JP3979679B2 - プロモーター機能を有するｄｎａ断片 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はコリネ型細菌染色体由来のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に関する。
コリネ型細菌は、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸や、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産する際に用いられる工業的に重要なグラム陽性細菌であるが、組換えＤＮＡ技術の導入による菌株の育種改良は大腸菌（Escherichia coli）に比べて遅れており、遺伝的改良に利用可能な工業的に有用なベクター、特にその構成要素として用いるプロモーター、例えば強力な遺伝子発現機能を有するプロモーターや遺伝子発現の制御が可能なプロモーター等の開発が強く望まれている。
【０００２】
【従来の技術】
コリネ型細菌内で機能するプロモーターの改良に関する研究については、大腸菌由来のプロモーターを用いた例が報告されているのみである［Journal of Biotechnology, 5, 305（1987)； Gene, 102, 93（1991)］。それによると、大腸菌由来のｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターを融合させたｔａｃプロモーター［Gene, 20, 231（1982)］がコリネ型細菌内で構成的（constitutive）に最も強い機能を有するプロモーターとして記載されている。しかしながら、本願発明者等の知るかぎり、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強い機能を有するプロモーターは現在のところ開発されていない。
【０００３】
また、コリネ型細菌で人為的に有用遺伝子の発現を制御する方法については、大腸菌由来の制御可能なプロモーターをそのままコリネ型細菌に適用した例がある［Bio/Technology, 6, 428（1988)］。しかし、該発現制御法は大腸菌を宿主とした場合に比べて遺伝子産物の蓄積量が少なく十分に強力な発現方法とは言い難い。
従って、コリネ型細菌内で有用遺伝子を効率よく発現させるためには、コリネ型細菌内で種々の機能、例えば、強力な発現機能を有するプロモーターあるいは培地の組成条件を変えることにより発現制御可能な機能を有するプロモーターを新たに取得する必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、コリネ型細菌内で有用遺伝子を高効率に発現させうるプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、即ち大腸菌由来のｔａｃプロモーターより強い機能を持つプロモーターＤＮＡをコリネ型細菌染色体から見いだすこと、およびコリネ型細菌内で有用遺伝子の発現を人為的に制御可能なプロモーターＤＮＡをコリネ型細菌染色体から見いだすことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討の結果、本願発明者等が新たに構築したプロモーター検出用ベクター（promoter probe shuttle vector）、即ち、
ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子、
の５つのＤＮＡ領域を有するプロモーター検出用ベクターを用いれば、上記した特性を有するプロモーターＤＮＡ断片をコリネ型細菌から検出可能なことを見い出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
かくして、本発明によれば、
（１）コリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
特に、 ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子、
の５つのＤＮＡ領域を有するプロモータ検出用ベクターを用いてコリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内でｔａｃプロモータよりも強いプロモータ機能を有するＤＮＡ断片；
ＤＮＡ断片を下記の５つのＤＮＡ領域を有するプロモーター検出用ベクターに連結させた後、電気パルス法でブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株に形質転換したときに、得られた形質転換株が、ｔａｃプロモータを連結した該プロモータ検出ベクターを電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株に形質転換したものよりも強いカナマイシン耐性を付与するプロモーター機能を有する該ＤＮＡ断片：
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子；
配列番号：１〜配列番号：１２で示される塩基配列及び配列番号：１〜配列番号で示される塩基配列に対して１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列より成る群から選ばれる少くとも１つの塩基配列からなるコリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
（２）コリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少くとも１つの物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な少くとも１つの他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が提供される。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】
本明細書において、いくつかの術語を用いるが、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有する。
「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域のことを言う。
「ｔａｃプロモーター」とは、大腸菌（Escherichia coli）のトリプトファン・オペロン・プロモーター（tryptophan operon promoter）の−３５領域の配列とラクトース・オペロン・プロモーター（lactose operon promoter）の−１０領域の配列を融合させたプロモーターを言う。
「プロモーター機能を有するＤＮＡ断片」とは、天然に存在する染色体ＤＮＡから得られるＤＮＡ断片または人工的に合成されたＤＮＡ断片であり、該ＤＮＡ断片は遺伝子の転写を開始する機能を有し、すなわち遺伝子の転写能力を有しており、該ＤＮＡ断片中に上記プロモーターが含まれていると推定されるＤＮＡ断片を意味する。
【０００８】
「ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片」とは、上記プロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、遺伝子の転写能力がｔａｃプロモーターの転写能力よりも強い転写能力を有するＤＮＡ断片を意味する。「プロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片」とは、上記したプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、該ＤＮＡ断片を保有する宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を変更することにより、該ＤＮＡ断片の有する遺伝子の転写を開始する機能を自由に誘導しうる、すなわち抑制されていた該機能を解除・誘導することができ又は解除・誘導されていた該機能を抑制することができるＤＮＡ断片を意味するものである。
「コリネ型細菌（Coryneform bacteria）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌を意味する。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述べるようなコリネ型細菌が本発明においてプロモーターＤＮＡの遺伝子源あるいは宿主微生物として好ましいものである。
【０００９】
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6871
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC 14066
ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム（Brevibacterium immariophilium）ATCC 14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）ATCC 13825
ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）ATCC 9174
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ATCC 13826
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）
ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO 12144 （FERM BP-2515）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）ATCC 19240
コリネバクテリウム・アセトアシドフィリウム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC 13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ATCC 15806
コリネバクテリウム・カルナ（Corynebacterium callunae）ATCC 15991
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032, ATCC 13060
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）ATCC 15990
コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）ATCC 17965
【００１０】
また、これらのコリネ型細菌の培養は、それ自体既知の通常用いられるコリネ型細菌培養用の培地で培養し、培養物から菌体を取得することができる。
本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、その塩基配列が決定された後においては合成することも可能であるが、通常は天然に存在する微生物染色体から得られる場合が多く、その供給源となる微生物としては、上記コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）が有利に使用される。
上記コリネ型細菌からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離する方法としては、まず染色体ＤＮＡを抽出し（例えば、Biochimica et Biophysica Acta., 72, 619（1963）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵素で、染色体ＤＮＡを比較的短いＤＮＡ断片になるように切断する。そのためには、４塩基配列を認識する制限酵素例えば、ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、ＡｃｃII、ＡｆａＩ等を用い、単独あるいは数種類の組み合わせで切断することが好ましい。
【００１１】
このようにして得られた染色体ＤＮＡ切断物からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離するために、プロモーター検出用ベクターを用いて行うことができる。このプロモーター検出用ベクター（promoter probe shuttle vector）としては、下記（ａ）〜（ｅ）の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明者等が新たに構築したベクターが好ましい。
ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子。
【００１２】
上記プロモータ検出用ベクターの構築に必要とされる、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域（以下これを「ａ領域」と言うことがある）としては、大腸菌内でプラスミドの自律複製を司る機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（日本ジーン社製）等から得られるＤＮＡ断片等を用いることができる。
上記ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域（以下これを「ｂ領域」と言うことがある）としては、コリネ型細菌内でプラスミドの自律複製を司る機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、例えばプラスミドｐＣＲＹ３［ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-2513）が保有するプラスミド；米国特許第５,１８５,２６２号参照］、プラスミドｐＣＲＹ２［ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３ ＧＥ１０１（FERM BP-2512）が保有するプラスミド；米国特許第５,１８５,２６２号］、プラスミドｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６７９号公報参照）、プラスミドｐＭＨ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等を用いることができる。
【００１３】
上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域（以下これを「ｃ領域」又は「マーカー遺伝子（marker gene）」と言うことがある）としては、プラスミドのマーカーとして用いることができ、かつ上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域と異なる表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ断片であれば特に制限がなく、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｖｕII部位にトランスポゾン（Transposon）９［Nature, vol.293, pp.309-311（1981)参照］のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むサイズ（大きさ）が約３.０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片を挿入することにより構築されたプラスミドｐＪＣＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,３００ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、プラスミドｐＣＭ７（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切り出すことによって得られる大きさが７８７６ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが７９２ｂｐのクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ・ジンブロック（Chloramphenicol Acetyltransferase GenBlock；ファルマシア社製）、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,４２６ｂｐのテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片等を用いることができる。
【００１４】
上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域（以下これを「ｄ領域」又は「レポーター遺伝子（reporter gene)」と言うことがある）としては、プラスミドのマーカーとして用いることができ、かつそれ自身のプロモーターが欠如している遺伝子であって、上記ｃ）のプラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域であれば特に制限がなく、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位にトランスポゾン（Transposon）５［Molecular and General Genetics, vol.177, p.65（1979）参照］のＮＰＴII（カナマイシン耐性遺伝子）を含むサイズ（大きさ）が約５.９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を挿入することにより構築されるプラスミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が約１.６ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、プラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,４９４ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが１２８２ｂｐのカナマイシン・レジスタンス・ジンブロック（Kanamycin Resistance GenBlock；ファルマシア社製）、プラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社製）あるいはｐＳＧＭＵ３２（ファルマシア社製）をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩまたはＳａｃＩとＳａｌＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）がそれぞれ３,１１７ｂｐあるいは約３.３ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）遺伝子を含むＤＮＡ断片等を用いることができる。
