WO2019211958A1 - 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法 - Google Patents

形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019211958A1
WO2019211958A1 PCT/JP2019/013368 JP2019013368W WO2019211958A1 WO 2019211958 A1 WO2019211958 A1 WO 2019211958A1 JP 2019013368 W JP2019013368 W JP 2019013368W WO 2019211958 A1 WO2019211958 A1 WO 2019211958A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organic compound
acid
enzyme
transformant
pathway
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/013368
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
乾将行
須田雅子
加藤直人
長谷川智
小暮高久
城島透
Original Assignee
公益財団法人地球環境産業技術研究機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 filed Critical 公益財団法人地球環境産業技術研究機構
Priority to JP2020517032A priority Critical patent/JP6991319B2/ja
Priority to CN201980029017.0A priority patent/CN112105716A/zh
Priority to US17/051,832 priority patent/US11459574B2/en
Priority to EP19796243.4A priority patent/EP3789480A4/en
Publication of WO2019211958A1 publication Critical patent/WO2019211958A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01012—Phosphogluconate dehydratase (4.2.1.12)

Definitions

  • the present disclosure relates to a microorganism with enhanced ability to perform a biorefinery process and a method for producing an organic compound with high productivity thereby.
  • biorefinery Production of organic compounds such as organic acids, amino acids, and alcohols from biomass-derived saccharide raw materials by biological methods to produce chemical products and energy products is called biorefinery.
  • petroleum refinery producing these organic compounds from fossil resources is called petroleum refinery.
  • biorefinery solves the problem of resource depletion and global warming, and is expected as an environmentally conscious manufacturing technology.
  • biorefinery is generally said to be less productive than oil refinery.
  • One method of improving productivity by biological methods is to improve the metabolic rate and yield of saccharides to various organic compounds, and to increase the concentration of organic compounds in bioreaction solutions (separation and purification of target organic compounds). It can be implemented with high efficiency).
  • G6DH glucose 6-phosphate dehydrogenase
  • EDD 6-phosphogluconic acid dehydratase
  • EDA aldolase
  • Patent Document 1 relates to Saccharomyces yeasts in which an ED pathway is introduced into yeast that has been modified so that it cannot be metabolized by the EMP pathway, and the sugar metabolism pathway is modified to metabolize sugar only by the ED pathway.
  • Escherichia coli, yeast (Saccharomyces cerevisiae), or lactic acid bacterium (Lactobacillus plantarum) is used as a host to introduce or enhance the ED pathway and to inactivate enzymes of the EMP pathway and PP pathway.
  • An isobutanol production technique in which the carbon flux is enhanced only in the ED pathway is disclosed.
  • Patent Document 3 by enhancing the intrinsic ED pathway, specifically, enhancing 6-phosphogluconate dehydratase activity, or 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity, or both. This shows that the yield of L-amino acid production is improved.
  • the present disclosure provides a method for improving the productivity of organic compounds in bacteria that do not have an inherent ED pathway.
  • the present disclosure relates to a transformant of coryneform bacteria in which the Entner-Doudoroff pathway is introduced into the host coryneform bacteria.
  • the present disclosure provides, in a host coryneform bacterium, a gene encoded with an enzyme having glucose 6-phosphate dehydrogenase activity, a gene encoded with an enzyme having 6-phosphogluconate dehydratase activity, and
  • the present invention relates to a transformant of coryneform bacterium into which a gene encoding an enzyme having 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity has been introduced.
  • the coryneform bacterium transformant according to the present disclosure is reacted in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions; And a step of recovering the organic compound in the reaction medium.
  • the production of organic compounds in coryneform bacteria can be made efficient.
  • the production rate and / or yield in the production of organic compounds can be improved.
  • the present inventors expressed an enzyme gene constituting the Entner-Doudoroff pathway (ED pathway) in coryneform bacteria, and two glycolysis of the Emden-Meyerhof-Parnas pathway (EMP pathway) and the ED pathway. It has been found that the productivity of organic compounds can be improved by coexisting the system. In coryneform bacteria that do not have an ED pathway in the wild type, it is estimated that the rate of metabolic conversion and consumption of saccharides can be improved and the productivity of organic compounds can be improved by functioning the two glycolytic systems of the ED pathway and the EMP pathway. The However, the present disclosure may not be limited to this mechanism. According to the present disclosure, in one embodiment, the conversion rate and conversion rate (yield) of carbonaceous matter into an organic compound that is a metabolite of a saccharide can be improved.
  • ED pathway Entner-Doudoroff pathway
  • EMP pathway Emden-Meyerhof-Parnas pathway
  • Patent Documents 1 and 2 the inherent EMP pathway is inactivated. Moreover, in patent document 3, although the intrinsic ED pathway is strengthened, the amino acid production rate is rather lowered due to the enhancement of the ED pathway.
  • the host into which the ED pathway is introduced is a coryneform bacterium.
  • Coryneform bacteria are naturally, ie, naturally occurring wild-type bacteria do not have an ED pathway.
  • coryneform bacteria are a group of microorganisms defined in the Bargeys Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), and are usually preferred. There is no particular limitation as long as it grows under atmospheric conditions. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, and Micrococcus. Among the coryneform bacteria, the genus Corynebacterium is preferable.
  • Corynebacterium bacteria include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, and Corynebacterium alkanolyticum ( Corynebacterium alkanolyticum) and the like.
  • Corynebacterium glutamicum is preferable because it is safe and has high availability of xylooligosaccharides.
  • Corynebacterium glutamicum R strain (FERM P-18976), ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 Strains, ATCC13746 strain, ATCC13761 strain, ATCC14020 strain, ATCC31831 strain, MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) and the like.
  • R strain (FERM P-18976), ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable.
  • strains can be obtained from NBRC (NITE Biological Resource Center) and ATCC (American Type Culture Collection), which are microorganism preservation organizations. These microorganisms may be not only wild strains existing in nature, but also mutants or genetically modified strains thereof.
  • One form of introducing the ED pathway into the host coryneform bacterium includes introducing at least the following three genes. (1) A gene encoding an enzyme having glucose 6-phosphate dehydrogenase activity. (2) A gene encoding an enzyme having 6-phosphogluconate dehydratase activity. (3) A gene encoding an enzyme having 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity.
  • a gene for introducing the ED pathway can be obtained from various organisms, and its origin is not particularly limited as long as it functions in a host coryneform bacterium.
