JPS62201585A - クエン酸合成酵素産生遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のクエ
ン酸合成酵素（Ｃｉｔｒａｔｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ、以
下しばしばＣ８と略す）産生遺伝子を含むＤＮＡ断片、
及び該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ。

及び該組換体ＤＮＡを保有する細胞に関する。

グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量にＬ−グルタ
ミン酸を生産することが知られている。

またその変異株は、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシン
酸等のプリンヌクレオチドを生産することが知られてい
る。

（従来の技術） 工業的に有用なグルタミン酸生産性コリネ型細菌につい
て、ＤＮＡ組換技術による育種改良が試みられている。

該細菌のＤＮＡ組換え技術による育種改良の重要な要素
として、該細菌のある目的遺伝子を含んだＤＮＡ断片が
ある。

今までに、グルタミン酸生産コリネ型細菌では。

次の遺伝子が、クローニングされている。

石田ら（昭和５８年１日本醗酵工学会大会講演要旨集Ｐ
、２８４）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ａｃｔｏ−ｆ
ｅｒ＋ｍｅｎｔｕｍ）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（
Ｈｏｍｏ−ｓｅｒｉｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
）遺伝子をクローニングした。伊藤ら（日本農芸化学会
昭和５９年度大会講演要旨集Ｐ、４３１）は、ブレビバ
クテリウム・□ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　１ａｃｔｏ−ｆｅｒ＋ｓｅｎｔｕｍ）
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｅｎｏｌ　ｐｙｒｕｖａｔａ　ｃａｒｂｏｘｙ
ｌ−ａｓｅ：　ＰＲＰＣ）遺伝子をクローニングした０
勝亦ら（特開昭５８−１２６７８９）は、コリネバクテ
リウム・グルタミクム（並■朋加脛ｅｅｒｉｕｍ　ｄユ
型−１μ徂）（ＡＴＣＣ２１５４３）の５−（２−アミ
ノエチル）システィン耐性を支配する遺伝子と。

ブレビバクテリウム・フラブム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０６７）のアン
スラニル酸合成酵素（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ　５ｙ
ｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子をクローニングした。水上ら
（日本農芸化学会昭和５９年度大会講演要旨集Ｐ・２４
９）は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃａｒ　
ｎｅｂａｃｔｅ−１す］上白ユ説四）のＡＴＰ−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（ＡＴＰ　−Ｐｈｏｓｐ、
ｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒ−ａｓｅ）遺伝子
をクローニングした。三輪ら（特開昭５９−１９６０９
８）は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏ−ｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ）（Ａ　Ｔ　ＣＣ１３８６９）のアンスラニ
ル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ａｎ−ｔｈｒ
ａｎｉｌａｔａ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａ
ｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子をクローニングした。佐野ら
（特開昭５９−２１０８８７）は、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｎ＋　１ａｃｔｏｆｅｒｎ＋ｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１
３８６９）のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ｍｅｓｏ
−２，６−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ　ｃａｒｂ
ｏｘｙ−１ｙａｓｅ）遺伝子をクローニングした。申合
ら（特開昭６Ｏ−６２９８３）は、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｌａｃｔｏ−ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のヒスチジノー
ルホスファターゼ（Ｉｌｉｓｔｉｄｉｎｏｌ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ）遺伝子をクローニングした。申合ら（
特開昭６Ｏ−６２９８２）は、ブレビバクテリム・ラク
トファーメンタム（Ｂｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のホモセリン拳キナー
ゼ（Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ）遺伝子をク
ローニングした。申合ら（特開昭６０−６６９８４、同
６Ｏ−７００９３）は、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔａｒｉｕｍ　ｌａｃ
ｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のコリスミン酸ムターゼ（Ｃ
ｈｏｒｉｓｍａｔｅ　ｎ＋ｕｔａｓｅ）βサブユニツト
遺伝子をクローニングした。

（発明が解決しようとする問題点） トリカルボン酸回路は、有機物の酸化に係るだけでなく
、そのトリカルボン酸回路で得られる中間体をアミノ酸
、核酸等の菌体成分の生合成のために供給するという役
割を有する。このトリカルボン酸回路の第１段反応を触
媒するのが、クエン酸合成酵素（Ｃｉｔｒａｔｅ　５ｙ
ｎｔｈａｓｅ：　ＣＳ　）である６従って、このＣ８を
強化すればトリカルボン酸回路の働きが活発になり、そ
の結果多量の中間体を供給できるためそれから合成され
るアミノ酸や核酸などの物質の生産性を大きく改善する
ことができる。しかしながら従来Ｃ８活性を強化する有
効な手段が見い出されていなかった。

（問題点を解決する為の手段および作用）本発明者らは
上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌より該細菌のＣ８産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片を単離することに成功し、遺伝子操作に
より該ＤＮＡ断片でグルタミン酸生産性コリネ型細菌や
有用物質生産菌を形質転換することによりこれらの細菌
のＣ８活性を増強できることを見い出した。これらの知
見により本発明者らは本発明を完成するに到った。

即ち、基本的には１本発明によれば、グルタミン酸生産
性コリネ型細菌由来のＣＳ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
が供給される。

また２本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と細胞内での
自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含有する
組換え体ＤＮＡが提供される。

更にまた本発明によれば、グルタミン酸生産性コリネ型
細菌由来のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と細胞内で
の自律複製のために必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片とを
含有する組換え体ＤＮＡを保有する細胞が提供される。

グルタミン酸生産性コリネ型細菌とは、ダラム染色陽性
、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビオチンを要求
するコリネ型細菌である。また該細菌は、ビオチン制限
培地で、または高濃度ビオチン含有培地では界面活性剤
等の添加により、培地中にＬ−グルタミン酸を著量蓄積
する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌のＣ８産生遺伝
子を含むＤＮＡ断片の分離には、大腸菌の宿主ベクター
系を用いることができる。尚、該ＤＮＡ断片の分離には
、グルタミン酸生産性コリネ型細菌の宿主ベクター系を
用いることも可能である。大腸菌の宿主ベクター系とし
ては、エシェリヒア・コリＫ　１２　（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏ旦に１２）の変異株を、ベクターとして
は、該菌種の公知のプラスミドを用いた宿主ベクター系
があげられる。以下グルタミン酸生産性コリネ型細菌の
Ｃ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離について詳細に
説明する。

（１）　　グルタミン酸生産性コリネ型細菌の菌体より
全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断する。全ＤＮＡの抽
出は１通常用いられている方法（リゾチウム・ＳＤＳ処
理とフェノール・クロロホルム処理）により行うことが
できる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、上
記細菌の全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ本目的に使用
する大腸菌ベクターの開裂に用いることができる制限酵
素であればいずれも使用可能である。この除用いる制限
酵素が目的遺伝子の内部を切断するかどうかは事前に不
明なので適当な条件で制限酵素を弱く作用させ、ＤＮＡ
を部分的に分解することにより目的遺伝子を完全に含む
様な適当な大きさのＤＮＡ断片が得られる。

（２）ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。

ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制限
酵素を充分作用させることにより行なう。

（３）ベクターＤＮＡの開裂部位に（１）で得たＤＮＡ
断片を組み込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡをつくる。

ベクターＤＮＡの開裂部位にＤＮＡ断片を組み込ませる
には、公知の常法例えばマニアティスらの方法〔ティー
・マニアティス、イー・エフ・フリッチュ、ジェイ・サ
ンプルツク：モレキュラー　クローニング　ア　ラボラ
トリ−マニュアル、コールド　スプリング　ハーバ−ラ
ボラトリ−、コールド　スプリング　ハーバ−エフ・ワ
イ・１９８２　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ
１ｔｓｃｈ、Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ−ｕａｌ、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｎ、Ｙ、
　１９８２　）　）を用いることができる。

（４）組換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に移入する。

宿主となる大腸菌は、目的遺伝子をクローニングした場
合宿主の表現型に変化が現れるものであれば、いずれで
も用いることができる。一般には。

その様な変異株を使用する必要がある。Ｃ８産生遺伝子
をクローニングする場合には、宿主となる大腸菌はＣ８
活性を欠損している必要がある。そうすれば宿主はグル
タミン酸を生育の為に要求する。従って、外来のＣ８産
生遺伝子を含むＤＮＡ断片が移入されると、その宿主は
グルタミン酸を生育に要求しなくなり他と識別すること
ができる。

大腸菌でＣ８欠損株を育種する場合には大腸菌をＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン（Ｎ　−
Ｍｅｔｈｙｌ　−Ｎ’　−ｎ１ｔｒｏ　−Ｎ　−ｎｉｔ
ｒｏｓｏｇｕａｎｉ−ｄｉｎｅ、ＮＴＧ）を用いて、公
知の常法に従って変異処理し、さらに公知の常法に従っ
てＬ−グルタミン酸要求株を分離し、それらの酵素活性
測定試験を経て、Ｃ８欠損株を取得することができる。

ＮＴＧ変異処理の代りに、他の公知の変異誘導法〔例え
ば、紫外線照射、Ｘ線照射、その他の変異誘起剤処理、
トランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）処理〕を用い
ることもできる。また、研究者や公的機関より分譲され
たＣ８欠損株を使用することもできる。

宿主に選定した大腸菌が、制限能を有している場合には
、その宿主大腸菌にベクターＤＮＡを一旦移入し、得ら
れた形質転換株より調製したベクターＤＮＡを前記（２
）で用いる必要がある。組換え体ＤＮＡの移入は、公知
の方法例えばマンデルらの方法（マンデル、エム０．ヒ
ガ、エイ、ニジエイ。

モル、パイオル０，５３巻１５９−１６２頁１９７０年
（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、。

１１ｉｇａ、Ａ、：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　５３，
１５９−１６２（１９７０）））によって行なうことが
できる。

（５）組換え体ＤＮＡを移入された大腸菌の中から目的
遺伝子を有する菌株を選択分離する。上記の工程によっ
て得られる大腸菌の中で目的遺伝子を有するものはごく
わずかなので目的とする菌株を選択する必要がある。−
次選択方法としては。

目的遺伝子が移入された菌株の表現型の変化を検出でき
る培地で前記（４）で得られた菌体を常法通り培養する
。その結果予定の変化の現れた菌体を選択分離すること
ができる。前記の宿主でＣ８産生遺伝子をクローニング
する場合には、グルタミン酸無添加合成培地上で生育す
る菌株を選択する。最終的に目的遺伝子をクローニング
した菌株を選択するには目的遺伝子の産物の有無を調べ
る。

その結果により目的の菌株が選択できる。目的遺伝子が
酵素遺伝子の場合にはその酵素活性を測定する。Ｃ８産
生遺伝子をクローニングする場合には、グルタミン酸無
添加合成培地で生育した菌株について、それらの細胞抽
出液を用いて常法によりＣ８活性を測定する。その結果
、Ｃ８活性を有する形質転換株を分離し、該株を培養す
ることによりＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離す
ることができる。

