JPH0224518B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌由
来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むDNA断片、該DNA断片と同菌種の微生物細胞
内で増殖可能なプラスミドの自律複製のために必
要な遺伝子を含むDNA断片とを有する新規ベク
タープラスミド及び該ベクタープラスミドを含有
する微生物に関する。
来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むDNA断片、該DNA断片と同菌種の微生物細胞
内で増殖可能なプラスミドの自律複製のために必
要な遺伝子を含むDNA断片とを有する新規ベク
タープラスミド及び該ベクタープラスミドを含有
する微生物に関する。
尚、グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、大量
にＬ−グルタミン酸を生産することが知られてお
り、またその変異株により、Ｌ−リジン等のアミ
ノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドが生産
されている。
にＬ−グルタミン酸を生産することが知られてお
り、またその変異株により、Ｌ−リジン等のアミ
ノ酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドが生産
されている。
（従来の技術）
工業的に極めて有用なグルタミン酸生産性コリ
ネ型細菌について、遺伝子工学の手法を用いた育
種改良が試みられている。それにより同菌種を宿
主とするに適したベクタープラスミドが、種々開
発されてきた。この開発の中で最も重要なこと
は、ベクタープラスミド保持菌を効率よく識別す
ることであり、このことは実用上必要不可欠であ
る。そのため様々な選沢マーカーを有したベクタ
ープラスミドが試作されている。
ネ型細菌について、遺伝子工学の手法を用いた育
種改良が試みられている。それにより同菌種を宿
主とするに適したベクタープラスミドが、種々開
発されてきた。この開発の中で最も重要なこと
は、ベクタープラスミド保持菌を効率よく識別す
ることであり、このことは実用上必要不可欠であ
る。そのため様々な選沢マーカーを有したベクタ
ープラスミドが試作されている。
これらのベクタープラスミドの中で異種菌由来
の選沢マーカーを利用したものとしては、以下の
ものがある。
の選沢マーカーを利用したものとしては、以下の
ものがある。
プラスミドpCE54：大腸菌プラスミド
pGA22由来のテトラサイクリン耐性、クロラ
ムフエニコール耐性、カナマイシン耐性を選択
マーカーとしている。（特開昭58−105999号、
特開昭58−126789号） プラスミドpCB101：スタフイロコツカス由
来のプラスミドpUB110のカナマイシン耐性を
選択マーカーとしている（特開昭58−105999
号） プラスミドpEthr1：大腸菌のスレオニンオ
ペロンの発現による栄養要求性の回復を選択マ
ーカーとしている。（特開昭58−105999号） プラスミドpAJ43：大腸菌プラスミド
pBR325由来のクロラムフエニコール耐性を選
択マーカーとしている（特開昭59−120090号） プラスミドpAJ655：大腸菌プラスミド
pBR325由来のクロラムフエニコール耐性を選
択マーカーとしている（特開昭58−216199号、
特開昭59−120090号） プラスミドpAJ440、プラスミドpAJ3148：
スタフイロコツカス由来のプラスミドpUB110
のカナマイシン耐性を選択マーカーとしている
（特開昭58−216199号） 以上のプラスミドは、主に大腸菌や枯草菌で用
いられているベクタープラスミドの薬剤耐性遺伝
子を利用したものである。
pGA22由来のテトラサイクリン耐性、クロラ
ムフエニコール耐性、カナマイシン耐性を選択
マーカーとしている。（特開昭58−105999号、
特開昭58−126789号） プラスミドpCB101：スタフイロコツカス由
来のプラスミドpUB110のカナマイシン耐性を
選択マーカーとしている（特開昭58−105999
号） プラスミドpEthr1：大腸菌のスレオニンオ
ペロンの発現による栄養要求性の回復を選択マ
ーカーとしている。（特開昭58−105999号） プラスミドpAJ43：大腸菌プラスミド
pBR325由来のクロラムフエニコール耐性を選
択マーカーとしている（特開昭59−120090号） プラスミドpAJ655：大腸菌プラスミド
pBR325由来のクロラムフエニコール耐性を選
択マーカーとしている（特開昭58−216199号、
特開昭59−120090号） プラスミドpAJ440、プラスミドpAJ3148：
スタフイロコツカス由来のプラスミドpUB110
のカナマイシン耐性を選択マーカーとしている
（特開昭58−216199号） 以上のプラスミドは、主に大腸菌や枯草菌で用
いられているベクタープラスミドの薬剤耐性遺伝
子を利用したものである。
またグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来の選
択マーカーを利用した同菌種のベクタープラスミ
ドとしては、以下のものがある。
択マーカーを利用した同菌種のベクタープラスミ
ドとしては、以下のものがある。
プラスミドpCG11：コリネバクテリウムのプ
ラスミドpCG4由来のストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとし
ている（特開昭57−183799号、特開昭58−
105999号） プラスミドpCB101、プラスミドpEthr1：プ
ラスミドpCG4由来のストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとし
ている（特開昭58−105999号） グルタミン酸生産性コリネ型細菌の薬剤耐性遺
伝子としては、ストレプトマイシンおよびスペク
チノマイシン耐性遺伝子しか発明されていない。
故に前述したプラスミドは、全て同薬剤耐性遺伝
子を利用しているものであり、他にグルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来の薬剤耐性遺伝子を利用
したベクタープラスミドは、未だ開発されていな
い。
ラスミドpCG4由来のストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとし
ている（特開昭57−183799号、特開昭58−
105999号） プラスミドpCB101、プラスミドpEthr1：プ
ラスミドpCG4由来のストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシン耐性を選択マーカーとし
ている（特開昭58−105999号） グルタミン酸生産性コリネ型細菌の薬剤耐性遺
伝子としては、ストレプトマイシンおよびスペク
チノマイシン耐性遺伝子しか発明されていない。
故に前述したプラスミドは、全て同薬剤耐性遺伝
子を利用しているものであり、他にグルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来の薬剤耐性遺伝子を利用
したベクタープラスミドは、未だ開発されていな
い。
（発明が解決しようとする問題点）
グルタミン酸生産性コリネ型細菌では、実用的
なベクタープラスミドの開発が遅れている。これ
が、同菌種の遺伝子工学の手法による育種改良を
遅らせている原因の一つになつている。従つて他
の菌種と同様に同菌種においても、薬剤耐性を選
択マーカーとしたより実用性の高いベクタープラ
スミドを開発する必要がある。
なベクタープラスミドの開発が遅れている。これ
が、同菌種の遺伝子工学の手法による育種改良を
遅らせている原因の一つになつている。従つて他
の菌種と同様に同菌種においても、薬剤耐性を選
択マーカーとしたより実用性の高いベクタープラ
スミドを開発する必要がある。
ところでテトラサイクリン耐性を選択マーカー
とした同菌種のベクタープラスミドとしては、プ
ラスミドpCE54が開発されているだけである。こ
れは、大腸菌のプラスミドpGA22由来のテトラ
サイクリン耐性を選択マーカーとしている。しか
しこのプラスミドによつて宿主のグルタミン酸生
産性コリネ型細菌に付与されるテトラサイクリン
耐性度は小さく、宿主のテトラサイクリンによる
最小生育阻止濃度を0.1μｇ／mlから3.2μｇ／mlに
増大させただけであつた。これは大腸菌でテトラ
サイクリン耐性形質転換株を選択するために一般
に用いられている培地中のテトラサイクリン濃度
10μｇ／mlに比べると、かなり低い濃度である。
とした同菌種のベクタープラスミドとしては、プ
ラスミドpCE54が開発されているだけである。こ
れは、大腸菌のプラスミドpGA22由来のテトラ
サイクリン耐性を選択マーカーとしている。しか
しこのプラスミドによつて宿主のグルタミン酸生
産性コリネ型細菌に付与されるテトラサイクリン
耐性度は小さく、宿主のテトラサイクリンによる
最小生育阻止濃度を0.1μｇ／mlから3.2μｇ／mlに
増大させただけであつた。これは大腸菌でテトラ
サイクリン耐性形質転換株を選択するために一般
に用いられている培地中のテトラサイクリン濃度
10μｇ／mlに比べると、かなり低い濃度である。
大腸菌のプラスミドpGA22由来のテトラサイ
クリン耐性遺伝子は、大腸菌の細胞内ではその機
能を充分発揮でき、宿主に高い耐性度を付与する
ことができるグルタミン酸生産性コリネ型細菌の
細胞内では該遺伝子は、発現はするがその機能を
充分発揮することができず、宿主に付与できる耐
性度も低い（特開昭58−105999号）その為に、グ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌においてテトラサ
イクリン耐性を選択マーカーとして、プラスミド
pCE54による形質転換株を選択する場合、非形質
転換株が混入する可能性が高い。
クリン耐性遺伝子は、大腸菌の細胞内ではその機
能を充分発揮でき、宿主に高い耐性度を付与する
ことができるグルタミン酸生産性コリネ型細菌の
細胞内では該遺伝子は、発現はするがその機能を
充分発揮することができず、宿主に付与できる耐
性度も低い（特開昭58−105999号）その為に、グ
ルタミン酸生産性コリネ型細菌においてテトラサ
イクリン耐性を選択マーカーとして、プラスミド
pCE54による形質転換株を選択する場合、非形質
転換株が混入する可能性が高い。
従つて、グルタミン酸生産性コリネ型細菌の細
胞中でその機能を充分発揮できるように、同菌種
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を分離し、該
遺伝子を利用したベクタープラスミドを開発する
必要があつた。
胞中でその機能を充分発揮できるように、同菌種
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を分離し、該
遺伝子を利用したベクタープラスミドを開発する
必要があつた。
（問題を解決する為の手段および作用）
本発明者らは、グルタミン生産性コリネ型細菌
由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を
含むDNA断片を分離し、更に該DNA断片と同菌
種の細胞内で増殖可能なプラスミドの自律複製の
ために必要な遺伝子を含むDNA断片とを有する
新規ベクタープラスミドを開発し、本発明を完成
した。
由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を
含むDNA断片を分離し、更に該DNA断片と同菌
種の細胞内で増殖可能なプラスミドの自律複製の
ために必要な遺伝子を含むDNA断片とを有する
新規ベクタープラスミドを開発し、本発明を完成
した。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、グラム染
色陽性、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビ
オチンを要求する。更に同細菌は、ビオチン制限
培地で、または高濃度ビオチン含有培地では界面
活性剤等の添加により培地中にＬ−グルタミン酸
を著量蓄積する。その代表的な微生物としては、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
またはミクロバクテリウム属に属する微生物が挙
げられる。
色陽性、非運動性、好気性で胞子をつくらず、ビ
オチンを要求する。更に同細菌は、ビオチン制限
培地で、または高濃度ビオチン含有培地では界面
活性剤等の添加により培地中にＬ−グルタミン酸
を著量蓄積する。その代表的な微生物としては、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
