 발명 |
| VXA15-3 | 3rd isolated strain from 15th passage | 본 발명 |
| VXA38-1 | 1st isolated strain from 38th passage | 본 발명 |
| VXA38-2 | 2nd isolated strain from 38th passage | 본 발명 |
| VXA38-3 | 3rd isolated strain from 38th passage | 본 발명 |
| VXA38C | VXA38-1/pACYC_Duet | 본 발명 |
| VXA38Y | VXA38-1/pACYC_yrkL | 본 발명 |
| VXA38D | VXA38-1/pACYC_deoR | 본 발명 |
| VXW | Vibrio sp. dhg /pACYC_xylAWT_Histag | 본 발명 |
| VXM | Vibrio sp. dhg /pACYC_xylAMUT_Histag | 본 발명 |
| VXWP1 | Vibrio sp. dhg /pACYC_PWT_xylAWT_sgfp | 본 발명 |
| VXMP1 | Vibrio sp. dhg /pACYC_PWT_xylAMUT_sgfp | 본 발명 |
| VXWP2 | Vibrio sp. dhg /pACYC_PMUT_xylAWT_sgfp | 본 발명 |
| VXMP2 | Vibrio sp. dhg /pACYC_PMUT_xylAMUT_sgfp | 본 발명 |
| VXA38P | VX38-1ΔptsG | 본 발명 |
| VXA38PG | VXA38P/pACYC_galP | 본 발명 |
| VXA38PGL | VXA38PΔfrdABCDΔpflB/pACYC_galP_ldhA | 본 발명 |
| Plasmids | ||
| pACYC_Duet | p15A, LacI, CmR | |
| pCDF_Duet | CloDF13, LacI, SmR | Novagen |
| FRT72_cat | T-vector, containing cat gene flanked by FRT variant sequences2 | Balat, M.(2011). |
| pACYA_SXT | p15A, AmpR, SXT recombinase expression vector | Balat, M.(2011). |
| pRSF_FLP | RSF1030, PVP13_synUTR_flp SC | Balat, M.(2011). |
| pCDF_xylA_ins | CloDF13, SmR, homology(dns)-CmR-PJ23100_synUTR_xylA-homology(dns) | 본 발명 |
| pCDF_ptsG_del | CloDF13, SmR, homology(ptsG)-CmR-homology(ptsG) | 본 발명 |
| pCDF_frdABCD_del | CloDF13, SmR, homology(frdABCD)-CmR-homology(frdABCD) | Balat, M.(2011). |
| pCDF_pflB_del | CloDF13, SmR, homology(pflB)-CmR-homology(pflB) | Balat, M.(2011). |
| pACYC_yrkL | p15A, CmR, yrkL | 본 발명 |
| pACYC_deoR | p15A, CmR, deoR | 본 발명 |
| pACYC_xylAWT_Histag | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_xylA WT_His tag_BBa_B1001 terminator | 본 발명 |
| pACYC_xylAMUT_Histag | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_xylA MUT(A3D)_His tag_BBa_B1001 terminator | 본 발명 |
| pACYC_PWT_xylAWT_sgfp | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_ xylA WT _sgfp_BBa_B1001 terminator | 본 발명 |
| pACYC_PWT_xylAMUT_sgfp | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_ xylA MUT(A3D)_sgfp_BBa_B1001 terminator |
본 발명 |
| pACYC_PMUT_xylAWT_sgfp | p15A, CmR, Pmutant_synUTR_ xylA WT _sgfp_BBa_B1001 terminator | |
| pACYC_PMUT_xylAMUT_sgfp | p15A, CmR, Pmutant_synUTR_ xylA MUT(A3D)_sgfp_BBa_B1001 terminator | |
| pACYC_galP | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_galP_BBa_B1001 terminator | 본 발명 |
| pACYC_galP_ldhA | p15A, CmR, PJ23100_synUTR_galP_BBa_B1001 terminator, PJ23100_synUTR_ldhA_BBa_B1001 terminator | 본 발명 |
후술되는 실험에서, 플라스크 규모의 일상적인 세포 배양은 콜로니를 LB 또는 LBv2 배지(10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 21.92 g/L NaCl, 0.3 g/L KCl, 및 2.2 g/L MgCl
2
) 한천 플레이트에서 골라내고, 3 mL의 M9또는 비브리오용 변형 최소배지(5 g/L(NH
4
)
2
SO
4
, 30 g/L NaCl, 10.7 g/L K
2
HPO
4
, 5.2 g/L KH
2
PO
4
, 0.5 g/L MgSO
4
·7H
2
O, 및 2 mL/L trace metal solution) 를 담고 있는 15 mL 시험관에 접종했다. 해당 배양액을 밤새 배양한 후, 해당 배양액을 새로운 배지에 0.05의 OD
600
로 재접종했다. OD
600
이 1.0에 도달하고 나서, 25 mL의 변형 최소배지를 담고 있는 350 mL 삼각 플라스크에 0.05의 OD
600
로 재접종했다. 배양은 회전 진탕기에서 37°C, 200rpm로 진행되었다. 적절한 항생제가 첨가되었고, 모든 세포 배양은 삼중으로 수행되었다. OD
600
이 1.0일 때, 대장균의 경우 0.31 g
dcw
/L, 비브리오 dhg 균주의 경우 0.27 g
dcw
/L에 해당한다. 성장 속도(μ, h
-1
)는 성장기(log phase) 동안의 ln(OD
600
)과 시간(h)의 선형 회귀로 계산하였다. 탄소원 대사 속도(g g
dcw
-1
L
-1
)는 성장 속도를 바이오매스 수율로 나누어 계산했다.
