WO2017146241A1 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－アミノ安息香酸又はその塩の製造方法 - Google Patents

コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－アミノ安息香酸又はその塩の製造方法 Download PDF

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乾将行
平賀和三
須田雅子
久保田健
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公益財団法人地球環境産業技術研究機構
住友ベークライト株式会社
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    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to coryneform which has been subjected to a specific genetic manipulation in order to confer the ability to produce 4-aminobenzoic acid (also referred to as para-aminobenzoic acid; hereinafter sometimes abbreviated as “4-ABA”) or a salt thereof.
  • 4-aminobenzoic acid also referred to as para-aminobenzoic acid; hereinafter sometimes abbreviated as “4-ABA”
  • the present invention relates to a transformant of type bacteria and an efficient method for producing 4-ABA using the transformant.
  • 4-ABA has an amino group and a carboxyl group in the molecule and is expected to be used as a polymer raw material. It is already widely used as a raw material for ultraviolet absorbers and pharmaceuticals.
  • 4-ABA has been synthesized through a multi-step reaction using petroleum as a raw material. That is, it is a route for synthesizing paranitrotoluene from petroleum-derived toluene and synthesizing 4-ABA via paranitrobenzoic acid or paratoluidine. These reactions require strong energy and high temperature conditions, and therefore require a great deal of energy. Therefore, the 4-ABA production method using biorefinery technology, which is an environmentally harmonious process, is strongly desired from the viewpoints of dependence on defossil resources and reduction of carbon dioxide emissions.
  • Paraaminobenzoate synthetase component II releases the ammonia group from glutamine
  • paraaminobenzoate synthetase component I (PabB) synthesizes 4-amino-4-deoxychorismate from the ammonia group and chorismate.
  • 4-amino-4-deoxychorismate is converted to 4-ABA by 4-amino-4-deoxychorismate lyase (PabC).
  • E. coli has pabA, pabB, and pabC genes at different positions on the chromosome, but there are microorganisms that have pabAB as a two-component protein and microorganisms that have pabBC.
  • Non-Patent Document 1 teaches that 4-ABA is produced using a transformant in which an abz1 gene (a homologous gene of pabAB) is overexpressed in yeast.
  • the 4-ABA productivity of this transformant is extremely low at 250 ⁇ M in 160 hours, which is not practical.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 report that 4-ABA is produced using a transformant in which pabAB derived from Corynebacterium efficiens is introduced into the chromosome of Escherichia coli.
  • 4-ABA productivity is as low as 35 mM (4.8 g / L) in 48 hours, which is insufficient for industrial production.
  • Patent Document 1 also reports that 4-ABA is produced using a transformant in which pabAB derived from Saccharopolyspora erythrea is introduced into Streptomyces lividans. It was 1 mM or less per day. Further, Patent Document 2 describes that pabA, pabB, and pabC can be overexpressed in Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger, Synecocystis, or Escherichia coli, thereby increasing the conversion of chorismate to 4-ABA. It describes what can be done. However, Patent Document 2 only describes the possibility of producing 4-ABA, and does not describe an example of producing 4-ABA.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of efficiently producing 4-ABA or a salt thereof from a saccharide as a raw material, and a method for efficiently producing 4-ABA or a salt thereof using the microorganism.
  • Corynebacterium glutamicum has a very strong 4-ABA resistance and is suitable for the production of 4-ABA or a salt thereof.
  • a coryneform bacterium that encodes a gene encoding 4-amino-4-deoxychorismate lyase (pabC), a gene encoding paraaminobenzoate synthetase component I (pabB), and paraaminobenzoate synthetase component II
  • the transformant introduced with the gene (pabA) capable of efficiently producing 4-ABA or a salt thereof from saccharides.
  • a transformant obtained by introducing a gene (pabB) encoding paraaminobenzoate synthetase component I into a coryneform bacterium can be efficiently transformed from saccharides into 4-ABA or a salt thereof in a medium containing ammonia or an ammonium salt. Can produce.
  • These transformants have particularly high production efficiency of 4-ABA when they are reacted under aerobic and substantially non-proliferating conditions.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following transformant and a method for producing 4-ABA or a salt thereof.
  • Item 1. Paraaminobenzoate synthetase A transformant having the ability to produce paraaminobenzoic acid, in which a gene encoding an enzyme having component I activity is introduced into a host coryneform bacterium.
  • Item 2. Item 2. The transformant according to Item 1, wherein the gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component I activity is pabB.
  • pabAB is Corynebacterium callunae, Conynebacterium efficiens, Conynebacterium casei, Conynebacterium glutamicum, Conynebacterium ureicelerivorans, Corynebacterium argentoratense, Conynebacterium terpenotabidum, Neurospora crassa, Rhodococcus opacus, or Rhodococcus erythropolis 10.
  • pabC is a combination of Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Saccharophagus degradans, Shewanella woodyi, Sherobella woodyi, Arthrobivorana phenanthrenibrans variabilis, Azotobacter vinelandii, Ochrobactrum anthropi, Clostridium beijerinckii, Xenorhabdus bovienii, Bacillus cus Synechococcus sp.), Bacteroides thraiotaomicron, or ferri Eggplant Barearika (Ferrimonas. Balearica) is a gene from the transformant according to claim 6 or 8. Item 12. Item 9.
  • a method for producing 4-aminobenzoic acid or a salt thereof comprising the step of culturing the transformant according to any one of items 1 to 19 in a reaction solution containing a saccharide to produce 4-aminobenzoic acid or a salt thereof. .
  • a transformant obtained by introducing a gene encoding paraaminobenzoate synthetase component I, a gene encoding paraaminobenzoate synthetase component II, and a gene encoding 4-amino-4-deoxychorismate lyase into coryneform bacterium 4-ABA can be produced from sugars such as glucose in high concentration and high yield.
  • 4-ABA is produced by culturing a transformant in a culture solution containing ammonia or an ammonium salt, a gene encoding paraaminobenzoate synthetase component II may not be introduced.
  • 4-ABA can be produced in a yield. Therefore, according to the present invention, 4-ABA useful as a raw material for polymers, pharmaceuticals, ultraviolet absorbers and the like can be produced at low cost and in large quantities with reduced environmental load.
  • coryneform bacteria it is important to use a coryneform bacterium as a host in terms of production efficiency of 4-ABA or a salt thereof. Therefore, in the present invention, it can be said that the combination of the host coryneform bacterium and the specific transgene described above is important.
  • microorganisms are inhibited from growing due to the cytotoxicity of aromatic compounds such as 4-ABA, and it has been difficult to produce 4-ABA using microorganisms.
  • coryneform bacteria have a very strong resistance to 4-ABA, a high concentration of 4-ABA or a salt thereof can be produced using the transformant of the present invention. Coryneform bacteria, unlike E.
  • FIG. 4 is a growth curve of various microorganisms including Corynebacterium glutencam in the presence of paraaminobenzoic acid. It is a figure which shows the time-dependent change of the glucose concentration in the reaction liquid of a Corynebacterium glutamicum wild strain in the presence of paraaminobenzoic acid. It is a figure which shows the time-dependent change of the para amino benzoic acid production from glucose by the Corynebacterium glutamicum transformant which introduce
  • coryneform bacteria are used as a host.
  • Coryneform bacteria are a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), under normal aerobic conditions. If it proliferates, it will not be specifically limited. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, and the like. Among the coryneform bacteria, the genus Corynebacterium is preferable.
  • Corynebacterium glutamicum is preferable because it is safe and has high 4-HBA productivity.
  • Corynebacterium glutamicum R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 Strains, ATCC13746 strain, ATCC13761 strain, ATCC14020 strain, ATCC31831 strain, MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) and the like. These strains are deposited internationally under the Budapest Treaty and are publicly available. Among these, R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable.
  • coryneforms such as Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium, etc.
  • the name of the bacterium is the same as Corynebacterium glutamicum [Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum” DSM 20411, “Brevibacterium lactofermentum” DSM 20412 and DSM 1412 , and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260.
  • Brevibacterium ammoniagenes for example, ATCC6872 strain.
  • Arthrobacter examples include Arthrobacter globiformis (for example, ATCC 8010 strain, ATCC 4336 strain, ATCC 21056 strain, ATCC 31250 strain, ATCC 31738 strain, ATCC 35698 strain) and the like.
  • examples of the genus Mycobacterium include Mycobacterium bovis (for example, ATCC19210 strain, ATCC27289 strain).
  • Examples of the genus Micrococcus include Micrococcus freudenreichii (for example, No. 239 strain (FERM P-13221)), Micrococcus leuteus (for example, No.
  • Examples include Micrococcus ureae (for example, IAM1010 strain), Micrococcus roseus (for example, IFO3764 strain), and the like. These shares have been deposited internationally under the Budapest Treaty and are publicly available.
  • the coryneform bacterium may be a mutant strain or an artificial gene recombinant.
  • disrupted strains of genes such as lactate (lactate dehydrogenase: LDH), phosphoenolpyruvate carboxylase, malate dehydrogenase, and the like can be mentioned.
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase: LDH
  • phosphoenolpyruvate carboxylase phosphoenolpyruvate carboxylase
  • malate dehydrogenase and the like
  • a disrupted strain of lactate dehydrogenase gene is preferable. In this gene-disrupted strain, the metabolic pathway from pyruvate to lactic acid is blocked because the lactate dehydrogenase gene is disrupted.
  • a disrupted strain of Corynebacterium glutamicum particularly a lactate dehydrogenase gene of R (FERM BP-18976) strain is preferable.
  • a gene-disrupted strain can be prepared according to a conventional method by genetic engineering techniques.
  • WO2005 / 010182A1 describes a lactate dehydrogenase-disrupting strain and a method for producing the same.
  • coryneform bacteria have extremely high resistance to 4-ABA compared to other bacteria.
  • coryneform bacteria are suitable for 4-ABA production by the method of the present invention.
  • a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component I activity, a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component II activity, and 4-amino A gene encoding an enzyme having -4-deoxychorismate lyase activity is introduced.
  • Paraaminobenzoate synthetase Component I catalyzes the reaction to produce 4-amino-4-deoxychorismate from chorismate and ammonia.
  • Paraaminobenzoate synthetase component II also catalyzes the reaction of glutamine and ammonia from glutamine.
  • 4-amino-4-deoxychorismate lyase catalyzes a reaction for producing 4-aminobenzoic acid (4-ABA or a salt thereof) and pyruvic acid from 4-amino-4-deoxychorismate. Therefore, by introducing the above three genes into coryneform bacteria, a transformant capable of efficiently producing 4-ABA or a salt thereof from chorismate is obtained.
  • the transformant according to another embodiment of the present invention is a transformant obtained by introducing a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component I activity into coryneform bacteria.
  • a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component I activity a gene encoding an enzyme having 4-amino-4-deoxychorismate lyase activity can also be introduced.
  • a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoate synthetase component II activity can also be introduced.
  • a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoic acid synthase component I activity includes pabB, a gene encoding an enzyme having paraaminobenzoic acid synthetase component II activity includes pabA, and 4-amino-4-deoxycholine.
  • An example of a gene encoding an enzyme having a succinate lyase activity is pabC.
  • the two-component enzymes include paraaminobenzoate synthetase component I activity and paraaminobenzoate synthetase component II activity (PabAB), paraaminobenzoate synthetase component I activity and 4-amino-4-deoxychorismate lyase activity
  • PabBC paraaminobenzoate synthetase component II activity
  • genes or gene combinations to be introduced into coryneform bacteria include the following. (i) pabB (ii) pabB and pabC (iii) pabBC (iv) pabB and pabA (v) pabAB (vi) pabB, pabA and pabC (vii) pabAB and pabC (viii) pabA and pabBC (ix) pabAB and pabBC
  • pabB includes corynebacterium bacteria (especially Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium resistens), Corynebacterium falsenii), and Bacillus bacteria (especially Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus thuringiensis, Escherichia bacteria (especially Escherichia coli), Escherichia ferguson bacteria, Escherichia ferguson bacteria In particular, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans), Salmonella bacteria (especially monkeys) Monella enterica (Salmonella enterica), Salmonella bongori), Pseudomonas bacteria (especially Pseudomonas aeruginosa), Pseudomonas putida, Pseu
  • Enterobacter sp. Enterobacter cloacae
  • Mycobacterium smegmatis Mycobacterium smegmatis
  • Klebsiella pneumoniae Xenorhabdus bovienii
  • Pantoea ananatis Pantoea ananatis
  • Providencia stuartii Zotobacter vinelandii (Azotobacter vinelandii)
  • Acinetobacter baumannii Shewanella woodyi
  • Zymomonas mobilis Polyclostriporias .
  • genes of Bacillus subtilis, Escherichia coli, Streptomyces sericolor, Enterobacter cloacae, Mycobacterium smegmatis, Klebsiella pneumoniae, Xenohabudas bovieni, Pantoea ananatis, Providencia stuati are preferred, Escherichia coli, More preferred is the Stuati gene.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 133, , SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 147 SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO:
  • Escherichia coli Escherichia fergusonii, Saccharophagus degradans, Shewanella woodyi, Shewanella woodyi, Arthrobacter ren Anabaena variabilis, Azotobacter vinelandii, Ochrobactrum anthropi, Clostridium beijerinckiierXenorhabdus boviscu (Synechococcus sp.), Bacteroides Thraiotaomicron (Bacteroides) thetaiotaomicron), or genes Ferimonasu Barearika (Ferrimonas balearica) and the like.
  • genes of xenorhabudas-bobieni, anabaena-barrierbilis, bacillus-pseudofilms, escherichia coli, oclobactrum-anthropi are preferable, and genes of xenorhabudas-bobieni, anabaena-barrier-bilis, escherichia coli are more preferable.
  • pabA includes Escherichia bacterium (especially Escherichia coli, Escherichia sonfergusonii), Salmonella bacterium (especially Salmonella enterica ⁇ ⁇ , Salmonella almonella monmon
  • Escherichia bacterium especially Escherichia coli, Escherichia sonfergusonii
  • Salmonella bacterium especially Salmonella enterica ⁇ ⁇ , Salmonella almonella monmon
  • Enterobacter bacteria especially Enterobacter cloacae
  • Klebsiella bacterium especially Klebsiella pneumonia
  • bacteria belonging to the genus Providencia especially Providencia stuartii
  • bacteria belonging to the genus Shewanella especially Shewanella Woody anella woodyi)
  • Zymomonas bacteria especially Zymo
  • genes of Escherichia coli, Providencia stuati, Enterobacter cloacae, Pantoea anaanatis are preferable, and genes of Enterobacter cloacae and Escherichia coli are more preferable.
  • pabBC includes Ralstonia (preferably Ralstonia eutropha), Capriavidas (preferably Capriavidus taiwanensis), Chromohalobacter (preferably Chromohalobacter), Pandrea (preferably Pandoraea pnomenusa), Lactococcus (preferably Lactococcus lactis), or Streptococcus pneumoniae (preferably Streptococcus pneumoniae), Streptococcus phil Streptococcus phil ) Gene.