またはミクロバクテリウム属に属する微生物が挙
げられる。
グルタミン酸生産性コリネ型細菌の細胞内で自
律複製可能なプラスミドの具体例としては、プラ
スミドpAG1，pAG3等が挙げられる。これらの
プラスミドは、本発明者らが分離した新規プラス
ミドであり、特開昭61−52290号、特開昭61−
52291号でそれぞれ開示したものであり、これら
のプラスミドを保持する菌株コルネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22220（微工研条寄第559号）は、
微生物工業技術研究所に寄託されている。
律複製可能なプラスミドの具体例としては、プラ
スミドpAG1，pAG3等が挙げられる。これらの
プラスミドは、本発明者らが分離した新規プラス
ミドであり、特開昭61−52290号、特開昭61−
52291号でそれぞれ開示したものであり、これら
のプラスミドを保持する菌株コルネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22220（微工研条寄第559号）は、
微生物工業技術研究所に寄託されている。
本発明のグルタミン酸生産性コリネ型細菌由来
でテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含む
DNA断片とは、同菌種より分離されたテトラサ
イクリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片
である。
でテトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含む
DNA断片とは、同菌種より分離されたテトラサ
イクリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片
である。
具体的には、プラスミドpAG1，pAG12，
pAG14，pAG31，pAG32，pAG50由来のDNA
断片で、そのDNA上に存在する遺伝子が同菌種
の細胞内で発現して宿主をテトラサイクリン耐性
にする性質を有するものであればよい。またこれ
らのDNA断片でその一部のDNAを、遺伝子工学
の手法により変更して、その結果得られたDNA
断片を適当なプラスミドに組み込んで宿主に移入
することによつて、その宿主をテトラサイクリン
耐性とすることもでき、このようなDNA断片も
本発明のDNA断片に含まれる。
pAG14，pAG31，pAG32，pAG50由来のDNA
断片で、そのDNA上に存在する遺伝子が同菌種
の細胞内で発現して宿主をテトラサイクリン耐性
にする性質を有するものであればよい。またこれ
らのDNA断片でその一部のDNAを、遺伝子工学
の手法により変更して、その結果得られたDNA
断片を適当なプラスミドに組み込んで宿主に移入
することによつて、その宿主をテトラサイクリン
耐性とすることもでき、このようなDNA断片も
本発明のDNA断片に含まれる。
また本発明における新規ベクタープラスミドの
具体例としては、プラスミドpAG1の縮小化によ
つて得られたプラスミドpAG12，pAG14，
pAG31，pAG32およびプラスミドpAG14由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片と
プラスミドpAG3とより作成された組換えプラス
ミドpAG50が挙げられる。
具体例としては、プラスミドpAG1の縮小化によ
つて得られたプラスミドpAG12，pAG14，
pAG31，pAG32およびプラスミドpAG14由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA断片と
プラスミドpAG3とより作成された組換えプラス
ミドpAG50が挙げられる。
本発明のベクタープラスミドは、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン耐性
に関与する遺伝子を含むDNA断片を有するもの
であり、該ベクタープラスミドによつてテトラサ
イクリン耐性に形質転換されたグルタミン酸生産
性コリネ型細菌のテトラサイクリン最小生育阻止
濃度は、10μｇ／ml以上となる。一方、同菌種の
テトラサイクリン最小生育阻止濃度は、一般に
1μｇ／ml前後である。従つて、テトラサイクリ
ン濃度10μｇ／mlの培地を用いることにより、上
述のベクタープラスミドにより形質転換された菌
株のみを確実に選択することができる。これは、
同菌種の遺伝子操作を行う上で極めて有利であ
る。
生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン耐性
に関与する遺伝子を含むDNA断片を有するもの
であり、該ベクタープラスミドによつてテトラサ
イクリン耐性に形質転換されたグルタミン酸生産
性コリネ型細菌のテトラサイクリン最小生育阻止
濃度は、10μｇ／ml以上となる。一方、同菌種の
テトラサイクリン最小生育阻止濃度は、一般に
1μｇ／ml前後である。従つて、テトラサイクリ
ン濃度10μｇ／mlの培地を用いることにより、上
述のベクタープラスミドにより形質転換された菌
株のみを確実に選択することができる。これは、
同菌種の遺伝子操作を行う上で極めて有利であ
る。
尚、本文中で用いる制限酵素の名称は、次の菌
種から得られる制限酵素の略称である。
種から得られる制限酵素の略称である。
EcoRI：エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli RY13） BamHI：バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス （Bacillus amyloliquefaciensH） Bgl：（バチルス・グロビギイ
（Bacillus・globigii） Hae：ヘモフイラス・エジプテイウス （Haemophilus・aegyptius） Hind：ヘモフイラス・インフルエンザ
Rd （Haemophilus influenzae Rd） Pst：プロビデンシア・スチユアーテイ
ー 164（Providencia stuartii164） Xba：キサントモナス・バドリ
（Xanthomonas badrii） Sal：ストレプトマイセス・アルバスＧ （Streptomyces albusG） 以下、各組換えベクタープラスミドおよびテト
ラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA
断片について、更に詳しく説明する。
coli RY13） BamHI：バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス （Bacillus amyloliquefaciensH） Bgl：（バチルス・グロビギイ
（Bacillus・globigii） Hae：ヘモフイラス・エジプテイウス （Haemophilus・aegyptius） Hind：ヘモフイラス・インフルエンザ
Rd （Haemophilus influenzae Rd） Pst：プロビデンシア・スチユアーテイ
ー 164（Providencia stuartii164） Xba：キサントモナス・バドリ
（Xanthomonas badrii） Sal：ストレプトマイセス・アルバスＧ （Streptomyces albusG） 以下、各組換えベクタープラスミドおよびテト
ラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA
断片について、更に詳しく説明する。
プラスミドpAG12，pAG14
プラスミドpAG12，pAG14は、プラスミド
pAG1より、次の様にして作製することができ
る。プラスミドpAG1は、その保有菌コリネバク
テリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）の培
養菌体より、リゾチウム・SDS処理、同浴菌液フ
エノール・クロロホルム処理、同処理液のエタノ
ール沈澱処理、同沈澱物質のエチジウムブロマイ
ドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心により、
容易に分離精製される。プラスミドpAG1には、
制限酵素EcoRIの切断部位が８個所存在してお
り、これらを利用して、プラスミドpAG1を縮小
化する。プラスミドpAG1を制限酵素EcoRIで完
全消化して直鎖状にした後、T4フアージDNAリ
ガーゼを作用させ、環状のDNA分子を作製する。
目的とするテトラサイクリン耐性遺伝子及び自律
複製のために必要な遺伝子を含むプラスミドは、
同反応液を用いてグルタミン酸生産性コリネ型細
菌を形質転換した後、その中からテトラサイクリ
ン耐性の形質転換株を分離し、これらの形質転換
株の保有するプラスミドを解析することによつて
取得される。DNAリガーゼ反応物による形質転
換は、通常枯草菌等で用いられているプロトプラ
ストを用いた形質転換法により実施することがで
きる。
pAG1より、次の様にして作製することができ
る。プラスミドpAG1は、その保有菌コリネバク
テリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）の培
養菌体より、リゾチウム・SDS処理、同浴菌液フ
エノール・クロロホルム処理、同処理液のエタノ
ール沈澱処理、同沈澱物質のエチジウムブロマイ
ドを含む塩化セシウム平衡密度勾配遠心により、
容易に分離精製される。プラスミドpAG1には、
制限酵素EcoRIの切断部位が８個所存在してお
り、これらを利用して、プラスミドpAG1を縮小
化する。プラスミドpAG1を制限酵素EcoRIで完
全消化して直鎖状にした後、T4フアージDNAリ
ガーゼを作用させ、環状のDNA分子を作製する。
目的とするテトラサイクリン耐性遺伝子及び自律
複製のために必要な遺伝子を含むプラスミドは、
同反応液を用いてグルタミン酸生産性コリネ型細
菌を形質転換した後、その中からテトラサイクリ
ン耐性の形質転換株を分離し、これらの形質転換
株の保有するプラスミドを解析することによつて
取得される。DNAリガーゼ反応物による形質転
換は、通常枯草菌等で用いられているプロトプラ
ストを用いた形質転換法により実施することがで
きる。
こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、前記に示した方法により培養菌体
から分離精製でき、更に各種制限酵素で消化して
生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する
ことにより、その構造を知ることができる。形質
転換株からそれぞれ分離されたプラスミドが、プ
ラスミドpAG12，pAG14である。第３図、第４
図にそれぞれプラスミドpAG12，pAG14の制限
酵素地図を示す。プラスミドpAG12，pAG14は、
プラスミドpAG1由来の２つのEcoRI断片がそれ
ぞれ逆方向、順方向に結合した組換えプラスミド
である。両プラスミド共、制限酵素Xbaの切断
部位が、１箇所である。また、テトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができる
ので、グルタミン酸生産性コリネ型細菌におい
て、同プラスミドによる形質転換株をより一層効
率良く選択することができる。
ミドDNAは、前記に示した方法により培養菌体
から分離精製でき、更に各種制限酵素で消化して
生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する
ことにより、その構造を知ることができる。形質
転換株からそれぞれ分離されたプラスミドが、プ
ラスミドpAG12，pAG14である。第３図、第４
図にそれぞれプラスミドpAG12，pAG14の制限
酵素地図を示す。プラスミドpAG12，pAG14は、
プラスミドpAG1由来の２つのEcoRI断片がそれ
ぞれ逆方向、順方向に結合した組換えプラスミド
である。両プラスミド共、制限酵素Xbaの切断
部位が、１箇所である。また、テトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができる
ので、グルタミン酸生産性コリネ型細菌におい
て、同プラスミドによる形質転換株をより一層効
率良く選択することができる。
プラスミドpAG31，pAG32
プラスミドpAG31，pAG32は、次の様にして、
プラスミドpAG12をより縮小化することにより、
作製することができる。前述の様にして得られた
プラスミドpAG12のプラスミドDNAを、制限酵
素EcoRI※ 〔T.I.TIKCHONENKO，E.V，
KARAMOV，B.A.ZAVIZION and B.S.