실시예 2. 비브리오 dhg 균주에 구축된 자일로스 이성화 경로의 진화적 최적화
글루코스, 자일로스 및 아라비노스에 대한 대사경로는 도 2a와 같다.
향상된 자일로스 활용을 위해서 적응 진화 전략을 적용했다. VXA0 균주가 자일로스를 유일 탄소원으로 하여 자랄 수 있었기 때문에, 해당 균주를 자일로스 최소 배지에 반복적으로 배양했다. 반복 배양은 대장균이 글루코스 최소 배지에서 자랄 때의 상정 속도인 0.6 h-1에 도달할 때까지 지속되었다. 적응 진화는 자일로스가 첨가된 최소 배지에 성장시키며 수행되었다. 세포를 OD600가 0.1이 되도록 접종하고, OD600이 2를 초과할 때 마다 동일한 최소 배지를 가진 다음 플라스크에 계대배양하였다. 두 번째 플라스크의 개체군은 유도기없이 상당히 향상된 성장 속도를 보였다. 이후, 개체군의 성장 속도는 점진적으로 증가하였다.
두 달 안에, 38번째 플라스크에서 0.58 h-1까지 향상된 성장 속도를 확인하였다. 이는 자일로스 이화 작용을 증가시키는 새로운 돌연변이의 생성과 축적을 의미한다. 진화된 개체군은 총 164개의 세대를 거쳐, 누적 세포 분열수(cumulative cell divisions, CCD)는 1.4 ⅹ1012번에 달한다. 누적 세포 분열 수는 플라스크의 초기 세포 수와 총 세대 수로부터 계산된 분열 수의 합으로 계산되었다. 1.0의 OD600은 8ⅹ108개 세포로 간주되었다.
구체적인 특성화를 위해서, 여러 시점으로부터 진화된 균주들을 분리하여 자일로스 최소 배지에서의 성장 속도와 자일로스 대사 속도를 확인했다. 더 자세하게는, 서로 다른 4개의 시점으로부터 각각 세 균주를 분리하여 총 12개의 균주를 얻었다. 4개의 시점은 각각 명확한 성장 속도의 증가가 관찰되었던 1, 3, 15번째 플라스크와 적응 진화 실험의 마지막 시점인 38번째 플라스크를 의미한다. 성장 속도 및 자일로스 대사 속도를 확인한 결과는 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, 분리된 균주의 성장 속도 증가는 개체군의 성장속도 증가와 비슷한 경향성을 나타냈으며, 자일로스 대사 속도 또한 크게 향상되었음을 확인하였다. 결과적으로 마지막 시점으로부터 분리한 세 균주의 성장 속도는 0.67h-1, 자일로스 대사 속도는 2.15 g/gdcw/h 로, 자일로스를 대사할 수 있는 미생물 플랫폼 중에 가장 높은 값임을 확인하였다(표 3).
| Host strain |
Type
(wildtype or engineered) |
Specific growth rate on xylose
(h -1 ) |
Specific xylose consumption rate(g g dcw -1 h -1 ) | Culture condition | Reference |
| Pichia stipitis | Wildtype | 0.12 | 0.10 | Rich medium, aerobic | Skoog and Hahn-Hgerdal, 1990 |
| Clostridium tyrobutyricum | Wildtype | 0.12 | n.d. | Defined medium, anaerobic | Liu and Yang, 2006 |
| Corynebacterium glutamicum | Engineered | 0.07 | n.d. | Defined medium, aerobic | Radek et al., 2014 |
| Saccharomyces cerevisiae | Engineered | 0.20 | 0.70 | Rich medium, anaerobic | Peng et al., 2015 |
| Pseudomonas putida KT2440 | Engineered | 0.21 | n.d. | Defined medium, aerobic | Bator et al., 2019 |
| E. coli | Engineered | 0.34 | 0.94 | Defined medium, aerobic | Hernandez-Montalvo et al., 2001 |
| Vibrio sp. dhg VXA38-1 | Engineered | 0.67 | 2.15 | Defined medium, aerobic | 본 발명 |
실시예 3. 자일로스 대사를 향상시킨 유익한 돌연변이의 식별 및 검증을 위한 전체 게놈 시퀀싱 및 역설계
자일로스 대사를 향상시킨 돌연변이를 식별하기 위해서 VXA0 균주와 진화된 균주에 대한 전체 게놈 시퀀싱을 수행하였다. 구체적으로, 각 균주에서 유전체를 추출하고, 일루미나 사의 MiniSeq 시스템으로 시퀀싱을 진행했다. 진화된 균주의 유전체의 네 부위에서 5개의 돌연변이를 식별했다:
(1) 2개의 인접한 유전자(NADH 산화 환원 효소를 암호화하는 yrkL 유전자와 만니톨 대사 관련 효소에 대한 전사 인자를 암호화하는 deoR 유전자)에 생긴 1423개의 염기 서열을 하나의 T로 대체하는 돌연변이: 비브리오 dhg 2번 염색체 (genbank accession No. CP028944)의 1,846,276번 염기부터 1,847,699번 염기가 결손되고, 이 위치에 티민 (Thymine, T)이 삽입되었다. 이에 따라 YrkL의 55번째 아미노산인 트레오닌 (Threonine, Thr)이 종결코돈으로 변이되었고, DeoR의 55번째 아미노산인 발린 (Valine, Val)이 히스티딘 (Histidine, His)으로 변이되었다. 또한 본 돌연변이로 인해 frame shift가 발생하여 DeoR의 57번째 아미노산 위치에 종결코돈이 형성되었다.
