JPH0795891A

JPH0795891A - プロモーター機能を有するｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH0795891A
Application number: JP6127816A
Authority: JP
Inventors: Jiei Zupanchitsuku Toomasu; トーマス・ジェイ・ズパンチック; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-06-15
Filing date: 1994-06-09
Publication date: 1995-04-11
Anticipated expiration: 2022-09-19
Also published as: EP0629699A2; JP3979679B2; US5693781A; DE69415085D1; EP0629699A3; EP0629699B1; DE69415085T2; KR950000884A; EP0803575A1

Abstract

(57)【要約】【構成】コリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細
菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、
コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片および宿主コリネ型細菌
が利用可能な培地中の少なくとも１つの物質を宿主コリ
ネ型細菌が利用可能な少なくとも１つの他の物質に変更
することにより、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機
能が制御可能なＤＮＡ断片。【効果】本発明のＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の育種
改良に好適に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌染色体由来
のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に関する。コリ
ネ型細菌は、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ
酸や、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産する際
に用いられる工業的に重要なグラム陽性細菌であるが、
組換えＤＮＡ技術の導入による菌株の育種改良は大腸菌
（Escheric hia coli）に比べて遅れており、遺伝的改良
に利用可能な工業的に有用なベクター、特にその構成要
素として用いるプロモーター、例えば強力な遺伝子発現
機能を有するプロモーターや遺伝子発現の制御が可能な
プロモーター等の開発が強く望まれている。

【０００２】

【従来の技術】コリネ型細菌内で機能するプロモーター
の改良に関する研究については、大腸菌由来のプロモー
ターを用いた例が報告されているのみである［Journal
of Biotechnology, 5, 305（1987)； Gene, 102, 93（1
991)］。それによると、大腸菌由来のｔｒｐプロモータ
ーとｌａｃプロモーターを融合させたｔａｃプロモータ
ー［Gene, 20, 231（1982)］がコリネ型細菌内で構成
的（constitutive）に最も強い機能を有するプロモータ
ーとして記載されている。しかしながら、本願発明者等
の知るかぎり、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよ
りも強い機能を有するプロモーターは現在のところ開発
されていない。

【０００３】また、コリネ型細菌で人為的に有用遺伝子
の発現を制御する方法については、大腸菌由来の制御可
能なプロモーターをそのままコリネ型細菌に適用した例
がある［Bio/Technology, 6, 428（1988)］。しかし、
該発現制御法は大腸菌を宿主とした場合に比べて遺伝子
産物の蓄積量が少なく十分に強力な発現方法とは言い難
い。従って、コリネ型細菌内で有用遺伝子を効率よく発
現させるためには、コリネ型細菌内で種々の機能、例え
ば、強力な発現機能を有するプロモーターあるいは培地
の組成条件を変えることにより発現制御可能な機能を有
するプロモーターを新たに取得する必要がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌内で有用遺伝子を高効率に発現させうるプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片、即ち大腸菌由来のｔａ
ｃプロモーターより強い機能を持つプロモーターＤＮＡ
をコリネ型細菌染色体から見いだすこと、およびコリネ
型細菌内で有用遺伝子の発現を人為的に制御可能なプロ
モーターＤＮＡをコリネ型細菌染色体から見いだすこと
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本願発明者等は、上記目
的を達成するために鋭意検討の結果、本願発明者等が新
たに構築したプロモーター検出用ベクター（promoter p
robe shuttle vector）、即ち、ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミ
ド複製増殖ＤＮＡ領域、ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮ
Ａ領域、ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker ge
ne）を含むＤＮＡ領域、ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ
領域（それ自身のプロモーター領域が欠如している上記
ｃ）プラスミドマーカー遺伝子と異る表現型を示す遺伝
子を含むＤＮＡ領域）、ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含
むＤＮＡ領域の上流に位置する転写終結因子、の５つの
ＤＮＡ領域を有するプラスミド検出用ベクターを用いれ
ば、上記した特性を有するプロモーターＤＮＡ断片をコ
リネ型細菌から検出可能なことを見い出し本発明を完成
するに至った。

【０００６】かくして、本発明によれば、（１）コリネ
型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内でプロモータ
ー機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で
ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有す
るＤＮＡ断片、（２）コリネ型細菌染色体から得られる
コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
であって、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少く
とも１つの物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な少くと
も１つの他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片
の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が提
供される。以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【０００７】本明細書において、いくつかの術語を用い
るが、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有す
る。「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するた
めにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の
領域のことを言う。「ｔａｃプロモーター」とは、大腸
菌（Escherichia coli）のトリプトファン・オペロン・
プロモーター（tryptophan operon promoter）の−３５
領域の配列とラクトース・オペロン・プロモーター（la
ctose operon promoter）の−１０領域の配列を融合さ
せたプロモーターを言う。「プロモーター機能を有する
ＤＮＡ断片」とは、天然に存在する染色体ＤＮＡから得
られるＤＮＡ断片または人工的に合成されたＤＮＡ断片
であり、該ＤＮＡ断片は遺伝子の転写を開始する機能を
有し、すなわち遺伝子の転写能力を有しており、該ＤＮ
Ａ断片中に上記プロモーターが含まれていると推定され
るＤＮＡ断片を意味する。

【０００８】「ｔａｃプロモーターよりも強いプロモー
ター機能を有するＤＮＡ断片」とは、上記プロモーター
機能を有するＤＮＡ断片であって、遺伝子の転写能力が
ｔａｃプロモーターの転写能力よりも強い転写能力を有
するＤＮＡ断片を意味する。「プロモーター機能が制御
可能なＤＮＡ断片」とは、上記したプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片であって、該ＤＮＡ断片を保有する宿
主コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を変更するこ
とにより、該ＤＮＡ断片の有する遺伝子の転写を開始す
る機能を自由に誘導しうる、すなわち抑制されていた該
機能を解除・誘導することができ又は解除・誘導されて
いた該機能を抑制することができるＤＮＡ断片を意味す
るものである。「コリネ型細菌（Coryneform bacteri
a）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネ
イティブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Dete
rminative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）
に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム
陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌を意味す
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述べるよ
うなコリネ型細菌が本発明においてプロモーターＤＮＡ
の遺伝子源あるいは宿主微生物として好ましいものであ
る。

【０００９】ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC6871 ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium
divaricatum）ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacte
rium saccharolyticum）ATCC 14066 ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム（Brevibacte
rium immariophilium）ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseu
m）ATCC 13825 ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linen
s）ATCC 9174 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ATCC 13826 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ−２３３（FERMBP-1497）ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium s
tationis）IFO 12144（FERM BP-2515）ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium
thiogenitalis）ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィリウム（Coryne
bacterium acetoacidoph ilum）ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebact
erium acetoglutamicum）ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナ（Corynebacterium callun
ae）ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC 13032, ATCC 13060 コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lili
um）ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）ATCC 17965