【００１５】
さらに、上記ｅ）レポーター遺伝子（reporter gene）（ｄ領域）の上流に位置する転写終結因子（transcriptional terminator）（以下これを「ｅ領域」または「転写終結因子」と言うことがある）としては、次の塩基配列（配列番号：２１）：
5’AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT 3'
3’TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA 5'
を有する大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子であるｔｒｐＡターミネーターをＤＮＡ合成機で化学合成したものを用いることができる。
次に、上記ａ領域〜ｅ領域の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の取得に用いるプロモーター検出用ベクターの構築方法を述べる。
【００１６】
まず、ａ領域とｃ領域（以後、このマーカー遺伝子をプラスミド選択の指標として用いてプロモーター検出用ベクターを構築する）をＤＮＡリガーゼで連結させてマーカー遺伝子を保有する大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドを作成する。次に、このａ領域とｃ領域を保有するプラスミドを適当な制限酵素で開裂し、そこに転写終結因子（ｅ領域）をＤＮＡリガーゼにより連結し、さらにｅ領域（レポーター遺伝子）を転写終結因子の下流に連結する。最後に、この転写終結因子の下流にレポーター遺伝子（ｄ領域）が連結されたマーカー遺伝子（ｃ領域）を保有し大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドを適当な制限酵素で開裂し、ｂ領域をＤＮＡリガーゼで連結することにより、プロモーター検出用ベクターを構築することができる。
【００１７】
かくして構築されるプロモーター検出用ベクターの具体例としては、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＢｓｔＹ１とＰｖｕIIで切断して得られるサイズが１.１ｋｂのＤＮＡ断片にプロモーターを結合したＤＮＡ断片）、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（プラスミドｐＣＲＹ３を制限酵素ＸｈｏＩで切断して得られるサイズが４.０ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（プラスミドｐＪＣＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断して得られるサイズが１.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｄ）プロモーターが欠如しているカナマイシン耐性遺伝子（プラスミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（前記した６１ｂｐの合成ＤＮＡ断片）、
より成るプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７、ならびに、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｄ）プロモーターが欠如しているβ−ガラクトシターゼ遺伝子（プラスミドｐＳＧＭＵ２２を制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
より成るプラスミドｐ１７Ｂｇａｌを挙げることができる。
【００１８】
なお、図２および図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の構築方法の詳細については後記実施例１で述べる。またプラスミドｐ１７Ｂｇａｌの制限酵素切断点地図を図４に示す。
以上のようにして作成したプロモーター検出用ベクターを用いて、コリネ型細菌染色体から本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離する方法を述べる。
【００１９】
上記プロモーター検出用ベクターを、それ自体既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法［Agricultural and Biological chemistry., 54, 443（1990）参照］等でコリネ型細菌へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、レポーター遺伝子（ｃ領域）が発現しない（レポーター遺伝子はプロモーター領域が欠如しているのでこの状態では発現しない）ことを確認しておく。ここで、レポーター遺伝子の発現の有無および発現強度の測定は、レポーター遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行うことができる。また発現の有無および発現強度は、形質転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中のレポーター遺伝子の発現産物を、レポーター遺伝子の発現産物の性質を利用して調べることもできる。
【００２０】
例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼである場合は、β−ガラクトシダーゼの基質となる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を含有する選択培地で培養し、形質転換株の形成するコロニーの色、即ち、β−ガラクトシダーゼの発現によりＸ−ｇａｌが分解され、コロニーが青色を呈色することにより判別することができる。
【００２１】
レポーター遺伝子がコリネ型細菌内で発現していないことが確認できたプロモーター検出用ベクターの、レポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領域）の間を該部位を認識する適当な制限酵素で開裂する。このＤＮＡ断片と前記コリネ型細菌染色体を４塩基配列を認識する制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片とをＤＮＡリガーゼで連結し、コリネ型細菌へ電気パルス法等により導入する。
かくして得られる形質転換株を培養し、前記したレポーター遺伝子の確認法によりレポーター遺伝子の発現が認められる形質転換株を採取することにより、プロモーター機能を有するＤＮＡ断片を保有するプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌を取得することができる。このレポーター遺伝子発現能を有するコリネ型細菌から、次に述べる方法により、本願発明のＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２２】
先ず、本願発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の取得法について述べる。
プロモーター機能の強さの指標となる前記ｔａｃプロモーターを前記プロモーター検出用ベクターのレポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領域）の間に前記方法で挿入し、このプラスミドでコリネ型細菌を前記電気パルス法により形質転換し前記方法によりレポーター遺伝子の発現強度を調べる。ここでｔａｃプロモーターは、プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られる９６ｂｐのＤＮＡ断片またはＤＮＡ合成機で人工的に合成されたＤＮＡ断片を用いることができる。
【００２３】
上記で得られたｔａｃプロモーターが導入されたプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌のレポーター遺伝子発現強度より強いレポーター遺伝子の発現強度を有する前記コリネ型細菌染色体から得られたＤＮＡ断片が導入されたプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌を選ぶことにより、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するプロモーターを保有する形質転換株を取得することができる。
得られた形質転換株が、プロモーター検出用ベクターに挿入されたプロモーターに依存してレポーター遺伝子の発現が強化されたのかどうかを判定するために、即ち、該プロモーター以外の機能として宿主染色体上に変異が起きレポーター遺伝子の発現が強化された場合と区別するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し同様にレポーター遺伝子の発現強度を測定し、レポーター遺伝子の発現の強化が、導入されたコリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片に依存する形質転換株を取得する。
【００２４】
かくして得られる形質転換株の具体例としては、前記プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３であって５００ μg/ml 以上のカナマイシン耐性濃度を有する（カナマイシン５００ μg/ml を含有する培地で生育する）形質転換株１２株が挙げられる。これら形質転換株および保有するプラスミドを次のとおり命名した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
これら形質転換株のカナマイシン耐性濃度は下記第１表に示すとおりである。なお、プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７のＥｃｏＲＶ部位にｔａｃプロモーターが挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３のカナマイシン耐性濃度は５００ μg/ml 未満であり、カナマイシン５００ μg/ml を含有する培地で形質転換株は生育しなかった。
【００２７】
【表２】
【００２８】
このようにして得られる形質転換株からの本願発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列の決定は次のとおり行うことができる。
まずプロモーター検出用ベクターの前記コリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片が挿入された制限酵素部位（ｄ領域とｅ領域の間の制限酵素部位）の上流および下流の配列に相当する塩基配列を化学合成し、プライマーＤＮＡとする。この場合、プロモーター検出用ベクターがｐＰＲＯＢＥ１７である時は、ｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側および３’側の配列に相当する以下に示す塩基配列：
GATCAGATCCCAGAATTGAT （５’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２２）
TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （３’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２３）
を化学合成しプライマーＤＮＡとする。
【００２９】
次に、前記で得られた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、上記プライマーＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（パーキンエルマー・シータス社製）を用い、ＰＣＲ法［Nature, 324, 163(1986）参照］により挿入されたＤＮＡ断片部分のみを増幅することができる。この増幅されたＤＮＡ断片のサイズはアガロースゲル電気泳動により、分子量既知のＤＮＡ断片（例えばｐＨＹマーカー；宝酒造社製等）の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき算出することができる。次に上記で得られた挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、上記ＰＣＲに用いたプライマーを再度用いまた上記ＰＣＲ産物を鋳型にし、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Chaintermination method；Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, 74, 5463（1977）参照〕により決定することができる。
【００３０】
かくして決定された前記で得られた形質転換株１２株のプロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は次のとおりである。
【００３１】
【表３】
【００３２】
上記の塩基配列を含有して成る本発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製、３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよい。
また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得される本発明のＤＮＡ断片は、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を実質的に損なう事がない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよくまたは削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
次に、本発明のコリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片について説明する。
【００３３】
ここで、「コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質」とは、コリネ型細菌の生育に必要な炭素源、窒素源、その他の栄養素となり得る物質を意味するものであり、例えば、グルコース、フルクトース、エタノール、メタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、アミノ酸、尿素、廃糖密、硫酸アンモニウム等を挙げることができる。これらの中で特にグルコース、フルクトース、エタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物を好適に用いることができる。これらの物質は、最少培地に、単独にあるいは数種類に組合せて添加して用いることができる。培地中のこれらの物質の濃度は、コリネ型細菌が利用可能な濃度であれば特に制限はないが、通常、グルコースの場合は５％〜０.０１％、エタノールの場合は５％〜０.０１％、フルクトースの場合は５％〜０.０１％、カゼイン加水分解物の場合は１％〜０.０１％、酵母抽出物の場合は１％〜０.０１％の範囲内が適当である。
【００３４】
また、最少培地とはコリネ型細菌の生育に必須な化学構造が既知の培地成分よりなる培地のことを意味し、具体的にはグルコースやエタノール等の化学構造が既知の炭素源；アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の窒素源；リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩；ビオチン、ビタミン等のその他栄養素等のコリネ型細菌の生育に必須な成分のみからなる培地を意味するものである。
本願発明のプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片は次のとおり取得することができる。
【００３５】
まず、前記のコリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片が挿入されたプロモーター検出用ベクターが導入されたコリネ型細菌を、最少培地で培養し、マーカー遺伝子の発現を前記方法により確認し、プロモーター検出用ベクターが導入された形質転換株を得る。次に、最少培地に前記コリネ型細菌が利用可能な物質を加えた培地で上記で得られた各形質転換株を培養し、レポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。さらに最少培地に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更して各形質転換株のレポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。かくして、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を、宿主コリネ型細菌が利用可能な他の物質に変更することにより、レポーター遺伝子の発現が制御可能な形質転換株を得ることができる。