NARODITSKY：Gene，４，195−212（1978）〕
で部分消化して鎖状にした後、T4フアージDNA
リガーゼを作用させ環状DNA分子を作製する。
この反応液の中からの目的とするテトラサイクリ
ン耐性遺伝子及び自律複製のために必要な遺伝子
を含むプラスミドは、同反応液を用いてグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラサ
イクリン耐性の形質転換株を分離し、これらの形
質転換株の保有するプラスミドを解析することに
より取得される。
プラスミドpAG12をより縮小化することにより、
作製することができる。前述の様にして得られた
プラスミドpAG12のプラスミドDNAを、制限酵
素EcoRI※ 〔T.I.TIKCHONENKO，E.V，
KARAMOV，B.A.ZAVIZION and B.S.
NARODITSKY：Gene，４，195−212（1978）〕
で部分消化して鎖状にした後、T4フアージDNA
リガーゼを作用させ環状DNA分子を作製する。
この反応液の中からの目的とするテトラサイクリ
ン耐性遺伝子及び自律複製のために必要な遺伝子
を含むプラスミドは、同反応液を用いてグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌を形質転換してテトラサ
イクリン耐性の形質転換株を分離し、これらの形
質転換株の保有するプラスミドを解析することに
より取得される。
この様にして得られる形質転換株の保有するプ
ラスミドは、前記に示した方法により培養菌体か
ら分離精製でき、更に各種制限酵素で消化して生
成するDNA断片をアガロースグル電気泳動およ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析す
ることにより、その構造を知ることができる。形
質転換株からそれぞれ分離されたプラスミドが、
プラスミドpAG31，pAG32である。第５図、第
６図にそれぞれプラスミドpAG31，pAG32の制
限酵素地図を示す。プラスミドpAG31，プラス
ミドpAG32は、プラスミドpAG12の２つの
EcoRI断片が縮小されながらそれぞれ順方向、逆
方向に結合した組換えプラスミドである。プラス
ミドpAG31は、制限酵素BamHI，EcoRIによる
切断部位が各１箇所であり、プラスミドpAG32
は、制限酵素BamHI，EcoRI，Hindによる切
断部位が各１箇所である。両プラスミド共、一般
によく用いられている制限酵素EcoRIの切断部位
が１箇所である為、同部位へのDNA断片のクロ
ーニングが容易である。更にテトラサイクリン耐
性を選択マーカーとして使用することができるの
で、DNA断片のクローン化を、グルタミン酸生
産性コリネ型細菌において、より一層効率良く実
施することができる。
ラスミドは、前記に示した方法により培養菌体か
ら分離精製でき、更に各種制限酵素で消化して生
成するDNA断片をアガロースグル電気泳動およ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析す
ることにより、その構造を知ることができる。形
質転換株からそれぞれ分離されたプラスミドが、
プラスミドpAG31，pAG32である。第５図、第
６図にそれぞれプラスミドpAG31，pAG32の制
限酵素地図を示す。プラスミドpAG31，プラス
ミドpAG32は、プラスミドpAG12の２つの
EcoRI断片が縮小されながらそれぞれ順方向、逆
方向に結合した組換えプラスミドである。プラス
ミドpAG31は、制限酵素BamHI，EcoRIによる
切断部位が各１箇所であり、プラスミドpAG32
は、制限酵素BamHI，EcoRI，Hindによる切
断部位が各１箇所である。両プラスミド共、一般
によく用いられている制限酵素EcoRIの切断部位
が１箇所である為、同部位へのDNA断片のクロ
ーニングが容易である。更にテトラサイクリン耐
性を選択マーカーとして使用することができるの
で、DNA断片のクローン化を、グルタミン酸生
産性コリネ型細菌において、より一層効率良く実
施することができる。
プラスミドpAG50
プラスミドpAG50は、プラスミドpAG3の制限
酵素BamHIの唯一の切断部位に、前述のプラス
ミドpAG14のテトラサイクリン耐性に関与する
遺伝子を含むBamH−Bg1断片を、両者の同
一接着末端を利用して結合せしめた組換えプラス
ミドである。プラスミドpAG3は、本発明者らに
より先にコリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22220（微工研
条寄第559号）より分離されたものである。
酵素BamHIの唯一の切断部位に、前述のプラス
ミドpAG14のテトラサイクリン耐性に関与する
遺伝子を含むBamH−Bg1断片を、両者の同
一接着末端を利用して結合せしめた組換えプラス
ミドである。プラスミドpAG3は、本発明者らに
より先にコリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22220（微工研
条寄第559号）より分離されたものである。
先づT4フアージDNAリガーゼ存在下で、プラ
スミドpAG3のBamHI断片とテトラサイクリン
耐性プラスミドpAG14のBamHI−Bg1断片と
を反応させる。次にこの反応液からのプラスミド
pAG50の選択は、上記リガーゼ反応液を用いて
グルタミン酸生産性コリネ型細菌を形質転換して
テトラサイクリン耐性形質転換株を分離し、これ
らの形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことによつて行なわれる。第７図にpAG50の制
限酵素地図を示す。プラスミドpAG50は、制限
酵素BamHI，EcoRI，Hind，SalI，XbaIの切
断部位が各１箇所である。更にテトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができる
ので、DNA断片のクーロン化を、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌においてより一層効率よく実
施することができる。
スミドpAG3のBamHI断片とテトラサイクリン
耐性プラスミドpAG14のBamHI−Bg1断片と
を反応させる。次にこの反応液からのプラスミド
pAG50の選択は、上記リガーゼ反応液を用いて
グルタミン酸生産性コリネ型細菌を形質転換して
テトラサイクリン耐性形質転換株を分離し、これ
らの形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことによつて行なわれる。第７図にpAG50の制
限酵素地図を示す。プラスミドpAG50は、制限
酵素BamHI，EcoRI，Hind，SalI，XbaIの切
断部位が各１箇所である。更にテトラサイクリン
耐性を選択マーカーとして使用することができる
ので、DNA断片のクーロン化を、グルタミン酸
生産性コリネ型細菌においてより一層効率よく実
施することができる。
尚、上記の形質転換実験では、宿主のグルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌の具体例として、コリネ
バクテリウム・メラセコラ（Coryneacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）のプ
ラスミドキユアード株、又はコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）を用い
た。本来プラスミドを保有していないグルタミン
酸生産性コリネ型細菌の具体例として用いたコリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）は、新
たに土壌から分離された菌株である。その菌学的
性質と分類同定理由は、以下の通りである。
ン酸生産性コリネ型細菌の具体例として、コリネ
バクテリウム・メラセコラ（Coryneacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）のプ
ラスミドキユアード株、又はコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）を用い
た。本来プラスミドを保有していないグルタミン
酸生産性コリネ型細菌の具体例として用いたコリ
ネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）は、新
たに土壌から分離された菌株である。その菌学的
性質と分類同定理由は、以下の通りである。
菌学的性質
(1) 顕微鏡による所見
通常（0.5−1.0）×（0.8×2.0）ミクロンの桿
菌で、大小不同のものを含む。スナツピツング
デイビジヨンによるＶ字状配列と多形性を示
す。グラム染色陽性、非運動性で胞子をつくな
らい。
菌で、大小不同のものを含む。スナツピツング
デイビジヨンによるＶ字状配列と多形性を示
す。グラム染色陽性、非運動性で胞子をつくな
らい。
(2) 培養による所見
ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはつき
りした正円形で、不透明で光沢があり、色は黄
色である。寒天斜面上では接種線に沿つて線状
に旺盛な生育を示し、臭気や培地の着色はな
い。寒天穿刺培養では、最上部で旺盛な生育を
示す。液体ブイヨン培地では均質に濁り、表面
にリングを形成する。
りした正円形で、不透明で光沢があり、色は黄
色である。寒天斜面上では接種線に沿つて線状
に旺盛な生育を示し、臭気や培地の着色はな
い。寒天穿刺培養では、最上部で旺盛な生育を
示す。液体ブイヨン培地では均質に濁り、表面
にリングを形成する。
(3) 生理的性質
ａ 温度：25℃−37℃で生育する。
ｂ PH：PH６−PH９で生育可能である。
ｃ 耐熱性：10％スキムミルク中で55℃前後で15
分程度の耐熱性を有する。
分程度の耐熱性を有する。
ｄ 好気性である。
ｅ ゼラチンを液化しない。
ｆ リトマスミルクを変化させない。
ｇ インドールを生産しない。
ｈ フオーゲス・プロスカウエル試験（Voges−
Pros Kauer test）：陰性。
Pros Kauer test）：陰性。
ｉ 硫化水素を生成しない。
ｊ メチルレツド試験：陽性。
ｋ 硝酸塩環元性：陰性。
ｌ クエン酸を利用しない。
ｍ デンプンを液化しない。
ｎ ウレアーゼ生成：陽性。
ｏ カタラーゼ生成：陽性。
ｐ 各種炭水化物からの酸の生成：グルコース、
フラクトース、シユークロース、マルトース、
マンノースより酸を生成するが、マンニトー
ル、キシロース、アラビノース、ラフイノー
ス、ラクトースからは酸を生成しない。
フラクトース、シユークロース、マルトース、
マンノースより酸を生成するが、マンニトー
ル、キシロース、アラビノース、ラフイノー
ス、ラクトースからは酸を生成しない。
ｑ ビチオンを要求する。
ｒ ビチオン制限培地で、または高濃度ビオチン
含有培地では界面活性剤の添加により、培地中
にＬ−グルタミン酸を著量蓄積する。
含有培地では界面活性剤の添加により、培地中
にＬ−グルタミン酸を著量蓄積する。
上記の菌学的性質を有する801菌についてその
