JPS60110292A - セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片 - Google Patents
セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片Info
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- JPS60110292A JPS60110292A JP21863283A JP21863283A JPS60110292A JP S60110292 A JPS60110292 A JP S60110292A JP 21863283 A JP21863283 A JP 21863283A JP 21863283 A JP21863283 A JP 21863283A JP S60110292 A JPS60110292 A JP S60110292A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ラーゼ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌および改良さ
れたセファロスポリン・アシラーゼの製造法に関する。
れたセファロスポリン・アシラーゼの製造法に関する。
セファロスポリンＣ（以下ｃｅｐｈ Ｃと略記する）は
７−アミノセファロスポラン酸（以下７ ＡＣＡと略記
する）に変換され、それから優れた抗菌活性を有するｃ
ｅｐｈ Ｃの７−アシルアミド同族体に変換することが
できる。
７−アミノセファロスポラン酸（以下７ ＡＣＡと略記
する）に変換され、それから優れた抗菌活性を有するｃ
ｅｐｈ Ｃの７−アシルアミド同族体に変換することが
できる。
ｃｅｐｈｃを７ＡＣＡに変換する方法としては、ｃｅｐ
ｈｃより誘導された化合物 （式中、Ｒは−ｃｏｏＨ基または一〇〇〇〇〇Ｈ基）に
特定の微生物、たとえばコマモナス属の一細菌５Ｙ−７
７−１を作用させ、そのアシラーゼ作用により７ＡＣＡ
を生成せしめる方法（、特公昭５４−１７０３２）があ
る。本酵素反応には酵素作用を有する微生物の培養菌体
あるいはその処理物が用いられるが、本反応を工業的に
有利に用いるためには、単位苗体重当りの酵素活性（以
下これを比活性と称する）を増大させる必要がある。本
発明者らは上記酵素を微生物に著量生成させる方法を研
究した結果、コマモナス属細菌５Ｙ−７７−１微工研菌
寄第２４１Ｏ号よりセファロスポリン・アシラーゼ産生
に関する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をとり出し、ベクタ
ーを介して大腸菌に導入させることに成功し、これニヨ
リセファロスポリン・アシラーゼ活性の著量に増大した
微生物菌体を得ることができることをゼ産生遺伝子を含
有するようになった新規な大腸菌およびこの菌を培養す
ることによるセファロスポリン・アシラーゼの製造法を
提供するものである。
ｈｃより誘導された化合物 （式中、Ｒは−ｃｏｏＨ基または一〇〇〇〇〇Ｈ基）に
特定の微生物、たとえばコマモナス属の一細菌５Ｙ−７
７−１を作用させ、そのアシラーゼ作用により７ＡＣＡ
を生成せしめる方法（、特公昭５４−１７０３２）があ
る。本酵素反応には酵素作用を有する微生物の培養菌体
あるいはその処理物が用いられるが、本反応を工業的に
有利に用いるためには、単位苗体重当りの酵素活性（以
下これを比活性と称する）を増大させる必要がある。本
発明者らは上記酵素を微生物に著量生成させる方法を研
究した結果、コマモナス属細菌５Ｙ−７７−１微工研菌
寄第２４１Ｏ号よりセファロスポリン・アシラーゼ産生
に関する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をとり出し、ベクタ
ーを介して大腸菌に導入させることに成功し、これニヨ
リセファロスポリン・アシラーゼ活性の著量に増大した
微生物菌体を得ることができることをゼ産生遺伝子を含
有するようになった新規な大腸菌およびこの菌を培養す
ることによるセファロスポリン・アシラーゼの製造法を
提供するものである。
以下に本発明をさらに（わしく説明する。
本発明にかかる大腸菌は下記の工程によって造成される
。
。
１）、コマモナス属細舊５Ｙ−７７−１微工研菌寄第２
４１０号の菌体より全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断
する。
４１０号の菌体より全ＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断
する。
２）、ベクターＤＮＡを制限酵素で切断・開裂させる。
３）、ベクターＤＮＡの開裂部位にｌ）で得たＤＮＡ断
片を組込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡなつ（る。
片を組込ませ、閉環した組換え体ＤＮＡなつ（る。
４）１組換え体ＤＮＡを宿主たる大腸菌に導入する。
５）１組換え体ＤＮＡを導入された大腸菌の中から、セ
ファロスポリン・アシラーゼ活性を有する菌株を選択分
離する。
ファロスポリン・アシラーゼ活性を有する菌株を選択分
離する。
６）０選択された大腸菌の菌株よりプラスミドＤＮＡを
とり出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベク
ターを用いて改変し、セファロスポリン・アシラーゼ遺
伝子の発現が増大するようになった組換え体ＤＮＡをつ
くる。
とり出し、制限酵素および再結合酵素あるいは他のベク
ターを用いて改変し、セファロスポリン・アシラーゼ遺
伝子の発現が増大するようになった組換え体ＤＮＡをつ
くる。
７）、−改変された組換え体ＤＮＡを大腸菌に導入し、
その後導入された大腸菌の中からセファロスポリン・ア
シラーゼ産生能の増大した株を選択分離する。
その後導入された大腸菌の中からセファロスポリン・ア
シラーゼ産生能の増大した株を選択分離する。
コマモナス鳥細菌５Ｙ−７７−１微工研菌寄第２４１０
号からの全ＤＮＡの抽出は通常行なわれている方法（た
