JPS6152290A - プラスミドｐＡＧ／ - Google Patents
プラスミドｐＡＧ／Info
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- JPS6152290A JPS6152290A JP59172395A JP17239584A JPS6152290A JP S6152290 A JPS6152290 A JP S6152290A JP 59172395 A JP59172395 A JP 59172395A JP 17239584 A JP17239584 A JP 17239584A JP S6152290 A JPS6152290 A JP S6152290A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- corynebacterium
- restriction enzyme
- microorganism
- melassec
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
３−７ 産業上の利用分野
この発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌より分離
された新規プラスミドｐ Ａ Ｇ ／およびその誘導体
、該プラスミドを製造する方法並びに該プラスミドを含
有する微生物に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細
菌は、大…にＬ−グルタミン酸を生産することが知られ
ており、またその変異株は ｌＪ ９ジン等のアミノ酸
、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産することが
知られている。
された新規プラスミドｐ Ａ Ｇ ／およびその誘導体
、該プラスミドを製造する方法並びに該プラスミドを含
有する微生物に関する。グルタミン酸生産性コリネ型細
菌は、大…にＬ−グルタミン酸を生産することが知られ
ており、またその変異株は ｌＪ ９ジン等のアミノ酸
、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産することが
知られている。
３−２ 従来の技術
グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、産業上極めて有用
な菌種であり、他の産業上有用な微生物と同様に、ＤＮ
Ａ組換え技術による育種、改良が試みられている。一方
、このＤＮＡ組換え技術による育種、改良をおこなうた
めにはこの菌種を宿主とするに適したベクターの収得が
必須であり、プラスミドやファージの検索がおこなわれ
ている。
な菌種であり、他の産業上有用な微生物と同様に、ＤＮ
Ａ組換え技術による育種、改良が試みられている。一方
、このＤＮＡ組換え技術による育種、改良をおこなうた
めにはこの菌種を宿主とするに適したベクターの収得が
必須であり、プラスミドやファージの検索がおこなわれ
ている。
現在までに、プラスミドｐｃｏ／ （特開昭５７−／３
￥ｊθθ）、プラスミドｐＣＧ２ （特開昭ｊ♂−３夕
／９７）、プラスミドｐ Ｃ（３グ（特開昭タフ−／♂
乙４ｔ９．２）、プラスミドｐ Ａ Ｍ ３３θ・プラ
スミドｐ Ａ Ｍ 、２と乙（特開昭ｊ♂−に７６９９
）、プラスミドル８Ｍ／夕／９（特開昭ｊと−７７と９
ｔ）等のグルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミド
が知られているが、大部分のプラスミドは適切な選択マ
ーカーを有しておらず実用性に欠けている。選択マーカ
ーとして有用な薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドは、
プラスミドｐ ＣＧ ￥およびその誘導体のみである。
￥ｊθθ）、プラスミドｐＣＧ２ （特開昭ｊ♂−３夕
／９７）、プラスミドｐ Ｃ（３グ（特開昭タフ−／♂
乙４ｔ９．２）、プラスミドｐ Ａ Ｍ ３３θ・プラ
スミドｐ Ａ Ｍ 、２と乙（特開昭ｊ♂−に７６９９
）、プラスミドル８Ｍ／夕／９（特開昭ｊと−７７と９
ｔ）等のグルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミド
が知られているが、大部分のプラスミドは適切な選択マ
ーカーを有しておらず実用性に欠けている。選択マーカ
ーとして有用な薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドは、
プラスミドｐ ＣＧ ￥およびその誘導体のみである。
尚、プラスミドｐｃＧｇは、ストレプトマイシンおよび
スペクチノマイシンに対する耐性遺伝子を担っている。
スペクチノマイシンに対する耐性遺伝子を担っている。
、？ −−？ 発明が解決しようとする間禎点遺伝子
工学技術が先づ大腸菌を宿主として確立された背景には
、長年蓄積された大腸菌の遺伝学的知見と多くの有用な
ベクタープラスミドの開発とがある。有用なベクタープ
ラスミドの条件としては、細胞中で多数のコピーとして
存在する複製特性を有していてプラスミドの分離が容易
であること、また分子量が小さく種々の制限酵素による
切断部位が７個所であってプラスミドの複製能を欠損さ
せることなくＤＮＡ断片をクローン化することが容易で
あること、が重要である。更にプラスミド上に２種以上
の薬剤耐性遺伝子が存在し、それぞれ選択マーカーとし
て使用でき、各薬剤耐性遺伝子内にプラスミド中唯−の
制限酵素切断点をそれぞれ有していることもベクタープ
ラスミドとして具備すべき条件である。なぜならば、制
限酵素切断部位へＤ Ｎ Ａ １ｆ′ｒ片を組み込むと
その薬剤耐性遺伝子が切断され薬剤感受性となることを
利用して、一方の薬剤耐性でプラスミド保持菌を選択し
た後他方の薬剤について感受性であることを調べること
により、容易に組換えプラスミド保持菌を識別できるか
らである。以上の様な条件を備えた代表的な大腸菌ベク
タープラスミドとしては、プラスミドｐＢＲ３，２，２
％プラスミドｐ Ｂ Ｒ−？ 、２夕等がある。
工学技術が先づ大腸菌を宿主として確立された背景には
、長年蓄積された大腸菌の遺伝学的知見と多くの有用な
ベクタープラスミドの開発とがある。有用なベクタープ
ラスミドの条件としては、細胞中で多数のコピーとして
存在する複製特性を有していてプラスミドの分離が容易
であること、また分子量が小さく種々の制限酵素による
切断部位が７個所であってプラスミドの複製能を欠損さ
せることなくＤＮＡ断片をクローン化することが容易で
あること、が重要である。更にプラスミド上に２種以上
の薬剤耐性遺伝子が存在し、それぞれ選択マーカーとし
て使用でき、各薬剤耐性遺伝子内にプラスミド中唯−の
制限酵素切断点をそれぞれ有していることもベクタープ
ラスミドとして具備すべき条件である。なぜならば、制
限酵素切断部位へＤ Ｎ Ａ １ｆ′ｒ片を組み込むと
その薬剤耐性遺伝子が切断され薬剤感受性となることを
利用して、一方の薬剤耐性でプラスミド保持菌を選択し
た後他方の薬剤について感受性であることを調べること
により、容易に組換えプラスミド保持菌を識別できるか