【００３６】
次に、得られた形質転換株が、プロモーター検出用ベクターに挿入されたＤＮＡ断片に依存し上記レポーター遺伝子の発現の制御が可能となったのかどうかを判定するために、即ち該プロモーター以外の機能として宿主染色体上に変異が起きたためにレポーター遺伝子の発現の制御が可能となる場合と区別するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様に最少培地に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更してレポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。
【００３７】
ここで、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少くとも１つの物質を、宿主コリネ型細菌が利用可能な少くとも１つの他の物質に変更する方法については特に制限されるものではなく、例えば次のような方法も含まれる。
（１）利用可能な物質を含有する培地で細胞を培養し、通常用いられる遠心分離または濾過分離により集菌し、得られた菌体を、利用可能な他の物質を含有する培地に植え代えるか、もしくは（２）培地中の利用可能な物質を完全に消費した後に、利用可能な他の物質を培地に添加する。
【００３８】
このようにして、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を他の物質に変更することによりプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が挿入されたプロモーター検出用ベクターが導入された形質転換株を得ることができる。
この形質転換株の具体例としては、前記プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３であって、次の性質を有する菌株を挙げることができる。それらの形質転換株および保有するプラスミドをそれぞれ次のとおり命名した。
【００３９】
（ｉ）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをエタノールに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
【００４０】
（ii）培地中のエタノールによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のエタノールをグルコースに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
【００４１】
（iii）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをフルクトースに変えることによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
【００４２】
（iv）培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物によりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースをグルコースに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
【００４３】
（ｖ）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物に変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
【００４４】
このようにして得られる本発明のプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は前記したと同様の方法で決定することができる。前記方法で決定された上記形質転換株のプロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は次のとおりである。なお、挿入ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断して得られる切断断片のサイズ（大きさ）はアガロースゲル電気泳動で求めた値である。
【００４５】
【表４】
【００４６】
上記の塩基配列およびＤＮＡ断片を含有して成る本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよい。また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得される本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能および該プロモーターの制御機能を実質的に損なう事がない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよくまたは削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００４７】
上記で詳述したコリネ型細菌由来の本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の下流に発現させるべき目的の遺伝子を連結し、それをコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドベクターに挿入後、このプラスミドをコリネ型細菌へ導入し、該コリネ型細菌を用いて目的とする遺伝子を高効率に発現させることが可能となる。本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に直接接続されるところの発現させるべき遺伝子は、微生物起源のもの、植物起源のもの、動物起源のもの、人工的に合成されたもの等いずれでもよい。また発現されるべき遺伝子の発現産物は、アミノ酸、有機酸、ビタミン、脂質等の生体内物質の生合成あるいは代謝に関わる酵素、タンパク質、油脂、抗生物質等の生理活性物質の生合成あるいは代謝に関わる酵素である。
【００４８】
また、本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域を有するものであれば特に制限はない。コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域を有するプラスミドベクターとしては、例えば、
（１）ｐＡＭ３３０［Agricultural and Biological Chemistry, 48, 2901（1986)］
（２）ｐＣＧ４［Journal of Bacteriology, 159, 306（1984)］
（３）ｐＳＲ１［Journal of Bacteriology, 162, 591（1985)］
（４）ｐＢＹ５０３［Journal of Industrial Microbiology, 5, 159（1990)］
（５）ｐＢＬ１［Journal of Bacteriology, 162, 463（1985)］
（６）ｐＨＭ１５１９［Gene, 39, 281（1985)］
（７）ｐＣＧ１［Molecular and General Genetics, 196, 175（1984)］
（８）ｐＣＧ１００［Journal of General Microbiology, 137, 2093（1991)］
等を挙げることができる。もちろん、これらのプラスミドベクターから得られたコリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域が組み込まれたプラスミドベクターもまた好適に用いることができる。
【００４９】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１ プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の構築
作成は図２および図３に示すスキームにより行った。
先ず、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ ＤＮＡ １０μｇを、制限酵素ＰｖｕIIとＢｓｔＹＩの両酵素で３７℃、１時間保温することにより切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、大腸菌内で複製増殖能を担うＤＮＡ領域（ＯＲＩ）１.１ｋｂ断片をゲルから切り出し溶出精製し、ＤＮＡ １.５μｇを得た。
【００５０】
次に得られたＤＮＡ断片は、ｐＢＲ３２２の複製制御因子であるＲＮＡＩのプロモーター部分が欠けているため、以下に示す合成ＤＮＡ（配列中に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を含む）
▲１▼ 5’GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGATCCCAG 3’(配列番号：２４)
▲２▼ 3’ AGTTCT TCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCTAGGGTC 5’
を、▲１▼と▲２▼の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化学合成（アプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５０℃にて５時間保温することによりアニーリングし、上記に示す二本鎖ＤＮＡを５μｇ得た。得られた合成ＤＮＡ ５μｇと前述の１.１ｋｂＤＮＡ断片 １.５μｇとを混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた（ａ領域)。
【００５１】
次に連結物を制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温することにより切断し、トランスポゾンＴｎ９のクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つプラスミドｐＪＣＭ１ １μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温することにより切断した（ｃ領域）。６５℃で１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＢＲＣＭ１０２と命名したプラスミドが得られた。
【００５２】
次に、得られたプラスミドｐＢＲＣＭ１０２のＤＮＡ ５μｇを制限酵素ＰｖｕIIを用い３７℃、５分間保温により部分切断を行い、複製増殖能を担うＤＮＡ領域（ＯＲＩ）の３’側のＰｖｕII部位に、以下に示す配列（配列番号：２１) ▲３▼ 5'AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT3'
▲４▼ 3'TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA5'
からなる大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（ｅ領域、以下これを「ｔｅｒｍ」と称す）を、▲３▼と▲４▼の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化学合成（アプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５０℃にて５時間保温することによりアニーリングし、上記に示す二本鎖ＤＮＡを５μｇ得た。
【００５３】
上記部分切断物５μｇと合成ＤＮＡ ５μｇを混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照]、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＣＭＴ４４と命名したプラスミドが得られた。
【００５４】
次に、図３に示す、プラスミドｐＫＰＧ１３ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温により、カナマイシン耐性遺伝子自身のプロモーターを含まないように切断し、アガロースゲル電気泳動し、１.５ｋｂ断片のカナマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子部分のみをゲルから切り出し、溶出精製し、ＤＮＡ １μｇを得た（ｄ領域：レポーター遺伝子)。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＭＴ４４ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、５分間保温し部分切断を行ったものと混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図３に示すｐＣＫＴ１１と命名したプラスミドが得られた。
【００５５】
次に、コリネ型細菌内で複製増殖能を持つプラスミドｐＣＲＹ３を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-2513）から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＸｈｏＩを用い、３７℃、１時間保温により切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、４.０ｋｂのコリネ型細菌内で複製増殖能をもつＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶出精製し、２.５μｇを得た（ｂ領域）。得られたＤＮＡ断片２.５μｇと、プラスミドｐＣＫＴ１１ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＸｈｏＩで３７℃、１時間保温により切断したものを混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。
【００５６】
得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989(1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図３に示すｐＰＲＯＢＥ１７と命名したプラスミドが得られた。
【００５７】
以上のようにして構築したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７は、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー、
ｄ）カナマイシン耐性遺伝子（但し、プロモーター領域が欠如）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター、
から構成される。
【００５８】
実施例２ プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７のコリネ型細菌への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株を１００ｍｌのＡ培地［尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０ｇおよび蒸留水 １リットル］を用い３３℃で対数増殖中期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/ｍｌになるように添加して、さらに２時間培養後、遠心分離により集菌し、菌体を２０ｍｌの滅菌水およびパルス用緩衝液［２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2：ｐＨ７.４］でそれぞれ洗浄した。
【００５９】
さらに菌体を遠心分離により集菌し、２ｍｌの上記パルス用緩衝液に懸濁し、１２０μｌの菌体懸濁液と前記実施例１で得られたプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ＤＮＡ ５μｌとを混合し、氷中に１０分間静置した。ジーンパルサ（バイオラッド社製）を用いて、１９５０ボルト、２５μＦＤに設定しパルスを印加後、氷中に１０分間放置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地にて懸濁し、懸濁液を３３℃にて１時間培養後、クロラムフェニコールを３ μg/ml（最終濃度）含む前記Ａ寒天培地［寒天はＡ培地１リットル当たり１６ｇを添加］に塗沫し３３℃で２日培養した。出現したクロラムフェニコール耐性株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、前記実施例１で構築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７であることを確認した。
【００６０】
次に、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７は、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域が欠如しているため、同プラスミドのみをコリネ型細菌内に導入した場合カナマイシン感受性を示すことを確認するために、カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日培養したところ同培地上では全く生育しなかった。このことより、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７のカナマイシン耐性遺伝子の上流に挿入した転写終結因子ｔｒｐＡターミネーターの有効性、即ち、コリネ型細菌内でのプラスミド上のリードスルーによるカナマイシン耐性遺伝子の発現が全く無いことを確認した。