とえば文献： Ｍａｒｍｕｒ、Ｊ、（１９６１）Ｊ−Ｍ
ｏＬ。
号からの全ＤＮＡの抽出は通常行なわれている方法（た
とえば文献： Ｍａｒｍｕｒ、Ｊ、（１９６１）Ｊ−Ｍ
ｏＬ。
ＢｉｏＬ、亜、２２７−２３９ ）を用いて行なうこと
ができる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、
■全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ■上記目的のためベ
クターの開裂に用いられる酵素であればいずれでも用い
ることができる。この除用いる制限酵素がセファロスポ
リン・アシラーゼ産生遺伝子の内部を切断するかどうか
は事前に不明なので、制限酵素を弱く作用させ、ＤＮＡ
を部分的に分解することにより、適当な太ささのＤＮＡ
断片が得られるようにする。
ができる。全ＤＮＡの切断に用いる制限酵素としては、
■全ＤＮＡを適当に切断でき、かつ■上記目的のためベ
クターの開裂に用いられる酵素であればいずれでも用い
ることができる。この除用いる制限酵素がセファロスポ
リン・アシラーゼ産生遺伝子の内部を切断するかどうか
は事前に不明なので、制限酵素を弱く作用させ、ＤＮＡ
を部分的に分解することにより、適当な太ささのＤＮＡ
断片が得られるようにする。
ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当な制限
酵素を光分に作用させることにより行なう。ベクターＤ
ＮＡとしては大腸菌中で複製可能な公知のベクター、た
とえばＣｏｔ＜ｇ １． ｐＭＢ ９゜ｐｓｃ １０１
あるいはその誘導体（たとえばｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３
２５，ｐＡＣＹＬ １８４など）やλフアージ由来のシ
ャロン・ベクターなどを用いることができる。
酵素を光分に作用させることにより行なう。ベクターＤ
ＮＡとしては大腸菌中で複製可能な公知のベクター、た
とえばＣｏｔ＜ｇ １． ｐＭＢ ９゜ｐｓｃ １０１
あるいはその誘導体（たとえばｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３
２５，ｐＡＣＹＬ １８４など）やλフアージ由来のシ
ャロン・ベクターなどを用いることができる。
次にベクターＤＮＡの開裂部位に上記のＤＮＡ断片を組
込ませるには公知の常法によればよ（、ベクターＤＮＡ
、組込むべきＤＮＡの種類や用いる制限酵素の種類等に
応じて適当な反応条件を選択すればよい。こうして造成
された組換え体ＤＮＡを導入する宿主たる大腸菌として
は、大腸菌に特異的な制限能を欠損した菌株であれば基
本的にすべて使用することができる。組換え体ＤＮＡの
導入は公知の方法（たとえば文献： ＭａｎｄｅＬ、Ｍ
、。
込ませるには公知の常法によればよ（、ベクターＤＮＡ
、組込むべきＤＮＡの種類や用いる制限酵素の種類等に
応じて適当な反応条件を選択すればよい。こうして造成
された組換え体ＤＮＡを導入する宿主たる大腸菌として
は、大腸菌に特異的な制限能を欠損した菌株であれば基
本的にすべて使用することができる。組換え体ＤＮＡの
導入は公知の方法（たとえば文献： ＭａｎｄｅＬ、Ｍ
、。
Ｈｉｇａ、Ａ、、（１９７０）Ｊ、ＭｏＬ、ＢｉｏＬ、
、５３，１５９−１６２）によって行なえばよい。
、５３，１５９−１６２）によって行なえばよい。
上記の工程によって得られる大腸菌の中でセファロスポ
リン・アシラーゼ活性を示すようになるものはごくわず
かなので、目的とする菌株を選択分離する必要がある。
リン・アシラーゼ活性を示すようになるものはごくわず
かなので、目的とする菌株を選択分離する必要がある。
選択の方法としては試験菌をセファロスポリン・アシラ
ーゼの基質のうちの一種類、たとえばグルタリル７ＡＣ
Ａを３−アセトキシメチル−ニー（土−カルボキシブタ
ンアミド）セフ−３−、−ｃＰＡ−４−カルボン酸に作
用させ、生成してくる７ＡＣＡを検出することにより行
なう。
ーゼの基質のうちの一種類、たとえばグルタリル７ＡＣ
Ａを３−アセトキシメチル−ニー（土−カルボキシブタ
ンアミド）セフ−３−、−ｃＰＡ−４−カルボン酸に作
用させ、生成してくる７ＡＣＡを検出することにより行
なう。
７ＡＣＡの検出にはｐ−ジメチルベンズアルデヒドによ
る発色を利用する公知の方法（たとえば文献：Ｓｈｉ
ｂｕｙａ 、Ｙ、、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、に、 、Ｆｕ
ｊ ｉ ｉ 、Ｔ 、（−１９８１）Ａｚｒ−ＢｉｏＬ
、Ｃｈｅｍ、、４５．１５６１−１５６７ ）や高速液
体クロマトグラフィーによる分画検出の方法を用いるこ
とができる。
る発色を利用する公知の方法（たとえば文献：Ｓｈｉ
ｂｕｙａ 、Ｙ、、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、に、 、Ｆｕ
ｊ ｉ ｉ 、Ｔ 、（−１９８１）Ａｚｒ−ＢｉｏＬ
、Ｃｈｅｍ、、４５．１５６１−１５６７ ）や高速液
体クロマトグラフィーによる分画検出の方法を用いるこ
とができる。
こうして分離された新規な大腸ｌのセファロスポリン・
アシラーゼ産生能は用いたベクターの大腸菌細胞内にお
ける複製数（いわゆるベクターのコピー数）に依存する
とともに、目的とする遺伝子のベクター上における組込
まれた部位あるいは組込まれた方向等に大きく依存する
。これは一般的に遺伝子の一端にその遺伝子の発現を調
節する構造が存在し、遺伝子の種類によって発現の調節
が各々異なることによるもので、ベクター上における組
込まれた部位あるいは方向により、セファロスポリン・
アシラーゼ産生遺伝子の発現の調節が自己の遺伝子に備
わっている構造に依存したり、ベクター上の発現調節構
造のいずれかに支配されることにより、セファロスポリ
ン・アシラーゼの産生能が異なって（るものと考えられ
る。そこでセファロスポリン・アシラーゼ産生能の増大
した大腸菌を得るには、大腸菌内で強力な遺伝子発現を
与える構造を含有するＤＮＡ断片をセファロスポリン・
アシラーゼ産生遺伝子の一端に組込ませた組換え体ＤＮ
