JPS62166890A - イソクエン酸デヒドロゲナ−ゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のイソ
クエン酸デヒドロゲナーゼ（以下しばしばＩ　ＣＤＨと
略す）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断
片を有する組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡを保
有する細胞に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌
は、大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られて
いる。またその変異株は、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イ
ノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産することが知ら
れている。

（従来の技術） 工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌につい
て、ＤＮＡ組換技術による育種改良が試みられている。

該細菌のＤＮＡ組換え技術による育種改良の重要な要素
として、該細菌のある特定の遺伝子を含んだＤＮＡ断片
がある。

今までに、グルタミン酸生産性コリネ型細菌では、次の
遺伝子がクローニングされている。

万円ら（昭和５８年、日本醗酵工学会大会講演要旨集Ｐ
、２８４）は、ブレビバクテリウム・ラフｄｅｈｙｄｒ
ｏｇｅｎａｓｅ　）遺伝子をクローニングした。９藤ら
（日本農大化学会昭和５９年度大会講演要旨集Ｐ、４３
１）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーホエノール
ピルピン酸カル？キシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ
ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　：ＰＥＰ
Ｃ）遺伝子をクローニングした。

勝亦ら（特開昭５８−１２６７８９）は、コリネバクテ
リウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｇｌｕｔａｍｌｃｕｍ　）　（ＡＴＣＣ２１５４３）
の５−（２−アミノエチル）−システィン耐性を支配す
る遺伝子と、ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖ
ｌｂａｅｔｅｒｌｕｍｆｌａｖｕｍ　）　（ＡＴＣＣ１
４０６７）のアンスラニル酸合成酵素（Ａｎｔｈｒａｎ
Ｉｌａｔｅ　ａｙｎｔｈｅｔａｇａ）遺伝子をクローニ
ングした。水上ら（日本農芸化学会昭和５９年度大会講
演要旨集Ｐ、２４９）は、コリネバクテリウム・グホス
ホリデシルトランスフェラーゼ（ＡＴＰ−Ｐｈｏａｐｈ
ｏｒｉ−ｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｇｅ　）遺伝子
をクローニングした。

三輪ら（％開昭５９−１９６０９８）は、プレビバ酸ホ
スホリゲシルトランスフェラーゼ（Ａｎｔｈｒａｎｉ　
１ａｔｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉ　ｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｇ
ｆｅｒａａ＊　）遺伝子をクローニングした。佐野ら（
％開昭５９−２１０８８７）は、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム（Ｂｒｓｖｉｂａｅ−ノピメリン
酸脱炭酸酵素（ｍｅａｏ　−２，６−ｄｉ　ａｍｉ　ｎ
ｏｐｉｍｅ　１ａｔｅｃａｒｂｏｘｙ−１７ａａｓ　）
遺伝子をクローニングした。

中森ら（特開昭６Ｏ−６２９８３）は、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｌｂａｃｔｅｒ
ｌｕｍゼ（Ｈｌｓｔｉｄｌｎｏｌ　ｐｈｏａｐｈａｔａ
ｓ＊　）遺伝子をクローニングした。中森ら（偶開昭６
Ｏ−６２９８２）は、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｉｎａｇ
ｅ　）遺伝子をクローニングした。中森ら（特開昭６０
−６６９８４及び６Ｏ−７００９３）は、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉ６ｍｕｔａｓｅ　）βサブユニツト遺伝子をクロー
ニングした。

（発明が解決しようとする問題点） 生合成に還元反応があるとき、利用される補酵素は、殆
んど例外なく還元型ニコチンアミドヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）である。ＮＡＤＰＨが利用される反応に
は、例えば、長鎖脂肪酸の生合成、不飽和脂肪酸の形成
、ダルコースからソルビトールへの変換、ジヒドロ葉酸
からテトラヒドロ葉酸への還元、グルクロン酸からＬ−
グロン酸への変換、２．５−ジケトグルコン酸から２−
ケトーＬ−グロン酸への還元、α−ケトグルタル酸とア
ンモニアからのＬ−グルタミン酸の生成がある。ニコチ
７７ミドヌクレオチドリン酸に特異的なＩ　ＣＤＨは、
この重要なＮＡＤＰＨを供給する反応を触媒している。

従って、工業的に有用な細菌に目的物質を生合成させる
場合に、その細菌のＩ　ＣＤＨ活性を強化することがで
きればその細菌内のＮＡＤＰＨの関与する還元反応を促
進することができ、その結果その細菌による目的物質の
生合成の効率を高めることができる。

しかし従来ニコチンアミドヌクレオチドリン酸に特異的
なＩ　ＣＤＨの活性を強化する有効な手段が見い出され
ていなかりた。

（問題を解決する為の手段および作用）本発明者らは、
上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌より、該菌種のＮＡＤＰＨ％異
的Ｉ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離するこ
とに成功し、該ＤＮＡ断片を用いた遺伝子操作によυ、
グルタミン酸生産性コリネ型細菌や有用物質生産菌を形
質転換することによシ、これらの細菌のＮＡＤＰＨ％異
的ＩＣＤＨ（以下、特に規定がない限υ単にＩＣＤＨと
略す）活性を増強できることを見出した。これらの知見
によシ、本発明者らは、本発明を完成するに到った。

即ち、基本的には、本発明によれば、グルタミン酸生産
性コリネ型細菌由来のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が提供される。

また、本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のＩＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と細胞内
での自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含有
する組換え体ＤＮＡが提供される。

更にまた本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型
細菌由来のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と細
胞内での自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断
片とを含有する組換え体ＤＮＡを保有する細胞が提供さ
れる。

グルタミン酸生産性コリネ型細菌とは、ダラム染色陽性
、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求
するコリネ型細菌である。また該細菌は、ビオチン制限
培地で、または高濃度ビオチン含有培地では、界面活性
剤等の添加によシ、培地中にＬ−グルタミン酸を著量蓄
積する。

グルタミン酸生産性コリネ型細菌のＩＣＤＨ産生遺伝子
を含むＤＮＡ断片の分離には、大腸菌の宿主ベクター系
を用いることができる。尚、該ＤＮＡ断片の分離には、
グルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主ベクター系を用
いることも可能である。大腸菌の宿主ベクター系として
は、エシェリヒア・コリＫ　１２　（Ｅｇｅｈｅｒｉｃ
ｈｌａ　ｃａｌｆ　Ｋ１２　）の変異株を、ベクターと
しては、該細菌の公知のプラスミドを用いた宿主ベクタ
ー系があげられる。以下グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のｉ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離
について詳細に説明する。

（１）　　グルタミン酸生産性コリネ型細菌の菌体より
、全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断する。全ＤＮＡの
抽出は、通常用いられている方法（リゾチウム・ＳＤＳ
処理とフェノール・クロロホルム処理）によシ行うこと
ができる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、
上記細菌の全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に使
用する大腸菌ベクターの開裂に用いることができる制限
酵素であれば、いずれも使用可能である。この除用いる
制限酵素が、目的遺伝子の内部を切断するかどうかは事
前に不明なので、適当な条件で制限酵素を弱く作用させ
、ＤＮＡを部分的に分解することによυ、目的遺伝子を
完全に含む様な適当な大きさのＤＮＡ断片が得られる。

（２）　　ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させ
る。ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な
制限酵素を充分作用させることによシ行なう。

（３）　　ベクターＤＮＡの開裂部位に（１）で得たＤ
ＮＡ断片を組み込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡをつく
る。

ることかできる。

（４）組換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に移入する。宿主と
なる大腸菌は、目的遺伝子をクローニングした場合宿主
の表現型に変化が現れるものであれば、いずれでも用い
ることができる。一般には、その様な変異株を使用する
必要がある。Ｉ　ＣＤＨ産生遺伝子をクローニングする
場合には、宿主となる大腸菌は、Ｉ　ＣＤＨ活性を欠損
している必要がある。ＩＣＤＨ活性を欠損している大腸
菌はグルタミン酸を生育の為に要求するが外来のＩ　Ｃ
ＤＨ産生遺伝子を担うＤＮＡ断片が移入されると、その
宿主は、グルタミン酸を生育の為に要求しなくなり、外
来のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を担うＤＮＡ断片が移入され
ていない上記大腸菌と識別することができる。

大腸菌でＩ　ＣＤＨ欠損株を育種する場合には、大腸Ｉ
をＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロングアニジン
（Ｎ　−Ｍｅｔｈｙｌ　−Ｎ’　−ｎ１ｔｒｏ　−Ｎ−
ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉ出ｎｅ。

ＮＴＧ　）を用いて、常法通シ変異処理し更に常法通９
にＬ−グルタミン酸要求株を分離し、それらの酵素活性
測定試験を経て、Ｉ　ＣＤＨ欠損株を取得することがで
きる。ＮＴＧ変異の代シに、他の公知の変異誘導法〔例
えば、紫外線照射、Ｘ線照射、その他の変異誘起剤処理
、トランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　）処理〕を
用いることもできる。また、研究者や公的機関より分譲
されたＩ　ＣＤＩ（欠損株を使用することもできる。

宿主に選定した大腸菌が、制限能を有している場合には
、その宿主大腸菌にベクターＤＮＡを一旦移入し、得ら
れた形質転換株よシ調製したベクター６２（１９７０）
）によって行なうことができる。

（５）組換え体ＤＮＡを移入された大腸菌の中から目的
遺伝子を有する１株を選択分離する。上記の工程によっ
て得られる大腸菌の中で、目的遺伝子を有するものは、
ごくわずかなので、目的とする菌株を選択する必要があ
る。−次選択方法としては、目的遺伝子が移入された菌
株の表現型の変化を検出できる培地で、前記（４）で得
られた菌体を、常法通シ培養する。その結果、予定の変
化の現れた菌体を選択分離することができる。前記の宿
主でＩ　ＣＤＨ産生遺伝子をクローニングする場合には
、グルタミン酸無添加合成培地上で生育する菌株を選択
する。

最終的に目的遺伝子をクローニングした菌株を選択する
には、目的遺伝子の産物の有無を調べる。

その結果によシ、目的の菌株が選択できる。目的遺伝子
が酵素遺伝子の場合には、その酵素活性を測定する。ｒ
ｃＤｕ、を生遺伝子をクロー二／グする場合には、グル
タミン酸無添加培地で生育した菌株について、それらの
細胞抽出液を用いて、常法によ、９　ＩＣＤＨ活性を測
定する。その結果、ＩＣＤＨ活性の回復した形質転換株
を選択分離し該株を培養することによｆｉ　ＩＣＤＨ産
生遺伝子を分離することができる。

上述のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片は、次の
様にして分離することができる。先づ該ＤＮＡ断片を含
有する組換体ＤＮＡを制限酵素で処理して、ベクターＤ
ＮＡと１ｃＤＩ（産生遺伝子を含むＤＮＡ断片とに切断
し、次にこれらの制限酵素処理試料を、アガロースゲル
電気泳動に供する。アガロースダル電気泳動上でベクタ
ーＤＮＡ断片とＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
とを充分分離する為には、該ＤＮＡ断片を含有する組換
え体ＤＮＡを複数の制限酵素で処理する必要がある場合
もある。目的の分子の長さを有するＤＮＡ断片を含むア
ガロースゲルを切り出し、それぞれのアガロースゲルを
溶かした後、フェノール抽出、フェノール・クロロホル
ム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱によｐ　、
　ＩＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離すること
ができる。

ＩＣＤＩ（産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の一つの例とし
て、たとえば下記の特徴を有するＤＮＡ断片が挙げられ
る。