分類学上の位置を、バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology Eighth Edition）および登録番号
576690の特許を参照し、更にコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterinm
melassecola）（ATCC 17965）をタイプカルチ
ヤーとして比較検討した結果、801株は、コリネ
バクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）に極めてよく一致していた。それ
故、801株をコリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）と同定した。
尚、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）801は、微生
物工業研究所に寄託され、その寄託番号は、微工
研条寄第558号である。
分類学上の位置を、バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology Eighth Edition）および登録番号
576690の特許を参照し、更にコリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterinm
melassecola）（ATCC 17965）をタイプカルチ
ヤーとして比較検討した結果、801株は、コリネ
バクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）に極めてよく一致していた。それ
故、801株をコリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）と同定した。
尚、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）801は、微生
物工業研究所に寄託され、その寄託番号は、微工
研条寄第558号である。
テトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含む
DNA断片 グルタミン酸生産性コリネ型細菌のテトラサイ
クリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片は、
具体的には次の様にして取り出すことができる。
プラスミドpAG3の制限酵素BamHIの唯一の切
断部位に、プラスミドpAG14由来の約3.2キロベ
ースの大きさのBamHI−Bg1断片を組込む。
この様にして作製された組換えプラスミド
pAG50は、宿主をテトラサイクリン耐性に形質
転換することができ、この能力が約3.2キロベー
スの大きさのBamHI−Bag1断片上の遺伝子に
備わつていることが解る。この事実は、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片を、具体
的なDNA断片として利用可能な状態に分離でき
たことを示している。更に同DNA断片を約2.8キ
ロベースの大きさのBamHI−EcoR断片、約
2.5キロベースのBg1−Sal断片約2.1キロベー
スの大きさのEcoRI−SaI断片として取り出すこ
とも可能である。なぜならば、プラスミド
pAG50は、制限酵素EcoRI，SalIのそれぞれの唯
一の切断部位へ外来DNA断片を組み込んでも、
テトラサイクリン耐性形質転換能を失なわなかつ
たからである。
DNA断片 グルタミン酸生産性コリネ型細菌のテトラサイ
クリン耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片は、
具体的には次の様にして取り出すことができる。
プラスミドpAG3の制限酵素BamHIの唯一の切
断部位に、プラスミドpAG14由来の約3.2キロベ
ースの大きさのBamHI−Bg1断片を組込む。
この様にして作製された組換えプラスミド
pAG50は、宿主をテトラサイクリン耐性に形質
転換することができ、この能力が約3.2キロベー
スの大きさのBamHI−Bag1断片上の遺伝子に
備わつていることが解る。この事実は、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌由来のテトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含むDNA断片を、具体
的なDNA断片として利用可能な状態に分離でき
たことを示している。更に同DNA断片を約2.8キ
ロベースの大きさのBamHI−EcoR断片、約
2.5キロベースのBg1−Sal断片約2.1キロベー
スの大きさのEcoRI−SaI断片として取り出すこ
とも可能である。なぜならば、プラスミド
pAG50は、制限酵素EcoRI，SalIのそれぞれの唯
一の切断部位へ外来DNA断片を組み込んでも、
テトラサイクリン耐性形質転換能を失なわなかつ
たからである。
テトラサイクリン耐性に関与した遺伝子を含む
約3.2キロベースのBamHI−Bg1断片は、次の
特徴がある。
約3.2キロベースのBamHI−Bg1断片は、次の
特徴がある。
(1) 該断片は、分子量約3.2キロベースのデオキ
シリボ核酸（DNA）である。
シリボ核酸（DNA）である。
(2) 該断片の両端は、それぞれ制限酵素BamHI，
Bglによつて生じる一本鎖末端である。
Bglによつて生じる一本鎖末端である。
(3) 該断片は、下記制限酵素に対して、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
EcoRI １
PstI ２
SalI １
また、テトラサイクリン耐性に関与した遺伝子
を含む約2.8キロベースのBamHI−EcoRI断片
は、次の特徴がある。
を含む約2.8キロベースのBamHI−EcoRI断片
は、次の特徴がある。
(1) 該断片は、分子量2.8キロベースのデオキシ
リボ核酸（DNA）である。
リボ核酸（DNA）である。
(2) 該断片の両端は、それぞれ制限酵素BamHI，
EcoRIによつて生じる一本鎖末端である。
EcoRIによつて生じる一本鎖末端である。
(3) 該断片は、下記制限酵素に対して、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
PstI ２
SalI １
また、テトラサイクリン酸性に関与した遺伝子
を含む約2.5キロベースのBg1−Sal断片は、
次の特徴がある。
を含む約2.5キロベースのBg1−Sal断片は、
次の特徴がある。
(1) 該断片は、分子量約2.5キロベースのデオキ
シリボ核酸（DNA）である。
シリボ核酸（DNA）である。
(2) 該断片の両端は、それぞれ制限酵素Bg1，
Sa1Iによつて生じる一本鎖末端である。
Sa1Iによつて生じる一本鎖末端である。
(3) 該断片は、下記制限酵素に対して、次の切断
感受性を有する。
感受性を有する。
（制限酵素） （切断部位数）
EcoRI １
PstI ２
また、テトラサイクリン耐性に関与した遺伝子
を含む約2.1キロベースのEcoRI−Sa1I断片は、
次の特徴がある。
を含む約2.1キロベースのEcoRI−Sa1I断片は、
次の特徴がある。
(1) 該断片は、分子量約2.1キロベースのデオキ
シリボ核酸（DNA）である。
シリボ核酸（DNA）である。
(2) 該断片の両端は、それぞれ制限酵素EcoRI，
SalIによつて生じる一本鎖末端である。
SalIによつて生じる一本鎖末端である。
(3) 該断片は、制限酵素PstIに対して、２箇所の
切断感受性部位を有する。
切断感受性部位を有する。
現在の遺伝子工学の技術では、制限酵素切断部
分をなくしたり、他の制限酵素切断部分に変更し
たりする等、DNA断片の一部を変更することは、
容易である。故に、上述のテトラサイクリン耐性
に関与する遺伝子を含むDNA断片においても、
同様の操作を行つたDNA断片を新たに作製する
ことは、容易である。従つて、その様に一部を変
更したDNA断片であつても、テトラサイクリン
耐性形質転換能を有したDNA断片であれば本発
明の目的は達成される。
分をなくしたり、他の制限酵素切断部分に変更し
たりする等、DNA断片の一部を変更することは、
容易である。故に、上述のテトラサイクリン耐性
に関与する遺伝子を含むDNA断片においても、
同様の操作を行つたDNA断片を新たに作製する
ことは、容易である。従つて、その様に一部を変
更したDNA断片であつても、テトラサイクリン
耐性形質転換能を有したDNA断片であれば本発
明の目的は達成される。
テトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含む
DNA断片は、後述する如く実用上利用価値が極
めて高い。ベクタープラスミドの安定性を増した
り、コピー数を変化させる事は、実用上重要なこ
とである。なぜならば種々の宿主に対し、目的に
合つた複製特性を有するベクタープラスミドがそ
れぞれ必要となるからである。一方グルタミン酸
生産性コリネ型細菌において、選択マーカーを持
たないプラスミドは、比較的容易に見い出され
る。従つて、それらのプラスミドの中から目的に
合つた複製特性を有したプラスミドを選抜して、
その自律複製に必要な遺伝子を含むDNA断片を
取り出し、テトラサイクリン耐性に関与する遺伝
子を含むDNA断片と結合させることにより、選
択マーカーを有し目的に合つた複製特性をもつ新
たなベクタープラスミドを作製することができ
る。つまり、本発明のグルタミン酸生産性コリネ
型細菌由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺
伝子を含むDNA断片を利用することにより、目
的に合つた複製特性を有し、かつテトラサイクリ
ン耐性の選択マーカーを有したベクタープラスミ
ドを種種開発することが、極めて容易になつた。
DNA断片は、後述する如く実用上利用価値が極
めて高い。ベクタープラスミドの安定性を増した
り、コピー数を変化させる事は、実用上重要なこ
とである。なぜならば種々の宿主に対し、目的に
合つた複製特性を有するベクタープラスミドがそ
れぞれ必要となるからである。一方グルタミン酸
生産性コリネ型細菌において、選択マーカーを持
たないプラスミドは、比較的容易に見い出され
る。従つて、それらのプラスミドの中から目的に
合つた複製特性を有したプラスミドを選抜して、
その自律複製に必要な遺伝子を含むDNA断片を
取り出し、テトラサイクリン耐性に関与する遺伝
子を含むDNA断片と結合させることにより、選
択マーカーを有し目的に合つた複製特性をもつ新
たなベクタープラスミドを作製することができ
る。つまり、本発明のグルタミン酸生産性コリネ
型細菌由来のテトラサイクリン耐性に関与する遺
伝子を含むDNA断片を利用することにより、目
的に合つた複製特性を有し、かつテトラサイクリ
ン耐性の選択マーカーを有したベクタープラスミ
ドを種種開発することが、極めて容易になつた。
以下実施例により、本発明を具体的に説明す
る。
る。
（実施例）
１ プラスミドpAG12，pAG14の作製
(1) コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工