(2) 이중 기능성 diguanylate cyclase/phospho diesterase를 암호화하는 scrC 유전자에 생긴 단일 염기 변이 돌연변이: 비브리오 dhg 2번 염색체 (genbank accession No. CP028944)의 1,409,023번째 사이토신 (Cytosine, C)이 티민으로 변이되었다. 이에 따라 ScrC의 32번째 아미노산인 트레오닌이 이소류신 (Isoleucine, Ile)으로 변이되었다.
(3, 4) xylA 유전자의 프로모터 및 코딩 서열에 생긴 단일 염기 변이 돌연변이: 대장균의 xylA 유전자 카세트가 도입된 비브리오 dhg 1번 염색체 (genbank accession No. CP028943)의 2,768,325번째 사이토신이 아데닌 (Adenine, A)으로 변이되었다. 즉, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA 유전자의 8번째 위치가 C에서 A로 변이되었다. 이에 따라 XylA의 3번째 아미노산인 알라닌 (Alanine, Ala)이 아스파트산 (Aspartic acid, Asp)으로 변이되었다.
또한 대장균의 xylA 유전자 카세트가 도입된 비브리오 dhg 1번 염색체 (genbank accession No. CP028943)의 2,768,285번째 사이토신이 아데닌으로 변이되었다. 즉, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 xylA 프로모터의 28번째 위치가 C에서 A로 변이되었다.
(5) 세포질 축 방향 필라멘트 단백질을 암호화하는 cafA 유전자의 단일 염기 변이 돌연변이: 대장균의 xylA 유전자 카세트가 도입된 비브리오 dhg 1번 염색체 (genbank accession No. CP028943)의 2,875,221번째 티민이 아데닌으로 변이되었다. 이에 따라 CafA의 68번째 아미노산인 류신 (Leucine, Leu)이 종결코돈으로 변이되었다.
식별된 돌연변이는 표 4 및 5에 나타내었다.
| Position | Mutation | Gene product |
| Chromosome 1 | ||
| 190,931 | +a | Glycosyl transferase domain protein |
| 721,562 | A147T(GCG→ACG) | Thiamine biosynthesis protein thiI |
| 975,004 | +G | tRNA-Tyr-GTA |
| 1,015,314 | C5S(TGT→TCT) | Thiamine kinase(EC 2.7.1.89) Adenosylcobinamide kinase(EC 2.7.1.156) |
| 1,746,440 | G→A | Intergenic region |
| 1,821,426 | (GATT)2→1 | Intergenic region |
| 2,768,312 | N434N(AAT→AAC) | Xylose isomerase(EC 5.3.1.5) |
| Chromosome 2 | ||
| 22,916 | P87P(CCG→CCC) | Methylcrotonyl-CoA carboxylase carboxyl transferase subunit(EC 6.4.1.4) |
| 646,893 | (G)5→6 | Predicted hydrolase |
| 1,456,700 | Δ(CTGTTGCTG) | TPR domain protein in aerotolerance operon |
| Plasmid | ||
| 51,986 | (G)6→7 | Aconitate hydratase(EC 4.2.1.3) |
| 54,467 | (G)10→11 | Intergenic region |
| 129,285 | C→T | Intergenic region |
| 129,561 | E4E(GAA→GAG) | Mobile element protein |
| GeneLocation | DNA modification | Protein modification | |
| Chr2; 1,846,276 | yrkL | [CP028944: DBX26_24050, DBX26_24055]: g.1846276_1847699delinsT | T55X |
| deoR | V55HfsX2 | ||
| Chr2; 1,409,023 | scrC | [CP028944: DBX26_21970]: c.95C>T | T32I |
| Chr1; 2,768,325 | xylA | [CP002185: ECW_m3839]: c.8C>A | A3D |
| Chr1; 2,768,285 | [CP002185: ECW_m3839]: c.-35C>A | - | |
| Chr1; 2,875,221 | cafA | [CP028943: DBX26_13360]: c.203T>A | L68X |
| g., a linear genomic reference sequence; c., a coding DNA reference sequence; fs, frame shift; X, stop codon. | |||
상기 식별된 돌연변이를 각 VXA1, VXA3, VAX15 및 VXA38 균주에 존재하는지 확인하였으며, 그 결과는 도 2c에 나타내었다. 도 2c의 빨간색으로 표시한 것은 해당 돌연변이가 균주에 존재함을 의미한다.
또한 균주 VXA1-1(scrC 야생형), VXA1-2(srcC 변이), VXA15-1(cafA 야생형) 및 VXA15-3(cafA 변이)를 자일로스 최소배지에서 배양하여, 이들의 성장곡선을 작성하였다. 성장곡선은 도 3에 나타내었다.
도 2c 및 3에 나타낸 바와 같이, 이 중 세 돌연변이 (1), (3) 및 (4)는 자일로스에서의 성장 속도를 크게 향상시켰다. 또한 scrC에 생긴 돌연변이는 성장기(log phase)에서의 성장에는 영향을 주지 않은 반면, 유도기를 크게 단축시켰다. VXA15-1 균주와 VXA15-3 균주 사이에 큰 차이가 관찰되지 않고 돌연변이가 축적되지 않은 것을 미루어 볼 때, cafA 유전자에 생긴 돌연변이는 자일로스 대사와 관련이 없는 것으로 된다.
성장기 동안의 자일로스 대사가 어떻게 향상되었는지 이해하기 위하여, 상기 (1), (3) 및 (4) 돌연변이에 대해 추가적으로 조사했다. yrkL과 deoR 유전자에 생긴 돌연변이가 적응 진화 과정 중 가장 먼저 생겼고 deoR 유전자 바로 아래에 자일로스 대사에 필수적인 xylB 유전자가 포함된 오페론이 발현되고 있었기 때문에(도 2a), 해당 돌연변이에 대해서 우선적으로 분석을 진행했다.