  • the gene sequence can be searched in a general gene sequence database (for example, KEGG; http://www.genome.jp/kegg/genes.html).
  • the gene for introducing the ED pathway has the enzyme activities (1) to (3) described above even if the amino acid sequence encoded by the gene has an amino acid deletion, addition, or amino acid substitution. If you do.
  • introduction of an enzyme gene constituting the ED pathway into a host coryneform bacterium is described in general gene recombination techniques (for example, Michael R. Green & Joseph Sambrook, Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press). And can be carried out in the form of gene transfer using a plasmid vector or integration into a host coryneform bacterial chromosome.
  • introduction of a gene refers to introduction of the gene so that it can be expressed in a host in one or a plurality of embodiments.
  • glucose 6-phosphate dehydrogenase gene in order to introduce the glucose 6-phosphate dehydrogenase gene into a host coryneform bacterium, it is preferable to incorporate an appropriate promoter 5′-upstream of the gene, and in addition, a terminator is incorporated 3′-downstream of the gene. Is more preferable.
  • an enzyme having glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6DH) activity refers to an enzyme having an activity of converting glucose 6-phosphate into 6-phosphoglucono-1,5-lactone.
  • the enzyme having G6DH activity is preferably an enzyme that can use oxidized nicotinamide dinucleotide (NAD + ) as a coenzyme from the viewpoint of increasing the efficiency of organic compound production.
  • Examples of the gene encoding an enzyme having glucose 6-phosphate dehydrogenase activity using NAD + as a coenzyme include Zymomonas mobilis glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase gene (zwf gene) or an ortholog thereof.
  • Examples of the ortholog include orthologs of the genus Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, or Pantoea.
  • the “orthologous gene” means a related gene encoding a protein having a homologous function existing in different organisms (eg, different species, different genera).
  • an enzyme having 6-phosphogluconate dehydratase (EDD) activity refers to an enzyme having an activity of catalyzing the reaction of 6-phosphogluconic acid to 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconic acid.
  • the gene encoding an enzyme having EDD activity includes the 6-phosphogluconate dehydratase gene (edd gene) of Zymomonas mobilis or an ortholog thereof. Examples of the ortholog include orthologs of the genus Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, or Pantoea.
  • an enzyme having 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase (EDA) activity refers to glyceraldehyde-3 by cleaving 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate. -Refers to an enzyme having the activity of producing phosphate and pyruvate.
  • examples of the gene encoded with an enzyme having EDA activity include Zymomonas mobilis 6-phosphogluconate dehydratase gene (eda gene) or an ortholog thereof. Examples of the ortholog include orthologs of the genus Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter, or Pantoea.
  • the present disclosure relates to a transformant in which an ED pathway is introduced into a host coryneform bacterium.
  • the transformant according to the present disclosure is a transformant in which at least the genes (1) to (3) are introduced into a host coryneform bacterium.
  • the transformant according to the present disclosure By introducing the ED pathway into the host coryneform bacterium, the production of pyruvate and / or phosphoenolpyruvate in the cell is enhanced.
  • a further gene may be introduced or a gene deletion and / or mutation may be introduced for the production of an organic compound or its efficiency. The introduction of these genes and the like can be appropriately designed by those skilled in the art depending on the organic compound produced.
  • the organic compound produced by the transformant according to the present disclosure includes a compound having pyruvic acid as an intermediate or a compound having phosphoenolpyruvic acid as an intermediate.
  • the compound having pyruvic acid as an intermediate or the compound having phosphoenolpyruvate as an intermediate is composed of monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, ketocarboxylic acid, hydroxycarboxylic acid, amino acid, monoalcohol, polyol, aromatic compound and vitamin. There may be mentioned at least one selected from the group.
  • Compounds with pyruvic acid as an intermediate include L-lactic acid, D-lactic acid, acetic acid, 3-hydroxypropionic acid, acrylic acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, oxaloacetic acid, citric acid, cisaconic acid, itacone Acid, isocitric acid, 2-oxoglutaric acid, 2-hydroxyisovaleric acid, ethanol, 1,3-propanediol, glycerol, butanol, isobutanol, 1,4-butanediol, xylitol, sorbitol, valine, leucine, alanine, Examples include aspartic acid, lysine, isoleucine, and threonine.
  • Examples of the compound having phosphoenolpyruvate as an intermediate include shikimic acid, protocatechuic acid, catechol, 4-hydroxybenzoic acid, phenol, tyrosine, phenylalanine, and try
  • the transformant according to the present disclosure is a compound in which a saccharide is used as a raw material and a compound having pyruvic acid as an intermediate or a compound having phosphoenolpyruvate as an intermediate, for example, a monocarboxylic acid, in a reaction solution not accompanied by cell growth.
  • Dicarboxylic acid, ketocarboxylic acid, hydroxycarboxylic acid, amino acid, monoalcohol, polyol, aromatic compound and vitamin can be produced with high efficiency. Therefore, the present disclosure, in another aspect, includes reacting the transformant according to the present disclosure in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions; And a step of recovering the organic compound in the medium.
  • the transformant according to the present disclosure is grown and cultured under aerobic conditions.
  • the transformant according to the present disclosure can be cultured using a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • a carbon source for example, glucose or molasses can be used as a carbon source
  • a nitrogen source for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea, or the like can be used alone or in combination.
  • the inorganic salt for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate or magnesium sulfate can be used.
  • Culturing can usually be performed at a temperature of about 20 ° C. to about 60 ° C., preferably about 25 ° C. to about 35 ° C. under aerobic conditions such as aeration and shaking.
  • the pH during the culture is, for example, in the range of about 5 to 10, preferably about 7 to 8.
  • the pH during the culture can be adjusted by adding an acid or an alkali.
  • the carbon source concentration at the start of the culture is about 1% (W / V) to about 20% (W / V), preferably about 2% (W / V) to about 5% (W / V).
  • the culture period is usually about 1 to 7 days.
  • the cultured cells of the transformant according to the present disclosure are collected.
  • the method for recovering and separating the cultured cells from the culture obtained as described above is not particularly limited, and for example, a known method such as centrifugation or membrane separation can be used.
  • the collected cultured microbial cells may be treated, and the resulting microbial cell processed product may be used in the next step.