（１）約５．１キロベースの分子の長はを有する。

（２）制限酵素ＥｃｏＲＩによって生じる一本鎖末端を
両端に有する。

（３）下記の制限酵素切断部位（以下、しはしは単に「
制限部位」と略す）を有する： （制限酵素）　　　　　　　（切断部位数）ＢａｍＨｌ
　　　　　　　　　　　　２ＥｃｏＲｉ　　　　　　　
　　　　　０Ｈｉｎｄｌ　　　　　　　　　　　　３Ｐ
ｓｔ　ｌ　　　　　　　　　　　　　７ＳａｔＩ　　　
　　　　　　　　　Ｉ Ｘｂａｉ　　　　　　　　　　　　　１制限酵素による
切断部位は、過剰の制限酵素存在下でＩ　ＣＤＨ産性遺
伝子を含むＤＮＡ断片を有するグラスミドを完全消化し
、それらの消化物を１％アガロースゲル電気泳動および
４チポリアクリルアミドダル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定される。分子の長さは、アガロース
ゲル電気泳動の場合には、大腸菌のラムダファーノ（λ
ｐｈａｇｅ　）のＤＮＡを制限酵素Ｈ１ｎｄ　Ｉで消化
して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アがロース
ダル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、またポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の場合には、大腸菌の２
アイ・エックス１７４フアージ（φＸ１７４ｐｈａｇｅ
　）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅｌで消化して得られる分
子の長さ既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドダ
ル上での泳動距離で描かれる標準＃に基づき、消化プラ
スミドｐＡＧ　３０２の分子量を算出する。複数の断片
を生じる場合には、それぞれの分子の長さを加算して求
める。

上記プラスミドに対する前記制限酵素の相対的な切断部
位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で解析することによシ、決めることができる
。このようにして得られるＩＣＤＨ産生遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片は必要に応じて縮小化することができる。縮小
化は該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で部分的に消化する
ことによシ行なうことができる。本発明のＤＮＡ断片は
そのような、ＩＣＤＨ産生遺伝子を含む縮小化されたＤ
ＮＡ断片をも包含する。

縮小化によって得られるＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片の例としては、例えば、分子の長さが約３．４
キロベースであるＤＮＡ断片があげられる。こＡ４キロ
ベースの分子の長さをもつＤＮＡ断片は、下記の特徴を
有する。

（１）約３．４キロベースの分子の長さを有する。

（２）　　制限酵素ＥｅｏＲＩによりて生じる一本鎖末
端を一端に、そして制限酵素５ａｌｌによって生じる一
本鎖末端を他端に有する。

（３）下記の制限酵素切断部位を有する：（制限酵素）
　　　　　　（切断部位数）ＢａｍＨｌ　　　　　　　
　　　　Ｉ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　　０ Ｈ１ｎｄｌ　　　　　　　　　　　３ Ｐｓｔ　Ｉ　　　　　　　　　　　　５Ｓａｔｉ　　　
　　　　　　　　　０ Ｘｂａｌ　　　　　　　　　　　　１ 現在の遺伝子操作技術では、制限酵素切断部位をなくし
たυ、他の制限酵素切断部位に変更したシする等、ＤＮ
Ａ断片の一部を変更することは容易である。従って、そ
の様に一部を変更したＤＮＡ断片でありても、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌由来のＩ　ＣＤＨ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含まれることは
明白である。例えば、上述の約３．４キロベースのＤＮ
Ａ断片については、５ａＬＩ　　リンカ−を利用するこ
とによシ該断片のＥｃｏＲＪによる切断端を、５ａｉｌ
によりて生じる一本鎖末端に変更することができる。こ
のようにして得られる約３．４キロベースの５ＩＬｔＩ
ＤＮＡ断片は、次の性質を有する。

（１）　　約３．４キロベースの分子の長さを有する。

（２）　　制限酵素５ａｔ（によって生じる一本鎖末端
を両端に有する。

（３）下記の制限酵素切断部位を有する：（制限酵素）
　　　　　　（切断部位数）ＢａｍＨｌ　　　　　　　
　　　Ｉ ＥｅｏＲｌ　　　　　　　　　　Ｏ Ｈ１ｎｄ　ｌ　　　　　　　　　　　３Ｐｓｔｌ　　　
　　　　　　　　５ Ｓａｔ（０ ＸｂａＪ　　　　　　　　　　　１ 本発明の組換え体ＤＮＡは、イソクエン酸産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片（４）と細胞内での自律複製に必要な遺
伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）を含有する。インク二ン酸
産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（４）と自律複製に必要な
遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とは直接または他の種類
のＤＮＡを介して間接的に結合している。ＤＮＡ断片（
４）としては、前述の本発明のＤＮＡ断片を用いる。Ｄ
ＮＡ断片（Ｂ）としては、公知の宿主−ベクター系で用
いられるプラスミド、例えば、大腸菌の宿主−ベクター
系で用いられるプラスミドおよびグルタミン酸生産性コ
リネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるグラスミド
などを用いることができる。大腸菌の宿主−ベクター系
で用いられるシラスミドとしては例えばプラスミドｐＢ
Ｒ３２５及びグラスミドｐＢＲ３２５由来のプラスミド
などが挙げられる。グルタミン酸生産性コリネ型細菌の
宿主−ベクター系で用いられるプラスミドとしては例え
はグラスミドｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡＧ　１４、ｐＡ
Ｇ　５０及びそれらのシラスミド由来のプラスミドなど
が挙けられる。プラスミドｐＡＧ１、ｐＡＧ　３　、　
ｐＡＧｌ　４及びｐＡＧ　５０は後述の方法によシ調製
することができる。プラスミドｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐ
ＡＧｌ４及びｐＡＧ　５０はそれぞれ第４図、第５図、
第６図及び第７図に示す制限酢紫地図で表される。本発
明の組換え体ＤＮＡは公知の宿主−ベクター系を用いて
作成することができる。例えば大腸菌の宿主−ベクター
系、枯草菌の宿主−ベクター系及びグルタミン酸生産性
コリネ型細菌の宿主−ベクター系などを用いて本発明の
組換え体ＤＮＡを作成することができる。

本発明の組換え体ＤＮＡとしては、例えば、ｐＡＧ３０
２、ｐＡＧ　３０３、ｐＡＧ３１１％ｐＡＧ　３００１
などがあげられる。組換え体ＤＮＡ　ｐＡＧ　３０２、
ｐＡＧ　３０３、ｐＡＧ３１１は、Ｉ　ＣＤＨ産生遺伝
子を含む上述のＤＮＡ断片を、大腸菌のベクタープラス
ミドＰＢＲ３２５又はｐＢＲ３２５由来のグラスミドに
組込んだ複合グラスミドである。組換え体ＤＮＡ　ｐＡ
Ｇ　３００１は、Ｉ　ＣＤＨ産生遺伝子を含む上述のＤ
ＮＡ断片を、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラス
ミドｐＡＧ５０に組込んだ複合プラスミドである。

テζト”σケ°′す一七゛ 本発明の細胞は、細菌とインク１７ｍＮ”Ｅ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡとを含有する。

該組換え体ＤＮＡは該細菌の中に保有されている。

のグルタミン酸生産性コリネ型細菌を挙げることができ
る。

本発明の細胞は通常の公知の組換えＤＮＡ技術を用いて
該細菌を該組換え体ＤＮＡで形質転換することによυ製
造することができる。

本発明の細胞としては、例えば、宿主を大腸菌とした場
合には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｌａ
ｃａｌｌ　）　Ｋ１２　ＥＢ　１０６　（ｐＡＧ３０２
　）　、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｌ　）Ｋｌ　２　ＥＢ　１０６　（ｐＡＧ３０
３　）、ＥＢ１０６（ｐＡＧ３１１）　　などがあけら
れ、宿主をグルタミン酸生産性コリネ型細菌とした場合
には、ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌｍ）　８０１　（ｐＡＧ３
００１　）などがあけられる。

ｍｅｌａｓｓｅｅｏｌａ　）’　８０１は、土壌よシ新
たに分離された菌株であシ、微生物工業技術研究所に寄
託番号第微工研条寄第５５８号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５５
８）の下に寄託されている。

以下実施例によシ本発明の詳細な説明するが本発明はこ
れに限定されるものではない。

（＞ｉ下京ｆ３） （実施例） 実施例１ 本実施例は、コリネバクテリウム・メラセコラ８０１　
（Ｑｕと江、ｃｔｓｒｌｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅａｏ　ａ
　８０１　）　（微工研条寄第５５８号）　？　ＤＮＡ
供与体として、該菌株のＩＣＤＨ産生遺伝子を、大腸菌
の宿主ベクター系全利用してクローニングしｔ例である
。大腸菌宿主としては、エシェリヒア・コリに１２ＥＢ
１０６（Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｌｌＫｌ　２　
ＥＢ１０６）　ｋ用い、大腸菌ベクターとしては、ベク
ターｐＢＲ３２５ｔ−用いた。

コリネパクテリウＡ−メラセコラ８０１　（Ｃｏｒ　ｎ
＠ｂａｃｔｅｒｉｕｍｍ＠１ａａｓｅｃｏｌａ８０１　
）は、微生物工業技術研究所に微工研条寄第５５８号と
して寄託されている。エシェリヒア・コリＫ　１２　Ｅ
Ｂ　１０６　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　　ｃｏ旦に１
２　ａｇｔｏｓ）はイー・コリジエテイツク　スト３３
３３　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｅｔｌｃｕｔ　
０６５１０Ｕ、Ｓ、Ａ）のパーパラ　ジェイ　バックマ
ン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ、Ｂａｃｈｍａｎｎ）より分譲
され九菌株である。尚、上記機関からはだれでも該菌株
の分譲をうけることができる・ベクターｐＢＲ３２５は
、ペゼスダ・リサーチ・ラボラトリ−社（米国）より購
入した。

（１）　　コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（Ｃ
ｏｒ　ｎ＊ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｌａｓｓｅｃｏｌ
ｍ）　（微工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡ　ｕ調
製とその切断。

糖蜜培地（ビート廃糖蜜８０　Ｋｌｌ、　ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２００，５ｇ／ｌ、尿素８　ｇ／ｌ、リン酸１．５
　ｖ；／ｌ、　ｐＨ６，２に調艷後１２０℃１５分間殺
菌する。）１００ｍｔに、コリネバクテリウム・メラセ
コラ８０１　（Ｃａｒ　ｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌ
ａｓ＠ｅｃｏｌａ　８０１　）　（微工研条寄第５５８
号）を植菌し、３２℃にて一晩振とり培養し友。得られ
次培養液より菌体全集め、洗浄した後、１０　ｍＭ　ト
リス（Ｔｒｌｓ　）　−ＨＣＩ　（ｆ　８．０　）、１
　ｍＭＥＤＴＡの緩衝液８　ｍｌに懸濁し文。これにリ
ゾチウムを最終濃度５ｍ９７ｍＡになるように加え、３
７℃にて４時間反応させ几。これにプロナーゼＥ（シグ
マ社より購入）全最終濃度２００μｇ　／　ｍＬになる
ように加え、室温で１５分間反応させた。その後、ドデ
シル硫酸ナトリウム金最終濃度１係になるように添加し
て３７℃にて１時間反応させ九。反応終了後、反応液と
等容のＴＮＩ緩衝液Ｃ５０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）　
−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００　ｍＭ　ＮａＣ
１、ＰＩ−１８，０］で飽和し次フェノールヲ加え混合
し几後、　１０．００Ｏｒｐｍ（１１，０００ｇ　）で
１０分間遠心分離して水層を回収し友。この水層ニフェ
ノール・クロロホルム（１：１、Ｖ　／　Ｖ　）液七等
容加えて混合の後、１０．００Ｏｒｐｍ（１１，ＯＯＯ
ｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収し九〇この水層
に更に等容のクロロホルムを加えて混合の後、１０．０
０Ｏｒｐｍ（１１，ＯＯＯｇ）で１０分間遠心分離して
水層を回収し友。この水層にリボヌクレア−ンクシグマ
社、米国より購入）を最終濃度４０μｇ／ｍＡになる様
に加えて３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、１
１５容の５　Ｍ　Ｎ＆Ｃ１水溶液と１／４容の５０チポ
リエチレングリコール６，０００水溶液を添加混合し、
４℃にて４時間保持し友。得られ几試料を５．ＯＯＯｒ
ｐｍ　（２，７００ｇ）で２０分間遠心分離し、沈殿全
回収し比。沈殿全ＴＥ緩衝液〔１０ｒｒＬＭトリス（Ｔ
ｒｉｍ）　−ＨＣＩ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，
５］　４　ｍｔｉＣ溶かし、酢酸ナトリウムを最終濃度
３００ｍＭになるように加えて、２倍容のエタノール金
添加しｔ０得られ九混合物を攪拌の後、−３０℃にて３
時間保持し、１．０．０００ｒｐｍ（１１，ＯＯＯｇ）
で２０分間遠心分離し、沈殿を回収しｔ０得られ文沈殿
を減圧乾燥の後、ＴＥ緩衝液２ｍＬＶｃ溶解し、ＤＮＡ
濃度０．８５　ｍｇ／ｍｔの全ＤＮＡ濯液を得文。