  • Ralstonia preferably Ralstonia eutropha
  • Capriavidas preferably Capriavidus taiwanensis
  • Chromohalobacter preferably Chromohalobacter
  • Pandrea preferably Pandoraea pnomenusa
  • Lactococcus preferably Lactococcus lactis
  • Streptococcus pneumoniae preferably Streptococcus pneumoniae
  • Streptococcus phil Streptococcus phil Streptococc
  • thermophilus pabBC As pabBC of Lastonia Eutropha, Capriavidus Thaiwanensis, Chromohalobacter Salixigenes, Pandrea Nomenusa, Lactococcus lactis, Streptococcus Pneumoniae, and Streptococcus ⁇ thermophilus pabBC are SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, Examples include those consisting of the nucleotide sequences shown in No. 166 and SEQ ID No. 167.
  • pabAB includes corynebacteria (especially Conynebacterium callunae), Corynebacterium efficiens, Conynebacterium casei, Conynebacterium glutamicum, Corynebacterium, Conynebacterium ureicelerivorans, Conynebacterium argentoratense, Conynebacterium terpenotabidum), Neurospora bacterium (especially Neurospora crassa), or Rhodococcus Examples include genes of bacteria (particularly, Rhodococcus opacus or Rodococcus erythropolis).
  • genes of Corynebacterium carnae, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium casei, Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus opax, and Neurospora crassa are preferable, and genes of Corynebacterium carnae and Corynebacterium efficiens are more preferable.
  • arrangement is mentioned.
  • pabB The analog of pabB will be described. It is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to any one of SEQ ID NOS: 1 and 132 to 161, and paraaminobenzoate synthetase component I DNA encoding a polypeptide having activity can also be used.
  • pabC The analog of pabC will be described. It is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to any one of SEQ ID NOs: 2 to 16, and 4-amino-4-deoxy coli. DNA encoding a polypeptide having succinate lyase activity can also be used.
  • pabA The analog of pabA is described. It is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 17 and 168 to 202, and paraaminobenzoate synthetase component II DNA encoding a polypeptide having activity can also be used.
  • pabBC The analog of pabBC will be described. It is DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to any one of SEQ ID NOS: 129 and 162 to 167, and paraaminobenzoate synthetase component I DNA encoding a polypeptide having activity and 4-amino-4-deoxychorismate lyase activity can also be used.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to any of the base sequences of SEQ ID NOs: 18 to 27, and paraaminobenzoate synthetase component I activity and DNA encoding a polypeptide having paraaminobenzoate synthetase component II activity can also be used.
  • stringent conditions refers to hybridization in a hybridization solution having a salt concentration of 6 ⁇ SSC at a temperature of 50 to 60 ° C. for 16 hours, and in a solution having a salt concentration of 0.1 ⁇ SSC. Refers to conditions for cleaning.
  • the analog of pabB is described as DNA comprising a nucleotide sequence having identity of 90% or more, particularly 95% or more, especially 98% or more with any one of SEQ ID NOS: 1, 132 to 161,
  • DNA encoding a polypeptide having paraaminobenzoate synthetase component I activity can also be used.
  • pabC analogs it is a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more, particularly 95% or more, particularly 98% or more identity with any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 to 16, and 4-amino
  • a DNA encoding a polypeptide having -4-deoxychorismate lyase activity can also be used.
  • the pabA analog is a DNA having a nucleotide sequence of 90% or more, particularly 95% or more, particularly 98% or more of any one of SEQ ID NOs: 17 and 168 to 202, and paraamino.
  • DNA encoding a polypeptide having benzoate synthetase component II activity can also be used.
  • DNA having a nucleotide sequence of 90% or more, particularly 95% or more, especially 98% or more of any one of SEQ ID NOS: 129 and 162 to 167, and paraamino DNA encoding a polypeptide having benzoate synthetase component I activity and 4-amino-4-deoxychorismate lyase activity can also be used.
  • pabAB analogues it is a DNA having a nucleotide sequence of 90% or more, particularly 95% or more, especially 98% or more of any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 to 27, and paraaminobenzoic acid.
  • DNA encoding a polypeptide having synthetase component I activity and paraaminobenzoate synthetase component II activity can also be used.
  • the identity of the base sequence is a value calculated by GENETYX® ver. 8 (manufactured by GENETYX® GENETICS).
  • Paraaminobenzoate synthetase Component I activity can be measured as follows. 50 mM triethanolamine (pH 8.5), 5% glycerol, 5 mM dithiothreitol (DTT), 5 mM MgCl 2 , 250 mM NH 4 Cl, 0.1 mM chorismate Ba, PabB (20U) in a total volume of 3 ml React. After starting the reaction at 33 ° C, sample 0.5 ml every 2 minutes and stop by adding 0.1 ml of 1N HCl.
  • ADC 4-aminodeoxychorismate
  • Paraaminobenzoate synthetase component II activity can be measured as follows. The reaction is performed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5% glycerol, 5 mM DTT, 5 mM MgCl 2 , 250 mM NH 4 Cl, 10 mM L-glutamine, PabA (20 U) in a total volume of 3 ml. After starting the reaction at 33 ° C, sample 0.5 ml every 2 minutes and stop by adding 0.1 ml of 1N HCl.
  • the resulting L-glutamic acid was separated by HPLC (Prominence) manufactured by Shimadzu Corporation and the column was Shim-Pack Amino-Na (6.0 x 100 mm, manufactured by Shimadzu Corporation) after separation of L-glutamic acid, a reaction product. Then, label with O-phthalaldehyde, detect fluorescence, quantify, and calculate the enzyme activity from the initial rate. Moreover, the following method is used when measuring by coupling with PabB.
  • the resulting ADC was analyzed using Shimadzu HPLC (Prominence), and the column was separated using Cosmosil packed column 5C18-AR-II (4.6 x 250 mm, manufactured by Nacalai Tesque) and detected at a wavelength of 270 nm. Then, the enzyme activity is calculated from the initial velocity.
  • the 4-amino-4-deoxychorismate lyase activity is measured as follows using a coupling reaction with PabB. That is, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5% glycerol, 5 mM DTT, 5 mM MgCl 2 , 250 mM NH 4 Cl, 0.1 mM chorismate Ba, PabB (200U), PabC (20U) React with 3 ml. After starting the reaction at 33 ° C, sample 0.5 ml every 2 minutes and stop by adding 0.1 ml of 1N HCl.
  • the resulting paraaminobenzoic acid was separated by HPLC (Prominence) manufactured by Shimadzu Corporation, and the column was separated by 254 nm using Cosmosil packed column 5C18-AR-II (4.6 x 250 mm, manufactured by Nacalai Tesque).
  • the enzyme activity is calculated from the initial velocity.
  • An analog of a DNA comprising any one of the nucleotide sequences 1 to 27, 129 and 132 to 202 can be obtained by, for example, PCR or hybridization using primers or probes designed according to a conventional method based on these nucleotide sequences. You can select from a DNA library.
  • the host coryneform bacterium with enhanced DAHP synthase activity is preferably one in which the activity of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase is enhanced compared to the wild-type coryneform bacterium.
  • DAHP synthase is an enzyme that produces DAHP, which is an initial metabolite of an aromatic compound biosynthesis common pathway, from erythrose-4-phosphate (E4P) and phosphoenolpyruvate (PEP).
  • DAHP synthase activity increases the expression level of this gene by introducing the DAHP synthase gene, or introducing a mutation into the regulatory sequence and gene coding region of the DAHP synthase gene on the chromosome of a coryneform bacterium, or by replacing the gene. It can be enhanced by increasing the activity of the product. Among these, it is simple and efficient to enhance DAHP synthase activity by introducing a DAHP synthase gene.
  • the origin of the DAHP synthase gene to be introduced is not particularly limited, but the DAHP synthase gene of Corynebacterium is preferable in terms of good 4-ABA production efficiency.
  • Examples of the Corynebacterium DAHP synthase gene include the Corynebacterium glutamicum DAHP synthase gene aroG (SEQ ID NO: 203).
  • a gene derived from Escherichia coli, particularly a gene derived from Escherichia coli is also preferable.
  • DNA ( aroGS180F ) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 211 is even more preferable.
  • This gene is a gene in which the mutation (S180F) that mutates the 180th serine of the amino acid sequence encoded by this gene to phenylalanine is introduced into the aroG gene, which is one of the DAHP synthase genes derived from Escherichia coli.
  • the present inventors have found through comparative studies that gene products exhibit resistance to feedback inhibition by aromatic compounds containing aromatic amino acids and high DAHP synthase activity (unpublished).
  • DAHP 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate
  • the transformant of the present invention is preferably one obtained by introducing a gene encoding chorismate synthase into a host coryneform bacterium.
  • Chorismate synthase is an enzyme that catalyzes the conversion of 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate to chorismate.
  • the origin of the introduced chorismate synthase gene is not particularly limited, but the chorismate synthase gene of Corynebacterium bacteria, particularly Corynebacterium glutamicum, is preferred from the viewpoint of high production efficiency of 4-ABA.
  • AroC for example, SEQ ID NO: 204
  • SEQ ID NO: 204 is known as a chorismate synthase gene of Corynebacterium glutamicum.
  • the chorismate synthase activity is measured according to a known method (Kitzing, K. et al., Spectroscopic and Kinetic Characterization of the Bifunctional Chorismate Synthase from Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 276: 42658-42666 (2001)). That is, at 37 ° C, it consists of a crude enzyme solution of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.6), 4 mM MgSO4, 10 mM glutamine, 30 mM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ammonium sulfate, 1 m DTT, 0.01 mM FMN, 0.08 mM EPSP, anthranilate synthase.
  • the reaction is started by adding the test enzyme solution to the reaction mixture, and the fluorescence of 390 nm indicating the production of anthranilic acid generated by the coupling reaction with anthranilate synthase is F-2500 Fluorescence Spectrophotometer (manufactured by Hitachi)
  • the enzyme activity is calculated from the initial rate. Reduction of FMN is carried out by adding 1 mM mM NADPH. If activity is detected, it is determined that there is chorismate synthase activity.
  • the transformant of the present invention is preferably obtained by introducing a gene encoding shikimate kinase into a host coryneform bacterium.
  • Shikimate kinase is an enzyme that catalyzes the conversion of shikimate to shikimate-3-phosphate.
  • the origin of the shikimate kinase gene to be introduced is not particularly limited, but the shikimate kinase gene of Corynebacterium, particularly Corynebacterium glutamicum, is preferred from the viewpoint of high production efficiency of 4-ABA.
  • As a shikimate kinase gene of Corynebacterium glutamicum, aroK (for example, SEQ ID NO: 205) is known.
  • DNA consisting of a nucleotide sequence having 90% or more, particularly 95% or more, particularly 98% or more of SEQ ID NO: 205, and a DNA encoding a polypeptide having shikimate kinase activity, or complementary to SEQ ID NO: 205 It is also possible to use DNA encoding a polypeptide having a shikimate kinase activity, which is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a basic nucleotide sequence.
  • Shikimate kinase activity is measured according to a known method (Cheng, WC. Et al., Structures of Helicobacter pylori shikimate kinase reveal a selective inhibitor-induced-fit mechanism. PLoS ONE. 7: e33481 (2012)).
  • the transformant of the present invention is preferably one in which a gene encoding 3-dehydroquinic acid (DHQ) synthase is further introduced into the host coryneform bacterium.
  • DHQ 3-dehydroquinic acid
  • Dehydroquinic acid synthase is an enzyme that catalyzes the conversion of DAHP to 3-dehydroquinic acid.
  • the origin of the 3-dehydroquinate synthase gene to be introduced is not particularly limited, but the 3-dehydroquinate synthase gene of Corynebacterium, particularly Corynebacterium glutamicum, is preferable from the viewpoint of high production efficiency of 4-ABA.
  • AroB for example, SEQ ID NO: 206 is known as the 3-dehydroquinate synthase gene of Corynebacterium glutamicum.
  • DNA consisting of a nucleotide sequence having 90% or more, particularly 95% or more, particularly 98% or more of SEQ ID NO: 206, and a DNA encoding a polypeptide having dehydroquinate synthase activity, or complementary to SEQ ID NO: 206 It is also possible to use DNA encoding a polypeptide having a dehydroquinate synthase activity that hybridizes with a DNA comprising a basic sequence under stringent conditions.
  • Dehydroquinate synthase activity is determined by a known method (Meudi, S. et al., Dehydroquinate synthase from Escherichia coli, and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate. Methods. Enzymol. 142: 306-314 (1987)).
  • the transgene construct the above-described vectors for transformants were amplified by PCR may be cloned into a suitable vector capable of amplifying in a coryneform bacterium.
  • the plasmid vector may be any plasmid vector as long as it contains a gene that controls the autonomous replication function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include pAM330 derived from Brevibacterium lactofermentum 2256 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-67699), [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] and [Yamaguchi, R.
  • pCG4 derived from Corynebacterium glutamicum T250 [JP-A-57 -183799], [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 (JP 62-166890), pEK0, pEC5, pEKEx1 [Eikmanns, BJ et al., A family of Corynebacterium glutamicum / Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing.
  • Preferred promoters include the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A gene (gapA) promoter PgapA, the malate dehydrogenase gene (mdh) promoter Pmdh, and the lactate dehydrogenase A gene (ldhA) promoter PldhA derived from Corynebacterium glutamicum R. Among them, PgapA is preferable.
  • Preferred terminators include the rrnB T1T2 terminator of the E. coli rRNA operon, the trpA terminator of E. coli, the trp terminator of Brevibacterium lactofermentum, and the rrnB T1T2 terminator is preferred.
  • Transformation transformation methods can be used without limitation any known methods.
  • known methods include calcium chloride / rubidium chloride method, calcium phosphate method, DEAE-dextran mediated transfection, and electric pulse method.
  • the electric pulse method is suitable for coryneform bacteria, and the electric pulse method can be performed by a known method (Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)).
  • a natural medium or a synthetic medium usually containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances can be used.
  • carbon sources examples include glucose, fructose, sucrose, mannose, maltose, mannitol, xylose, arabinose, galactose, starch, molasses, sorbitol, glycerin and other sugars or sugar alcohols; acetic acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid Or organic acids, such as gluconic acid; Alcohol, such as ethanol and a propanol, is mentioned.
  • a carbon source can be used individually by 1 type, or may mix 2 or more types. The concentration of these carbon sources in the medium is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • the nitrogen source examples include inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, and potassium nitrate. Further, corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can be used. As the nitrogen source, one kind may be used alone, or two or more kinds may be mixed and used.
  • the nitrogen source concentration in the medium is usually 10 (w / v%), although it varies depending on the nitrogen compound used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. These inorganic salts may be used alone or in a combination of two or more. The concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.1 to 1 (w / v%).
  • the nutrient substance examples include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, or extracts of animal or plant or microbial cells and their degradation products. However, it is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-9.
  • a preferred microorganism culture medium is A medium (Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)).
  • BT medium [Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)].
  • the culture temperature may be about 15 to 45 ° C.
  • the culture time may be about 1 to 7 days.
  • saccharides examples include monosaccharides such as fructose, mannose, arabinose, xylose and galactose; disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose and xylobiose; polysaccharides such as dextrin and soluble starch Can be mentioned.
  • molasses can also be used as a raw material containing these raw material compounds.