らである。以上の様な条件を備えた代表的な大腸菌ベク
タープラスミドとしては、プラスミドｐＢＲ３，２，２
％プラスミドｐ Ｂ Ｒ−？ 、２夕等がある。
ところが、グルタミン酸生産性コリネ型細菌においては
、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対す
る耐性遺伝子しか発見されておらず、遺伝子操作Ｃ二際
し上記の様な挿入不活化を利用した組換えプラスミド検
出法を実施できるベクターを、開発することができなか
った。その開発−夕 − を行うためには、グルタミン酸性産性コリネ型細菌由来
のストンブトマイシン及びスペクチノマイシン以外の第
コの薬剤耐性遺伝子の発見及びその遺伝子を担っている
プラスミドの単離が待たれていた。
、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンに対す
る耐性遺伝子しか発見されておらず、遺伝子操作Ｃ二際
し上記の様な挿入不活化を利用した組換えプラスミド検
出法を実施できるベクターを、開発することができなか
った。その開発−夕 − を行うためには、グルタミン酸性産性コリネ型細菌由来
のストンブトマイシン及びスペクチノマイシン以外の第
コの薬剤耐性遺伝子の発見及びその遺伝子を担っている
プラスミドの単離が待たれていた。
３−グ 問題を解決するための手段および作用本発明者
らは、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のより良いＤＮ
Ａ組換え技術を確立するために、この菌種のベクタープ
ラスミドとなり得るプラスミドの検索をおこなってきた
。その納采、ベクタープラスミドとして用いるのに適し
た、またはベクタープラスミドとして加工するのに適し
た前記以外の薬剤耐性遺伝子を有したプラスミドｐＡＧ
３／を、コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２．２．２４ｔ３（微工研条奇第ｊ乙θ号
）から得ることができ、本発明を完成した。
らは、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のより良いＤＮ
Ａ組換え技術を確立するために、この菌種のベクタープ
ラスミドとなり得るプラスミドの検索をおこなってきた
。その納采、ベクタープラスミドとして用いるのに適し
た、またはベクタープラスミドとして加工するのに適し
た前記以外の薬剤耐性遺伝子を有したプラスミドｐＡＧ
３／を、コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２．２．２４ｔ３（微工研条奇第ｊ乙θ号
）から得ることができ、本発明を完成した。
プラスミドｐ Ａ、 Ｇ ／は、約！θキロベースの分
子量があり、頻用される制限酵素数種に対して後記する
ごとき限定された切断部位を有し、更にその−に − Ｄ Ｎ Ａ−ににテトラサイタリンに対する耐性遺伝子
を有する。
子量があり、頻用される制限酵素数種に対して後記する
ごとき限定された切断部位を有し、更にその−に − Ｄ Ｎ Ａ−ににテトラサイタリンに対する耐性遺伝子
を有する。
プラスミドｐ Ａ （，３／は、新たに土壌から単離し
た菌株２２．２グ３から得られた。２２．２グ３株の菌
学的性質は、下記のとおりである。
た菌株２２．２グ３から得られた。２２．２グ３株の菌
学的性質は、下記のとおりである。
（１） 顕微鏡による所μ
通常θ、Ｊ−−／、θ×θ、／ −，２，０ミクロンの
桿菌で大小不同のものを含む。スナツピングディビジョ
ンに、ＬるＶ字配列を示Ｉ７、多形性を示す。
桿菌で大小不同のものを含む。スナツピングディビジョ
ンに、ＬるＶ字配列を示Ｉ７、多形性を示す。
グラム陽性、非運動性で、胞子をつくらない。
（２）培養による所見
ブイヨン寒天平板−ヒの集落は、辺縁のはつきりした正
円形で、不透明で光沢がある。色は黄色を帯びた乳白色
である。寒天斜面上では接種線に沿って線状に旺盛な生
育を示し、臭気や培地の着色はない。寒天穿刺培養では
、最−Ｌ部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン培地では
均質に濁り、表面にリングを形成する。
円形で、不透明で光沢がある。色は黄色を帯びた乳白色
である。寒天斜面上では接種線に沿って線状に旺盛な生
育を示し、臭気や培地の着色はない。寒天穿刺培養では
、最−Ｌ部で旺盛な生育を示す。液体ブイヨン培地では
均質に濁り、表面にリングを形成する。
（３）生理的性質
ａ、温度：、、ｔ、ｓ℃〜３７℃で生育する。
ｂ、 ｐＨ、ｐＨに−ｐＨ９で生育可能である。
Ｃ１耐熱性二／θ係スキムミルク中、タオ℃前後で／
、１分程度の耐熱性を有する。
、１分程度の耐熱性を有する。
ｄ、好気性である。
ｅ、ゼラチンを液化しない。
ｆ、！ｊトマスミルクを変化させない。
ｇ、インドールを生産しない。
ｈ、フォーゲスφプロスカウエルｉｔ験（Ｖｏｇｅｓ−
Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ｔｅｓｔ ） ：陰性。
Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ｔｅｓｔ ） ：陰性。
１、メチルレッド試験：陽性。
」、硫化水素は生成１．ない。
ｋ、硝酸塩を還元する。
１、クエン酸を利用しない。
叱 デンプンを液化しない。
ｎ、ウレアーゼ生成：陽性。
０、カタラーゼの生成：陽性。
ｐ、各種炭水化物からの酸の生成
グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、マンノースより酸を生成するが、マンニトール、キ
シロース、アラビノース、ラフィノース、ラクトースか
らは酸を生成しない。
ス、マンノースより酸を生成するが、マンニトール、キ
シロース、アラビノース、ラフィノース、ラクトースか
らは酸を生成しない。
ｑ、ビオチンを要求する。
ｒ、ビオチン制限培地で、または高濃度ピオチン含有培
地では界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタミ
ン酸を著量蓄積する。
地では界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタミ
ン酸を著量蓄積する。
−上記の歯学的性質を有する−２．２２’１３株につい
てその分類学上の位置を、バーシーズ・マニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー 第♂版（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｅｉｇｈｔ
ｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ）および特許第５７ｇ乙り０号の
特許を参照し更にコリネバクテリウム・メラセコラ Ａ
ＴＣＣ／７９乙ｊ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ／７９乙ｊ）をタイ
プカルチャーとして比較検討した結果、２２２４ｔ、？
株はコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）に極め