  • the treated microbial cells include those obtained by adding some treatment to cultured microbial cells, and examples include immobilized microbial cells obtained by immobilizing microbial cells with acrylamide or carrageenan.
  • the organic compound production reaction by the cultured cells of the transformant according to the present disclosure recovered or separated from the culture obtained as described above or the treated cells thereof may be performed in a reaction solution that does not involve cell growth. Any generation method of aerobic conditions and reducing conditions may be used.
  • the organic compound generation method can be either a batch method or a continuous method.
  • not growing includes not substantially growing or hardly growing. For example, in a reaction under aerobic conditions, by using a reaction solution that lacks or restricts one or more of vitamins such as biotin and thiamine, which are essential compounds for the growth of microorganisms, and a nitrogen source, Proliferation can be avoided or suppressed.
  • the composition of the reaction solution is not defined because coryneform bacteria do not substantially grow.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction solution under reducing conditions is preferably about ⁇ 200 mV to about ⁇ 500 mV, more preferably about ⁇ 150 mV to about ⁇ 500 mV.
  • the reduction state of the reaction solution can be estimated easily with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state), but using a redox potentiometer (for example, BROADLEY JAMES, ORP Electrodes) Can be measured.
  • the reaction solution it is preferable to maintain the reducing conditions immediately after adding the microbial cells or the processed product to the reaction solution until collecting the organic compound, but at least at the time of collecting the organic compound, the reaction solution is reduced. Any state is acceptable. It is desirable that the reaction solution be kept under reducing conditions for about 50% or more of the reaction time, more preferably about 70% or more, and even more preferably about 90% or more. In particular, the oxidation-reduction potential of the reaction solution is maintained at about -200 mV to about -500 mV for a time of about 50% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 90% or more of the reaction time. Is more desirable.
  • the present disclosure in one aspect, reacts the bacterial transformant according to the present disclosure in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions, and a reaction medium. And a step of recovering the organic compound therein.
  • the reaction liquid contains an organic carbon source (for example, saccharides) that is a raw material for producing an organic compound.
  • organic carbon source include substances that can be used for biochemical reactions by the transformant according to the present disclosure.
  • the saccharide include monosaccharides such as glucose, xylose, arabinose, galactose, fructose or mannose, disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose or maltose, or polysaccharides such as dextrin or soluble starch. It is done. Of these, glucose is preferable.
  • the organic compound produced in the reaction medium as described above is collected.
  • a known method used in a bioprocess can be used. Such known methods include salting out, recrystallization, organic solvent extraction, esterification distillation separation, chromatographic separation, or electrodialysis, etc. of the organic compound production liquid. The separation, purification and collection method can be determined accordingly.
  • the present disclosure may relate to the following: [1] A transformant of coryneform bacteria in which the Entner-Doudoroff pathway is introduced into the host coryneform bacteria. [2] In the host coryneform bacterium, A gene encoding an enzyme having glucose 6-phosphate dehydrogenase activity; Characteristics of coryneform bacteria into which a gene encoding an enzyme having 6-phosphogluconate dehydratase activity and a gene encoding an enzyme having 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity have been introduced Convertible.
  • [7] A transformant of Corynebacterium glutamicum ALA98 (accession number: NITE BP-02688). [8] A step of reacting the transformant according to any one of [1] to [7] in a reaction solution in which at least one factor necessary for growth is removed or in a reaction solution under reducing conditions; And a step of recovering the organic compound in the culture medium.
  • the organic compound is at least one selected from the group consisting of monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, ketocarboxylic acid, hydroxycarboxylic acid, amino acid, monoalcohol, polyol, aromatic compound, and vitamin. [8] To [10]. The method for producing an organic compound according to any one of [10].
  • Example 1 Construction of ethanol, isobutanol, D-lactic acid, alanine and shikimic acid producing strains using ED pathway-introduced Corynebacterium glutamicum as a host (1) Preparation and acquisition of chromosomal DNA Chromosomal DNA was prepared from the following strains. Chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976) and Zymomonas mobilis ATCC 31821 are cultured according to the information of the strain-obtained institution, and then a DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham).
  • Table 1 shows the primer sequences used to isolate the target enzyme gene.
  • a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) was used, and PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) was used as a reaction reagent.
  • the obtained DNA fragment was introduced into a cloning vector (pCRG5, pCRB214 [FEBS Lett. 2012 Nov 30; 586 (23): 4228-4232]) containing a tac promoter.
  • Table 2 shows the introduced cloning vector and the obtained plasmid name. Since zwf and edd are continuously arranged in the same direction on the chromosome, cloning was performed together (SEQ ID NO: 1).
  • pCRG5 cloning vector Vector pCRB22 [Appl Environ Microbiol. 2012 Jun; 78 (12): 4447- containing the tC promoter sequence derived from the cloning vector pKK223-3 (Pharmacia) and the rrnB T1T2 bidirectional terminator sequence and the pCASE1 ori sequence. 4CR] was constructed.
  • the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 were used for tac promoter sequence amplification, and the obtained DNA fragment was introduced into pCRB210 [Microbiology. 2015 Feb; 161 (Pt 2): 254-263 / WO2012 / 033112].
  • the resulting cloning vector containing the tac promoter was named pCRG5.
  • a restriction enzyme site (unique site) for incorporating a gene into the SSI region was introduced into pCRG12 by inverse PCR.
  • Table 3 shows primer sequences used for isolation and inverse PCR of the SSI region and the resulting vector for chromosome introduction.
  • the tac promoter fusion enzyme gene fragment was obtained from the ED pathway-related gene expression plasmid constructed in Table 2 and introduced into the above-described chromosome introduction vector to construct plasmid introduction plasmids pCRG14 and pCRG15. Also, a plasmid pCRG16 for chromosomal introduction of the Ldhoba gene derived from Lactobacillus delbrueckii was constructed using pCRB215 [Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Jun; 99 (11): 4679-4689] and pCRB263 [WO2017 / 146241]. Table 4 shows the resulting plasmids for chromosome introduction.
  • pCRA725 Construction of production strain by chromosomal gene recombination Markerless chromosomal gene transfer pCRA725 is a plasmid that cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R.