【００１０】また、これらのコリネ型細菌の培養は、そ
れ自体既知の通常用いられるコリネ型細菌培養用の培地
で培養し、培養物から菌体を取得することができる。本
願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片は、その
塩基配列が決定された後においては合成することも可能
であるが、通常は天然に存在する微生物染色体から得ら
れる場合が多く、その供給源となる微生物としては、上
記コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３（FERM BP-1497）が有利に使用される。上記
コリネ型細菌からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を単離する方法としては、まず染色体ＤＮＡを抽出し
（例えば、Biochimica et Biophysica Acta., 72, 619
（1963）の方法が使用できる）、これを適当な制限酵素
で、染色体ＤＮＡを比較的短いＤＮＡ断片になるように
切断する。そのためには、４塩基配列を認識する制限酵
素例えば、ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、ＡｃｃII、ＡｆａＩ
等を用い、単独あるいは数種類の組み合わせで切断する
ことが好ましい。

【００１１】このようにして得られた染色体ＤＮＡ切断
物からプロモーター機能を有するＤＮＡ断片を単離する
ために、プロモーター検出用ベクターを用いて行うこと
ができる。このプロモーター検出用ベクター（promoter
probe shuttle vector）としては、下記（ａ）〜
（ｅ）の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明者等が新た
に構築したベクターが好ましい。ａ）大腸菌（Escherichia coli）内で機能するプラスミ
ド複製増殖ＤＮＡ領域、ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮ
Ａ領域、ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（selectable marker ge
ne）を含むＤＮＡ領域、ｄ）レポーター遺伝子（reporter gene）を含むＤＮＡ
領域、ｅ）上記ｄ）レポーター遺伝子を含むＤＮＡ領域の上流
に位置する転写終結因子。

【００１２】上記プラスミド検出用ベクターの構築に必
要とされる、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増
殖ＤＮＡ領域（以下これを「ａ領域」と言うことがあ
る）としては、大腸菌内でプラスミドの自律複製を司る
機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、例
えば、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、プラス
ミドｐＡＣＹＣ１８４（日本ジーン社製）等から得られ
るＤＮＡ断片等を用いることができる。上記ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖
ＤＮＡ領域（以下これを「ｂ領域」と言うことがある）
としては、コリネ型細菌内でプラスミドの自律複製を司
る機能を有するＤＮＡ断片であれば特に制限はないが、
例えばプラスミドｐＣＲＹ３［ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３ＧＥ１０
２（FERM BP-2513）が保有するプラスミド；米国特許第
５,１８５,２６２号参照］、プラスミドｐＣＲＹ２［ブ
レビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum）
ＭＪ２３３ＧＥ１０１（FERM BP-2512）が保有するプ
ラスミド；米国特許第５,１８５,２６２号］、プラスミ
ドｐＡＭ３３０（特開昭５８−６７６７９号公報参
照）、プラスミドｐＭＨ１５１９（特開昭５８−７７８
９５号公報参照）等を用いることができる。

【００１３】上記ｃ）プラスミドマーカー遺伝子（sele
ctable marker gene）を含むＤＮＡ領域（以下これを
「ｃ領域」又は「マーカー遺伝子（marker gene）」と
言うことがある）としては、プラスミドのマーカーとし
て用いることができ、かつ上記ｄ）レポーター遺伝子
（reporter gene）を含むＤＮＡ領域と異なる表現型を
示す遺伝子を含むＤＮＡ断片であれば特に制限がなく、
例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＰｖｕII部位にトランスポゾン（Transposon）９
［Nature, vol.293, pp.309-311（1981)参照］のクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子を含むサイズ（大きさ）が約
３.０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｖｕII断片を挿入すること
により構築されたプラスミドｐＪＣＭ１を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切り出すことによって得られるサイズ（大き
さ）が１,３００ｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝
子を含むＤＮＡ断片、プラスミドｐＣＭ７（ファルマシ
ア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切り出すことによっ
て得られる大きさが７８７６ｂｐのクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが７９２ｂｐの
クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ・
ジンブロック（Chloramphenicol Acetyltransferase Ge
nBlock；ファルマシア社製）、プラスミドｐＢＲ３２２
（宝酒造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｖａＩで切り
出すことによって得られるサイズ（大きさ）が１,４２
６ｂｐのテトラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
等を用いることができる。

【００１４】上記ｄ）レポーター遺伝子（reporter gen
e）を含むＤＮＡ領域（以下これを「ｄ領域」又は「レ
ポーター遺伝子（reporter gene)」と言うことがある）
としては、プラスミドのマーカーとして用いることがで
き、かつそれ自身のプロモーターが欠如している遺伝子
であって、上記ｃ）のプラスミドマーカー遺伝子と異る
表現型を示す遺伝子を含むＤＮＡ領域であれば特に制限
がなく、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｌＩ部位にトランスポゾン（Transposo
n）５［Molecular and General Genetics, vol.177, p.
65（1979）参照］のＮＰＴII（カナマイシン耐性遺伝
子）を含むサイズ（大きさ）が約５.９ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ−ＳａｌＩ断片を挿入することにより構築されるプラ
スミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで
切り出すことによって得られるサイズ（大きさ）が約
１.６ｋｂのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断
片、プラスミドｐＮＥＯ（ファルマシア社製）を制限酵
素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り出すことによって得
られるサイズ（大きさ）が１,４９４ｂｐのカナマイシ
ン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、大きさが１２８２ｂｐ
のカナマイシン・レジスタンス・ジンブロック（Kanamy
cin Resistance GenBlock；ファルマシア社製）、プラ
スミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア社製）あるいはｐ
ＳＧＭＵ３２（ファルマシア社製）をそれぞれ制限酵素
ＢａｍＨＩまたはＳａｃＩとＳａｌＩで切り出すことに
よって得られるサイズ（大きさ）がそれぞれ３,１１７
ｂｐあるいは約３.３ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ（β-
galactosidase）遺伝子を含むＤＮＡ断片等を用いるこ
とができる。

【００１５】さらに、上記ｅ）レポーター遺伝子（repo
rter gene）（ｄ領域）の上流に位置する転写終結因子
（transcriptional terminator）（以下これを「ｅ領
域」または「転写終結因子」と言うことがある）として
は、次の塩基配列（配列番号：２１）： 5’AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT 3' 3’TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA 5' を有する大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子
であるｔｒｐＡターミネーターをＤＮＡ合成機で化学合
成したものを用いることができる。次に、上記ａ領域〜
ｅ領域の５つのＤＮＡ領域を有する本願発明のプロモー
ター機能を有するＤＮＡ断片の取得に用いるプラスミド
検出用ベクターの構築方法を述べる。

【００１６】まず、ａ領域とｃ領域（以後、このマーカ
ー遺伝子をプラスミド選択の指標として用いてプロモー
ター検出用ベクターを構築する）をＤＮＡリガーゼで連
結させてマーカー遺伝子を保有する大腸菌内で複製増殖
可能なプラスミドを作成する。次に、このａ領域とｃ領
域を保有するプラスミドを適当な制限酵素で開裂し、そ
こに転写終結因子（ｅ領域）をＤＮＡリガーゼにより連
結し、さらにｅ領域（レポーター遺伝子）を転写終結因
子の下流に連結する。最後に、この転写終結因子の下流
にレポーター遺伝子（ｄ領域）が連結されたマーカー遺
伝子（ｃ領域）を保有し大腸菌内で複製増殖可能なプラ
スミドを適当な制限酵素で開裂し、ｂ領域をＤＮＡリガ
ーゼで連結することにより、プラスミド検出用ベクター
を構築することができる。