Ａを造成すればよい。この目的を達成する一方法として
は、ベクター上にすでに存在している発現調節部位（た
とえばｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の発
現調節構造）の一端に組換え体ＤＮＡから適当な制限酵
素を用いて切出したセファロスポリン・アシラーゼ産生
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を組込ませればよい。ある
いは強力な発現活性を有するＤｈｉＡ断片を大腸菌の染
色体ＤＮＡあるいは７アニジＤＮＡあるいはプラスミド
ＤＮＡから切出して、組換え体ＤＮＡ中のセファロスポ
リン・アシラーゼ産生遺伝子の一端に組込んだＤＮＡを
造成することによっても目的を達成することができる。
アシラーゼ産生能は用いたベクターの大腸菌細胞内にお
ける複製数（いわゆるベクターのコピー数）に依存する
とともに、目的とする遺伝子のベクター上における組込
まれた部位あるいは組込まれた方向等に大きく依存する
。これは一般的に遺伝子の一端にその遺伝子の発現を調
節する構造が存在し、遺伝子の種類によって発現の調節
が各々異なることによるもので、ベクター上における組
込まれた部位あるいは方向により、セファロスポリン・
アシラーゼ産生遺伝子の発現の調節が自己の遺伝子に備
わっている構造に依存したり、ベクター上の発現調節構
造のいずれかに支配されることにより、セファロスポリ
ン・アシラーゼの産生能が異なって（るものと考えられ
る。そこでセファロスポリン・アシラーゼ産生能の増大
した大腸菌を得るには、大腸菌内で強力な遺伝子発現を
与える構造を含有するＤＮＡ断片をセファロスポリン・
アシラーゼ産生遺伝子の一端に組込ませた組換え体ＤＮ
Ａを造成すればよい。この目的を達成する一方法として
は、ベクター上にすでに存在している発現調節部位（た
とえばｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の発
現調節構造）の一端に組換え体ＤＮＡから適当な制限酵
素を用いて切出したセファロスポリン・アシラーゼ産生
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を組込ませればよい。ある
いは強力な発現活性を有するＤｈｉＡ断片を大腸菌の染
色体ＤＮＡあるいは７アニジＤＮＡあるいはプラスミド
ＤＮＡから切出して、組換え体ＤＮＡ中のセファロスポ
リン・アシラーゼ産生遺伝子の一端に組込んだＤＮＡを
造成することによっても目的を達成することができる。
このようにして得られる新規な大腸菌のセファロスポリ
ン・アシラーゼ産生能は、たとえば後述の実施例により
得られたエシェリヒア−コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫ
Ｂｌｏｏｌ）をもとのセファロスポリン・アシラーゼ生
産菌であるコマモナス属細菌ＳＹ”７７−１微工研菌寄
第２４１ｏ号と比較して下表にみられるとと（飛躍的に
増大していることがわかる。
ン・アシラーゼ産生能は、たとえば後述の実施例により
得られたエシェリヒア−コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫ
Ｂｌｏｏｌ）をもとのセファロスポリン・アシラーゼ生
産菌であるコマモナス属細菌ＳＹ”７７−１微工研菌寄
第２４１ｏ号と比較して下表にみられるとと（飛躍的に
増大していることがわかる。
相対比活性
コマモナス属細菌５Ｙ−７７−１１
上記のようにして得られるセファロスポリン・アシラー
ゼ産生能を有する大腸菌はその菌学的性質においてはも
との大腸菌にくらべ、セファロスポリン・アシラーゼ産
生能を有していること以外変るところがない。
ゼ産生能を有する大腸菌はその菌学的性質においてはも
との大腸菌にくらべ、セファロスポリン・アシラーゼ産
生能を有していること以外変るところがない。
本発明により得られた新規な大腸菌な用いてその大腸菌
を培養し、培養菌体を得、これに適当な処理をほどこす
ことにより、工業的なセファロスポリン・アシラーゼの
製造法が提供される。
を培養し、培養菌体を得、これに適当な処理をほどこす
ことにより、工業的なセファロスポリン・アシラーゼの
製造法が提供される。
以下に本発明の実施例を掲げる。
実施例
本実施例はＤＮＡ供与体としてコマモナス祖細菌５Ｙ−
７７−１微工研菌寄牙２４１Ｏ号の全ＤＮＡを。
７７−１微工研菌寄牙２４１Ｏ号の全ＤＮＡを。
ベクターＤＮＡとしてｐＢＲ３２２およびその誘導体で
あるｐＢＲ３２５を、宿生大腸劇としてエシェリヒア・
コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ３３５２５を用い
て行なった例である。
あるｐＢＲ３２５を、宿生大腸劇としてエシェリヒア・
コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ３３５２５を用い
て行なった例である。
】）、コマモナス鵜細菌５Ｙ−７７−１微工研舊寄第２
４１０号から全ＤＮＡの調製とその切断 ニュートリエンド・ブロス（牛肉エキス０．３％。
４１０号から全ＤＮＡの調製とその切断 ニュートリエンド・ブロス（牛肉エキス０．３％。
ヘフトン０．５％）１００７ｄ［＝ｆｆマモナスＪｌ］
［１ＳＹ−７７−］微工研菌寄：１２４１０号を接種し
、３０℃にて一夜培養後集菌し、８ａのＴＥ緩衝液（１
０ｒＩ・ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 １ｍＭ ＥＤ ＴＡ
； ｐＨ８，０）に懸濁する。これにリゾ４−ムを終濃
度１ｍｙ／ｍｌになるように加え、３７℃にて１時間反
応させる。次にこれにプロナーゼＥを終濃度２００μカ
鯰になるように加え、つづいてドデシル硫酸ナトリ□ウ
ムを終濃度１％になるように加えて３７℃にて１時間反
応させる。反応終了説反応液に等容量のＴＮＥ緩衝液（
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ 、
１００ｍＭ ＮａＣ１； ｐＨ８，０）で飽和したフェ
ノールを加え、混合した後１０．００Ｏｒｐｍで１０分