てよく一致していた。それ故、２２２４１３株をコリネ
バクテリワム個メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）と同定した。
てその分類学上の位置を、バーシーズ・マニュアル・オ
ブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー 第♂版（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｅｉｇｈｔ
ｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ）および特許第５７ｇ乙り０号の
特許を参照し更にコリネバクテリウム・メラセコラ Ａ
ＴＣＣ／７９乙ｊ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ／７９乙ｊ）をタイ
プカルチャーとして比較検討した結果、２２２４ｔ、？
株はコリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）に極め
てよく一致していた。それ故、２２２４１３株をコリネ
バクテリワム個メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）と同定した。
−ター
コリネバクテリウム・メラセコラ ２．２．２４１３（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ ） 、：ｌ、 、；ｌ 、；ｌ １７３は、上記
の如く菌学的性質においては、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ）とよく一致するが、テトラナイフリン耐
性プラスミドＩ）ＡＵ／を保持することが顕著な特徴で
ある。テトラサイクリン耐性遺伝子がプラスミドｐ Ａ
（１／−ヒに存在することは、後記の実験／、実験２
で確認されている。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ ） 、：ｌ、 、；ｌ 、；ｌ １７３は、上記
の如く菌学的性質においては、コリネバクテリウム・メ
ラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓ
ｓｅｃｏｌａ）とよく一致するが、テトラナイフリン耐
性プラスミドＩ）ＡＵ／を保持することが顕著な特徴で
ある。テトラサイクリン耐性遺伝子がプラスミドｐ Ａ
（１／−ヒに存在することは、後記の実験／、実験２
で確認されている。
尚、コリネバクテリウム・メラセコラ ２２２￥３（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ 、２．２２４ｔ３ ）は微生物工業技術研究所に微
］−研条寄第Ｊ−ｇθ号として寄託されている。
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ 、２．２２４ｔ３ ）は微生物工業技術研究所に微
］−研条寄第Ｊ−ｇθ号として寄託されている。
プラスミドｐＡＧ／は、菌体のリゾチウム・８０８処理
、同浴菌液のフェノール・クロロホルム処理、同処理液
のエタノール沈澱処理、同沈澱物質のエチジウムブロマ
イドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心により、容易
に分離精製できる。
、同浴菌液のフェノール・クロロホルム処理、同処理液
のエタノール沈澱処理、同沈澱物質のエチジウムブロマ
イドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心により、容易
に分離精製できる。
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ 、 ＲｏＦ、 Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ 、 Ｊ、 ５ａｎｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ−／ θ − Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｌ）ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｎ、
Ｙ、 ／ ９／ 、２ ）プラスミドｐ Ａ Ｇ ／
の特徴 ＋ｌ） プラスミドｐ Ａ （１／は、分子量約２０
キロベースのデオキシリボ核酸（Ｄ Ｎ Ａ ）である
。
ｃｈ 、 Ｊ、 ５ａｎｂｒｏｏｋ ：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ−／ θ − Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｌ）ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｎ、
Ｙ、 ／ ９／ 、２ ）プラスミドｐ Ａ Ｇ ／
の特徴 ＋ｌ） プラスミドｐ Ａ （１／は、分子量約２０
キロベースのデオキシリボ核酸（Ｄ Ｎ Ａ ）である
。
（２） プラスミドｐ Ａ （］ ／は、下記制限酵
素に対し、次の切断感受性を有する。
素に対し、次の切断感受性を有する。
酵素＊ 切断部位数
Ｒｃ ｏ Ｒｌ 、ｙ
Ｈｉ ｎ ｄ ｌ −タＰ ｓ ｔ ｌ
３ １３ａｍＨ１２ Ｘｂａｌ ／ ＊：制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制限酵素
の略称である。
３ １３ａｍＨ１２ Ｘｂａｌ ／ ＊：制限酵素の名称は、次の菌種から得られる制限酵素
の略称である。
ＥｃｏＲＩ：エシェリヒア・コリ ＲＹ ／ 、？（Ｂ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ／ｊ）Ｈｉｎ
ｄｌ：ヘモフィラス・インフルエンｆＲｄ（１−１ａｅ
ｍｏｐ１−１ａｅ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ
）ＰｓｔｌＨプロビデンシア・スチュアーティー／乙
グ （Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ
／乙グ）Ｂ ａｍｌ（ｌ ： ”’チルス・アミロリ
クエファシェンス ｌ−１（Ｂａｃｉ目ｕｓ ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓＨ） Ｘ、ｂａｌ：キサントモナス・バドリ（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓｂａｄｒｉｉ ） 制限酵素による切断部位は、過剰の制限酵素存在下でプ
ラスミドｐ Ａ Ｏ／を完全消化し、それ等の消化物を
／係アガロース電気泳動およびグ係ポリアクリルアミド
ゲル′屯気泳動にかけ分離可能な断片の数から決定され
る。分子けはアガロースゲルの場合には、大腸菌のラム
ダファージ（λ ｐｈａｇｅ ）のＤＮＡをＨｉｎｄｌ
ｌで消化して得られる分子量既知の断片（分子量の大き