ＣＳ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片は、次の特徴を有する
。

（１）該ＤＡＮ断片は、分子の長さが約４．９キロベー
スのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、制限酵素ＸｂａＩによっ
て生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　（切断部位数） ＢａｍＨＩ　　　　　　　　　２ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　０ Ｈｉｎｄ　ｍ　　　　　　　　　２ Ｐｓｔ　Ｉ　　　　　　　　　ｌ ５ａｉｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｘｂａ
　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　０Ｘｈｏ　Ｉ　　　
　　　　　　　　　　　　２制限酵素による切断部位は
、過剰の制限酵素存在下でＣＳ産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片を有するプラスミド例えば後述のρＡＧ４０１を完
全消化し、それらの消化物を１％アガロースゲル電気泳
動および４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、
分離可能な断片の数から決定される。分子量は、アガロ
ースゲル電気泳動の場合には、大腸菌のラムダファージ
（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素）ｆｉｎｄ［［［
で消化して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガ
ロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
またポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合には、大腸
菌のファイ・エックス１７４フアージ（φＸ　１７４　
　ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｓ　ｍで消化し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
消化プラスミドｐＡＧ４０１の分子の長さを算出する。

複数の断片を生じる場合には、それぞれの分子の長さを
加算して求める。尚、各ＤＮＡ断片の分子の長さの決定
には、ｌｋｂ以上の分子の長さについては１％アガロー
スゲル電気泳動を用い、約０．１ｋｂからｌｋｂ未満の
分子の長さについては４％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を用いた。

上記プラスミドに対する前記制限酵素の相対的な切断部
位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で解析することにより、決めることができる
。このようにして得られるＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ
断片は必要に応じて縮小化することができる。縮小化は
該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で消化することにより行
うことができる。本発明のＤＮＡ断片はその様なＣ８産
生遺伝子を含む縮小化されたＤＮＡ断片も包含する。縮
小化によって得られるＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
としては、例えば、２種類の約３．２キロベースの分子
の長さを有するＤＮＡ断片があげられる。これらの縮小
化されたＤＮＡ断片がＣ８産生遺伝子を含むことは、該
ＤＮＡ断片を組込んだプラスミド保持菌株のＣ８比活性
が増大していることにより確認することができる。

上述の分子の長さをもつ縮小化されたＤＮＡ断片は、次
の様な特徴を有する。

の　さが・３．２キロベースのＤＮＡ　　　その１（１
）該ＤＮＡ断片は、分子の長さが約３．２キロベースの
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、制限酵素Ｂａ１１）ＩＩ
によって生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　（切断部位数） Ｂａ＋ｍＨＩ　　　　　　　　　０ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　０ Ｅｉｎｄ　ｍ　　　　　　　　Ｑ ＰｓｔＩ　　　　　　　　　０ ５ａｌＩ　　　　　　　　　Ｉ ＸｂａＩ　　　　　　　　　０ ＸｈｏＩ　　　　　　　　　　　　　　　１分子の長さ
が約３．２キロベースのＤＮＡ断片その２（１）該ＤＮ
Ａ断片は、分子の長さが約３．２キロベースのデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）である。

（２）該ＤＮＡ断片の両端は、それぞれ制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１，５ａｌＩによって生じる一本鎖末端である。

（３）該ＤＮＡ断片は、下記制限酵素に対し、次の切断
感受性を有する。

（制限酵素）　　　　　（切断部位数）Ｂａ■ＨＩ　　
　　　　　　　　０ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　　　　０ Ｈｉｎｄ　ｍ　　　　　　　　　　０ ＰｓｔＩ　　　　　　　　　　０ ５ａｌＩ　　　　　　　　　　０ ＸｂａＩ　　　　　　　　　　０ ＸｈｏＩ　　　　　　　　　　１ 現在の遺伝子操作技術では、制限酵素切断部位をなくし
たり、他の制限酵素切断部位に変更したりする等、ＤＮ
Ａ断片の一部を変更することは、容易である。故に、前
述のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片においても、同様
の操作を行うことは、容易である。従って、その様に一
部を変更したＤＮＡ断片であっても、Ｏ８産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含まれることは
、明白である。

本発明の組換え体ＤＮＡは上述のグルタミン酸生産性コ
リネ型細菌由来のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片と細
胞内での自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片とを
含有する。後者のＤＮＡ断片としては大腸菌の宿主ベク
ター系、枯草菌の宿主ベクター系、グルタミン酸生産性
コリネ型細菌の宿主ベクター系などで用いられるベクタ
ーを含むものが挙げられる。大腸菌の宿主ベクター系で
用いられるベクターとしてはプラスミドρＢＲ３２５及
びそれより由来するプラスミドが挙げられる。枯草菌の
宿主ベクター系で用いられるベクターとしてはプラスミ
ドｐＵＢ１１０などが挙げられる。グルタミン酸生産性
コリネ型細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターと
してはプラスミドｐＡＧ１．プラスミドｐＡＧ３、プラ
スミドｐＡＧ５０及びそれらのプラスミドより由来する
プラスミドが挙げられる。

本発明の組換え体ＤＮＡは上述のＣ８産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片と自律複製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片
とを結合させることによって得ることができる。本発明
の組換え体ＤＮＡの作成には種々の宿主ベクター系を用
いることができ、例えば上述の大腸菌の宿主ベクター系
、枯草菌の宿主ベクター系、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌の宿主ベクター系などを用いることができる。ま
た本発明の組換え体ＤＮＡとしては、例えば、ｐＡＧ４
０１＋　ＰＡＧ４００１、ＰＡＧ４００２、ｐＡＧ４０
０３などがあげられる。組換え体ＤＮＡ　ｐＡＧ４０１
は、Ｃ８産生遺伝子を含む上述のＤＮＡ断片を大腸菌の
プラスミドｐＢ８３２５由来のプラスミドに組込んだ複
合プラスミドである。組換え体ＤＮＡ　ｐＡＧ４００１
、ＰＡＧ４００２、ｐＡＧ４００３は、Ｃ８産生遺伝子
を含む上述のＤＮＡ断片をグルタミン酸生産性コリネ型
細菌のプラスミドρＡＧ５０又はｐＡＧ５０由来のプラ
スミドに組込んだ複合プラスミドである。プラスミドＰ
ＡＧ５０は、本発明者が、特願昭５９−２２６６５１で
開示したグルタミン酸生産性コリネ型細菌のベクタープ
ラスミドであり、後述の方法により得ることができる。

また１本発明の細胞は、遺伝子操作によって得られる本
発明の組換え体ＤＮＡを保有する全ての細胞を包含する
。本発明の組換え体ＤＮＡを保有する細胞としては１例
えば宿主を大腸菌をした場合にはエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　Ｗ６２０
（ｐＡＧ４０１）などがあげられ、宿主をグルタミン酸
生産性コリネ型細菌とした場合には、コリネバクテリウ
ム０メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（ｐＡＧ４００１）、コ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１（ｐＡ
Ｇ４００２）、コリネバクテリウム・メラセコラ（並■
ｎｅｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
　８０１（ｐＡＧ４００３）などがあげられる。宿主で
あるコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１は
、土壌より新たに分離された菌株であり１本発明者によ
り特願昭５９−２２６６５１号明細書に開示されている
。尚、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅ−妖憇ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１は、
微生物工業技術研究所に寄託されており、その寄託番号
は、微工研条寄第５５８号である。

上述のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片は、次の様にし
て分離することができる。先づ、該ＤＮＡ断片を含有す
る組換体ＤＮＡを制限酵素で処理して、ベクターＤＮＡ
とＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片とに切断し、次に、
この制限酵素処理試料を、アガロースゲル電気泳動に供
する。アガロースゲル電気泳動上でベクターＤＮＡ断片
とＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片とを充分分離する為
には、該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡを、複数
の制限酵素で処理する必要がある場合もある。

次に目的のＤＮＡ断片を含有するアガロースゲルを切り
出し、それぞれのアガロースゲルを溶かした後、フェノ
ール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿により、Ｃ８産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を分離することができる。

以下実施例により本発明の詳細な説明するが本発明はこ
れに限定されるものではない。

（以下余白） （実施例） 実施例１ 本実施例は、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｌ１ｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）　８０１　（微工研条寄第５５８号）をＤＮＡ供与
体として、該菌株のＣ８産生遺伝子を大腸菌の宿主ベク
ター系を利用してクローニングした例である。大腸菌宿
主としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　　Ｋ６２０を用い、大腸菌ベ
クターとしては、ベクターｐＢＲ３２５を用いた。コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓ−ｓｅｃｏｌａ）　８０１は、微
生物工業技術研究所に微工研条寄第５５８号として寄託
されている。ベクターＰＢＲ３２５は、ベゼスダ・リサ
ーチ・ラボラトリ−社（米国）より購入した。エシェリ
ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ
　１２　　Ｗ　６２０はＣＳ欠損株であり、ジェイ・ア
ール・ゲスト（Ｊ、　Ｒ。

Ｇｕｅｓｔ）より分譲をうけた（バーバート及びゲスト
。

ジェイ、ジエン、マイクロパイオル、５９巻３６３頁１
９６８年（Ｈｅｒｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｇｕｅｓｔ、　Ｊ
、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５３．３６３　（１９６８）　）
　）　。尚。

該菌株はイー・コリ　ジエネテインク　ストックセンタ
ー〔イー・コリ　ジエネテイツク　ストックセンター、
デパートメントオブヒューマンジェネティックス、エー
ルユニバーシティースクールオブメディシン、３３３シ
ーダーストリート　ピー、オー、ボックス３３３３、ニ
ューヘイブン、コネチカット０６５１０アメリカ合衆国
（Ｅ、　ｃｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎ
ｔｅｒ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　！（ｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

３３３　　Ｃｅｄａｒ　　５ｔｒｅｅｔ　　Ｐ、　　Ｏ
，［３ｏｘ　　３３３３　　Ｎｅｗ　　Ｈａｖｅｎ。

Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０　Ｕ、Ｓ、Ａ、）
のバーバラ　シェイパツクマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ、
　Ｂａｃｈｍａｎｎ）からも分譲を受けることができる
。上記機関からはだれでも該菌株の分譲をうけることが
できる。

（１）　コリネバクテリウム・メラセコラ（包墜匣−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎ＋ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０
１　（微工研条寄第５５８号）からの全ＤＮＡの調製と
その切断。

糖蜜培地（ビート廃糖Ｗｉ８０ｇ／Ｑ、Ｍｇ５ｏ４・７
　Ｈｔ　Ｏ０、５ｇ　／　Ｑ、尿素８ｇ／Ｑ、リン酸１
’、５ｇ／Ｑを含む溶液をｐ）１６　、２に調整後１２
０”Ｃ１５分間殺菌する）１００ｍｆｆｉに、コリネバ
クテリウム・メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｍｅｌａｓ−ｓｅｃｏｌａ）　８０１　（微工研
条寄第５５８号）を植菌し、３２℃にて一晩振どう培養
した。得られた培養液より菌体を集め、洗浄した後、１
０ｍＭ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔ
ｒｉｓ（ｂｙ−ｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ＋
ａｅｔｈａｎｅ、以下Ｔｒｉｓと略す〕−ＨＣＩ（ｐＨ
８，０）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡの緩衝液８ｍＭに懸濁し
た。これにリゾチウムを最終濃度５　ｍ　ｇ　／　ｍ　
４１になるように加え、３７℃にて４時間反応させた。