  • non-edible agricultural waste such as straw (rice straw, barley straw, wheat straw, rye straw, oat straw), bagasse, corn stover, energy crops such as switchgrass, napiergrass and miscanthus, and wood chips
  • a saccharified solution containing a plurality of sugars such as glucose obtained by saccharifying used paper with a saccharifying enzyme or the like can also be used.
  • the transformant Prior to the culture in a medium containing microbial growth saccharides, that is, the reaction, the transformant is preferably grown under aerobic conditions at a temperature of about 25 to 38 ° C. for about 12 to 48 hours.
  • Medium used for the aerobic cultivation of transformants prior to culture medium reaction can be used natural or synthetic medium containing carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and other nutrients, and the like.
  • carbon sources saccharides (monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose; disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose, trehalose; polysaccharides such as starch; molasses etc.), Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerin; organic acids such as acetic acid, citric fermentation, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, and gluconic acid; alcohols such as ethanol and propanol; hydrocarbons such as normal paraffin Can also be used.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the medium varies depending on the nitrogen compound to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • One inorganic salt can be used alone, or two or more inorganic salts can be mixed and used.
  • the concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • the nutritional substance examples include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, animal and plant or microbial cell extracts, and their degradation products.
  • concentration of the nutrient substance in the medium varies depending on the nutrient substance used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-9.
  • a medium (Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182- 196 (2004)), BT medium (Omumasaba, CA et al., YneCorynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)) Etc.
  • the saccharide concentration may be used within the above range.
  • a culture solution or a reaction solution a natural reaction solution or a synthetic reaction solution containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like can be used.
  • the carbon source the saccharide described above or molasses or saccharified solution containing the saccharide may be used.
  • a carbon source in addition to sugars, sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerin; organic acids such as acetic acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, gluconic acid; ethanol, propanol, etc.
  • Non-alcoholic; hydrocarbons such as normal paraffin can also be used.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of the saccharide as the raw material compound in the reaction solution is preferably about 1 to 20 (w / v%), more preferably about 2 to 10 (w / v%), and about 2 to 5 (w / v%). Is even more preferred. Further, the concentration of the total carbon source including the saccharide as a raw material may be about 2 to 5 (w / v%).
  • inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the reaction solution varies depending on the nitrogen compound to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • One inorganic salt can be used alone, or two or more inorganic salts can be mixed and used.
  • the concentration of the inorganic salt in the reaction solution varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the reaction solution is preferably about 5-9.
  • reaction solution for coryneform bacteria include the BT medium described above.
  • saccharide concentration may be used within the above range.
  • the culture temperature or reaction temperature that is, the survival temperature of the transformant is preferably about 20 to 50 ° C., more preferably about 25 to 47 ° C. If it is the said temperature range, 4-HBA can be manufactured efficiently.
  • the culture or reaction time is preferably about 1 to 7 days, more preferably about 1 to 3 days.
  • the culture may be any of batch type, fed-batch type, and continuous type. Among these, the batch type is preferable.
  • the reaction may be carried out under aerobic conditions or under reducing conditions.
  • the transformant of the present invention itself has a higher 4-ABA production capacity under aerobic conditions. However, since the transformant grows under an aerobic condition, the raw material compound is consumed for the growth, and the 4-ABA production efficiency decreases accordingly.
  • Not proliferating in the present invention includes substantially not proliferating or hardly proliferating.
  • the growth of transformants can be avoided or suppressed by using a reaction solution that lacks or restricts one or more of vitamins such as biotin and thiamine, which are essential compounds for the growth of microorganisms, and nitrogen sources. .
  • the reduction condition is defined by the oxidation-reduction potential of the reaction solution.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction solution is preferably about ⁇ 200 mV to ⁇ 500 mV, more preferably about ⁇ 150 mV to ⁇ 500 mV.
  • the reduction state of the reaction solution can be estimated easily with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state), but using a redox potentiometer (for example, BROADLEY JAMES, ORP Electrodes) Can be measured.
  • a known method can be used without limitation.
  • an aqueous solution for a reaction solution may be used as a liquid medium for the reaction solution instead of distilled water.
  • an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions can be obtained by removing dissolved gas by heat treatment or decompression treatment of distilled water or the like.
  • distilled water or the like is treated for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less.
  • the dissolved gas, particularly dissolved oxygen can be removed to prepare an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions.
  • an appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.
  • An appropriate combination of these methods is also an effective method for preparing an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions.
  • the reaction system is made of an inert gas such as nitrogen gas or carbon dioxide gas.
  • the method of enclosing is mentioned.
  • a pH maintenance adjusting solution of the reaction system or various nutrient solution in such a case, it is effective to remove oxygen from the added solution in advance.
  • 4-ABA or a salt thereof is produced in the culture solution or reaction solution.
  • the salt of 4-ABA varies depending on the medium or the components of the reaction solution, and examples thereof include alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.) and alkaline earth metal salts (magnesium salt, calcium salt, etc.).
  • Corynebacterium glutamicum R strain was applied to the A agar medium containing 4% glucose and allowed to stand at 33 ° C. for 15 hours in the dark.
  • One platinum loop of the Corynebacterium glutamicum grown on the above plate was inoculated into a test tube containing 10 ml of the A liquid medium containing 4% glucose, and aerobically shaken at 33 ° C for 15 hours. Culture was performed.
  • Escherichia coli grown on the plate was inoculated into LB liquid medium [1% polypeptone, 0.5% yeast extract, and 0.5% sodium chloride] and cultured under aerobic shaking at 37 ° C. for 13 hours.
  • aerobically shaking culture at 37 ° C. Proliferation of cells was carried out by measuring the OD 610. Streptomyces lividans 1326 strain was applied to LB agar medium and allowed to stand in the dark at 28 ° C.
  • Streptomyces lividans grown on the above plate was inoculated into an LB liquid medium, a coil was added, and cultured with shaking aerobically at 28 ° C. for 24 hours.
  • Saccharomyces cerevisiae W303 strain was applied to YEPD agar medium [2% polypeptone, 1% yeast extract, 2% glucose, and 1.5% agar] and allowed to stand in the dark at 30 ° C. for 20 hours. Saccharomyces cerevisiae grown on the plate was inoculated into YEPD liquid medium [2% polypeptone, 1% yeast extract, and 2% glucose], and aerobically shaken and cultured at 30 ° C. for 13 hours.
  • Fig. 1 shows the analysis results of the influence on the aerobic growth caused by the addition of paraaminobenzoic acid to the medium.
  • the Escherichia coli JM109 strain was significantly inhibited in the presence of 100 mM paraaminobenzoic acid, and the growth was almost completely inhibited at 300 mM.
  • the Streptomyces lividans 1326 strain was markedly inhibited in the presence of 100 mM paraaminobenzoic acid, and the growth was almost completely inhibited at 200 mM.
  • Pseudomonas putida strain S12 (which was reported as solvent-resistant) was almost completely inhibited from growing at a low concentration of 100 mM paraaminobenzoic acid.
  • Saccharomyces cerevisiae W303 was strongly inhibited by 200 mM paraaminobenzoic acid, and extremely strongly inhibited by 300 mM paraaminobenzoic acid.
  • the Corynebacterium glutamicum R strain was able to grow even in the presence of 300 mM paraaminobenzoic acid in which the growth of Escherichia coli, Streptomyces lividans, Pseudomonas putida, and Saccharomyces cerevisiae was almost completely inhibited.
  • Corynebacterium glutamicum can grow even in the presence of 400 mM paraaminobenzoic acid, and although not shown here, it grew to the same extent as that in the presence of 200 mM paraaminobenzoic acid 24 hours after the start of culture.
  • Corynebacterium glutamicum has a higher resistance to paraaminobenzoic acid than other microorganisms and representative solvent-resistant bacteria reported as paraaminobenzoic acid producing hosts, and is a host for producing paraaminobenzoic acid. As shown, it has high suitability.
  • the wild strain was inoculated into 10 ml of the A liquid medium containing 2% glucose, and then aerobically shaken and cultured at 33 ° C. for 18 hours.
  • the strain was inoculated into 100 ml of the A liquid medium containing 2% glucose and then aerobically shaken and cultured at 33 ° C. for 12 hours.
  • the bacterial cells of the strain grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 3000 ⁇ g, 10 minutes), and the obtained bacterial cells are collected in 6% of jar fermenter culture tank of 1000 ml capacity.
  • the bacterial cells of the strain grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 5000 ⁇ g, 10 minutes), washed once with 0.9% aqueous sodium chloride solution, and then 100 g wet bacterial cells / L 250 ml reaction solution containing 5% glucose and 0, 50 mM, 100 mM, or 200 mM paraaminobenzoic acid [(NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) Fe 2 SO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.01% (w / v) thiamine solution 2 ml dissolved in 1 L of distilled water] and suspended in 33 ml, pH 7.0 (5.0 N ammonia water) using a 1000 ml jar fermenter
  • Corynebacterium glutamicum showed almost no decrease in the sugar consumption rate even in the presence of a high concentration of paraaminobenzoic acid.
  • Corynebacterium glutamicum is remarkably useful as a host in the production of paraaminobenzoic acid.
  • Example 1 4-ABA production stock construction (1) Preparation and acquisition of chromosomal DNA
  • chromosomal DNA was prepared or obtained from the following strains.
  • Corynebacterium glutamicum R (FERM P-18976), Escherichia coli K-12 MG1655, Escherichia fergusonii NBRC 102419, Saccharophagus degradans ATCC 439 Shewanella woodyi ATCC 51908), Arthrobacter phenanthrenivorans JCM 16027, Azotobacter vinelandii ATCC 9104, Ochrobactrum anthropic NBRC 8019, MB (Xenorhabdus bovienii ATCC 35271), Bacillus pseudofilms (Bacillus pseudofirmus JCM 9141), Bacteroides thetaiotaomicron JCM 58 27), Ferrimonas balearica (NBRC 104245), Enterobacter cloacae NBRC 13535, Cor
  • pCRB240 cloning vector Vector pCRB1 containing the pBL1 ori sequence containing the promoter sequence of the gapA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum R strain and the cloning vector pKK223-3 (Pharmacia) rrnB T1T2 bidirectional terminator sequence J Mol Microbiol Biotechnol. 8 (4): 243-254 (2004)].
  • Primers of SEQ ID NOs: 207 and 208 were used for PgapA sequence amplification, and primers of SEQ ID NOs: 209 and 210 were used for amplification of terminator sequences.
  • the resulting cloning vector containing the PgapA promoter was named pCRB240.
  • the primer sequences used for the construction of pCRB204 are SEQ ID NOs: 207, 208, 209 and 210.
  • Table 2 shows the introduced cloning vectors and the obtained plasmid names. Since aroC, aroK, and aroB are continuously arranged in the same direction on the chromosome, cloning was performed together (SEQ ID NO: 113).
  • Plasmids that can coexist in Corynebacterium glutamicum (pCRB1 [NCBI GenBank: AB444682], pCRB15 [NCBI GenBank: AB444683]) were transformed into PgapA promoter fusion enzymes from the 4-ABA production-related gene expression plasmids shown in Tables 1 and 2 above. A gene fragment was obtained and introduced. The obtained 4-ABA production-related gene plasmids are shown in Table 3.
  • the PgapA promoter fusion enzyme gene fragment was obtained from the 4-ABA production-related gene expression plasmid constructed in Table 2 above and introduced into a plasmid that can coexist in Escherichia coli (pSTV28 [Takara Bio Inc.]).
  • the obtained 4-ABA production-related gene plasmids are shown in Table 4.
  • pCRB260, pCRB263, pCRB265, pCRB266, and pCRB267 introduced a restriction enzyme site (unique site) for incorporating a gene into the SSI region by an inverse PCR method.
  • Table 5 shows the primer sequences used for isolation and inverse PCR of the SSI region and the resulting vector for chromosome introduction.
  • the PgapA promoter fusion enzyme gene fragment was obtained from the 4-ABA production-related gene expression plasmid constructed in Table 2 above and introduced into the above-described chromosome introduction plasmid.
  • Table 6 shows the resulting plasmids for chromosomal introduction of 4-ABA production-related genes.
  • the markerless chromosomal gene transfer vector pCRA725 is a plasmid that cannot replicate in Corynebacterium glutamicum R.
  • kanamycin resistance by expression of the kanamycin resistance gene on pCRA725 and sucrose content by expression of the sacR-sacB gene of Bacillus subtilis In contrast to lethality in the medium, the double crossover strain shows kanamycin sensitivity due to the loss of the kanamycin resistance gene on pCRA725 and the growth in the sucrose-containing medium due to the loss of the sacR-sacB gene.
  • the markerless chromosome gene-introduced strain exhibits kanamycin sensitivity and sucrose-containing medium growth.
  • a 4-ABA production-related gene chromosome introduction strain was constructed using the above-mentioned plasmid for 4-ABA production-related gene chromosome introduction. The summary of this chromosome gene recombination is summarized in Table 7.
  • aroG Serine at position 180 of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase gene (here, SEQ ID NO: 112) derived from Escherichia coli was substituted with phenylalanine.
  • DAHP 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate
  • aroC Chorismate synthase gene from Corynebacterium glutamicum
  • aroK Shikimate kinase gene from Corynebacterium glutamicum
  • aroB 3-dehydroquinate synthase gene from Corynebacterium glutamicum
  • aroA Corynebacterium glutamicum 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase gene (here, SEQ ID NO: 114)
  • aroD 3-dehydroquinate dehydratase gene derived from Corynebacterium glutamicum (here, SEQ ID NO: 115)
  • aroE Shikimate dehydrogenase gene derived from Corynebacterium glutamicum (here, SEQ ID NO: 116)
  • ⁇ ldhA lactate (lactic acid) dehydrogenase destruction
  • a 4-ABA production strain with enhanced metabolic pathway was constructed by introducing the pabAB expression plasmid (Pani198) into the 4-ABA production-related gene-introduced strain shown in Table 5.
  • the summary of this metabolic pathway-enhancing 4-ABA production strain is summarized in Table 10.
  • a 4-ABA production strain was constructed by simultaneously introducing the pabA expression plasmid and the pabBC expression plasmid into the Corynebacterium glutamicum R strain. Moreover, a 4-ABA production strain was constructed by simultaneously introducing the pabAB expression plasmid and the pabBC expression plasmid described above. The outline of this 4-ABA production strain is summarized in Table 11. Corynebacterium glutamicum ANI 198 was deposited internationally at the Patent Microorganisms Depositary Center, National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan (zip code 292-0818) (Trust Date: January 6, 2016, Trust Number: NITE BP-02188). This stock is therefore publicly available.
  • a 4-ABA production strain was constructed by simultaneously introducing the pabAB expression plasmid and the pabC expression plasmid described above into the Corynebacterium glutamicum strain R. Moreover, 4-ABA production strains with different hosts were constructed by simultaneously introducing the pabAB expression plasmid and pabC expression plasmid described above into Escherichia coli K-12 MG1655 strain. The summary of this 4-ABA production strain is summarized in Table 12.
  • Example 2 (Combination of pabAB and pabC) Production test in test tube (10 mL scale) Tested using the ANI 198 strain (see Example 1 (Table 10)), a paraaminobenzoic acid production strain constructed based on the ESani 33 strain, a strain enhanced by the Shikimic acid pathway of the Corynebacterium glutamicum R strain.
