JPS6152291A - プラスミドｐＡＧ３ - Google Patents
プラスミドｐＡＧ３Info
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- JPS6152291A JPS6152291A JP59172396A JP17239684A JPS6152291A JP S6152291 A JPS6152291 A JP S6152291A JP 59172396 A JP59172396 A JP 59172396A JP 17239684 A JP17239684 A JP 17239684A JP S6152291 A JPS6152291 A JP S6152291A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- pag3
- corynebacterium
- microorganism
- molecular weight
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌よシ分離
された新規プラスミドｐＡＧ３およびその誘導体ｊ該プ
ラスミドを製造する方法並びに該プラスミドを含有する
微生物に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、
大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られておシ
、またその変異株は、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシ
ン酸等のプリンヌクレオチドを生産することが知られて
いる。
された新規プラスミドｐＡＧ３およびその誘導体ｊ該プ
ラスミドを製造する方法並びに該プラスミドを含有する
微生物に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、
大量にＬ−グルタミン酸を生産することが知られておシ
、またその変異株は、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシ
ン酸等のプリンヌクレオチドを生産することが知られて
いる。
従来の技術
グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、章業上極めて有用
な菌種でアわ、他の産業上有用な微生物と同様にこの菌
種についても、Ｄ Ｎ Ａ組換え技術による育種、改良
が試みられている。一方、このＤＮＡ組換え技術による
育種、改良をおこなうためには、この菌種を宿主とする
に適したベクターの取得が必須でアシ、プラスミドやフ
ァージの検索がおこなわれそいる。
な菌種でアわ、他の産業上有用な微生物と同様にこの菌
種についても、Ｄ Ｎ Ａ組換え技術による育種、改良
が試みられている。一方、このＤＮＡ組換え技術による
育種、改良をおこなうためには、この菌種を宿主とする
に適したベクターの取得が必須でアシ、プラスミドやフ
ァージの検索がおこなわれそいる。
現在までに、プラスミドｐｃＧｌ（％開昭５７−１３４
５ｏｏ）、プラスミドｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９
７ ） 、プラスミド１）ＣＧ４ （特開昭５７−１８
６４９２ ）、プラスミドｐ Ａ Ｍ ２８６ ％プラ
スミドｐＡＭ３３０ （＊開昭５８−６７６９９）
％プラスミドｐＨＭ１ ｓ １９（特開昭５８−７７８
９５）等のグルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミ
ドが知られている。
５ｏｏ）、プラスミドｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９
７ ） 、プラスミド１）ＣＧ４ （特開昭５７−１８
６４９２ ）、プラスミドｐ Ａ Ｍ ２８６ ％プラ
スミドｐＡＭ３３０ （＊開昭５８−６７６９９）
％プラスミドｐＨＭ１ ｓ １９（特開昭５８−７７８
９５）等のグルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミ
ドが知られている。
発明が解決しようとする問題点
グルタミン酸生産性コリネ型細菌を宿主とするよセ良い
ベクタープラスミドの作成を行う為には、よシ多くの同
菌種のプラスミドを取得し、その中からベクタープラス
ミドに適した、またはベクタープラスミドに加工するに
適したプラスミドを選択する必要がある。しかし現在ま
でには、前記のプラスミドしか発見されておらず、グル
タミン酸生産性コリネ型細菌の新たなプラスミドの発見
及び単離が望まれていた。
ベクタープラスミドの作成を行う為には、よシ多くの同
菌種のプラスミドを取得し、その中からベクタープラス
ミドに適した、またはベクタープラスミドに加工するに
適したプラスミドを選択する必要がある。しかし現在ま
でには、前記のプラスミドしか発見されておらず、グル