  • kanamycin resistance by expression of the kanamycin resistance gene on pCRA725 and sucrose content by expression of the sacR-sacB gene of Bacillus subtilis In contrast to lethality in the medium, the double crossover strain shows sensitivity to kanamycin due to loss of the kanamycin resistance gene on pCRA725 and growth in a sucrose-containing medium due to loss of the sacR-sacB gene.
  • the markerless chromosome gene-introduced strain exhibits kanamycin sensitivity and sucrose-containing medium growth.
  • an ED pathway-related gene chromosome introduction strain was constructed using the above-mentioned plasmid for ED pathway-related gene chromosome introduction.
  • Coryneform bacteria CRZ14 [Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Feb; 99 (3): 1165-1172] and LPglc267 [Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Jun; 99 (11): 4679-4689] were used as host strains.
  • LHglc435 is a plasmid pCRD109 [Appl Microbiol Biotechnol.
  • plasmid pCRB283 for introducing the tkt-tal gene chromosome, plasmid pSKM26 [WO 2016/027870 A1] for disrupting the qsuB gene, plasmid pCRA725-pobA / CG [WO2012 / 063860 A1] for disrupting the pobA gene And poxF gene disruption plasmid pCRA725-poxF / CG [WO2012 / 067174 A1], qsuD gene disruption plasmid pSKM27 [WO2016 / 027870 A1] and aroK gene disruption plasmid pCRC329 [WO2016 / 027870 A1].
  • Tables 5 and 6 The summary of this chromosome gene recombination is summarized in Tables 5 and 6.
  • a shikimic acid-producing strain was constructed by introducing pCRB1-aroG / CG [WO2012 / 033112 A1] and pSKM7 [WO2016 / 027870 A1]. The outline of this production stock is summarized in Table 7.
  • Corynebacterium glutamicum ALA98 is internationally deposited with the Patent Microbiology Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8 122, Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan (Zip 292-0818) (Date of international deposit under the Budapest Treaty: April 17, 2018, deposit number: NITE BP-02688)
  • Example 2 Verification of ED pathway introduction effect by ethanol-producing Corynebacterium glutamicum transformant Ethanol-producing strains ETH1 and ETH2 constructed based on Corynebacterium glutamicum R strain [see Example 1 (Table 7)] The ethanol productivity under the conditions was investigated.
  • the evaluation strain is 4% glucose and 5 ng / L chloramphenicol in nutrient medium (2 g urea, 2 g yeast extract, 7 g casamino acids, 7 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g KH 2 PO 4 in 1 liter of water).
  • the obtained cells are 10 g (dry cells) / L in a minimal medium (7 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g KH 2 PO 4 , 0.5 g K 2 HPO 4 , 1 liter of water, 0.5 g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 6 mg FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 4.2 mg MnSO 4 ⁇ H 2 O, 0.2 mg biotin and 0.2 mg thiamin were dissolved), and glucose was added to start the production reaction. An aqueous ammonia solution was appropriately added so as to maintain the reaction temperature at 33 ° C. and the pH at 6.5. The results of the production test are shown in Table 8. The productivity of the ED pathway-introduced strain (ETH2) was significantly improved as compared to the strain without the ED pathway (ETH1).
  • Example 3 Verification of ED pathway introduction effect by isobutanol-producing Corynebacterium glutamicum transformant Isobutanol-producing strains IBU103 and IBU104 constructed on the basis of Corynebacterium glutamicum R strain (see Example 1 (Table 7)), The isobutanol productivity under the growth inhibition condition was examined.
  • the evaluation strain was cultured under aerobic conditions using a nutrient medium supplemented with 4% glucose, 50 ng / L kanamycin, 5 ng / L chloramphenicol, and 50 ng / L zeocin to prepare bacterial cells.
  • the obtained microbial cells were suspended in a minimal medium so as to be 20 g (dry microbial cells) / L, and glucose was added to start the production reaction. An aqueous ammonia solution was appropriately added so as to maintain the reaction temperature at 33 ° C. and the pH at 7.5.
  • the results of the production test are shown in Table 9.
  • the ED pathway-introduced strain (IBU104) was significantly more productive than the strain without the ED pathway (IBU103).
  • Example 4 Verification of ED pathway introduction effect by D-lactic acid producing Corynebacterium glutamicum transformants
  • the D-lactic acid productivity under the growth suppression conditions was examined. Evaluation strains were cultured under aerobic conditions using a nutrient medium supplemented with 4% glucose to prepare bacterial cells. The obtained microbial cells were suspended in a minimal medium so as to be 10 g (dry microbial cells) / L, and glucose was added to start the production reaction. An aqueous ammonia solution was appropriately added so as to maintain the reaction temperature at 33 ° C. and the pH at 7.0. The results of the production test are shown in Table 10. The productivity of the ED pathway-introduced strain (LPglc349ED) was significantly improved as compared to the strain without the ED pathway (LPglc349).
  • Example 5 Verification of ED pathway introduction effect by alanine-producing Corynebacterium glutamicum transformant Using alanine-producing strains ALA97 and ALA98 (see Example 1 (Table 7)) constructed based on Corynebacterium glutamicum R strain, inhibition of growth Alanine productivity under the conditions was examined.
  • the evaluation strain was cultured under aerobic conditions using a nutrient medium supplemented with 4% glucose and 50 ng / L kanamycin to prepare bacterial cells.
  • the obtained microbial cells were suspended in a minimal medium so as to be 10 g (dry microbial cells) / L, and glucose was added to start the production reaction.
  • An aqueous ammonia solution was appropriately added so as to maintain the reaction temperature at 33 ° C. and the pH at 7.0.
  • the results of the production test are shown in Table 11.
  • the productivity of the ED pathway-introduced strain (ALA98) was significantly improved as compared to the strain without the ED pathway (ALA97).
  • Example 6 Verification of ED pathway introduction effect by Shikimic acid-producing Corynebacterium glutamicum transformant Using alanine-producing strains SHI2 and SHI3 [see Example 1 (Table 7)] constructed based on Corynebacterium glutamicum R strain Alanine productivity under inhibitory conditions was examined.
  • the evaluation strain is preferably a nutrient medium supplemented with 4% glucose, 50 ng / L kanamycin, 5 ng / L chloramphenicol, 20 ⁇ g / ml phenylalanine, 20 ⁇ g / ml tyrosine, 20 ⁇ g / ml tryptophan and 10 ⁇ g / ml p-aminobenzoic acid.
  • the cells were cultured under atmospheric conditions to prepare bacterial cells.
  • the obtained microbial cells were suspended in a minimal medium so as to be 10 g (dry microbial cells) / L, and glucose was added to start the production reaction.
  • reaction temperature is 33 ° C
  • air flow rate is 0.25L / min (air, 1vvm)
  • dissolved oxygen concentration (DO) 5% saturated dissolved at atmospheric pressure
  • the reaction was carried out under the conditions of oxygen concentration (100%), and an aqueous ammonia solution was appropriately added so that the pH was maintained at 7.0.
  • the results of the production test are shown in Table 12.
  • the productivity of the ED pathway-introduced strain (SHI3) was significantly improved as compared to the strain without the ED pathway (SHI2).
  • the present disclosure is useful for the production of useful organic compounds such as organic acids, amino acids, and alcohols.