これにプロナーゼＥ（シグマ社より購入）を最終濃度２
００μｇ／＋ａＱになるように加え、室温で１５分間反
応させた。その後、ドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度
１％になるように添加して３７℃にて１時間反応させた
。反応終了後、反応液と等容のＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　
ＮａＣ１，ｐＨ８，０）で飽和したフェノールを加え混
合した後、１０，０００　ｐ　ｐ　ｍ　（１１，０００
ｇ　）で１０分間遠心分離して水層を回収した。この水
層にフェノール・クロロホルム（１：１、Ｖ／Ｖ）液を
等容加えて混合の後、１０．００Ｏｒ　ｐ　ｍ　（１１
，ＯＯＯｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収した。

この水層に更に等容のクロロホルムを加えて混合の後、
１０．００Ｏｒ　ｐ　ｍ　（１１，０００ｇ　）で１０
分間遠心分離して水層を回収した。この水層にリボヌク
レアーゼＡ（シグマ社より購入）を最終濃度４０μｇ　
／　ｍ　Ｑになる様に加えて３７℃にて１時間反応させ
た。

反応終了後、１１５容の５ＭＮａＣ１水溶液と１／４容
の５０％ポリエチレングリコール６．０００水溶液を添
加混合し、４℃にて４時間保持した。得られた試料を５
，０ＯＯｒ　ｐ　ｍ　（２，７００ｇ）で２０分間遠心
分離し、沈殿を回収した。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｆｆ
１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１＋ｏＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ
７、５）４　ｍ　Ｑに溶かし、酢酸ナトリウムを最終濃
度３００ｍＭになるように加えて、２倍容のエタノール
を添加した。同試料を攪拌の後、−３０℃にて３時間保
持し、１０．０００　ｒ　ｐ　ｍ　（１１，ＯＯＯｇ）
で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。同沈殿を減圧
乾燥の後、ＴＥ緩衝液２ｍ１２に溶解し、ＤＮＡ１ｆｉ
度０．８５ｍｇ／圓Ｑの全ＤＮＡ溶液を得た。

全ＤＮＡの切断のためには、１２８μｇの全ＤＮＡに対
して、１３単位の制限酵素ＸｂａＩにッポンジーン社よ
り購入）を加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，４）　、　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００＋ｏＭ　Ｎ
ａＣ１、の緩衝液２００μα中で３７℃にて２時間反応
させた。その後７０℃で１０分間加熱して反応を停止さ
せた。（ＤＮＡ試料■） （２）ベクターｐＢＲ３２５の調製と開裂とＸｂａ　Ｉ
リンカ−の組込み 先づ、ベクターｐＢＲ３２５をエシェリヒア・コリ（ε
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｋ　１２　　Ｗ
　６２０に移入し、得られた形質転換株からｐＢＲ３２
５を調製した。即ち、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
−ｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）　　Ｋ１２　　Ｗ６２０を５
０ｍｍのＬ−ブロス（ポリペプトン１０　ｇ　／　Ｑ、
酵母エキス５　ｇ／　Ｑ　、　ＮａＣ１５ｇ／　Ｑ　　
ｐＨ７，２＞に植菌し、３７℃にて菌濃度５　Ｘ　１０
”個／　ｍ　ｎまで増殖させた後、２℃で集菌した。該
菌体を５０　ｍ　Ａの氷冷した１　００　ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２水溶液に懸濁し、Ｓ菌後更に２５ｍｍの氷冷した１
　００’ｍＭ　ＣａＣｌ２水溶液に想濁した。水中で３
０分保持した後、集菌して再度５　ｍ　Ｑの氷冷した１
　００　ｍＭ　ＣａＣｌ２水溶液に懸濁し、水中で１時
間保持した〔コンピテントセル（Ｃｏｍ−ｐｅｔｅｎｔ
　ｃｅｌｌ））　、＋この菌Ｓ濁液２００μＱに０゜１
μｇのｐＢＲ３２５ＤＮＡを添加して、水中で１時間保
持した。その後４２℃にて２分間保持した後、５ｍｆｉ
のＬ−ブロスを添加して、３７℃にて９０分間静置培養
した。得られた培養液を適当に希釈して、１０μｇ／ｍ
Ｑのテトラサイクリンを添加したＬ−寒天培地（Ｌ−ブ
ロスに１５ｇ／悲の寒天を添加した培地）に塗布し３７
℃で一晩培養した。得られたｐＢＲ３２５による形質転
換株：ｒ−シｘ’Ｊヒフ　　：ｉ＋ＪＫ１２　　Ｗ６２
０　（ｐＢＲ３２５）より、以下のようにして該ベクタ
ーの調製を行った。

ベクターｐＢＲ３２５を保持したエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　Ｗ　
６２０を。

１００ｍＡのテトラサイクリン（１０／ｊｇ／ｍＱ）を
含むＬ−グロスに植菌し、３７℃にて一晩培養した。得
られた培養液より集菌しＴＥ緩衝液で洗浄後、１５％シ
ュークロース、　５　ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
８、５）、５０ａＭ　ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍｕリゾチウ
ム（シグマ社）よりなる水溶液２ｍｆｉに調濁し、室温
にて３０分間反応させた。次にトリトン溶液〔０，１％
トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）、　
　５０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ、５０＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，５）２ｍＡを加えて３７℃にて３０分間保持
した。次にこの溶液を、５℃にて３０，０００　ｒ　ｐ
　ｍ　（６４，０００ｇ　）で１時間遠心分離し上清を
回収し、ＴＥ緩衝液を加えて１８ｍｆｌとした。この液
に、１０＋ａｇ／ａｎのエチジウムブロマイド水溶液１
．２ｍＱと塩化セシウム１８．６４　ｇとを加えて静か
に溶解し、４０，０００ｒ　ｐ　ｍ　（１００，ＯＯＯ
ｇ）　、　１５℃で４８時間遠心分雛した。ベクターｐ
ＢＲ３２５は、紫外線照射により遠心チューブ中、２本
のバンドの下方として見い出され、このバンドを遠心チ
ューブの側面から注射器で抜き取ることにより、ベクタ
ーｐＢＲ３２５を分離した。次にこの分画液を等容量の
イソプロピルアルコールで４回抽出して、エチジウムブ
ロマイドを除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析し
て、ＤＮＡ濃度１９０μｇ／ｍＱのベクターｐＢＲ３２
５の透析完了液１ｍＱを得た。

ベクターｐＢＲ３２５ＤＮＡ５μｇに対して２０単位の
制限酵素ＥｃｏＲＩを加えて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ７，４）　、　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１
００ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１、の緩衝液５０μＱ中で３７℃に
て２時間反応させた。その後、７０℃で１０分間加熱し
て反応を停止させた。この液に酢液ナトリウムを最終濃
度３００ｎ＋Ｈになる様に加え、２倍容のエタノールを
添加して、−３０℃にて３時間保持した。次に１２，０
００　ｒ　ｐ　ｍ　（８，９００ｇ　）で１０分間遠心
分離してＤＮＡ沈殿を回収し、同沈殿を減圧乾燥した（
ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料■と３単位Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、　
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）　（宝酒造株式会
社より購入）とを、　　３３　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＨ，
Ｃ００Ｈ（ｐＨ７、９）、６６ｍＭ　ＣＩ、ＧＯＯＫ、
ｌ　ＯｍＭ　（ＣＨ，Ｃｏｏ）、Ｍｇ、　０．５ｍＭジ
チオトレイトール、Ｏ、ｌ　ｍｇ／ｍ　Ｑ　ＢＳＡ（Ｂ
ｏｖｉｎａ　５ｅｒｕｏ＋ａｌｂｕｍｉｎ）　（ベゼス
ダリサーチラボラ１〜り一社より購入）、０．１ｍＭ２
’−デオキシアデノシン　５′−トリホスフェート（シ
グマ社、米国より購入）、０゜１　ｎ＋Ｍ　２　’−デ
オキシシチジン　５′−トリホスフェート（シグマ社、
米国より購入）、０．１ｍＭ　２’−デオキシグアノシ
ン　５′−トリホスフェート（シグマ社、米国より購入
）、Ｏ，ｌ＋ａＭチミジン　５Ｉ−トリホスフェート（
シグマ社、米国より購入）の反応液４４μΩ中で３０’
Ｃにて２０分間反応させた。この液に酢酸ナトリウムを
最終濃度３００ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノー
ルを添加して、−３０℃にて３時間保持した０次に１２
．０００ｒρｍ　（８，９００ｇ　）で１０分間遠心分
離してＤＮＡ沈殿を回収し、得られた沈殿を減圧乾燥し
た（ＤＮＡ試料ＩＩＩ）。

Ｘｂａ　Ｉリンカ−（Ｘｂａ　Ｉ　　１ｉｎｋｅｒ）　
（宝酒造株式会社より購入）１．５μｇとＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｔ４Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
　ｋｉｎａｓｅ）（宝酒造株式会社より購入）２．５単
位とを、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、
１ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，、１ｍＭスペル
ミジン、１５ｍＭジチオトレイトール、０゜２ｍｇ／ｍ
ＱＢＳＡの反応液１０μＱ中で３７℃にて１時間反応さ
せた（ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料■の１／２量とＤＮＡ試料試料量全量４ファ
ージＤＮＡリガーゼ（Ｔ４Ｐｈａｇｅ　ＤＮＡｌｉｇａ
ｓｅ）　（宝酒造株式会社より購入）６単位とを、６６
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７、６）、１ｍＭ　Ａ
ＴＰ、１０ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１，，１ｍＭスペルミジン、
１５ｍＭジチオトレイトール、０．２ｍｇ１０ｆｉ　　
ＢＳＡの反応液２２μΩ中で２２℃にて４時間反応させ
た。この反応液に等容のフェノール・クロロホルム（１
：１゜ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌の後、水層を
回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍ
Ｍになる様に加え１次に２倍容のエタノールを添加して
、−３０’Ｃ７−３時間保持り、　タ後、１２，０００
ｒｐｍ（８，９００ｇ　）で１０分間遠心分離してＤＮ
Ａ沈殿を回収しこれを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。

ＤＮＡ試料試料量全量して、１５単位の制限酵素Ｘｂａ
　Ｉを加えて、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−）１ｃＩ（ｐ
Ｈ７、４）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１の緩衝液５０μＲ中で３７℃にて、２時間反応させ
た。消化した試料は、前記の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。ただし電気泳動には、ベゼス
ダ・リサーチラボラトリ−社より購入したＬＭＰアガロ
ースを使用し、４℃で電気泳動した。次にエチジウムブ
ロマイドで染色したアガロースゲルを紫外線照射下に虹
き、６．０キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、そ
の付近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガ
ロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、
６５℃で１０分間加熱し、アガロースゲルを完全にとか
した。