タミン酸生産性コリネ型細菌の新たなプラスミドの発見
及び単離が望まれていた。
問題を解決する為の手段および作用
本発明者らは、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラ
スミドを検索した結果、ベクタープラスミドとして用い
るのに適したまたはベクタープラスミドに加工するのに
適したシラスミ７ドｐＡＧ３を、コリネＡクテリウム・
メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ａｉ＠ｃｏｌａ ） ２２２２０ （微工研条第５５９
号）から得ることができ、本発明を完成した。
スミドを検索した結果、ベクタープラスミドとして用い
るのに適したまたはベクタープラスミドに加工するのに
適したシラスミ７ドｐＡＧ３を、コリネＡクテリウム・
メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ａｉ＠ｃｏｌａ ） ２２２２０ （微工研条第５５９
号）から得ることができ、本発明を完成した。
プラスミドｐＡＧ３は、約４８キロベースの分子量があ
シ、頻用される制限酵素に対して、後記するごとき限定
された切断部分を有する。プラスミドｐＡＧ３は、新ら
たに土壌から単離した菌株２２２２０から得られた。２
２２２０株の菌学的性質は下記の通シである。
シ、頻用される制限酵素に対して、後記するごとき限定
された切断部分を有する。プラスミドｐＡＧ３は、新ら
たに土壌から単離した菌株２２２２０から得られた。２
２２２０株の菌学的性質は下記の通シである。
（１）顕微鏡による所見
通常０．５〜ＬＯＸ０．８−４０ ミクロンの桿菌で
大小不同のものを含む。スナツピングディ、ビジョンに
よるＶ字状配列と多形性を示す。グジム陽性、非運動性
で、胞子をつくらない。
大小不同のものを含む。スナツピングディ、ビジョンに
よるＶ字状配列と多形性を示す。グジム陽性、非運動性
で、胞子をつくらない。
（２）培養による所見
ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはつきシした正円
形で、不透明でやや光沢がある。
形で、不透明でやや光沢がある。
色は黄色である。寒天斜面上では、接種線に沿って線状
に旺盛な生育を示し、臭気や培地の着色はない。寒天穿
刺培養では、最上部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン
培地では、均質に、濁奴、表面にリングを形成する。
に旺盛な生育を示し、臭気や培地の着色はない。寒天穿
刺培養では、最上部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン
培地では、均質に、濁奴、表面にリングを形成する。
（３）生理的性質
ａ、温度＝２５℃−３７℃で生育する。
ｂ、ｐＨ：ｐＨ６−ｐＨ９で生育可能である。
Ｃ１耐熱性：１０％スキムミルク中、５５℃前後で１５
分程度の耐熱性を有する。
分程度の耐熱性を有する。
ｄ、好気性である。
ｅ、ゼラチンを液化しない。
ｆ、リドマスミルクを変化させない。
ｇ、インドールを生産しない。
ｈ、フォーゲス尋プロスカウエル試験
（Ｖｏｇｅａ −Ｐｒｏａｋａｕｅｒ ｔｅｓｔ）に陰
性。
性。
１、硫化水素を生成しない。
ｊ、メチルレッド試験に陽性。
ｋ６硝酸塩を還元する。
１、クエン酸を利用しない。
ｍ、デンプンを液化しない。
ｎ、ウレアーゼ生成：陽性。
０、カタラーゼの生成：陽性。
ｐ、各種炭水化物からの酸の生成。
グルコース、フンクトース、シュークロ６一
−ス、マルトース、マンノースｊＪ）ｆｆヲ生成スルフ
！Ｊｉ、マンニトール、キシロース、アラビノース、ラ
フィノース、ラクトースからは酸を生成しない。
！Ｊｉ、マンニトール、キシロース、アラビノース、ラ
フィノース、ラクトースからは酸を生成しない。
ｑ、ビオチンを要求する。
ｒ、ビオチン制限培地で、または高濃度ピオチン含有培
地では界面活性剤の添加によ・す、培地中にＬ−グルタ
ミン酸を著量蓄積する。
地では界面活性剤の添加によ・す、培地中にＬ−グルタ
ミン酸を著量蓄積する。
上記の菌学的性質を有する２２２２０株についてその分
類学上の位置を、ノ々−シーズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・ノ々クテリオロジー第８版（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｅｉｇｈｔｈ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）および登録番号５７６６９０の特許を参
照し更【コリネノ々クテリウム・メラセコラ ＡＴＣＣ
１７９６５（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５）をタイプカル
チャーとして比較横側した結果、２２２２０株はコリネ
ノ々クテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｌ）ａｃｔ