研条寄第560号）菌体からのプラスミドpAG1
の分離上記菌体を、半合成培地〔（NH4）2SO4
10ｇ、尿素３ｇ、K2HPO4 １ｇ、NaCl 50mg、
MgSO4・7H2O 400mg、MnSO4・４−6H2O
２mg、FeSO4・４−6H2O ２mg、グルコース20
ｇ、ビオチン50μｇ、チアミン塩酸塩200μｇ、
酵母エキス１ｇを純水に溶かして１とし、PH
７，２に調整した培地〕で、32℃、１晩振盪培
養し、その種培養８mlを200mlの前記半合成培
地に移植して、32℃で５時間振盪培養した。
（Corynebacterium melassecola）22243（微工
研条寄第560号）菌体からのプラスミドpAG1
の分離上記菌体を、半合成培地〔（NH4）2SO4
10ｇ、尿素３ｇ、K2HPO4 １ｇ、NaCl 50mg、
MgSO4・7H2O 400mg、MnSO4・４−6H2O
２mg、FeSO4・４−6H2O ２mg、グルコース20
ｇ、ビオチン50μｇ、チアミン塩酸塩200μｇ、
酵母エキス１ｇを純水に溶かして１とし、PH
７，２に調整した培地〕で、32℃、１晩振盪培
養し、その種培養８mlを200mlの前記半合成培
地に移植して、32℃で５時間振盪培養した。
培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液
（50mMグルコース、10mM EDTA、25mMト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（Tris（hydroxymethyl）aminomethane：
Tris）、10mg／mlリゾチウム、シグマ社より購
入PH8.0〕10mlに懸濁し42℃で１時間反応させ
た。本反応液にアルカリSDS液〔0.2N
NaOH、１％SDS（Sodium Dodecylsulfate）〕
20mlを添加撹拌の後、氷中に５分間置いた。次
に本反応液に、氷冷した酢酸カリウム溶液
（5M酢酸カリウム水溶液60ml、酢酸11.5ml、純
水28.5mlの混合液）15mlを添加撹拌の後、氷中
に10分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移
し、４℃、５分間、12000rpm（13000ｇ）の遠
心分離を行い、上澄液を回収した。これを等容
のフエノール・クロロホルム液（１：１）で抽
出して水層を回収した。これに２倍容のエタノ
ールを添加撹拌して、５分間室温に置き、20
℃、10分間、10000rpm（11000ｇ）の遠心分離
を行つた。得られた沈澱物を、70％エタノール
水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、TE緩衡液
〔10mM Tris，1mM EDTA，PH7.5〕20mlで、
ふたたび溶解した。この液10mg／mlエチジウム
ブロマイド水溶液1.2mlと塩化セシウム23.6ｇ
とを加えて静かに溶解し、40000rpm（100000
ｇ）15℃で48時間遠心分離した。プラスミド
pAG1は、紫外線照射により遠心チユーブ中、
２本のバンドの下方として見い出され、このバ
ンドを遠心チユーブの側面から注射器で抜き取
ることにより、プラスミドpAG1を分離した。
次でこの分画液を等容量のイソプロピルアルコ
ールで４回抽出して、エチジウムブロマイドを
除去し、その後にTE緩衡液に対して透析して、
DNA濃度50μｇ／mlのプラスミドpAG1の透析
完了液１mlを得た。
（50mMグルコース、10mM EDTA、25mMト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（Tris（hydroxymethyl）aminomethane：
Tris）、10mg／mlリゾチウム、シグマ社より購
入PH8.0〕10mlに懸濁し42℃で１時間反応させ
た。本反応液にアルカリSDS液〔0.2N
NaOH、１％SDS（Sodium Dodecylsulfate）〕
20mlを添加撹拌の後、氷中に５分間置いた。次
に本反応液に、氷冷した酢酸カリウム溶液
（5M酢酸カリウム水溶液60ml、酢酸11.5ml、純
水28.5mlの混合液）15mlを添加撹拌の後、氷中
に10分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移
し、４℃、５分間、12000rpm（13000ｇ）の遠
心分離を行い、上澄液を回収した。これを等容
のフエノール・クロロホルム液（１：１）で抽
出して水層を回収した。これに２倍容のエタノ
ールを添加撹拌して、５分間室温に置き、20
℃、10分間、10000rpm（11000ｇ）の遠心分離
を行つた。得られた沈澱物を、70％エタノール
水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、TE緩衡液
〔10mM Tris，1mM EDTA，PH7.5〕20mlで、
ふたたび溶解した。この液10mg／mlエチジウム
ブロマイド水溶液1.2mlと塩化セシウム23.6ｇ
とを加えて静かに溶解し、40000rpm（100000
ｇ）15℃で48時間遠心分離した。プラスミド
pAG1は、紫外線照射により遠心チユーブ中、
２本のバンドの下方として見い出され、このバ
ンドを遠心チユーブの側面から注射器で抜き取
ることにより、プラスミドpAG1を分離した。
次でこの分画液を等容量のイソプロピルアルコ
ールで４回抽出して、エチジウムブロマイドを
除去し、その後にTE緩衡液に対して透析して、
DNA濃度50μｇ／mlのプラスミドpAG1の透析
完了液１mlを得た。
(2) プラスミドpAG1の試験管内組換え
実施例の(1)で調製したプラスミドpAG1の
DNA0.5μｇに対して、10単位の制限酵素
EcoRI（ニツポンジーン社より購入）を加え、
50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、
100mM NaClの緩衡液40μl中で、37℃にて２
時間反応させた。その後70℃で10分間加熱して
反応を停止させた。この反応後20μlと３単位の
T4フアージDNAリガーゼ（ニツポンジーン社
より購入）とを、50mM Tris−HCl（PH7.4）、
10mM MgCl2、10mM Dith−iothreitol、
1mM Spermidine、1mM ATP、0.1mg／ml
BSA（Bovine serumalbumin）（ベゼスタリサ
ーチラボラトリー社より購入）の緩衡液50μ
中で、15℃にて一晩反応させた。
DNA0.5μｇに対して、10単位の制限酵素
EcoRI（ニツポンジーン社より購入）を加え、
50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、
100mM NaClの緩衡液40μl中で、37℃にて２
時間反応させた。その後70℃で10分間加熱して
反応を停止させた。この反応後20μlと３単位の
T4フアージDNAリガーゼ（ニツポンジーン社
より購入）とを、50mM Tris−HCl（PH7.4）、
10mM MgCl2、10mM Dith−iothreitol、
1mM Spermidine、1mM ATP、0.1mg／ml
BSA（Bovine serumalbumin）（ベゼスタリサ
ーチラボラトリー社より購入）の緩衡液50μ
中で、15℃にて一晩反応させた。
(3) プラスミドpAG12，pAG14の取得
実施例１の(2)で作成したプラスミドpAG1由
来の組換えDNAにより、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）の
プラスミドキユアード株を形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株の保有す
るプラスミドを解析することにより、プラスミ
ドpAG12，pAG14を取得した。以下上記実験
について詳しく説明する。
来の組換えDNAにより、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）の
プラスミドキユアード株を形質転換した。得ら
れたテトラサイクリン耐性形質転換株の保有す
るプラスミドを解析することにより、プラスミ
ドpAG12，pAG14を取得した。以下上記実験
について詳しく説明する。
（プラスミドのキユアリング）コリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）をLG
培地（トリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl
５ｇ、グルコース２ｇを純水に溶かして１と
し、PH7.2に調整した培地）５mlに１白金耳植菌
して、37℃で一晩振盪培養した。この培養液を無
菌水で希釈してLG寒天培地（LG培地に1.5％寒
天を添加した培地）に塗布し、32℃で２日間培養
した。生じたコロニー100個を取り、テトラサイ
クリン10μｇ／mlを含有するLG寒天培地に釣菌し
た。32℃で２日間培養してテトラサイクリン感受
性株を選択した。得られた２株のテトラサイクリ
ン感受性株について、前記と同様なプラスミドの
単離法によりプラスミドpAG1の存在を調べた。
その結果得られた２株のテトラサイクリン感受性
株は、いずれもプラスミドを保持していなかつ
た。これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿
主として用いた。
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22243（微工研条寄第560号）をLG
培地（トリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl
５ｇ、グルコース２ｇを純水に溶かして１と
し、PH7.2に調整した培地）５mlに１白金耳植菌
して、37℃で一晩振盪培養した。この培養液を無
菌水で希釈してLG寒天培地（LG培地に1.5％寒
天を添加した培地）に塗布し、32℃で２日間培養
した。生じたコロニー100個を取り、テトラサイ
クリン10μｇ／mlを含有するLG寒天培地に釣菌し
た。32℃で２日間培養してテトラサイクリン感受
性株を選択した。得られた２株のテトラサイクリ
ン感受性株について、前記と同様なプラスミドの
単離法によりプラスミドpAG1の存在を調べた。
その結果得られた２株のテトラサイクリン感受性
株は、いずれもプラスミドを保持していなかつ
た。これらの一方の株を以後の形質転換実験の宿
主として用いた。
（形質転換）コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工研
条寄第560号）より前記の操作で分離したプラス
ミドキユアード株を、前記半合成培地で32℃、12
時間振盪培養し、この培養液0.5mlを同じ半合成
培地50mlに植菌して32℃で振盪培養した。日立分
光光度計（228型）で波長660nmにおける吸光度
（OD）を測定し、ODが0.2になつた時点で培養液
にペニシリンＧを0.3単位／mlの濃度になるよう
に添加した。これを更に32℃で1.5時間培養を続
けた。