次に等容のフェノールを添加して攪拌後、水層を回収し
た。得られた水層に、等容のフェノール・クロロホルム
（１：　１．ｖ／ｖ）液を添加して。

攪拌の後水層を回収した。得られた水層に等容のクロロ
ホルムを添加して攪拌後、水層を回収した。

得られた水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度３゜ＯｍＭ
になるように添加し、更に２倍容のエタノールを加えて
攪拌の後、−３０℃で３時間保持した。

その後１０．００Ｏｒｐｍ（９，０００ｇ　）で１０分
間遠心分離してＤＮＡ沈殿を回収した。次に、得られた
沈殿を減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。

（３）組換え体プラスミドの作成 りＮＡ試料１２μｇとＤＮＡ試料試料量全量単位のＴ４
ファージＤＮＡリガーゼとを、５０ＩＩＩＭＴｒｉｓ　
−ＨＣＩ（ｐＨ７、４）、１０　ｍＷ　ＭｇＣ１ｚ　、
　１０　ｍＷジチオトレイトール、１ｍＮスペルミジン
、１ｍ１ｌｌＡＴＰ、０．１ｍｇ／ａ＋ＲＢｓＡの緩衝
液４Ｏｆｉ　Ｑ中で、１５℃にて一晩反応させた。その
後７０℃にて１０分間加熱することにより１反応を停止
させた。

（４）組換え体プラスミドの大腸菌への移入前記実施例
１−　（２）の方法により、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｗ６２０の
コンピテントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ）を
調製した。

得られた細胞懸濁液４００μＱと前記実施例１−（３）
の反応液４０μαとを混合して、水中に１時間保持した
。その後、４２℃にて２分間加熱した後、５ｍｆｉのＬ
−ブロスを添加して３７℃にて９０分間静置培養した。

次に、得られた培養液から集菌し、無菌水に懸濁した。

得られた懸濁液を、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＱ
）を添加した合成寒天培地ＣＭｇ５Ｏ−・７Ｈ２００−
２ｇ／　ｎ、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ４Ｈ，０
）　２ｇＩＱ、無水リン酸水素二カリウム（に２１（Ｐ
Ｏｌ・ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）　Ｌｏｇ／　Ｑ　、　Ｎａ
ＨＮＨ，ＰＯ，・４Ｈ，０３，５ｇ／　Ｑ、グ／Ｌ／：
Ｉ−ス１ｇ、／Ｑ、寒天１．５ｇ／４゜塩酸チアミン５
　ｍｇ／　Ｑ　、ウラシル３５ｍｇ／　Ｑ　）に塗布し
て培養した。

（５）コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕豆−ｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１
　（微工研条寄５５８号）のＣ８産生遺伝子を有する大
腸菌の選択分離 前記実施例１−（４）で得られた菌株を、アン。

ピシリン（３０μｇ／ｍｌ）とテトラサイクリン（１０
μｇ／ｉｎ）とを含む前記合成寒天培地で培養し、生育
の有無を調べた。その結果、アンピシリン耐性テトラサ
イクリン耐性グルタミン酸非要求性を示す菌株を目的の
Ｃ８産生遺伝子を保有した大腸菌エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２Ｗ　６２
０　（ｐＡＧ４０１）として分離した。

該大腸菌のＣ８活性を、下記の方法で測定することによ
り、クローニングした遺伝子がＣ８産生遺伝子であるこ
とを確認した。合成液体培地（前記合成寒天培地より寒
天を削除した培地組成）５０ｍｇで、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｗ
　６２０　（ｐＡＧ４０１）を振盪培養した。該大腸菌
を集菌後、０．８％のＮａＣ１水溶液１０ｍｇで洗浄し
、２ｍＱのＭＥＳ緩衝液［５０ｍＭ　２−（Ｎ−モリフ
オリノエタンスルホン酸：阿ＥＳ、１０　ｍＭ　Ｍｎ５
Ｏ，、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０］に懸濁した
。これを超音波処理した後、１４，０００　ｒｐｍ　（
２０，０００ｇ）で２０分間遠心分離して、細胞抽出液
（粗酵素液）を調製した。尚、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ旦）Ｋ１２Ｗ６２０、エシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）
　Ｋ　１２　Ｗ　６２０　（ｐＢＲ３２５）を培養する
場合には、前記合成液体培地にグルタミン酸ナトリウム
（ＭＳＧ）　０．５　ｇ＃ｌを添加した。エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　
２　Ｗ　６２０　（ｐＡＧ４０１）、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　
Ｗ　６２０　（ｐＢＲ３２５）を培養する場合には、前
記合成液体培地にテトラサイクリン１０μｇ／ｍ　１２
を添加した。

ＣＳ活性は、３．ＯｍＱの酵素反応液（９５ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−＋＋ｃｔ（ｐｕ　ａ、ｏ）、０．２　ｍＷオキザ
ロ酢酸、０．１　ｍＭ　５．５’−ジチオビス−（２−
ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）。

０．１６　ｆｆ１Ｍ　７セチ）Ｌｔ−Ｃ，ｏＡ、　１０
　ｐ　ｎ細胞抽出液〕の４１２　ｎｍの吸光度の増大を
、日立分光光度計（２２８型）で測定することにより求
めた。

また、細胞抽出液の蛋白質濃度の測定には、ローリ−ら
（オー、エイチ、ローリ−、エフ、ジエイ。

ローウェブロー、アール、ジエイ、ランダル、ジエイ、
パイオル、ダム。１９３巻２６５頁１９５１年（０，Ｈ
，Ｌｏｗｒｙ。

Ｎ、Ｊ、Ｒｏｗｅｂｒｏｕｇｈ、　Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａ
ｌｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１９３、２６５　（１９５１）））の方法を用いた。尚
、同測定の標準蛋白質として、ウシ血清アルブミン（和
光純薬工業社より購入）を用いた。測定結果を第１表に
示した。第１表のＣ８比活性測定結果より、エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２
　Ｗ６２０（ｐＡＧ４０１）は、明らかにＣ８活性を回
復していた。

（６）複合プラスミドｐＡＧ４０１の分離と解析エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　
Ｋ　１２Ｗ　６２０　（ｐＡＧ４０Ｌ）より、前記実施
例１−（２）（７）方法でプラスミドρ＾Ｇ４０１のＤ
ＮＡを、１６０μｇ分離精製した。このＤＮＡ０．３μ
ｇに、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩにツインジー２社
より購入）、１０単位の制限酵素Ｂａａ＋ＨＩ　にツイ
ンジー２社より購入）、１０単位の制限酵素Ｈｉｎｄｍ
にッポンジーン社より購入）、１０単位の制限酵素Ｐｓ
ｔＩ（ベゼスダリサーチラボラトリー社より購入）、１
０単位の制限酵素５ａｌＩにツインジー２社より購入）
、１０単位の制限酵素ＸｈｏＩにツインジー２社より購
入）１０単位の制限酵素ＸｂａＩにツボンジーン社より
購入）の少なくとも１種類の制限酵素を加えて。

それぞれの適正緩衝液２０μａ中にて、３７℃で２時間
反応させた。消化した試料は、マニアティスら〔ティー
、マニアティス、イー、エフ、フリッチュ、ジェイ、サ
ンプルツク：モレキュラークローニングアラポラトリー
マニュアル、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−
、コールドスプリングハーパーエフ、ワイ、（Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａ−ｔｉｓ、　Ｅ＋Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ
、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ−ｂａｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　
Ｎ、Ｙ、）１５０〜１８５頁１９８２年）の方法により
、１％アガロースゲル電気泳動および４Ｉポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供した。泳動の終ったゲルを１μ
ｇ／ｍ　Ｑエチジウムブロマイド水溶液に浸漬して３０
分間染色した後、紫外線をゲルに照射してゲル上に１！
察されるバンドの数から生成りＮＡ断片の数を判定し、
各断片の泳動距雛から各々の分子の長さを算出し。

それらを加算してプラスミドＰＡＧ４０１の分子の長さ
を求めた。同時にそれらの結果に基づき、プラスミドｐ
ＡＧ４０１の分子中の各制限酵素切断部位を決定した。

各ＤＮＡ断片の分子の長さの決定には、１　ｋｂ以上の
分子の長さにつ・いては１％アガロースゲル電気泳動を
用い、約０．１　ｋｂから１　ｋｂ未満の分子の長さに
ついては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
。尚１分子の長さのマーカーとしては、同一アガロース
ゲル上で同時に電気泳動したラムダファージＤＮＡにツ
ポンジーン社より購入）の制限酵素Ｈｉｎｄ　ｍによる
消化断片と、同一ポリアクリルアミドゲル上で同時に電
気泳動したファイエックス１７４フアージＤＮＡの制限
酵素Ｈａｅ　ｍの消化断片（ベゼスダリサーチラボラト
リー社より購入）とを用いた。

その結果、プラスミドｐＡＧ４０１は、第１図の制限酵
素地図で示される構造を有し、ベクターｐＢＲ３２５の
制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位にＸｂａニリンカーを組込
んで作成したベクターの制限酵素ＸｂａＩ切断部位に。

約４．９キロベースのＣ８産生遺伝子を含む外来のＸｂ
ａＩ断片が組込まれていた。このＸｂａＩ断片が、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（江■ｎｅｂａｃｔｅ■肥
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１　（微工研条寄第５５
８号）由来のＣ８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片である。

プラスミドｐＡＧ４０１のＤＮＡにより、前記実施例１
−（２）の方法で、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ−
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　Ｗ６２０を形質転換
した。その結果、調べた形質転換株は、全てテトラサイ
クリン耐性アンピシリン耐性グルタミン酸非要求性であ
った。更に、該形質転換株について、それらが保有する
プラスミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供
与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定さ
れるプラスミドであった。

第１表 注１）反応液中の蛋白質１　ｍｇが、１分間に生成させ
たクエン酸のマイクロモル数で表示しである。

実際には、クエン酸と同時に生成するコエンザイムＡを
、ＳＨ基定量試薬（ＤＴＮＢ）を用いて定量した。

注２）ジェイ・アール・ゲスト（Ｊ、Ｒ，Ｇｕｅｓｔ）
より分譲をうけたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２のＣ８欠損株である〔バー
バートアンドゲスト（Ｈｅｒｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｇｕｅ
ｓｔ）、ジェイ、ジエン、マイクロパイオル、（Ｊ、　
Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　５３．３６３（１
９６８））。尚、該菌株は、イー・コリ　ジェネティッ
ク　ストックセンター〔イー・コリ　ジェネティックス
トックセンター、デパートメントオブヒューマンジエネ
ティックス、エールユニバーシティースクールオブメデ
イシン、３３３シーダーストリート　ピー、オー、ボッ
クス３３３３、ニューヘイブン、コネチカット０６５１
０アメリカ合衆国（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　
５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｄｅｐａｒｔ−ｍｅｎｔ
　ｏｆ　）ｌｕｎ＋ａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｙａｌ
ｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ、　３３３　Ｃｅｄｅｒ　５ｔｒｅｅｔ　Ｐ
、Ｏ，Ｂｏｘ３３３３　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ
ｅｃｔｉｃｕｔ　０６５１０　Ｕ、Ｓ、Ａ、））のバー
バラジエイバツクマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｊ＋Ｂａｃｈ
ｍａｎｎ）より分譲を受けることもできる。