구체적으로, 마지막 시점에서 분리된 균주인 VXA38-1 균주에 플라스미드를 통해 yrkL 유전자(서열번호 2) 및 deoR 유전자(서열번호 3)를 각각 도입했다. 구축된 균주를 각각 VXA38Y(yrkL이 발현된 VXA38-1 균주), VXA38D(deoR이 발현된 VXA38-1 균주), VXA38C(공벡터가 발현된 VXA38-1 균주)로 명명하였다. 구축된 균주는 자일로스 최소 배지에서 배양하였다. 배양 시간에 따른 OD600 값을 측정하였으며, 그 결과는 도 2d에 나타내었다.
도 2d에 나타낸 바와 같이, yrkL의 발현은 자일로스에서의 성장에 영향을 미치지 않은 반면, deoR의 발현은 자일로스에서의 성장을 완전히 손상시켰다.
추가적으로, VXA38D와 VXA38C 균주에서의 xylB 전사체에 대한 RT-qPCR로 확인하였다. 이를 위하여, 전사체 전체를 추출한 후, 역전사효소를 활용하여 xylB mRNA에 대한 cDNA를 얻었다. 이 때, rpoA에 대한 cDNA도 얻어, 이를 기준으로 활용하였다. 해당 cDNA를 활용한 qPCR을 통해 얻은 Ct 값을 활용하여 상대적인 양을 비교하였다. qPCR 분석 결과는 도 2e에 나타내었다.
도 2e에 나타낸 바와 같이, VXA38D에서의 xylB 유전자 발현량은 100배 가량 줄어, deoR이 xylB가 포함된 오페론의 발현을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다. 이에 더불어, 해당 오페론이 아라비톨 대사 관련 효소(AtlA, XylB, AtlT)를 포함하고 있고, 만니톨과 아라비톨은 탄소수만 다른 서로 비슷한 당알코올이기 때문에, 해당 결과가 더욱 타당성을 얻는다.
종합적으로, 이러한 관찰로 인해 XylB의 불충분한 활성이 자일로스 대사의 속도 제한 단계 중 하나였으며, deoR의 제거로 인한 XylB 발현 증가로 인해 더 높은 성장을 얻을 수 있었음을 확인할 수 있었다.
다음으로, xylA 유전자의 코딩 서열 및 프로모터 부분에 생긴 두개의 돌연변이의 역할에 대해서 조사했다. 코딩 서열의 돌연변이로 인해 아미노산 서열이 변화하였기 때문에, xylA의 효소 활성이 영향을 받았을 것으로 예상되었다. 따라서, 돌연변이와 야생형 XylA를 정제하여 고유 활성(kcat/Km)을 비교했다. 활성의 비교를 위해서, 각 효소를 His-tag을 활용해 정제하고, 기질인 자일로스를 여러 농도로 첨가하고, 여러 시간동안 배양한 뒤, 생성물인 자일룰로스의 농도를 정량하였다. kcat 및 Km을 분석한 결과는 도 2f 및 4에 나타내었다.
도 2f 및 4에 나타낸 바와 같이, 해당 돌연변이로 인해 kcat이 0.83배, Km이 0.64배 감소하여 고유 활성이 1.3 배 증가하였음을 확인하였다. 이는 XylA의 활성 증가로 인해 자일로스의 대사가 향상되었음을 의미한다.
상기 xylA 돌연변이로 인한 잠재적 구조 변화가 I-Tasser 서버를 통해서 예측하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 돌연변이가 N 말단에 생겼음에도 불구하고, 구조의 변화는 C 말단의 단위체 결합 부위에 나타날 것으로 예측되었다. 이러한 분석은 단위체의 상호 작용을 개선함으로써 효소의 활성이 향상되었을 가능성을 시사한다.
마지막으로, 두 돌연변이가 xylA의 발현량에 미친 영향에 대해서 조사했다. 두 돌연변이가 프로모터의 -10 박스와 개시 코돈 주위에 위치했기 때문에, xylA 발현량에 영향을 주었을 것으로 예상했다. 특히, 프로모터 서열은 돌연변이로 인해, 박테리아 유래 프로모터와의 유사성이 증가하여 해당 돌연변이가 xylA의 발현량을 향상시켰을 것으로 예상되었다. 이를 검증하기 위해서, VXAWP1, VXAMP1, VXAWP2 및 VXAMP2 균주를 이용하였다. 상기 VXAWP1, VXAMP1, VXAWP2 및 VXAMP2 균주는 각각 서열번호 16 내지 19의 염기서열로 표시되는 프로모터를 포함한다. VXAWP1 및 VXAWP2 균주에서, 녹색 형광 단백질(sGFP)와 돌연변이 및 자연형의 XylA의 융합을 통해 XylA의 양을 정량하였다. xylA 정량 결과는 도 2g 및 도 6에 나타내었다.
도 2g 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 자연형의 프로모터에 비해서 돌연변이 프로모터를 가진 경우 단백질의 양이 6배 높게 측정되었다. 반면, 코딩 서열의 돌연변이는 발현량에 변화를 야기하지 못했다. 따라서, 자일로스 대사에 있어서 XylA의 낮은 활성이 장애물이었으며, 이를 해결하기 위해서 돌연변이가 생겨 전사 정도 및 효소 활성이 변했을 것으로 예상된다.
실시예 4. 글루코스, 자일로스, 아라비노스의 동시 대사를 위한 균주 개량
목질계 바이오매스로부터 얻어질 수 있는 주요한 탄소원(글루코스, 자일로스, 아라비노스)를 동시에 활용할 수 있도록 하기 위해서, VXA38-1 균주를 추가 개량했다(도 7a). 세가지 탄소원이 혼합되어 있는 배지에서 자연형 균주와 VXA38-1 균주를 배양하였다. 균주 배양 동안 OD600과 세가지 탄소원의 농도를 분석하였으며, 그 결과는 도 7b 및 c에 나타내었다.