い順に２３／３θ、９４ｔ／？、乙３−３−７、グ３７
／、２３２）、λθλ♂、ｊ乙グ、／２！ｉ 塩基対の
大きさを有する。）の同一アガロースゲル上での泳動距
離で描かれる標準線に基づき、またポリアクリルアミド
ゲルの場合には大腸菌のファイ・エックス／７グフアー
ジ（σＸ／７１１ ｐｈａｇｅ ）のＤＮＡをＨａｅ
ｌｌＣへモフイラス・ニジイブティウス（ｆ−１ａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）より得られる制
御４Ｍ酵素〕で消化して得られる分子ｌ既知の断片（分
子量の大きい順に／ −？ ｊ 、？、／θ７♂、／７
．．２、乙θ３．３／θ１．２Ｊ＞／１．２７／１．２
３￥、９グ、／／♂、７２ 塩基対の大きさを有する。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ／ｊ）Ｈｉｎ
ｄｌ：ヘモフィラス・インフルエンｆＲｄ（１−１ａｅ
ｍｏｐ１−１ａｅ １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ
）ＰｓｔｌＨプロビデンシア・スチュアーティー／乙
グ （Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ５ｔｕａｒｔｉｉ
／乙グ）Ｂ ａｍｌ（ｌ ： ”’チルス・アミロリ
クエファシェンス ｌ−１（Ｂａｃｉ目ｕｓ ａ
ｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓＨ） Ｘ、ｂａｌ：キサントモナス・バドリ（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓｂａｄｒｉｉ ） 制限酵素による切断部位は、過剰の制限酵素存在下でプ
ラスミドｐ Ａ Ｏ／を完全消化し、それ等の消化物を
／係アガロース電気泳動およびグ係ポリアクリルアミド
ゲル′屯気泳動にかけ分離可能な断片の数から決定され
る。分子けはアガロースゲルの場合には、大腸菌のラム
ダファージ（λ ｐｈａｇｅ ）のＤＮＡをＨｉｎｄｌ
ｌで消化して得られる分子量既知の断片（分子量の大き
い順に２３／３θ、９４ｔ／？、乙３−３−７、グ３７
／、２３２）、λθλ♂、ｊ乙グ、／２！ｉ 塩基対の
大きさを有する。）の同一アガロースゲル上での泳動距
離で描かれる標準線に基づき、またポリアクリルアミド
ゲルの場合には大腸菌のファイ・エックス／７グフアー
ジ（σＸ／７１１ ｐｈａｇｅ ）のＤＮＡをＨａｅ
ｌｌＣへモフイラス・ニジイブティウス（ｆ−１ａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）より得られる制
御４Ｍ酵素〕で消化して得られる分子ｌ既知の断片（分
子量の大きい順に／ −？ ｊ 、？、／θ７♂、／７
．．２、乙θ３．３／θ１．２Ｊ＞／１．２７／１．２
３￥、９グ、／／♂、７２ 塩基対の大きさを有する。
）の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描か
れる標準線に基づき、消化プラスミドｐＡＧ１／の断片
の分子量を膨出する。
れる標準線に基づき、消化プラスミドｐＡＧ１／の断片
の分子量を膨出する。
複数の断片を生じる場合には、それぞれの分子量を加算
して求める。
して求める。
プラスミドｐＡＧ／に対する前記制限酵素の相対的な切
断部位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ
断片なアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で解析することにより求めることができ
る。こうして得られたプラスミドｐ Ａ、 Ｏ／の制限
酵素地図を第７図に示す。
断部位は、複数の制限酵素で完全消化し、生じたＤＮＡ
断片なアガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で解析することにより求めることができ
る。こうして得られたプラスミドｐ Ａ、 Ｏ／の制限
酵素地図を第７図に示す。
プラスミドｐＡＯ／の自律複製とテトラサイクリン耐性
発現とを可能なら１−める機能は、一般のプラスミドと
同様にプラスミドｐ Ａ Ｏ／の一部に担われている。
発現とを可能なら１−める機能は、一般のプラスミドと
同様にプラスミドｐ Ａ Ｏ／の一部に担われている。
従って、プラスミドｐ Ａ （１／の一部の領域を欠失
したり、あるいは別のＤＮＡ断片を挿入付加したような
プラスミド誘導体も同様な機能を有する。それ故これら
の有用性はプラスミドｐＡＯ／だけでなく、それより修
飾して得られるｒ）ＮＡにも備わっている。
したり、あるいは別のＤＮＡ断片を挿入付加したような
プラスミド誘導体も同様な機能を有する。それ故これら
の有用性はプラスミドｐＡＯ／だけでなく、それより修
飾して得られるｒ）ＮＡにも備わっている。
３− 、ｔ 実施例
（１） コリネバクテリウム・メラセコラヨ丑士幻北
１−ｊヒ云＝Ｍ−＝＝Ｂｍｌト＝＝ｊ＝濾ズ天 （Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌす、
２．２．２ｔ、ｔ ３（ｆＬＬ、門Ｑ 市りにθう）菌
体からのプラスミドｐ Ａ Ｇ／の単離コリネバクテリ
ウム・メラセコラ −一母丸ね井４−ｆ１；４＝ｔ）十
−■＃（Ｃｏ ｒｙ ｎｅｂａｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ＋
＋ｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌすＪ 、２ 、！ ＜ｔ ３
（ｆ＜ｚｔ４ 鼾％％ｓ ｔθつ）を半合成培地（（Ｎ
［Ｉ＜’）ｔ８０ａ ／θｔ、尿素３ｔ、Ｋ２ＨＰＯ
４／ ？、ＮａＣ１、ｔθＷＩ９ 、 ＭｇＳＯ４−７
Ｈ２０グθθ〃り、 Ｍｎ３Ｏ４４’−６ＦＩ２０．２
．■、 Ｆｅ８０Ｆｅ３０４４ｔ−２ｍｇ、グルコース
２０２、ビオテンタθμ７、サイアミン塩酸塩 ２０
θμｆ、酵母エキス ／２ を純水に溶かして／ｌとし
て−／ グ − ｐ１４７．．２に調整した培地〕で１、？２℃、７晩振
盪培養を行い、その種培養♂ｍｅを２０θｔｎｅの前記
半合成培地に植菌して１、？β′Ｃでオ時間倣（搦培養
した。
１−ｊヒ云＝Ｍ−＝＝Ｂｍｌト＝＝ｊ＝濾ズ天 （Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌす、
２．２．２ｔ、ｔ ３（ｆＬＬ、門Ｑ 市りにθう）菌
体からのプラスミドｐ Ａ Ｇ／の単離コリネバクテリ
ウム・メラセコラ −一母丸ね井４−ｆ１；４＝ｔ）十
−■＃（Ｃｏ ｒｙ ｎｅｂａｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ＋
＋ｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌすＪ 、２ 、！ ＜ｔ ３
（ｆ＜ｚｔ４ 鼾％％ｓ ｔθつ）を半合成培地（（Ｎ
［Ｉ＜’）ｔ８０ａ ／θｔ、尿素３ｔ、Ｋ２ＨＰＯ
４／ ？、ＮａＣ１、ｔθＷＩ９ 、 ＭｇＳＯ４−７
Ｈ２０グθθ〃り、 Ｍｎ３Ｏ４４’−６ＦＩ２０．２