全ＤＮＡの切断の九めには、４０μｇの全ＤＮＡに対し
て、１６０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　（ニラポンジー
ン社工り購入）を加え、　５０　ｍＭ　）、ｒソ入−Ｈ
Ｃｌ　（ｐｉ（７，４’）、１０　ｒｎＭｉ　Ｍｇ５Ｏ
ａ、１００　ｍＭ　ＮａＣｌの緩衝Ｗ　７　ＯｐＬ中で
３７℃にて３０分間反石窟せ九〇その後７０℃で１０分
間加熱して反応全停止させ友。

（２）　　ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂先ス、ベ
クターｐＢＲ３２５”（ｊエシェリヒア・コリ　Ｋｌ　
　２　　ＥＢ　１０６　　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｉｌ　　Ｋ１２　　ＥＢ１０６）に移入し、得ら
れ比形質転換株からｐＢＲ３２５ｋ調製し文。エシェリ
ヒア・コ１ＪＫ１２　　ＥＢ１０６（Ｅ＋５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　Ｋｌ　２　ＥＢ１０６）　ｋ　５
０ｍｔのＬ−プロス（ポリペプトン１０　ｇ／ｌ、酵母
エキス５　ｇ／Ｌ、　Ｎａ（！１５　ｇ／ｌ−ＰＬ（７
，２）に植菌し、３７℃にて菌濃度５Ｘ１０個／ｍＡま
で増殖させ友後、２℃で集菌し次。該菌体ｆ　５０　ｍ
ｔの氷冷し７？−１００ｍＭＭｇＣｌ□水溶液に懸濁し
、集菌後更に２５　ｍｔの氷冷１００　ｍＭ　ＣａＣ１
□水溶液に懸濁し、水中で１時間保持し友〔コンピテン
トセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃ・１１）〕。この菌懸
濁液２００μｔｉｃｏ、ｉμｇのｐＢＲ３２５ＤＮＡ全
添加して、水中で１時間保持し友。その後４２℃にて２
分間保持しｔ後、５　ｍＡのし一ブロス全添加して、３
７℃にて９０分間靜装培養した。得られ几培養液全適当
に希釈して、３０μｇ／ｍ’Ｌのアンピシリンを添加し
７ｔＬ−寒天培地（Ｌ−プロスに１５ｇ／ｌの寒天全添
加し几培地）Ｋ塗布し３７℃で一晩培養し几。得られた
ｐＢＲ３２５による形質転換株より、以下のようにして
該ベクターの調製全行っ九ゆベクターｐＢＲ３２５ｋ保
持し友エシェリヒア・コ　リ　Ｋ　１　２　　ＥＢ　１
　０６　　（Ｅｓｃｈｅｒｌａｈｉａ　　ｃｏｌｔ　　
Ｋ１２　　ＥＢ１０６）を、アンピシリン（３０μｇ／
ｍＡ　）　ｋ含むＬ−プロス１００　ｍＡに植菌し、３
７℃にて一晩振盪培養し友。

得られｔ培養液より集菌しＴＥ緩衝液で洗浄後、１５チ
シユークロース、５０　ｍＭ　トリス（Ｔｒｉｇ）　−
ＨＣＩ（ｐＨ８，５）、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍｇ
／ｍｔリゾチウム（シグマ社、米国より購入）よりなる
水溶液２　ｍｔに懸濁し、室温にて３０分間反応させ几
。次にトリトン（Ｔｒｔｔｏｎ　）溶液［０，１％トリ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，５０ｍＭ）リス（Ｔ
ｒｉｍ）　−ＨＣＩ、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８
，５）　２　ｍＡ　ｋ加えて３７℃にて３０分間保持し
九〇次にこのＳｇｔ。

５℃にて３０，０００ｒｐｍ（６４，０００ｇ）で１時
間遠心分離し上清を回収し、ＴＥ緩衝液を加えて１８ｍ
ｔとし念。この液に、１０　ｍｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロマイド水溶液１．２ｍｔと塩化セシウム１８．６４ｇ
とを加えて静かに溶解し、４０，０００ｒｐｍ（１００
，０００ｇ　）、１５℃で４８時間遠心分離し几。ベク
ターｐＢＲ３２５は、紫外線照射により遠心チー−プ中
、２本のバンドの下方として見い出され、このノ々ンド
を遠心チー−ブの側面から注射器で抜き取ることにより
、ベクターｐＢＲ３２５’ｉ分離し次。次にこの分画液
に等容量のイソプロピルアルコールで４回抽出して、エ
チジウムブロマイドを除去し、その後にＴＥ緩衝液に対
して透析して、　ＤＮＡ濃度１８０μｇ／ｒｎＬのベク
ターｐＢＲ３２５の透析完了液１ｍｔ’ｌｉ得几。

ベクターｐＢＲ３２５ＤＮＡ　１５μｇに対して４５単
位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　ｋ加えて、５０ｒｒＩＭトリ
ス（Ｔｒｉｍ）−ＨＣｌ　（ｐＨ７−４）　１０　ｒｎ
Ｎｆ　Ｍｇ　Ｓｏ　ａ、１００　ｍＭ　ＮａＣ１の緩衝
液１５０μを中で３７℃にて２時間反応させ友。その後
、７０℃で１０分間加熱して、反応全停止させ几。この
液に酢液す）　ＩＪウムを最終濃度３００ｍＭになる様
に加え、２倍容のエタノール全添加して、−３０℃にて
３時間保持し友０次に１２，０００　ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、同
沈殿を減圧乾燥し比ゆ得られｔ試料七ＢＡＰＴ緩衝液（
５０ｍＭ）’す又−ＭＣＩ、　ｐ）１８．４　）　２０
０１ｔｔに溶解し、バクチリアル・アルカリ・ホスファ
ターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈ
ｏａｐｈ＊ｅ）　（宝酒造株式会社より購入）全１単位
添加して６５℃にて３０分間反応させた。更に該酵素を
１単位添加して、６５℃で３０分間反応させ几。その後
、反応液に等容のＴＮＥ緩衝液で飽和し次フェノールを
加え、混合した後、１２，０００ｒｐｍ（８，９００Ｉ
）で１０分間遠心分離して水層を回収し、更にもう一回
同じ操作を繰シ返した。次に水層に等容のフェノール・
クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）液を添加して混合した
後、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００，ｌｉ’）で１０
分間遠心分離し、水層を回収した。更に水層に等容のク
ロロホルムを添加して攪拌した後、１２，０００ｒｐｍ
（８，９００Ｉ）で１０分間遠心分離し、水層を回収し
た。該水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭにな
る様に加え、２倍容のエタノールを添加し攪拌した後、
−３０℃にて３時間保持した。

その後、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００，９）で１０
分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収した。これを減圧乾
燥した後、３０μｌのＴＥ緩衝液で溶解した。

（３）　ＤＮＡの組換え反応 前記実施例１−　（１）のＤＮＡ　４μｇと前記実施例
１−（２）のＤＮＡ　２μｙと３単位のＴ４７アージＤ
ＮＡリガーゼにツポンジーン社よシ購入）とを、　５０
ｍＭトリス（Ｔｒｉｇ）−ＨＣＬ　　（ｐＨ７，４）　
　、　１０　ｍＭＭｇＣｔ２．１０ｍＭジチオトレイト
ー＃　（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ｍＭスペ
ルミノン（Ｓｐｅｒｍｉｄｌｎｅ　）、１　ｍＭ　ＡＴ
Ｐ　。

０．１ｍ９／−ウシＨ血Ｍｏｖｉｎ＠ｓｅｒｕｍ　ａｌ
ｂｕｍｉｎ　。

以下ＢＳＡと称す）（ペゼスダリサーチラがラトリー社
、米国よシ購入）の緩衝液Ｚｏｏμ！中で、１５℃にて
一晩反応させた。その後、７０℃にて１０分間加熱する
ことによシ、反応を停止させた。

（４）組換え体プラスミドの大腸菌への移入前記実施例
１−（２）の方法によシ、エシェリヒア・コ　　リ　　
Ｋ１２　　　　ＥＢ１０６　　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　　ｃａｌｔ　　　Ｋ１２ＥＢ１０６　）のコンピ
テントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）をル、ｌ
ｌ磐した。得られた細胞懸濁液４００μｌと前記実施例
１−（３）の反応液４０μ！とを混合して、水中に１時
間保持した。その後、４２℃にて２分間加熱した後、５
ｄのＬ−プロスを添加して３７℃にて９０分間靜置場養
した。次に、得られた培養液から集菌し、無菌水に懸濁
した。得られた懸濁液を、合成寒天培地（Ｎａ　２ＨＰ
０４６Ｆ／’、ＫＨ２ＰＯ４３９／ｌ、ＮａＣｔｏ、５
Ｅ／ｌ　、　ＭＨ４ＣＬ　１１／ｌ　、　Ｍｇ５０４１
　ｍＭ　、　ＣａＣｔ２０．１ｍＭ　、グルコース２Ｉ
／！、寒天１５１／ｌ　　、Ｌ−トリプトファン０．１
　ｒｎＭ）に筐布して培養した。

（５）　　コリネバクテリウム・メラセコラ８０１（９
狂ｖＹすｔｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｇｏｃｏｌａ　
８０１　）（微工研条寄第５５８号）のＩ　ＣＤＨ産生
遺伝子を有する大腸菌の選択分離 前記実施例１−（４）で得られた菌株を、りａラムフェ
ニコール（２０μｇ／―）とテトラサイクリン（１０μ
ｇ／ｍｌ）とを含む前記合成寒天培地と、テトラサイク
リン（１０μｇ／ｄ）のみを含む前記合成寒天培地とで
それぞれ培養し、生育の有無を調べた。その結果、クロ
ラムフェニコール感受性テトラサイクリン耐性グルタミ
ン酸非要求性を示す菌株を、目的のＩＣＤＨ産生遺伝子
ｔ−ｔｉ有した大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅａｃｈ＠
ｒｌｃｈｉａ・旦旦）Ｋ１２　　ＥＢ１０６（ｐＡＧ３
０２）として分離した。