도 7b 및 c에 나타낸 바와 같이, 다른 많은 박테리아의 경우와 동일하게, 글루코스의 존재가 자일로스 및 아라비노스의 대사를 저해하는 것; 및 글루코스가 전부 대사되고 나서 자일로스와 아라비노스가 동시에 대사되는 것;을 확인하였다. 비브리오 균주를 포함한 많은 박테리아 균주에서, 글루코스가 먼저 대사되며, cAMP 수용 단백질(CRP)에 의해 비선호당의 유전자 발현이 억제된다고 알려져 있다. 세포내의 cAMP 농도를 조절하는 adnylate cyclase의 활성이 phosphotransferase system(PTS)에 의해 조절되기 때문에, PTS에서 중요한 역할을 하는 PtsG(EIIBC)의 제거를 통해 여러 탄소원의 동시 대사를 가능하게 한 연구가 다수 존재한다.
이에, 비브리오 dhg 균주에서의 ptsG 제거가 동시 대사를 가능하게 하는지 확인하였다. 구체적으로, 상기 VXA38-1 균주에서 ptsG 유전자(서열번호 4)를 결실시켰으며, 이를 VXA38P로 명명하였다. VXA38P 균주를 배양하며, OD600과 세가지 탄소원의 농도를 분석하였다. OD600과 세가지 탄소원의 농도를 분석한 결과는 도 7d에 나타내었다.
도 7d에 나타낸 바와 같이, 선행 연구 결과와 일치하게, 해당 균주는 세 탄소원을 동시에 대사하는 것이 가능했다. 하지만, 글루코스 대사 효율이 크게 저해되어, 추가적인 개량이 필요해 보였다.
GalP는 우선적인 기질은 갈락토스임에도 불구하고, 해당 수송 단백질은 cAMP 농도에 영향없이 글루코스도 운반할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 글루코스 운반을 회복하기 위해서 PTS와 관련이 없는 대체적인 수송 단백질인 GalP 유전자(서열번호 5)를 VXA38P 균주 내에 도입했다(도 7a). 구축된 균주는 VXA38PG로 명명하였다. VXA38PG 균주를 배양하며, OD600과 세가지 탄소원의 농도를 분석하였다. OD600과 세가지 탄소원의 농도를 분석한 결과는 도 7e에 나타내었다.
도 7e에 나타낸 바와 같이, 구축된 VXA38PG 균주의 경우 자일로스와 아라비노스의 대사에 큰 영향 없이 글루코스에 대한 대사속도를 향상시켰다. 게다가, 전체 탄소원 대사 효율 또한 VXA39P 균주(1.69 g gdcw -1h-1)에 비해서 VXA38PG 균주(2.01 g gdcw -1h-1)에서 현저히 증가했다. 목질계 유래의 주요 탄소원의 빠른 동시 대사를 확인하여, 화합물 생산을 위해서 해당 균주의 추가적인 개량이 이루어졌다.
목질계 유래 탄소원을 빠르고 동시에 활용할 수 있게 개량된 VXA38PG 균주를 화합물 생산에 적용하였다. 모델 화합물로 산미류, 방부제 및 생분해성 플라스틱 탄량체와 같은 다양한 산업 응용 분야를 가진 젖산을 선택했다. 균주 내 젖산 생산 경로가 도 8a과 같이 되도록 VXA38PG 균주를 추가 개량하였다. 구체적으로, 젖산을 효율적으로 생산하기 위하여, VXA38PG 유전체에서 frdABCD 유전자와 pflB 유전자를 제거하여 부산물 생산 경로를 차단했다. 상기 frdA, frdB, frdC 및 frdD 유전자는 서열번호 6 내지 9의 염기서열로 표시되며, 상기 pflB 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 표시된다. 추가적으로, 젖산의 생산을 위하여, 상기 균주 내에 ldhA 유전자(서열번호 11)를 과발현시켰다. 앞서 설명한대로, VXA38PG 균주를 개량하여 frdABCD 유전자와 pflB 유전자를 제거하고, ldhA 유전자를 과발현시킨 균주를 VXA38PGL 균주로 명명하였다. 세 탄소원(글루코스, 자일로스, 아라비노스)의 혼합물을 6:3:1의 비율로 첨가한 배지에서 개량된 균주 VXA38PGL을 배양하여, OD600, 소비된 탄소원, 젖산 및 부산물 생산을 분석하였다. 배양 중에는 목질계 바이오매스 모방 탄소원 혼합액(40 g/L)은 주기적으로 12시간 간격으로 첨가되었다. OD600 및 소비된 탄소원을 분석한 결과는 도 8b에 나타내었고, 젖산 및 부산물 생산을 분석한 결과는 도 8c에 나타내었다.