．■、 Ｆｅ８０Ｆｅ３０４４ｔ−２ｍｇ、グルコース
２０２、ビオテンタθμ７、サイアミン塩酸塩 ２０
θμｆ、酵母エキス ／２ を純水に溶かして／ｌとし
て−／ グ − ｐ１４７．．２に調整した培地〕で１、？２℃、７晩振
盪培養を行い、その種培養♂ｍｅを２０θｔｎｅの前記
半合成培地に植菌して１、？β′Ｃでオ時間倣（搦培養
した。
培養１（ｋから菌体を重両し、リゾチウム液〔グ／Ｌ／
コース、ｔθｍＭ 、 ｌ＞ ｆ） Ｔ Ａ ／
θｍＭ、）リス（ヒドロキンメチル）アミツメクン ２
ｊｍＭ、 リゾチラノ・ ／θｍｆｌ／ｍｐ、ｐｌｌ
ｚ、ｏ ） ／θｍｌに懸濁しグツ℃で７時間反応させ
た。本反応液にアルカリ５１）Ｓ液（Ｎａ（月」 θ、
、！Ｎ％５ｌ）Ｓｌ係）、２０ｍｌをγ水加攪拌の後、
水中に一ダ分装置いた。次に、本反応液に氷冷した酢酸
カリウム浴液（タＭ耐酸カリウム浴液にθｍｅ、酢＃
／ ／、−ｆｍｅ、純水、、！ｇ、 、ｔ ＋ｐｅの混
合液） ／ Ｊ” ｒｎｌを１永加攪拌の後氷中に／θ
分出１置いた。溶菌物全搦を遠心管に移し、グ℃、５分
間、／、２０θθｒｐｍ（／３θθθ２）の遠心にかけ
」二澄液を回収した。これを等量のフェノール・クロロ
ホルム液（／：／）で抽出して水用を回収した。これに
−倍量のエタノールを添加攪拌して一夕分間室温に置き
、ノθ℃、／θ分間／θθθθｒｐｍ（／／θθθ２）
の遠心によりペレットを回収した。このペレットを７θ
係エダノール水浴液で／４＋−／’ｒ）の後減圧乾燥し
て、ふたたび′ｒＥ緩伸工液〔トリス（ヒドロキンメチ
ル）アミノメタン／ θ ｍＭ、 １】 ｒ）
’Ｉ’ Ａ ／ ｍＭ、 ｐｉ−］
７．．ｔ ） ２ θ ｍｌで浴解［７た。こ
の液に／θｔｒｙ／；、＋ｌエチジウムブロマイド浴液
／ 、 、、７ ＋＋＋ｅと塩化セシウムノ３．乙Ｖを
加えて静かに浴解し、グθθθθｒｐｍ（７θθθθθ
２）、／−９℃でグイ時間遠心した。プラスミドｐ Ａ
、 （１／は、紫外線照射により遠心チューブ中でＦ方
のバンドとしてμいだされ、このバンドを遠心チューブ
の側面から注射器で抜きとることによりプラスミドｐＡ
Ｇ／を単離した。ついでこの分画液を等容量のイソプロ
ピルアルコールでグ回抽出してエチジウムブロマイドを
除去し、その後に１゛１ル緩伸■液に対して透析１．て
ＤＮＡ濃ＩＪｊ 、５−θ／（ｆ ／＋ｒ（ｅのプラス
ミドｐＡＯ／の透析液／ １ｎｌを得た。
コース、ｔθｍＭ 、 ｌ＞ ｆ） Ｔ Ａ ／
θｍＭ、）リス（ヒドロキンメチル）アミツメクン ２
ｊｍＭ、 リゾチラノ・ ／θｍｆｌ／ｍｐ、ｐｌｌ
ｚ、ｏ ） ／θｍｌに懸濁しグツ℃で７時間反応させ
た。本反応液にアルカリ５１）Ｓ液（Ｎａ（月」 θ、
、！Ｎ％５ｌ）Ｓｌ係）、２０ｍｌをγ水加攪拌の後、
水中に一ダ分装置いた。次に、本反応液に氷冷した酢酸
カリウム浴液（タＭ耐酸カリウム浴液にθｍｅ、酢＃
／ ／、−ｆｍｅ、純水、、！ｇ、 、ｔ ＋ｐｅの混
合液） ／ Ｊ” ｒｎｌを１永加攪拌の後氷中に／θ
分出１置いた。溶菌物全搦を遠心管に移し、グ℃、５分
間、／、２０θθｒｐｍ（／３θθθ２）の遠心にかけ
」二澄液を回収した。これを等量のフェノール・クロロ
ホルム液（／：／）で抽出して水用を回収した。これに
−倍量のエタノールを添加攪拌して一夕分間室温に置き
、ノθ℃、／θ分間／θθθθｒｐｍ（／／θθθ２）
の遠心によりペレットを回収した。このペレットを７θ
係エダノール水浴液で／４＋−／’ｒ）の後減圧乾燥し
て、ふたたび′ｒＥ緩伸工液〔トリス（ヒドロキンメチ
ル）アミノメタン／ θ ｍＭ、 １】 ｒ）
’Ｉ’ Ａ ／ ｍＭ、 ｐｉ−］
７．．ｔ ） ２ θ ｍｌで浴解［７た。こ
の液に／θｔｒｙ／；、＋ｌエチジウムブロマイド浴液
／ 、 、、７ ＋＋＋ｅと塩化セシウムノ３．乙Ｖを
加えて静かに浴解し、グθθθθｒｐｍ（７θθθθθ
２）、／−９℃でグイ時間遠心した。プラスミドｐ Ａ
、 （１／は、紫外線照射により遠心チューブ中でＦ方
のバンドとしてμいだされ、このバンドを遠心チューブ
の側面から注射器で抜きとることによりプラスミドｐＡ
Ｇ／を単離した。ついでこの分画液を等容量のイソプロ
ピルアルコールでグ回抽出してエチジウムブロマイドを
除去し、その後に１゛１ル緩伸■液に対して透析１．て
ＤＮＡ濃ＩＪｊ 、５−θ／（ｆ ／＋ｒ（ｅのプラス
ミドｐＡＯ／の透析液／ １ｎｌを得た。
（２） プラスミドｐ Ａ、 （，１／の制限酵素地
図と分子晴前記（１）でＡｌＡ１製したプラスミドｐＡ
Ｇ／の透析液／θμｔ（プラスミドｐＡＧ／ ＤＮＡ
θ、ｊμｆｔ）に過剰の制限酵素（ＷｃｏＲｌ 、Ｈ
ｉｎｄｌ、Ｐｓｔｌ、ＢａｍＨｌはニラポンシーン社製
、Ｘｂａｌはベゼスダリサーチ・ラボラトリ−社製）を
各々の制限酵素適正条件にて反応させた。
図と分子晴前記（１）でＡｌＡ１製したプラスミドｐＡ
Ｇ／の透析液／θμｔ（プラスミドｐＡＧ／ ＤＮＡ
θ、ｊμｆｔ）に過剰の制限酵素（ＷｃｏＲｌ 、Ｈ
ｉｎｄｌ、Ｐｓｔｌ、ＢａｍＨｌはニラポンシーン社製
、Ｘｂａｌはベゼスダリサーチ・ラボラトリ−社製）を
各々の制限酵素適正条件にて反応させた。
消化した試料は常法に従い／係アガロースゲル電気泳動
またはグ係ポリアクリルアミドゲル屯気泳動に供し、巾
／ζｍ当り夕Ｖの一定電圧でｙ時開泳動をおこなった。
またはグ係ポリアクリルアミドゲル屯気泳動に供し、巾
／ζｍ当り夕Ｖの一定電圧でｙ時開泳動をおこなった。
泳動の終ったゲルを７μｆ／ｍｅエチジウムブロマイド
浴液に浸漬して、？θ分間染色した後紫外線をゲルに照
射して生成断片数を判定１〜、各断片の泳動距離から各
々の分子量を算出し、それらを加′捧してプラスミドｐ
Ａ Ｏ／の分子量を求めた。尚、分子量は同一アガロ
ースゲル上で同時に泳動したラムダファージＤＮＡのＨ
ｉｎｄｌ消化断片の既知分子量、または同一ポリアクリ
ルアミドゲル上で同時に泳動したファイ・エックス／７
グフアージＤＮＡのＨａ ｅ ｌ消化断片の既知分子量
に基いて算出した。
浴液に浸漬して、？θ分間染色した後紫外線をゲルに照
射して生成断片数を判定１〜、各断片の泳動距離から各
々の分子量を算出し、それらを加′捧してプラスミドｐ
Ａ Ｏ／の分子量を求めた。尚、分子量は同一アガロ
ースゲル上で同時に泳動したラムダファージＤＮＡのＨ
ｉｎｄｌ消化断片の既知分子量、または同一ポリアクリ
ルアミドゲル上で同時に泳動したファイ・エックス／７
グフアージＤＮＡのＨａ ｅ ｌ消化断片の既知分子量
に基いて算出した。
結果を第７表に示す。消化断片の大きさと複数の制限酵
素に、しる消化断片の解析がら決定されたプラスミドｎ
Ａ （］ ／の制限酵素地図を第７図に示す。
素に、しる消化断片の解析がら決定されたプラスミドｎ
Ａ （］ ／の制限酵素地図を第７図に示す。
−／！−
３−乙 発明の効果
本プラスミドＤＮＡによる形質転換の成立は、テトラサ
イクリン耐性形質転換株の出現で判定することができ極
めて便利である。尚、プラスミド１） Ｎ Ａによる形
質転換は、通常枯曜菌等で用いられているプロトプラス
トによる形質転換法を用いて実施することができる。
イクリン耐性形質転換株の出現で判定することができ極
めて便利である。尚、プラスミド１） Ｎ Ａによる形
質転換は、通常枯曜菌等で用いられているプロトプラス