該大腸菌のＩ　ＣＤＨ活性を、下記の方法で測定するこ
とによシ、クローニングした遺伝子がＩＣＤＨ産生遺伝
子であることを確認した。前記Ｌ−プロス５０ｄで、エ
シェリヒア・コリ（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ旦具）Ｋ１
２（ｐＡＧ３０２）を３２℃で振盪培養した。該大腸菌
を集菌後、２ｄのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭこれを超音波
処理した後、１４０００　ｒｐｍ　（２００００ｇ）で
２０分間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵累液）を調製
した。尚、エシェリヒア・コリ（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｌ
ａ　＝　ｃａｌｌ　）　Ｋ　１２　　Ｅ　Ｂ　１０６（
ｐＢＲ３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｅｈｉａ　・旦旦）Ｋ１２　　ＥＢ１０６（ｐＡＧ３０
２）を培養する場合には、前記Ｌ−プロスにテトラサイ
クリン１０μｇ／ｒｎｌ’を添加した。エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ　−ｃｏ旦）Ｋ１２　　
ＥＢ１０６（ｐＡＧ３０３）を培養する場合には、前記
Ｌ−ブロスにアンピシリン３０μｔｔ／ｒｔｔｌ’ｒ添
加した。エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｉａ
　ｃｏｉｌ　）　Ｋ　］　２　ＥＢ　］　０６（ｐＡＧ
３１１）を培養する場合には、前記Ｌ−ブロスにクロラ
ムフェニコール２ｏμｇ　／ｍｌを添加シタ。

また、エシェリヒア・コリ（Ｅｇｈｓｒｉｃｈｉａ−ｅ
ｏｌユ）Ｋ１２　　ＥＢ１０６やエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｌ）Ｋ１２　　ＥＢ１０６
（ｐＢＲ３２５）を培養する場合には、前記Ｌ−プロス
に、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧと略す）２ｆｌ／
Ａｔ添加した。

ＩＣＤＨ活性は、２．９Ｍの酵素反応液（１０３ｍＭト
リス（Ｔｒｉｍ　）−ＨＯ２（ｐ）１７．４　）、１　
ｍＭイソクエン酸塩（ｌ５ｏｃｉｔｒａｔａ　）　、　
１　ｍＭ　ＭｎＣｌ２．０．５　ｍＭ酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａ
ｍｉｄｅ　Ａｄｅｎｉｎ＠ＤｌｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅＰ
ｈｏｓｐｈａｔｅ　、　０ｘｉｄｌｚｅｄ　Ｆｏｒｍ　
、以下ＮＡＤＰと略す）。

４０μを細胞抽出液〕の３４０　ｎｍの吸光度の増大を
、日立分光光度計（２２８型）で測定することにより求
めた。また、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、ロー
リ−（Ｌｏｗｒｙ　）ら〔オー、エイチ。

ローリ−（０，Ｈ＊Ｌｏｗｒｙ　）　ｐ　ｆ−ヌ、ジェ
イ、ローウェブｏ　−（Ｎ、Ｊ、Ｒｏｗｅｂｒｏｕｇｈ
　）　＋アール、ジェイ。

ランダル（Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ　）　、ジェイ、パ
イオル。

ケム（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、　）　１９３巻、２６
５頁１９５１年〕の方法を用いた。尚、同測定の標準蛋
白質として、ウシ血清アルブミン（和光紬薬工業社よシ
購入）を用いた。

測定結果を第１表に示す。第１表のＩＣＤＨ比活性測定
結果よシ、エシェリヒア・コリ（Ｅａｅｈｅｒｉｃｈｉ
ａ旦旦）Ｋ］２　ＥＢ１０６（ｐＡＧ３０２）は、明ら
かにＩＣＤＨＣＤ上回復していた。

（６）　　複合プラスミドｐＡＧ３０２の分離と解析エ
シェリヒア・コリ（Ｅ＋５ｃｈｅｒｌｅｈｌａ　ａｔす
、１＝）Ｋ１２　　ＥＢ１０６（ｐＡＧ３０２）より、
前記実施例１−（２）の方法でプラスミドｐＡＧ　３０
２のＤＮＡを、１６０μｇ分離精製した。このＤＮＡ　
０．３μｇに、過剰の制限酵素（ＥｃｏＲＩ　、　Ｂａ
ｍＨＩ　にツポンジーン社より購入）　、　Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ　（二ツ？ンジーン社よシ購入）、ｐｓｔＩ（ベゼ
スダリサーチラボラトリー社、米国よシ購入）、５ａｔ
Ｉにツポンジー／社より購入）、ｘｂａｌ（＝ッポンジ
ーン社より購入）〕ヲ、それぞれの適正条件にて反応さ
せ、その消化し九試料を常法に従い１％ア１ｆｏ−スｒ
ル電気泳動、および４％ポリアクリルアミドｒル電気泳
動に供した。

泳動の終った）ｒ”　／ｌ／ｆ　１μｇ／ｒｎ！エチジ
ウムブロマイド水浴液に浸漬して３０分間染色した後、
紫外線’２ｙルに照射して生成断片の数を判定し、各断
片の泳動距離から各々の分子量ｔ−算出した。尚、分子
量は、同一アがロースグル上で同時忙電気泳動したラム
ダ７アーソ（λｐｈａｇｅ　）　ＤＮＡ　にツポンジー
ン社よシ購入）の制限酵素Ｈ１ｎｄｌ［Ｉによる消化断
片の既知分子量に、または同一ポリアクリルアミドグル
上で同時に電気泳動したファイエックス１７４フアージ
（φＸ　１７４　ｐｈａｇｅ　）　ＤＮＡの制限酵素Ｈ
ａｅｌ［による消化断片（ペゼスダリサーチラボラトリ
ー社よシ購入）の既知分子量に、基づいて算出した。更
に、複数の制限酵素処理によって生じた消化断片を解析
することＫよシ、グラスミド分子中の各制限酵素切断部
位を決定した。

その結果、プラスミドｐＡＧ　３０２は、第１図の制限
酵素地図で示される構造を有し、ベクターのｐＢＲ３２
５の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に約５．１キロベース
のＩＣＤＨ産生遺伝子を含む外来のＥｃ　ｏＲＩ断片が
組込まれていた。このｇｃ　ｏＲＩ断片が、コリネ由来
のＩＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片である。

プラスミドｐＡＧ　３０２　ＤＮＡによシ、前記実施例
１−（２）の方法でエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｔ　）　Ｋ　１２　　Ｅ８１０６　ｆ
ｔ形質転換した。その結果、調べた形質転換株は、全て
テトラサイクリン耐性アンピシリン耐性クロラムフェニ
コール感受性グルタミン酸非要求性であった。更に、該
形質転換株につめて、それらが保有するプラスミドを解
析した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと
比べて制限酵素切断様式で同一と判定されるグラスミド
であった。

（７）　ＩＣＤＨ産生遺伝子を含む約５．１キロベース
のＤＮＡ断片の縮小化 前記実施例１−（６）で調製したベクターｐＡＧ　３０
２ＤＮＡ　３μｇに対して２０単位の制限酵素５ａｔＩ
　ｔｌ”加えて、５０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｇ　）　
−ＨＣＬ　（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，
１００ｍＭＮａＣｔの緩衝液５０　μＬ中で３７℃にて
２時間反応させ友。そこへ等容のフェノール−／ロロホ
ルム（１：　１．ｖ　／　ｖ　）　Ｗｋ添加して攪拌の
後、水層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加し
て攪拌の後、水層を回収した。そこへ酢酸す）　ＩＪウ
ムを最終濃度３００ｍＭになるように加え、次に２倍容
のエタノールを添加して、−３０℃で３時間保持した後
、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００，ｌｉ’）で１０分
間遠心分離してＤＮＡの沈ｐｉヲ回収し、これを減圧乾
燥した（　ＤＮＡ試料Ｉ）。

前記のＤＮＡ試料Ｉの全量に対して、３単位のＴ４ファ
ージＤＮＡリガーゼｆ　５０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ
）−Ｈｃｚ（ｐＨ７，４）、１０　ｔｎｌｉｆ！　Ｍｇ
Ｃｌ２．１０ｍＭソチオトレイトール（Ｄｌｔｈｉｏｔ
ｈｒａｉｔｏｌ　）、１−スペルミソｙ　（Ｓｐａｒｍ
ｉｄｉｎｅ　）、１　ｍＭ　ＡＴＰ　、　０．１　ｍ９
／ｒｆＬｌＢＳＡの緩衝液５０　μｉ中で、１５℃にて
一晩作用作用させ友。その後、７０℃にて１０分間加熱
することによシ、反応を停止させた。

このリガーゼ反応液音用いて、前記実施例１−（２）の
方法によシ、エシェリヒア・コ１７　（Ｅｓｃｈｅｒｉ
　一旦Ｕ旦１１　）　Ｋ　１２　　ＥＢ１０６　　の形
質転換操作を行った。その結果、アンピシリン耐性クロ
ラムフェニコール感受性テトラサイクリン感受性グルタ
ミン酸非要求性を示す形質転換株を多数分離することが
できた。これらの菌株について、前記実施例１−（６）
の方法によシ、各形質転換株の保有するプラスミドを分
離し解析し友結果、プラスミドｐＡＧ３０３を取得する
ことができた。

プラスミドｐＡＧ　３０３’を保有する菌株エシェリヒ
ア・コリ（Ｅａｃｈ＊ｒｉｃｈｉａ　ｅｏｌｌ　）　Ｋ
　１２　　ＥＢ１０６（ｐＡＧ　３０３）について、前
記実施例１−（５）の方法によシ、ＩＣＤＨ活性を測定
した結果、第１表に示すように、ＩＣＤＨ活性の明らか
な回復が認められた。プラスミドｐＡＧ　３０３は、第
２図の制限酵素地図で示される構造を有し、ベクターｐ
ＢＲ３２５由来のＥｃｏＲｌ　−Ｓ　ａ　Ｌ　Ｉ断片に
約３．４キロベースの外来のＥｅｏＲＩ−８ａｔ）断片
が組込まれていた。このＫｃｏＲＩ−８ａｔｌ　ＵＴ片
が、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ＠ｂ
ａｃｔｓｒ１ｕｍ　ｍｅｌａｉｇ＠ｃｏ１ｍ　）　８０
１　（微工研条寄第５５８号）由来のＩ　ＣＤＨ産生遺
伝子を含むＤＮＡ断片である。

プラスミドｐＡＧ　３０３　ＤＮＡによシ、前記実施例
１−（２）の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉ−ｃｈｉａ　ｃｏｉｌ　）Ｋ１２　　Ｅ３１０６に
形質転換した。

得られた形質転換株を調べた結果、調べた形質転換株は
、全てクロ乏ムフェニコール感受性アンピシリン耐性テ
トラサイクリン感受性グシタミン酸非要求性であった。

更にそれら形質転換株について、それらが保有するプラ
スミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供与プ
ラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定される
プラスミドであった。

ｃ共丁余白） （８）　　Ｉ　ＣＤＨ産生遺伝子を含む約３．４キロベ
ースのＥｃｏＲｌ−８ａｔＩ断片におけるＥＯＯＲＩ末
端のＳｍ４末端への変更。

実施例１−（６）で調製したプラスミドｐＡＧ３０２諷
５μｌに対して２０単位の制限酵素ＫａｏＲＩを加えて
、５０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＬ（ｐＨ７，
４）、１０ｍＭＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣ２の緩
衝液１００１１１で３７℃にて、２時間反応させた。そ
の後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止させた、
この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる様
に加え。

２倍容のエタノールを添加して、−３０℃にて３時間保
持した。次に１２．００Ｏｒｐｍ　（８，９００，ｌｉ
’）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、得ら
れた沈殿を減圧乾燥した（　ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料■と３単位Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４Ｄ
ＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓａ）　（宝酒造株式会社よシ購
入）とを、３３ｍＭトリス（Ｔ　ｒ　ｉ　ｇ　）−ＣＨ
３ＣＯＯＨ（ｐｌ（７，９）、６６ｍＭＣＨ３ＣＯ０Ｋ
　、　　１０ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ　１０．５
　ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｌｔ
ｏｌ）、　０．１モ佃ＢｓＡ、０．１ｍＭ　２’−デオ
キシアデノシン５′−トリホスフェート（シグマ社、米
国よシ購入）　、０．１ｍＭ　２’−デオキシシチジン
５′−トリホスフェート（シグマ社、米国よシ購入）％
０．１ｍＭ２’−デオキシグアノシン５′−トリホスフ
ェート（シグマ社、米国よシ購入）。