【００６１】
実施例３ 大腸菌由来ｔａｃプロモーターのコリネ型細菌内での強度測定
ｔａｃプロモーターの調製は、プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）から得る事とし、同プラスミドＤＮＡ ２５μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで３７℃、一時間保温し、アガロースゲル電気泳動し、９６ｂｐのｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶出精製し、０.５μｇを得た。得られたＤＮＡ断片０.５μｇをＳ１ヌクレアーゼで３７℃、１時間保温することにより平滑末端化し、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶで３７℃、１時間保温することにより切断平滑末端化したものと混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。
【００６２】
得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換株の選択は、カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）を含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で２日培養した。出現したカナマイシン耐性株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989(1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、前記実施例１で構築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に２７０ｂｐのｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００６３】
次に得られたカナマイシン耐性株を用い、カナマイシン濃度（培地に添加するカナマイシンの濃度）を調べる事により、導入したｔａｃプロモーターのコリネ型細菌内での強度について調べた。その結果、カナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日間培養したところ、上記カナマイシン耐性形質転換株は生育しない（カナマイシン１００ μg/ml を含有する培地で生育する）ことを確認した。
【００６４】
実施例４ コリネ型細菌染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株を１００ｍｌの前記Ａ培地に植え、３３℃にて対数増殖後期まで培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体を１０ mg/ml の濃度にリゾチームを含むリゾチーム反応液［１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。次に、プロテナーゼＫを最終濃度が１００ μg/ml になるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になるように添加し、５０℃で１時間保温して溶菌させた。この溶菌液に、等量のフェノール・クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振とうした後、全量を遠心分離し、上清画分を分取した。上清画分に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え、遠心分離し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させた。乾燥させたＤＮＡを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａの混合液５ｍｌに溶解させ染色体ＤＮＡを得た。
【００６５】
実施例５ コリネ型細菌染色体からの大腸菌由来ｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の単離
上記実施例４で得られた染色体ＤＮＡ ２０μｇを、４塩基認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIを用い、３７℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７℃で１時間保温することにより切断を行った。両切断物を混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換株の選択は、カナマイシンを５００、７５０、
１０００、１５００ μg/ml（最終濃度）をそれぞれ含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養した。その結果、前記第１表に示したとおり、５００ μg/ml 以上のカナマイシンを含有する培地で生育する形質転換株が１２株得られた。それらの形質転換株および保持するプラスミドを次のとおり命名した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
上記１２株のカナマイシン耐性株から、それぞれ常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出した。
得られたプラスミドＤＮＡを用い、再度ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換し、カナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）を含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養したところ、前記１２株から抽出したプラスミドＤＮＡを用いた場合、いずれも生育することが判明し、全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたコリネ型細菌染色体由来のＤＮＡ断片に依存すること、即ち挿入されたＤＮＡ断片はｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であることを確認した。
【００６８】
次に、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズを決定した。まずプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側および３’側の配列に相当する以下に示す塩基配列のプライマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。
５’側プライマーＤＮＡ GATCAGATCCCAGAATTGAT （配列番号：２２）
３’側プライマーＤＮＡ TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （配列番号：２３）
【００６９】
次に、上記で得られた１２株の形質転換株からプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲ法［Nature, 324, 163(1986）参照］により挿入されたＤＮＡ断片部分のみを増幅させ、１％アガロースゲル電気泳動によりサイズを決定した。ＤＮＡ断片のサイズは、ｐＨＹマーカー（宝酒造社製）の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき算出した。また、これらＤＮＡ断片の塩基配列を、上記ＰＣＲに用いたプライマーを再度用い、上記で得られたＰＣＲ産物を鋳型にし、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Chain termination method：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463（1977）参照］により決定した。その結果は次のとおりであった。
【００７０】
【表６】
【００７１】
実施例６ コリネ型細菌染色体からの制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
実施例４で得られた染色体ＤＮＡ ２０μｇを、４塩基認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIII を用い、３７℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７℃で１時間保温することにより切断を行った。両切断物を混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。
【００７２】
形質転換株の選択は、ＢＴ培地［尿素２ｇ、(ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン２００ μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、寒天 １６ｇおよび蒸留水 １リットル］にクロラムフェニコールを５ｍｇおよびグルコースを２０ｇを添加した培地（最少培地）に塗沫し３３℃で３日培養した。これによりクロラムフェニコール耐性株１００,０００株を得た。
次に、それぞれ性質の異なる制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索法について順次説明する。
【００７３】
実施例７ 培地中のグルコースをエタノールに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
上記実施例６で得られた形質転換株を、前記ＢＴ培地にグルコース（２０ g/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＧＫ培地と呼ぶ）と、ＢＴ培地にエタノール（２０ ml/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＥＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないが、ＥＫ培地には生育する形質転換株を２株得た。それらの形質転換株を次のとおり命名した。
【００７４】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーターに依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた２株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたところ、２株いずれもＥＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーターを特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定した。それらの結果は次のとおりであった。
【００７５】
【表７】
【００７６】
実施例８ 培地中のエタノールをグルコースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、前記実施例７と同様にＧＫ培地とＥＫ培地の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育するがＥＫ培地には生育しない形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０１、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０１と命名した。
【００７７】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＧ１０１はＧＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＧ１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約５５０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１５に示したとおりであった。
【００７８】
実施例９ 培地中のグルコースをフルクトースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ培地にフルクトース（２０ g/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＦＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないがＦＫ培地には生育する形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＦ１０１、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＦ１０１と命名した。
【００７９】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＦＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＦ１０１はＦＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＦ１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約２５００ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１６に示したとおりであった。
【００８０】
実施例１０ 培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物をグルコースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ培地にグルコース（
２０ g/l）、酵母エキス（１ g/l）、カゼイン加水分解（カザミノ酸)（１ g/l）およびカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＧＹＣＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育するがＧＹＣＫ培地には生育しない形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０２、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０２と命名した。
【００８１】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＧ１０２はＧＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＧ１０２株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約５７０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１７に示したとおりであった。
【００８２】
実施例１１ 培地中のグルコースをカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物に変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＧＹＣＫ培地の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないがＧＹＣＫ培地には生育する形質転換株を３株得られ、それぞれの形質転換株および保持するプラスミドを次のとおり命名した。
【００８３】
【００８４】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた３株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べたところ、３株いずれもＧＹＣＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーターを特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定した。それらの結果は次ぎのとおりであった。
【００８５】
【表８】
【００８６】
【配列表】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明で用いるプロモーター検出用ベクターの構成図。
【図２】 本発明で用いるプラスミドｐＢＲＣＭ１０２およびｐＣＭＴ４４の構築操作図。
【図３】 本発明で用いるプラスミドｐＣＫＴ１１およびｐＰＲＯＢＥ１７の構築操作図。
【図４】 プロモーター検出用ベクターｐ１７Ｂ−ｇａｌの制限酵素切断点地図。
【産業上の利用分野】
本発明はコリネ型細菌染色体由来のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に関する。
コリネ型細菌は、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸や、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産する際に用いられる工業的に重要なグラム陽性細菌であるが、組換えＤＮＡ技術の導入による菌株の育種改良は大腸菌（Escherichia coli）に比べて遅れており、遺伝的改良に利用可能な工業的に有用なベクター、特にその構成要素として用いるプロモーター、例えば強力な遺伝子発現機能を有するプロモーターや遺伝子発現の制御が可能なプロモーター等の開発が強く望まれている。
【０００２】
【従来の技術】