トによる形質転換法を用いて実施することができる。
また、グルタミン酸生産性コリネ型細菌においてストレ
プトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性遺
伝子以外にもテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を発
μできたことにより、グルタミン酸生賄νｌ、コリイ・
型細菌の有用なベクタープラスミドの開発が６丁能と７
Ｃつだ。これは、木閑神の遺伝子操作を発展させる。Ｌ
で画期的なことである。
プトマイシンおよびスペクチノマイシンに対する耐性遺
伝子以外にもテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を発
μできたことにより、グルタミン酸生賄νｌ、コリイ・
型細菌の有用なベクタープラスミドの開発が６丁能と７
Ｃつだ。これは、木閑神の遺伝子操作を発展させる。Ｌ
で画期的なことである。
プラスミドｐ Ａ、 Ｏ／にテトラサイクリン耐性遺伝
子が洋仕することは、プラスミドｐＡＧ］／を保持１゜
たコリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２．２．２ ’７３（微工研条寄オにθ号
）からプラスミドｐ Ａ （１／のキユアリングによっ
て得られた菌株が、テトラサイクリン感受性であること
と、その菌株にプラスミドｐ Ａ、 （］ ／を移入す
るとテトラサイクリン耐性となることとによりｔ１Ｆ明
でべろ。これらのことについては、それぞれ以丁′の実
験／、実験λで詳しく述べる。
子が洋仕することは、プラスミドｐＡＧ］／を保持１゜
たコリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ ） ２．２．２ ’７３（微工研条寄オにθ号
）からプラスミドｐ Ａ （１／のキユアリングによっ
て得られた菌株が、テトラサイクリン感受性であること
と、その菌株にプラスミドｐ Ａ、 （］ ／を移入す
るとテトラサイクリン耐性となることとによりｔ１Ｆ明
でべろ。これらのことについては、それぞれ以丁′の実
験／、実験λで詳しく述べる。
実験／：コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃａｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２２２ ’７３（微工研条寄タ乙θ号）からのプラスミ
ドｐ Ａ Ｇ ／のキユアリング。
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２２２ ’７３（微工研条寄タ乙θ号）からのプラスミ
ドｐ Ａ Ｇ ／のキユアリング。
コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） 、、２２．
２￥ ３ （微工研条奇−タ乙θ号）をＬ Ｇ培地（ト
リプトン／θり、酵母エキスｊり、ＮａＣｌ ３ ？
、グルコース２ｖを純水に浴かしてｌｌとして、ｐＨ７
０，２，に調整した培地）ｊｒｎｌに／白全耳植菌し１
、：１７℃で一晩振盪培養１．た。
ｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ） 、、２２．
２￥ ３ （微工研条奇−タ乙θ号）をＬ Ｇ培地（ト
リプトン／θり、酵母エキスｊり、ＮａＣｌ ３ ？
、グルコース２ｖを純水に浴かしてｌｌとして、ｐＨ７
０，２，に調整した培地）ｊｒｎｌに／白全耳植菌し１
、：１７℃で一晩振盪培養１．た。
培養液を；す１（菌水で希釈してＩ・（］寒寒天培地Ｉ
、０培地に／、す係基人を添加した培地）に塗布、３．
２℃で２１−１培養した。生じたコロニー７００個を取
り、テトラサイクリン／θμ？／ｍｅを含むＬ Ｇ寒天
培地に釣菌した。、９２℃で一日培養してテトラサイク
リン感受性株を選択した。得られた２株のテトラサイク
リン感受性株ｌ二ついてｎ１１記と同様な方法でプラス
ミドを単離してプラスミドｐＡＧ／の存在を調べた。そ
の結果、得られた２株のテトラサイクリン感受性林はど
ちらもプラスミドを保有していなかった。
、０培地に／、す係基人を添加した培地）に塗布、３．
２℃で２１−１培養した。生じたコロニー７００個を取
り、テトラサイクリン／θμ？／ｍｅを含むＬ Ｇ寒天
培地に釣菌した。、９２℃で一日培養してテトラサイク
リン感受性株を選択した。得られた２株のテトラサイク
リン感受性株ｌ二ついてｎ１１記と同様な方法でプラス
ミドを単離してプラスミドｐＡＧ／の存在を調べた。そ
の結果、得られた２株のテトラサイクリン感受性林はど
ちらもプラスミドを保有していなかった。
実験２：コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｉｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２．２．２４１３（微工研粂寄５乙θ号）プラスミドキ
ュアート株のプラスミドｐ Ａ、 Ｇ ／によるテトラ
サイクリン耐性への形質転換 コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ ） ２ ２ ．２ ４１３（微工研条
寄−タ６θ号）プラスミドキュアート株をｎＴＩ記半合
成培地で３．２℃、７２時ｍ１撤盪培養し、その培養液
θ、夕ｍｅを同様の半合成培地５θｍｅに植菌１．て３
２℃で振盪培養した。日立分光光１梵計でに≦θｎｍに
おける吸光＋ｉ （０１） ）を測定し、ＯＤがθ８．
２になった時点で培養液にペニシリン０を一、２／− θ、３単位／ｒｎｌの濃度になるように添加した。これ
を史に、９２℃で／、５時間培養を続けた。
ｅｂａｃｉｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ）
２．２．２４１３（微工研粂寄５乙θ号）プラスミドキ
ュアート株のプラスミドｐ Ａ、 Ｇ ／によるテトラ
サイクリン耐性への形質転換 コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅ
ｃｏｌａ ） ２ ２ ．２ ４１３（微工研条
寄−タ６θ号）プラスミドキュアート株をｎＴＩ記半合
成培地で３．２℃、７２時ｍ１撤盪培養し、その培養液
θ、夕ｍｅを同様の半合成培地５θｍｅに植菌１．て３
２℃で振盪培養した。日立分光光１梵計でに≦θｎｍに
おける吸光＋ｉ （０１） ）を測定し、ＯＤがθ８．
２になった時点で培養液にペニシリン０を一、２／− θ、３単位／ｒｎｌの濃度になるように添加した。これ
を史に、９２℃で／、５時間培養を続けた。
培養液から菌体を集菌し、Ｒ培地〔グルコースｊ？、カ
ザミノ酸／θ２、酵母エキス／θ？、Ｋ２ＨＰＯ４０，
３ｔ ｒ 、 ＫＭ２Ｐ（１，θ、／３；ｆ１ｉ／ニー
クロース／３７？、Ｎ−）リス（ハイドロキシメチル）
） ”ｌｌ−ルーーーアミノエタンスルホン酸（ＴＥ
Ｓ：Ｎ−Ｔｒｉｓ （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ）
ｍｅｔｈｙｌ −２−ａｍｉｎｏｅｔｈａ−ｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ） −ｔ、７３ ｆ 、 Ｍ