（７）Ｃ８産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮ
Ａ断片の分離 前記実施例１−（６）で調製したプラスミドｐＡＧ４０
１のＤＮＡ２０μｇに対して、　６０単位の制限酵素Ｘ
ｂａＩを加えて、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，４）、１０　ｍＭＮｇＳＯ，、１００ｍＮ　Ｎａ１
ｌの緩衝液１００μｆｆ中で３７℃にて２時間反応させ
た。消化した試料は、前記の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。ただし、ベゼスダ・リサーチ
・ラボラトリ−社より購入したＬＭＰアガロースを使用
し、４℃で電気泳動した。次にエチジウムブロマイドで
染色したアガロースゲルを紫外線照射下に誼き、Ｏ８産
生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮＡ断片の存在
を確認し、その付近のアガロースゲルを切り出した。該
アガロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加え
て、６５℃で１０分間保持し、アガロースゲルを完全に
とかした。次に、等容のフェノールを添加して、攪拌の
後、水層を回収した。得られた水層に、等容のフェノー
ル・クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）液を添加して、攪
拌の後、水層を回収した。

得られた水層に９等容のクロロホルムを添加して、攪拌
の後、水層を回収した。得られた水層に、酢酸ナトリウ
ムを最終濃度３００　ｍＷになるように添加し、更に２
倍容のエタノールを加えて攪拌の後、−３０℃にて３時
間保持した。その後、１０．０００　ｒｐｍ（９，００
０ｇ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回収し
た。次に、同沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ１１１＠液２０μ
Ｑに溶解した。以上の操作により、Ｃ８産生遺伝子を含
む約４．９キロベースのＤＮＡ断片を、約３μｇ取得し
た。

実施例２ 本実施例は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣ
８産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該細菌のベクターに
組込んで、該細菌のＣ８強化株を育種した例である。グ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣＳ産生遺伝子を
含むＤＮＡ断片としては、前記実施例１−（７）で調製
したＣ８産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＸｂａ
　Ｉ断片を使用した。グルタミン酸生産性コリネ型細菌
のベクターとしては、プラスミドｐＡＧ５０を使用した
。プラスミドＰＡＧ５０は、該細菌のプラスミドＰＡＧ
　１、ＰＡＧ　３より、後述する方法により作成された
ベクタープラスミドである。プラスミドρＡＧＩはコリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４３　（微
工研条寄第５６０号）より分離されたテトラサイクリン
耐性プラスミドである。プラスミドＰＡＧ　３は、コリ
ネバクテリウム０メラセコラ（Ｃａｒ　ｎｅｂａｅｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２２２２０　（微
工研条寄第５５９号）より分離されたクリプテイックプ
ラスミドである。

（１）プラスミドρＡＧ５０の作成と該プラスミド保有
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎａｂａｃ
ｔｅ−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　８０１　
（ｐＡＧ５０）からの該プラスミドの分離 プラスミドＰＡＧ５０は、次の方法で作成した。先づプ
ラスミドｐＡＧ　ｌを縮小化してプラスミドｐＡＧ１４
を作成し、該プラスミドよりテトラサイクリン耐性遺伝
子を含むＤＮＡ断片を分離した。次に該ＤＮＡ断片をプ
ラスミドρＡＧ３に組込んでプラスミドｐＡＧ５０を作
成した。以下、上述の操作について詳細に説明する。

■コリネバクテリウム・メラセコラ（７−ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４３　（微
工研条寄第５６０号）菌体がらのプラスミドＰＡＧ　１
の分離上記菌株を、半合成培地（（ＮＨ４）、５ｏ４１
０　ｇ　。

尿素３　ｇ　、　Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ　、　ＮａＣ１５０
ｍｇ、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０４００ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ
，・４−６Ｈ，０２ｍｇ、　Ｆｅ５０．・４−６Ｈ２０
２ｍｇ、グル：ｌＩ−ス２０ｇ、ビオチン５０μｇ、チ
アミン塩酸塩２００μｇ、酵母エキス１ｇを純水に溶か
してＩＱとし、ＰＨ７，２に調整した培地〕で、３２℃
、−晩振盪培養し、その種培養８ｍＱを２００ｍｆｌの
前記半合成培地に移植して、３２℃で５時間振盪培養し
た。

培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液〔５０ｍＭグル
コース、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、
１０ｍ　ｇ　／ｍ　Ｑリゾチウム（シグマ社より購入）
、ｐＨ８，ｏ）１０ｍｍに懸濁し４２℃で１時間反応さ
せた。本反応液にアルカリＳＤＳ液（０，２ＮＮａＯＨ
１１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（Ｓｏｄｉｕｎ＋　Ｄｏｄｅｃｙｌ
ｓｕｌｆａｔｅ）］　２０　ｍ　Ｑを添加攪拌の後、水
中に５分装置いた。次に本反応液に。

氷冷した酢酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム水溶液６
０ｍＱ、酢酸１１．５ｍＭ、純水２８．５ｎｌの混合液
）１５ｍｍを添加攪拌の後、水中に１０分間装いた。溶
菌物の全量を遠心管に移し、４℃、５分間、１２．００
０　ｒｐｍ（１３０００ｇ）の遠心分離を行い、上澄液
を回収した。これを等容のフェノール・クロロホルム液
（１：１）で抽出して水層を回収した。これに２倍容の
エタノールを添加攪拌して、５分間室温に置き、２０℃
、１０分間、ｔｏ　、　ｏｏ。

ｒｐｍ（１１，０００ｇ　）の遠心分離を行った。得ら
れた沈澱物を、７０％エタノール水溶液で洗浄の後減圧
乾燥して、ＴＥｆｉ衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，５）　２０ｍ　Ｑで、ふたたび溶解した。この
液に、１０ｎ＋ｇ／ｍ　Ｑエチジウムブロマイド水溶液
１．２ｍＱと塩化セシウム２３．６　ｇとを加えて静か
に溶解し、４０．０００　ｒｐｍ　（１００，０００ｇ
）１５℃で４８時間遠心分渭した。プラスミドρＡＧＩ
は、紫外線照射により遠心チューブ中、２本のバンドの
下方として見い出されこのバンドを遠心チューブの側面
から注射器で抜き取ることにより、プラスミドｐＡＧ　
１を分離した。次いでこの分画液を等容量のイソプロピ
ルアルコールで４回抽出して、エチジウムブロマイドを
除去し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析して、ＤＮＡ
濃度５０μｇ／ｍＱのプラスミドｐＡＧ　１の透析完了
液ＩＩＩＩＱを得た。得られたプラスミドＰＡＧＩを制
限酵素としてＢａａ＋ｌ（Ｉ、ＩＥｓｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩを用いる以外は前記実施
例１−　（６）と同様の方法により、解析した。その結
果得られたプラスミドＰＡＧＩ制限酵素地図を第２図に
示す。

■プラスミドｐＡＧ　１の試験管内ＤＮＡ組換え前記工
程■で調製したプラスミドρＡＧＩのＤＮＡ０．５μｇ
に対して、１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加え、５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　
ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ　ＮａＣ１の緩衝液４０μＱ中
で、３７℃にて２時間反応させた。その後７０℃で１０
分間加熱して反応を停止させた。この反応液２０μＱと
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにツポンジーン社
購入）とを、５０ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ７
，４）、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、１０ｍＭジチオトレ
イトール、　１ｍＭスペルミジン、　１！ＩＭ　ＡＴＰ
、　０．１ｍｇ／ｍＱＢ　Ｓ　Ａ　（Ｂｏ−ｖｉｎｅ　
ｓｅｒｕｍ　ａｌｕｂｕｗｉｎ、ベゼスダ・リサーチ・
ラボラトリ−社より購入）の緩衝液５０μＱ中で、１５
℃にて一晩反応させた。

■プラスミドｐＡＧ１４の取得 前記工程■で作成したプラスミドｐＡＧ１由来の組換え
ＤＮＡにより、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏ
ｒ　ｎｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ
）　２２２４３（微工研条寄第５６０号）のプラスミド
キュアート株を形質転換した。得られたテトラサイクリ
ン耐性形質転換株の保有するプラスミドを解析すること
により、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。以下上記実
験について詳しく説明する。

（プラスミドのキユアリング） コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃ
ｔａ−ｒｉｕｍ　１Ｉｌｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２
２４３　（微工研条寄第５６０号）をＬＧ培地（トリプ
トンＬｏｇ、酵母エキス５　ｇ、　ＮａＣ１５ｇ、グル
コース　２ｇ＋　ｐＨ７，２にｗＩｉｍした培地）５ｍ
１２に白金耳植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。こ
の培養液を無菌水で希釈してＬＧ寒天培地（ＬＧ培地に
１．５％寒天を添加した培地）に塗布し、３２℃で２日
間培養した。

生じたコロニー１００個を取り、テトラサイクリン１０
μｇ／ｍＱを含有するＬＧ寒天培地に釣菌した。

３２℃で２日間培養してテトラサキタリン感受性株を選
択した。得られた２株のテトラサイタリン感受性株につ
いて、前記と同様なプラスミドの単離法によりプラスミ
ドｐＡＧ　１の存在を調べた。その結果得られた２株の
テトラサイクリン感受性株は、いずれもプラスミドを保
持していなかった。

これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿主として用
いた。

（形質転換） コリネバクテリウム・メラセコラ（蝕■坦−ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｎ＋　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）　２２２４３　
（微工研条寄第５６０号）より前記の操作で分離したプ
ラスミドキュアート株を、前記半合成培地で３２℃、１
２時間振盪培養し、その培養液０．５ｍ１２を同じ半合
成培地５０ｍ　Ｑに植菌して３２℃で振盪した。日立分
光光度計（２２８型）で波長６．６０ｎｍにおける吸光
度（ＯＤ）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養
液にペニシリンＧを０．３単位／ｍＱの濃度になるよう
に添加した。これを更に３２℃で１．５時間培養を続け
た。

その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ、カザ
ミノ酸１０ｇ、酵母エキスｌｏｇ、に２ＨＰＯ４０，３
５ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４０，１５ｇ、シュークロース１３
７　ｇ。

Ｎ−）−リス（ハイドロキシメチル）メチル−２−アミ
ノエタンスルホン酸（Ｔ　Ｅ　Ｓ　：　Ｎ−Ｔｒｉｓ（
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）　ｍｅｔｈｙｌ−２−ａ
ｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）５．
７３ｇ、　ＭｇＣｌ２０．９５ｇ、　ＣａＣ１□１．１
１ｇを純水に溶かしてＩＱとし、　ＮａＯＨでｐＨ７，
２に調整した培地）５ｍｇに懸濁した。この菌＠濁液４
．５ｍＱに、３ｍ　ｇ　／ｍ　Ｑ濃度のりゾチウムを含
有するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除菌した）０．５
ｍｇを添加して、３５℃で５時間静置反応させた。プロ
トプラスト化した細胞を７．０００　ｒｐｍ　（４５０
０ｇ）、５℃、７分間で遠心分離して回収し、Ｒ培地５
ＩＩＩＱに懸濁した。同様の操作を更にもう一度行った
後、Ｒ培地５ＩＩＱに再懸濁してプロトプラスト菌液と
した。