コリネ型細菌内で機能するプロモーターの改良に関する研究については、大腸菌由来のプロモーターを用いた例が報告されているのみである［Journal of Biotechnology, 5, 305（1987)； Gene, 102, 93（1991)］。それによると、大腸菌由来のｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターを融合させたｔａｃプロモーター［Gene, 20, 231（1982)］がコリネ型細菌内で構成的（constitutive）に最も強い機能を有するプロモーターとして記載されている。しかしながら、本願発明者等の知るかぎり、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強い機能を有するプロモーターは現在のところ開発されていない。
【０００３】
また、コリネ型細菌で人為的に有用遺伝子の発現を制御する方法については、大腸菌由来の制御可能なプロモーターをそのままコリネ型細菌に適用した例がある［Bio/Technology, 6, 428（1988)］。しかし、該発現制御法は大腸菌を宿主とした場合に比べて遺伝子産物の蓄積量が少なく十分に強力な発現方法とは言い難い。
従って、コリネ型細菌内で有用遺伝子を効率よく発現させるためには、コリネ型細菌内で種々の機能、例えば、強力な発現機能を有するプロモーターあるいは培地の組成条件を変えることにより発現制御可能な機能を有するプロモーターを新たに取得する必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、コリネ型細菌内で有用遺伝子を高効率に発現させうるプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、即ち大腸菌由来のｔａｃプロモーターより強い機能を持つプロモーターＤＮＡをコリネ型細菌染色体から見いだすこと、およびコリネ型細菌内で有用遺伝子の発現を人為的に制御可能なプロモーターＤＮＡをコリネ型細菌染色体から見いだすことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討の結果、本願発明者等が新たに構築したプロモーター検出用ベクター（promoter probe shuttle vector）、即ち、
ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子、
の５つのＤＮＡ領域を有するプロモーター検出用ベクターを用いれば、上記した特性を有するプロモーターＤＮＡ断片をコリネ型細菌から検出可能なことを見い出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
かくして、本発明によれば、
（１）コリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
特に、 ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子、
の５つのＤＮＡ領域を有するプロモータ検出用ベクターを用いてコリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内でｔａｃプロモータよりも強いプロモータ機能を有するＤＮＡ断片；
ＤＮＡ断片を下記の５つのＤＮＡ領域を有するプロモーター検出用ベクターに連結させた後、電気パルス法でブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株に形質転換したときに、得られた形質転換株が、ｔａｃプロモータを連結した該プロモータ検出ベクターを電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株に形質転換したものよりも強いカナマイシン耐性を付与するプロモーター機能を有する該ＤＮＡ断片：
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域）、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子；
配列番号：１〜配列番号：１２で示される塩基配列及び配列番号：１〜配列番号で示される塩基配列に対して１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列より成る群から選ばれる少くとも１つの塩基配列からなるコリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
（２）コリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少くとも１つの物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な少くとも１つの他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が提供される。
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】
本明細書において、いくつかの術語を用いるが、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有する。
「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域のことを言う。
「ｔａｃプロモーター」とは、大腸菌（Escherichia coli）のトリプトファン・オペロン・プロモーター（tryptophan operon promoter）の−３５領域の配列とラクトース・オペロン・プロモーター（lactose operon promoter）の−１０領域の配列を融合させたプロモーターを言う。
「プロモーター機能を有するＤＮＡ断片」とは、天然に存在する染色体ＤＮＡから得られるＤＮＡ断片または人工的に合成されたＤＮＡ断片であり、該ＤＮＡ断片は遺伝子の転写を開始する機能を有し、すなわち遺伝子の転写能力を有しており、該ＤＮＡ断片中に上記プロモーターが含まれていると推定されるＤＮＡ断片を意味する。
【０００８】
「ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片」とは、上記プロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、遺伝子の転写能力がｔａｃプロモーターの転写能力よりも強い転写能力を有するＤＮＡ断片を意味する。「プロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片」とは、上記したプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、該ＤＮＡ断片を保有する宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を変更することにより、該ＤＮＡ断片の有する遺伝子の転写を開始する機能を自由に誘導しうる、すなわち抑制されていた該機能を解除・誘導することができ又は解除・誘導されていた該機能を抑制することができるＤＮＡ断片を意味するものである。
「コリネ型細菌（Coryneform bacteria）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌を意味する。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述べるようなコリネ型細菌が本発明においてプロモーターＤＮＡの遺伝子源あるいは宿主微生物として好ましいものである。
【０００９】
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6871
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC 14066
ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム（Brevibacterium immariophilium）ATCC 14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）ATCC 13825
ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）ATCC 9174
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ATCC 13826
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）
ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO 12144 （FERM BP-2515）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）ATCC 19240
コリネバクテリウム・アセトアシドフィリウム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC 13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ATCC 15806
コリネバクテリウム・カルナ（Corynebacterium callunae）ATCC 15991
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032, ATCC 13060
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）ATCC 15990
コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）ATCC 17965
【００１０】
また、これらのコリネ型細菌の培養は、それ自体既知の通常用いられるコリネ型細菌培養用の培地で培養し、培養物から菌体を取得することができる。
本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、その塩基配列が決定された後においては合成することも可能であるが、通常は天然に存在する微生物染色体から得られる場合が多く、その供給源となる微生物としては、上記コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）が有利に使用される。
上記コリネ型細菌からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離する方法としては、まず染色体ＤＮＡを抽出し（例えば、Biochimica et Biophysica Acta., 72, 619（1963）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵素で、染色体ＤＮＡを比較的短いＤＮＡ断片になるように切断する。そのためには、４塩基配列を認識する制限酵素例えば、ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、ＡｃｃII、ＡｆａＩ等を用い、単独あるいは数種類の組み合わせで切断することが好ましい。
【００１１】
このようにして得られた染色体ＤＮＡ切断物からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離するために、プロモーター検出用ベクターを用いて行うことができる。このプロモーター検出用ベクター（promoter probe shuttle vector）としては、下記（ａ）〜（ｅ）の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明者等が新たに構築したベクターが好ましい。
ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域、
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域、
ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域、
ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子。
【００１２】
上記プロモータ検出用ベクターの構築に必要とされる、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域（以下これを「ａ領域」と言うことがある）としては、大腸菌内でプラスミドの自律複製を司る機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（日本ジーン社製）等から得られるＤＮＡ断片等を用いることができる。
上記ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域（以下これを「ｂ領域」と言うことがある）としては、コリネ型細菌内でプラスミドの自律複製を司る機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、例えばプラスミドｐＣＲＹ３［ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-2513）が保有するプラスミド；米国特許第５,１８５,２６２号参照］、プラスミドｐＣＲＹ２［ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３ ＧＥ１０１（FERM BP-2512）が保有するプラスミド；米国特許第５,１８５,２６２号］、プラスミドｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６７９号公報参照）、プラスミドｐＭＨ１５１９（特開昭５８−７７８９５号公報参照）等を用いることができる。
【００１３】
上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker gene）を含むＤＮＡ領域（以下これを「ｃ領域」又は「マーカー遺伝子（marker gene）」と言うことがある）としては、プラスミドのマーカーとして用いることができ、かつ上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域と異なる表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ断片であれば特に制限がなく、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｖｕII部位にトランスポゾン（Transposon）９［Nature, vol.293, pp.309-311（1981)参照］のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むサイズ（大きさ）が約３.０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片を挿入することにより構築されたプラスミドｐＪＣＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,３００ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、プラスミドｐＣＭ７（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切り出すことによって得られる大きさが７８７６ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが７９２ｂｐのクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ・ジンブロック（Chloramphenicol Acetyltransferase GenBlock；ファルマシア社製）、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,４２６ｂｐのテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片等を用いることができる。
【００１４】
上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ領域（以下これを「ｄ領域」又は「レポーター遺伝子（reporter gene)」と言うことがある）としては、プラスミドのマーカーとして用いることができ、かつそれ自身のプロモーターが欠如している遺伝子であって、上記ｃ）のプラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域であれば特に制限がなく、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位にトランスポゾン（Transposon）５［Molecular and General Genetics, vol.177, p.65（1979）参照］のＮＰＴII（カナマイシン耐性遺伝子）を含むサイズ（大きさ）が約５.９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を挿入することにより構築されるプラスミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が約１.６ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、プラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,４９４ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが１２８２ｂｐのカナマイシン・レジスタンス・ジンブロック（Kanamycin Resistance GenBlock；ファルマシア社製）、プラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社製）あるいはｐＳＧＭＵ３２（ファルマシア社製）をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩまたはＳａｃＩとＳａｌＩで切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）がそれぞれ３,１１７ｂｐあるいは約３.３ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）遺伝子を含むＤＮＡ断片等を用いることができる。