【００１７】かくして構築されるプラスミド検出用ベク
ターの具体例としては、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（プラ
スミドｐＢＲ３２２を制限酵素ＢｓｔＹ１とＰｖｕIIで
切断して得られるサイズが１.１ｋｂのＤＮＡ断片にプ
ロモーターを結合したＤＮＡ断片）、ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域
（プラスミドｐＣＲＹ３を制限酵素ＸｈｏＩで切断して
得られるサイズが４.０ｋｂのＤＮＡ断片）、ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（プラス
ミドｐＪＣＭ１を制限酵素ＢａｍＨＩで切断して得られ
るサイズが１.３ｋｂのＤＮＡ断片）、ｄ）プロモーターが欠如しているカナマイシン耐性遺伝
子（プラスミドｐＫＰＧ１３を制限酵素ＢｇｌIIとＢａ
ｍＨＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤＮＡ
断片）、ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結
因子ｔｒｐＡターミネーター（前記した６１ｂｐの合成
ＤＮＡ断片）、より成るプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７、
ならびに、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域（上記
ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領域
（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー（上記ｐ
ＰＲＯＢＥ１７と同一のＤＮＡ断片）、ｄ）プロモーターが欠如しているβ−ガラクトシターゼ
遺伝子（プラスミドｐＳＧＭＵ２２を制限酵素ＳａｃＩ
とＳａｌＩで切断して得られるサイズが３.３ｋｂのＤ
ＮＡ断片）、ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結
因子ｔｒｐＡターミネーター（上記ｐＰＲＯＢＥ１７と
同一のＤＮＡ断片）、より成るプラスミドｐ１７Ｂｇａ
ｌを挙げることができる。

【００１８】なお、図２および図３に示すプラスミドｐ
ＰＲＯＢＥ１７の構築方法の詳細については後記実施例
１で述べる。またプラスミドｐ１７Ｂｇａｌの制限酵素
切断点地図を図４に示す。以上のようにして作成したプ
ロモーター検出用ベクターを用いて、コリネ型細菌染色
体から本願発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を単離する方法を述べる。

【００１９】上記プラスミド検出用ベクターを、それ自
体既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス
法［Agricultural and Biological chemistry., 54, 44
3（1990）参照］等でコリネ型細菌へ導入し、形質転換
株を適当な培地で培養し、レポーター遺伝子（ｃ領域）
が発現しない（レポーター遺伝子はプロモーター領域が
欠如しているのでこの状態では発現しない）ことを確認
しておく。ここで、レポーター遺伝子の発現の有無およ
び発現強度の測定は、レポーター遺伝子が薬剤耐性遺伝
子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養し、
形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行うこと
ができる。また発現の有無および発現強度は、形質転換
株を通常用いられる培地で培養し、培地中のレポーター
遺伝子の発現産物を、レポーター遺伝子の発現産物の性
質を利用して調べることもできる。

【００２０】例えば、レポーター遺伝子がβ−ガラクト
シダーゼである場合は、β−ガラクトシダーゼの基質と
なる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を含有する選択培地
で培養し、形質転換株の形成するコロニーの色、即ち、
β−ガラクトシダーゼの発現によりＸ−ｇａｌが分解さ
れ、コロニーが青色を呈色することにより判別すること
ができる。

【００２１】レポーター遺伝子がコリネ型細菌内で発現
していないことが確認できたプラスミド検出用ベクター
の、レポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領
域）の間を該部位を認識する適当な制限酵素で開裂す
る。このＤＮＡ断片と前記コリネ型細菌染色体を４塩基
配列を認識する制限酵素で切断して得られるＤＮＡ断片
とをＤＮＡリガーゼで連結し、コリネ型細菌へ電気パル
ス法等により導入する。かくして得られる形質転換株を
培養し、前記したレポーター遺伝子の確認法によりレポ
ーター遺伝子の発現が認められる形質転換株を採取する
ことにより、プロモーター機能を有するＤＮＡ断片を保
有するプラスミド検出用ベクターで形質転換されたコリ
ネ型細菌を取得することができる。このレポーター遺伝
子発現能を有するコリネ型細菌から、次に述べる方法に
より、本願発明のＤＮＡ断片を取得することができる。

【００２２】先ず、本願発明のｔａｃプロモーターより
も強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の取得法に
ついて述べる。プロモーター機能の強さの指標となる前
記ｔａｃプロモーターを前記プロモーター検出用ベクタ
ーのレポーター遺伝子（ｄ領域）と転写終結因子（ｅ領
域）の間に前記方法で挿入し、このプラスミドでコリネ
型細菌を前記電気パルス法により形質転換し前記方法に
よりレポーター遺伝子の発現強度を調べる。ここでｔａ
ｃプロモーターは、プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマ
シア社製）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで切り
出すことによって得られる９６ｂｐのＤＮＡ断片または
ＤＮＡ合成機で人工的に合成されたＤＮＡ断片を用いる
ことができる。

【００２３】上記で得られたｔａｃプロモーターが導入
されたプラスミド検出用ベクターで形質転換されたコリ
ネ型細菌のレポーター遺伝子発現強度より強いレポータ
ー遺伝子の発現強度を有する前記コリネ型細菌染色体か
ら得られたＤＮＡ断片が導入されたプラスミド検出用ベ
クターで形質転換されたコリネ型細菌を選ぶことによ
り、ｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を
有するプロモーターを保有する形質転換株を取得するこ
とができる。得られた形質転換株が、プラスミド検出用
ベクターに挿入されたプロモーターに依存してレポータ
ー遺伝子の発現が強化されたのかどうかを判定するため
に、即ち、該プロモーター以外の機能として宿主染色体
上に変異が起きレポーター遺伝子の発現が強化された場
合と区別するために、得られた形質転換株よりプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換
し同様にレポーター遺伝子の発現強度を測定し、レポー
ター遺伝子の発現の強化が、導入されたコリネ型細菌染
色体から得られるＤＮＡ断片に依存する形質転換株を取
得する。

【００２４】かくして得られる形質転換株の具体例とし
ては、前記プラスミド検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７
の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FERM
BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａ
ｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片が挿入されたプラ
スミドで形質転換されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３であって５００ μg/ml 以上のカナマイシ
ン耐性濃度を有する（カナマイシン５００μg/ml を含
有する培地で生育する）形質転換株１２株が挙げられ
る。これら形質転換株および保有するプラスミドを次の
とおり命名した。

【００２５】

【表１】番号菌株プラスミド（１）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００１ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００１（２）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００２ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００２（３）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００３ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００３（４）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００４ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００４（５）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００５ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００５（６）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００６ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００６（７）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００７ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００７（８）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００８ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００８（９）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００９ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００９（10）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１０ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１０（11）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１１ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１１（12）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１２ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１２

【００２６】これら形質転換株のカナマイシン耐性濃度
は下記第１表に示すとおりである。なお、プラスミド検
出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７のＥｃｏＲＶ部位にｔａ
ｃプロモーターが挿入されたプラスミドで形質転換され
たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３のカナマイ
シン耐性濃度は５００ μg/ml 未満であり、カナマイシ
ン５００ μg/ml を含有する培地で形質転換株は生育し
なかった。