（Corynebacterium melassecola）22243（微工研
条寄第560号）より前記の操作で分離したプラス
ミドキユアード株を、前記半合成培地で32℃、12
時間振盪培養し、この培養液0.5mlを同じ半合成
培地50mlに植菌して32℃で振盪培養した。日立分
光光度計（228型）で波長660nmにおける吸光度
（OD）を測定し、ODが0.2になつた時点で培養液
にペニシリンＧを0.3単位／mlの濃度になるよう
に添加した。これを更に32℃で1.5時間培養を続
けた。
その培養液より集菌し、Ｒ培地〔グルコース５
ｇ、カザミノ酸10ｇ、酵母エキス10ｇ、K2HPO4
0.35ｇ、KH2PO4 0.15ｇ、シユークロース137ｇ、
Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸（TES：Ｎ−Tris
（hydroxymethyl）methyl−２−
aminoethansulfonicacid）5.73ｇ、MgCl2 0.95
ｇ、CaCl2 1.11ｇを純水に溶かして１とし、
NaOHでPH7.2に調整した培地）５mlに懸濁した。
この菌懸濁液4.5mlに、３mg／ml濃度のリゾチウ
ムを含有するＲ培地（ミリポアフイルターで除菌
した。）0.5mlを添加して、35℃で５時間静置反応
させた。プロトプラスト化した細胞を7000rmp
（4500ｇ）、５℃、７分間で遠心分離して回収し、
Ｒ培地５mlに懸濁した。同様の操作を更にもう一
度行つた後、Ｒ培地５mlに再懸濁してプロトプラ
スト菌液とした。
ｇ、カザミノ酸10ｇ、酵母エキス10ｇ、K2HPO4
0.35ｇ、KH2PO4 0.15ｇ、シユークロース137ｇ、
Ｎ−トリス（ハイドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸（TES：Ｎ−Tris
（hydroxymethyl）methyl−２−
aminoethansulfonicacid）5.73ｇ、MgCl2 0.95
ｇ、CaCl2 1.11ｇを純水に溶かして１とし、
NaOHでPH7.2に調整した培地）５mlに懸濁した。
この菌懸濁液4.5mlに、３mg／ml濃度のリゾチウ
ムを含有するＲ培地（ミリポアフイルターで除菌
した。）0.5mlを添加して、35℃で５時間静置反応
させた。プロトプラスト化した細胞を7000rmp
（4500ｇ）、５℃、７分間で遠心分離して回収し、
Ｒ培地５mlに懸濁した。同様の操作を更にもう一
度行つた後、Ｒ培地５mlに再懸濁してプロトプラ
スト菌液とした。
実施例１の(2)で得られたリガーゼ反応液50μ
と２培濃度TSMC液（TSMC液は、TES
25mM、シユークロース0.4M、MgCl2 10mM、
CaCl2 30mMを含み、NaOHでPH7.2に調整した
水溶液である。）50μとの混合液を上記プロト
プラスト菌液0.5mlに添加混合した。その後更に
PEG液〔TSMC液にポリエチレングリコール
6000（Polyethylene glycol 6000）を40％濃度に
溶解する。〕1.5mlを添加してゆるやかに混和し、
２分間室温で静置した。その後Ｒ−PVP液〔Ｒ
培地にポリビニルピロリドン（PVP：Polyvinyl
pyrrolidone）40ｇ／を添加する。〕５mlを添加
して、4000rpm（1800ｇ）で10分間遠心分離して
上澄液を除去した。同様の遠心分離条件で洗浄操
作を更にもう一度行つた後、沈降したプロトプラ
ストを0.5mlのＲ−PVP液でゆるやかに懸濁した。
３時間、30℃に保つた後、Ｒ−PVP液で希釈し、
一定量をテトラサイクリン10μｇ／ml濃度を含む
再生培地（重層寒天培地を用いる。下層寒天培地
は、Ｒ培地にPVP40ｇ／、寒天15ｇ／を添
加して作製する。上層寒天培地は、PVP40ｇ／
、寒天６ｇ／を添加して作製する。プロトプ
ラスト懸濁液を溶けた上層寒天培地３mlと混合し
て、下層寒天培地上に重層する。）に植菌し、32
℃で４日培養した。
と２培濃度TSMC液（TSMC液は、TES
25mM、シユークロース0.4M、MgCl2 10mM、
CaCl2 30mMを含み、NaOHでPH7.2に調整した
水溶液である。）50μとの混合液を上記プロト
プラスト菌液0.5mlに添加混合した。その後更に
PEG液〔TSMC液にポリエチレングリコール
6000（Polyethylene glycol 6000）を40％濃度に
溶解する。〕1.5mlを添加してゆるやかに混和し、
２分間室温で静置した。その後Ｒ−PVP液〔Ｒ
培地にポリビニルピロリドン（PVP：Polyvinyl
pyrrolidone）40ｇ／を添加する。〕５mlを添加
して、4000rpm（1800ｇ）で10分間遠心分離して
上澄液を除去した。同様の遠心分離条件で洗浄操
作を更にもう一度行つた後、沈降したプロトプラ
ストを0.5mlのＲ−PVP液でゆるやかに懸濁した。
３時間、30℃に保つた後、Ｒ−PVP液で希釈し、
一定量をテトラサイクリン10μｇ／ml濃度を含む
再生培地（重層寒天培地を用いる。下層寒天培地
は、Ｒ培地にPVP40ｇ／、寒天15ｇ／を添
加して作製する。上層寒天培地は、PVP40ｇ／
、寒天６ｇ／を添加して作製する。プロトプ
ラスト懸濁液を溶けた上層寒天培地３mlと混合し
て、下層寒天培地上に重層する。）に植菌し、32
℃で４日培養した。
出現したテトラサイクリン耐性形質転換株から
任意に10株を選び、テトラサイクリン10μｇ／ml
濃度を含むLG寒天培地上で純化した後、実施例
１の(1)でプラスミドpAG1を分離した方法によ
り、各菌株からプラスミドを分離した。各プラス
ミドDNA0.5μｇに各々10単位の制限酵素
（EcoRI，Hind，Pst，BamHI，Bg1，
Sa1は、ニツポンジーン社製より購入Xbaは
ベセスダリサーチラボラトリー社より購入）１種
又は２種以上の組合せを各々の制限酵素の適正緩
衡液20μにて37℃で２時間反応させた。消化し
た試料は、１％アガロースゲル電気泳動および４
％ポリアクリルアミドゲル電気に供し、巾１cm当
り5Vの一定電圧で４時間泳動を行つた。泳動の
終つたゲルを1μｇ／mlエチジウムブロマイド溶
液に浸漬して30分間染色した後、紫外線をゲルに
照射して生成断片の数を判定し、各断片の泳動距
離から各々の分子量を算出した。次にそれらを加
算して、各プラスミドの分子量を求めた。同時
に、それらの結果に基づき、各プラスミド分子中
の各制限酵素切断部位を決定した。各DNA断片
の分子量決定には、約0.5kb以上の分子量につい
ては１％アガロースゲル電気泳動を用い、約
0.1kbから約0.5kbまでの分子量については４％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。尚、分
子量は、同一アガロースゲル上で同時に泳動した
ラムダフアージ（λphage）DNA（ニツポンジー
ン社より購入）の制限酵素Hindによる消化断
片の既知分子量、または同一ポリアクリルアミド
ゲル上で同時に泳動したフアイ・エツクス174フ
アージ（φ×174phage）DNA（ベゼスグリサー
チラボラトリー社より購入）の制限酵素Haeに
よる消化断片の既知分子量に基づいて算出した。
更に複数の制限酵素処理によつて生じた消化断片
を解析することにより、各プラスミド分子中の各
制限酵素切断部位を決定した。本実験で得られた
プラスミドは全てプラスミドpAG12又はプラス
ミドpAG14であり、それらの制限酵素地図は、
それぞれ第３図、第４図である。
任意に10株を選び、テトラサイクリン10μｇ／ml
濃度を含むLG寒天培地上で純化した後、実施例
１の(1)でプラスミドpAG1を分離した方法によ
り、各菌株からプラスミドを分離した。各プラス
ミドDNA0.5μｇに各々10単位の制限酵素
（EcoRI，Hind，Pst，BamHI，Bg1，
Sa1は、ニツポンジーン社製より購入Xbaは
ベセスダリサーチラボラトリー社より購入）１種
又は２種以上の組合せを各々の制限酵素の適正緩
衡液20μにて37℃で２時間反応させた。消化し
た試料は、１％アガロースゲル電気泳動および４
％ポリアクリルアミドゲル電気に供し、巾１cm当
り5Vの一定電圧で４時間泳動を行つた。泳動の
終つたゲルを1μｇ／mlエチジウムブロマイド溶
液に浸漬して30分間染色した後、紫外線をゲルに
照射して生成断片の数を判定し、各断片の泳動距
離から各々の分子量を算出した。次にそれらを加
算して、各プラスミドの分子量を求めた。同時
に、それらの結果に基づき、各プラスミド分子中
の各制限酵素切断部位を決定した。各DNA断片
の分子量決定には、約0.5kb以上の分子量につい
ては１％アガロースゲル電気泳動を用い、約
0.1kbから約0.5kbまでの分子量については４％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。尚、分
子量は、同一アガロースゲル上で同時に泳動した
ラムダフアージ（λphage）DNA（ニツポンジー
ン社より購入）の制限酵素Hindによる消化断
片の既知分子量、または同一ポリアクリルアミド
ゲル上で同時に泳動したフアイ・エツクス174フ
アージ（φ×174phage）DNA（ベゼスグリサー
チラボラトリー社より購入）の制限酵素Haeに
よる消化断片の既知分子量に基づいて算出した。
更に複数の制限酵素処理によつて生じた消化断片
を解析することにより、各プラスミド分子中の各
制限酵素切断部位を決定した。本実験で得られた
プラスミドは全てプラスミドpAG12又はプラス
ミドpAG14であり、それらの制限酵素地図は、
それぞれ第３図、第４図である。
これらのプラスミドDNAを用いて、前記と同
様な方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工研
条寄第560号）のプラスミドキユアード株を形質
転換した。得られたテトラサイクリン耐性株につ
いて、それらが保有するプラスミドを解析した結
果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比
べて、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラ
スミドであつた。
様な方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工研
条寄第560号）のプラスミドキユアード株を形質
転換した。得られたテトラサイクリン耐性株につ
いて、それらが保有するプラスミドを解析した結
果、それらのプラスミドは、供与プラスミドと比
べて、制限酵素切断様式で同一と判定されるプラ
スミドであつた。
２ プラスミドpAG31，pAG32の作製
(1) プラスミドpAG12の試験管内組換え
実施例１の(3)で調製したプラスミドpAG12
のDNA2μｇに対して、10単位の制限酵素
EcoRIを加え、25mM Tris−HCl（PH8.6）、
2mM MgSO4、40％グリセロールの緩衡液80μ
中で、37℃にて90分間反応させ、その後70℃
にて10分間加熱して反応を停止させた。次に酢
酸ナトリウムを最終濃度300mMになるように
加え、更に２倍容のエタノールを加えて撹拌の
後−30℃にて３時間保持した。その後、
12000rpm（8900ｇ）で10間遠心分離して、