【００１５】
さらに、上記ｅ）レポーター遺伝子（reporter gene）（ｄ領域）の上流に位置する転写終結因子（transcriptional terminator）（以下これを「ｅ領域」または「転写終結因子」と言うことがある）としては、次の塩基配列（配列番号：２１）：
5’AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT 3'
3’TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA 5'
を有する大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子であるｔｒｐＡターミネーターをＤＮＡ合成機で化学合成したものを用いることができる。
次に、上記ａ領域〜ｅ領域の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の取得に用いるプロモーター検出用ベクターの構築方法を述べる。
【００１６】
まず、ａ領域とｃ領域（以後、このマーカー遺伝子をプラスミド選択の指標として用いてプロモーター検出用ベクターを構築する）をＤＮＡリガーゼで連結させてマーカー遺伝子を保有する大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドを作成する。次に、このａ領域とｃ領域を保有するプラスミドを適当な制限酵素で開裂し、そこに転写終結因子（ｅ領域）をＤＮＡリガーゼにより連結し、さらにｅ領域（レポーター遺伝子）を転写終結因子の下流に連結する。最後に、この転写終結因子の下流にレポーター遺伝子（ｄ領域）が連結されたマーカー遺伝子（ｃ領域）を保有し大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドを適当な制限酵素で開裂し、ｂ領域をＤＮＡリガーゼで連結することにより、プロモーター検出用ベクターを構築することができる。
【００１７】
かくして構築されるプロモーター検出用ベクターの具体例としては、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（プラスミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＢｓｔＹ１とＰｖｕIIで切断して得られるサイズが１.１ｋｂのＤＮＡ断片にプロモーターを結合したＤＮＡ断片）、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（プラスミドｐＣＲＹ３を制限酵素ＸｈｏＩで切断して得られるサイズが４.０ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（プラスミドｐＪＣＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断して得られるサイズが１.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｄ）プロモーターが欠如しているカナマイシン耐性遺伝子（プラスミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（前記した６１ｂｐの合成ＤＮＡ断片）、
より成るプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７、ならびに、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
ｄ）プロモーターが欠如しているβ−ガラクトシターゼ遺伝子（プラスミドｐＳＧＭＵ２２を制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤＮＡ断片）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、
より成るプラスミドｐ１７Ｂｇａｌを挙げることができる。
【００１８】
なお、図２および図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の構築方法の詳細については後記実施例１で述べる。またプラスミドｐ１７Ｂｇａｌの制限酵素切断点地図を図４に示す。
以上のようにして作成したプロモーター検出用ベクターを用いて、コリネ型細菌染色体から本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離する方法を述べる。
【００１９】
上記プロモーター検出用ベクターを、それ自体既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法［Agricultural and Biological chemistry., 54, 443（1990）参照］等でコリネ型細菌へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、レポーター遺伝子（ｃ領域）が発現しない（レポーター遺伝子はプロモーター領域が欠如しているのでこの状態では発現しない）ことを確認しておく。ここで、レポーター遺伝子の発現の有無および発現強度の測定は、レポーター遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行うことができる。また発現の有無および発現強度は、形質転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中のレポーター遺伝子の発現産物を、レポーター遺伝子の発現産物の性質を利用して調べることもできる。
【００２０】
例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼである場合は、β−ガラクトシダーゼの基質となる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を含有する選択培地で培養し、形質転換株の形成するコロニーの色、即ち、β−ガラクトシダーゼの発現によりＸ−ｇａｌが分解され、コロニーが青色を呈色することにより判別することができる。
【００２１】
レポーター遺伝子がコリネ型細菌内で発現していないことが確認できたプロモーター検出用ベクターの、レポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領域）の間を該部位を認識する適当な制限酵素で開裂する。このＤＮＡ断片と前記コリネ型細菌染色体を４塩基配列を認識する制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片とをＤＮＡリガーゼで連結し、コリネ型細菌へ電気パルス法等により導入する。
かくして得られる形質転換株を培養し、前記したレポーター遺伝子の確認法によりレポーター遺伝子の発現が認められる形質転換株を採取することにより、プロモーター機能を有するＤＮＡ断片を保有するプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌を取得することができる。このレポーター遺伝子発現能を有するコリネ型細菌から、次に述べる方法により、本願発明のＤＮＡ断片を取得することができる。
【００２２】
先ず、本願発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の取得法について述べる。
プロモーター機能の強さの指標となる前記ｔａｃプロモーターを前記プロモーター検出用ベクターのレポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領域）の間に前記方法で挿入し、このプラスミドでコリネ型細菌を前記電気パルス法により形質転換し前記方法によりレポーター遺伝子の発現強度を調べる。ここでｔａｃプロモーターは、プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得られる９６ｂｐのＤＮＡ断片またはＤＮＡ合成機で人工的に合成されたＤＮＡ断片を用いることができる。
【００２３】
上記で得られたｔａｃプロモーターが導入されたプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌のレポーター遺伝子発現強度より強いレポーター遺伝子の発現強度を有する前記コリネ型細菌染色体から得られたＤＮＡ断片が導入されたプロモーター検出用ベクターで形質転換されたコリネ型細菌を選ぶことにより、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するプロモーターを保有する形質転換株を取得することができる。
得られた形質転換株が、プロモーター検出用ベクターに挿入されたプロモーターに依存してレポーター遺伝子の発現が強化されたのかどうかを判定するために、即ち、該プロモーター以外の機能として宿主染色体上に変異が起きレポーター遺伝子の発現が強化された場合と区別するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し同様にレポーター遺伝子の発現強度を測定し、レポーター遺伝子の発現の強化が、導入されたコリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片に依存する形質転換株を取得する。
【００２４】
かくして得られる形質転換株の具体例としては、前記プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３であって５００ μg/ml 以上のカナマイシン耐性濃度を有する（カナマイシン５００ μg/ml を含有する培地で生育する）形質転換株１２株が挙げられる。これら形質転換株および保有するプラスミドを次のとおり命名した。
【００２５】
【表１】
これら形質転換株のカナマイシン耐性濃度は下記第１表に示すとおりである。なお、プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７のＥｃｏＲＶ部位にｔａｃプロモーターが挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３のカナマイシン耐性濃度は５００ μg/ml 未満であり、カナマイシン５００ μg/ml を含有する培地で形質転換株は生育しなかった。
【００２７】
【表２】
このようにして得られる形質転換株からの本願発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列の決定は次のとおり行うことができる。
まずプロモーター検出用ベクターの前記コリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片が挿入された制限酵素部位（ｄ領域とｅ領域の間の制限酵素部位）の上流および下流の配列に相当する塩基配列を化学合成し、プライマーＤＮＡとする。この場合、プロモーター検出用ベクターがｐＰＲＯＢＥ１７である時は、ｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側および３’側の配列に相当する以下に示す塩基配列：
GATCAGATCCCAGAATTGAT （５’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２２）
TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （３’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２３）
を化学合成しプライマーＤＮＡとする。
【００２９】
次に、前記で得られた形質転換株からプラスミドＤＮＡを抽出し、上記プライマーＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（パーキンエルマー・シータス社製）を用い、ＰＣＲ法［Nature, 324, 163(1986）参照］により挿入されたＤＮＡ断片部分のみを増幅することができる。この増幅されたＤＮＡ断片のサイズはアガロースゲル電気泳動により、分子量既知のＤＮＡ断片（例えばｐＨＹマーカー；宝酒造社製等）の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき算出することができる。次に上記で得られた挿入ＤＮＡ断片の塩基配列は、上記ＰＣＲに用いたプライマーを再度用いまた上記ＰＣＲ産物を鋳型にし、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Chaintermination method；Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, 74, 5463（1977）参照〕により決定することができる。
【００３０】
かくして決定された前記で得られた形質転換株１２株のプロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は次のとおりである。
【００３１】
【表３】
上記の塩基配列を含有して成る本発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製、３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよい。
また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得される本発明のＤＮＡ断片は、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を実質的に損なう事がない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよくまたは削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
次に、本発明のコリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片について説明する。
【００３３】
ここで、「コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質」とは、コリネ型細菌の生育に必要な炭素源、窒素源、その他の栄養素となり得る物質を意味するものであり、例えば、グルコース、フルクトース、エタノール、メタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、アミノ酸、尿素、廃糖密、硫酸アンモニウム等を挙げることができる。これらの中で特にグルコース、フルクトース、エタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物を好適に用いることができる。これらの物質は、最少培地に、単独にあるいは数種類に組合せて添加して用いることができる。培地中のこれらの物質の濃度は、コリネ型細菌が利用可能な濃度であれば特に制限はないが、通常、グルコースの場合は５％〜０.０１％、エタノールの場合は５％〜０.０１％、フルクトースの場合は５％〜０.０１％、カゼイン加水分解物の場合は１％〜０.０１％、酵母抽出物の場合は１％〜０.０１％の範囲内が適当である。
【００３４】
また、最少培地とはコリネ型細菌の生育に必須な化学構造が既知の培地成分よりなる培地のことを意味し、具体的にはグルコースやエタノール等の化学構造が既知の炭素源；アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の窒素源；リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩；ビオチン、ビタミン等のその他栄養素等のコリネ型細菌の生育に必須な成分のみからなる培地を意味するものである。
本願発明のプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片は次のとおり取得することができる。
【００３５】
まず、前記のコリネ型細菌染色体から得られるＤＮＡ断片が挿入されたプロモーター検出用ベクターが導入されたコリネ型細菌を、最少培地で培養し、マーカー遺伝子の発現を前記方法により確認し、プロモーター検出用ベクターが導入された形質転換株を得る。次に、最少培地に前記コリネ型細菌が利用可能な物質を加えた培地で上記で得られた各形質転換株を培養し、レポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。さらに最少培地に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更して各形質転換株のレポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。かくして、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を、宿主コリネ型細菌が利用可能な他の物質に変更することにより、レポーター遺伝子の発現が制御可能な形質転換株を得ることができる。
【００３６】
次に、得られた形質転換株が、プロモーター検出用ベクターに挿入されたＤＮＡ断片に依存し上記レポーター遺伝子の発現の制御が可能となったのかどうかを判定するために、即ち該プロモーター以外の機能として宿主染色体上に変異が起きたためにレポーター遺伝子の発現の制御が可能となる場合と区別するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様に最少培地に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更してレポーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。