【００２７】

【表２】第１表培地中のカナマイシン濃度５００７５０１０００１５００（μｇ／ｍｌ）生育可能形質転換株数５４１２

【００２８】このようにして得られる形質転換株からの
本願発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター
機能を有するＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基
配列の決定は次のとおり行うことができる。まずプラス
ミド検出用ベクターの前記コリネ型細菌染色体から得ら
れるＤＮＡ断片が挿入された制限酵素部位（ｄ領域とｅ
領域の間の制限酵素部位）の上流および下流の配列に相
当する塩基配列を化学合成し、プライマーＤＮＡとす
る。この場合、プラスミド検出用ベクターがｐＰＲＯＢ
Ｅ１７である時は、ｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側および３’側の
配列に相当する以下に示す塩基配列： GATCAGATCCCAGAATTGAT （５’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２２） TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （３’側プライマーＤＮＡ)(配列番号：２３）を化学合成しプライマーＤＮＡとする。

【００２９】次に、前記で得られた形質転換株からプラ
スミドＤＮＡを抽出し、上記プライマーＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（パーキンエル
マー・シータス社製）を用い、ＰＣＲ法［Nature, 324,
163(1986）参照］により挿入されたＤＮＡ断片部分の
みを増幅することができる。この増幅されたＤＮＡ断片
のサイズはアガロースゲル電気泳動により、分子量既知
のＤＮＡ断片（例えばｐＨＹマーカー；宝酒造社製等）
の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線
に基づき算出することができる。次に上記で得られた挿
入ＤＮＡ断片の塩基配列は、上記ＰＣＲに用いたプライ
マーを再度用いまた上記ＰＣＲ産物を鋳型にし、ジデオ
キシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Chaintermination m
ethod；Proceedings of the National Academy Science
s of the United States of America, 74, 5463（197
7）参照〕により決定することができる。

【００３０】かくして決定された前記で得られた形質転
換株１２株のプロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ
１７に挿入されたＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）および
塩基配列は次のとおりである。

【００３１】

【表３】挿入ＤＮＡ断片挿入ＤＮＡ断片番号プラスミドのサイズの塩基配列（１）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００１約１３０ｂｐ配列番号：１（２）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００２約４１０ｂｐ配列番号：２（３）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００３約４２０ｂｐ配列番号：３（４）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００４約２４０ｂｐ配列番号：４（５）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００５約６００ｂｐ配列番号：５（６）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００６約５９０ｂｐ配列番号：６（７）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００７約４３０ｂｐ配列番号：７（８）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００８約８６０ｂｐ配列番号：８（９）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００９約１１９０ｂｐ配列番号：９（10）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１０約７１０ｂｐ配列番号：10 （11）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１１約１０００ｂｐ配列番号：11 （12）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１２約７４０ｂｐ配列番号：12

【００３２】上記の塩基配列を含有して成る本発明のｔ
ａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能を有する
ＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分
離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製、３８０
Ａ型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよ
い。また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得され
る本発明のＤＮＡ断片は、ｔａｃプロモーターよりも強
いプロモーター機能を実質的に損なう事がない限り、塩
基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく
または削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿
入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、本
発明のｔａｃプロモーターよりも強いプロモーター機能
を有するＤＮＡ断片に包含されるものである。次に、本
発明のコリネ型細菌染色体から得られるコリネ型細菌内
でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であって、宿主
コリネ型細菌が利用可能な培地中の物質を宿主コリネ型
細菌が利用可能な他の物質に変更することにより、該Ｄ
ＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ
断片について説明する。

【００３３】ここで、「コリネ型細菌が利用可能な培地
中の物質」とは、コリネ型細菌の生育に必要な炭素源、
窒素源、その他の栄養素となり得る物質を意味するもの
であり、例えば、グルコース、フルクトース、エタノー
ル、メタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、ア
ミノ酸、尿素、廃糖密、硫酸アンモニウム等を挙げるこ
とができる。これらの中で特にグルコース、フルクトー
ス、エタノール、カゼイン加水分解物、酵母抽出物を好
適に用いることができる。これらの物質は、最少培地
に、単独にあるいは数種類に組合せて添加して用いるこ
とができる。培地中のこれらの物質の濃度は、コリネ型
細菌が利用可能な濃度であれば特に制限はないが、通
常、グルコースの場合は５％〜０.０１％、エタノール
の場合は５％〜０.０１％、フルクトースの場合は５％
〜０.０１％、カゼイン加水分解物の場合は１％〜０.０
１％、酵母抽出物の場合は１％〜０.０１％の範囲内が
適当である。

【００３４】また、最少培地とはコリネ型細菌の生育に
必須な化学構造が既知の培地成分よりなる培地のことを
意味し、具体的にはグルコースやエタノール等の化学構
造が既知の炭素源；アンモニア、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の窒素源；
リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム等の無機塩；ビオチン、ビタミン等のその他
栄養素等のコリネ型細菌の生育に必須な成分のみからな
る培地を意味するものである。本願発明のプロモーター
機能が制御可能なＤＮＡ断片は次のとおり取得すること
ができる。

【００３５】まず、前記のコリネ型細菌染色体から得ら
れるＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド検出用ベクター
が導入されたコリネ型細菌を、最少培地で培養し、マー
カー遺伝子の発現を前記方法により確認し、プラスミド
検出用ベクターが導入された形質転換株を得る。次に、
最少培地に前記コリネ型細菌が利用可能な物質を加えた
培地で上記で得られた各形質転換株を培養し、レポータ
ー遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。さらに
最少培地に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更
して各形質転換株のレポーター遺伝子の発現の有無およ
び発現強度を調べる。かくして、宿主コリネ型細菌が利
用可能な培地中の物質を、宿主コリネ型細菌が利用可能
な他の物質に変更することにより、レポーター遺伝子の
発現が制御可能な形質転換株を得ることができる。

【００３６】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
検出用ベクターに挿入されたＤＮＡ断片に依存し上記レ
ポーター遺伝子の発現の制御が可能となったのかどうか
を判定するために、即ち該プロモーター以外の機能とし
て宿主染色体上に変異が起きたためにレポーター遺伝子
の発現の制御が可能となる場合と区別するために、得ら
れた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新たに
コリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様に最少培地
に加えるコリネ型細菌が利用可能な物質を変更してレポ
ーター遺伝子の発現の有無および発現強度を調べる。

【００３７】ここで、宿主コリネ型細菌が利用可能な培
地中の少くとも１つの物質を、宿主コリネ型細菌が利用
可能な少くとも１つの他の物質に変更する方法について
は特に制限されるものではなく、例えば次のような方法
も含まれる。（１）利用可能な物質を含有する培地で細胞を培養し、
通常用いられる遠心分離または濾過分離により集菌し、
得られた菌体を、利用可能な他の物質を含有する培地に
植え代えるか、もしくは（２）培地中の利用可能な物質
を完全に消費した後に、利用可能な他の物質を培地に添
加する。

【００３８】このようにして、宿主コリネ型細菌が利用
可能な培地中の物質を他の物質に変更することによりプ
ロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片が挿入されたプ
ロモーター検出用ベクターが導入された形質転換株を得
ることができる。この形質転換株の具体例としては、前
記プラスミド検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７の制限酵
素ＥｃｏＲＶ部位に、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３（FERM BP-1497）染色体ＤＮＡを制限酵素Ａ
ｌｕＩおよびＨａｅIIIで切断して得られるＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドで形質転換されたブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３であって、次の性質を有
する菌株を挙げることができる。それらの形質転換株お
よび保有するプラスミドをそれぞれ次のとおり命名し
た。