Abstract

本来内在するED経路を持たない細菌における有機化合物の生産性向上方法の提供。 一態様において、宿主のコリネ型細菌にエントナー－ドゥドロフ経路が導入された、コリネ型細菌の形質転換体に関する。その他の一態様において、宿主のコリネ型細菌に、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、及び２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入された、コリネ型細菌の形質転換体に関する。

Description

形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法
　本開示は、バイオリファイナリープロセスを実施する為の能力が強化された微生物と、それによる有機化合物の高生産性製造方法に関する。
　バイオマス由来の糖類の原料から、有機酸、アミノ酸、及びアルコール等の有機化合物を生物的方法により製造して化学製品やエネルギー製品とすることは、バイオリファイナリーと呼ばれる。一方で、化石資源からこれら有機化合物を製造することは、石油リファイナリーと呼ばれる。バイオリファイナリーは、石油リファイナリーとは異なり、資源枯渇問題や地球温暖化問題を解消し、環境調和型製造技術として期待されているものである。
　しかし、バイオリファイナリーは、一般的に、その生産性が石油リファイナリーに比べて低いと言われている。
　生物的方法による生産性向上法の一つは、糖類の各種有機化合物への代謝速度と収率を向上させ、バイオ反応溶液中の有機化合物の蓄積濃度を高める（目的有機化合物の分離・精製が高効率に実施できる）ことである。
　コリネバクテリウム属細菌による糖代謝では、エムデン－マイヤーホフ－パルナス経路（EMP経路）、及びペントースリン酸経路（PP経路）を介して行われ、糖類はピルビン酸へ変換され、その後各種の有機化合物へ更に変換される。一方、Zymomonas mobilisなどの一部の微生物は、エントナー－ドゥドロフ経路（ED経路）を介して糖代謝を行う。
　ED経路は、グルコース６－リン酸を６－ホスホグルコノ－１，５－ラクトンへ変換するグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「G6DH」と略す）、６－ホスホグルコノ－１，５－ラクトンを６－ホスホグルコン酸へ変換する６－ホスホグルコノラクトナーゼ、６－ホスホグルコン酸から２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸の反応を触媒する６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（以下、「EDD」と略す）、及び２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸を開裂してグリセルアルデヒド－３－リン酸とピルビン酸を生成する酵素２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下、「EDA」と略す）から成る。ED経路による糖代謝では、ATPの生成効率が低いため、それを補うために糖代謝速度がEMP経路よりも速いと言われており、結果として発酵生産では、ED経路を有する微生物では、高い生産性を達成することができると言われている。
　特許文献１では、サッカロミセス属酵母に関し、EMP経路により糖代謝できないように改変されている酵母にED経路を導入し、ED経路のみで糖を代謝するように糖代謝経路が改変されている例が記載されている。
　特許文献２では、大腸菌(Escherichia coli)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、又は乳酸菌(Lactobacillus plantarum)を宿主とし、ED経路を導入又は強化するとともに、EMP経路及びPP経路の酵素を不活性化することで、ED経路のみへ炭素流束を増強させたイソブタノール生産技術が開示されている。
　特許文献３では、内在するED経路の強化、具体的には６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、もしくは２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方を増強することにより、Ｌ－アミノ酸生産の収率が向上することを示している。
特表平９－５１０３６０号公報 米国特許第２０１０／０１２０１０５号明細書 特許第３９３２９４５号公報
　本開示は、一態様において、本来内在するED経路を持たない細菌における有機化合物の生産性向上方法を提供する。
　本開示は、一態様において、宿主のコリネ型細菌にエントナー－ドゥドロフ経路が導入された、コリネ型細菌の形質転換体に関する。
　本開示は、その他の一態様において、宿主のコリネ型細菌に、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、及び２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入された、コリネ型細菌の形質転換体に関する。
　本開示は、その他の一態様において、本開示に係るコリネ型細菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中の有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法に関する。
　本開示によれば、一態様において、コリネ型細菌における有機化合物の製造を効率化することができる。例えば、有機化合物の生産における生産速度及び／又は収率を向上できる。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、コリネ型細菌においてエントナー－ドゥドロフ経路（ED経路）を構成する酵素遺伝子を発現させ、エムデン－マイヤーホフ－パルナス経路（EMP経路）とED経路の２つの解糖系を併存させることにより、有機化合物の生産性を向上できることを見出した。
　野生型ではED経路を有さないコリネ型細菌においてED経路とEMP経路との２つの解糖系を機能させることにより糖類の代謝変換消費速度が向上し、有機化合物の生産性が向上すると推定される。ただし、本開示はこのメカニズムに限定されなくてもよい。
　本開示によれば、一態様において、糖類の代謝産物である有機化合物への炭素質の変換速度と変換率（収率）とを向上させうる。
　なお、特許文献１及び２においては、内在するEMP経路は不活化されている。
　また、特許文献３では、内在するED経路を強化しているが、アミノ酸生産速度は、ED経路の強化によりむしろ低下している。
　［宿主］
　本開示において、ED経路を導入する宿主は、コリネ型細菌である。
　コリネ型細菌は、本来、すなわち、自然界に存在する野生型は、ED経路を有さない。
　本開示において、コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、及びマイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム、コリネバクテリウム　エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム　アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム　ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、及びコリネバクテリウム　アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、安全でかつキシロオリゴ糖の利用能が高い点で、コリネバクテリウム　グルタミカムが好ましい。
　好適な菌株として、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、及びMJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、及びATCC13869株が好ましい。
　これらの菌株は、微生物保存機関であるNBRC（NITE Biological Resource Center）、及びATCC（American Type Culture Collection）などで入手可能である。
　また、これら微生物は、自然界に存在する野生株だけでなく、その変異株、又は遺伝子組換え株であってもよい。
　［ED経路の導入］
　宿主コリネ型細菌にED経路を導入する一形態は、少なくとも下記の３つの遺伝子を導入することが挙げられる。
（１）グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子。
（２）６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子。
（３）２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子。
　ED経路を導入するための遺伝子は、様々な生物から取得でき、宿主コリネ型細菌内で機能すれば、特に由来は限定されない。該遺伝子配列は、一般的な遺伝子配列データベース（例えば、KEGG；http://www.genome.jp/kegg/genes.html）において検索できる。
　ED経路を導入するための遺伝子は、該遺伝子がコードするアミノ酸配列に、アミノ酸欠失、付加、又はアミノ酸置換があっても、各酵素が上述の（１）～（３）の酵素活性を有していればよい。
　本開示において、ED経路を構成する酵素遺伝子の宿主コリネ型細菌への導入にあたっては、一般的な遺伝子組換え技術（例えば、Michael R. Green & Joseph Sambrook, Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）を用いて行うことができ、プラスミドベクターを用いた遺伝子導入、又は宿主コリネ型細菌染色体へ組み込む形態で実施することができる。
　本開示において、遺伝子の導入とは、一又は複数の実施形態において、該遺伝子が宿主内で発現可能に導入することをいう。
　例えば、宿主コリネ型細菌にグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入するには、適当なプロモーターを該遺伝子の5'-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを3'-側下流に組み込むことがさらに好ましい。
　［グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素］
　本開示において、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ（G6DH）活性を有する酵素とは、グルコース６－リン酸を６－ホスホグルコノ－１，５－ラクトンへ変換する活性を有する酵素をいう。
　本開示において、G6DH活性を有する酵素は、有機化合物生産の効率化の観点から、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド（NAD+）を補酵素として利用可能な酵素であることが好ましい。
　NAD+を補酵素とするグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、Zymomonas mobilisのグルコース６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ遺伝子（zwf遺伝子）又はそのオーソログが挙げられる。前記オーソログとしては、Escherichia属、Pseudomonas属、Enterobacter属、又はPantoea属のオーソログが挙げられる。
　なお、本開示において「オーソログ遺伝子」とは、異なる生物（例えば、異なる種、異なる属）に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子を意味する。
　［６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素］
　本開示において、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（EDD）活性を有する酵素とは、６－ホスホグルコン酸から２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸の反応を触媒する活性を有する酵素をいう。
　本開示において、EDD活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、Zymomonas mobilisの６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（edd遺伝子）又はそのオーソログが挙げられる。前記オーソログとしては、Escherichia属、Pseudomonas属、 Enterobacter属、又はPantoea属のオーソログが挙げられる。
　［２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素］
　本開示において、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ（EDA）活性を有する酵素とは、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸を開裂してグリセルアルデヒド－３－リン酸とピルビン酸とを生成する活性を有する酵素をいう。