【００３７】
ここで、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少くとも１つの物質を、宿主コリネ型細菌が利用可能な少くとも１つの他の物質に変更する方法については特に制限されるものではなく、例えば次のような方法も含まれる。
（１）利用可能な物質を含有する培地で細胞を培養し、通常用いられる遠心分離または濾過分離により集菌し、得られた菌体を、利用可能な他の物質を含有する培地に植え代えるか、もしくは（２）培地中の利用可能な物質を完全に消費した後に、利用可能な他の物質を培地に添加する。
【００３８】
このようにして、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を他の物質に変更することによりプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が挿入されたプロモーター検出用ベクターが導入された形質転換株を得ることができる。
この形質転換株の具体例としては、前記プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３であって、次の性質を有する菌株を挙げることができる。それらの形質転換株および保有するプラスミドをそれぞれ次のとおり命名した。
【００３９】
（ｉ）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをエタノールに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
（ii）培地中のエタノールによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のエタノールをグルコースに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
（iii）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをフルクトースに変えることによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
（iv）培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物によりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースをグルコースに変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
（ｖ）培地中のグルコースによりレポーター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培地中のグルコースをカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物に変更することによりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：
このようにして得られる本発明のプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は前記したと同様の方法で決定することができる。前記方法で決定された上記形質転換株のプロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は次のとおりである。なお、挿入ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断して得られる切断断片のサイズ（大きさ）はアガロースゲル電気泳動で求めた値である。
【００４５】
【表４】
上記の塩基配列およびＤＮＡ断片を含有して成る本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよい。また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得される本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能および該プロモーターの制御機能を実質的に損なう事がない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよくまたは削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００４７】
上記で詳述したコリネ型細菌由来の本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の下流に発現させるべき目的の遺伝子を連結し、それをコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドベクターに挿入後、このプラスミドをコリネ型細菌へ導入し、該コリネ型細菌を用いて目的とする遺伝子を高効率に発現させることが可能となる。本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に直接接続されるところの発現させるべき遺伝子は、微生物起源のもの、植物起源のもの、動物起源のもの、人工的に合成されたもの等いずれでもよい。また発現されるべき遺伝子の発現産物は、アミノ酸、有機酸、ビタミン、脂質等の生体内物質の生合成あるいは代謝に関わる酵素、タンパク質、油脂、抗生物質等の生理活性物質の生合成あるいは代謝に関わる酵素である。
【００４８】
また、本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域を有するものであれば特に制限はない。コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域を有するプラスミドベクターとしては、例えば、
（１）ｐＡＭ３３０［Agricultural and Biological Chemistry, 48, 2901（1986)］
（２）ｐＣＧ４［Journal of Bacteriology, 159, 306（1984)］
（３）ｐＳＲ１［Journal of Bacteriology, 162, 591（1985)］
（４）ｐＢＹ５０３［Journal of Industrial Microbiology, 5, 159（1990)］
（５）ｐＢＬ１［Journal of Bacteriology, 162, 463（1985)］
（６）ｐＨＭ１５１９［Gene, 39, 281（1985)］
（７）ｐＣＧ１［Molecular and General Genetics, 196, 175（1984)］
（８）ｐＣＧ１００［Journal of General Microbiology, 137, 2093（1991)］
等を挙げることができる。もちろん、これらのプラスミドベクターから得られたコリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域が組み込まれたプラスミドベクターもまた好適に用いることができる。
【００４９】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１ プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の構築
作成は図２および図３に示すスキームにより行った。
先ず、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ ＤＮＡ １０μｇを、制限酵素ＰｖｕIIとＢｓｔＹＩの両酵素で３７℃、１時間保温することにより切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、大腸菌内で複製増殖能を担うＤＮＡ領域（ＯＲＩ）１.１ｋｂ断片をゲルから切り出し溶出精製し、ＤＮＡ １.５μｇを得た。
【００５０】
次に得られたＤＮＡ断片は、ｐＢＲ３２２の複製制御因子であるＲＮＡＩのプロモーター部分が欠けているため、以下に示す合成ＤＮＡ（配列中に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を含む）
▲１▼ 5’GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGATCCCAG 3’(配列番号：２４)
▲２▼ 3’ AGTTCT TCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCTAGGGTC 5’
を、▲１▼と▲２▼の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化学合成（アプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５０℃にて５時間保温することによりアニーリングし、上記に示す二本鎖ＤＮＡを５μｇ得た。得られた合成ＤＮＡ ５μｇと前述の１.１ｋｂＤＮＡ断片 １.５μｇとを混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた（ａ領域)。
【００５１】
次に連結物を制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温することにより切断し、トランスポゾンＴｎ９のクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つプラスミドｐＪＣＭ１ １μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温することにより切断した（ｃ領域）。６５℃で１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＢＲＣＭ１０２と命名したプラスミドが得られた。
【００５２】
次に、得られたプラスミドｐＢＲＣＭ１０２のＤＮＡ ５μｇを制限酵素ＰｖｕIIを用い３７℃、５分間保温により部分切断を行い、複製増殖能を担うＤＮＡ領域（ＯＲＩ）の３’側のＰｖｕII部位に、以下に示す配列（配列番号：２１) ▲３▼ 5'AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT3'
▲４▼ 3'TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA5'
からなる大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター（ｅ領域、以下これを「ｔｅｒｍ」と称す）を、▲３▼と▲４▼の一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化学合成（アプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５０℃にて５時間保温することによりアニーリングし、上記に示す二本鎖ＤＮＡを５μｇ得た。
【００５３】
上記部分切断物５μｇと合成ＤＮＡ ５μｇを混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照]、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＣＭＴ４４と命名したプラスミドが得られた。
【００５４】
次に、図３に示す、プラスミドｐＫＰＧ１３ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで３７℃、１時間保温により、カナマイシン耐性遺伝子自身のプロモーターを含まないように切断し、アガロースゲル電気泳動し、１.５ｋｂ断片のカナマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子部分のみをゲルから切り出し、溶出精製し、ＤＮＡ １μｇを得た（ｄ領域：レポーター遺伝子)。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＭＴ４４ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、５分間保温し部分切断を行ったものと混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図３に示すｐＣＫＴ１１と命名したプラスミドが得られた。
【００５５】
次に、コリネ型細菌内で複製増殖能を持つプラスミドｐＣＲＹ３を保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ ＧＥ１０２（FERM BP-2513）から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＸｈｏＩを用い、３７℃、１時間保温により切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、４.０ｋｂのコリネ型細菌内で複製増殖能をもつＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶出精製し、２.５μｇを得た（ｂ領域）。得られたＤＮＡ断片２.５μｇと、プラスミドｐＣＫＴ１１ ＤＮＡ １μｇを制限酵素ＸｈｏＩで３７℃、１時間保温により切断したものを混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。
【００５６】
得られた連結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール ５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水 １リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989(1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、図３に示すｐＰＲＯＢＥ１７と命名したプラスミドが得られた。
【００５７】
以上のようにして構築したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７は、
ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域、
ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域、
ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー、
ｄ）カナマイシン耐性遺伝子（但し、プロモーター領域が欠如）、
ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結因子ｔｒｐＡターミネーター、
から構成される。
【００５８】
実施例２ プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７のコリネ型細菌への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株を１００ｍｌのＡ培地［尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス ２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０ｇおよび蒸留水 １リットル］を用い３３℃で対数増殖中期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット/ｍｌになるように添加して、さらに２時間培養後、遠心分離により集菌し、菌体を２０ｍｌの滅菌水およびパルス用緩衝液［２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2：ｐＨ７.４］でそれぞれ洗浄した。
【００５９】
さらに菌体を遠心分離により集菌し、２ｍｌの上記パルス用緩衝液に懸濁し、１２０μｌの菌体懸濁液と前記実施例１で得られたプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ＤＮＡ ５μｌとを混合し、氷中に１０分間静置した。ジーンパルサ（バイオラッド社製）を用いて、１９５０ボルト、２５μＦＤに設定しパルスを印加後、氷中に１０分間放置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地にて懸濁し、懸濁液を３３℃にて１時間培養後、クロラムフェニコールを３ μg/ml（最終濃度）含む前記Ａ寒天培地［寒天はＡ培地１リットル当たり１６ｇを添加］に塗沫し３３℃で２日培養した。出現したクロラムフェニコール耐性株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、前記実施例１で構築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７であることを確認した。
【００６０】
次に、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７は、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域が欠如しているため、同プラスミドのみをコリネ型細菌内に導入した場合カナマイシン感受性を示すことを確認するために、カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日培養したところ同培地上では全く生育しなかった。このことより、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７のカナマイシン耐性遺伝子の上流に挿入した転写終結因子ｔｒｐＡターミネーターの有効性、即ち、コリネ型細菌内でのプラスミド上のリードスルーによるカナマイシン耐性遺伝子の発現が全く無いことを確認した。
【００６１】
実施例３ 大腸菌由来ｔａｃプロモーターのコリネ型細菌内での強度測定