DNAの沈澱を回収した。減圧乾燥後得られた
DNA全量と３単位のT4フアージDNAリガー
ゼとを、50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM
MgCl2、10mM Dithiothreitol、1mM
Spermidine、1mM ATP、0.1mg／mlBSA
（Bovine serum albumin）の緩衡液50μ中
で、15℃にて一晩反応させた。その後70℃にて
10分間加熱することにより反応を停止させた。
のDNA2μｇに対して、10単位の制限酵素
EcoRIを加え、25mM Tris−HCl（PH8.6）、
2mM MgSO4、40％グリセロールの緩衡液80μ
中で、37℃にて90分間反応させ、その後70℃
にて10分間加熱して反応を停止させた。次に酢
酸ナトリウムを最終濃度300mMになるように
加え、更に２倍容のエタノールを加えて撹拌の
後−30℃にて３時間保持した。その後、
12000rpm（8900ｇ）で10間遠心分離して、
DNAの沈澱を回収した。減圧乾燥後得られた
DNA全量と３単位のT4フアージDNAリガー
ゼとを、50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM
MgCl2、10mM Dithiothreitol、1mM
Spermidine、1mM ATP、0.1mg／mlBSA
（Bovine serum albumin）の緩衡液50μ中
で、15℃にて一晩反応させた。その後70℃にて
10分間加熱することにより反応を停止させた。
(2) プラスミドpAG31，pAG32の取得
実施例２の(1)で得られたリガーゼ反応液50μ
を用いて、実施例１と同じ操作により、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工
研条寄第560号）のプラスミドキユアード株を
テトラサイクリン耐性が付与される様に形質転
換した。得られたテトラサイクリン耐性形質転
換株について、実施例１の(3)の方法により、各
形質転換株の保有するプラスミドを解析した結
果、プラスミドpAG31，pAG32を取得するこ
とができた。これらのプラスミド制限酵素地図
を、それぞれ第５図、第６図に示す。
を用いて、実施例１と同じ操作により、コリ
ネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22243（微工
研条寄第560号）のプラスミドキユアード株を
テトラサイクリン耐性が付与される様に形質転
換した。得られたテトラサイクリン耐性形質転
換株について、実施例１の(3)の方法により、各
形質転換株の保有するプラスミドを解析した結
果、プラスミドpAG31，pAG32を取得するこ
とができた。これらのプラスミド制限酵素地図
を、それぞれ第５図、第６図に示す。
これらのプラスミドDNAを用いて、前記と
同様な方法で、コリネバクテリウム、メラセコ
ラ（Corynebacterium melassecola）22243
（微工研条寄第560号）のプラスミドキユアード
株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミド
を解析した結果、それらのプラスミドは、供与
プラスミドと比べて、制限酵素切断様式で同一
と判定されるプラスミドであつた。
同様な方法で、コリネバクテリウム、メラセコ
ラ（Corynebacterium melassecola）22243
（微工研条寄第560号）のプラスミドキユアード
株を形質転換した。得られたテトラサイクリン
耐性株について、それらが保有するプラスミド
を解析した結果、それらのプラスミドは、供与
プラスミドと比べて、制限酵素切断様式で同一
と判定されるプラスミドであつた。
３ プラスミドpAG50の作製
プラスミドpAG14のDNAを制限酵素BamHI，
Bg1で切断し、同DNA断片混合物の中からア
ガロースゲル電気泳動により、テトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含む約3.2キロベースの
DNA断片を分離した。次に同DNA断片とプラス
ミドpAG3の制限酵素BamHI切断断片との混合
物に、T4フアージDNAリガーゼを作用させた。
次に同リガーゼ反応液により、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）を形質
転換し、テトラサイクリン耐性株を取得した。同
形質転換株の保有するプラスミドを分離し解析し
た結果、プラスミドpAG50を取得することがで
きた。以下詳細に説明する。
Bg1で切断し、同DNA断片混合物の中からア
ガロースゲル電気泳動により、テトラサイクリン
耐性に関与する遺伝子を含む約3.2キロベースの
DNA断片を分離した。次に同DNA断片とプラス
ミドpAG3の制限酵素BamHI切断断片との混合
物に、T4フアージDNAリガーゼを作用させた。
次に同リガーゼ反応液により、コリネバクテリウ
ム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）801（微工研条寄第558号）を形質
転換し、テトラサイクリン耐性株を取得した。同
形質転換株の保有するプラスミドを分離し解析し
た結果、プラスミドpAG50を取得することがで
きた。以下詳細に説明する。
(1) テトラサイクリン耐性に関与する遺伝子を含
むDNA断片の分離 実施例１の(3)で調製したプラスミドpAG14
のDNA20μｇに対して、100単位の制限酵素
BamHI，Bg1をそれぞれ加えて、10mM
Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、50mM
NaCl、1mM Dithiothreitolの緩衡液100ml中
で、37℃にて２時間反応させた。消化した試料
は、実施例１の(3)の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。ただし、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリース社より購入した
LMP Agaroseを使用し、４℃で電気泳動し
た。次に、エチジウムブロマイドで染色したア
ガロースを紫外線照射下に置き、テトラサイク
リン耐性に関与する遺伝子を含む約3.2キロベ
ースのDNA断片の存在を確認し、その付近の
アガロースゲルを切り出した。同アガロースに
その重量の３倍量のTE緩衡液を加えて、65℃
で10分間保持し、アガロースゲルを完全にとか
した。次に、等容のフエノールを添加して、撹
拌の後、水層を回収した。同水層に等容のフエ
ノールクロロホルム（１：１）液を添加して、
撹拌の後、水層を回収した。同水層に等容のク
ロロホルムを添加して、撹拌の後、水層を回収
した。同水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度
300mMになるように添加し、更に２倍容のエ
タノールを加えて撹拌の後、−30℃にて３時間
保持した。その後、10000rpm（9000ｇ）で10分
間遠心分離して、DNAの沈澱を回収し、同沈
澱を減圧乾燥した。
むDNA断片の分離 実施例１の(3)で調製したプラスミドpAG14
のDNA20μｇに対して、100単位の制限酵素
BamHI，Bg1をそれぞれ加えて、10mM
Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、50mM
NaCl、1mM Dithiothreitolの緩衡液100ml中
で、37℃にて２時間反応させた。消化した試料
は、実施例１の(3)の方法により、１％アガロー
スゲル電気泳動に供した。ただし、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリース社より購入した
LMP Agaroseを使用し、４℃で電気泳動し
た。次に、エチジウムブロマイドで染色したア
ガロースを紫外線照射下に置き、テトラサイク
リン耐性に関与する遺伝子を含む約3.2キロベ
ースのDNA断片の存在を確認し、その付近の
アガロースゲルを切り出した。同アガロースに
その重量の３倍量のTE緩衡液を加えて、65℃
で10分間保持し、アガロースゲルを完全にとか
した。次に、等容のフエノールを添加して、撹
拌の後、水層を回収した。同水層に等容のフエ
ノールクロロホルム（１：１）液を添加して、
撹拌の後、水層を回収した。同水層に等容のク
ロロホルムを添加して、撹拌の後、水層を回収
した。同水層に、酢酸ナトリウムを最終濃度
300mMになるように添加し、更に２倍容のエ
タノールを加えて撹拌の後、−30℃にて３時間
保持した。その後、10000rpm（9000ｇ）で10分
間遠心分離して、DNAの沈澱を回収し、同沈
澱を減圧乾燥した。
(2) プラスミドpAG3の調製と制限酵素BamHI
処理 実施例１の(1)の方法により、コリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22220（微工研条寄第559号）か
ら分離精製したプラスミドpAG3のDNA4μｇ
に対して、20単位の制限酵素BamHIを加えて、
10mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、
50mM NaCl、1mM Dithiothreitolの緩衡液
100μ中で、37℃にて２時間反応させた。そ
こへ等容のフエノール・クロロホルム（１：
１）液を添加して撹拌の後、水層を回収した。
更に等容のクロロホルムを添加して撹拌の後、
水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終
濃度300mMになるように加え、次に２倍容の
エタノーを添加して、−30℃にて３時間保持し
た後、12000rpm（8900ｇ）で10分間遠心分離し
てDNAの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した。
処理 実施例１の(1)の方法により、コリネバクテリ
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）22220（微工研条寄第559号）か
ら分離精製したプラスミドpAG3のDNA4μｇ
に対して、20単位の制限酵素BamHIを加えて、
10mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM MgSO4、
50mM NaCl、1mM Dithiothreitolの緩衡液
100μ中で、37℃にて２時間反応させた。そ
こへ等容のフエノール・クロロホルム（１：
１）液を添加して撹拌の後、水層を回収した。
更に等容のクロロホルムを添加して撹拌の後、
水層を回収した。そこへ酢酸ナトリウムを最終
濃度300mMになるように加え、次に２倍容の
エタノーを添加して、−30℃にて３時間保持し
た後、12000rpm（8900ｇ）で10分間遠心分離し
てDNAの沈澱を回収し、これを減圧乾燥した。
(3) プラスミドpAG50の取得
実施例３の(1)，(2)で調製したそれぞれの
DNA全量と３単位のT4フアージDNAリガー