도 8b 및 c에 나타낸 바와 같이, 72시간 동안 83 g/L의 젖산이 생산되었으며, 이는 1.15 g/L/h의 생산성에 해당한다. 특히 부산물 형성이 최소화되어, 이론적 최대 수율의 80%에 해당하는 높은 수율(0.8 g/g)을 달성했다. 역가는 현재까지 보고된 박테리아를 활용한 연구 결과 중 가장 높았다. 또한, 대장균을 활용하여 동일한 탄소원 조성에서 수행한 이전 연구 결과에 비해서 1.4 배 더 높은 생산성을 달성했다. 상기 결과는 비브리오 dhg 균주 자체의 높은 대사 효율이 목질계 바이오매스 기반 발효 공정의 효율을 크게 향상시키는 데에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
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Seoul National University R&DB Foundation
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylA
<400> 1
atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60
ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggcaagcg tatggaagag 120
cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac acattctgct ggaacggggc ggacatgttt 180
ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240
cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300
cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360
caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420
accgctaact gctttacaaa ccctcgctat ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480
gaagtcttca gttgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540
ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600
gacttgcgtc aggagcgtga acagctgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660
cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720
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aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840
catgaaattg ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900
gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960
gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020
aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080
gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140
aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200
ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacataattt gtctccggtg 1260
catcagagtg gtcgccagga gcaactggaa aatctggtaa atcattatct gttcgacaaa 1320
taa 1323
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<211> 612
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> yrkL
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cttacatgca tcaatgttgt gtccgctgca gagcaggttc ataaaacgga tataaaaacg 120
ctggttattg tctcacatcc ctatccagaa aggtcagtga tgaccaaggg gatgcagcaa 180
gctgctgaaa gtgttgaagg agtcacagtc agaaacctcg agactattta tggttttgat 240
actcgcgcca tcgatgcaca aaaggagcgc gagctaacga gagaacacga tcgcattgta 300
tttatgtttc caacccattg gttcaatatt actccgatga tgaaagctta catgaatgat 360
gtttggggga gtgtaggacc tggattatgg cagggaaaag aaatgctgtt ggtgacgact 420
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ttccaaactt caatgaagta cagcaacatc aaacgttttg atgagtactt tgtgttggat 480
ctgcttgttg acgatggtga agtacaaggt ctgatcgcca ttcacatgtc tgaaggtgag 540
ttggtcacca tcaaagcgaa atctgttgtg cttgcgactg gtggcgcggg acgtgtttac 600
cactgtaaca ccaatggcgg tatcgtaacg ggcgatggca tggcgatggc ttaccgtcac 660
ggtgttccgc tacgtgatat ggaatttgtt caataccacc ctactggcct accaggtact 720
ggtatcctaa tgacagaagg ttgtcgtggt gaaggtggta ttattgtcaa caaaaacggc 780
taccgctacc tacaagacta cggcatgggc cctgaaactc cagtgggtca accgaaaaac 840
aaatacatgg aactgggtcc acgtgacaaa gtttctcaag ctttctggca tgagcaacag 900
aaaggcaaca ccatcaaaca cccactgggt gacgtggtgc acctagacct tcgccacctt 960
ggtgaagagt acctacaaga acgtttacct ttcatctgtg agctagcaaa agcttacgtg 1020
aacgttgatc ctgcaaaaga accaattcca attcgtccga ccgtgcacta caccatgggc 1080
ggcatcgaaa ctgatggtgg ctgtgagact cgcgttaaag gtctattcgc agttggtgag 1140
tgtgcgtcag ttggtctgca tggtgcgaac cgtcttggct ctaactctct ggctgagttc 1200
gtggtatttg gccgagttgc gggtgaaaac gcagtgaaac gtgcagcaga attcaaaggc 1260
tggaacgaca atgctatcgc agctcaagtg aaagctgttg aagaacgcat tgccagctta 1320
atgaaccaag aaggcgatga aaactgggca gacatccgta ccgaaatggg ccacaccatg 1380
gaagcgggtt gtggcatcta ccgccaagaa gatctgatgc aagcaaccat cgataagatc 1440
acggaactta aacaacgtta caaacgcatt agcatcaaag acaaaggcaa agtgttcaac 1500
actgaccttc tttacgcaat cgaagtcggt tacggcctag aagtggcaga agcgatggtt 1560
cactctgcaa tcctgcgcaa agaatctcgc ggtgcacacc aacgtctcga tgatggctgc 1620
actgaacgtg acgacgtgaa cttcctgaaa cactcacttg ctttctatca accagacgca 1680
gcgcctagca tcgactacag caatgtaacc attactaagt ctcagcctaa agcgcgtcta 1740
tacggtgaag ctgcagaaaa agccgcagca gaagaagcag cgaagaacgc agaggagcaa 1800
gcataa 1806
<210> 7
<211> 747
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> frdB
<400> 7
atgtcagcaa accgcatcca gaaagtagac attctgcgtt atgacccaga aaaagacgca 60
gaaccgcact tacaaacttt cgaagtacca ttcgatgaaa ctatgtctgt gctcgacgcg 120
attggttaca tcaaagataa cctagacaaa gacttatctt accgttggtc ttgtcgtatg 180
gcgatctgtg gctcatgcgg catcatggtt aatggtgtgc ctaagctagc ttgtaagagc 240
ttcttacgtg actaccaaaa tggtctgaaa atcgagccat tagcgaattt cccgattgag 300
aaagacttga tcgttgatat gacgccattt atcgagcgtc ttgaagcgat caaaccttac 360
atcattggta acgaccgtaa acctgaagac ggcacaaact tgcaaacgcc agagcaaatg 420
gcgaagtaca agcagtttgc tggttgtatc aactgtggtc tgtgttacgc agcgtgtcct 480
cagttcggtc tcaacccaga gttcatcggc ccggcagcgc taacattggc gcaccgttac 540
aacttagaca gtcgtgataa cggtaaagct gagcgtatga agctgattaa cggtgagaat 600
ggcgcctggg gttgtacgtt tgtaggttac tgttctgagg tttgtccaaa gagcgttgac 660