ｔａｃプロモーターの調製は、プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）から得る事とし、同プラスミドＤＮＡ ２５μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで３７℃、一時間保温し、アガロースゲル電気泳動し、９６ｂｐのｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をゲルから切り出し、溶出精製し、０.５μｇを得た。得られたＤＮＡ断片０.５μｇをＳ１ヌクレアーゼで３７℃、１時間保温することにより平滑末端化し、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ ５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶで３７℃、１時間保温することにより切断平滑末端化したものと混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。
【００６２】
得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換株の選択は、カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）を含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で２日培養した。出現したカナマイシン耐性株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989(1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、前記実施例１で構築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に２７０ｂｐのｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【００６３】
次に得られたカナマイシン耐性株を用い、カナマイシン濃度（培地に添加するカナマイシンの濃度）を調べる事により、導入したｔａｃプロモーターのコリネ型細菌内での強度について調べた。その結果、カナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日間培養したところ、上記カナマイシン耐性形質転換株は生育しない（カナマイシン１００ μg/ml を含有する培地で生育する）ことを確認した。
【００６４】
実施例４ コリネ型細菌染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株を１００ｍｌの前記Ａ培地に植え、３３℃にて対数増殖後期まで培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体を１０ mg/ml の濃度にリゾチームを含むリゾチーム反応液［１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。次に、プロテナーゼＫを最終濃度が１００ μg/ml になるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になるように添加し、５０℃で１時間保温して溶菌させた。この溶菌液に、等量のフェノール・クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振とうした後、全量を遠心分離し、上清画分を分取した。上清画分に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え、遠心分離し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させた。乾燥させたＤＮＡを、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａの混合液５ｍｌに溶解させ染色体ＤＮＡを得た。
【００６５】
実施例５ コリネ型細菌染色体からの大腸菌由来ｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の単離
上記実施例４で得られた染色体ＤＮＡ ２０μｇを、４塩基認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIを用い、３７℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７℃で１時間保温することにより切断を行った。両切断物を混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換株の選択は、カナマイシンを５００、７５０、
１０００、１５００ μg/ml（最終濃度）をそれぞれ含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養した。その結果、前記第１表に示したとおり、５００ μg/ml 以上のカナマイシンを含有する培地で生育する形質転換株が１２株得られた。それらの形質転換株および保持するプラスミドを次のとおり命名した。
【００６６】
【表５】
上記１２株のカナマイシン耐性株から、それぞれ常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出した。
得られたプラスミドＤＮＡを用い、再度ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換し、カナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）を含有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養したところ、前記１２株から抽出したプラスミドＤＮＡを用いた場合、いずれも生育することが判明し、全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたコリネ型細菌染色体由来のＤＮＡ断片に依存すること、即ち挿入されたＤＮＡ断片はｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であることを確認した。
【００６８】
次に、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズを決定した。まずプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側および３’側の配列に相当する以下に示す塩基配列のプライマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。
５’側プライマーＤＮＡ GATCAGATCCCAGAATTGAT （配列番号：２２）
３’側プライマーＤＮＡ TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （配列番号：２３）
【００６９】
次に、上記で得られた１２株の形質転換株からプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲ法［Nature, 324, 163(1986）参照］により挿入されたＤＮＡ断片部分のみを増幅させ、１％アガロースゲル電気泳動によりサイズを決定した。ＤＮＡ断片のサイズは、ｐＨＹマーカー（宝酒造社製）の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき算出した。また、これらＤＮＡ断片の塩基配列を、上記ＰＣＲに用いたプライマーを再度用い、上記で得られたＰＣＲ産物を鋳型にし、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Chain termination method：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463（1977）参照］により決定した。その結果は次のとおりであった。
【００７０】
【表６】
実施例６ コリネ型細菌染色体からの制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
実施例４で得られた染色体ＤＮＡ ２０μｇを、４塩基認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIII を用い、３７℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ ＤＮＡ １０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７℃で１時間保温することにより切断を行った。両切断物を混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。
【００７２】
形質転換株の選択は、ＢＴ培地［尿素２ｇ、(ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ビオチン２００ μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、寒天 １６ｇおよび蒸留水 １リットル］にクロラムフェニコールを５ｍｇおよびグルコースを２０ｇを添加した培地（最少培地）に塗沫し３３℃で３日培養した。これによりクロラムフェニコール耐性株１００,０００株を得た。
次に、それぞれ性質の異なる制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索法について順次説明する。
【００７３】
実施例７ 培地中のグルコースをエタノールに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
上記実施例６で得られた形質転換株を、前記ＢＴ培地にグルコース（２０ g/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＧＫ培地と呼ぶ）と、ＢＴ培地にエタノール（２０ ml/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＥＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないが、ＥＫ培地には生育する形質転換株を２株得た。それらの形質転換株を次のとおり命名した。
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーターに依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた２株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたところ、２株いずれもＥＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーターを特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定した。それらの結果は次のとおりであった。
【００７５】
【表７】
実施例８ 培地中のエタノールをグルコースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、前記実施例７と同様にＧＫ培地とＥＫ培地の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育するがＥＫ培地には生育しない形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０１、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０１と命名した。
【００７７】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＧ１０１はＧＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＧ１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約５５０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１５に示したとおりであった。
【００７８】
実施例９ 培地中のグルコースをフルクトースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ培地にフルクトース（２０ g/l）とカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＦＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないがＦＫ培地には生育する形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＦ１０１、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＦ１０１と命名した。
【００７９】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＦＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＦ１０１はＦＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＦ１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約２５００ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１６に示したとおりであった。
【００８０】
実施例１０ 培地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物をグルコースに変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ培地にグルコース（
２０ g/l）、酵母エキス（１ g/l）、カゼイン加水分解（カザミノ酸)（１ g/l）およびカナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下ＧＹＣＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育するがＧＹＣＫ培地には生育しない形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０２、この形質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０２と命名した。
【００８１】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べたところ、この形質転換株ＫＧ１０２はＧＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＧ１０２株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約５７０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１７に示したとおりであった。
【００８２】
実施例１１ 培地中のグルコースをカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物に変更することにより誘導される、制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索
前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＧＹＣＫ培地の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないがＧＹＣＫ培地には生育する形質転換株を３株得られ、それぞれの形質転換株および保持するプラスミドを次のとおり命名した。
【００８３】
次に、得られた形質転換株が、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するために、得られた３株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べたところ、３株いずれもＧＹＣＫ培地でのみ生育することが判明し、この性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを確認した。
次に、上記で得られたプロモーターを特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べた方法にて決定した。それらの結果は次ぎのとおりであった。
【００８５】
【表８】
【配列表】
【００８７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明で用いるプロモーター検出用ベクターの構成図。
【図２】 本発明で用いるプラスミドｐＢＲＣＭ１０２およびｐＣＭＴ４４の構築操作図。
【図３】 本発明で用いるプラスミドｐＣＫＴ１１およびｐＰＲＯＢＥ１７の構築操作図。
【図４】 プロモーター検出用ベクターｐ１７Ｂ−ｇａｌの制限酵素切断点地図。
Claims (1)
- 配列番号１及び配列番号４で示される塩基配列並びに配列番号１及び配列番号４で示される塩基配列に対して１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列より成る群から選ばれる少なくとも１つの塩基配列からなるＤＮＡ断片であり、当該ＤＮＡ断片をプロモーターとして用い、カナマイシン耐性遺伝子をレポーター遺伝子としてコリネ型細菌内で発現させた場合、ｔａｃプロモーターを用いた場合よりも高い濃度のカナマイシン耐性を示す程度の強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片。
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