ｇＣｌ２ θ、９ ｊ ｆ 。
ザミノ酸／θ２、酵母エキス／θ？、Ｋ２ＨＰＯ４０，
３ｔ ｒ 、 ＫＭ２Ｐ（１，θ、／３；ｆ１ｉ／ニー
クロース／３７？、Ｎ−）リス（ハイドロキシメチル）
） ”ｌｌ−ルーーーアミノエタンスルホン酸（ＴＥ
Ｓ：Ｎ−Ｔｒｉｓ （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ）
ｍｅｔｈｙｌ −２−ａｍｉｎｏｅｔｈａ−ｎｅｓｕ
ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ） −ｔ、７３ ｆ 、 Ｍ
ｇＣｌ２ θ、９ ｊ ｆ 。
ＣａＣｌ２ ／、／ ／ ｆを純水に浴かしてｌｌとし
て、ＮａＯＨでｒ＋Ｈ７，、！に調整した培地） ５
ｒｎｌに懸濁した。
て、ＮａＯＨでｒ＋Ｈ７，、！に調整した培地） ５
ｒｎｌに懸濁した。
この一部を収りＲ培地で希釈し、Ｌ ｏ 寒天培地に塗
布して３．２℃で２日培養し、リゾチウム処理供試正常
菌数（７，に×／♂ｍｅ−’ ）を求めた。
布して３．２℃で２日培養し、リゾチウム処理供試正常
菌数（７，に×／♂ｍｅ−’ ）を求めた。
菌懸濁液グ、タゴに３ Ｔ’９Ａｌ濃度のりゾテウムを
含有するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除菌する。）Ｏ
ｏｊ−を添加して３．ｆ℃で夕晴間静置反応させた。
含有するＲ培地（ミリポアフィルタ−で除菌する。）Ｏ
ｏｊ−を添加して３．ｆ℃で夕晴間静置反応させた。
プロトプラスト化した細胞を２０θθｒｐｍ（ｇｔθθ
Ｖ）１．ｔ℃、７分間遠心分離して回収し、Ｒ培地ｊ
ｔｎｌ！、に懸濁１．た。同様の操作を更にもう一度お
こなった後Ｒ培地、３− ｍｅに再懸濁して、プロトプ
ラスト菌液とした。この一部を無菌水で希釈してＬ （
１寒犬培地に塗布し、また別の一部なＲ培地で希釈［２
て１１生培地〔重層寒天培地を用いる。
Ｖ）１．ｔ℃、７分間遠心分離して回収し、Ｒ培地ｊ
ｔｎｌ！、に懸濁１．た。同様の操作を更にもう一度お
こなった後Ｒ培地、３− ｍｅに再懸濁して、プロトプ
ラスト菌液とした。この一部を無菌水で希釈してＬ （
１寒犬培地に塗布し、また別の一部なＲ培地で希釈［２
て１１生培地〔重層寒天培地を用いる。
下層寒天培地にはＲ培地にポリビニルピロリドン（Ｐ
Ｖ Ｐ ： Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏ
ｎｅ ） ’ｌθ１／１゜寒天／ １ ？／１を添加す
る。上層寒天培地にはＰＶＰりθｙ／ｌ、寒天ｔ＜ｙ／
ｌを添加する。菌懸濁液を浴けた一Ｌ層墓大培地３ ｍ
ｌと混合してｆ層寒天培地上に重層する。〕に稙菌して
３．２℃で培養１７、各々低張条件（Ｉ・０寒天培地）
、高張条件（再生培地）でのコロニー形成可能菌数を求
めた。低張条件での生成コロニー数は培養λ８目に測定
し、高張条件での生成コロニー数はグ日目に測定した。
Ｖ Ｐ ： Ｐｏ１ｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏ
ｎｅ ） ’ｌθ１／１゜寒天／ １ ？／１を添加す
る。上層寒天培地にはＰＶＰりθｙ／ｌ、寒天ｔ＜ｙ／
ｌを添加する。菌懸濁液を浴けた一Ｌ層墓大培地３ ｍ
ｌと混合してｆ層寒天培地上に重層する。〕に稙菌して
３．２℃で培養１７、各々低張条件（Ｉ・０寒天培地）
、高張条件（再生培地）でのコロニー形成可能菌数を求
めた。低張条件での生成コロニー数は培養λ８目に測定
し、高張条件での生成コロニー数はグ日目に測定した。
（いずれも町に培養しても数の増加は認められなかった
。）その結果、リゾチクム処理供試正常菌数当りの低張
条件でのコロニー形成菌数は／、３ Ｘ ／θ−５、再
生菌数はノ、グ×／θ１であった。
。）その結果、リゾチクム処理供試正常菌数当りの低張
条件でのコロニー形成菌数は／、３ Ｘ ／θ−５、再
生菌数はノ、グ×／θ１であった。
形質転換には上記プロトプラスト菌液を用いた。゛プラ
スミドル Ａ （１／液ｊθμＬ （／、、２ ｓ １
１ｔ Ｄ Ｎ Ａ含有）とｉ倍濃度Ｔ Ｓ Ｍ （”液
（’］’ Ｓ Ｍ Ｃ液はＴＦｉＳ、、ｌｊｍＭ、ｊ７
ユークロースθ、１１Ｍ、 ＭｇＣ＋２／θｍＭ。
スミドル Ａ （１／液ｊθμＬ （／、、２ ｓ １
１ｔ Ｄ Ｎ Ａ含有）とｉ倍濃度Ｔ Ｓ Ｍ （”液
（’］’ Ｓ Ｍ Ｃ液はＴＦｉＳ、、ｌｊｍＭ、ｊ７
ユークロースθ、１１Ｍ、 ＭｇＣ＋２／θｍＭ。
ＣａＣｌ２ ３θｍＭを含み、ＮａＯＨでｐＨ７，、！
に調整する。）りθμｔとの混合液を上記プロトプラス
ト菌液θ、ｔｍｌに添加混合した。その後更にＰＥＧ液
ＣＴ Ｓ Ｍ Ｃ液にポリエチレングリコール乙θθθ
（Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ 乙θθ
θ）をグθ係濃度に溶解する。〕／、夕ｍｌを添加して
ゆるやかに混和し、２分間静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ
液（Ｒ培地にｐｖ’ｐｇθｙ／ｌを添加する。）夕ｒｎ
１．を添加して、グθθθｒｐｍ （／♂θθ２）で７
θ分間遠心分離にかけて上澄液を除去した。同様の遠心
洗浄操作を更にもう一度おこなった後、沈降したプロト
プラストをθ０．５′−のＲ−ＰＶＰ液にゆるやかに懸
濁した。、９時間、３θ℃に保った後Ｒ−Ｐ ＶＰ液で
希釈し、一定量をテトラサイクリン１０μｔ ７ｍｅ
４度を含む前記再生培地に植菌した。同時にコロニー形
成可能菌数を知るために前記再生培地にもその高希釈液
を植菌した。３．２℃でグ日間培養して出現コロニー数
を測定した。尚、対照としてプラスミドｐ Ａ （３／
無添加系も併行試験１．た。
に調整する。）りθμｔとの混合液を上記プロトプラス
ト菌液θ、ｔｍｌに添加混合した。その後更にＰＥＧ液
ＣＴ Ｓ Ｍ Ｃ液にポリエチレングリコール乙θθθ
（Ｐｏ１ｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ 乙θθ
θ）をグθ係濃度に溶解する。〕／、夕ｍｌを添加して
ゆるやかに混和し、２分間静置した。その後Ｒ−ＰＶＰ
液（Ｒ培地にｐｖ’ｐｇθｙ／ｌを添加する。）夕ｒｎ
１．を添加して、グθθθｒｐｍ （／♂θθ２）で７
θ分間遠心分離にかけて上澄液を除去した。同様の遠心
洗浄操作を更にもう一度おこなった後、沈降したプロト
プラストをθ０．５′−のＲ−ＰＶＰ液にゆるやかに懸
濁した。、９時間、３θ℃に保った後Ｒ−Ｐ ＶＰ液で
希釈し、一定量をテトラサイクリン１０μｔ ７ｍｅ
４度を含む前記再生培地に植菌した。同時にコロニー形
成可能菌数を知るために前記再生培地にもその高希釈液
を植菌した。３．２℃でグ日間培養して出現コロニー数
を測定した。尚、対照としてプラスミドｐ Ａ （３／
無添加系も併行試験１．た。
その結果リゾチウム処理供試正常閑数当りの形質転換操
作実施後のコロニー形成可能菌数は／、ざ×／θ−２、
テトラサイクリン耐性菌数は３．２×／θ−４であった
。また添加プラスミドＬ） Ｎ Ａ ／μｍ当り７０５
個のテトラサイクリン耐性コロニーが出現した。一方、