ｅｒｉｕｍｍｅｌａａｓｅｃｏｌａ ）に極めてよく一
致していた。それ故、２２２２０株をコリネノ々クテリ
ウムψメラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｎｅｌａｓｓｅｃｌａ）と同定した。
類学上の位置を、ノ々−シーズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・ノ々クテリオロジー第８版（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｅｉｇｈｔｈ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）および登録番号５７６６９０の特許を参
照し更【コリネノ々クテリウム・メラセコラ ＡＴＣＣ
１７９６５（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５）をタイプカル
チャーとして比較横側した結果、２２２２０株はコリネ
ノ々クテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｌ）ａｃｔ
ｅｒｉｕｍｍｅｌａａｓｅｃｏｌａ ）に極めてよく一
致していた。それ故、２２２２０株をコリネノ々クテリ
ウムψメラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｒｎｅｌａｓｓｅｃｌａ）と同定した。
同、コリネノ々クテリウム拳メラセコラ ２２２２０（
Ｃｏｒｙｎｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ ２２２２０ ）は１微生物工業技術研究所に微工
研条寄第５５９号として寄託されている。
Ｃｏｒｙｎｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ ２２２２０ ）は１微生物工業技術研究所に微工
研条寄第５５９号として寄託されている。
プラスミドｐ Ａ Ｇ ３は、笛体のりゾチウム・ＳＤ
Ｓ処理、同溶菌液のフェノール・クロロホルム処理、同
処理液のエタノール沈澱処理・同沈澱物質のエチジウム
ブロマイドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心によシ
、容易に分離精製できる。
Ｓ処理、同溶菌液のフェノール・クロロホルム処理、同
処理液のエタノール沈澱処理・同沈澱物質のエチジウム
ブロマイドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心によシ
、容易に分離精製できる。
（Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ ｅ Ｊ、 ５ａｎｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｙ 、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、 Ｙ、 １９８２）プラスミ
ドｐＡＧ３’の特徴 （１） プラスミドｐＡＧ３は、分子量約４，８キロ
ベースのデオキシリ２核酸（ＤＮＡ）である。
ｓｃｈ ｅ Ｊ、 ５ａｎｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｙ 、 ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、 Ｙ、 １９８２）プラスミ
ドｐＡＧ３’の特徴 （１） プラスミドｐＡＧ３は、分子量約４，８キロ
ベースのデオキシリ２核酸（ＤＮＡ）である。
（２） プラスミドｐＡＧ３は、下記制限酵素に対し
、次の切断感受性を有する。
、次の切断感受性を有する。
酵素半 切断部位数
Ｈｉｎｄｌｌｌ ＩＰａｔ Ｉ
Ｉ Ｂａｍ旧 Ｉ ＸｂａＩ １ 半制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制限酵素の
略称である。
Ｉ Ｂａｍ旧 Ｉ ＸｂａＩ １ 半制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制限酵素の
略称である。
Ｈｉｎｄｎ［：ヘモフイラス・インフルエンザＲｄ（Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ
）ＰｓｔＩ：プロビデンシア・スチュアーテイー １６
４（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ １
６４ ）ＢａｍＨＩ ：Ａチルス・アミロリクエファ
シェンス Ｈ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｌｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎ＋ｓ Ｈ）ＸｂａＩ ：キサンド
モナス拳パドリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｂａｄｒ
ｉｉ）制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素存
在下でプラスミドｐＡＧ３を完全消化し、それらの消化
物を１係アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能段断
片の数から決定される。
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ
）ＰｓｔＩ：プロビデンシア・スチュアーテイー １６
４（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ １
６４ ）ＢａｍＨＩ ：Ａチルス・アミロリクエファ
シェンス Ｈ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｌｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎ＋ｓ Ｈ）ＸｂａＩ ：キサンド
モナス拳パドリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｂａｄｒ
ｉｉ）制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素存
在下でプラスミドｐＡＧ３を完全消化し、それらの消化
物を１係アガロースゲル電気泳動にかけ、分離可能段断
片の数から決定される。
分子量は、アガロースゲルの場合には大腸菌のラムダフ
ァ一−）（λｐｈａｇｅ ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩ［ｌ で消化して得られる分子量既知の断片（分
子量の大きい順に２３１３０．９４１９．６５５７ 。
ァ一−）（λｐｈａｇｅ ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩ［ｌ で消化して得られる分子量既知の断片（分
子量の大きい順に２３１３０．９４１９．６５５７ 。
４３７１．２３２２．２０２８．５６４．１２５ 塩
基対の大きさを有する）の同一アガロースグル上での泳
動距離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドｐＡ
Ｇ３の分子量を算出する。
基対の大きさを有する）の同一アガロースグル上での泳
動距離で描かれる標準線に基づき、消化プラスミドｐＡ
Ｇ３の分子量を算出する。
プラスミドｐＡＧ３に対する前記制限酵素の相対的な切
断部位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動で解析することにより求
めることができる。こうして得られたプラスミドｐＡＧ
３の制限酵素地図を第１図に示す。
断部位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動で解析することにより求
めることができる。こうして得られたプラスミドｐＡＧ
３の制限酵素地図を第１図に示す。
プラスミドｐＡＧ３の自律複製の機能は、一般のプラス
ミドと同様に、プラスミドｐＡＧ３の一部に担われてい
る。従ってプラスミドｐＡＧ３の一部領域を欠失しｆｃ
ｂ、あるいは別のＤＮＡを挿入付加したようなプラスミ
ド誘導体も同様な機能を有している。それ故、プラスミ
ドｐＡＧ３の有用性は、そのものだけでなく、それよシ
修飾して得られるＤＮＡにも備わっている。
ミドと同様に、プラスミドｐＡＧ３の一部に担われてい
る。従ってプラスミドｐＡＧ３の一部領域を欠失しｆｃ
ｂ、あるいは別のＤＮＡを挿入付加したようなプラスミ
ド誘導体も同様な機能を有している。それ故、プラスミ
ドｐＡＧ３の有用性は、そのものだけでなく、それよシ
修飾して得られるＤＮＡにも備わっている。
実施例
（１） コリネノ々クテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌｍ
） ２２２ Ｚ Ｏ（微工研条寄第５５９号）菌体から
のプラスミドｐＡＧ３の単離。
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌｍ
） ２２２ Ｚ Ｏ（微工研条寄第５５９号）菌体から
のプラスミドｐＡＧ３の単離。
コリネノ々クテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２
２０ （微工研条第５５９号）を半合成培地Ｃ（ＮＩ（
４）２８０４ １０９ ’、尿素３にｌ 、 Ｉ’５Ｈ
Ｐ０４ｉｇ、 ＮａＣ７５０９、Ｍｇ５Ｏ＜ ”７Ｈ２
０４００り、 ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ２７ｎ９ 、
ＦｅＳＯ４・４−６Ｈ，０２■、グルコース２０ｇ、
ピオチン５０μｇ、チアミン塩酸塩２００μＩ、 酵
母エキス１ｇを純水に溶かして１１とし、ｐＨ７，２に
調整した培地〕で、３２℃、１晩振盪培養を行い、その