【００３９】（ｉ）培地中のグルコースによりレポータ
ー遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示
し)、培地中のグルコースをエタノールに変更すること
によりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性
濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：番号菌株プラスミド（13）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＥ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０１（14）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＥ１０２ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０２

【００４０】（ii）培地中のエタノールによりレポータ
ー遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示
し)、培地中のエタノールをグルコースに変更すること
によりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性
濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：番号菌株プラスミド（15）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０１

【００４１】（iii）培地中のグルコースによりレポー
ター遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示
し)、培地中のグルコースをフルクトースに変えること
によりレポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性
濃度１００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：番号菌株プラスミド（16）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＦ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＦ１０１

【００４２】（iv）培地中のカゼイン加水分解物、酵母
エキスおよびグルコースの混合物によりレポーター遺伝
子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示し)、培
地中のカゼイン加水分解物、酵母エキスおよびグルコー
スをグルコースに変更することによりレポーター遺伝子
が発現する（カナマイシン耐性濃度１００ μg/ml 以上
を示す）形質転換株：番号菌株プラスミド（17）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧ１０２ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０２

【００４３】（ｖ）培地中のグルコースによりレポータ
ー遺伝子の発現が抑制され（カナマイシン感受性を示
し)、培地中のグルコースをカゼイン加水分解物、酵母
エキスおよびグルコースの混合物に変更することにより
レポーター遺伝子が発現する（カナマイシン耐性濃度１
００ μg/ml 以上を示す）形質転換株：番号菌株プラスミド（18）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０１（19）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０２ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０２（20）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０３ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０３

【００４４】このようにして得られる本発明のプロモー
ター機能が制御可能なＤＮＡ断片のサイズ（大きさ）お
よび塩基配列は前記したと同様の方法で決定することが
できる。前記方法で決定された上記形質転換株のプロモ
ーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤ
ＮＡ断片のサイズ（大きさ）および塩基配列は次のとお
りである。なお、挿入ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切
断して得られる切断断片のサイズ（大きさ）はアガロー
スゲル電気泳動で求めた値である。

【００４５】

【表４】挿入ＤＮＡ断片挿入ＤＮＡ断片番号プラスミドのサイズの塩基配列（13）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０１約２３００ｂｐ配列番号：13 （14）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０２約５５０ｂｐ配列番号：14 （15）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０１約５５０ｂｐ配列番号：15 （16）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＦ１０１約２５００ｂｐ配列番号：16 （17）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０２約５７０ｂｐ配列番号：17 （18）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０１約１１１０ｂｐ配列番号：18 （19）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０２約２２００ｂｐ配列番号：19 （20）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０３約２３００ｂｐ配列番号：20

【００４６】上記の塩基配列およびＤＮＡ断片を含有し
て成る本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤ
ＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離
されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ
型ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってもよ
い。また前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（FERM BP-1497）の染色体ＤＮＡから取得され
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能および該プ
ロモーターの制御機能を実質的に損なう事がない限り、
塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよ
くまたは削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が
挿入されていてもよく、これらの誘導体のいずれもが、
本発明の制御可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断
片に包含されるものである。

【００４７】上記で詳述したコリネ型細菌由来の本発明
のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の下流に発現さ
せるべき目的の遺伝子を連結し、それをコリネ型細菌内
で複製増殖可能なプラスミドベクターに挿入後、このプ
ラスミドをコリネ型細菌へ導入し、該コリネ型細菌を用
いて目的とする遺伝子を高効率に発現させることが可能
となる。本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
に直接接続されるところの発現させるべき遺伝子は、微
生物起源のもの、植物起源のもの、動物起源のもの、人
工的に合成されたもの等いずれでもよい。また発現され
るべき遺伝子の発現産物は、アミノ酸、有機酸、ビタミ
ン、脂質等の生体内物質の生合成あるいは代謝に関わる
酵素、タンパク質、油脂、抗生物質等の生理活性物質の
生合成あるいは代謝に関わる酵素である。

【００４８】また、本発明のプロモーター機能を有する
ＤＮＡ断片を組み込むことができるプラスミドベクター
としては、コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増
殖ＤＮＡ領域を有するものであれば特に制限はない。コ
リネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖ＤＮＡ領域
を有するプラスミドベクターとしては、例えば、（１）ｐＡＭ３３０［Agricultural and Biological Ch
emistry, 48, 2901（1986)］（２）ｐＣＧ４［Journal of Bacteriology, 159, 306
（1984)］（３）ｐＳＲ１［Journal of Bacteriology, 162, 591
（1985)］（４）ｐＢＹ５０３［Journal of Industrial Microbio
logy, 5, 159（1990)］（５）ｐＢＬ１［Journal of Bacteriology, 162, 463
（1985)］（６）ｐＨＭ１５１９［Gene, 39, 281（1985)］（７）ｐＣＧ１［Molecular and General Genetics, 19
6, 175（1984)］（８）ｐＣＧ１００［Journal of General Microbiolog
y, 137, 2093（1991)］等を挙げることができる。もちろん、これらのプラスミ
ドベクターから得られたコリネ型細菌内で機能するプラ
スミド複製増殖ＤＮＡ領域が組み込まれたプラスミドベ
クターもまた好適に用いることができる。

【００４９】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１プロモーター検出用ベクターｐＰＲＯＢＥ１
７の構築作成は図２および図３に示すスキームにより行った。先
ず、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ１０μｇ
を、制限酵素ＰｖｕIIとＢｓｔＹＩの両酵素で３７℃、
１時間保温することにより切断し、アガロースゲル電気
泳動にかけ分離後、大腸菌内で複製増殖能を担うＤＮＡ
領域（ＯＲＩ）１.１ｋｂ断片をゲルから切り出し溶出
精製し、ＤＮＡ１.５μｇを得た。

【００５０】次に得られたＤＮＡ断片は、ｐＢＲ３２２
の複製制御因子であるＲＮＡＩのプロモーター部分が欠
けているため、以下に示す合成ＤＮＡ（配列中に制限酵
素ＢａｍＨＩ部位を含む） 5’GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGATCCCAG 3’(配列番号：２４) 3’ AGTTCT TCTAGGAAAC TAGAAAAGAT GCCTAGGGTC 5’ を、との一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化学合成（アプ
ライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型ＤＮＡ合成機
を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５０℃にて５時
間保温することによりアニーリングし、上記に示す二本
鎖ＤＮＡを５μｇ得た。得られた合成ＤＮＡ５μｇと
前述の１.１ｋｂＤＮＡ断片１.５μｇとを混合し、Ａ
ＴＰおよびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由
来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、
両ＤＮＡ鎖を連結せしめた（ａ領域)。

【００５１】次に連結物を制限酵素ＢａｍＨＩで３７
℃、１時間保温することにより切断し、トランスポゾン
Ｔｎ９のクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つプラス
ミドｐＪＣＭ１１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７
℃、１時間保温することにより切断した（ｃ領域）。６
５℃で１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰ
およびジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両Ｄ
ＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カ
ルシウム法［Journal of Molecular Biology, 53, 159
（1970）参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株
（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール５
０ｍｇを含む選択培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキ
ス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１６ｇを蒸
留水１リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生
育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9, 298
9（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラ
スミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲル
電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＢＲＣＭ
１０２と命名したプラスミドが得られた。