  • a paraaminobenzoic acid production experiment in an aerobic batch reaction using a tube was performed by the method described below.
  • ANI 198 strain grown on the above plate was transferred to a liquid medium containing kanamycin and 2% glucose at a final concentration of 50 ⁇ g / mL [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g dissolved in 1 L of distilled water] 10 ml
  • One platinum ear was inoculated into a test tube, and cultured with shaking aerobically at 33 ° C for 7-15 hours.
  • Metabolite concentration in the culture supernatant was determined using a high performance liquid chromatography system (Prominence HPLC system (manufactured by Shimadzu Corporation), COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II, 20% methanol, 0.07% perchloric acid as the mobile phase. Analysis). As a result, the strain produced 40.1 mM paraaminobenzoic acid after 48 hours.
  • Example 3 Paraaminobenzoic acid production test in jar fermenter by Corynebacterium glutamicum transformant (250 mL scale) (Combination of pabAB and pabC) Using the ANI 198 strain (see Example 1 (Table 10)), a paraaminobenzoic acid production strain constructed based on the ESani 22 strain, a strain enhanced by the Shikimic acid pathway of the Corynebacterium glutamicum R strain, Paraaminobenzoic acid production experiments in an aerobic fed-batch reaction using a fermenter were carried out by the method described below.
  • the ANI 198 strain was inoculated into 20 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, and then cultured aerobically at 33 ° C. for 18 hours.
  • the ANI 198 strain was inoculated into 100 ml of the A liquid medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 2% glucose, followed by aerobic shaking culture at 33 ° C for 12 hours.
  • Bacteria grown under the above conditions are collected by centrifugation (4 ° C, 3000 xg, 10 minutes), and the resulting cells are placed in a jar fermenter culture tank with a volume of 1000 ml to a final concentration of 50 ⁇ g / Medium containing 5 g / L of kanamycin, 6% glucose, and antifoam (Dishome CB-442) [(NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) biotin solution 25 ⁇ l, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g dissolved in 1 L of
  • the glucose concentration in the reaction solution was monitored using a glucose sensor (Oji Scientific Instruments, BF-5i), and additional glucose was added before the glucose was depleted.
  • the metabolite concentration in the culture supernatant was analyzed by the high performance liquid chromatography system. The results are shown in FIG.
  • the ANI 198 strain produced 186 mM (25.5 g / l) of paraaminobenzoic acid (paraaminobenzoic acid production rate 3.9 mM / h) 48 hours after the start of the paraaminobenzoic acid production reaction.
  • the growth of the bacterial cells was hardly observed during the production reaction of paraaminobenzoic acid by the same strain.
  • this strain has a very high productivity of paraaminobenzoic acid in a reaction process that does not involve cell growth using an inorganic salt minimal medium.
  • the productivity of para-aminobenzoic acid in this strain is 35 mM (4.8 g / L) for the productivity of Escherichia coli recombinant strain with the highest productivity reported so far.
  • the time (patent document 1, non-patent document 2) was significantly exceeded.
  • Example 4 (Combination of pabA and pabBC) Production test in test tube (10 mL scale) ANI123 strain (see Example 1 (Table 11)), which is a paraaminobenzoic acid-producing strain constructed based on Corynebacterium glutamicum R strain, was used to test paraaminobenzoic acid in aerobic batch reactions using test tubes. A production experiment was conducted by the method described below. The ANI 123 strain was applied to the A agar medium containing final concentrations of 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol and 4% glucose, and allowed to stand in the dark at 33 ° C. for 15 hours.
  • the same strain grown on the above plate was transplanted into a test tube containing 10 ml of the liquid A medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, and 2% glucose.
  • the cells were cultured and aerobically shaken at 33 ° C for 7-15 hours.
  • 200 mg CaCO 3 was added to the suspension, and aerobic shaking culture was performed at 33 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of paraaminobenzoic acid by the high performance liquid chromatography system. As a result, the strain produced 16.6 mM paraaminobenzoic acid after 48 hours.
  • Example 5 (Combination of pabAB and pabBC) Production test in test tube (10 mL scale) ANI127 strain (see Example 1 (Table 11)), which is a paraaminobenzoic acid producing strain constructed based on the Corynebacterium glutamicum R strain, was used to test paraaminobenzoic acid in aerobic batch reactions using test tubes. A production experiment was conducted by the method described below. The ANI 127 strain was applied to the A agar medium containing final concentrations of 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol and 4% glucose, and allowed to stand at 33 ° C. for 15 hours in the dark.
  • the same strain grown on the above plate was transplanted into a test tube containing 10 ml of the liquid A medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, and 2% glucose.
  • the cells were cultured and aerobically shaken at 33 ° C for 7-15 hours.
  • 200 mg CaCO 3 was added to the suspension, and aerobic shaking culture was performed at 33 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of paraaminobenzoic acid by the high performance liquid chromatography system. As a result, the strain produced 7.6 mM paraaminobenzoic acid after 48 hours.
  • Example 6 Effect of pabAB from various organisms on paraaminobenzoic acid production
  • various types of strains constructed based on ESani 12 were tested for paraaminobenzoic acid productivity Compared. Each strain was applied to the A agar medium containing a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 4% glucose and allowed to stand in the dark at 33 ° C. for 15 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of paraaminobenzoic acid by the high performance liquid chromatography system.
  • the results are shown in Table 13. From this result, it was shown that the production amount of paraaminobenzoic acid was increased by the high expression of pabAB derived from the genus Corynebacterium, and in particular, when pabAB derived from Corynebacterium callunae was used, the production amount was particularly high.
  • Example 7 Effect of pabC from various organisms on paraaminobenzoic acid production
  • multiple strains constructed based on ESani 41 strain were the same as in Example 6
  • the productivity of paraaminobenzoic acid was compared by the above method. The results are shown in Table 14.
  • the production amount of paraaminobenzoic acid was increased by high expression of pabC from the genus Escherichia, Saccharophagus, Arthrobacter, Anabaena, Ochrobactrum, Xenorhabdus, Bacillus, or Ferrimonas.
  • Example 8 Effect of metabolic pathway enhancement and by-product pathway blockage on paraaminobenzoic acid productivity
  • Example 6 The productivity of paraaminobenzoic acid was compared by the same method.
  • the effects of adding a gene on the shikimate pathway on the chromosome and destroying a byproduct pathway gene were compared. The results are shown in Table 15.
  • Example 9 Effect of host on 4-ABA productivity (E. coli and coryneform bacteria)
  • pabAB was derived from Corynebacterium callunae
  • pabC was derived from E. coli.
  • Production strain ANI 109 (Example 1 (Table 12)) constructed on the basis of a wild strain of coryneform bacterium was converted into the A containing final concentrations of 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, and 4% glucose. It was applied to an agar medium and left in the dark for 15 hours at 33 ° C. Each strain grown on the above plate was added with a final concentration of 50 ⁇ g / mL kanamycin, 5 ⁇ g / mL chloramphenicol, and 2% glucose.
  • One platinum ear was inoculated into a test tube containing 10 ml of the above-mentioned A liquid medium, and cultured under aerobic shaking at 33 ° C. for 7-15 hours.
  • 200 mg of CaCO 3 was added, and aerobic shaking culture was performed at 33 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of paraaminobenzoic acid by the high performance liquid chromatography system.
  • ANI 225 (Example 1 (Table 12)) constructed based on the wild strain of E. coli K-12 MG1655 was applied to the LB agar medium containing final concentrations of 50 ⁇ g / mL kanamycin and 50 ⁇ g / mL chloramphenicol. Each strain grown on the above plate was allowed to stand in the dark for 15 hours at 33 ° C. The LB containing final concentrations of 50 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL chloramphenicol, and 2% glucose One platinum ear was inoculated into a test tube containing 10 ml of liquid medium, and cultured with shaking aerobically at 37 ° C. for 7-15 hours.
  • 200 mg of CaCO 3 was added and aerobic shaking culture was performed at 37 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution after 48 hours was centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ g, 5 minutes), and the obtained supernatant was subjected to quantitative analysis of paraaminobenzoic acid by the high performance liquid chromatography system.
  • the concentration of 4-ABA contained in the culture supernatant after 48 hours of ANI strain 109 using coryneform bacteria as a host was 16.2 mM.
  • ANI 225 strain using Escherichia coli as a host it was below the detection limit.
  • 4-ABA or a salt thereof can be produced from glucose or the like with practical efficiency using a microorganism.

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Abstract

糖類を原料として、効率よくパラアミノ安息香酸（4-ABA）又はその塩を製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良く4-ABA又はその塩を製造する方法を提供することを課題とする。 コリネ型細菌に、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIをコードする遺伝子、及びパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIIをコードする遺伝子を導入した形質転換体は、効率よく糖類から4-ABA又はその塩を生産できる。

Description

コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４－アミノ安息香酸又はその塩の製造方法
　本発明は、4-アミノ安息香酸（パラアミノ安息香酸とも言う。以下、「4-ABA」と略称することがある）又はその塩の生産能を付与するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌の形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的な4-ABAの製造方法に関する。
　地球温暖化、および化石資源の枯渇問題を背景に、再生可能な資源を原料とした化学品の製造は、バイオ燃料と並んで新産業バイオリファイナリーとして低炭素社会実現に向けた重要な方策であることが認識され、注目されている。
　4-ABAは分子内にアミノ基とカルボキシル基を持ち、ポリマー原料としての需要が見込まれている。また、紫外線吸収剤や医薬品の原料として既に広く用いられている。
　従来、4-ABAは石油を原料に多段階の反応を経て合成されてきた。すなわち、石油由来のトルエンからパラニトロトルエンを合成し、パラニトロ安息香酸またはパラトルイジンを経て4-ABAを合成する経路である。これらの反応では強酸や高温条件が求められるため、多大なエネルギーを必要とする。従って、脱化石資源依存および二酸化炭素排出削減の観点から、環境調和型プロセスであるバイオリファイナリー技術を用いた4-ABA生産法が強く望まれている。
　一方、多くの微生物が、葉酸の前駆体として4-ABAの生産経路を有している。すなわち、細菌、酵母、植物等が有する芳香族化合物生合成経路いわゆるシキミ酸経路を通してコリスミ酸を生成した後、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸を経て4-ABAを合成する経路である。
　コリスミ酸から4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸への変換は、実際には2段階反応によって行われる。パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII (PabA) がグルタミンからアンモニア基を遊離させ、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI (PabB) がそのアンモニア基とコリスミ酸から4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸を合成する。さらに、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸は4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ (PabC) によって4-ABAに変換される。大腸菌はpabA遺伝子、pabB遺伝子、pabC遺伝子を染色体上でそれぞれ別の位置に持っているが、2成分タンパク質としてpabABを持つ微生物やpabBCを持つ微生物も存在する。
　ここで、非特許文献1は、酵母にabz1遺伝子(pabABの相同遺伝子)を過剰発現させた形質転換体を用いて4-ABAを生産することを教えている。しかし、この形質転換体の4-ABA生産性は160時間で250 μMと極端に低く、実用的ではない。
　また、特許文献1及び非特許文献2は、コリネバクテリウム エフィシエンス由来のpabABを大腸菌の染色体に導入した形質転換体を用いて4-ABAを生産することを報告している。しかし、4-ABA生産性は48時間で35 mM (4.8 g/L) と低く、工業的生産には不十分である。また、特許文献１は、サッカロポリスポラ エリスレア由来のpabABをストレプトマイセス リビダンスに導入した形質転換体を用いて4-ABAを生産することも報告しているが、4-ABA生産性は9日間で1 mM以下であった。
　また、特許文献2は、サッカロマイセス セレビシエ、クルイベロマイセス ラクティス、アスペルギルス ニガー、シネコシスティス、又は大腸菌において、pabA、pabB、及びpabCを過剰発現させ得ること、それによりコリスミ酸から4-ABAの変換を増大させ得ることを記載している。しかし、特許文献2は、4-ABAの生産可能性を記載しているだけで、4-ABAを生産した実例は記載していない。
特開2015-15号公報 米国2014/0371418A1号公報
J Biotechnol (2013) 163:184-193 Biosci Biotechnol Biochem; 2014, Vol.78, No.2, 350-357
　本発明は、糖類を原料として、効率よく4-ABA又はその塩を製造できる微生物、及び、この微生物を用いて効率良く4-ABA又はその塩を製造する方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  これまでに4-ABAの生産が報告されている幾つかの形質転換体の宿主について、それらの増殖に及ぼす4-ABAの影響を比較したところ、コリネバクテリウム グルタミカム、エシェリヒア コリ、ストレプトマイセス リビダンス、シュードモナスプチダ、サッカロマイセス セレビシエの中では、コリネバクテリウム グルタミカムが最も4-ABA耐性が高い。具体的には、コリネバクテリウム グルタミカムは、数百mMオーダーの高濃度の4-ABAの存在下でも増殖でき、また、4-ABAが存在しない場合と同程度に糖を消費できる。このように、コリネバクテリウム グルタミカムは、4-ABA耐性が非常に強いため、4-ABA又はその塩の生産に適する。