０．１ｍＭチミジン５′−トリホスフェート（シグマ社
、米国よ）購入）の反応液４４μを中で３０℃にて２０
分間反応させ穴。この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３
００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノールを添加し
て、−３０℃にて３時間保持しな。次に１２，０００　
ｒｐｍ（８，９００，Ｆ）で１０分間遠心分離してＤＮ
Ａ沈殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥し７’ｃ　（
ＤＮＡ試料■）。

５ａｔｌリンカ−（５ａｔＩ　１ｉｎｋｅｒ）　（宝酒
造株式会社よシ購入）１．５μ９とＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（Ｔ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋ
ｉｎａｓｅ）　（宝酒造株式会社よシ購入）２．５単位
とを、６６ｍＭ）リス（Ｔｒｔｓ）−ＨＣｔ（ｐ）１７
．６）、１　ｍＭ　ＡＴＰ、１０　ｍＭ　ＭｇＣ２２，
１癲スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ　）、１５ｍ
Ｍジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
）、０．２　ｌＲ９７ｍ７ＢｓＡの反応液１０μを中で
３７℃にて１時間反応させ７’ｉ（ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料■の１／２量とＤＮＡ試料試料量全量４ファ
ージＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ｐｈａｇａＤＮＡｌｉｇａｓ
ａ　）　６単位とを、　６６ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣＡ（ｐＨ７，６）　、　１　ｍＭＡＴＰ　、　１
０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒ
ｍｉｄｉｎｅ）、１５ｍＭジチオトレイトール（Ｄｌｔ
ｈｌｏｔｈｒｅｌｔｏｌ）、　　０．２　ｍ９７ｍ１　
ＢＳＡの反応液２２ＩＬｔ中で２２℃にて４時間反応さ
せた。この反応液に等容のフェノール・クロロホルム（
１二１　ｖ／ｖ　）液を添加して攪拌の後、水層を回収
した。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水
層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００
錫になる様に加え１次に２倍容のエタノールを添加して
、−３０℃で３時間保持した後、　１２．００Ｏｒｐｍ
（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を
回収し、これを減圧乾燥した（　ＤＮＡ試料Ｖ）。

ＤＮＡ試料試料量全量して、１５単位の制限酵素５ａｔ
Ｉを加えて、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｍ）−ＨＣｔ（ｐ
Ｈ７，４）。

１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣＬの緩衝液
５０ｐｔ中で３７℃にて、２時間反応させた。消化した
試料は、前記の方法によシ、１チアガロースｒ／Ｌ／電
気泳動に供し次。ただし、電気泳動には、ペゼスグ・リ
サーチラボラトリ−社よシ購入したひ正アガロース（Ａ
ｇａｒｏｓｅ）を使用し、４℃で電気泳動した。次にエ
チジウムブロマイドで染色したア７！／ロースグルを紫
外線照射下に置き、約３．４キロベースのＩＩＩ’ＪＡ
断片の存在を確認し、その付近のアガロースダルを切ｐ
出した。切フ出したアガロースゲルにその重量の３倍量
のπ緩衝液を加えて、６５℃で１０分間加熱し、アガロ
ースゲルを完全にとかした。次に等容のフェノールを添
加して、攪拌後、水層を回収した。得られた水層に、等
容のフェノール・クロロホルム（１：　Ｉ　Ｖ／Ｖ　）
液を添加して、攪拌の後水層を回収した。得られた水層
に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後水層を収し次
。得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍ
Ｍになるように添加し、更に２倍容のエタノールを加え
て攪拌の後、−３０℃で３時間保持した。その後、　１
０，０００ｒｐｍ　（９，０００，！ｉ’　）で１０分
間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収した。次に、得られ念
沈殿を減圧乾燥した（　ＤＮＡ試料■）。

前記実施例１−（２）で調製したプラスミドｐＢＲ３２
５のＤＮＡ　４μｇに対して、２０単位の制限酵素５ａ
ｔＩを加えて、５０　＋ｎＭ　）リス（Ｔｒｉｇ　）−
ＨＣｔ（ｐＦ（７，４）。

１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣＬの緩衝
ｉ５０μを中で３７℃で２時間反応させた。そこへ等容
のフェノ−Ａ’・クロロホルム（１：　１　ｖ／ｖ　）
　液を添加Ｌテ攪拌の後、水層を回収した。更に等容の
クロロホルムを添加して攪拌の後、水層を回収した。そ
こへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになるように
加え、次に２倍容のエタノールを添加して、−３０℃で
３時間保持した後、１２．００Ｏｒｐｍ（８，９００Ｉ
）で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し。

これを減圧乾燥した（　ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料試料量全量ＮＡ試料試料量全量単位のＴ４フ
ァーノＤＮＡリガーゼとを、５０ｍＭ）リス（Ｔｒｉｍ
）−ＨＣｔ（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭ　ＮａＣＬ２．
１０ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｓｉ
ｔｏｌ）、１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ
）　、１ｍＭ　ＡＴＰ、　０．１　ｍ９７ｍ１　ＢＳＡ
の緩衝液１００μを中で、１５℃にて一晩反応させた。

その後７０℃にて１０分間加熱することによシ、反応を
停止させた。このリカーゼ反応液４０μｔを用いて、前
記実施例１−（４）の操作を行った。その結果、得られ
た菌株を、テトラサイクリン（１０μｉ／ｍｌ　）とク
ロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）とを含む前記合
成寒天培地と、クロジムフェニコール（２０μ７７７ｍ
１）のみを含む前記合成寒天培地とでそれぞれ培養し、
生育の有無を調べた。その結果、グルタミン酸非要求性
で、テトラサイクリ／感受性クロラムフェニコール耐性
を示す菌株を分離した。次に、これらの菌株から、前記
実施例１−（２）の方法により、それぞれの菌株の保有
するプラスミドを単離精製し念。これらのプラスミドＤ
ＮＡを用いて、前記実施例１−（６）の方法により、各
プラスミドの構造を調べた結果、目的の複合グラスミド
ｐＡＧ３１１を取得した。グラスミドｐＡＧ３１１は、
第３図の制限酵素地図で示される構造を有していた。す
なわち、得られ次複合プラスミドは。

プラスミドｐＢＲ３２５の制限酵素５ａＬｌ切断部位に
、約３．４キロベースのＩ　ＣＤＨ産生遣云子を含む外
来の５ａｌｌ断片が組込まれていた。この５ａｔＩ断片
が、コリネパクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｌｕｍｍｅｌａ＠５ａｅｏｌａ）８０１　（
微工研条寄第５５８号）由来のＩＣＤＨ産生遣云子を含
む約３．４キロベースのＥｃｏＲＩ−８ａｔＩ断片のＥ
ｃｏＲＩ末端を５ａｔｌ末端に変更したＤＮＡ断片であ
る。

プラスミドｐＡＧ３１１を保有する菌株エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ）　Ｋ１２Ｋ
Ｂ１０６（ｐＡＧ３１１）について、前記実施例１−（
５）の方法によ、９．ＩＣＤＨ活性を測定した結果、第
１表に示すように、　ＩＣＤＨ活性の明らかな回復が認
められた。グラスミドｐＡＧ　３１１　ＤＮＡにより、
前記実施例１−（２）の方法で、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｌａ　ｃｏｉｌ）Ｋ１２　ＥＢ１０
６を形質転換した。その結果、調べた形質転換株は、全
てテトラサイクリン感受性クロラムフェニコール耐性ア
ンピシリン耐性グルタミン酸非要求性であり穴。更に該
形質転換株について、それらが保有するプラスミドを解
析した結果、それらのグラスミドは、供与プラスミドと
比べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミド
であった。

第　　１　　表 注１）反応液中の蛋白質１ｊｖが、１分間に生成させｆ
ｃ　ＮＡＤＰＨ（Ｎｉｃｏｔｌｎａｍｉｄｅ　Ａｄｅｎ
ｉｎｅ　ＤｉｎｕａｌｅｏｔｉｄｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ
、Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｆｏｒｍ）のマイクロモル数で表示
しである。

注２）イー・コリ　ジェネテイックストツクセンタ　−
　（Ｅ　、ｃｏｌｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　　５ｔｏｃ
ｋ　　Ｃｅｎｔｅｒ）、　デ　ノクート　　メントオプ
ヒューマンジェネンテイツクス、エールユニパーシティ
、スクールオブメデイシン。

３３３　シーダーストリート、ピー、オー、？ツクス３
３３３　、ニューヘイブン、コネチカット０６５１０゜
アメリカ合衆国（Ｄｅｐａｒｔｒｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕ
ｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｍ＋Ｙａｌｅ　Ｕｎｌｖｅｒｓ
ｌｔｙｊＳｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉａｉｎｅ＊３３
３ＣｅｄｅｒＳｔｒｅｅｔ　　Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　　３３
３３＋Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ＋Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ０
６５１０　Ｕ、Ｓ、Ａ）のパーパラシェイパツクマン（
Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ、Ｂａｅｈｍａｎｎ）より分譲され
たエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏ
旦）Ｋ１２の変異株である。

本菌株は、Ｉ　ＣＤＨ活性を欠損している。尚、上記機
関からは、誰でも該菌株の分譲を受けることができる。

（９）　　プラスミドｐＡＧ３０２からのＩＣＤＨ産生
遺云子を含む約５．１キロベースのＤＮＡ断片の分離前
記実施例１−（６）で調製しｆｃ７°ラスミドｐＡＧ３
０２のＤＮＡ　２０　μｍ１に対して、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　、　Ｘｂａ　Ｉをそれぞれ６０単位加えて、５０
ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＬ　（ｐＨ７，４）　
、　１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　’ｔＪ＊ｃｔ
の緩衝液１００μを中で、３７℃にて２時間反応させた
。

消化した試料は、前記の方法により、１チアガロースグ
ル電気泳動に供し念。ただし、電気泳動には、ベゼスダ
・リサーチ・う？ラトリー社より購入し７’？　ＬＭＰ
アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）を使用し、４℃で電気泳
動した。次にエチノウムプロマイドで染色したアガロー
スゲルを紫外線照射下に置き、ＩＣＤＨ産生遺伝子を含
む約３．９キロベースと約１．２キロベースのＤＮＡ断
片の存在を確認し、その付近のアがロースダルを、それ
ぞれ切フ出した。それぞれのアガロースゲルに、その重
量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、６５℃で１０分間保
持し、アガロースダルを完全にとかした。次に等容のフ
ェノールを添加して、攪拌の後、水層を回収した。

得られた水層に、等容のフェノール・クロロホルム（１
：　１　ｖ／ｖ　）液を添加して攪拌の後、水層を回収
した。得られた水層に等容のクロロホルムを添加して攪
拌の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリ
ウムを最終濃度を３００ｍＭになるように添加し、更に
２倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３
時間保持した。その後。

１０．００Ｏｒｐｍ（９，０００，９）で１０分間遠心
分離してＤＮＡの沈殿を回収した。次に、得られた沈殿
を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液２０μｔに溶解した。以上の
操作によシ、グルタミン酸生産性コリネ型廁菌由来のＩ
ＣＤＨ産生遺伝子を含む約５．１キロベースのＥｃｏＲ
Ｉ断片を、約３．９キロベースＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ　
Ｆｒ片と約１，２キロペースＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩ断片
の２断片として、それぞれ約４μｌ、約１μｙ取得し念
。