cctgcagcag cagtaaacca aggcaaagta gagtcttcta tggacttcgt aattgcgatg 720
ctgaaacctc aggaggcaga aggatga 747
<210> 8
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> frdC
<400> 8
atgagtaacc gtaaacctta cgttcgtgaa gtaaaacgca cttggtggaa ggaccatcct 60
ttctaccgct tctacatgtt acgtgaagcg acggtactgc cactgattct attcaccatc 120
ttcctgactt tcggcctggg ttcactagtg aaagggcctg aagcttggca aggctggtta 180
gagttcatgg caaacccaat cgtagtcgcg atcaacatcg ttgcgctact tggaagcctg 240
ttccacgcac aaaccttctt cagcatgatg ccacaggtga tgccaattcg cctaaaaggc 300
aaacctgtgg gtaagaatat catcgtactg actcagtggg cagcggtcgc gtttatctca 360
ctgatcgttc tcatcgtggt gtaa 384
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> frdD
<400> 9
atgaaaccaa attatagtgt aaacacagca ccaaaacgtt cagatgagcc aatctggtgg 60
ggactgtttg gtgcaggcgg tacctggttt gcgatgatca ctcctatcac cgtacttgta 120
cttggtatcc tcgttccact gggcgtgatt gatgcagacg ccatgagcta cgagcgagta 180
tctgaattcg cgaccagtat cattggtgcg ctatttatca tcggtacact agcgctgcca 240
atgtggcatg caatgcaccg tgttcaccac ggcatgcacg accttaagtt ccacactggt 300
gtggtgggaa aagtggcatg ctatgcgttc gctggcctta tcagtgcgct atcagttatc 360
tttatcttca tgatttaa 378
<210> 10
<211> 2277
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pflB
<400> 10
atggcagagc aatttgctaa agcttgggaa ggttttgctg caggtgattg gcaaaacgaa 60
gtaaacgttc gtgatttcat tcagaagaac tacactccgt acgaaggcga cgaatctttc 120
ctagtttctg aaggtactga agcaacaaac aagctttggg ctaaagtaat ggaaggtatc 180
aaacaagaga acgcgactca cgctcctgtt gattttgata catctgttat ctctaccatc 240
actgctcacg atgcaggcta catcgaaaaa gatcttgaaa ctatcgtagg tctacaaact 300
gaagcgcctc taaaacgtgc gatcatccct aacggtggta ttcgcatggt tgaaggttca 360
tgcaaagcat atgaccgcga actagaccca caagttaaga aaatcttcac agaataccgt 420
aaaacacaca atgctggtgt tttcgatatc tacactcctg atatccttgc atgtcgtaag 480
tctggtgtac taactggtct tcctgacgca tacggccgtg gtcgtatcat cggtgactac 540
cgtcgcgttg cgctttacgg tatcgacttc ctaatgaagg acaaactagc tcagttcact 600
tctctacaag agaaatttga gaacggcgaa gaccttcaca tgactatgca acttcgtgaa 660
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atggacaaga tcgaaggtga atacctagat tacaacgagc tatgggaaaa aatggatcac 1440
ttcatggatt ggttagctaa gcagtacgtg actgcactaa acagcatcca cttcatgcac 1500
gacaagtaca gctacgaagc gtctctaatg gctctacatg accgtgacgt taaacgtaca 1560
atggcttgtg gtatcgctgg tctatctgtt gctgctgact ctctatcagc aatcaaatac 1620
gcgaaagtta aaccagttcg tgacgaagat ggtctagcaa tcgactttga aatcgaaggc 1680
gattacccta aattcggtaa caacgacgct cgcgtagatg acatcgcttg tgaacttgtt 1740
tctgtattta tgaacaagat ccgtgagctt aagacttacc gtgatgctat ccctactcag 1800
tctatcctga ctatcacttc aaacgtggta tacggtaaga agactggtaa cacgcctgat 1860
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aaaggtgcag tagcatcatt gacttcagta gcgaaactac cgtttgctga cgctcaagat 1980
ggtatctctt acacattctc tatcgtgcca aatgcactag gtaaagaaga gactagccaa 2040
cgtgctaacc ttgcaggcct aatggatggt tacttccacc acgaagctgg catcgaaggt 2100
ggccaacacc taaacgtgaa cgtgcttaac cgcgaaactc tagaagacgc agttaaacac 2160
ccagagaaat accctcagct aactatccgt gtatcgggtt acgctgtacg tttcaactct 2220
ctgactgctg aacagcaagc tgacgttatc gctcgtacat tcactgaatc actataa 2277
<210> 11
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA
<400> 11
atgattaaca ttgctttttt tagcgccaaa tcctatgacg aagcttcttt taacaaagta 60
aaaaatcaac gggatttaga gtttcattat cacgattttc ggttgaccac gaagacggcg 120
aaaatggctc acggctgcga agtcgtctgt gcatttgtta acgatgatct gtcagaaccc 180
gttttaaaac agctatctca gggcgggact aagcttatag cgatgcgttg tgcgggattt 240
gataaggtcg accaacaagc ggctaagaag ctaggcttgc aagtagtaca tgtgcccgcc 300
tattcacctg aagcggttgc cgaacatacg gttggtatga tgatgtgtct aaaccgtcga 360
ctacacaaag cctatcagcg aacccgggat gcgaatttct ctctggaagg tttagttggc 420
ttcaactttt ttggtaagac tgtaggggta ataggtacgg gaaaaatcgg cattgctgcg 480
atgagaattt ttaagggatt aggcatggaa attctttgcc atgatcctta cgaaaaccca 540
ctggcaatag agatgggcgc acgttactgc tctcttgaag atatatacgc caatgcggat 600
attattactt tgcattgccc gatgagtaaa gaaaactacc acctcctcaa tgccgactca 660
ttttcgaaaa tgaaagatgg ggtgatgatc attaatacga gtcgtggaga gctattggat 720
tctgtagcag caatcgaagc gctaaaacaa ggcagaatcg gctcactagg cttggatgtg 780
tacgacaatg aaaaagagtt gttcttccag gataaatcaa acgacattat cgtagacgat 840
gttttccgcc gactgtcggc atgtcataac gtgctgttca cgggtcatca agctttctta 900
actcacgaag cgctcaacaa catcgcgtca gtgacactaa ataacgtaga agtattcttc 960
tctgggcaag tttcaggcaa tgaactgatc aactaa 996
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP13
<400> 12
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PJ23100
<400> 13
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylA 5 UTR
<400> 14
aagtgaaacc tagaaggaga tctgt 25
<210> 15
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dns
<400> 15
atgaaatacc tgttctcttt attcattctt gcactatcca gtgccgccgt ggccgcgcca 60
ccaagttcat tttcagccgc taagcgcgaa gcggtaaaaa tctatcaaga tcatcccacc 120
agcttttatt gcggctgtga tattcaatgg caaggcaaga aaggcttacc tgacctttcc 180
tcttgtggtt accaggttcg caaacaagaa aagcgtgctt cacgcatcga gtgggaacac 240
gtcgttccag cttggcaatt tggacaccag ctgcaatgct ggcaaagcgg tggtcgtaaa 300
aactgctcgc gtaatgacaa aacattccgc tcaatggaag ccgatctgca caacctgact 360