前記工程■で得られたりガーゼ反応液５ｏμＱと２倍濃
度ＴＳＭＣ液（Ｔ　Ｓ　ＭＣ液は、ＴＥＳ　　２５鱈、
シュータ０−２０．４Ｍ、ＭｇＣ１，１０ｍＭ、ＣａＣ
Ｌ。

３０ｍＭを含み、ＮａＯＨでＰＨ７，２に調整した水溶
液である）５０μρとの混合液を上記プロトプラスト菌
液０．５ｎ＋Ｑに添加混合した。その後更にＰＥＧ液Ｃ
ＴＳＭＣ液にポリエチレングリコール６０００（Ｐｏｌ
ｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　６０００）を４０％
濃度に溶解する）１．５ｍｇを添加してゆるやかに混和
し、２分間室温で静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ液〔Ｒ培
地にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：Ｐｏ１ｙｖｉｎｙ
ｌ　ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）４０　ｇＩ　Ｑを添加す
る）５ｍｇを添加して、４．ＱＯＯｒｐｍ（１８００ｇ
）で１０分間遠心分離して上澄液を除去した。同様の遠
心分離条件で洗浄操作を更にもう一度行った後、沈降し
たプロトプラストを０．５ｍｇのＲ−ＰＶＰ液でゆるや
かに懸濁した。３時間、３０℃に保った後、Ｒ−ＰＶＰ
液で希釈し、一定量をテトラサイクリン１０μｇ／ｍ１
２＋１１度を含む再生培地（重層寒天培地を用いる。下
層寒天培地は、Ｒ培地にＰＶＰ　４０　ｇＩＱ、寒天１
５ｇ／ｆｌを添加して作成する。上層寒天培地は、ＰＶ
Ｐ　４０　ｇ＃ｌ　、寒天６ｇ／＋２を添加して作成す
る。

プロトプラスト懸濁液を溶けた上層寒天培地３ｍ１２と
混合して、下層寒天培地上に重層する）に植菌し、３２
℃で４日培養した。

出現したテトラサイクリン耐性形質転換株から任意に１
０株を選び、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＱ濃度を含
むＬＧ寒天培地上で純化した後、前記工程■でプラスミ
ドＰＡＧＩを分離したのと同様の方法により、各菌株か
らプラスミドを分離した。各プラスミドＤＮＡ　０．５
　μｇに対して、制限酵素としてＥｃ。

Ｒ１，Ｈｉｎｄｍ、Ｐｓｔｌ、　Ｂａｎ＋ＩＩＩ、Ｂｇ
ｌｎにツインジー２社より購入）及びＸｂａＩを用いる
以外は前記実施例１−（６）と同様の方法により、各プ
ラスミド分子の大きさと各制限酵素切断部位を決定した
。その結果、プラスミドｐＡＧ１４を取得した。プラス
ミドｐＡＧ１４の制限酵素地図を第４図に示す。

このプラスミドＤＮＡを用いて、前・記と同様な方法で
、コリネバクテリウム・メラセコラ（垣■竺−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２２２４３（微
工研条寄第５６０号）のプラスミドキュアート株を形質
転換した。

得られたテトラサイクリン耐性株について、それらが保
有するプラスミドを解析した結果、それらのプラスミド
は、供与プラスミドと比べて、制限酵素切断様式で同一
と判定されるプラスミドであった・ ■プラスミドＰＡＧ１４からのテトラサイクリン耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片の分離。

前記工程■で調製したプラスミドＰＡＧ１４のＤＮＡ　
２０μ匹に対して、１００単位の制限酵素ＢａｍＨＩ、
Ｂｇｌ　ＩＩをそれぞれ加えて、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐｌ＋　７．４）、　１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４
，５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭジチオトレイトールの緩
衝液１００＋ＩＩＱ中で、３７℃にて２時間反応させた
。消化した試料は、前記実施例１−（６）の方法により
、１％アガロースゲル電気泳動に供した。

ただし、ベゼスダ・リサーチ・ラボラドリース社より購
入したＬＭＰアガロースを使用し、４℃で電気泳動した
。次に、エチジウムブロマイドで染色したアガロースを
紫外線照射下に置き、テトラサイクリン耐性遺伝子を含
む約３．１キロベースのＤＮＡ断片の存在を確認し、そ
の付近のアガロースゲルを切り出した。切り出したアガ
ロースゲルにその重量の３倍量のＴＥ緩衝液を加えて、
６５℃で１０分間保持し、アガロースゲルを完全にとか
した。次に、等容のフェノールを添加して、攪拌の後、
水層を回収した。回収した水層に等容のフェノール・ク
ロロホルム（１：１）液を添加して、攪拌の後、水層を
回収した。回収した水層に等容のクロロホルムを添加し
て、攪拌の後、水層を回収した。回収した水層に酢酸ナ
トリウムを最終濃度３００ｍＭになるように添加し、更
に２倍容のエタノールを加・えて攪拌の後、−３０℃に
て３時間保持した。その後、１０．００Ｏｒｐｍ（９，
０００ｇ）で１０分間遠心分離して、ＤＮＡの沈殿を回
収し、同沈殿を減圧乾燥した。

■プラスミドｐＡＧ３の調製と制限酵素ＢａｍＨＩ処理
前記工程■と同様の方法により、コリネバクテリウム”
メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌ
ａｓｓｅ−ｃｏｌａ）２２２２０（微工研条寄第５５９
号）から分離精製したプラスミドＰＡＧ３のＤＮＡ　４
μｇに対して、２０単位の制限酵素ＢａｍＨＩを加えて
、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１４Ｃ１（ｐＨ７，４）、　
１０　ｍＭＭｇＳＯ，、５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＷジ
チオトレイトールの緩衝液１００μα中で、３７℃にて
２時間反応させた。そこへ等容のフェノール・クロロホ
ルム（１：１）液を添加して攪拌の後、水層を回収した
。

回収した水層に等容のクロロホルムを添加して、攪拌の
後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度
３００ＩＩＩＭになるように加え、次に２倍容のエタノ
ールを添加して、−３０℃にて３時間保持した。次いで
得られた混合物を１２．０００　ｒｐｍ（８０００ｇ）
で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈殿を回収し、これを
減圧乾燥してプラスミドｐＡＧ３を得た。

得られたプラスミドを制限酵素としてＨｉｎｄ　ｍ、Ｂ
ａｍＨｌ、　ＸｂａＩ及びＰｓｔＩを用いる以外は実施
例１−（６）と同様の方法で解析して、制限酵素切断部
位を決定した。得られたプラスミドρＡＧ３の制限酵素
地図を第３図に示す。

■プラスミドｐＡＧ５０の取得 前記工程■、■で調製したそれぞれのＤＮＡ全量と３単
位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼとを５０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０　ｌＩＩＭ　ＭｇＣ
Ｌ、　１００１Ｍジチオトレイトール、１　ｎ＋Ｍスペ
ルミジン、１　ｍＭ　ＡＴＰ、０．ＩＩｇ／ＩＩＩｆｌ
　ＢＳＡの緩衝液５０μα中で、１５℃にて一晩反応さ
せた。その後７０℃にて１０分間加熱して反応を停止さ
せた。

得られたりガーゼ反応液５０μＱを用いて、前記工程■
と同様の形質転換操作によりコリネバクテリウム・メラ
セコラ（劇■朋動剣旦１ｕ懸よ狙−５ｅｃｏ１ａ）８０
１（微工研条寄第５５８号）のテトラサイクリン耐性形
質転換株を取得した。ただし、再生培地による培養は、
７日間とした。得られたテトラサイクリン耐性形質転換
株について前記工程■と同様の方法により、各株の保有
するプラスミドを分離し、制限酵素としてＢａｍＨＩ、
Ｈｉｎｄ　ｍ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、５ａｌＩ及びＸ
ｂａＩを用いる以外は前記実施例１−（６）と同様の方
法によりそれぞれのプラスミドを解析した。得られたプ
ラスミドをプラスミドｐＡＧ５０と命名した。このプラ
スミドの制限酵素地図を第５図に示す。

このプラスミドを用いて、前記と同様な方法でコリネバ
クテリウム・メラセコラ（並ｕ■立狡ρ−ｒｉｕｍ　ｍ
ｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微工研条寄第５５８号
）を、形質転換した。得られたテトラサイクリン耐性形
質転換株について、それらが保有するプラスミドを解析
した結果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比
べて制限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミドで
あった。

このプラスミドＤＮＡを用いて、前記と同様な方法でコ
リネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微工
研条寄第５５８号）を、形質転換した。得られたテトラ
サイクリン耐性形質転換株について、それらが保有する
プラスミドを解析した結果、それらのプラスミドは、供
与プラスミドと比べて制限酵素切断様式で同一と判定さ
れるプラスミドであった。

（２）プラスミドＰＡＧ５０へのＣ３産生遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の組込み 前記実施例２７（１）で調製したプラスミドｐＡＧ５０
のＤＮＡ　５μｇに対して、制限酵素ＸｂａＩを１５単
位加えて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）
、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、１００ｍＭ　ＮａＣ１の緩
衝液６０　μα中で、３７℃にて２時間反応させた。そ
の後、７０℃で１０分間加熱して、反応を停止させた。

この液に酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍＭになる
様に加え、２倍容のエタノールを添加して、−３０℃に
てβ時間保持した。次に１２．００Ｏｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で１０分間遠心分離してｏＮＡ沈殿を回収し、同
沈殿を減圧乾燥した。得られた試料をＢＡＰＴ緩衝液（
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，４）２００　
ｐ　Ｑに溶解し、バクチリアル・アルカリ・ホスファタ
ーゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓｅ）　（宝酒造株式会社より四人）を１
単位添加して６５°Ｃにて３０分間反応させた。更に該
酵素を１単位添加して、６５℃で３０分間反応させた。

その後、反応液に等容のＴＮＥ４！？ｉ液で飽秘したフ
ェノールを加え、混合した液、１２，０００　ｒｐｍ　
（８，９００ｇ）で１０分間遠心分離して水層を回収し
、更にもう１回同じ操作を繰り返した。次に水層に等容
のフェノール・クロロホルム（１：１．　ｖ／ｖ）液を
添加して混合した後、１２．０００　ｒｐｍ（８，９０
０ｇ）で１０分間遠心分離し、水層を回収した。