α０　プラスミドｐＡＧ３０３からのＩＣＤＨ産生遺伝
子を含む約３．４キロベースのＥｃｏＲＩ−８ａｌｌ断
片の分離 前記実施例１−（７）で調製したプラスミドＰＡＧ３０
３のＤＮＡ　２０　ｆｉｇに対して、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ　−、Ｓ’−ＩＩＸｂａｌをそれぞれ６０単位加えて
、５０ｒｎＭトリス（Ｔｒ　ｉ　ｍ　）−ＨＣＬ　（ｐ
Ｈ７，４）、１０　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１００ｍＭＮａ
Ｃ１の緩衝液１００μを中で、３７℃にて２時間反応さ
せ念。消化しな試料は、前記実施例１−（９）の方法に
よりアガロースゲル電気泳動に供し穴。次に、Ｉ　ＣＤ
Ｈ産生遺伝子を含む約２．２キロベースと約１．２キロ
ベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、その付近の７〃ロ
ースグルを切シ出し念。同アｆロースダルからのＤＮＡ
断片の抽出は、前記実施例１−（９）の方法を用い念。

その結果、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＩ　
ＣＤＨ産生遺伝子を含む約３．４キロベースのＥａｏＲ
Ｉ−８ａｌｌ断片を、約２．２キロベースの５ａｌｌ−
ＸｂａＩ断片と約１．２キロベースのＩＡＩ取得し六。

ＣＬＩ）　　グラスミドｐＡＧ３１１からのＩＣＤＨ産
生遺伝子を含む約３．４キロベースの５ａｌｌ断片の分
離前記実施例１−（８）で調製したプラスミドｐＡＧ３
１１のＤＮＡ　２０μ９に対して、制限酵素Ｓａ４を６
０単位加えて、　５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＡ（ｐＨ７，
４）、　ｌ　０ｍＭＭｇＳＯ４，１００ｍＭＭａＣ１の
緩衝液１００ｐｔ中で、３７℃にて２時間反応させた。

消化し次試料は、前記実施例１−（９）の方法によシア
ガロースグル電気泳動に供した。次に、　ＩＣＤＨ産生
遺伝子を含む約３．４キロベースのＤＮＡ断片の存在を
確認し、その付近のアガロースゲルを切シ出した。切シ
出したアガロースゲルからのＤＮＡの抽出は、前記実施
例１−（９）の方法を用いた。その結果、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来のＩＣＤＨ産生遺伝子を含む約
３．４キロベースのＥｃｏＲＩ−８ａｌｌ断片の制限酵
素ＥｃｏＲ１処理によりて生じる末端を制限酵素５ａｔ
Ｉ処理によりて生じる末端に変更した断片を、約４μｉ
取得した。

実施例２ 本実施例は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＩ
ＣＤＨ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該菌種のベクタ
ーに組込んで、該菌種のＩＣＤＨ強化株を育種した例で
ある。グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＩＣＤＨ
産生遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、前記実施例１−
（６）で？Ａ與したＩＣ’ＤＨ産生遺伝子を含ｔｒ　約
３．４　＊　ｏ　ヘースの５ａｌｌ断片を使用した。グ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌のベクターとしては、グ
ラスミドｐＡＧ　５０を使用した。プラスミドｐＡＧ５
０は、該菌種のプラスミドｐＡＧ１　、　ｐＡＧ３よシ
、後述する方法によシ作成されたベクタープラスミドで
ある。プラスミドｐＡＧ１は、コリネバクテリウム・メ
２セコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａ
ｓａｅｃｏｌｍ　）２２２４３（微工研条寄第５６０号
）よシ分離されたナト２サイクリン耐性プラスミドであ
る。プラスミドｐＡＧ３はコリネバクテリウム・メラセ
コラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｍｅｌａｓｓ
ｅｃｏｌａ　）　２２２２０　（微工研条寄第５５９号
）よシ分離されたクリプテイックグラスミドである。

（１）プラスミドｐＡＧ　５０の作成と該プラスミド保
有コリネバクテリ９ム鳴メラセコラ （Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｍｅｌａｓａｅｃ
ｏｌｍ　）　８０１　（ｐＡＧ５０）からの該プラスミ
ドの分離。

プラスミドｐＡＧ　５０は、次の方法で作成した。

先づプラスミドｐＡＧ　１を縮小化してプラスミドｐＡ
Ｇ　１４を作成し、該プラスミドよ）テトラサイクリン
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離した。次に該ＤＮＡ
断片をプラスミドｐＡＧ　３に組込んでプラスミドｐＡ
Ｇ　５０を作成し念。以下、上述の操作について詳細に
説明する。

■コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓａｅ
ｏｌｍ　）　２２２４３　（微工研条寄第５６０号）菌
体からのプラスミドｐＡＧ１の分離。

上記菌株を、半合成培地〔（ＮＨ４）２８０４１０ｇ、
尿素３　、！；’　、　Ｋ２ＨＰＯ４１、！ｉｒ、Ｎ＊
Ｃ１５０Ｉｎ９、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０４００１ｒＩ９
、ＭｎＳＯ４’４−６Ｈ２０２”９、Ｆｅ５ｏ４・４−
６Ｈ２０２７Ｑ、ｆルコ−：ｘ　２０　ｊ；／　、　ヒ
ｙｋ−＋７５０μｙ１チアミン塩酸塩２００μｙ１酵母
エキス１ｙ全純水に溶かして１ノとし、−７，２に調整
した培地〕で、３２℃、１晩振盪培養し、その種培養８
ａを２００ゴの前記半合成培地に移植して、３２℃で５
時間振盪培養した。

培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液［５０−グルコ
ース、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　２５　ｍＭ　）リ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ（ｈｙ
ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ　）　ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ
＊　：　Ｔｒｉｍ　）、１０　ｍ９７ｒＲ１リゾチウム
（シグマ社よシ購入）、−８，０）１０ｄに懸濁し４２
℃で１時間反応させた。

本反応液Ｋ　７　＃　カリＳＤｇ液（０，２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ，ｌ　ｔ４ドデシルスルホン酸ナトリウム（Ｓｏｄ
ｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ　、以下ＳＤ８と
略す））２０ｍを添加攪拌の後、水中に５分間置い友。

次に本反応液に、氷冷した酢酸カリタム溶液（５Ｍ酢酸
カリウム水溶液６０ゴ、酢酸１１．５１ｄ、純水２８．
５ｊＬｇの混合液）１５ａＪｉ添加攪拌の後、水中に１
００分間置た。溶菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５
分間、１２，０００ｒｐｍ（１３０００，！ｉ’）の遠
心分離を行ｒ、上澄液を回収した。これを等容のフェノ
ール・クロロホルム液（１：１）で抽出して水層を回収
し念、これに２倍容のエタノールを添加攪拌して、５分
間室温に置き、２０℃、１０分間、１０．ＯＯＯｒｐｍ
（１１，ＯＯＯ，Ｆ）の遠心分離を行った。得られた沈
殿物を、７０チエタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥し
て、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ　）　、
　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐ）４７．５　）２０ｄで
、ふ念たび溶解した。この液に、１０■／ｒ！ｉｌエチ
ジウムブロマイド水溶液１．２−と塩化セシウム２３．
６ｆＩとを加えて静かに溶解し、４０．０００ｒｐｍ（
１００，０００，ｊｉｌ）１５℃で４８時間遠心分離し
た。プラスミドｐＡＧ　１は、紫外線照射によシ遠心チ
ューブ中、２本のバンドの下方として見い出され、この
バンドを遠心チューブの側面から注射器で抜き取ること
によシ、プラスミドｐＡＧ　１　ｉ分離した。次でこの
分画液を等容量のインプロピルアルコールで４回抽出し
て、エチジウムブロマイドを除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析して、ＤＮＡ濃度５０μｇ／＆ｌのプラ
スミドｐＡＧ　１の透析完了液１Ｍを得た。

■プラスミドｐＡＧ　１の試験管内ＤＮＡ組換え。

前記実施例２−（１）−■で調書し念プヲスミドｐＡＧ
　Ｉ　ＬＤ　ＤＮＡ　０．５１１９１ｃ対して、ＩＯ年
単位制限酵素ＥｃｏＲＩ　ｆ加え、５０ｍＭトリス（Ｔ
ｒｉｇ　）　−ＨＣｔ（ｐＨ７，４）、１０　ｒｎｈｌ
　Ｍｇ５ｏ４．１００ｍＭＮａＣ１の緩衝液４０μを中
で、３７℃にて２時間反応させた。その後７０℃で１０
分間加熱して反応を停止させた。この反応液２０μｔと
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにツポンジーン社
よシ購入）とを、５０ｍＭトリ、ｃ　（Ｔｒｌｓ　）−
ＨＣＩ、　（ｐＨ７，４）、１０　ｒｎＭＬ　ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭジチオトレイトール（Ｄｌｔｈｉｏｔｈｒ
ｅｌｔｏｌ　）、１ｍＭスペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄ
ｌｎｅ　）、１　ｍＭ　ＡＴＰ　、　０．１　ｍ９／ｒ
！ＬＩ　ＢＳＡ（ベゼスグ・リサーチ・、７がラトリー
社よシ購入）の緩衝液５０μ！中で、１５℃にて一晩反
応させた。

■プラスミドｐＡＧ　１４の取得。

前記実施例２−（１）−■で作成したプラスミドｐＡＧ
　１由来の組換えＤＮＡにより、コリネバクテリウム・
メラセコ、１７（９ｎμ江り匡山巴号）のグラスミドキ
ュアート株を形質転換した。

得られたテトラサイクリン耐性形質転換株の保有するプ
ラスミドを解析することによシ、プラスミドｐＡＧ　１
４　ｔ−取得した。以下上記実験について詳しく説明す
る。

（プラスミドのキユアリング）コリネバクテリウム自メ
ラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓ
＋ｓｅｃｏ１ｍ　）　２２２４３　（微工研条寄第５６
０号）ｉＬＧ培地（トリプトン１（１，酵母工Φス５ｇ
、Ｎ＆Ｃ１，５１１、グルコース２Ｉを純水に溶かして
１１とし、−７，２に調整した培地）５ゴに１白金耳植
菌して、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液を無菌
水で希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地に１．５　％寒天
全添加した培地）に塗布し、３２℃で２日間培養した。

生じたコロニー１００個を取シ、テトラサイクリン１０
μ９７ｋｌｆ含有するＬＧ寒天培地に釣菌した。３２℃
で２日間培養してテトラサイクリン感受性株を選択した
。得られた２株のテトラサイクリン感受性株について、
前記と同様なプラスミドの単離法によシブラスミドｐＡ
Ｇ１の存在を調べた。その結果得られた２株のナト２サ
イクリン感受性株は、＾ずれもプラスミドを保持してい
なかった。これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿
主として用いた。

（形質転換）コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌｍ　
）　２２２４３（微工研条寄第５６０号）よシ前記の操
作で分離したプ２スミドキ、アート株を、前記半合成培
地で３２℃、１２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍ
ｆ：同じ半合成培地５Ｑｒｎｌに植菌して３２℃で振盪
培養した。日立分光光度計（２２８型）で波長６６０　
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）’ｉ測測定、ＯＤが０．２
になった時点で培養液ににニジリンＧを０．３単位／プ
の濃度になるように添加した。これを更に３２℃で１．
５時間培養を続けた。

その培養液よシ集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｙ、カザ
ミノ酸１０，９．酵母エキス１０ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４０，３５ｇ、Ｋ２ＨＯ４０，１５、ｌｉ＋
　、シュークロース１．３７　ｇ、Ｎ−トリス、（〕・
イドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン
ｉ　（ＴＥＳ：Ｎ−Ｔｒｉｍ（ｈｙｄｒｏｘｙｍ＠ｔｈ
ｙｌ）　ｍｅｔｈｙｌ　−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓ
ｕｌｆｏｎｉｃａｅｉｄ　）　５．７３　ｐ　、　Ｍｇ
Ｃｌ２０．９５　ｆ！　。