種培養８−を２００−の前記半合成培地に植菌して、３
２℃で５時間振盪培養した。
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ２２２
２０ （微工研条第５５９号）を半合成培地Ｃ（ＮＩ（
４）２８０４ １０９ ’、尿素３にｌ 、 Ｉ’５Ｈ
Ｐ０４ｉｇ、 ＮａＣ７５０９、Ｍｇ５Ｏ＜ ”７Ｈ２
０４００り、 ＭｎＳＯ４・４−６Ｈ２Ｏ２７ｎ９ 、
ＦｅＳＯ４・４−６Ｈ，０２■、グルコース２０ｇ、
ピオチン５０μｇ、チアミン塩酸塩２００μＩ、 酵
母エキス１ｇを純水に溶かして１１とし、ｐＨ７，２に
調整した培地〕で、３２℃、１晩振盪培養を行い、その
種培養８−を２００−の前記半合成培地に植菌して、３
２℃で５時間振盪培養した。
培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液〔グルコース
５０ ｍＭ ａ Ｅ ９ Ｔ Ａ １０ ｍ Ｍ ＃
）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ２５ ｒ
ｎ Ｍ ＃リゾチウム１０〜／ｄ、ｐＨ８，０，ｌ
１Ｏｍｇ に懸濁し、４２℃で１時間反応させた。本
反応液にアルカリＳＤＳ液（ＮａＯＨ０，２Ｎ 、
ＳＤＳ １’％） ２０１ｎｔを添加攪拌の後、水中に
５分間型いた。次に本反応液に氷冷した酢酸カリウム溶
液（５Ｍ酢酸カリウム溶液 ６０−１酢酸 ＩＦ５−１
純水２＆５ｆ１１ｔの混合液）１５−を添加攪拌の後水
中に１０分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移し、４
℃、５分間、１２００Ｏｒｐｍ（１３０００ｇ）の遠心
Ｋかけ上澄液を回収した。これを等量のフェノール・ク
ロロホルム液（１： １ ）で抽出して水層を回収した
。これに２培量のエタノールを添加攪拌して５分間室温
に置き、２０℃、１０分間、１００００ｒｐｍ（１００
００ｒｐ の遠心によシ、ペレットを回収した。この
ペレットを７０係エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥
して、ふたたびＴｇ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ
７，５）２０！ＩＩ／！で溶解した。この液に１０ダ／
−エチジウムブロマイド溶液Ｌ２−と塩化セシウム２＆
６ｇを加えて静かに溶解し、４００ＧＯｒｐｍ（１００
０００，ｊｉ＋）。
５０ ｍＭ ａ Ｅ ９ Ｔ Ａ １０ ｍ Ｍ ＃
）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ２５ ｒ
ｎ Ｍ ＃リゾチウム１０〜／ｄ、ｐＨ８，０，ｌ
１Ｏｍｇ に懸濁し、４２℃で１時間反応させた。本
反応液にアルカリＳＤＳ液（ＮａＯＨ０，２Ｎ 、
ＳＤＳ １’％） ２０１ｎｔを添加攪拌の後、水中に
５分間型いた。次に本反応液に氷冷した酢酸カリウム溶
液（５Ｍ酢酸カリウム溶液 ６０−１酢酸 ＩＦ５−１
純水２＆５ｆ１１ｔの混合液）１５−を添加攪拌の後水
中に１０分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移し、４
℃、５分間、１２００Ｏｒｐｍ（１３０００ｇ）の遠心
Ｋかけ上澄液を回収した。これを等量のフェノール・ク
ロロホルム液（１： １ ）で抽出して水層を回収した
。これに２培量のエタノールを添加攪拌して５分間室温
に置き、２０℃、１０分間、１００００ｒｐｍ（１００
００ｒｐ の遠心によシ、ペレットを回収した。この
ペレットを７０係エタノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥
して、ふたたびＴｇ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ
７，５）２０！ＩＩ／！で溶解した。この液に１０ダ／
−エチジウムブロマイド溶液Ｌ２−と塩化セシウム２＆
６ｇを加えて静かに溶解し、４００ＧＯｒｐｍ（１００
０００，ｊｉ＋）。
１５℃で４８時間遠心した。プラスミドｐＡＧ３は、紫
外線照射により遠心チューブ中で下方のノ々ンドとして
見い出された。このノ々ンドを遠心チューブの側面から
注射器で抜きとることによシ、プラスミドｐＡＧ３は単
離された。つづいて分画液を等容量のイソプロピルアル
コールで４回抽出してエチジウムブロマイドを除去し、
その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行って、ＤＮＡ濃度
５０μｇ／艷のプラスミドｐＡＧ３の透析液１−を得た
。
外線照射により遠心チューブ中で下方のノ々ンドとして
見い出された。このノ々ンドを遠心チューブの側面から
注射器で抜きとることによシ、プラスミドｐＡＧ３は単
離された。つづいて分画液を等容量のイソプロピルアル
コールで４回抽出してエチジウムブロマイドを除去し、
その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行って、ＤＮＡ濃度