(ii)　コリネ型細菌に、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子(pabC)、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIをコードする遺伝子(pabB)、及びパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIIをコードする遺伝子(pabA)を導入した形質転換体は、効率よく糖類から4-ABA又はその塩を生産できる。
(iii)  コリネ型細菌に、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIをコードする遺伝子(pabB)を導入した形質転換体は、アンモニア又はアンモニウム塩を含有する培地中で、効率よく糖類から4-ABA又はその塩を生産できる。
(iv)　これらの形質転換体は、好気的、かつ実質的に増殖しない条件下で反応させる場合に、特に4-ABAの生産効率が高い。
　本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の形質転換体、及び、4-ABA又はその塩の製造方法を提供する。
項１．　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、パラアミノ安息香酸生産能を有する形質転換体。
項２．　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子がpabBである、項１に記載の形質転換体。
項３．　さらに、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、項１に記載の形質転換体。
項４．　(i)  パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabA、又は(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABが、宿主のコリネ型細菌に導入された、項３に記載の形質転換体。
項５．　さらに、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、項１に記載の形質転換体。
項６．　(i)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、又は(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCが、宿主のコリネ型細菌に導入された、項５に記載の形質転換体。
項７．　さらに、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、項３に記載の形質転換体。
項８．　(i)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabAと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabA、(iii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、又は(iv) パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCが、宿主のコリネ型細菌に導入された、項７に記載の形質転換体。
項９.  pabABがコリネバクテリウム属細菌、ニューロスポラ属細菌、又はロドコッカス属細菌の遺伝子である、請求項４又は８に記載の形質転換体。
項１０．　pabABがコリネバクテリウム カルナエ（Conynebacterium callunae）、コリネバクテリウム エフィシエンス（Conynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム カゼイ（Conynebacterium casei）、コリネバクテリウム グルタミカム（Conynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム ウレイセレリボランス（Conynebacterium ureicelerivorans）、コリネバクテリウム アルジェントラテンス（Conynebacterium argentoratense）、コリネバクテリウム テルペノタビダム（Conynebacterium terpenotabidum）、ニューロスポラ クラサ(Neurospora crassa)、ロドコッカス オパクス（Rodococcus opacus）、又はロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis）の遺伝子である、請求項９に記載の形質転換体。
項１１．　pabCが、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニ（Escherichia fergusonii）、サッカロファガス デグラダンス（Saccharophagus degradans）、シェワネラ ウッディ（Shewanella woodyi）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、オクロバクトラム アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）、クロストリジウム ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、キセノルハブダス ボビエニ（Xenorhabdus bovienii）、バチルス シュードフィルムス（Bacillus pseudofirmus）、カウロバクター クレセンタス（Caulobacter crescentus）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、バクテロイデス スライオタオミクロン（Bacteroides thraiotaomicron）、又はフェリモナス バレアリカ（Ferrimonas. balearica）由来の遺伝子である、項６又は８に記載の形質転換体。
項１２．　pabBCが、ラルストニア属、カプリアビダス属、又はクロモハロバクター属細菌の遺伝子である、項６又は８に記載の形質転換体。
項１３．　pabBCが、ラストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha）、カプリアビダス タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）、又はクロモハロバクター サレキシゲネス（Chromohalobacter salexigens）の遺伝子である、項１２に記載の形質転換体。
項１４.　pabAがエンテロバクター属細菌の遺伝子である、項４又は８に記載の形質転換体。
項１５．　pabAがエンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）の遺伝子である、項１４に記載の形質転換体。
項１６．　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である項１～１５の何れかに記載の形質転換体。
項１７．　宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである項１６に記載の形質転換体。
項１８．　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルタミカムR (FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC 13869である項１７に記載の形質転換体。
項１９．　コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体ANI198（NITE BP-02188）。
項２０．　項１～１９のいずれかに記載の形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養して4-アミノ安息香酸又はその塩を生産させる工程を含む4-アミノ安息香酸又はその塩の製造方法。
項２１．　好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する項２０に記載の方法。
　コリネ型細菌に、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIをコードする遺伝子、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIIをコードする遺伝子、及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体は、グルコース等の糖類から、高濃度かつ高収率で4-ABAを生産できる。
　また、アンモニア又はアンモニウム塩を含有する培養液中で、形質転換体を培養することにより4-ABAを生産する場合は、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIIをコードする遺伝子を導入しなくてもよく、コリネ型細菌に、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIをコードする遺伝子、又はさらに4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体が、グルコース等の糖類から、高濃度かつ高収率で4-ABAを生産できる。
　従って、本発明により、ポリマー、医薬品、紫外線吸収剤等の原料として有用な4-ABAを、環境負荷を抑えて、安価かつ大量に生産できるようになった。
　本発明では、4-ABA又はその塩生産効率の点で、宿主としてコリネ型細菌を用いることが重要である。従って、本発明では、宿主のコリネ型細菌と上記の特定の導入遺伝子との組み合わせが重要と言える。
　一般に微生物は4-ABAのような芳香族化合物の細胞毒性により、増殖が阻害されるため、微生物を用いて4-ABAを製造することは困難であった。しかし、コリネ型細菌は、4-ABAに対する耐性が非常に強いため、本発明の形質転換体を用いれば、高濃度の4-ABA又はその塩を生産することができる。また、コリネ型細菌は、大腸菌とは異なりエンドトキシンを生成しないため、生産物へのエンドトキシンの残留を懸念する必要がない。また、コリネ型細菌は、増殖を制限した条件下でも4-ABA又はその塩の生成反応が進むため、原料の糖が増殖のために消費されず4-ABA又はその塩の収率が高くなると共に、微生物の増殖に一般に求められる芳香族アミノ酸、4-ヒドロキシ安息香酸などを培養液に添加する必要がなく、その分、生産コストを抑えることができる。
パラアミノ安息香酸存在下での、コリネバクテリウム グルタミカムを含む種々の微生物の増殖曲線である。 パラアミノ安息香酸存在下での、コリネバクテリウム グルタミカム野生株の反応液中グルコース濃度の経時変化を示す図である。 pabAB及びpabCを導入したコリネバクテリウム グルタミカム形質転換体による、グルコースからのパラアミノ安息香酸生産の経時変化を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（１）4-ABA生産能を有する形質転換体
宿主
　本発明では、コリネ型細菌を宿主として使用する。
　コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
　中でも、安全でかつ4-HBA生産性が高い点で、コリネバクテリウム グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　中でも、R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
　なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
　マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
　以上の株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM BP-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
　このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
　図2に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、4-ABAに対する耐性が極めて高いことを見出した。この点で、コリネ型細菌は本発明方法による4-ABA製造に好適である。
導入遺伝子
　本発明の１実施態様では、コリネ型細菌に、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子と、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子と、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子とを導入する。
　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIは、コリスミ酸とアンモニアから4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸を生成する反応を触媒する。また、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIIは、グルタミンからグルタミン酸とアンモニアを生じる反応を触媒する。また、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼは、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸から4-アミノ安息香酸（4-ABA又はその塩）とピルビン酸を生成する反応を触媒する。
　従って、上記3遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより、コリスミ酸から4-ABA又はその塩の生成を効率よく行える形質転換体となる。
　但し、反応液ないしは培養液中にアンモニア又はアンモニウム塩が含まれる場合は、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入しなくても良い。その場合、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントIは、反応液ないしは培養液中のアンモニア又はアンモニウム塩を利用して、コリスミ酸から4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸を生成する。
　また、コリネ型細菌は、染色体上に4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ遺伝子を有するため、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、必ずしも導入しなくて良い。しかし、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入する方が、4-ABA又はその塩をより効率よく生産できる形質転換体となる。
　従って、本発明の他の実施態様の形質転換体は、コリネ型細菌に、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入したものである。また、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有する酵素をコードする遺伝子に加えて、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入することもできる。また、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有する酵素をコードする遺伝子に加えて、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入することもできる。
　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有する酵素をコードする遺伝子としてはpabBが挙げられ、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有する酵素をコードする遺伝子としてはpabAが挙げられ、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子としてはpabCが挙げられる。
　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII、及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼのうち2つの活性を有する２成分酵素ないしは2機能酵素も存在する。2成分酵素としては、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有する2成分酵素（PabAB）、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有する2成分酵素（PabBC）が挙げられる。
　従って、コリネ型細菌に導入する遺伝子又は遺伝子の組み合わせとしては、以下のものが挙げられる。
(i)pabB
(ii)pabBとpabC
(iii)pabBC
(iv)pabBとpabA
(v)pabAB
(vi)pabBとpabAとpabC
(vii)pabABとpabC
(viii)pabAとpabBC
(ix) pabABとpabBC
　各遺伝子の由来は特に限定されないが、例えば、下記の微生物の遺伝子が挙げられる。
　pabBとしては、コリネバクテリウム属細菌（特に、コリネバクテリウム クロッペンステディ (Corynebacterium kroppenstedtii)、コリネバクテリウム レジステンス (Corynebacterium resistens)、コリネバクテリウム ファルセニ (Corynebacterium falsenii))、バチルス属細菌（特に、バチルス サブチリス (Bacillus subtilis)、バチルス アミロリケファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス チューリンゲンシス (Bacillus thuringiensis)）、エシェリヒア属細菌（特に、エシェリヒア コリ (Escherichia coli)、エシェリヒア フェルグソニ (Escherichia fergusonii)）、ストレプトマイセス属細菌（特に、ストレプトマイセス セリカラー (Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス グリセウス (Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス リビダンス (Streptomyces lividans)）、サルモネラ属細菌（特に、サルモネラ エンテリカ (Salmonella enterica)、サルモネラ ボンゴリ (Salmonella bongori)）、シュードモナス属細菌（特に、シュードモナス アエルギノサ (Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス プチダ (Pseudomonas putida)、シュードモナス フルオレセンス (Pseudomonas fluorescens)）、エルシニア属細菌（特に、エルシニア ペスチス (Yersinia pestis)、エルシニア シュードツベルキュロシス (Yersinia pseudotuberculosis)）、エンテロバクター属細菌（特に、エンテロバクター種 (Enterobacter sp.)、エンテロバクター クロアカエ (Enterobacter cloacae)）、マイコバクテリウム スメグマチス (Mycobacterium smegmatis)、クレブシラ ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae)、キセノハブダス ボビエニ (Xenorhabdus bovienii)、パントエア アナナチス (Pantoea ananatis)、プロビデンシア スチュアーティ (Providencia stuartii)、アゾトバクター ビネランディ (Azotobacter vinelandii)、アシネトバクター バウマンニ (Acinetobacter baumannii)、シェワネラ ウッディ (Shewanella woodyi)、ザイモモナス モビリス (Zymomonas mobilis)、クロストリジウム ペルフリンゲンス (Clostridium perfringens)、又はサッカロポリスポラ エリスレア (Saccharopolyspora erythraea)の遺伝子が挙げられる。
　中でも、バチルス サブチリス、エシェリヒア コリ、ストレプトマイセス セリカラー、エンテロバクター クロアカエ、マイコバクテリウム スメグマチス、クレブシラ ニューモニエ、キセノハブダス ボビエニ、パントエア アナナチス、プロビデンシア スチュアーティの遺伝子が好ましく、エシェリヒア コリ、エンテロバクター クロアカエ、パントエア アナナチス、プロビデンシア スチュアーティの遺伝子がより好ましい。
　コリネバクテリウム クロッペンステディ、コリネバクテリウム レジステンス、コリネバクテリウム ファルセニ、バチルス サブチリス、バチルス アミロリケファシエンス、バチルス チューリンゲンシス、エシェリヒア コリ、エシェリヒア フェルグソニ、ストレプトマイセス セリカラー、ストレプトマイセス グリセウス、ストレプトマイセス リビダンス、サルモネラ エンテリカ、サルモネラ ボンゴリ、シュードモナス アエルギノサ、シュードモナス プチダ、シュードモナス フルオレセンス、エルシニア ペスチス、エルシニア シュードツベルキュロシス、エンテロバクター種、エンテロバクター クロアカエ、マイコバクテリウム スメグマチス、クレブシラ ニューモニエ、キセノハブダス ボビエニ、パントエア アナナチス、プロビデンシア スチュアーティ、アゾトバクター ビネランディ、アシネトバクター バウマンニ、シェワネラ ウッディ、ザイモモナス モビリス、クロストリジウム ペルフリンゲンス、サッカロポリスポラ エリスレアのpabBとしては、配列番号1、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、及び配列番号161に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
　pabCとしては、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニ（Escherichia fergusonii）、サッカロファガス デグラダンス（Saccharophagus degradans）、シェワネラ ウッディ（Shewanella woodyi）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、オクロバクトラム アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）、クロストリジウム ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、キセノルハブダス ボビエニ（Xenorhabdus bovienii）、バチルス シュードフィルムス（Bacillus pseudofirmus）、カウロバクター クレセンタス（Caulobacter crescentus）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、バクテロイデス スライオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、又はフェリモナス バレアリカ（Ferrimonas balearica）の遺伝子が挙げられる。中でも、キセノルハブダス ボビエニ、アナバエナ バリアビリス、バチルス シュードフィルムス、エシェリヒア コリ、オクロバクトラム アンスロピの遺伝子が好ましく、キセノルハブダス ボビエニ、アナバエナ バリアビリス、エシェリヒア コリの遺伝子がより好ましい。
　エシェリヒア コリ、エシェリヒア フェルグソニ、サッカロファガス デグラダンス、シェワネラ ウッディ、アースロバクター フェナンスレニボランス、アナバエナ バリアビリス、アゾトバクター ビネランディ、オクロバクトラム アンスロピ、クロストリジウム ベイジェリンキ、キセノルハブダス ボビエニ、バチルス シュードフィルムス、カウロバクター クレセンタス、シネココッカス種、バクテロイデス スライオタオミクロン、及びフェリモナス バレアリカのpabCとしては、それぞれ、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
　pabAとしては、エシェリヒア属細菌(特に、エシェリヒア コリ (Escherichia coli)、エシェリヒア フェルグソニ (Escherichia fergusonii))、サルモネラ属細菌(特に、サルモネラ エンテリカ (Salmonella enterica)、サルモネラ ボンゴリ (Salmonella bongori))、エルシニア属細菌(特に、エルシニア ペスチス (Yersinia pestis)、エルシニア シュードツベルキュロシス (Yersinia pseudotuberculosis))、エンテロバクター属細菌(特に、エンテロバクター クロアカエ (Enterobacter cloacae))、クレブシラ属細菌(特に、クレブシラ ニューモニエ (Klebsiella pneumoniae)、キセノハブダス属細菌(特に、キセノハブダス ボビエニ (Xenorhabdus bovienii))、プロビデンシア属細菌(特に、プロビデンシア スチュアーティ (Providencia stuartii))、シェワネラ属細菌(特に、シェワネラ ウッディ (Shewanella woodyi))、ザイモモナス属細菌(特に、ザイモモナス モビリス (Zymomonas mobilis))、バチルス属細菌(特に、バチルス サブチリス (Bacillus subtilis)、バチルス チューリンゲンシス (Bacillus thuringiensis))、ラクトコッカス属細菌(特に、ラクトコッカス ラクティス (Lactococcus lactis))、マイコバクテリウム属細菌(特に、マイコバクテリウム ボビス (Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム スメグマチス (Mycobacterium smegmatis))、コリネバクテリウム属細菌(特に、コリネバクテリウム ウレアリティカム (Corynebacterium urealyticum)、コリネバクテリウム クロッペンステディ (Corynebacterium kroppenstedtii)、コリネバクテリウム レジスタンス (Corynebacterium resistens)、コリネバクテリウム バリアビレ (Corynebacterium variabile)、コリネバクテリウム ファルセニ (Corynebacterium falsenii))、ロドコッカス属細菌(特に、ロドコッカス ジョスティ (Rhodococcus jostii)、ロドコッカス エリスロポリス (Rhodococcus erythropolis)、ロドコッカス オパクス (Rhodococcus opacus))、ストレプトマイセス属細菌(特に、ストレプトマイセス セリカラー (Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス アヴェルミティリス (Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス グリセウス (Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス リビダンス (Streptomyces lividans))、アースロバクター属細菌(特に、アースロバクター フェナンスレニボランス (Arthrobacter phenanthrenivorans))、レニバクテリウム属細菌(特に、レニバクテリウム サルモニナルム (Renibacterium salmoninarum))、ビフィドバクテリウム属細菌(特に、ビフィドバクテリウム ロングス (Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム アニマリス (Bifidobacterium animalis)、ビフィドバクテリウム ビフィダム (Bifidobacterium bifidum))、シネココッカス種 (Synechococcus sp.)、又はパントエア属細菌(特に、パントエア アナナチス (Pantoea ananatis))の遺伝子が挙げられる。中でも、エシェリヒア コリ、プロビデンシア スチュアーティ、エンテロバクター クロアカエ、パントエア アナナチスの遺伝子が好ましく、エンテロバクター クロアカエ、エシェリヒア コリの遺伝子がより好ましい。