ＣａＣ１２１−１１Ｊを純水に溶かして１１とし、Ｎａ
ＯＨでｐＨ７，２に調整した培地〕５Ｍに懸濁した。こ
の懸濁濁液４．５１Ｒ１！に、３　ｍｇｔ　／　ｒｎｌ
濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリポアフィルタ
−で除菌した。）０、５ゴを添加して、３５℃で５時間
静置反応させた。プロトプラスト化したａ胞を７．００
　Ｏｒｐｍ（４５００ｇ）、５℃、７分間で遠心分離し
て回収し、Ｒ培地５廓に懸濁した。同様の操作を更にも
う一度行った後、Ｒ培地５１ｄＫ再懸濁してグロトプラ
スト菌液とし念。

前記実施例２−　（１’）−■で得られたりガーゼ反応
液５０μｔと２倍濃度ＴＳＭＣ液（ＴＳＭＣ液はＴＥＳ
　２Ｓ錫、シュークロース０．４　Ｍ、　ＭｇＣｌ２１
０　ｍ　Ｍ。

ＣａＣｔ２３０ｒｒＭを含み、ＮａＯＨで−７，２に調
整した水溶液である。）５０μｔとの混合液を上記グロ
トグラスト菌液０．５ｄＫ添加混合した。その後更にＰ
ＥＧ液（ＴＳＭＣ液Ｋｒリエチレングリコール６，００
０（Ｐｏ１ｙｅｔｈｌｅｎａ　ｇｌｙｅｏｌ　６０００
　）　ｋ　４０　％（一度に溶解する。）１．５１１Ｌ
ｔｉ添加してゆるやかに混和し、２分間室温で静置した
。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニ７’７ピロリ
ドン（ＰＶＰ　：　Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉ
ｄｏｎｅ　）　４０１　／　ｌ　を添加する。〕５ｄを
添加して、４，０００ｒｐｍ（１８００，ｌｉ’）で１
ｏ分間遠心分離して上澄液を除去した。同様の遠心分離
条件で洗浄操作を更にもう一度行った後、沈降したプロ
トプラストを０．５　ｍ／のＲ−ＰＶＰ液でゆるやかＫ
Ｍ濁した。３時間、３０℃に保っり後、Ｒ−ＰＶＰ液で
希釈し、一定ｆ［ヲテトラサイクリ７１０μμ濃度を含
む再生培地（１層寒天培地を用いる。下層寒天培地は、
Ｒ培地にＰＶＰ　４０　Ｅ／ｌ　　、寒天１５ｊｉ／ｌ
を添加して作表する。上層寒天培地は、ＰＶＰ　４０１
／ｌ　　−寒天６１／ｌｌｔ添加して作成する。プロト
プラスト懸濁液を溶けた上層寒天培地３罰と混合して、
下層寒天培地上に重層する。）に植菌し、３２℃で４日
培養した。

出現したテトラサイクリン耐性形質転換株から任意に１
０株ｗｈび、テトラサイクリン１０μｙ／一濃度を含む
ＬＧ寒天培地上で純化した後、実施例１の（１）でプラ
スミドｐＡＧ　ｌ′ｔ−分離した方法にょシ、各菌株か
らグラスミドを分離した。各プラスミドＤＮＡ←←→に
対して、前記実施例１−（６）の方法によ）、各プラス
ミド分子中の各制限酵素切断部位を決定した。その結果
、プラスミドｐＡＧ　１４を取得した。

このプラスミドＤＮＡ　（ｉ−用いて、前記と同様な方
法で、コリネバクテリウム・メラセコラ（微工研条寄第
５６０号）のプラスミドキュアート株を形質転換した。

得られたテトラサイクリン耐性株につめて、それらが保
有するプラスミドを解析した結果、それらのプラスミド
は、供与プラスミドと比べて、制限酵素切断様式で同一
と判定されるプラスミドであり友。

■プラスミド分子中　１４からのテトラサイクリン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離。

前記実施例２−（１）−〇で基又したプラスミドｐＡＧ
　１４のＤＮＡ　２０μｓに対して、１００単位の制限
酵素ＢａｍＨｉ　、Ｂｇｌｌｌ　ｆそれぞれ加えて、１
０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｌｇ）　−ＨＣＬ　（ｐ［４７
，４）、１０　ｒｎｈｌ　Ｍｇ５ｏ４．５０ｍＭＮａＣ
ｔ、１ｍＭｍナノトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ）の緩衝液１００ゴ中で、３７℃にて２時間反
応させた。消化した試料は、前記実施例１−（６）の方
法によシ、１チアがロースグル電気泳動に供した。

ただし、ペゼスダ・リサーチ・ラゴラトリース社よシ購
入したＬＭＰアガロース（Ａｇａｒｏｉｅ　）を使用し
、４℃で電気泳動した。次に、エチソウムプロマイドで
染色ｊ７たアガロースを紫外線照射下に置き、テトラサ
イクリン耐性遺伝子を含む約３．１．キロペースのＤＮ
Ａ断片の存在を確認し、その付近のアガロースゲルを切
シ出し友。同アガロースにその重量の３倍量のＴＥ緩衝
液を加えて、６５℃で１０分間保持し、アガロースダル
を完全にとかした。次に、等容のフェノ−Ａ／ｌ−添加
して、攪拌の後、水層全回収した。同水層に等容のフェ
ノールクロロホルム（１：１）液を添加して、攪拌の後
、水層全回収した。同水層に等容のクロロホルムを添加
して、攪拌の後、水層を回収した。同水層に、酢酸ナト
リウムを最終濃度３００ｍＭになるように添加し、更に
２倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３
時間保持した。その後、１０、ＯＯＯｒｐｍ（９，ＯＯ
Ｏｇ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し
、同沈殿を減圧乾燥した。

■プラスミド全解析　３の調製と制限酵素Ｂ　ａｍＨＩ
処理 前記実施例２−（１）−■の方法によシ、コリネバクゾ
リウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
から分離精製したプラスミドｐＡＧ　３のＤＮＡ　４μ
ｌに対して、２０単位の制限酵素Ｂ＆ｍＨＩを加えて、
１０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｍ　）　−ＨＣｌ（ｐＨ７
，４）、１０！ｕＭＭｇＳ０４．５０　ｍＭ　ＮａＣ１
、１ｒＭジチオトレイト−／ｌ／　（Ｄｌｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ　）の緩衝液１００μｌ中で、３７℃にて
２時間反応させた。そこへ等容のフェノール嚢クロロホ
ルム（１：１）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍ
Ｍ　Ｋなるように加え、次に２倍容のエタノールを添加
して、−３０℃にて３時間保持した後、１２．　ＯＯＯ
ｒｐｍ　（８９００ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ
の沈殿を回収し、これを減圧乾燥した。

■グラス°ミドｐＡＧ　５０の取得 前記実施例２−（１）−■、■で調製したそれぞれのＤ
ＮＡ全量と３単位のＴ４ファーノＤＮＡ　リガーゼとを
５０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｍ　）　−ＨＣｔ（ｐＨ７
，４）、１０ｒｎ！１１１ＭｇＣ１２，１０ｍＭジチオ
トレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　）、１
ｍＦｉ’ｆスペルミノン（Ｓｐｅｒｍｌｄｌｎｅ　）、
１　ｍＭ　ＡＴＰ　、　０．１　ｍ９　／　ＭＩ　ＢＳ
Ａの緩衝液５０μｌ中で、１５℃にて一晩反応させた。

その後７０℃にて１０分間加熱して反応を停止させた。

回りが−ゼ反応液５０μＩｋ用いて、前記実施例２−（
１）−■と同じ形質転換操作によシコリネパクのテトラ
サイクリン耐性形質転換株を取得した。

ただし、再生培地による培養は、７日間とした。

得られ念テトラサイクリン耐性形質転換株について、前
記実施例２−（１）−■の方法によシ、６株の保有する
プラスミドを分離し、前記実施例１−（６）の方法によ
りそれぞれのプラスミド全解析し几結果、プラスミドｐ
ＡＧ　５０　ｋ取得することができた。

このプラスミドＤＮＡ　’ｉ用論て、前記と同様な方法
で、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌｍ　）　８０
１　（微工研条寄第５５８号）を、形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株について、それら
が保有するプラスミド全解析した結果、それらのプラス
ミドは、供与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同
一と判定されるプラスミドであった。

（１）プラスミドｐＡＧ　５０へのＩ　ＣＤＨ産生遺伝
子を含むＤＮＡ断片の組込み。

前記実施例２−（１）−■で調製したプラスミドｐＡＧ
　５０のＤＮＡ　５μｌに対して、制限酵素Ｓａｌ　ｌ
を１５単位加えて、５０　ｍＭ　Ｔｒｉ　ａ−ＨＣｔ（
ｐＨ７，４）、１０　ｒｎＭＬ　ＭｇＳＯ４，１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ６の緩衝液６０　ｐｌ中で、３７℃にて２時
間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱して、反
応を停止させた。

この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００ｍＭになる様
に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０℃にて
３時間保持した。次に１２，０００　ｒｐｍ（８，９０
０，Ｆ）で１０分間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収し、
同沈殿を減圧乾燥した。得られた試料’ｉ　ＲＡＰＴ緩
衝液（５０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｔ、　ｐ）
１８．４）２００μｌに溶解し、バクチリアル・アルカ
リ島ホスファターゼ（Ｂａｅｔａｒｉｍｌ　ｍｌｋｍｌ
ｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａＪａ　）　（宝酒造株式会社
よシ購入）を１単位添加して６５℃にて３０分間反応さ
せた。更に該酵素を１単位添加して、６５℃で３０分間
反応させた。その後、反応液に等容のＴＮＥ緩衝液で飽
和したフェノールを加え、混合した後、１２．００　Ｏ
ｒｐｍ　（８，９００９）で１０分間遠心分離して水層
を回収し、更にも９１回同じ操作を繰シ返した。

次１／Ｃ水層に等容のフェノール・クロロホルム（１：
　１　、　ｖ／ｖ）液を添加して混合した後、１２．０
０Ｏｒｐｍ（８，９００，ｌｉ’　）で１０分間遠心分
離し、水層を回収した。更に水層に等容のクロロホルム
を添加して攪拌した後、１２．０００　ｒｐｍ（８，９
００，９）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。該
水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３００−になる様に加
え、２倍容のエタノールを添加し攪拌しｔ後、−３０℃
にて３時間保持した。その後、１２．００Ｏｒｐｍ（８
，９００，！？）で１０分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を
回収した。これを減圧乾燥した。このＤＮＡ全量と前記
実施例１−（６）で鉤裂したＤＮＡ　１μｇと３単位の
Ｔ４ファージＤＮＡリガーゼにツポンジーン社よシ購入
）と全、５０　ｍＭ　トリス（Ｔｒｌｇ　）　−Ｈｃｔ
　（ｐＨ７；４　）、１０　ｒｎｈｌ　ＭｇＣｌ２．１
０ｍＭジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｌｔ
ｏｌ）、１ｍＭスペルミノン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ　
）　、　　１　ｍＭ　ＡＴＰ　。

０．１ダ／ｒＬｌＢｓＡ（ベゼスダリサーチラ？ラトリ
ー社よシ購入）の緩衝液　５０μ！中で、１５℃にて一
晩反応させ念。その後、７０℃にて１０分間加熱するこ
とによシ、反応を停止させた。