５０μｇ／艷のプラスミドｐＡＧ３の透析液１−を得た
。
（２） プラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図と分子量
実施例１の（１）で調製したプラスミドｐ Ａ Ｇ ３
の透、析液１０μｌ（プラスミドｐＡＧ３のＤＮＡ０．
５μｇ）に過剰の制限酵素（ＨＬｎｄｕｌ 、 Ｐｓ
ｔＩ−、ＢａｍＨＩはニラポンジーン社製、Ｘｂａｌは
ベゼスダリサーチ・うｉう）ＩＪ−社製）を各々の制限
酵素の適正条件で反応させた。消化した試料は、常法に
従い、１係アガロースゲル電気泳動に供し、巾１ｃｎ１
当シ５Ｖの一定電圧で４時間泳動を行った。泳動の終っ
たゲルを１μｇ／、ｔ エチジウムブロマイド溶液に
浸漬し３０分間染色した後、紫外線をゲルに照、射して
生成断片の数を判定し、各断片の泳動距離から各々の分
子量を算出し、プラスミドｐＡＧ３の分子量を求めた。
実施例１の（１）で調製したプラスミドｐ Ａ Ｇ ３
の透、析液１０μｌ（プラスミドｐＡＧ３のＤＮＡ０．
５μｇ）に過剰の制限酵素（ＨＬｎｄｕｌ 、 Ｐｓ
ｔＩ−、ＢａｍＨＩはニラポンジーン社製、Ｘｂａｌは
ベゼスダリサーチ・うｉう）ＩＪ−社製）を各々の制限
酵素の適正条件で反応させた。消化した試料は、常法に
従い、１係アガロースゲル電気泳動に供し、巾１ｃｎ１
当シ５Ｖの一定電圧で４時間泳動を行った。泳動の終っ
たゲルを１μｇ／、ｔ エチジウムブロマイド溶液に
浸漬し３０分間染色した後、紫外線をゲルに照、射して
生成断片の数を判定し、各断片の泳動距離から各々の分
子量を算出し、プラスミドｐＡＧ３の分子量を求めた。
同、分子量は、同一アガロースグル上で同時に泳動した
ラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ消化断片の既知分
子量に基づいて算出した。
ラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄｌｌ消化断片の既知分
子量に基づいて算出した。
消化断片の大きさと、複数の制限酵素による消化断片の
解析から決定されたプラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図
を第１図に示す。
解析から決定されたプラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図
を第１図に示す。
発明の効果
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａａｉｅｃｏｌａ ）に属する微
生物よシ１グルタミン酸生産性コリネ型細菌のベクター
プラスミドとして利用可能な新らたなプラスミドｐＡＧ
３を得た。
ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａａｉｅｃｏｌａ ）に属する微
生物よシ１グルタミン酸生産性コリネ型細菌のベクター
プラスミドとして利用可能な新らたなプラスミドｐＡＧ
３を得た。
プラスミドｐＡＧ３は、制限酵素ＢａｍＨＩ 、Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ ｅｐｓｔｌ 、 Ｘｂａｌ に対して、各
々単一の切断部位を有する極めて特徴のちる有用なプラ
スミドである。
ｄｌｌｌ ｅｐｓｔｌ 、 Ｘｂａｌ に対して、各
々単一の切断部位を有する極めて特徴のちる有用なプラ
スミドである。
従って、プラスミドｐＡＧ３を用いたシ、またはプラス
ミドｐＡＧ３を加工して作成したベクタープラスミドを
利用することによシ、グルタミン酸化産性コリネ型細菌
の遺伝子操作による菌株改良を行うことが可能と々つた
。
ミドｐＡＧ３を加工して作成したベクタープラスミドを
利用することによシ、グルタミン酸化産性コリネ型細菌
の遺伝子操作による菌株改良を行うことが可能と々つた
。
第１図は、本発明のプラスミドｐＡＧ３の制限酵素地図
である。プラスミドの分子量は、キロペース（Ｋｂ）で
表示しである。図中記号は、発明の詳細な説明中に記し
た制限酵素であシ、プラスミド上のその位置はその制限
酵素切断部位を示す。その横に付記した数字は、Ｈｉｎ
ｄｌｌ切断部位を基準としたプラスミド上での位置を、
キロベースで表示したものでちる。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第１図 Ｘｂａ Ｉ （２，５）
である。プラスミドの分子量は、キロペース（Ｋｂ）で
表示しである。図中記号は、発明の詳細な説明中に記し
た制限酵素であシ、プラスミド上のその位置はその制限
酵素切断部位を示す。その横に付記した数字は、Ｈｉｎ
ｄｌｌ切断部位を基準としたプラスミド上での位置を、
キロベースで表示したものでちる。 特許出願人 旭化成工業株式会社 第１図 Ｘｂａ Ｉ （２，５）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）約４．８キロベースの分子量を有し、かつ制限酵