間遠心し、水層を採取する。この水層に等容量のフェノ
ール・クロロホルム混液（１： １． Ｖ／Ｖ）を加え
、同様にして遠心後水層を採取して、さらに等容量のク
ロロホルムを加えて同様にして遠心後水層を採取する。
［１ＳＹ−７７−］微工研菌寄：１２４１０号を接種し
、３０℃にて一夜培養後集菌し、８ａのＴＥ緩衝液（１
０ｒＩ・ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 １ｍＭ ＥＤ ＴＡ
； ｐＨ８，０）に懸濁する。これにリゾ４−ムを終濃
度１ｍｙ／ｍｌになるように加え、３７℃にて１時間反
応させる。次にこれにプロナーゼＥを終濃度２００μカ
鯰になるように加え、つづいてドデシル硫酸ナトリ□ウ
ムを終濃度１％になるように加えて３７℃にて１時間反
応させる。反応終了説反応液に等容量のＴＮＥ緩衝液（
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ 、
１００ｍＭ ＮａＣ１； ｐＨ８，０）で飽和したフェ
ノールを加え、混合した後１０．００Ｏｒｐｍで１０分
間遠心し、水層を採取する。この水層に等容量のフェノ
ール・クロロホルム混液（１： １． Ｖ／Ｖ）を加え
、同様にして遠心後水層を採取して、さらに等容量のク
ロロホルムを加えて同様にして遠心後水層を採取する。
採取した水溶液にリボヌクレアーゼＡを終濃度４０μｙ
炸ｌになるように加え、３７℃にて１時間反応させる。
炸ｌになるように加え、３７℃にて１時間反応させる。
反応終了後ＮａＣ１とポリエチレングリコール６０００
を各々終濃度１Ｍｉよび１０％になるように加え、４℃
にて４時間保持してから５０００ｒｐｍで５分間遠心し
、生成した沈殿を２゜濃度ＴＥ緩衝液に溶かす。
を各々終濃度１Ｍｉよび１０％になるように加え、４℃
にて４時間保持してから５０００ｒｐｍで５分間遠心し
、生成した沈殿を２゜濃度ＴＥ緩衝液に溶かす。
こうして得られた溶液に酢酸ナトリウムを終濃度３００
ｍＭになるように加え、２倍容量のエタノールを加えて
、−２０℃にて４時間保持した後、１０．００Ｏｒｐｍ
で２０分間遠心してＤＮＡの沈殿を集める。
ｍＭになるように加え、２倍容量のエタノールを加えて
、−２０℃にて４時間保持した後、１０．００Ｏｒｐｍ
で２０分間遠心してＤＮＡの沈殿を集める。
この沈殿を×。濃度ＴＥ緩衝液に溶かし、以後の切断反
応に供する。ＤＮＡの切断のためにはｌμＩのＤＮＡに
対し０．３ ＵのＰｓｔＩを加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，４） 、 １０ｍＢＩＩＭｇＳＯ４
，５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｒｎＭジテオスレイトールの
緩衝液３０１Ｌｅ中で３７℃にて１．５時間反応を行な
わせ、つづいて７０℃で１０分間加熱して反応を停止さ
せる。
応に供する。ＤＮＡの切断のためにはｌμＩのＤＮＡに
対し０．３ ＵのＰｓｔＩを加え、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，４） 、 １０ｍＢＩＩＭｇＳＯ４
，５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｒｎＭジテオスレイトールの
緩衝液３０１Ｌｅ中で３７℃にて１．５時間反応を行な
わせ、つづいて７０℃で１０分間加熱して反応を停止さ
せる。
２）、ベクターｐＢＲ３２２の開裂
１、ＪＬのｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅａ社製品カタログ
Ｎ［Ｌ ５２６２ ＳＡ ）に対しＩＵｃｖＰｓｔＩを
加え、１）と同一の緩衝液ａｏ、ｍ４中で３７℃にて２
時間反応させ、１）と同様にして反応を停止させる。
ａｒｃｈ Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅａ社製品カタログ
Ｎ［Ｌ ５２６２ ＳＡ ）に対しＩＵｃｖＰｓｔＩを
加え、１）と同一の緩衝液ａｏ、ｍ４中で３７℃にて２
時間反応させ、１）と同様にして反応を停止させる。
３）、再結合反応
０．８μＪの切断されたコマモナス鵜細菌・５Ｙ−７７
−ｉＤＮＡ、、０．４μｉの開裂されたｐＢＲ３２２，
−３０ｍＦｖｉＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
１０ ｍＭＭｇｃｌ、、 １０ ｍＭ ２−メルカプト
エタノール、 ０．１ ｍＭ ＡＴＰ、 Ｉ Ｕ Ｔ４
リガーゼをふ（む１００．Ｊの反応液中で２２℃にて２
時間反応させる。その後７０℃にて１０分間加熱するこ
とにより、反応を停止させる。
−ｉＤＮＡ、、０．４μｉの開裂されたｐＢＲ３２２，
−３０ｍＦｖｉＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、
１０ ｍＭＭｇｃｌ、、 １０ ｍＭ ２−メルカプト
エタノール、 ０．１ ｍＭ ＡＴＰ、 Ｉ Ｕ Ｔ４
リガーゼをふ（む１００．Ｊの反応液中で２２℃にて２
時間反応させる。その後７０℃にて１０分間加熱するこ
とにより、反応を停止させる。
４）２組換え体プラスミドの大腸ｍへの導入エシェリヒ
ア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ３３５２５を
４ＯＮのＬ−グロス（ポリペプトン１％、酵母エキス０
．５％、 ＮａＣ１０，５％）に接種し、３７℃にて５
Ｘ１つｉまで増殖させた後、４℃にて遠心集菌する。こ
の角を２５ｍｅ＃）冷’Ｐ Ｌ タ１００μｉＭ Ｍｇ
Ｃ１゜に懸濁し、遠心集劇後、さらに２５１の冷やした
１ ００ｍＭ ＣａＣ５に懸濁し、２０分間水中で冷却
した後、再び遠心集菌する。この菌を４腕の冷やした１
００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁する。こうして得られた
菌懸濁液の２００ｄに再結合したプラスミドＤＮＡ溶液
４０μｍを加え、水中に１時間保持する。その後４２℃
にて２分間加熱した後、この懸濁液をテトラサイクリン