　エシェリヒア コリ、エシェリヒア フェルグソニ、サルモネラ エンテリカ、サルモネラ ボンゴリ、エルシニア ペスチス、エルシニア シュードツベルキュロシス、エンテロバクター クロアカエ、クレブシラ ニューモニエ、キセノハブダス ボビエニ、プロビデンシア スチュアーティ、シェワネラ ウッディ、ザイモモナス モビリス、バチルス サブチリス、バチルス チューリンゲンシス、ラクトコッカス ラクティス、マイコバクテリウム ボビス、マイコバクテリウム スメグマチス、コリネバクテリウム ウレアリティカム、コリネバクテリウム クロッペンステディ、コリネバクテリウム レジスタンス、コリネバクテリウム バリアビレ、コリネバクテリウム ファルセニ、ロドコッカス ジョスティ、ロドコッカス エリスロポリス、ロドコッカス オパクス、ストレプトマイセス セリカラー、ストレプトマイセス アヴェルミティリス、ストレプトマイセス グリセウス、ストレプトマイセス リビダンス、アースロバクター フェナンスレニボランス、レニバクテリウム サルモニナルム、ビフィドバクテリウム ロングス、ビフィドバクテリウム アニマリス、ビフィドバクテリウム ビフィダム、シネココッカス種、及びパントエア アナナチスのpabAとしては、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号17、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、及び配列番号202に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
　pabBCとしては、ラルストニア属（好ましくは、ラストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha））、カプリアビダス属（好ましくは、カプリアビダス タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis））、クロモハロバクター属（好ましくは、クロモハロバクター サレキシゲネス（Chromohalobacter salexigens））、パンドレア属（好ましくは、パンドレア ノメヌサ （Pandoraea pnomenusa））、 ラクトコッカス属（好ましくは、ラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis））、又はストレプトコッカス属（好ましくは、ストレプトコッカス ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus））の遺伝子が挙げられる。
　中でも、ラストニア ユートロファ、カプリアビダス タイワネンシス、クロモハロバクター サレキシゲネスの遺伝子が好ましく、ラストニア ユートロファの遺伝子がより好ましい。
　ラストニア ユートロファ、カプリアビダス タイワネンシス、クロモハロバクター サレキシゲネス、パンドレア ノメヌサ、ラクトコッカス ラクティス、ストレプトコッカス ニューモニエ、及びストレプトコッカス サーモフィラスのpabBCとしては、配列番号129、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、及び配列番号167に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
　pabABとしては、コリネバクテリウム属細菌（特に、コリネバクテリウム カルナエ（Conynebacterium callunae）、コリネバクテリウム エフィシエンス（Conynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム カゼイ（Conynebacterium casei）、コリネバクテリウム グルタミカム（Conynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム ウレイセレリボランス（Conynebacterium ureicelerivorans）、コリネバクテリウム アルジェントラテンス（Conynebacterium argentoratense）、コリネバクテリウム テルペノタビダム（Conynebacterium terpenotabidum））、ニューロスポラ属細菌（特に、ニューロスポラ クラサ(Neurospora crassa)）、又はロドコッカス属細菌（特に、ロドコッカス オパクス（Rodococcus opacus）、又はロドコッカス エリスロポリス（Rodococcus erythropolis））の遺伝子が挙げられる。
　中でも、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム エフィシエンス、コリネバクテリウム カゼイ、コリネバクテリウム グルタミカム、ロドコッカス オパクス、ニューロスポラ クラサの遺伝子が好ましく、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム エフィシエンスの遺伝子がより好ましい。
　コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム エフィシエンス、コリネバクテリウム カゼイ、コリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム ウレイセレリボランス、コリネバクテリウム アルジェントラテンス、コリネバクテリウム テルペノタビダム、ニューロスポラ クラサ、ロドコッカス オパクス、ロドコッカス エリスロポリスのpabABとしては、それぞれ、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、及び配列番号27に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
　pabBの類縁体について述べると、配列番号1、132～161のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabCの類縁体について述べると、配列番号2～16のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつ4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabAの類縁体について述べると、配列番号17、168～202のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabBCの類縁体について述べると、配列番号129、162～167のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabABの類縁体について述べると、配列番号18～27のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性及びパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50～60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
　また、pabBの類縁体について述べると、配列番号1、132～161のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabCの類縁体について述べると、配列番号2～16のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabAの類縁体について述べると、配列番号17、168～202のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabBCの類縁体について述べると、配列番号129、162～167のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性及び4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　pabABの類縁体について述べると、配列番号18～27のいずれかの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性及びパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性は、下記のようにして測定できる。
　50 mM トリエタノールアミン(pH 8.5), 5% グリセロール、5 mM dithiothreitol (DTT), 5 mM MgCl2, 250 mM NH4Cl、0.1 mM コリスミ酸Ba, PabB (20U)で総液量3 mlにて反応させる。33℃で反応開始後、2分おきに0.5 mlをサンプリングし、1N HCl を0.1 ml添加して反応を停止させる。生じた4-アミノデオキシコリスメート（ADC）を、島津製作所製HPLC(Prominence）を使用し、カラムはCosmosil packed column 5C18-AR-II (4.6 x 250 mm、ナカライテスク製）を用いてADCを分離して270 nmの波長で検出し、初速度から酵素活性を算出する。
　また、PabAを共存させる場合は、20 U のPabAを添加して同様に反応させる。
　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性は、下記のようにして測定できる。
　50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5% グリセロール、5 mM DTT, 5 mM MgCl2, 250 mM NH4Cl、 10 mM L-グルタミン、PabＡ(20U)で総液量3 mlにて反応させる。33℃で反応開始後、2分おきに0.5 mlをサンプリングし、1N HCl を0.1 ml添加して反応を停止させる。生じたL-グルタミン酸は、島津製作所製HPLC(Prominence）を使用し、カラムはShim-Pack Amino-Na(6.0 x 100 mm、島津製作所製）を用いて反応生成物であるL-グルタミン酸を分離後、O-フタルアルデヒド標識して蛍光検出、定量し、初速度から酵素活性を算出する。
　また、PabBとカップリングさせて測定する場合は、以下の方法を用いる。50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5% グリセロール、5 mM DTT, 5 mM MgCl2, 250 mM NH4Cl、0.1 mM コリスミ酸Ba, 10 mM L-グルタミン、PabA(20U)、PabB(20U)で総液量3 mlにて反応させる。33℃で反応開始後、2分おきに0.5 mlをサンプリングし、1N HCl を0.1 ml添加して反応を停止させる。生じたADCは、島津製作所製HPLC(Prominence）を使用し、カラムはCosmosil packed column 5C18-AR-II (4.6 x 250 mm、ナカライテスク製）を用いてADCを分離して270 nmの波長で検出し、初速度から酵素活性を算出する。
　4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性は、PabBとのカップリング反応を利用して下記のようにして測定する。即ち、50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 5% グリセロール、5 mM DTT, 5 mM MgCl2, 250 mM NH4Cl、0.1 mM コリスミ酸Ba、PabB (200U)、 PabC(20U)で総液量3 mlにて反応させる。33℃で反応開始後、2分おきに0.5 mlをサンプリングし、1N HCl を0.1 ml添加して反応を停止させる。生じたパラアミノ安息香酸は、島津製作所製HPLC(Prominence）を使用し、カラムはCosmosil packed column 5C18-AR-II (4.6 x 250 mm、ナカライテスク製）を用いてパラアミノ安息香酸を分離して254 nmの波長で検出し、初速度から酵素活性を算出する。
　塩基配列1～27,129,132～202のいずれかの塩基配列からなるDNAの類縁体は、例えば、これらの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたPCR又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のDNAライブラリーから選択することができる。
DAHPシンターゼ活性の強化
　宿主のコリネ型細菌は、3－デオキシ－D－アラビノ－ヘプツロソネート－7－リン酸（DAHP）シンターゼの活性が野生型コリネ型細菌より増強されたものであることが望ましい。
　DAHPシンターゼは、エリスロース-4-リン酸（E4P）とホスホエノールピルビン酸（PEP）とから芳香族化合物生合成共通経路の初発代謝産物であるDAHPを生成する酵素である。
　DAHPシンターゼ活性は、DAHPシンターゼ遺伝子の導入、又はコリネ型細菌の染色体上のDAHPシンターゼ遺伝子の制御配列および遺伝子コード領域への変異導入若しくは配列置換により、この遺伝子発現量を増大させ、または、この遺伝子産物の活性を増大させることにより増強することができる。
　このうち、DAHPシンターゼ遺伝子の導入によりDAHPシンターゼ活性を増強することが簡便で効率がよい。
　導入するDAHPシンターゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、4-ABA生産効率が良い点で、コリネバクテリウムのDAHPシンターゼ遺伝子が好ましい。コリネバクテリウムのDAHPシンターゼ遺伝子としては、コリネバクテリウム グルタミカムのDAHPシンターゼ遺伝子aroG（配列番号203）が挙げられる。
　また、エシェリヒア コリ(Eschelichia coli)由来の遺伝子、中でも、エシェリヒア コリ(Eschelichia coli)由来の遺伝子も好ましい。
　エシェリヒア コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子としては、配列番号211の塩基配列からなるDNA（aroG S180F）がさらにより好ましい。この遺伝子は、エシェリヒア コリ由来のDAHPシンターゼ遺伝子の一つであるaroG遺伝子において、この遺伝子がコードするアミノ酸配列の180番目のセリンをフェニルアラニンに変異させる変異(S180F)が導入された遺伝子であり、その遺伝子産物が芳香族アミノ酸を含む芳香族化合物によるフィードバック阻害への耐性、及び、高いDAHPシンターゼ活性を示すことを、本発明者らが比較検討により見出している（未発表）。
　配列番号203と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつDAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は配列番号203と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつDAHPシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　DAHPシンターゼ活性の有無は、ホスホエノールピルビン酸とエリトロース-4-リン酸を基質として反応させ、生じた3－デオキシ－D－アラビノ－ヘプツロソネート－7－リン酸（DAHP）を、チオバルビツール酸を用いた発色法（Appl. Environ. Microbiol., 74; 5497-5530 (2008)）により定量することにより検出できる。
コリスメートシンターゼ活性の強化
　本発明の形質転換体は、宿主のコリネ型細菌に、さらに、コリスメートシンターゼをコードする遺伝子を導入したものであることが好ましい。コリスメートシンターゼは、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸からコリスミ酸への変換を触媒する酵素である。
　導入するコリスメートシンターゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、4-ABAの生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、特にコリネバクテリウム グルタミカムのコリスメートシンターゼ遺伝子が好ましい。
　コリネバクテリウム グルタミカムのコリスメートシンターゼ遺伝子としてはaroC（例えば、配列番号204）が知られている。
　配列番号204と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつコリスメートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は配列番号204と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつコリスメートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　コリスメートシンターゼ活性は、公知の方法(Kitzing, K. et al., Spectroscopic and Kinetic Characterization of the Bifunctional Chorismate Synthase from Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 276: 42658-42666 (2001))に従って測定する。即ち、37℃において、100 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.6)、4 mM MgSO4、10 mM グルタミン、30 mM 硫酸アンモニウム、1 mM DTT、0.01 mM FMN、0.08 mM EPSP、アントラニル酸シンターゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、アントラニル酸シンターゼとのカップリング反応によって生成するアントラニル酸の生成を示す390 nmの蛍光をF-2500 Fluorescence Spectrophotometer (日立社製)によってモニターし、初速度から酵素活性を算出する。FMNの還元は1 mMのNADPHを添加することによって行う。活性が検出される場合に、コリスメートシンターゼ活性があると判定する。
シキミ酸キナーゼ活性の強化
　本発明の形質転換体は、宿主のコリネ型細菌に、さらに、シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したものであることが好ましい。シキミ酸キナーゼは、シキミ酸からシキミ酸-3-リン酸への変換を触媒する酵素である。
　導入するシキミ酸キナーゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、4-ABAの生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、特にコリネバクテリウム グルタミカムのシキミ酸キナーゼ遺伝子が好ましい。
　コリネバクテリウム グルタミカムのシキミ酸キナーゼ遺伝子としては、aroK（例えば、配列番号205）が知られている。
　配列番号205と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつシキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は配列番号205と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつシキミ酸キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　シキミ酸キナーゼ活性は、公知の方法(Cheng, WC. et al., Structures of Helicobacter pylori shikimate kinase reveal a selective inhibitor-induced-fit mechanism. PLoS ONE. 7: e33481 (2012))に従って測定する。即ち、25℃において、100 mM トリス塩酸バッファー (pH 7.5)、50 mM KCl、5 mM MgCl2、1.6 mM シキミ酸、2.5 mM ATP、1 mM phosphoenolpyruvate、0.1 mM NADH、ピルビン酸キナーゼの粗酵素液、乳酸デヒドロゲナーゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼとのカップリング反応によって減少するNADHの340 nmの吸収をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターし、初速度から酵素活性を算出する。活性が検出される場合に、シキミ酸キナーゼ活性があると判定する。
3-デヒドロキナ酸シンターゼ活性の強化
　本発明の形質転換体は、宿主のコリネ型細菌に、さらに、3-デヒドロキナ酸(DHQ)シンターゼをコードする遺伝子を導入したものであることが好ましい。デヒドロキナ酸シンターゼは、DAHPの3-デヒドロキナ酸への変換を触媒する酵素である。
　導入する3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子の由来は特に限定されないが、4-ABAの生産効率が良い点で、コリネバクテリウム属細菌、特にコリネバクテリウム グルタミカムの3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子が好ましい。
　コリネバクテリウム グルタミカムの3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子としてはaroB（例えば、配列番号206）が知られている。
　配列番号206と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつデヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は配列番号206と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであり、かつデヒドロキナ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも使用できる。
　デヒドロキナ酸シンターゼ活性は、公知の方法 (Meudi, S. et al., Dehydroquinate synthase from Escherichia coli, and its substrate 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate. Methods. Enzymol. 142: 306-314 (1987))に従って測定する。即ち、33℃において、50 mMリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)、0.2 mM DAHP、0.2 mM NAD+、1 mM Cobalt(II) chloride・6H2O、3-DHQデヒドラターゼの粗酵素液からなる反応用混合液に被験酵素液を添加することで反応を開始し、3-DHQデヒドラターゼとのカップリング反応によって生成する3-DHSの生成を示す234 nmの吸収 (=12000/M・cm)をBeckman DU800 spectrophotometer (ベックマン・コールター社製)によってモニターする。33℃において、1分間に1 μmolの3-DHQが生成される活性を、1 unitのデヒドロキナ酸シンターゼ活性とし、活性が検出される場合に、デヒドロキナ酸シンターゼ活性があると判定する。
形質転換体のためのベクターの構築
　上記説明した導入遺伝子をPCRで増幅し、コリネ型細菌内で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
　プラスミドベクターは、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58－67699号公報〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及び〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム　グルタミカム　ATCC3058由来のpHM1519  〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム グルタミカム　T250由来のpCG4〔特開昭57－183799号公報〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕等が挙げられる。
　好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3－フォスフェートデヒドロゲナーゼＡ遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhA等が挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
　好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーター等が挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
形質転換
　形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気パルス法などがあげられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる（Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)）。
　形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、1種を単独で使用でき、または2種以上を混合してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1～10（w/v %）とすればよい。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウ化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ－アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、10（w/v %）とすればよい。