　本開示において、EDA活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、Zymomonas mobilisの６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（eda遺伝子）又はそのオーソログが挙げられる。前記オーソログとしては、Escherichia属、Pseudomonas属、 Enterobacter属、又はPantoea属のオーソログが挙げられる。
　［形質転換体］
　本開示は、一態様において、宿主コリネ型細菌にED経路が導入された形質転換体に関する。
　本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、少なくとも上記（１）～（３）の遺伝子が宿主コリネ型細菌に導入された形質転換体である。
　宿主コリネ型細菌にED経路が導入されることで、細胞内におけるピルビン酸及び／又はホスホエノールピルビン酸の産生が亢進する。
　本開示に係る形質転換体は、有機化合物の産生又はその効率化のために、さらなる遺伝子が導入されてもよく、遺伝子の欠失及び／又は変異が導入されもよい。これらの遺伝子の導入等は、産生した有機化合物に応じて当業者であれば適宜設計できる。
　［有機化合物］
　本開示に係る形質転換体で産生する有機化合物は、一又は複数の実施形態において、ピルビン酸を中間体とする化合物又はホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物が挙げられる。
　ピルビン酸を中間体とする化合物又はホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール、芳香族化合物及びビタミンからなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
　ピルビン酸を中間体とする化合物としては、L-乳酸、D-乳酸、酢酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、シスアコニット酸、イタコン酸、イソクエン酸、２－オキソグルタル酸、２-ヒドロキシイソ吉草酸、エタノール、１，３－プロパンジオール、グリセロール、ブタノール、イソブタノール、１，４－ブタンジオール、キシリトール、ソルビトール、バリン、ロイシン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、イソロイシン、及びスレオニン等が挙げられる。
　ホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物としては、シキミ酸、プロトカテク酸、カテコール、4-ヒドロキシ安息香酸、フェノール、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファン等が挙げられる。
　［有機化合物の製造方法］
　本開示に係る形質転換体は、菌体増殖を伴わない反応液中で、糖類を原料として、ピルビン酸を中間体とする化合物又はホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物、例えば、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール、芳香族化合物及びビタミン等を高効率で生産できる。
　よって、本開示は、その他の一態様において、本開示に係る形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中の有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法に関する。
　本開示に係る有機化合物の製造方法においては、まず、上記の本開示に係る形質転換体を好気条件下で増殖培養する。
　本開示に係る形質転換体の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム又は尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウム又は硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸又はビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。
　培養は、通常、通気攪拌又は振盪等の好気的条件下、約20℃～約60℃、好ましくは、約25℃～約35℃の温度で行うことが出来る。培養時のpHは例えば5～10付近、好ましくは7～8付近の範囲であり、培養中のpH調整は酸又はアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約1%(W/V)～約20%(W/V)、好ましくは約2%(W/V)～約5%(W/V)である。また、培養期間は通常1～7日間程度である。
　ついで、本開示に係る形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。
　回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものが挙げられ、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
　上記の如くして得られる培養物から回収分離された本開示に係る形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物による有機化合物の生成反応は、菌体増殖を伴わない反応液中であれば好気条件及び還元条件のいずれの生成方式を用いてもよい。有機化合物生成方式は、回分式、連続式いずれの生成方式も可能である。
　本開示において、増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、好気条件の反応では微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避又は抑制できる。
　また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため反応液の組成は規定されない。還元条件における反応液の酸化還元電位は、約-200mV～約-500mVが好ましく、約-150mV～約-500mVがより好ましい。反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY JAMES社製、ORP Electrodes）を用いて測定できる。
　本開示においては、反応液に菌体又はその処理物を添加した直後から有機化合物を採取するまで、還元条件を維持していることが好ましいが、少なくとも有機化合物を採取する時点で反応液が還元状態であればよい。反応時間の約50％以上、より好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液が還元条件下に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約50%以上、より好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約90%以上の時間、反応液の酸化還元電位が約-200mV～約-500mV程度に保たれていることがより望ましい。
　よって、本開示は、一態様において、本開示に係る菌形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中の有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法に関する。
　反応液には、有機化合物生成の原料となる有機炭素源（例えば、糖類等）が含まれている。有機炭素源としては、本開示に係る形質転換体が生化学反応に利用できる物質が挙げられる。
　具体的には、糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖、ラクトースもしくはマルトースなどの二糖類、又はデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。
　最後に、上述のようにして反応培地で生成した有機化合物を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、有機化合物生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法又は電気透析法等があり、生成有機化合物の特性に応じてその分離精製採取法は適宜定めることが出来る。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
　[1]　宿主のコリネ型細菌にエントナー‐ドゥドロフ経路が導入された、コリネ型細菌の形質転換体。
　[2]　宿主のコリネ型細菌に、
　グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、
　６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、及び　２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入された、コリネ型細菌の形質転換体。
　[3]　前記グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼが、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを補酵素として利用可能な酵素である、[2]に記載の形質転換体。
　[4]　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムである、[1]から[3]のいずれかに記載の形質転換体。
　[5]　さらに、有機化合物の生産効率を向上するための遺伝子が導入されている、[1]から[4]のいずれかに記載の形質転換体。
　[6]　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM P-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である、[1]から[5]のいずれかに記載の形質転換体。
　[7]　コリネバクテリウム　グルタミカムALA98株（受託番号:NITE BP-02688）形質転換体。
　[8]　[1]から[7]のいずれかに記載の形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中の有機化合物を回収する工程とを含む、有機化合物の製造方法。
　[9]　[1]から[7]のいずれかに記載の形質転換体を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類から有機化合物へ変換し、該反応液より有機化合物を回収することを含む、[8]に記載の有機化合物の製造方法。
　[10]　前記有機化合物が、ピルビン酸を中間体とする化合物又はホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物である、[8]又は[9]に記載の有機化合物の製造方法。
　[11]　前記有機化合物が、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール、芳香族化合物及びビタミンからなる群から選択される少なくとも１種である、[8]から[10]のいずれかに記載の有機化合物の製造方法。
　以下、本開示を実施例により詳細に説明するが、本開示はこれらの実施例に限定されるものではない。
　［実施例１］
　ED経路導入コリネバクテリウム グルタミカムを宿主としたエタノール、イソブタノール、D-乳酸、アラニン及びシキミ酸生産株の構築
　（1）染色体DNAの調製・入手
　下記菌株から染色体DNAを調製した。
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R(FERM P-18976)、及びザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis ATCC 31821）の染色体DNAは、菌株入手機関の情報に従って培養した後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調製した。
　（2）遺伝子発現プラスミドの構築
　目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表1に示す。PCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。得られたDNA断片を、tacプロモーターを含有するクローニングベクター（pCRG5、pCRB214[FEBS Lett. 2012 Nov 30;586(23):4228-4232]）に導入した。
　導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表2に示す。なお、zwf及びeddは染色体上で連続して同じ向きに配置されているため、まとめてクローニングを行った（配列番号1）。
　pCRG5クローニングベクターの構築
　クローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来のtacプロモーター配列及びrrnB T1T2双方向ターミネーター配列をpCASE1 ori配列を含むベクターpCRB22[Appl Environ Microbiol. 2012 Jun;78(12):4447-4457]に導入したpCRG5を構築した。tacプロモーター配列増幅には配列番号7及び8のプライマーを使用し、得られたDNA断片をpCRB210[Microbiology. 2015 Feb;161(Pt 2):254-263 / WO2012/033112]に導入した。得られたtacプロモーターを含有するクローニングベクターをpCRG5と命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（3）染色体導入株の構築