更に水層に等容のクロロホルムを添加して攪拌した後、
１２．０００　ｒｐｍ（８，９００ｇ）でｉｏ分間遠心
分離し。

水層を回収した。該水層に酢酸ナトリウムを最終濃度３
００　ｍＭになる様に加え、２倍容のエタノールを添加
し攪拌した後、−３０℃にて３時間保持した。

その後、１２．０００　ｒｐｍ　（８，９００ｇ）で１
ｏ分間遠心分離し、ＤＮＡ沈殿を回収した。これを減圧
乾燥した。

このＤＮＡ全量と前記実施例１−（７）で調製したＤＮ
Ａ１μｇと３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼにツポ
ンジーン社より四人）とを、５０　ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７゜４）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　
ｍＭジチオトレイトール、１鱈スペルミジン、Ｉ　ＩＩ
Ｍ　ＡＴＰ、０．１　ｍｇ／ｍ　Ｑ　ＢＳＡ（Ｂｏ−ｖ
ｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）　（ベゼスダリ
サーチラボラトリー社より購入）の緩衝液５０　μρ中
で、　１５℃にて一晩反応させた。その後、７０℃にて
１０分間加熱することにより、反応を停止させた。

（３）Ｃ８産生遺伝子を含有した複合プラスミドＰへ〇
４００１の取得 前記実施例２−（２）で作成した組換え体ＤＮＡにより
、コリネバクテリウム・メラセコラに−ｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｍｅ’１ａｓｓｅｃｏ１ａ）８０１（微工研
条寄第５５８号）を形質転換した。得られたテトラサイ
クリン耐性形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことにより、目的プラスミドを取得した。得られたプラ
スミドをｐＡＧ４００１と命名した。更に得られたプラ
スミド保持菌株のＣ８比活性が強化されている事を確認
した。以下上記実験について詳しく説明する。コリネバ
クテリウム・メラセコラ（キエ−ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（微工研条寄第
５５８号）を前記半合成培地で３２℃、１２時間振盪培
養し、その培養液０．５＋＋Ｑを同じ半合成培地５０ｍ
ｆｌに植菌して３２℃で振盪培養した。日立分光光度計
（２２８型）で波長６６０　ｎｍにおける吸光度（ＯＤ
）を測定し、ＯＤが０．２になった時点で培養液にペニ
シリンＧを０．３単位／ｍＱの濃度になるように添加し
た。これを更に３２℃で１．５時間培養を続けた。

その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５ｇ。

カザミノ酸１０　ｇ、酵母エキス１０　ｇ、　Ｋ２１１
Ｐ０．０．３５ｇ、　Ｋ１−１２ＰＯ４０，１５ｇ、シ
ュークロース１３７　ｇ、　Ｎ−トリス（ハイドロキシ
メチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＢＳ
　：　Ｎ　−Ｔｒｉｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ
）−ｍａｔｈｙｌ−２−ａｎ＋１ｎｏｅｔｈａｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）５．７３　ｇ、　ＭｇＣ１□
０．９５　ｇ、　ＣａＣｌ２１．１１　ｇを純水に溶か
して１２とし、ＮａＯＨでＰＨ７，２に調整した培地）
５＋Ｉｌに懸濁した。この菌懸濁液４．５ｍＱに、　３
　ｍｇ／ｍＱ濃度のりゾチウムを含有するＲ培地（ミリ
ポアフィルタ−で除菌した）０．５ｍＱを添加して、３
５℃で５時間静置反応させた。プロトプラスト化した細
胞を７゜０００　ｒｐｍ（４５００ｇ）、５℃、７分間
で遠心分離して回収し、Ｒ培地５＋＋ｌに懸濁した。同
様の操作を更にもう一度行なった後、Ｒ培地５１１ＩＱ
に再懸濁してプロトプラスト菌液とした。前記実施例２
−（２）で得られたりガーゼ反応液５０　μαと２倍濃
度ＴＳＭＣ液（ＴＳＭＣ液は、’ｒＥｓ　２５　ｍＭ、
シュークロース０．４Ｍ、ＭｇＣ１，１０ｍＭ、ＣａＣ
Ｌ　３０　ｍＭを含み、ＮａＯＨでｐＨ７，２に調整し
た水溶液である）５０　μ葛との混合液を上記プロトプ
ラスト菌液０．５ｍＱに添加混合した。その後頁にＰＥ
Ｇ液ＣＴＳＭＣ液にポリエチレングリコール６．０００
（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　６０００
）を４０Ｈ１１度に溶解する］　１．５　ｍΩに添加し
てゆるやかに混和し、２分間室温で静置した。その後Ｒ
−ＰＶＰ液〔Ｒ培地にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：
Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）４０　ｇ
／　Ｑを添加する）５　ｍＱ添加して、４．０００　ｒ
ｐｍ（１８００ｇ）で１０分間遠心分離して上澄液を除
去した。同様の遠心分離条件で洗浄操作を更にもう一度
行なった後、沈降したプロトプラストを０．５ｍｊｌの
Ｒ−ＰＶＰ液でゆるやかに懸濁した。３時間、３０℃に
保った後、ｎ−ｐｖｐ液で希釈し、一定量をテトラサイ
クリン１０　μｇ／ｍＱ’ａ度を含む再生培地（重層寒
天培地を用いる。下層寒天培地は、Ｒ培地にＰＶＰ　４
０　ｇ／　Ｑ　、寒天１５ｇ／Ｑを添加して作成する。

上層寒天培地は、　Ｉ’ＶＰ　４０　ｇＩＱ、寒天６ｇ
ＩＱを添加して作成する。プロトプラスト懸濁液を溶け
た上層寒天培地３ｎＩＱと混合して、下層寒天府地上に
重層する）に植菌し、３２℃で７日間培養した。

得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を、テトラサ
イクリン１０μｇ／ｍ　Ｑを含むＬＧ寒天培地（Ｌ−寒
天培地にグルコース５ｇＩＱを添加した培地）上で純化
した後、各菌株から前記実施例２−（１）と同様の方法
により、プラスミドを分離し、制限酵素としてＥｃｏＲ
ｌ、　ＨｉｎｄｌｌＩ　、　Ｐｓｔｌ、　５ａｌＩ及び
ＸｂａＩを用いる以外は前記実施例１−（６）と同様の
方法によりそれらのプラスミドを解析した。得られたプ
ラスミドをプラスミドＰＡＧ４００１と命名した。

プラスミドｐＡＧ４００１は、第６図に示した様に、プ
ラスミドｐＡＧ５０の制限酵素ＸｂａＩ切断部位に、グ
ルタミン酸生産コリネ型細菌由来のＣ８産生遺伝子を含
む約４．９キロベースのＤＮＡ断片が組込まれた複合プ
ラスミドである。

（４）プラスミドＰＡＧ４００１保有菌株のＣ８活性の
測定 プラスミドｐＡＧ４００１の保有のコリネバクテリウム
１メラセコラ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｕｉｍ　ｍｅ
ｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０】を、テトラサイケリン１０
μ 蜜培地５０ｍ　Ｑで，３２℃にて一晩振盪培養した。た
だし、プラスミド非保持株は，テトラサイクリン無添加
で培養した。この培養液より集菌し、０．８％ＮａＣ１
水溶液２０ｍ　Ｑで２回洗浄後、前Ｎｉｌ！ＭＥＳ緩衝
液１０ｍ＜１に懸濁した。これを、ブラウン社製（西独
）のＭＳＫセルホモジナイザー（８５３０２１型）で処
理した後、１４０００ｒｐｍ（２００００　ｇ）で２０
分間遠心分離して、細胞抽出液（粗酵素液）を調整した
。この細胞抽出液を用いて，前記実施例１−　（５）の
方法により、Ｃ８活性を測定した。その結果，第２表に
示した様に，プラスミドｐＡＧ４００１保持菌株は、ベ
クターｐＡＧ５０保持菌株やプラスミド非保持菌に比べ
て、高いＣＳ比活性を示した。

（以下余白） 第２表 注１）第１表の注１）と同じ。

注２）コリネバクテリウム・メラセコラ（７−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕＩＩｌｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１．本菌
株は，微生物工業技術研究所に，微工研条寄第５５８号
として寄託されている。

（５）Ｃ３産生遺伝子を含む約４．９キロベースのＤＮ
Ａ断片の縮小化 前記実施例２−（３）で調製したプラスミドＰＡＧ４０
０１のＤＮＡ　５　ｔｔｇに対して，制限酵素１１ａｍ
ＨＩを１５単位加えて、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７．４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，。

５０　ｍ１ｌｌ　ＮａＣ１、Ｉ　ｒｎＭジチオトレイト
ールの緩衝液５０μＱ中で，３７℃にて２時間反応させ
た。そこへ等容のフェノール・クロロホルム（１：１　
ｖ／ｖ）液を添加して攪拌の後、水層を回収した。更に
等容のクロロホルムを添加して攪拌の後，水層を回収し
た。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃度３００　ＩＩＩＭ
になるように加え、次に２倍容のエタノールを添加して
、−３０℃で３時間保持した後、１２．００Ｏ　ｒｐｍ
（８，９００　ｇ）で１０分間遠心分離してＤＮＡの沈
殿を回収し、これを減圧乾燥した（ＤＮＡ試料■）。前
記実施例２−（１）−■で調製したプラスミドＰＡＧ５
０のＤＮＡ５μｇに対して、制限酵素ＢａｍＨＩを１５
単位加えて、１０　ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
．４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、　５０　ｍＭＮａＣ
ｌ、Ｉ　ｎ＋Ｎジチオトレイｊ〜−ルの緩衝液５０　μ
ρ中で、３７℃にて２時間反応させた。その後、前記実
施例２−　（２）の方法により、バクチリアル・アルカ
リ・ホスファターゼ処理、エタノール沈殿を行なった（
ＤＮＡ試料■）。

前記のＤＮＡ試料■とＤＮＡ試料■との全量に対して、
３単位のＴ４ファージＤＮＡリガーゼを５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７、４）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ
２、１０　ｍＭジチオトレイトール、　１　ｍＭスペル
ミジン、１　ｍＭ　ＡＴＰ、０．　１　ｆｆＩｇ／＋ｎ
　ｎ　ＢＳＡの緩衝液５０．μΩ中で、１５℃にて一晩
反応させた。

その後、　７０℃にて１０分間加熱することにより１反
応を停止させた。このリガーゼ反応液を用いて、前記実
施例２−（３）の方法により、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（蝕Ｕ朋蝕μ且１鎌凹↓狙−５ｅｃｏｌａ）８
０１　（微工研条寄第５５８号）を形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株をテトラサイクリ
ンｌＯμｇ／ｌｌＩｎを含む前記ＬＧ寒天培地上で純化
した後、各株から前記実施例２−（１）−■の方法によ
りプラスミドを分離し、制限酵素としてＥｃｏＲＩ、Ｉ
ｌｉｎｄｍ、ＰｓｔＩ、５ａｌＩ及びＸｂａＩを用いる
以外は前記実施例１−（６）と同様の方法によりそれら
のプラスミドを解析した。その結果、プラスミドＰＡＧ
４００２を取得した。第６図に示した様に、プラスミド
ＰＡＧ４００２は、プラスミドｐＡＧ５０の制限酵素Ｂ
ａｍ１ｌＩ切断部位に、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のＣ８産生遺伝子を含む約４，９キロベースのＤ
ＮＡ断片に含まれている約３．２キロベースのＢａｍＨ
Ｉ断片が組込まれた複合プラスミドである。