ゼとを50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM
MgCl2、10mM Dithiothreitol、1mM
Spermidine、1mM ATP、0.1mg／mlBSAの緩
衡液50μ中で、15℃にて一晩反応させた。そ
の後70℃にて10分間加熱して反応を停止させ
た。
DNA全量と３単位のT4フアージDNAリガー
ゼとを50mM Tris−HCl（PH7.4）、10mM
MgCl2、10mM Dithiothreitol、1mM
Spermidine、1mM ATP、0.1mg／mlBSAの緩
衡液50μ中で、15℃にて一晩反応させた。そ
の後70℃にて10分間加熱して反応を停止させ
た。
同リガーゼ反応液50μを用いて、実施例１
の(3)と同じ形質転換操作によりコリネバクチリ
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）（微工研条寄第558号）のテトラ
サイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得
られたテトラサイクリン耐性形質転換株につい
て、実施例１の(3)の方法により、各株の保有す
るプラスミドを解析した結果、プラスミド
pAG50を取得することができた。このプラス
ミドの制限酵素地図を、第７図に示す。
の(3)と同じ形質転換操作によりコリネバクチリ
ウム・メラセコラ（Corynebacterium
melassecola）（微工研条寄第558号）のテトラ
サイクリン耐性形質転換株を取得した。ただ
し、再生培地による培養は、７日間とした。得
られたテトラサイクリン耐性形質転換株につい
て、実施例１の(3)の方法により、各株の保有す
るプラスミドを解析した結果、プラスミド
pAG50を取得することができた。このプラス
ミドの制限酵素地図を、第７図に示す。
このプラスミドDNAを用いて、前記と同様
な方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）801（微工研
条寄第558号）を、形質転換した。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、それ
らが保有するプラスミドを解析した結果、それ
らのプラスミドは、供与プラスミドと比べて制
限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミド
であつた。
な方法で、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）801（微工研
条寄第558号）を、形質転換した。得られたテ
トラサイクリン耐性形質転換株について、それ
らが保有するプラスミドを解析した結果、それ
らのプラスミドは、供与プラスミドと比べて制
限酵素切断様式で同一と判定されるプラスミド
であつた。
（発明の効果）
本発明により、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌由来でテトラサイクリン耐性を選択マーカーと
した同菌種のベクタープラスミドを種々作製する
ことができる。この様にして作製されたベクター
プラスミドによる形質転換体はテトラサイクリン
耐性により選択することができ極めて便利であ
り、本発明により作製されたベクタープラスミド
を用いることにより、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌を宿主として任意の遺伝子を含むDNA断
片を容易にクローン化することが可能となつた。
菌由来でテトラサイクリン耐性を選択マーカーと
した同菌種のベクタープラスミドを種々作製する
ことができる。この様にして作製されたベクター
プラスミドによる形質転換体はテトラサイクリン
耐性により選択することができ極めて便利であ
り、本発明により作製されたベクタープラスミド
を用いることにより、グルタミン酸生産性コリネ
型細菌を宿主として任意の遺伝子を含むDNA断
片を容易にクローン化することが可能となつた。
また、テトラサイクリン耐性遺伝子を含む
DNA断片を取り出して利用できるようになつた
ので、その断片を次の様に利用することも可能で
ある。先づ、種々の複製特性を有しかつテトラサ
イクリン耐性の選択マーカーを有した新規ベクタ
ープラスミドを開発することができる。また他の
薬剤耐性遺伝子を含むDNA断片と組み合せるこ
とにより、プラスミドpBR322の如く、挿入不活
化を利用した組み換えプラスミド検出法を実施で
きるベクタープラスミドも開発することができ
る。
DNA断片を取り出して利用できるようになつた
ので、その断片を次の様に利用することも可能で
ある。先づ、種々の複製特性を有しかつテトラサ
イクリン耐性の選択マーカーを有した新規ベクタ
ープラスミドを開発することができる。また他の
薬剤耐性遺伝子を含むDNA断片と組み合せるこ
とにより、プラスミドpBR322の如く、挿入不活
化を利用した組み換えプラスミド検出法を実施で
きるベクタープラスミドも開発することができ
る。
第１図は、プラスミドpAG1の制限酵素地図で
ある。第２図は、プラスミドpAG3の制限酵素地
図である。第３図は、プラスミドpAG12の制限
酵素地図である。第４図は、プラスミドpAG14
の制限酵素地図である。第５図は、プラスミド
pAG31の制限酵素地図である。第６図は、プラ
スミドpAG32の制限酵素地図である。第７図は
プラスミドpAG50の制限酵素地図である。
ある。第２図は、プラスミドpAG3の制限酵素地
図である。第３図は、プラスミドpAG12の制限
酵素地図である。第４図は、プラスミドpAG14
の制限酵素地図である。第５図は、プラスミド
pAG31の制限酵素地図である。第６図は、プラ
スミドpAG32の制限酵素地図である。第７図は
プラスミドpAG50の制限酵素地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム・メラセコラ22243
（FERM BP−560）由来で、約2.1キロベースで
あり、かつ下図に示した制限酵素地図により特徴
づけられるテトラサイクリン耐性に関与する遺伝
子を含むDNA断片。 【表】
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59226651A JPS61104791A (ja) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
| GB8520632A GB2165546B (en) | 1984-08-21 | 1985-08-16 | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| FR858512538A FR2569421B1 (fr) | 1984-08-21 | 1985-08-20 | Plasmide et fragment d'adn comprenant un gene pour la resistance a la tetracycline, culture de microorganisme contenant le plasmide precite et microorganisme contenant ledit fragment d'adn |
| KR1019850006032A KR890003083B1 (ko) | 1984-08-21 | 1985-08-21 | 테트라시클린 내성 유전자를 함유한 플라스미드, 이로 부터 유도된 dna단편, 및 이 dna단편을 함유한 미생물 및 이들의 제조방법 |
| US07/492,227 US5158891A (en) | 1984-08-21 | 1990-03-13 | Plasmid containing a gene for tetracycline resistance and DNA fragments derived therefrom |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59226651A JPS61104791A (ja) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104791A JPS61104791A (ja) | 1986-05-23 |
| JPH0224518B2 true JPH0224518B2 (ja) | 1990-05-29 |
Family
ID=16848519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59226651A Granted JPS61104791A (ja) | 1984-08-21 | 1984-10-30 | テトラサイクリン耐性遺伝子を含むｄｎａ断片および該ｄｎａ断片を含むベクタ−プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61104791A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0467312U (ja) * | 1990-10-23 | 1992-06-15 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179081A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
| JPS59179080A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
| JPS6152290A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | プラスミドｐＡＧ／ |
-
1984
- 1984-10-30 JP JP59226651A patent/JPS61104791A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59179081A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０２ |
| JPS59179080A (ja) * | 1983-03-29 | 1984-10-11 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | プラスミドｐＴＰ１１０１ |
| JPS6152290A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | プラスミドｐＡＧ／ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0467312U (ja) * | 1990-10-23 | 1992-06-15 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61104791A (ja) | 1986-05-23 |
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