　遺伝子をCorynebacterium glutamicum R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の生育に必須でないと報告されている配列[Appl Environ Microbiol. 2005 Jun;71(6):3369-3372]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域をPCR法により増幅した。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725[J Mol Microbiol Biotechnol. 2004;8(4):243-54 / JP 2006-124440 A]に導入した。なお、pCRG12には、インバース PCR法によりSSI領域に遺伝子を組み込むための制限酵素部位（ユニークサイト）を導入した。SSI領域の単離及びインバースPCRに用いたプライマー配列及び得られた染色体導入用ベクターを表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上述の染色体導入用ベクターに、上記表2で構築したED経路関連遺伝子発現プラスミドからtacプロモーター融合酵素遺伝子断片を取得し導入し、染色体導入用プラスミドpCRG14及びpCRG15を構築した。また、pCRB215[Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Jun;99(11):4679-4689]及びpCRB263[WO2017/146241]を用いてLactobacillus delbrueckii由来ldhA遺伝子の染色体導入用プラスミドpCRG16を構築した。得られた染色体導入用プラスミドを表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（4）染色体遺伝子組換えによる生産株の構築
　マーカーレス染色体遺伝子導入用pCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入したSSI領域と染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性とを示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性とを示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　上記方法により、上述したED経路関連遺伝子染色体導入用プラスミドを用いてED経路関連遺伝子染色体導入株を構築した。宿主菌株としてコリネ型細菌CRZ14[Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Feb;99(3):1165-1172]及びLPglc267[Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Jun;99(11):4679-4689]を使用した。
　また、LHglc435は、コリネ型細菌CRZ1[J Mol Microbiol Biotechnol. 2004;8(4):243-254]を宿主としてアラビノース資化遺伝子（araBAD）染色体導入用プラスミドpCRD109[Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Nov;85(1):105-115]、アラビノーストランスポーター遺伝子（araE）染色体導入用プラスミドpCRD108[Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Nov;85(1):105-115]、キシロース資化遺伝子（xylAB）染色体導入用プラスミドXyl4・Xyl5[Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Dec;81(4):691-699]、セロビオース資化遺伝子（bglF(V317A)bglA）染色体導入用プラスミドCel1[Appl Microbiol Biotechnol. 2008 Dec;81(4):691-699]、gapA遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD907[Appl Environ Microbiol. 2012 Jun;78(12):4447-4457]、gpi遺伝子染色体導入用プラスミドpCRD913[Appl Environ Microbiol. 2012 Jun;78(12):4447-4457]、tpi遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB224[Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Aug;97(15):6693-6703]、tkt-tal遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB283[WO2016/027870]、qsuB遺伝子破壊用プラスミドpSKM26[WO 2016/027870 A1]、pobA遺伝子破壊用プラスミドpCRA725-pobA/CG[WO2012/063860 A1]、poxF遺伝子破壊用プラスミドpCRA725-poxF/CG[WO2012/067174 A1]、qsuD遺伝子破壊用プラスミドpSKM27[WO2016/027870 A1]及びaroK遺伝子破壊用プラスミドpCRC329[WO2016/027870 A1]を用いて構築した。なお、本染色体遺伝子組換えの概要は、表5及び6にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（5） プラスミド導入による有用物質生産株の構築
　上述の染色体遺伝子組換え株にpCRA723[J Mol Microbiol Biotechnol. 2004;8(4):243-254]を導入することによりエタノール生産株を構築した。pCRB-BNCTM[Appl Environ Microbiol. 2012 Feb;78(3):865-875]、pCRD926及びpCRD927[Biotechnol Bioeng. 2013 Nov;110(11):2938-48]を導入することによりイソブタノール生産株を構築した。pCRD914[Appl Environ Microbiol. 2012 Jun;78(12):4447-4457]を導入することによりアラニン生産株を構築した。pCRB1-aroG/CG[WO2012/033112 A1]及びpSKM7[WO2016/027870 A1]を導入することによりシキミ酸生産株を構築した。なお、本生産株の概要は、表7にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ALA98 は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託した（ブダペスト条約に基づく国際寄託の受託日：2018年4月17日、受託番号：NITE BP-02688）。
　[実施例2]
　エタノール生産コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるED経路導入効果の検証
　コリネバクテリウム　グルタミカムR株をベースとして構築したエタノール生産株ETH1株及びETH2株[実施例1(表7)参照]を用い、増殖抑制条件下におけるエタノール生産性を検討した。評価菌株は、4%グルコースと5ng/L chloramphenicolとを加えた栄養培地(1 literの水に 2g urea, 2g yeast extract, 7g casamino acids, 7g (NH4)2SO4, 0.5g KH2PO4, 0.5g K2HPO4, 0.5g MgSO4・7H2O, 6mg FeSO4・7H2O, 4.2mg MnSO4・H2O, 0.2mg biotin, 及び0.2mg thiamin・HClを溶解)を用いて好気条件で培養し、菌体を調製した。得られた菌体は、10g(乾燥菌体)/Lとなるように最少培地(1 literの水に7g (NH4)2SO4, 0.5g KH2PO4, 0.5g K2HPO4, 0.5g MgSO4・7H2O, 6mg FeSO4・7H2O, 4.2mg MnSO4・H2O, 0.2mg biotin及び0.2mg thiaminを溶解)に懸濁し、グルコースを加えて生産反応を開始した。反応温度は33℃、pHは6.5を維持するようにアンモニア水溶液を適宜添加した。生産試験の結果を表8に示した。ED経路導入株(ETH2)は、ED経路を導入していない株(ETH1)と比較して、顕著に生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　[実施例3]
　イソブタノール生産コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるED経路導入効果の検証
　コリネバクテリウム　グルタミカムR株をベースとして構築したイソブタノール生産株IBU103株及びIBU104株[実施例1(表7)参照]を用い、増殖抑制条件下におけるイソブタノール生産性を検討した。評価菌株は、4%グルコース、50ng/L kanamycin、5ng/L chloramphenicol、及び50 ng/L zeocinを加えた栄養培地を用いて好気条件で培養し、菌体を調製した。得られた菌体は、20g(乾燥菌体)/Lとなるように最少培地に懸濁し、グルコースを加えて生産反応を開始した。反応温度は33℃、pHは7.5を維持するようにアンモニア水溶液を適宜添加した。生産試験の結果を表9に示した。ED経路導入株(IBU104)は、ED経路を導入していない株(IBU103)と比較して、顕著に生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　[実施例4]
　D-乳酸生産コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるED経路導入効果の検証
　コリネバクテリウム　グルタミカムR株をベースとして構築したD-乳酸生産株LPglc349株及びLPglc349ED株[実施例1(表6)参照]を用い、増殖抑制条件下におけるD-乳酸生産性を検討した。評価菌株は、4%グルコースを加えた栄養培地を用いて好気条件で培養し、菌体を調製した。得られた菌体は、10g(乾燥菌体)/Lとなるように最少培地に懸濁し、グルコースを加えて生産反応を開始した。反応温度は33℃、pHは7.0を維持するようにアンモニア水溶液を適宜添加した。生産試験の結果を表10に示した。ED経路導入株(LPglc349ED)は、ED経路を導入していない株(LPglc349)と比較して、顕著に生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　[実施例5]
　アラニン生産コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるED経路導入効果の検証
　コリネバクテリウム　グルタミカムR株をベースとして構築したアラニン生産株ALA97株及びALA98株[実施例1(表7)参照]を用い、増殖抑制条件下におけるアラニン生産性を検討した。評価菌株は、4%グルコース、及び50ng/L kanamycinを加えた栄養培地を用いて好気条件で培養し、菌体を調製した。得られた菌体は、10g(乾燥菌体)/Lとなるように最少培地に懸濁し、グルコースを加えて生産反応を開始した。反応温度は33℃、pHは7.0を維持するようにアンモニア水溶液を適宜添加した。生産試験の結果を表11に示した。ED経路導入株(ALA98)は、ED経路を導入していない株(ALA97)と比較して、顕著に生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　[実施例6]
　シキミ酸生産コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるED経路導入効果の検証
　コリネバクテリウム　グルタミカムR株をベースとして構築したアラニン生産株SHI2株及びSHI3株[実施例1(表7)参照]を用い、増殖抑制条件下におけるアラニン生産性を検討した。評価菌株は、4%グルコース、50ng/L kanamycin、5ng/L chloramphenicol、20μg/mlフェニルアラニン、20μg/mlチロシン、20μg/mlトリプトファン及び10μg/ml p-アミノ安息香酸を加えた栄養培地を用いて好気条件で培養し、菌体を調製した。得られた菌体は、10g(乾燥菌体)/Lとなるように最少培地に懸濁し、グルコースを加えて生産反応を開始した。1000ml容量ジャーファーメンター(エイブル株式会社製、型式：BMJ1L)を用いて反応温度は33℃、通気量0.25L/min(air、1vvm)、溶存酸素濃度(DO)5%(大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として)の条件において反応を行い、pHは7.0を維持するようにアンモニア水溶液を適宜添加した。生産試験の結果を表12に示した。ED経路導入株(SHI3)は、ED経路を導入していない株(SHI2)と比較して、顕著に生産性が向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本開示は、例えば、有機酸、アミノ酸、及びアルコール等の有用な有機化合物の製造に有用である。