（１０μｍ膚）をふ（むし−グロス寒天培地に塗布し、
３７℃にて一夜培養する。こうして寒天培地上に出現し
たコロニーをアンピシリン（５ｏμｉ、Ａ／ ）をふ（
むＬ−グロス寒天培地上に移殖して生産の有無を試駁し
、アンピシリン感受性を示すコロニーを組換え体ＤＮＡ
を保持した大腸菌として分離した。
ア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ３３５２５を
４ＯＮのＬ−グロス（ポリペプトン１％、酵母エキス０
．５％、 ＮａＣ１０，５％）に接種し、３７℃にて５
Ｘ１つｉまで増殖させた後、４℃にて遠心集菌する。こ
の角を２５ｍｅ＃）冷’Ｐ Ｌ タ１００μｉＭ Ｍｇ
Ｃ１゜に懸濁し、遠心集劇後、さらに２５１の冷やした
１ ００ｍＭ ＣａＣ５に懸濁し、２０分間水中で冷却
した後、再び遠心集菌する。この菌を４腕の冷やした１
００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁する。こうして得られた
菌懸濁液の２００ｄに再結合したプラスミドＤＮＡ溶液
４０μｍを加え、水中に１時間保持する。その後４２℃
にて２分間加熱した後、この懸濁液をテトラサイクリン
（１０μｍ膚）をふ（むし−グロス寒天培地に塗布し、
３７℃にて一夜培養する。こうして寒天培地上に出現し
たコロニーをアンピシリン（５ｏμｉ、Ａ／ ）をふ（
むＬ−グロス寒天培地上に移殖して生産の有無を試駁し
、アンピシリン感受性を示すコロニーを組換え体ＤＮＡ
を保持した大腸菌として分離した。
５）、セファロスポリン・アシラーゼ産生能を有する大
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテト
ラサイクリンをふ（むＬ−グロス寒天培地上で３２℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかぎとって１００ｔ
Ｌｅの且−アセトキシメチル−ユー（土−カルボキシブ
タンアミド）七フー３−エム−４−カルボン酸（ＩＦ／
／ＩＭ）をふ（む０． Ｉ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に懸濁した後、３７℃にて５時間反応させる。その後
１２０μ４の反応停止液（１００％酢酸２容と０．２５
Ｍ ＮａＯＨ１容の混合液）を加え、さらに４ｏｌＬｅ
の発色液（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを０．
５％になるようにメタノールに加えた液）を加える。こ
の反応でセファロスポリン・アシラーゼ産生能を有する
大腸菌は反応液を黄色に変色させる。こうして得られた
新規な大腸菌をエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐ
ＡＫＫｌｏｏｌ）と命名した。
腸菌の選択分離 上記のようにして得られたアンピシリン感受性株をテト
ラサイクリンをふ（むＬ−グロス寒天培地上で３２℃に
て一夜培養し、生育した菌の一部をかぎとって１００ｔ
Ｌｅの且−アセトキシメチル−ユー（土−カルボキシブ
タンアミド）七フー３−エム−４−カルボン酸（ＩＦ／
／ＩＭ）をふ（む０． Ｉ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０
）に懸濁した後、３７℃にて５時間反応させる。その後
１２０μ４の反応停止液（１００％酢酸２容と０．２５
Ｍ ＮａＯＨ１容の混合液）を加え、さらに４ｏｌＬｅ
の発色液（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを０．
５％になるようにメタノールに加えた液）を加える。こ
の反応でセファロスポリン・アシラーゼ産生能を有する
大腸菌は反応液を黄色に変色させる。こうして得られた
新規な大腸菌をエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐ
ＡＫＫｌｏｏｌ）と命名した。
６）、大腸菌よりプラスミドＤＮＡの分離と解析上記の
大腸菌な１００ＮのテトラサイクリンをふくむＬ−グロ
スに接種し３７℃にて一夜培養後、遠心集菌し、１５％
蔗糖、 ｓ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ−ｇ（ｐＨ８、５
） 、 ５０ ｍＭＥＤＴＡおよび１苧省のリゾチーム
よりなる溶液２ｔｎｌに懸濁した後、室温にて１時間保
持する。
大腸菌な１００ＮのテトラサイクリンをふくむＬ−グロ
スに接種し３７℃にて一夜培養後、遠心集菌し、１５％
蔗糖、 ｓ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ−ｇ（ｐＨ８、５
） 、 ５０ ｍＭＥＤＴＡおよび１苧省のリゾチーム
よりなる溶液２ｔｎｌに懸濁した後、室温にて１時間保
持する。
次にＴｒｉｔｏｎ 溶液（０，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ；ｐＨ８，５） ２ ｍｌを加え、３７℃にて３０
分間保持する。その後この溶液を５℃にて３０．ＯＯＯ
ｒｐｍで３０分間遠心し、上溝を採取する。これをエチ
ジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心（１
５℃にて４０．ｔＪＯＯｒｐｍ 。
１００，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ；ｐＨ８，５） ２ ｍｌを加え、３７℃にて３０
分間保持する。その後この溶液を５℃にて３０．ＯＯＯ
ｒｐｍで３０分間遠心し、上溝を採取する。これをエチ
ジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心（１
５℃にて４０．ｔＪＯＯｒｐｍ 。
４８時間）にかけ、プラスミドＤＮＡを分離精製する。
これを２）と同様の方法でＰｓ ｔｌで切断し、断片の
長さを１％アガロースを用いたアガロース電気泳動法で
測定したところ、ベクターＤＮＡに相当する４、３Ｋｂ
の断片の他に３．６Ｋｂ 、 ２．６Ｋｂ 、 ０．９