【００５２】次に、得られたプラスミドｐＢＲＣＭ１０
２のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＰｖｕIIを用い３７℃、
５分間保温により部分切断を行い、複製増殖能を担うＤ
ＮＡ領域（ＯＲＩ）の３’側のＰｖｕII部位に、以下に
示す配列（配列番号：２１) 5'AATTCTCGCGATAATTAATTAATAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGATATCAATT3' 3'TTAAGAGCGCTATTAATTAATTATCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTATAGTTAA5' からなる大腸菌トリプトファンオペロンの転写終結因子
ｔｒｐＡターミネーター（ｅ領域、以下これを「ｔｅｒ
ｍ」と称す）を、との一本鎖ＤＮＡを、それぞれ化
学合成（アプライド・バイオシステムズ社製３８０Ａ型
ＤＮＡ合成機を使用）し、両一本鎖ＤＮＡを混合後、５
０℃にて５時間保温することによりアニーリングし、上
記に示す二本鎖ＤＮＡを５μｇ得た。

【００５３】上記部分切断物５μｇと合成ＤＮＡ５μ
ｇを混合し、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在下、
Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃で２
４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。得られた連
結物を用い、塩化カルシウム法［Journal of Molecular
Biology, 53, 159（1970）参照］によりエシェリヒア
・コリＨＢ１０１株を形質転換し、クロラムフェニコー
ル５０ｍｇを含む選択培地［トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１６ｇ
を蒸留水１リットルに溶解］に塗沫した。上記培地上
の生育株から常法により［Nucleic Acids Research, 9,
2989（1981）参照]、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プ
ラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、図２に示すｐＣＭＴ
４４と命名したプラスミドが得られた。

【００５４】次に、図３に示す、プラスミドｐＫＰＧ１
３ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨＩで
３７℃、１時間保温により、カナマイシン耐性遺伝子自
身のプロモーターを含まないように切断し、アガロース
ゲル電気泳動し、１.５ｋｂ断片のカナマイシン耐性遺
伝子の構造遺伝子部分のみをゲルから切り出し、溶出精
製し、ＤＮＡ１μｇを得た（ｄ領域：レポーター遺伝
子)。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＭＴ４４
ＤＮＡ１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３７℃、５分間
保温し部分切断を行ったものと混合し、ＡＴＰおよびジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリ
ガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を
連結せしめた。得られた連結物を用い、塩化カルシウム
法［Journal of Molecular Biology, 53, 159（1970）
参照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形質転
換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培地
［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウ
ム５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶
解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常法により
［Nucleic Acids Research, 9, 2989（1981）参照］、
プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限
酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調
べたところ、図３に示すｐＣＫＴ１１と命名したプラス
ミドが得られた。

【００５５】次に、コリネ型細菌内で複製増殖能を持つ
プラスミドｐＣＲＹ３を保有するブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０２（FERM BP-2513）から
常法により［Nucleic Acids Research, 9, 2989（198
1）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミド
ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＸｈｏＩを用い、３７℃、
１時間保温により切断し、アガロースゲル電気泳動を行
い、４.０ｋｂのコリネ型細菌内で複製増殖能をもつＤ
ＮＡ断片をゲルから切り出し、溶出精製し、２.５μｇ
を得た（ｂ領域）。得られたＤＮＡ断片２.５μｇと、
プラスミドｐＣＫＴ１１ＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｘｈ
ｏＩで３７℃、１時間保温により切断したものを混合
し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオ
スレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結
せしめた。

【００５６】得られた連結物を用い、塩化カルシウム法
［Journal of Molecular Biology,53, 159（1970）参
照］によりエシェリヒア・コリＨＢ１０１株（宝酒造
製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを
含む選択培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１リ
ットルに溶解］に塗沫した。上記培地上の生育株から常
法により［Nucleic AcidsResearch, 9, 2989(1981）参
照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡ
を制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用
いて調べたところ、図３に示すｐＰＲＯＢＥ１７と命名
したプラスミドが得られた。

【００５７】以上のようにして構築したプラスミドｐＰ
ＲＯＢＥ１７は、ａ）大腸菌内で機能するプラスミド複製増殖領域、ｂ）コリネ型細菌内で機能するプラスミド複製増殖領
域、ｃ）クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカー、ｄ）カナマイシン耐性遺伝子（但し、プロモーター領域
が欠如）、ｅ）カナマイシン耐性遺伝子の上流に存在する転写終結
因子ｔｒｐＡターミネーター、から構成される。

【００５８】実施例２プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の
コリネ型細菌への形質転換ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）株を１００ｍｌのＡ培地［尿素２ｇ、(ＮＨ₄)₂Ｓ
Ｏ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄０.５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、Ｍｎ
ＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２.５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン
２００μｇ、グルコース２０ｇおよび蒸留水１リット
ル］を用い３３℃で対数増殖中期まで培養し、ペニシリ
ンＧを１ユニット/ｍｌになるように添加して、さらに
２時間培養後、遠心分離により集菌し、菌体を２０ｍｌ
の滅菌水およびパルス用緩衝液［２７２ｍＭシューク
ロース、７ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭＭｇＣｌ₂：ｐＨ
７.４］でそれぞれ洗浄した。

【００５９】さらに菌体を遠心分離により集菌し、２ｍ
ｌの上記パルス用緩衝液に懸濁し、１２０μｌの菌体懸
濁液と前記実施例１で得られたプラスミドｐＰＲＯＢＥ
１７ＤＮＡ５μｌとを混合し、氷中に１０分間静置し
た。ジーンパルサ（バイオラッド社製）を用いて、１９
５０ボルト、２５μＦＤに設定しパルスを印加後、氷中
に１０分間放置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地にて懸
濁し、懸濁液を３３℃にて１時間培養後、クロラムフェ
ニコールを３ μg/ml（最終濃度）含む前記Ａ寒天培地
［寒天はＡ培地１リットル当たり１６ｇを添加］に塗沫
し３３℃で２日培養した。出現したクロラムフェニコー
ル耐性株から常法により［Nucleic Acids Research, 9,
2989（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出し、該
プラスミドＤＮＡを制限酵素により切断し、アガロース
ゲル電気泳動を用いて調べたところ、前記実施例１で構
築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７であるこ
とを確認した。

【００６０】次に、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７は、カ
ナマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域が欠如してい
るため、同プラスミドのみをコリネ型細菌内に導入した
場合カナマイシン感受性を示すことを確認するために、
カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）含有する前記
Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日培養したところ同培地
上では全く生育しなかった。このことより、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７のカナマイシン耐性遺伝子の上流に挿
入した転写終結因子ｔｒｐＡターミネーターの有効性、
即ち、コリネ型細菌内でのプラスミド上のリードスルー
によるカナマイシン耐性遺伝子の発現が全く無いことを
確認した。