Claims (8)

  1. 　宿主のコリネ型細菌にエントナー－ドゥドロフ経路が導入された、コリネ型細菌の形質転換体。
  2. 　宿主のコリネ型細菌に、
    　グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、
    　６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、及び
    　２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入された、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　前記グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼが、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドを補酵素として利用可能な酵素である、請求項２に記載の形質転換体。
  4. 　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム　グルタミカムである、請求項１から請求項３のいずれかに記載の形質転換体。
  5. 　請求項１から請求項４のいずれかに記載の形質転換体を、増殖に必要な因子の少なくとも１つを除いた反応液中又は還元条件の反応液中で反応させる工程と、反応培地中の有機化合物を回収する工程とを含む、有機化合物の製造方法。
  6. 　請求項１から請求項４のいずれかに記載の形質転換体を用いて、反応液中で、グルコース、フルクトース、セロビオース、キシロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、デキストリン、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース及び可溶性澱粉からなる群より選ばれる糖類から有機化合物へ変換し、該反応液より有機化合物を回収することを含む、請求項５に記載の有機化合物の製造方法。
  7. 　前記有機化合物が、ピルビン酸を中間体とする化合物又はホスホエノールピルビン酸を中間体とする化合物である、請求項５又は請求項６に記載の有機化合物の製造方法。
  8. 　前記有機化合物が、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール、芳香族化合物及びビタミンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５から請求項７のいずれかに記載の有機化合物の製造方法。
PCT/JP2019/013368 2018-05-01 2019-03-27 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法 WO2019211958A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020517032A JP6991319B2 (ja) 2018-05-01 2019-03-27 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法
CN201980029017.0A CN112105716A (zh) 2018-05-01 2019-03-27 转化体以及使用其的有机化合物的制造方法
US17/051,832 US11459574B2 (en) 2018-05-01 2019-03-27 Transformant having Entner-Doudoroff pathway and production method for organic compound using same
EP19796243.4A EP3789480A4 (en) 2018-05-01 2019-03-27 TRANSFORMER AND METHOD FOR PRODUCTION OF ORGANIC COMPOUND USING THE SAME

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018088425 2018-05-01
JP2018-088425 2018-05-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019211958A1 true WO2019211958A1 (ja) 2019-11-07

Family

ID=68385922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/013368 WO2019211958A1 (ja) 2018-05-01 2019-03-27 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11459574B2 (ja)
EP (1) EP3789480A4 (ja)
JP (1) JP6991319B2 (ja)
CN (1) CN112105716A (ja)
WO (1) WO2019211958A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540396A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 天津大学 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09510360A (ja) 1994-03-22 1997-10-21 ウィットブレッド・パブリック・リミテッド・カンパニー アルコール産生酵母に用いる解糖経路の酵素をコードするｄｎａ
JP2003274988A (ja) * 2002-03-27 2003-09-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2006124440A (ja) 2004-10-27 2006-05-18 Kohjin Co Ltd 非結晶性ポリエステル樹脂の製造方法
US20100120105A1 (en) 2008-10-27 2010-05-13 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol
WO2011006136A2 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 Verdezyne, Inc. Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity
WO2012033112A1 (ja) 2010-09-08 2012-03-15 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2012063860A1 (ja) 2010-11-10 2012-05-18 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2012067174A1 (ja) 2010-11-18 2012-05-24 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2016027870A1 (ja) 2014-08-21 2016-02-25 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法
WO2017146241A1 (ja) 2016-02-26 2017-08-31 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－アミノ安息香酸又はその塩の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016093294A1 (ja) 2014-12-11 2017-09-14 東レ株式会社 アルコールの製造方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09510360A (ja) 1994-03-22 1997-10-21 ウィットブレッド・パブリック・リミテッド・カンパニー アルコール産生酵母に用いる解糖経路の酵素をコードするｄｎａ
JP2003274988A (ja) * 2002-03-27 2003-09-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP3932945B2 (ja) 2002-03-27 2007-06-20 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2006124440A (ja) 2004-10-27 2006-05-18 Kohjin Co Ltd 非結晶性ポリエステル樹脂の製造方法
US20100120105A1 (en) 2008-10-27 2010-05-13 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol
WO2011006136A2 (en) * 2009-07-09 2011-01-13 Verdezyne, Inc. Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity
WO2012033112A1 (ja) 2010-09-08 2012-03-15 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2012063860A1 (ja) 2010-11-10 2012-05-18 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2012067174A1 (ja) 2010-11-18 2012-05-24 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
WO2016027870A1 (ja) 2014-08-21 2016-02-25 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる有機化合物の製造方法
WO2017146241A1 (ja) 2016-02-26 2017-08-31 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－アミノ安息香酸又はその塩の製造方法

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", vol. 8, 1974, pages: 599
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 71, no. 6, June 2005 (2005-06-01), pages 3369 - 3372
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 78, no. 12, June 2012 (2012-06-01), pages 4447 - 4457
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 78, no. 3, February 2012 (2012-02-01), pages 865 - 875
APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 78, no. 12, June 2012 (2012-06-01), pages 4447 - 4457
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 81, no. 4, December 2008 (2008-12-01), pages 691 - 699
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 85, no. 1, November 2009 (2009-11-01), pages 105 - 115
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 97, no. 15, August 2013 (2013-08-01), pages 6693 - 6703
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 99, no. 11, June 2015 (2015-06-01), pages 4679 - 4689
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 99, no. 3, February 2015 (2015-02-01), pages 1165 - 1172
BIOTECHNOL BIOENG, vol. 110, no. 11, November 2013 (2013-11-01), pages 2938 - 48
FEBS LETT, vol. 586, no. 23, 30 November 2012 (2012-11-30), pages 4228 - 4232
J MOL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 8, no. 4, 2004, pages 243 - 254
MICROBIOLOGY, vol. 161, no. 2, February 2015 (2015-02-01), pages 254 - 263
See also references of EP3789480A4
TSUGE, Y. ET AL.: "Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for hyperproduction of polymer-grade L- and D-lactic acid", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 103, no. 8, 15 March 2019 (2019-03-15), pages 3381 - 3391, XP036750416, ISSN: 0175-7598, DOI: 10.1007/s00253-019-09737-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112105716A (zh) 2020-12-18
JPWO2019211958A1 (ja) 2020-12-10
JP6991319B2 (ja) 2022-02-15
EP3789480A1 (en) 2021-03-10
US20210054386A1 (en) 2021-02-25
US11459574B2 (en) 2022-10-04
EP3789480A4 (en) 2022-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rogers et al. Zymomonas mobilis for fuel ethanol and higher value products
US9297026B2 (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
Zhang et al. Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli
CA2737428C (en) Bacterium capable of producing lactic acid, and method for producing lactic acid
KR102323473B1 (ko) 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시벤조산 또는 그 염의 제조 방법
KR102305413B1 (ko) 고활성 변이형 효소를 고발현시킨 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시 벤조산 또는 그 염의 제조 방법
WO2009154122A1 (ja) Ｄ－キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体
Gopinath et al. Corynebacterium glutamicum as a potent biocatalyst for the bioconversion of pentose sugars to value-added products
EP0943687A2 (en) Method of producing L-serine by fermentation
EP2336295B1 (en) Method for producing lactic acid from plant-derived raw material, and lactic-acid-producing bacterium
JPWO2010032698A6 (ja) 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌
JP6991319B2 (ja) 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法
WO2020090017A1 (ja) １，３－プロパンジオールの製造方法
WO2023038066A1 (ja) 芳香族化合物の製造方法
JP7376041B2 (ja) 形質転換体及びそれを用いる１，３－ブタンジオールの製造方法
US20230295671A1 (en) Enzymes and methods for production of malonic acid and derivatives thereof
RU2727666C2 (ru) Путресцин-продуцирующий микроорганизм и способ получения путресцина с использованием указанного микроорганизма
WO2019211937A1 (ja) コリネ型細菌の形質転換体およびそれを用いる有用化合物の製造方法
KR20230147948A (ko) 목질계 바이오매스 공정을 위한 형질전환된 비브리오속 dhg 균주
KR20150013092A (ko) 숙신산 생산능이 향상된 박테리아 세포 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19796243

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020517032

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019796243

Country of ref document: EP

Effective date: 20201201