（３）　ＩＣＤＨ産生遺伝子を含有した複合プラスミド
ｐＡＧ３００１　　の取得 前記実施例２−（２）で作成した組換え体ＤＮＡによシ
、コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｅ
ｏｌｍ　）　８０１　（微工研条寄第５５８号）を形質
転換した。得られ念テトラサイクリン耐性形質転換株の
保有するプラスミドを解析することによシ、プラスミド
ｐＡＧ　３００１を取得した。更に、同プラスミド保持
菌株のＩ　ＣＤＨ比活性が強化されている事を確認した
。以下上記実験について詳しく説明する。

コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａａｓｅｃ
ｏｌｍ　）　８０１　（微工研条寄第５５８号）を、前
記半合成培地で３２℃、１２時間振盪培養し、その培養
液０．５　Ｊを同じ半合成培地５０ｄに植菌して３２℃
で振盪培養した。

日立分光光度計（２２８型）で波長６６０　ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤｉ測定し、ＯＤが０．２になり九時点で
培養液にペニシリンＧ　’ｅ　０．３単位／ゴの濃度に
なるように添加した。これを更に３２℃で１．５時間培
養を続けた。

その培養液よυ集菌し、Ｒ培地〔グルコース５Ｉ、カザ
ミノ酸１０ｇ、酵母エキス１０ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４０，３５ｆｉ、　ＫＨ２ＰＯ４０，１５，
９、シュークロース１．３７．ＩＮ−）リス（ハイドロ
キシメチル）メチル−２−７ミノエタンスルホン酸（Ｔ
ＥＳ　：　Ｎ−Ｔｒｌｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙ
ｌ　）　ｍｅｔｈｙｌ　−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓ
ｕｌｆｏｎｌｃ　ａｃｉｄ　）　５．７３１　ｓ　Ｍｇ
Ｃｔｚ０．９５．！７、ＣａＣＺｚ　１．１１１を純水
に溶かしてｌノとし、ＮａＯＨでｐｉ−１７，２に調整
した培地）５ｍＪＫｉｌｉ濁した。この懸濁濁液４．５
　ｍｌに、３ｍ９７ｍ１濃度のりゾチウムを含有するＲ
培地（ミリデアフィルターで除菌した。）０．５１１Ｉ
ｌ！’ｉ添加して、３５℃で５時間静置反応させた。プ
ロトゲラスト化した細胞を７、０００　ｒｐｎ＋　（４
５００Ｎ　）、５℃、７分間で遠心分離して回収し、Ｒ
培地５ｍ１Ｋ懸濁した。同様の操作を更にもう一度行っ
た後、Ｒ培地５　ｒｎｌに再懸濁してプロトプラスト菌
液とした。

前記実施例２−（２）で得られたりガーゼ反応液５０μ
ノと２倍濃度ＴＳＭＣ液（ＴＳＭＣ液は、ＴＥＳ　２５
威、シ、−りｏ−ス０．４　Ｍ　、　ＭｇＣｔｚ　１０
　ｒｒＭｉ　。

ＣａＣ２２３０ｒｒＩｊ１１！に含み、ＮａＯＨでｐ）
Ｉ　７．２に調整した水溶液である。）５０μｔとの混
合液を上記グロトプラス）Ｓ液０．５コに添加混合した
。その後更にＰＥＧ液（ＴＳＭＣ液にポＩＪ　、Ｚ　ｆ
　Ｌ／　７　ｆす：ｒ−ル６，０００（Ｐｏ１ｙｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　６０００　）　ｋ　４０　
俤濃度に溶解する。）１．５ｍ１ｚ添加してゆるやかに
混和し、２分間室温で静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔
Ｒ培地にＩリピニルピロリドン（ＰＶＰ　：　Ｐｏ１ｙ
ｖｆｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ＊　）　４０１　／　
ｌ　ｔ’添加する。〕５ＷＬｔ’ｉ添加して、４，００
０ｒｐｍ（１８００ｇ）で１０分間遠心分離して上澄液
を除去し念。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう
一度行った後、沈降したプロトプラストを０，５ｄのＲ
−ＰＶＰ液でゆるやかに懸濁し念。３時間、３０℃忙保
った後、Ｒ−ＰＶＰ液で希釈し、一定量をテトラサイク
リン１０μＩ／ｄ濃度を含む再生培地（重層寒天培地を
用＾る。

下層寒天培地は、Ｒ培地にＰＶＰ　４０１／ｌ　　、寒
天１５９／１１を添加して作表する。上層寒天培地は、
ＰＶＰ４０ｉ／ｌ、寒天６１　／　ｌ　’ｆｃ　ｍ加シ
テ作製する。プロトプラスト懸濁液を溶けた上層寒天培
地３ゴと混合して、下層寒天培地上に重層する）に植菌
し、３２℃で７日間培養した。

得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を、テトラサ
イクリン１０μ１７１ｔｌｆ含むＬＧ寒天培地（Ｌ−寒
天培地にグルコース５ｇ／ｌ’ｒ添加した培地）上で純
化しｔ後、各菌株から前記実施例２−（１）の方法によ
シ、プラスミドを分離し、前記実施例１−（６）の方法
によ）それらのプラスミドを解析した。その結果、プラ
スミドｐＡＧ　３００１　ｋ取得し念。プラスミドｐＡ
Ｇ　３００１は、第８図に示Ｌ７を様に、プラスミドｐ
ＡＧ　５０の制限酵素Ｓ＆ｔ　ｌ切断部位に、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌由来のＩＣＤＨ産生遺伝子全含
む約３．４キロベースのＤＮＡ断片が組込まれた複合プ
ラスミドである。

（４）グラスミドｐＡＧ　３００１保有菌株のＩＣＤＨ
活性の測定 プラスミドｐＡＧ　３００１保有のコリネバクテリウム
働メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ＠ｂａｃｔ＠ｒｉｕｍｍｅｌ
ａｓｓｅｃｏ１ｍ　）　８０１　（ｐＡＧ　３００１　
）　ｆ、テトラサイクリン１０μｆｊ７ｆｎｌ含有Ｌ　
Ｇ　ＩＪン酸培地（Ｌ−プロスに、グルコース２　ｉ　
／ｌ　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７Ｆ１　／１１　、　ＫＨ
２ＰＯ４０，３，９／ｉｉを加、ｔて−７，２に脚盤し
念培地）５０ゴで、３２℃にて一晩振盪培養した。この
培養液よシ集菌し、０．８　％　ＮａＣ１水溶液２Ｑｒ
ｎｌで２回洗浄後、ＭＥＳ緩衝液１０１ｄＫ懸濁した。

これを、ブラウン社製のＭＳＫセルホモデナイザー（８
５３０２１型）で処理し念後、１４０００ｒｐｍ　（２
００００ｊ？　）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液
（粗酵素液）を制動した。この細胞抽出液を用いたＩＣ
ＤＨ活性の測定は、前記実施例１−（５）の方法によシ
行った。その結果、第２表に示した様に、プラスミドｐ
ＡＧ　３００１保持菌株は、ベクターｐＡＧ　５０保持
菌株やプラスミド非保持菌株に比べて、高１．−＞ＩＣ
ＤＨＣＤ性を示した。尚、プラスミド非保持株の培養は
テトラサイクリン無添加で行った。

（エム丁宋白） 第２表 注１）第１表の注１）と同じ 注２）　コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　　
ｓｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｇｓｅｃｏｌｍ）　　８
０１　ｏ本菌株は、微生物工業技術研究所に、微工研条
寄第５５８号とし、て寄託されている。

尚、本文中で用いた制限酵素の名称は、次の菌株から得
られる制限酵素の略称である。

ＥｃｏＲＩ　：エシェリヒア・コリ　ＲＹ１３（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＲＹ１３）ｆｌａｍＨＩ
　：　バチルス・アミロリクエファシェンスＨ（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｌＩａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎａ　Ｈ
）Ｈａｅ　ＩＩＩ：ヘモフィラス・エジプティウス（Ｈ
ａｅｍｏｐｈｌｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）Ｈｌｎｄ
Ｉｆｆ：ヘモフィラス・インフルエンザＲｄ（Ｈｍｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ　　１ｎｆｕｌｓｎｚａｅ　　Ｒｄ）Ｐ
ａｔ　Ｉ　　：プロビデンシア・スチーアーティー１６
４（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　１ｔｕａｒｔｉｉ　１６
４）Ｓａｔ　Ｉストレグトマイセス・アルバスＧＸｂａ
　ｌ　　：キサントモナス・パドリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ　ｂａｄｒｉｉ）（発明の効果） 本発明によシ、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の
ＮＡＤＰＨに特異的なＩＣＤＨ慶生遺伝子を含むＤＮＡ
断片を既存のベクターに組み込み、そのベクターの宿主
に移入することによシ、得られる宿主菌のＩＣＤＨ活性
を強化することができる。ＩＣＤＨ活性を増強するごと
によシ、生合成に２けるＮＡＤＰＨの関与する還元反応
を促進することができ、その結果その宿主菌による目的
物質の生合成の効率を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミドｐＡＧ　３０２の制限酵
素地図である。第２図は、本発明のプラスミドｐＡＧ　
３０３の制限酵素地図である。第３図は、本発明のプラ
スミドｐＡＧ　３１１の制限酵素地図である。第４図は
、プラスミドｐＡＧ　１の制限酵素地図である。第５図
は、プラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図である。第６図
は、プラスミドｐＡＧ　１４の制限酵素地図である。第
７図は、プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素地図である。 第８図は、本発明のプラスミドｐＡＧ　３００１の制限
酵素地図である。 プラスミド分子の長さは、キロペース（ｋｂ　）で表示
しである。図中記号は、発明の詳細な説明に記した制限
酵素名であシ、プラスミド上のその位置は、その制限酵
素切断部位を示す。その横に付し友数字は、第１図、第
２図、第３図、第４図、第５図、第６図、第７図、第８
図において、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲｌ　、　Ｅｃｏ
Ｒ■、　５ａｔｌ　、　Ｘｂａ　ｌ　。 Ｈｌｎｄ　ｍ　＋　Ｘｂａｌ　、　ＢａｍＨｌ　、　５
ａｔｌの切断部位を基準としたプラスミド上での位置を
、キロペースで表示したものである。第７図においてＤ
ＮＡ−（Ａ）はプラスミドｐＡＧ　１由来のテトラサイ
クリン耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片である。 特許出願人　旭化成工業株式会社 第２図 ’）ＯＬＨ５，４÷ノ 第３　口 第４図 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ（０−０／４．５） ＸＩ）（ｌＩＣ２，４７ 第６図 第７図 第８図 手続補正書（自発） 昭和６２年４月２０日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のイソクエ
   ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙ
   ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
   Ａ断片。
2. （２）該ＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム属細菌由来
   であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載
   のＤＮＡ断片。
3. （３）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のイソクエ
   ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙ
   ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
   Ａ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含
   むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡ。
4. （４）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
   菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（３）
   項記載の組換え体ＤＮＡ。
5. （５）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主ベクター系
   で用いられるベクターを含有することを特徴とする特許
   請求の範囲第（３）項記載の組換え体ＤＮＡ。
6. （６）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コリ
   ネ型細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターを含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の
   組換え体ＤＮＡ。
7. （７）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のイソクエ
   ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅｄｅｈｙ
   ｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＩＣＤＨ）産生遺伝子を含むＤＮ
   Ａ断片（Ａ）と細胞内での自律複製に必要な遺伝子を含
   むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含む組換え体ＤＮＡを保有した
   細胞。
8. （８）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
   菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（７）
   項記載の細胞。
9. （９）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主ベクター系
   で用いられるベクターを含有することを特徴とする特許
   請求の範囲第（７）項記載の細胞。
10. （１０）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コ
    リネ型細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターを含
    有することを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載
    の細胞。
11. （１１）該細胞が、エシェリヒア属細菌であることを特
    徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の細胞。
12. （１２）該細胞が、コリネバクテリウム属細菌であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の細胞。