Ｋｂの断片が見出された。このことから新規な大腸菌か
ら分離された組換え体ＤＮＡは別図１において制限酵素
地図で示される構造を有し、赳換え体Ｄ Ｎ’ Ａでは
ｐＢＲ３２２に７． ＩＫｂのＤＮＡ断片が組込まれて
いることが判明した。
長さを１％アガロースを用いたアガロース電気泳動法で
測定したところ、ベクターＤＮＡに相当する４、３Ｋｂ
の断片の他に３．６Ｋｂ 、 ２．６Ｋｂ 、 ０．９
Ｋｂの断片が見出された。このことから新規な大腸菌か
ら分離された組換え体ＤＮＡは別図１において制限酵素
地図で示される構造を有し、赳換え体Ｄ Ｎ’ Ａでは
ｐＢＲ３２２に７． ＩＫｂのＤＮＡ断片が組込まれて
いることが判明した。
７′）、反応生成物の確認
上記の新規な大腸菌をテトラサイクリンをふくむＬ−ブ
ロス５就に接種し、３２℃にて一夜培養後に遠心集菌し
、 １１１１１７のニーアセトキシメチル−７−（４−
カルボキシブタンアミド）セフ−ニーエム−土−カルボ
ン酸（２−５を肩）をふ（む０．１Ｍ燐酸緩衝液に懸濁
する。これを３７℃にて６時間反応させ、遠心して上溝
を採取し、高速液体クロマトグラフィーに供する。高速
液体クロマトグラｌフィーにはＬｉｎｃｈｒｏｓｏｒｂ
８１１００を元てんしＬカラム（１５０Ｘ４ｍｍ）を
用い、溶媒としては０．１ＭＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５
）を用いて溶出し、溶出液中の紫外部吸光物質を２６０
ｎｍの吸光度を測定して検出する。上記反応液からは
７ＡＣＡに完全に一致する紫外部吸光物質が検出され、
７ ＡＣＡが生成していることが確認された。
ロス５就に接種し、３２℃にて一夜培養後に遠心集菌し
、 １１１１１７のニーアセトキシメチル−７−（４−
カルボキシブタンアミド）セフ−ニーエム−土−カルボ
ン酸（２−５を肩）をふ（む０．１Ｍ燐酸緩衝液に懸濁
する。これを３７℃にて６時間反応させ、遠心して上溝
を採取し、高速液体クロマトグラフィーに供する。高速
液体クロマトグラｌフィーにはＬｉｎｃｈｒｏｓｏｒｂ
８１１００を元てんしＬカラム（１５０Ｘ４ｍｍ）を
用い、溶媒としては０．１ＭＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５
）を用いて溶出し、溶出液中の紫外部吸光物質を２６０
ｎｍの吸光度を測定して検出する。上記反応液からは
７ＡＣＡに完全に一致する紫外部吸光物質が検出され、
７ ＡＣＡが生成していることが確認された。
８）２組換え体ＤＮＡの改変によるセファロスポリ １
ン・アシラーゼ産生能の増大した大腸−菌の分離 組換え体ＤＮＡ中に存在するセファロスポリン・アシラ
ーゼ産生遺伝子の発現を増大させることによりセファロ
スポリン・アシラーゼの産生を増大させるため、以下に
のべる工程にしたがって組換え体ＤＮＡの改変が行なわ
れた。
ン・アシラーゼ産生能の増大した大腸−菌の分離 組換え体ＤＮＡ中に存在するセファロスポリン・アシラ
ーゼ産生遺伝子の発現を増大させることによりセファロ
スポリン・アシラーゼの産生を増大させるため、以下に
のべる工程にしたがって組換え体ＤＮＡの改変が行なわ
れた。
１１）、 エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫ
Ｋｌｏｏｚ）から６）のようにして分離したプラスミド
ＤＮＡな以下のようにしてＢａｍＨＩで部分的に切断す
る。プラスミドＤＮＡＩμＪに対し０．５ＵのＢａｍＨ
Ｉを加え、１）でのべたＤＮＡ切断用の緩衝ｇ３０με
中で３７℃にて１時間反応させた後、等容量のＴＮＥＩ
Ｉ衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止させる
。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容量のエ
チルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを除去す
る。この溶液中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ、沈殿
を％０濃度ＴＶ緩衝液に溶かす。
Ｋｌｏｏｚ）から６）のようにして分離したプラスミド
ＤＮＡな以下のようにしてＢａｍＨＩで部分的に切断す
る。プラスミドＤＮＡＩμＪに対し０．５ＵのＢａｍＨ
Ｉを加え、１）でのべたＤＮＡ切断用の緩衝ｇ３０με
中で３７℃にて１時間反応させた後、等容量のＴＮＥＩ
Ｉ衝液で飽和したフェノールを加え、反応を停止させる
。次に遠心によりフェノールを除去した後、等容量のエ
チルエーテルを加えて混合し、エチルエーテルを除去す
る。この溶液中のＤＮＡをエタノールで沈殿させ、沈殿
を％０濃度ＴＶ緩衝液に溶かす。
１）、ベクターｐＢＲ３２５（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製品カタロ
グＮα５２６５ ＳＡ ）を２）でのべた方法によって
ＰｓｔＩで開裂し３）でのべた方法で再び閉環させた後
、エシェリヒア・コＩＪ Ｋ１２Ｃ６０Ｏｒ−ｍ−ＡＴ
ＣＣ３３５２５に導入し、テトラサイクリンをふくむＬ
−プロス寒天培地上に生育して（るコロニーからアンピ
シリンに感受性になった株を選択分離する。こうして得
られたアンピシリン感受性体よりプラスミドＤＮＡを取
得することにより、アンピシリン耐性遺伝子（β−ラク
タマーゼ産生遺伝子）が不活化された新規なベクターが
得られる。
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製品カタロ
グＮα５２６５ ＳＡ ）を２）でのべた方法によって
ＰｓｔＩで開裂し３）でのべた方法で再び閉環させた後
、エシェリヒア・コＩＪ Ｋ１２Ｃ６０Ｏｒ−ｍ−ＡＴ
ＣＣ３３５２５に導入し、テトラサイクリンをふくむＬ
−プロス寒天培地上に生育して（るコロニーからアンピ
シリンに感受性になった株を選択分離する。こうして得
られたアンピシリン感受性体よりプラスミドＤＮＡを取
得することにより、アンピシリン耐性遺伝子（β−ラク
タマーゼ産生遺伝子）が不活化された新規なベクターが
得られる。
Ｃ）、上記の新規ブＺベクタープラスミドをＢａｍＨｉ