　無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、または炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.1～1（w/v %）とすればよい。
　栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられるが、通常、約0.1～10（w/v %）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のpHは約5～9が好ましい。
　好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
　培養温度は約15～45℃とすればよく、培養時間は約1～7日とすればよい。
（２）4-ABA又はその塩の製造方法
　上記説明した本発明の形質転換体を、糖類を含有する反応液中で培養又は反応させて4-ABA又はその塩を生産させる工程を含む方法により4-ABA又はその塩を製造することができる。
　糖類としては、グルコースが好適であるが、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれる。このような糖類としては、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。
　また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙などを糖化酵素などで糖化した、グルコースなどの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
微生物の増殖
　糖類を含む培地での培養、即ち反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25～38℃で、約12～48時間培養して増殖させることが好ましい。
培養用培地
　反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
　炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
　炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ－アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（w/v ％）とすればよい。
　栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のpHは約5～9が好ましい。
　具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
培養液又は反応液
　培養液又は反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
　炭素源としては、上記説明した糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液などを用いればよい。また、炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
　炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
　反応液中の原料化合物である糖類の濃度は、約1～20（w/v ％）が好ましく、約2～10（w/v ％）がより好ましく、約2～5（w/v ％）がさらにより好ましい。
　また、原料の糖類を含む全炭素源の濃度は、約2～5（w/v ％）とすればよい。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（w/v ％）とすればよい。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　反応液のｐＨは約5～9が好ましい。
　具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
培養条件又は反応条件
　培養温度又は反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約20～50℃が好ましく、約25～47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く4-HBAを製造できる。
　また、培養又は反応時間は、約1～7日間が好ましく、約1～3日間がより好ましい。
　培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
　反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。本発明の形質転換体自体の4-ABA生産能力は、好気的条件下の方が高い。しかし、好気的条件下では形質転換体が増殖するため、原料化合物が増殖のために消費され、その分、4-ABA製造効率が低下する。
　従って、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で反応を行うのが好ましい。本発明で増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避または抑制できる。
　また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため、原料化合物が増殖のために消費されない分、4-ABA製造効率が高くなる。
　還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約－200 mV～－500 mVが好ましく、約－150 mV～－500 mVがより好ましい。
　反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY　JAMES社製、ORP  Electrodes）を用いて測定できる。
　還元条件にある培養液又は反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate－reducing　bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and　Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書　第三巻、京都大学農学部　農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
　具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1～60分程度、好ましくは約5～40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
　また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
　これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
　還元条件下で反応させる場合は、反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
　上記のようにして培養することにより、培養液又は反応液中に4-ABA又はその塩が生産される。
　4-ABAの塩は、培地又は反応液の成分によっても異なるが、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）が挙げられる。
[参考例1]
生産物存在下においてコリネ型細菌が他の微生物より高い耐性を示すことの検証
　Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Streptomyces lividans, Pseudomonas putida, 及びSaccharomyces cerevisiaeについて、好気培養におけるパラアミノ安息香酸の増殖阻害実験を行った。なお、本試験に用いたPseudomonas putida S12は、これまでにパラアミノ安息香酸生産宿主として報告された例はないが、溶媒耐性菌として報告されておりパラアミノ安息香酸耐性に優れている可能性が考えられたため、比較用に用いた。
　Corynebacterium glutamicum R株を4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃で15時間暗所に静置した。上記のプレート上で増殖したコリネバクテリウム グルタミカムを4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて15時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したコリネバクテリウム グルタミカムを、4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.05となるように植菌し、同時にパラアミノ安息香酸が終濃度0, 100, 200, 300, 400 mMとなるように添加し、33℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。
　Escherichia coli JM109株をLB寒天培地 [1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、及び1.5%寒天] に塗布し、37℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したEscherichia coliをLB液体培地 [1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、及び0.5% 塩化ナトリウム] に植菌し、37℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したEscherichia coliをLB液体培地100 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.05となるように植菌し、同時にパラアミノ安息香酸濃度が終濃度0, 100, 200, 300, 400 mMとなるように添加し、37℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。
　Streptomyces lividans 1326株をLB寒天培地に塗布し、28℃、24時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したStreptomyces lividansをLB液体培地に植菌しコイルを加えて、28℃、24時間好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したStreptomyces lividansをLB液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.2となるように植菌しコイルを加え、同時にパラアミノ安息香酸濃度が終濃度0, 100, 200, 300 mMとなるように添加し、28℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。
　Pseudomonas putida S12株を前記LB寒天培地に塗布し、30℃、15時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したPseudomonas putidaを前記LB液体培地に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したPseudomonas putidaを前記LB液体培地100 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.05となるように植菌し、同時にパラアミノ安息香酸濃度が終濃度0, 100, 200, 300 mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610の吸光度を測定することにより行った。
　Saccharomyces cerevisiae W303株をYEPD寒天培地 [2%ポリペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース、及び1.5%寒天] に塗布し、30℃、20時間暗所に静置した。上記プレートで増殖したSaccharomyces cerevisiaeをYEPD液体培地 [2%ポリペプトン、1%酵母エキス、及び2% グルコース] に植菌し、30℃、13時間、好気的に振とう培養を行った。上記条件で増殖したSaccharomyces cerevisiaeを前記YEPD液体培地100 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.05となるように植菌し、同時にパラアミノ安息香酸濃度が終濃度0, 100, 200, 300 mMとなるように添加し、30℃にて好気的に振とう培養を行った。菌体の増殖は、OD610を測定することにより行った。
　培地中へのパラアミノ安息香酸添加による好気増殖への影響の解析結果を図1に示す。
　Escherichia coli JM109株は、100 mM パラアミノ安息香酸存在下で著しく増殖阻害を受け、300 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
　Streptomyces lividans 1326株は100 mM パラアミノ安息香酸存在下で著しく増殖阻害を受け、200 mMでは、ほぼ完全に増殖が阻害された。
　Pseudomonas putida S12株 (溶媒耐性として報告されていた株) は、驚いたことに100 mM パラアミノ安息香酸という低濃度でほぼ完全に増殖が阻害された。
　Saccharomyces cerevisiae W303株は、200 mMパラアミノ安息香酸によって増殖が強く阻害され、300 mMパラアミノ安息香酸で極めて強く増殖が阻害された。
　これに対して、Corynebacterium glutamicum R株は、Escherichia coli、Streptomyces lividans、Pseudomonas putida、及びSaccharomyces cerevisiaeの増殖がほぼ完全に阻害された300 mMのパラアミノ安息香酸存在下でも増殖可能であった。更に、Corynebacterium glutamicumは400 mMのパラアミノ安息香酸存在下でも増殖可能であり、ここには示さないが培養開始後24時間には200 mMパラアミノ安息香酸存在下における増殖と同等まで増殖した。
　このように、Corynebacterium glutamicumは、パラアミノ安息香酸生産宿主として報告のある他の微生物や代表的な溶媒耐性菌と比較して、パラアミノ安息香酸に対して高い耐性を有し、パラアミノ安息香酸生産の宿主として高い適性を有することが示された。
[参考例2]
生産物存在下においてコリネ型細菌が宿主として適していることの検証
（パラアミノ安息香酸による糖消費速度への影響）
　参考例1で示したようにCorynebacterium glutamicumは高濃度のパラアミノ安息香酸存在下でも増殖できる。ここではさらに、高濃度のパラアミノ安息香酸存在下でもグルコース消費速度への影響が極めて少ないことを以下の実験で示す。
　Corynebacterium glutamicum R株を用いて、パラアミノ安息香酸がグルコース消費速度に与える影響を以下に述べる方法によって検討した。
　野生株を2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。同株を2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100 mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で増殖した株の菌体を遠心分離 (4℃, 3000 × g, 10分) により集菌し、得られた菌体を、1000 ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、6%のグルコース、及び消泡剤 (ディスホームCB-442) 5 g/Lを含有する培養液 [(NH4)2SO4 21 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4. ・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 mL、0.02% (w/v) biotin solution 25 μL、0.01% (w/v) thiamine solution 2 mL、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] 600 mlにOD610 = 0.5となるように懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH 7.0 (5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.6 L/min (air、1 vvm)、DO 10%の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
　上記条件で増殖した株の菌体を遠心分離 (4℃, 5000 × g, 10分) により集菌し、菌体を0.9% 塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、100 g 湿菌体/L (培地体積あたり湿菌体重量として10%) となるように、5%グルコースと0または50 mMまたは100 mMまたは200 mMのパラアミノ安息香酸を含む250 ml反応液 [(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解] に懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンターを用いて33℃、pH 7.0 (5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.25 L/min (air、1 vvm)、DO（溶存酸素） 5%の条件においてグルコース消費速度を比較した。反応液中のグルコース濃度は前記グルコースセンサーを用いてモニターした。その結果を図2に示す。
　このように、Corynebacterium glutamicumは高濃度のパラアミノ安息香酸存在下でも糖消費速度はほとんど低下しなかった。参考例1と2を併せ、Corynebacterium glutamicumはパラアミノ安息香酸生産における宿主として際立って有用であることを示すことができた。
[実施例1]
4-ABA生産株の構築
（１）　染色体DNAの調整・入手
　4-ABA生産関連酵素遺伝子を取得するため、下記菌株から染色体DNAを調整または入手した。
　コリネバクテリウム グルタミカム （Corynebacterium glutamicum） R (FERM P-18976)、エシェリヒア コリ（Escherichia coli K-12 MG1655）、エシェリヒア フェルグソニ（Escherichia fergusonii NBRC 102419）、サッカロファガス デグラダンス（Saccharophagus degradans ATCC 43961）、シェワネラ ウッディ（Shewanella woodyi ATCC 51908）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans JCM 16027）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii ATCC 9104）、オクロバクトラム アンスロピ（Ochrobactrum anthropic NBRC 15819）、クロストリジウム ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii NCIMB 8052）、キセノルハブダス ボビエニ（Xenorhabdus bovienii ATCC 35271）、バチルス シュードフィルムス（Bacillus pseudofirmus JCM 9141）、バクテロイデス スライオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron JCM 5827）、フェリモナス バレアリカ（Ferrimonas balearica NBRC 104245）、エンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae NBRC 13535）、コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium callunae JCM 9489）、コリネバクテリウム エフィシエンス（Corynebacterium efficiens NBRC 100395）、コリネバクテリウム カゼイ（Corynebacterium casei JCM 12072）、コリネバクテリウム ウレイセレリボランス（Corynebacterium ureicelerivorans JCM 15295）、コリネバクテリウム アルジェントラテンス（Corynebacterium argentoratense JCM 10392）、コリネバクテリウム テルペノタビダム（Corynebacterium terpenotabidum JCM 10555））、ニューロスポラ クラサ(Neurospora crassa ATCC 36373）、ロドコッカス オパクス（Rhodococcus opacus ATCC 51881）、ロドコッカス オパクス（Rhodococcus erythropolis ATCC 27854）、ラルストニア　ユートロファ（Ralstonia eutropha IAM 12368)の染色体DNAは、菌株入手機関の情報に従って培養した後、DNAゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて調整した。
　アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis ATCC 29413D-5）、カウロバクター クレセンタス（Caulobacter crescentus ATCC 19089D-5）、シネココッカス種（Synechococcus sp. ATCC 27264D-5）の染色体DNAは、ATCCより入手した。
(２)  4-ABA生産関連遺伝子発現プラスミドの構築
　目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表1に示す。PCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いた。
　得られたDNA断片を、PgapAプロモーターを含有するクローニングベクター（pCRB207 [Hasegawa S et  al., Improvement of the redox balance increases L-valine production by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation conditions. Appl Environ Microbiol. 78(3):865-875 (2012)]、pCRB209 [国際公開 WO2012/033112]、pCRB210 [国際公開 WO2012/033112]、pCRB240）に導入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜pCRB240クローニングベクターの構築＞
　Corynebacterium glutamicum R株由来のグリセルアルデヒド－3－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするgapA遺伝子のプロモーター配列及びクローニングベクターpKK223-3（ファルマシア社製）由来rrnB T1T2双方向ターミネーター配列をpBL1 ori配列を含むベクターpCRB1 [J Mol Microbiol Biotechnol. 8(4):243-254 (2004)]に導入した。PgapA配列増幅には配列番号207及び208のプライマーを、ターミネーター配列の増幅には配列番号209及び210のプライマーを使用した。得られたPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターをpCRB240と命名した。pCRB204の構築に使用したプライマー配列は、配列番号207、208、209及び210である。
　導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表2に示す。尚、aroCとaroKとaroBは染色体上で連続して同じ向きに配置されているため、まとめてクローニングを行った(配列番号113）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミド（pCRB1 [NCBI GenBank : AB444682]、pCRB15 [NCBI GenBank : AB444683]）に、上記表１、表２に示す4-ABA生産関連遺伝子発現プラスミドからPgapAプロモーター融合酵素遺伝子断片を取得し導入した。得られた4-ABA生産関連遺伝子プラスミドを表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　エシェリヒア コリ内で共存可能なプラスミド（pSTV28 [タカラバイオ株式会社製]）に、上記表2で構築した4-ABA生産関連遺伝子発現プラスミドからPgapAプロモーター融合酵素遺伝子断片を取得し導入した。得られた4-ABA生産関連遺伝子プラスミドを表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
(３)  PABA生産関連遺伝子染色体導入株の構築
　PABA生産関連遺伝子をCorynebacterium glutamicum R株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なDNA領域を、Corynebacterium glutamicum R株の生育に必須でないと報告されている配列 [Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372 (2005)]（SSI領域）を基に決定した。このDNA領域PCR法により増幅した。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725 [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、（特開2006-124440）] に導入した。なお、pCRB260、pCRB263、pCRB265、pCRB266及びpCRB267は、インバース PCR法によりSSI領域に遺伝子を組み込むための制限酵素部位（ユニークサイト）を導入した。SSI領域の単離及びインバースPCRに用いたプライマー配列および得られた染色体導入用ベクターを表5に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ＊：インバースPCR法に使用したプライマー
　上述の染色体導入用プラスミドに、上記表2で構築した4-ABA生産関連遺伝子発現プラスミドからPgapAプロモーター融合酵素遺伝子断片を取得し導入した。得られた4-ABA生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドを表6に示す。
（４）　染色体遺伝子組換えによる4-ABA生産株の構築
　マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入したSSI領域と染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
　上記方法により、上述した4-ABA生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドを用いて4-ABA生産関連遺伝子染色体導入株を構築した。尚、本染色体遺伝子組換えの概要は、表7にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 aroG：Escherichia coli由来3－デオキシ－D－アラビノ－ヘプツロソネート－7－リン酸（DAHP）シンターゼ遺伝子(ここでは、配列番号112）の180番目のセリンをフェニルアラニンに置換した。
aroC：Corynebacterium glutamicum由来 コリスミ酸シンターゼ遺伝子
aroK：Corynebacterium glutamicum由来 シキミ酸キナーゼ遺伝子
aroB：Corynebacterium glutamicum由来 3-デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子
aroA：Corynebacterium glutamicum由来 3-ホスホシキミ酸 1-カルボキシビニルトランスフェラーゼ遺伝子(ここでは、配列番号114）
aroD：Corynebacterium glutamicum由来 3－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子(ここでは、配列番号115）
aroE：Corynebacterium glutamicum由来 シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ここでは、配列番号116）
ΔldhA：ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ破壊
(５)  4-ABA生産遺伝子発現プラスミド導入株の構築
　上述のpabAB遺伝子発現プラスミドをpabC遺伝子染色体導入株（ESani12）に、pabC遺伝子発現プラスミドをpabAB遺伝子染色体導入株（ESani41）に導入することにより4-ABA生産株を構築した。
　尚、本プラスミド導入株の概要は、表8及び表9にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表5に示した4-ABA生産関連遺伝子導入株にpabAB発現プラスミド(Pani198)を導入することにより、代謝経路を強化した4-ABA生産株を構築した。尚、本代謝経路強化4-ABA生産株の概要は、表10にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　上述のpabA発現プラスミドとpabBC発現プラスミドをCorynebacterium glutamicum R株に同時に導入することにより、4-ABA生産株を構築した。また、上述のpabAB発現プラスミドとpabBC発現プラスミドを同時に導入することにより、4-ABA生産株を構築した。尚、本4-ABA生産株の概要は、表11にまとめて示した。
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ANI 198は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託した（受託日：2016年1月6日、受託番号：NITE BP-02188）。従って、この株は、公に利用可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上述のpabAB発現プラスミドとpabC発現プラスミドをCorynebacterium glutamicum R株に同時に導入することにより、4-ABA生産株を構築した。また、上述のpabAB発現プラスミドとpabC発現プラスミドをEscherichia coli K-12 MG1655株に同時に導入することにより、宿主の異なる4-ABA生産株を構築した。尚、本4-ABA生産株の概要は、表12にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
[実施例2] (pabABとpabCの組み合わせ)
試験管での生産試験 (10 mLスケール)
　コリネバクテリウム グルタミカムR株のシキミ酸経路強化株である、ESani 33株をベースとして構築した、パラアミノ安息香酸生産株である、ANI 198株 (実施例1 (表10) 参照) を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるパラアミノ安息香酸生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　ANI 198株を終濃度50 μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA寒天培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに溶解] に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖したANI 198株を終濃度50 μg/mL カナマイシンと2%のグルコースを含んだA液体培地 [(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] 10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mL カナマイシンと4%のグルコースを含んだA液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.5となるように懸濁し、200 mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15,000 × g、5分) し、培養上清液を得た。培養上清液中の代謝物質濃度は、高速液体クロマトグラフィーシステム (Prominence HPLC装置 (島津製作所製)、COSMOSIL Packed column 5C18-AR-II、移動相に20%メタノール、0.07%過塩素酸を用いて分離) により分析した。その結果、同株は48時間後、40.1 mMのパラアミノ安息香酸を生産した。
[実施例3]
コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体によるジャーファーメンターでのパラアミノ安息香酸生産試験 (250 mLスケール)
(pabABとpabCの組み合わせ)
　コリネバクテリウム グルタミカムR株のシキミ酸経路強化株である、ESani 22株をベースとして構築した、パラアミノ安息香酸生産株である、ANI 198株 (実施例1 (表10) 参照) を用いて、ジャーファーメンターを用いた好気フェドバッチ反応におけるパラアミノ安息香酸生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　ANI 198株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地20 mlに植菌後、33℃で18時間、好気的に振盪培養を行った。
　ANI 198株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地100 mlに植菌後、33℃で12時間、好気的に振盪培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離 (4℃, 3000×g, 10分) により集菌し、得られた菌体を、1000 ml容量のジャーファーメンター培養槽内の、終濃度50 μg/mLカナマイシンと6%のグルコース、及び消泡剤 (ディスホームCB-442) 5 g/Lを含有する培養液 [(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 25 μl、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 gを蒸留水1 Lに溶解] 600 mlにOD610 = 0.5となるように懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンターにより33℃、pH 7.0 (5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.6 L/min (air、1 vvm)、溶存酸素濃度 (DO) 10% （大気圧下飽和溶存酸素濃度を100%として） の条件において18時間通気撹拌培養を行った。
　上記条件で増殖した菌体を遠心分離 (4℃, 5000 × g, 10分) により集菌し、菌体を0.9% 塩化ナトリウム水溶液で1回洗浄した後、100 g 湿菌体/L (培地体積あたり湿菌体重量として10%)となるように、7.2% グルコースを含む250 ml 反応液 [(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) Fe2SO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.01% (w/v) thiamine solution 2 mlを蒸留水1 Lに溶解] に懸濁し、1000 ml容量ジャーファーメンターを用いて33℃、pH 7.0 (5.0 N アンモニア水の添加により制御)、通気量0.25 L/min (air、1 vvm)、DO 5%の条件においてパラアミノ安息香酸生成反応を行った。なお、反応液中のグルコース濃度はグルコースセンサー (王子計測機器、BF-5i) を用いてモニターし、グルコースが枯渇する前にグルコースの追添加を行った。培養上清液中の代謝物質濃度は、前記の高速液体クロマトグラフィーシステムにより分析した。
　その結果を図3に示す。ANI 198株は、パラアミノ安息香酸生成反応開始48時間後に、186 mM (25.5 g/l)のパラアミノ安息香酸 （パラアミノ安息香酸生成速度 3.9 mM/h）を生成した。また、同株によるパラアミノ安息香酸生成反応時に菌体の増殖はほとんど認められなかった。これらの結果から、同株は、無機塩最少培地を用いる菌体増殖を伴わない反応プロセスにおいて、非常に高いパラアミノ安息香酸生産性を有することが示された。同株のパラアミノ安息香酸生産性は、糖からの発酵法による生産性としては、これまでに報告されている最も生産性の高いEscherichia coli組換え株の生産性35 mM (4.8 g/L) 48時間 (特許文献1, 非特許文献2)を大幅に上回った。
[実施例4] (pabAとpabBCの組み合わせ)
試験管での生産試験 (10 mLスケール)
　コリネバクテリウム グルタミカムR株をベースとして構築した、パラアミノ安息香酸生産株である、ANI 123株 (実施例1 (表11) 参照) を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるパラアミノ安息香酸生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　ANI 123株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖した同株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.5となるように懸濁し、200 mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15000 × g、5分) し、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりパラアミノ安息香酸の定量分析を行った。その結果、同株は48時間後、16.6 mMのパラアミノ安息香酸を生産した。
[実施例5] (pabABとpabBCの組み合わせ)
試験管での生産試験 (10 mLスケール)
　コリネバクテリウム グルタミカムR株をベースとして構築した、パラアミノ安息香酸生産株である、ANI 127株 (実施例1 (表11) 参照) を用いて、試験管を用いた好気バッチ反応におけるパラアミノ安息香酸生産実験を以下に述べる方法によって行った。
　ANI 127株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖した同株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 ＝ 0.5となるように懸濁し、200 mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15000 × g、5分) し、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりパラアミノ安息香酸の定量分析を行った。その結果、同株は48時間後、7.6 mMのパラアミノ安息香酸を生産した。
[実施例6]
様々な生物由来pabABのパラアミノ安息香酸生産に対する影響
　Corynebacterium glutamicum形質転換体によるパラアミノ安息香酸生産におけるpabAB遺伝子導入の効果を調べるため、ESani 12株をベースとして構築した複数種類の株についてパラアミノ安息香酸生産性を比較した。各株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖した各株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mLカナマイシンと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.5となるように植菌し、200 mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15000 × g、5分) し、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりパラアミノ安息香酸の定量分析を行った。
　結果を表13に示す。この結果から、コリネバクテリウム属由来のpabABの高発現によりパラアミノ安息香酸の生成量は増大することが示され、特にCorynebacterium callunae由来のpabABを用いた場合特に高い生産量を示すことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　表13に示される通り、pabABの由来により4-ABA生産量は大きく変動した。コリネバクテリウム属由来のpabABは概ね良好な4-ABA生産量を与えた。特に、コリネバクテリウム エフィシエンス、コリネバクテリウム カルナエ、コリネバクテリウム カゼイ由来のpabABを導入した形質転換体の4-ABA生産量が高かった。
[実施例7]
様々な生物由来pabCのパラアミノ安息香酸生産に対する影響
　Corynebacterium glutamicum形質転換体によるパラアミノ安息香酸生産におけるpabC遺伝子導入の効果を調べるため、ESani 41株をベースとして構築した複数種類の株について実施例6と同様の方法でパラアミノ安息香酸の生産性を比較した。結果を表14に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　表14に示される通り、Escherichia属、Saccharophagus属、Arthrobacter属、Anabaena属、Ochrobactrum属、Xenorhabdus属、Bacillus属、またはFerrimonas属由来のpabCの高発現によりパラアミノ安息香酸の生成量は増大した。
[実施例8]
代謝経路の強化と副生経路の遮断によるパラアミノ安息香酸生産性への影響
　Corynebacterium glutamicum形質転換体によるパラアミノ安息香酸生産における代謝経路の最適化の効果を調べるため、複数種類の株について実施例6と同様の方法でパラアミノ安息香酸生産性を比較した。
　ここではシキミ酸経路上の遺伝子を染色体上に追加した場合、および、副生経路遺伝子を破壊した場合の効果を比較した。結果を表15に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　表15に示される通り、シキミ酸経路の強化、副生経路の遮断を施すことによってパラアミノ安息香酸の生成量は増大した。
[実施例9]
4-ABA生産性に与える宿主の影響 (大腸菌とコリネ型細菌)
　宿主の違いによる4-ABA生産能力の違いを調べるため、コリネ型細菌と大腸菌それぞれに同じ生物種由来のpabABとpabCを導入し、4-ABA生産性を比較した。ここでpabABはCorynebacterium callunae由来のものを、pabCは大腸菌由来のものを用いた。
　コリネ型細菌の野生株をベースとして構築した生産株ANI 109 (実施例1 (表12)を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。上記のプレート上で増殖した各株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと2%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mLカナマイシンと5 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記A液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.5となるように植菌し、200 mgのCaCO3を加え33℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15000 × g、5分) し、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりパラアミノ安息香酸の定量分析を行った。
　大腸菌K-12 MG1655株の野生株をベースとして構築したANI 225 (実施例1 (表12)を終濃度50 μg/mLカナマイシンと50 μg/mLクロラムフェニコールを含んだ前記LB寒天培地に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。上記のプレート上で増殖した各株を終濃度50 μg/mLカナマイシンと50 μg/mLクロラムフェニコールと2%のグルコースを含んだ前記LB液体培地10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、37℃にて7-15時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖した各株を、終濃度50 μg/mLカナマイシンと50 μg/mLクロラムフェニコールと4%のグルコースを含んだ前記LB液体培地10 mlに初期菌体濃度OD610 = 0.5となるように植菌し、200 mgのCaCO3を加え37℃にて48時間、好気的に振とう培養を行った。48時間後の培養液を遠心分離 (4℃, 15000 × g、5分) し、得られた上清液について前記高速液体クロマトグラフィーシステムによりパラアミノ安息香酸の定量分析を行った。
　その結果、コリネ型細菌を宿主としたANI 109株の48時間後の培養上清中に含まれる4-ABA濃度は16.2 mMだった。これに対して大腸菌を宿主としたANI 225株の場合は検出限界以下だった。
　本発明方法によれば、微生物を用いて実用的な効率でグルコース等から4-ABA又はその塩を製造することができる。

Claims (21)

  1. 　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、パラアミノ安息香酸生産能を有する形質転換体。
  2. 　パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子がpabBである、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　さらに、パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項１に記載の形質転換体。
  4. 　(i)  パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabA、又は(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABが、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項３に記載の形質転換体。
  5. 　さらに、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項１に記載の形質転換体。
  6. 　(i)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、又は(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCが、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　さらに、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子が、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項３に記載の形質転換体。
  8. 　(i)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabBとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabAと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、(ii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabA、(iii)パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABと4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ酵素をコードする遺伝子pabC、又は(iv) パラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性とパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントII活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabABとパラアミノ安息香酸シンセターゼ コンポーネントI活性と4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸リアーゼ活性を持つ2成分酵素をコードする遺伝子pabBCが、宿主のコリネ型細菌に導入された、請求項７に記載の形質転換体。
  9. 　pabABがコリネバクテリウム属細菌、ニューロスポラ属細菌、又はロドコッカス属細菌の遺伝子である、請求項４又は８に記載の形質転換体。
  10. 　pabABがコリネバクテリウム カルナエ（Conynebacterium callunae）、コリネバクテリウム エフィシエンス（Conynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム カゼイ（Conynebacterium casei）、コリネバクテリウム グルタミカム（Conynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム ウレイセレリボランス（Conynebacterium ureicelerivorans）、コリネバクテリウム アルジェントラテンス（Conynebacterium argentoratense）、コリネバクテリウム テルペノタビダム（Conynebacterium terpenotabidum）、ニューロスポラ クラサ(Neurospora crassa)、ロドコッカス オパクス（Rodococcus opacus）、又はロドコッカス オパクス（Rodococcus erythropolis）の遺伝子である、請求項９に記載の形質転換体。
  11. 　pabCが、エシェリヒア コリ（Escherichia coli）、エシェリヒア フェルグソニ（Escherichia fergusonii）、サッカロファガス デグラダンス（Saccharophagus degradans）、シェワネラ ウッディ（Shewanella woodyi）、アースロバクター フェナンスレニボランス（Arthrobacter phenanthrenivorans）、アナバエナ バリアビリス（Anabaena variabilis）、アゾトバクター ビネランディ（Azotobacter vinelandii）、オクロバクトラム アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）、クロストリジウム ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、キセノルハブダス ボビエニ（Xenorhabdus bovienii）、バチルス シュードフィルムス（Bacillus pseudofirmus）、カウロバクター クレセンタス（Caulobacter crescentus）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、バクテロイデス スライオタオミクロン（Bacteroides thraiotaomicron）、又はフェリモナス バレアリカ（Ferrimonas. balearica）由来の遺伝子である、請求項６又は８に記載の形質転換体。
  12. 　pabBCが、ラルストニア属、カプリアビダス属、又はクロモハロバクター属細菌の遺伝子である、請求項６又は８に記載の形質転換体。
  13. 　pabBCが、ラストニア ユートロファ（Ralstonia eutropha）、カプリアビダス タイワネンシス（Cupriavidus taiwanensis）、又はクロモハロバクター サレキシゲネス（Chromohalobacter salexigens）の遺伝子である、請求項１２に記載の形質転換体。
  14. 　pabAがエンテロバクター属細菌の遺伝子である、請求項４又は８に記載の形質転換体。
  15. 　pabAがエンテロバクター クロアカエ（Enterobacter cloacae）の遺伝子である、請求項１４に記載の形質転換体。
  16. 　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項１～１５の何れかに記載の形質転換体。
  17. 　宿主のコリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである請求項１６に記載の形質転換体。
  18. 　宿主のコリネバクテリウム グルタミカムが、コリネバクテリウム グルタミカムR (FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC 13869である請求項１７に記載の形質転換体。
  19. 　コリネバクテリウム グルタミカム形質転換体ANI198（NITE BP-02188）。
  20. 　請求項１～１９のいずれかに記載の形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養して4-アミノ安息香酸又はその塩を生産させる工程を含む4-アミノ安息香酸又はその塩の製造方法。
  21. 　好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する請求項２０に記載の方法。
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