cctgcgattg gtgaggtaaa tggtgatcgc tctaactaca attttagtca gtggaatggg 420
gtcgatggcg caacctatgg tcgttgcgaa gtccaggtaa acttcaagca acgcaaagtc 480
atgccaccgg atcgagcacg cggctccatc gctcgcacct atctttatat gagcaaggag 540
tacggcttca aactgtccaa gcaacaaact cagttaatga gtgcatggaa caaaacctac 600
ccagccgata aatgggaatg tgaacgtgat aagcgtattg ccaaagtaca aggcaaccat 660
aatccattcg ttcaagaggc ctgccgcgca ctgtaa 696
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VXAWP1 promoter
<400> 16
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VXAMP1 promoter
<400> 17
ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VXAWP2 promoter
<400> 18
ttgacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VXAMP2 promoter
<400> 19
ttgacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35
<210> 20
<211> 1535
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Vibrio sp. DHG
<400> 20
catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggaaacgagt 60
taactgaacc ttcgggggac gttaacggcg tcgagcggcg gacgggtgag taatgcctag 120
gaaattgccc tgatgtgggg gataaccatt ggaaacgatg gctaataccg catgatgcct 180
acgggccaaa gagggggacc ttcgggcctc tcgcgtcagg atatgcctag gtgggattag 240
ctagttggtg aggtaagggc tcaccaaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgat 300
cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360
tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 420
gtaaagcact ttcagtcgtg aggaaggttt atacgttaat agcgtataga tttgacgtta 480
gcgacagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga 540
gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg catgcaggtg gtttgttaag tcagatgtga 600
aagcccgggg ctcaacctcg gaatagcatt tgaaactggc agactagagt actgtagagg 660
ggggtagaat ttcaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat accggtggcg 720
aaggcggccc cctggacaga tactgacact cagatgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtctact tggaggttgt ggccttgagc 840
cgtggctttc ggagctaacg cgttaagtag accgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 900
aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960
aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagagaact tttcagagat gaattggtgc 1020
cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tccttgtttg ccagcgagta atgtcgggaa 1140
ctccagggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200
gcccttacga gtagggctac acacgtgcta caatggcgca tacagagggc ggccaacttg 1260
cgaaagtgag cgaatcccaa aaagtgcgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact 1320
ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat acgttcccgg 1380
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggctg caaaagaagt aggtagttta 1440
accttcgggg gacgcttacc actttgtggt tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta 1500
gcgctagggg aacctggcgc tggatcacct cctta 1535
Claims (12)
- 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 xylA(xylose isomerase) 유전자가 도입된, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 dns(Extracellular deoxyribonuclease) 유전자를 포함하는, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주.
- 제2항에 있어서,
상기 균주는 자일로스 최소 배지에서 적응진화(adaptive evolution)시킨 것인, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주.
- 제2항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 16 내지 19로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 염기서열로 표시되는 프로모터를 포함하는, 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주. - 제2항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 yrkL(NAD(P)H oxidoreductase) 유전자를 더 포함하는, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제2항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 deoR(DNA-binding transcriptional repressor) 유전자를 더 포함하는, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제3항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 ptsG(glucose-specific PTS enzyme IIBC component) 유전자가 결실된 것인, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제7항에 있어서,
상기 균주는 글루코스, 자일로스 및 아라비노스를 동시에 대사하는 것인, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제7항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 GalP(galactose:H(+) symporter) 유전자를 포함하는 것인, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제9항에 있어서,
상기 균주는
서열번호 6의 염기서열로 표시되는 frdA(fumarate reductase A)유전자,
서열번호 7의 염기서열로 표시되는 frdB 유전자,
서열번호 8의 염기서열로 표시되는 frdC 유전자,
서열번호 9의 염기서열로 표시되는 frdD 유전자 및
서열번호 10의 염기서열로 표시되는 pflB(Formate acetyltransferase 1) 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 유전자가 결실된 것인,
형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제10항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 ldhA(Lactate dehydrogenase A) 유전자가 추가적으로 도입된 것인, 형질전환된 비브리오속 DHG 균주.
- 제1항의 형질전환된 비브리오 속 DHG 균주를 배양하는 단계;를 포함하는, 젖산 생산 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220046940A KR20230147948A (ko) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220046940A KR20230147948A (ko) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230147948A true KR20230147948A (ko) | 2023-10-24 |
Family
ID=88515387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220046940A KR20230147948A (ko) | 2022-04-15 | 2022-04-15 | 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20230147948A (ko) |
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