【００６１】実施例３大腸菌由来ｔａｃプロモーター
のコリネ型細菌内での強度測定ｔａｃプロモーターの調製は、プラスミドｐＤＲ５４０
（ファルマシア社製）から得る事とし、同プラスミドＤ
ＮＡ２５μｇを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで３
７℃、一時間保温し、アガロースゲル電気泳動し、９６
ｂｐのｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をゲルから
切り出し、溶出精製し、０.５μｇを得た。得られたＤ
ＮＡ断片０.５μｇをＳ１ヌクレアーゼで３７℃、１時
間保温することにより平滑末端化し、また前記実施例２
で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７ＤＮＡ５μｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＶで３７℃、１時間保温することに
より切断平滑末端化したものと混合し、６５℃で１０分
間加熱した後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール存在
下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによって１６℃
で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を連結せしめた。

【００６２】得られた連結物を用い、前記実施例２に記
載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換株の
選択は、カナマイシンを３０ μg/ml（最終濃度）を含
有する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で２日培養した。
出現したカナマイシン耐性株から常法により［Nucleic
Acids Research, 9, 2989(1981）参照］、プラスミドＤ
ＮＡを抽出し、該プラスミドＤＮＡを制限酵素により切
断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、
前記実施例１で構築した図３に示すプラスミドｐＰＲＯ
ＢＥ１７の制限酵素ＥｃｏＲＶ部位に２７０ｂｐのｔａ
ｃプロモーターを含むＤＮＡ断片が挿入されていること
を確認した。

【００６３】次に得られたカナマイシン耐性株を用い、
カナマイシン濃度（培地に添加するカナマイシンの濃
度）を調べる事により、導入したｔａｃプロモーターの
コリネ型細菌内での強度について調べた。その結果、カ
ナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）含有する前記
Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で４日間培養したところ、上
記カナマイシン耐性形質転換株は生育しない（カナマイ
シン１００ μg/ml を含有する培地で生育する）ことを
確認した。

【００６４】実施例４コリネ型細菌染色体ＤＮＡの調
製ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-
1497）株を１００ｍｌの前記Ａ培地に植え、３３℃にて
対数増殖後期まで培養し、遠心分離により集菌した。得
られた菌体を１０ mg/ml の濃度にリゾチームを含むリ
ゾチーム反応液［１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ８.０）、１ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ］１５
ｍｌに懸濁した。次に、プロテナーゼＫを最終濃度が１
００μg/ml になるように添加し、３７℃で１時間保温
した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.
５％になるように添加し、５０℃で１時間保温して溶菌
させた。この溶菌液に、等量のフェノール・クロロフォ
ルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振とうし
た後、全量を遠心分離し、上清画分を分取した。上清画
分に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した
後、２倍量のエタノールを加え、遠心分離し、７０％エ
タノールで洗浄した後、乾燥させた。乾燥させたＤＮＡ
を、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.５）および１ｍＭ
ＥＤＴＡ−２Ｎａの混合液５ｍｌに溶解させ染色体Ｄ
ＮＡを得た。

【００６５】実施例５コリネ型細菌染色体からの大腸
菌由来ｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片の単離上記実施例４で得られた染色体ＤＮＡ２０μｇを、４
塩基認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIIIを用い、
３７℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、
また前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１
７ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７
℃で１時間保温することにより切断を行った。両切断物
を混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよび
ジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ
リガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖
を連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２
に記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。形質転換
株の選択は、カナマイシンを５００、７５０、１００
０、１５００ μg/ml（最終濃度）をそれぞれ含有する
前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養した。その結
果、前記第１表に示したとおり、５００μg/ml 以上の
カナマイシンを含有する培地で生育する形質転換株が１
２株得られた。それらの形質転換株および保持するプラ
スミドを次のとおり命名した。

【００６６】

【表５】番号菌株プラスミド（１）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００１ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００１（２）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００２ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００２（３）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００３ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００３（４）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００４ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００４（５）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００５ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００５（６）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００６ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００６（７）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００７ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００７（８）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００８ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００８（９）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５００９ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００９（10）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１０ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１０（11）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１１ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１１（12）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Ｋｍ５０１２ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１２

【００６７】上記１２株のカナマイシン耐性株から、そ
れぞれ常法により［Nucleic AcidsResearch, 9, 2989
（1981）参照］、プラスミドＤＮＡを抽出した。得られ
たプラスミドＤＮＡを用い、再度ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）株に形質転換
し、カナマイシンを５００ μg/ml（最終濃度）を含有
する前記Ａ寒天培地に塗沫し３３℃で３日培養したとこ
ろ、前記１２株から抽出したプラスミドＤＮＡを用いた
場合、いずれも生育することが判明し、全てプラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたコリネ型細菌染色体由来
のＤＮＡ断片に依存すること、即ち挿入されたＤＮＡ断
片はｔａｃプロモーターより強いプロモーター機能を有
するＤＮＡ断片であることを確認した。

【００６８】次に、ｔａｃプロモーターよりも強いプロ
モーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、プ
ラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片のサ
イズを決定した。まずプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７の制
限酵素ＥｃｏＲＶ部位の上流および下流、即ち５’側お
よび３’側の配列に相当する以下に示す塩基配列のプラ
イマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。５’側プライマーＤＮＡ GATCAGATCCCAGAATTGAT （配列番号：２２）３’側プライマーＤＮＡ TGAGCGGGCTTTTTTTTGAT （配列番号：２３）

【００６９】次に、上記で得られた１２株の形質転換株
からプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、ＤＮＡサーマ
ルサイクラー４８０型（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲ法
［Nature, 324, 163(1986）参照］により挿入されたＤ
ＮＡ断片部分のみを増幅させ、１％アガロースゲル電気
泳動によりサイズを決定した。ＤＮＡ断片のサイズは、
ｐＨＹマーカー（宝酒造社製）の同一アガロースゲル上
での泳動距離で描かれる標準線に基づき算出した。ま
た、これらＤＮＡ断片の塩基配列を、上記ＰＣＲに用い
たプライマーを再度用い、上記で得られたＰＣＲ産物を
鋳型にし、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy Ch
ain termination method：Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, 74, 5463（1977）参照］により決定した。その結果
は次のとおりであった。

【００７０】

【表６】挿入ＤＮＡ断片挿入ＤＮＡ断片番号プラスミドのサイズの塩基配列（１）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００１約１３０ｂｐ配列番号：１（２）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００２約４１０ｂｐ配列番号：２（３）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００３約４２０ｂｐ配列番号：３（４）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００４約２４０ｂｐ配列番号：４（５）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００５約６００ｂｐ配列番号：５（６）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００６約５９０ｂｐ配列番号：６（７）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００７約４３０ｂｐ配列番号：７（８）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００８約８６０ｂｐ配列番号：８（９）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５００９約１１９０ｂｐ配列番号：９（10）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１０約７１０ｂｐ配列番号：10 （11）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１１約１０００ｂｐ配列番号：11 （12）ｐＰＲＯＢＥ１７Ｋｍ５０１２約７４０ｂｐ配列番号：12

【００７１】実施例６コリネ型細菌染色体からの制御
可能なプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検索実施例４で得られた染色体ＤＮＡ２０μｇを、４塩基
認識の制限酵素ＡｌｕＩおよびＨａｅIII を用い、３７
℃で１０時間保温することにより完全切断を行い、また
前記実施例２で調製したプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７
ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＶを用い、３７℃
で１時間保温することにより切断を行った。両切断物を
混合し、６５℃で１０分間加熱した後、ＡＴＰおよびジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリ
ガーゼによって１６℃で２４時間保温し、両ＤＮＡ鎖を
連結せしめた。得られた連結物を用い、前記実施例２に
記載の方法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（FERM BP-1497）株に形質転換した。