で開裂させる。
で開裂させる。
ｄ）、ａ）で得られたＤＮＡと開裂された新規なベクタ
ープラスミドを３）でのべ定方法により再結合し１．ｌ
ｒ−シエリヒア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ
３３５２５に導入した後、クロラムフェニコール（２０
ｐ、ｆｌ属）をふくむＬ−グロス寒天培地に生育するコ
ロニーを選択分離する。
ープラスミドを３）でのべ定方法により再結合し１．ｌ
ｒ−シエリヒア・コリに１２Ｃ６００ｒ−ｍ−ＡＴＣＣ
３３５２５に導入した後、クロラムフェニコール（２０
ｐ、ｆｌ属）をふくむＬ−グロス寒天培地に生育するコ
ロニーを選択分離する。
ｅ）１選択された株の中から５）にのべる方法によりセ
ファロスポリン・アシラーゼ産生能を有する株を選択分
離する。次にセファロスポリン・アシラーゼ産生能を有
する株のセファロスポリン・アシラーゼ活性を測定し、
最も活性の高い株を選択分離づ−る。セファロスポリン
・アシラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコールをふ
くむし一ブロス５彪で一夜培養した菌体をｌ−アセトキ
シメチル−ニー（生−カルボキシブタンアミド）七フー
章−エムー土−力′ルボンＥｌ（２，５ｍＶｎＪ）をふ
くむＯ，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，ｔｌ ）２鞭に懸濁
し、３７℃にて１５分間反応させ、反応後直ちに遠心し
て菌体を除去した後、反応液の一定量を７）にのべる高
速液体クロマトグラフィーに供し、生成している７ＡＣ
Ａを定量する。
ファロスポリン・アシラーゼ産生能を有する株を選択分
離する。次にセファロスポリン・アシラーゼ産生能を有
する株のセファロスポリン・アシラーゼ活性を測定し、
最も活性の高い株を選択分離づ−る。セファロスポリン
・アシラーゼ活性の測定にはクロラムフェニコールをふ
くむし一ブロス５彪で一夜培養した菌体をｌ−アセトキ
シメチル−ニー（生−カルボキシブタンアミド）七フー
章−エムー土−力′ルボンＥｌ（２，５ｍＶｎＪ）をふ
くむＯ，１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，ｔｌ ）２鞭に懸濁
し、３７℃にて１５分間反応させ、反応後直ちに遠心し
て菌体を除去した後、反応液の一定量を７）にのべる高
速液体クロマトグラフィーに供し、生成している７ＡＣ
Ａを定量する。
このようにして得られた高いセファロスポリン・アシラ
ーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒア
・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）と命名し
た。新規な大腸菌のセファロスポリン−アシラーゼ産生
能を比活性で比較したところ、コマモナス属細菌５Ｙ−
７７−１微工研菌寄第２４１ｏ号活性を１とするとき、
エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏｌ
）は３、これに対してエシェリヒア・コリに１２Ｃ６０
０（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）では１５であった。
ーゼ産生能を有する新規な大腸菌の一株をエシェリヒア
・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）と命名し
た。新規な大腸菌のセファロスポリン−アシラーゼ産生
能を比活性で比較したところ、コマモナス属細菌５Ｙ−
７７−１微工研菌寄第２４１ｏ号活性を１とするとき、
エシェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏｌ
）は３、これに対してエシェリヒア・コリに１２Ｃ６０
０（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）では１５であった。
９）、セファロスポリン・アシラーゼ産生能の増大した
大腸菌よりプラスミドＤ Ｎ Ａ Ｏ）分離と解析 ８）で得られた新規な大腸菌より６）でのべる方法によ
ってプラスミドＤＮＡを分離し、ＢａｍＨＩで切断して
アガロースゲル電気泳動法でＤＮＡ断片の長さを測定し
たところ、８）のｂ）で得られた新規なベクターに相当
する５、９Ｋｂの断片の他に４．８ Ｋｂ 。
大腸菌よりプラスミドＤ Ｎ Ａ Ｏ）分離と解析 ８）で得られた新規な大腸菌より６）でのべる方法によ
ってプラスミドＤＮＡを分離し、ＢａｍＨＩで切断して
アガロースゲル電気泳動法でＤＮＡ断片の長さを測定し
たところ、８）のｂ）で得られた新規なベクターに相当
する５、９Ｋｂの断片の他に４．８ Ｋｂ 。
０、７Ｋｂの断片が見出された。さらにプラスミドＤ
Ｎ Ａ ’ｆ＜ ＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動法で解析した結果にもとすいて、別図２に示され
る組換え体ＤＮＡの制限酵素地図が作成された。
Ｎ Ａ ’ｆ＜ ＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動法で解析した結果にもとすいて、別図２に示され
る組換え体ＤＮＡの制限酵素地図が作成された。
このことからエシェリヒア・コリＫｌ ２Ｃ６００（ｐ
ＡＫＫＢｌｏｏｌ）より分離された組換え体ＤＮＡでは
、ｐＢＲ３２５を改変した新規なベクターＤＮＡにエシ
ェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏｌ）か
ら分離された組換え体ＤＮＡの一部分である５、５Ｋｂ
のＤＮＡ断片が組込まれていることが判明した。
ＡＫＫＢｌｏｏｌ）より分離された組換え体ＤＮＡでは
、ｐＢＲ３２５を改変した新規なベクターＤＮＡにエシ
ェリヒア・コリに１２Ｃ６００（ｐＡＫＫｌｏｏｌ）か
ら分離された組換え体ＤＮＡの一部分である５、５Ｋｂ
のＤＮＡ断片が組込まれていることが判明した。
第１図はエシェリヒア・コリＫｌ ２Ｃ６００（ｐＡＫ