素に対する感受性部位数が、ＢａｍＨ I １、Ｈｉｎ
ｄIII １、Ｐｓｔ I １、Ｘｂａ I １であること
により特徴づけられるプラスミドｐＡＧ３およびその誘
導体 （２）プラスミドｐＡＧ３を含有する微生物を培地に培
養し、培養菌体を溶菌し、該溶菌物からプラスミドｐＡ
Ｇ３を単離することを特徴とするプラスミドｐＡＧ３の
製造法 （３）該微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ）に属する微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第（２）項記載のプラスミドｐＡＧ３の製造法（
４）該コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）に属す
る微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）２
２２２０（微工研条寄第５５９号）であることを特徴と
する特許請求の範囲第（３）項記載のプラスミドｐＡＧ
３の製造法 （５）プラスミドｐＡＧ３またはその誘導体を含有する
微生物 （６）該微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ）に属する微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第（５）項記載の微生物 （７）該コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）に属
する微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）
２２２２０（微工研条寄第５５９号）であることを特徴
とする特許請求の範囲第（６）項記載の微生物
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172396A JPS6152291A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ３ |
| GB8520632A GB2165546B (en) | 1984-08-21 | 1985-08-16 | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| FR858512538A FR2569421B1 (fr) | 1984-08-21 | 1985-08-20 | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| KR1019850006032A KR890003083B1 (ko) | 1984-08-21 | 1985-08-21 | 테트라시클린 내성 유전자를 함유한 플라스미드, 이로 부터 유도된 dna단편, 및 이 dna단편을 함유한 미생물 및 이들의 제조방법 |
| US07/492,227 US5158891A (en) | 1984-08-21 | 1990-03-13 | Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172396A JPS6152291A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152291A true JPS6152291A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0220237B2 JPH0220237B2 (ja) | 1990-05-08 |
Family
ID=15941157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59172396A Granted JPS6152291A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152291A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02236324A (ja) * | 1989-03-09 | 1990-09-19 | Taisei Corp | プレキヤストコンクリート梁構法 |
-
1984
- 1984-08-21 JP JP59172396A patent/JPS6152291A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02236324A (ja) * | 1989-03-09 | 1990-09-19 | Taisei Corp | プレキヤストコンクリート梁構法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0220237B2 (ja) | 1990-05-08 |
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