プラスミドｐＡＧ／無添加では、テトラサイクリン耐性
コロニーの出現は認められなかった。更に得られたテト
ラサイクリン耐性株の中から７２株について実施例１の
方法でプラスミドの単離と解析を行った結果、７２株全
てがプラスミドｐＡＧ／を保有していた。
作実施後のコロニー形成可能菌数は／、ざ×／θ−２、
テトラサイクリン耐性菌数は３．２×／θ−４であった
。また添加プラスミドＬ） Ｎ Ａ ／μｍ当り７０５
個のテトラサイクリン耐性コロニーが出現した。一方、
プラスミドｐＡＧ／無添加では、テトラサイクリン耐性
コロニーの出現は認められなかった。更に得られたテト
ラサイクリン耐性株の中から７２株について実施例１の
方法でプラスミドの単離と解析を行った結果、７２株全
てがプラスミドｐＡＧ／を保有していた。
第１図は、本発明のプラスミドｐＡＧ３／の制限酵素地
図である。プラスミドの分子量は、キロベース（Ｋｂ）
で表示しである。図中記号は、発明の詳細な説明中に記
した制限酵素であり、プラスミド−ヒのその位置は、そ
の制限酵素切断部位を示す。その横に付記した数字は、
制限酵素Ｘｂａｌ切断部位を基準にしたプラスミド上で
の位置をキロベースで表示したものである。 −，２ｇ−
図である。プラスミドの分子量は、キロベース（Ｋｂ）
で表示しである。図中記号は、発明の詳細な説明中に記
した制限酵素であり、プラスミド−ヒのその位置は、そ
の制限酵素切断部位を示す。その横に付記した数字は、
制限酵素Ｘｂａｌ切断部位を基準にしたプラスミド上で
の位置をキロベースで表示したものである。 −，２ｇ−
Claims (7)
- （１）約２０キロベースの分子量を有し、かつ制限酵素
に対する感受性部位数が、ＥｃｏＲ I ８、Ｈｉｎｄ
III ５、Ｐｓｔ I ５、ＢａｍＨ I ２、Ｘｂａ I
１である事により特徴づけられるプラスミドｐＡＧ
１およびその誘導体。 - （２）プラスミドｐＡＧ１を含有する微生物を培地に培
養し、培養菌体を溶菌し、該溶菌物からプラスミドｐＡ
Ｇ１を単離することを特徴とするプラスミドｐＡＧ１の
製造法。 - （３）該微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌ
ａ）に属する微生物であることを、特徴とする特許請求
の範囲第（２）項記載のプラスミドｐＡＧ１の製造法。 - （４）該コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ）に属する微生物が、コリネバクテリウム・メラ
セコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ）２２２４３（微工研条寄５６０号）であること
を特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載のプラスミ
ドｐＡＧ１の製造法。 - （５）プラスミドｐＡＧ１またはその誘導体を含有する
微生物。 - （６）該微生物が、コリネバクテリウム・メラセコラ（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏ
ｌａ）に属する微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第（５）項記載の微生物。 - （７）該コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ）に属する微生物が、コリネバクテリウム・メラ
セコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃ
ｏｌａ）２２２４３（徴工研条寄第５６０号）であるこ
とを、特徴とする特許請求の範囲第（６）項記載の微生
物。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172395A JPS6152290A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ／ |
| GB8520632A GB2165546B (en) | 1984-08-21 | 1985-08-16 | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| FR858512538A FR2569421B1 (fr) | 1984-08-21 | 1985-08-20 | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| KR1019850006032A KR890003083B1 (ko) | 1984-08-21 | 1985-08-21 | 테트라시클린 내성 유전자를 함유한 플라스미드, 이로 부터 유도된 dna단편, 및 이 dna단편을 함유한 미생물 및 이들의 제조방법 |
| US07/492,227 US5158891A (en) | 1984-08-21 | 1990-03-13 | Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59172395A JPS6152290A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ／ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152290A true JPS6152290A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0220236B2 JPH0220236B2 (ja) | 1990-05-08 |
Family
ID=15941138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59172395A Granted JPS6152290A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | プラスミドｐＡＧ／ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152290A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
-
1984
- 1984-08-21 JP JP59172395A patent/JPS6152290A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61104791A (ja) * | 1984-10-30 | 1986-05-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
| JPH0224518B2 (ja) * | 1984-10-30 | 1990-05-29 | Asahi Chemical Ind |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0220236B2 (ja) | 1990-05-08 |
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