Ｋｌｏｏｌ）より分離された組換え体プラスミドの制限
酵素地図であり、第２図は、エシェリヒア・コリに１２
Ｃ６００（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）より分離された組換え
体プラスミドの制限酵素地図である。 特許出願人 旭化成工業株式会社 −へ 味 鉄
Ｋｌｏｏｌ）より分離された組換え体プラスミドの制限
酵素地図であり、第２図は、エシェリヒア・コリに１２
Ｃ６００（ｐＡＫＫＢｌｏｏｌ）より分離された組換え
体プラスミドの制限酵素地図である。 特許出願人 旭化成工業株式会社 −へ 味 鉄
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）、コマモナス属細酌の全ＤＮＡを制限酵素で切ツし
て得たセファロスポリン化合物に対するアシラーゼ産生
遺伝情報を担５ＤＮＡ断片２、特許請求の範囲第１項記
載のＤＮＡ断片を大腸菌用ベクターに組込んだ組換え体
ＤＮＡ３）、特許請求の範囲第２項記載の組換え体ＤＮ
Ａを導入させた新規な大腸菌 “）・特許請求の範−オ′項記載の組換え体ＤＮＡ・
を改変し、セファロスポリン・アシラーゼ産生□ 能が
増大する遺伝情報を１含有するようにな？た改変された
組換え体ＤＮＡ ５）、特許請求の範囲第４項の改変された組換え体ＤＮ
Ａを導入させた新規な大腸菌 ６）、特許請求の範囲第５項の大腸−を培養し、一般式 （式中Ｒは−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＣＯＯＨ基、Ｘは
水垢原子、−ＯＨ基、−０ＣＯＣＨ８基または核性残基
な示す） であられされる化合物＜１）に作用させ、一般式 （式中Ｘは前記と同じ・基を示す） であられされる化合物側、を生成させる活性を有する菌
体またはその処理物を得る方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21863283A JPS60110292A (ja) | 1983-11-22 | 1983-11-22 | セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21863283A JPS60110292A (ja) | 1983-11-22 | 1983-11-22 | セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60110292A true JPS60110292A (ja) | 1985-06-15 |
Family
ID=16722988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21863283A Pending JPS60110292A (ja) | 1983-11-22 | 1983-11-22 | セフアロスポリン・アシラ−ゼ産生遺伝情報を担うｄνａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60110292A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6374488A (ja) * | 1986-09-18 | 1988-04-04 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ７−アミノセフアロスポラン酸およびその誘導体の製造法 |
| US4981789A (en) * | 1987-03-18 | 1991-01-01 | Merck & Co., Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| US5104800A (en) * | 1989-06-27 | 1992-04-14 | Merck & Co., Inc. | One-step cephalosporin c amidase enzyme |
| US5229274A (en) * | 1989-06-27 | 1993-07-20 | Merck & Co., Inc. | Gene encoding one step cephalosporin C amidase and expression thereof in recombinant bacillus |
| US5310659A (en) * | 1990-10-22 | 1994-05-10 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | GL-7ACA acylase |
| US5559005A (en) * | 1991-10-15 | 1996-09-24 | Merck & Co., Inc. | Bioprocess for preparing 7-ACA and 7-ADAC |
| US7592168B2 (en) | 2003-08-11 | 2009-09-22 | Sandoz Ag | Cephalosporin C acylase mutant and method for preparing 7-ACA using same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5417032A (en) * | 1977-07-08 | 1979-02-08 | Ricoh Co Ltd | Fixer for recording medium bearing toner image |
-
1983
- 1983-11-22 JP JP21863283A patent/JPS60110292A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5417032A (en) * | 1977-07-08 | 1979-02-08 | Ricoh Co Ltd | Fixer for recording medium bearing toner image |
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