コリネバクテリウム・メラセコラ（並ｎμ＝ｂａｃｔｅ
−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）８０１（ｐＡＧ
４００２）について、前記実施例２−（４）の方法によ
りＣ５活性を測定した結果、第２表に示した様に高いＣ
８比活性が認められた。故に、プラスミドｐＡＧ４００
２に含まれている３、２キロベースのＢａｍＨＩ断片に
は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のＣ８産生逍
伝子が含ま九ていることは明らかである。

（６）Ｃ３産生遺伝子を含む約３．２キロベースのＤＮ
Ａ断片の縮小化 前記実施例２−　（５）で調製したプラスミドＰＡＧ４
００２のｏＮＡ５ｕｇに対して、２０単位の制限酵素Ｓ
ａｌ■を加えて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，４）、１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，。

１００　ｍＭ　ＮａＣ１の緩衝液５０μΩ中で３７℃に
て２時間反応させた。そこへ等容のフェノール・クロロ
ホルム（１：１　ｖ／ｖ）液を添加して、攪拌の後、水
層を回収した。更に等容のクロロホルムを添加して攪拌
の後、水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終濃
度３００ｍＭになるように加え１次に２倍容のエタノー
ルを添加して、−３０℃で３時間保持した後、１２．０
０Ｏｒｐｍ（８，９００ｇ）で１ｏ分間遠心分離してＤ
ＮＡの沈殿を回収し、これを減圧乾燥した。このＤＮＡ
全量に対して、３単位のＴ、ファージＤＮＡリガーゼを
５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１０　
ｒｎＭ　ＭｇＣ１，。

１０　ｍＭジチオトレイトール、１　ｍＭスペルミジン
、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ　Ｏ，１ｍｇ／ｍＱＢｓＡの緩衝液
５０ｐＱ中で、１５℃にて一晩反応させた。その後、７
０℃にて１ｏ分間加熱することにより、反応を停止させ
た。このリガーゼ反応液を用いて、前記実施例２−（３
）の方法により、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃ
ｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）８０１　（微工研条寄第５５８号）を形質転換した
。

得られたテトラサイクリン耐性形質転換株を、テトラサ
イクリン１０μｇｅｍρを含む前記ＬＧ寒天培地上で純
化した後、各株から前記実施例２−（１）−■の方法に
よりプラスミドを分離し、制限酵素としてＥｃｏＲＩ、
Ｉｌｉｎｄｍ、　ＰｓｔＩ、５ａｌＩ及びＸｂａＩを用
いる以外は前記実施例１−（６）と同様の方法によりそ
れらのプラスミドを解析した。得られたプラスミドをプ
ラスミドＰＡＧ４００３と命名した。第８図に示した様
にプラスミドｐＡＧ４００３はプラスミドｐＡＧ４００
２の約０．７キロベースの５ａｌＩ断片が欠失したプラ
スミドである。

コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅ−ｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓａｃｏｌａ）８０１（ｐ
ＡＧ４００３）について、前記実施例２−（４）の方法
によりＣＳ活性を測定した結果、第２表に示した様に高
いＣ５比活性が認められた。故に、プラスミドＰＡＧ４
００３にふくまれている約３．２キロベースのＢａｍＨ
Ｉ−５ａｌＩ断片には、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来のＣ８産性遺伝子が含まれていることは、明らか
である。

（７）Ｃ８産性遺伝子を含む約３．２キロベースのＢａ
ｍＨＩ断片の分離 前記実施例２−　（５）で調製したプラスミドｐＡＧ４
００２の［）ＮＡ　１０　μｇに対して、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩを３０単位加えて、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（
Ｃ１（ｐＨ７，４）、１０　ｍＭＭｇＳＯ，、５０ｍＭ
　ＮａＣ１、ｌ　ｍＭジチオトレイトールの緩衝液１０
０μΩ中で３７℃にて２時間反応させた。消化した試料
は、前記実施ｆ′ｌ　１．−　（７）の方法によりアガ
ロースゲル電気泳動に供し、Ｃ８産生遺伝子を含む約３
．２キロベースのＤＮＡ断片が存在する付近のアガロー
スゲルを切り出した。次に切り出したアガロースゲルか
ら、前記実施例１−（７）の方法により、Ｏ８産生遺伝
子を含む約３．２キロベースのＢａｍＨＩ断片を約１μ
＆抽出分離した。

（Ｓ）ＣＳ産生遺伝子を含む約３．２キロベースのＢａ
ｍＨＩ−ＳａｌＩ断片の分離 前記実施例２−（６）で調製したプラスミドρＡＧ４０
０３のＤＮＡ　２０μｇに対して、制限酵素ＢａｍＨＩ
を６０単位加えて、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，４）、１０ＩＩＩＮＭｇＳＯ，、５０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１，ｌ　ｍＭジチオトレイトールのｔｌＶＲ液１００
μΩ中で３７℃にて２時間反応させた。該反応液に、酢
酸ナトリウムを最終濃度３００　ｍＭになるように添加
し、更に２倍容のエタノールを加えて攪拌した後、−３
０”Ｃにて３時間保持した。その後、１０．０００　ｒ
ｐｍ　（９，０００ｇ）で１０分間遠心分離して、ＤＮ
Ａの沈殿を回収した。次に１回収した沈殿を減圧乾燥し
た後、同試料に制限酵素５ａｌＩを６０単位加えて、５
０　ＩＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、　１
０　ｍＭＭｇＳＯ，、１００ｍＭ　ＮａＣ１、の緩衝液
１００μＱ中で、３７℃にて２時間反応させた。消化し
た試料は、前記実施例１−（７）の方法により、アガロ
ースゲル電気泳動に供し、Ｃ８産生遺伝子を含む約３．
２キロベースのＤＮＡ断片が存在する付近のアガロース
ゲルを切り出した。次に切り出したアガロースゲルから
、前記実施例１−（７）の方法により、Ｃ８産生遺伝子
を含む約３．２キロベースのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片
を、約１μｇ抽出分離した。

尚、本文中で用いた制限酵素の名称は、次の菌株から得
られる制限酵素の略称である。

ＥｃｏＲＩ：エシェリヒア・コリＲＹ　１３（Ｅｓｃｈ
ａｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＲＹ　１３）Ｂａａ＋ＨＩ
：バチルス・アミロリクエファシェンスＨ（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｈ）１
１ａｅｌ［［：ヘモフィラス・エジプテイウス（肋ｙ四
仇只犯り肛■述士組） ）＋ｉｎｄｍ：へモフィラス・インフルエンザＲｄ（Ｈ
ａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｕｌｅｎｚａｅ　Ｒｄ）
ＰｓｔＩ：プロビデンシア・スチュアーテイー１６４（
Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　５ｔｕａｒｔｉｉ　１６４）
ＳａｌＩ：ストレプトマイセス・アルバスＧ（Ｓｔｒｅ
　ｔｏｗ　ｃｅｓ　ａｌｂｕｓ　Ｇ）ＸｂａＩ：キサン
トモナス・バドリ （Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｂａｄｒｉｉ）ＸｈｏＩ：
キサントモナス・ホルシコラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
　ｈｏｌｃｉｃｏｌａ）（発明の効果） ＣＳ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することにより
、該断片を既存のベクターに組み込み、そのベクターの
宿主に移入して得られる宿主菌のＣ８活性を強化するこ
とができる。ｃｓ活性を増強することにより、トリカル
ボン酸回路の中間体の供給が効率よく行なわれ、その結
果トリカルボン酸回路の中間体に由来する物質を発酵法
により生産する際のその物質の生産性を大きく改善する
ことができる。

４、図の簡単な説明 第１図は本発明の組換え体ＤＮＡの−っであるプラスミ
ドｐＡＧ４０１の制限酵素地図である。第２図はプラス
ミドｐＡＧ１の制限酵素地図である。第３図はプラスミ
ドρＡＧ３の制限酵素地図である。第４図はプラスミド
ｐＡＧ１４の制限酵素地図である。第５図はプラスミド
ρＡＧ５０の制限酵素地図である。第６図はプラスミド
ｐＡＧ４００１の制限酵素地図である。

第７図はプラスミドρＡＧ４００２の制限酵素地図であ
る。第８図はプラスミドｐＡＧ４００３の制限酵素地図
である。

プラスミド分子の長さは、キロベース（ｋｂ）で表示し
である。図中記号は、発明の詳細な説明に記した制限酵
素基であり、プラスミド上のその位置は、その制限酵素
切断部位を示す。その横に付した数字は、第１図、第２
図、第３図、第４図、第５図、第６図、第７図及び第８
図において、それぞれ制限酵素Ｘｂａ１．Ｘｂａ１．　
Ｉ（ｉｎｄＩＩ［、Ｘｂａｌ、　ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ
、　ＢａｍＨｌ、　ＢａｍＨＩの切断部位を基準とした
プラスミド上での位置を、キロベースで表示したもので
ある。第５図においてＤＮＡ−（ａ）はプラスミドｐＡ
Ｇ１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片
である。

特許出願人　旭化成工業株式会社 第４図 第５図 第７図 第８図

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のクエン酸
   合成酵素（Ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＳ）
   産生遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. （２）該ＤＮＡ断片が、コリネバクテリウム型細菌由来
   であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載
   のＤＮＡ断片。
3. （３）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のクエン酸
   合成酵素（Ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＳ）
   産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複
   製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含有する
   組換え体ＤＮＡ。
4. （４）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
   菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（３）
   項記載の組換え体ＤＮＡ。
5. （５）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主ベクター系
   で用いられるベクターを含有することを特徴とする特許
   請求の範囲第（３）項記載の組換え体ＤＮＡ。
6. （６）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コリ
   ネ型細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターを含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の
   組換え体ＤＮＡ。
7. （７）グルタミン酸生産性コリネ型細菌由来のクエン酸
   合成酵素（Ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＣＳ）
   産生遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）と細胞内での自律複
   製に必要な遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｂ）とを含有する
   組換え体ＤＮＡを保有した細胞。
8. （８）該ＤＮＡ断片（Ａ）が、コリネバクテリウム属細
   菌由来であることを特徴とする特許請求の範囲第（７）
   項記載の細胞。
9. （９）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、大腸菌の宿主ベクター系
   で用いられるベクターを含有することを特徴とする特許
   請求の範囲第（７）項記載の細胞。
10. （１０）該ＤＮＡ断片（Ｂ）が、グルタミン酸生産性コ
    リネ型細菌の宿主ベクター系で用いられるベクターを含
    有することを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載
    の細胞。
11. （１１）該細胞が、エシェリヒア属細菌であることを特
    徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の細胞。
12. （１２）該細胞が、グルタミン酸生産性コリネ型細菌で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載の
    細胞。