【００７２】形質転換株の選択は、ＢＴ培地［尿素２
ｇ、(ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０.５ｇ、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０.５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン
２００ μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、寒天１６ｇ
および蒸留水１リットル］にクロラムフェニコールを
５ｍｇおよびグルコースを２０ｇを添加した培地（最少
培地）に塗沫し３３℃で３日培養した。これによりクロ
ラムフェニコール耐性株１００,０００株を得た。次
に、それぞれ性質の異なる制御可能なプロモーター機能
を有するＤＮＡ断片の検索法について順次説明する。

【００７３】実施例７培地中のグルコースをエタノー
ルに変更することにより誘導される、制御可能なプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片の検索上記実施例６で得られた形質転換株を、前記ＢＴ培地に
グルコース（２０ g/l）とカナマイシン（１００ μg/m
l）を添加した培地（以下ＧＫ培地と呼ぶ）と、ＢＴ培
地にエタノール（２０ ml/l）とカナマイシン（１００
μg/ml）を添加した培地（以下ＥＫ培地と呼ぶ）の両培
地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。その
結果、ＧＫ培地には生育しないが、ＥＫ培地には生育す
る形質転換株を２株得た。それらの形質転換株を次のと
おり命名した。番号菌株プラスミド（13）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＥ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０１（14）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＥ１０２ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０２

【００７４】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたプロモーターに依存しカ
ナマイシン含有培地に生育したものかどうかを判定する
ために、得られた２株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、
新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧ
Ｋ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたところ、
２株いずれもＥＫ培地でのみ生育することが判明し、こ
の性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入された
プロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存することを
確認した。次に、上記で得られたプロモーターを特定す
るために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤ
ＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べ
た方法にて決定した。それらの結果は次のとおりであっ
た。

【００７５】

【表７】挿入ＤＮＡ断片挿入ＤＮＡ断片番号プラスミドのサイズの塩基配列（13）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０１約２３００ｂｐ配列番号：13 （14）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＥ１０２約５５０ｂｐ配列番号：14

【００７６】実施例８培地中のエタノールをグルコー
スに変更することにより誘導される、制御可能なプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片の検索前記実施例６で得られた形質転換株を、前記実施例７と
同様にＧＫ培地とＥＫ培地の両培地にそれぞれレプリカ
し、３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生
育するがＥＫ培地には生育しない形質転換株を１株得ら
れ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３ＫＧ１０１、この形質転換株が保持するプラス
ミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０１と命名した。

【００７７】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナ
マイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するた
めに、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様
にＧＫ培地およびＥＫ培地での生育の有無を調べたとこ
ろ、この形質転換株ＫＧ１０１はＧＫ培地でのみ生育す
ることが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１
７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に
依存することを確認した。次に、上記で得られたプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＧ
１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤ
ＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べ
た方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約５
５０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１５に示したと
おりであった。

【００７８】実施例９培地中のグルコースをフルクト
ースに変更することにより誘導される、制御可能なプロ
モーター機能を有するＤＮＡ断片の検索前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ
培地にフルクトース（２０ g/l）とカナマイシン（１０
０ μg/ml）を添加した培地（以下ＦＫ培地と呼ぶ）の
両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日培養した。
その結果、ＧＫ培地には生育しないがＦＫ培地には生育
する形質転換株を１株得られ、その形質転換株をブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＦ１０１、この形
質転換株が保持するプラスミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＦ
１０１と命名した。

【００７９】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナ
マイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するた
めに、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様
にＧＫ培地およびＦＫ培地での生育の有無を調べたとこ
ろ、この形質転換株ＫＦ１０１はＦＫ培地でのみ生育す
ることが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢＥ１
７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に
依存することを確認した。次に、上記で得られたプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、ＫＦ
１０１株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤ
ＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で述べ
た方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは約２
５００ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１６に示した
とおりであった。

【００８０】実施例１０培地中のカゼイン加水分解
物、酵母エキスおよびグルコースの混合物をグルコース
に変更することにより誘導される、制御可能なプロモー
ター機能を有するＤＮＡ断片の検索前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＢＴ
培地にグルコース（２０ g/l）、酵母エキス（１ g/
l）、カゼイン加水分解（カザミノ酸)（１ g/l）および
カナマイシン（１００ μg/ml）を添加した培地（以下
ＧＹＣＫ培地と呼ぶ）の両培地にそれぞれレプリカし、
３３℃で３日培養した。その結果、ＧＫ培地には生育す
るがＧＹＣＫ培地には生育しない形質転換株を１株得ら
れ、その形質転換株をブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３ＫＧ１０２、この形質転換株が保持するプラス
ミドをｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧ１０２と命名した。

【００８１】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナ
マイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するた
めに、得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡを抽出
し、新たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様
にＧＫ培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べた
ところ、この形質転換株ＫＧ１０２はＧＫ培地でのみ生
育することが判明し、この性質はプラスミドｐＰＲＯＢ
Ｅ１７に挿入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断
片に依存することを確認した。次に、上記で得られたプ
ロモーター機能を有するＤＮＡ断片を特定するために、
ＫＧ１０２株のプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入され
たＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例５で
述べた方法にて決定したところ、ＤＮＡ断片のサイズは
約５７０ｂｐであり、塩基配列は配列番号：１７に示し
たとおりであった。

【００８２】実施例１１培地中のグルコースをカゼイ
ン加水分解物、酵母エキスおよびグルコースの混合物に
変更することにより誘導される、制御可能なプロモータ
ー機能を有するＤＮＡ断片の検索前記実施例６で得られた形質転換株を、ＧＫ培地とＧＹ
ＣＫ培地の両培地にそれぞれレプリカし、３３℃で３日
培養した。その結果、ＧＫ培地には生育しないがＧＹＣ
Ｋ培地には生育する形質転換株を３株得られ、それぞれ
の形質転換株および保持するプラスミドを次のとおり命
名した。

【００８３】番号菌株プラスミド（18）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０１ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０１（19）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０２ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０２（20）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＫＧＹＣ１０３ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０３

【００８４】次に、得られた形質転換株が、プラスミド
ｐＰＲＯＢＥ１７に挿入されたＤＮＡ断片に依存しカナ
マイシン含有培地に生育したものかどうかを判定するた
めに、得られた３株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、新
たにコリネ型細菌に再度形質転換し、上述と同様にＧＫ
培地およびＧＹＣＫ培地での生育の有無を調べたとこ
ろ、３株いずれもＧＹＣＫ培地でのみ生育することが判
明し、この性質は全てプラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿
入されたプロモーター機能を有するＤＮＡ断片に依存す
ることを確認した。次に、上記で得られたプロモーター
を特定するために、プラスミドｐＰＲＯＢＥ１７に挿入
されたＤＮＡ断片のサイズおよび塩基配列を前記実施例
５で述べた方法にて決定した。それらの結果は次ぎのと
おりであった。

【００８５】

【表８】挿入ＤＮＡ断片挿入ＤＮＡ断片番号プラスミドのサイズの塩基配列（18）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０１約１１１０ｂｐ配列番号：18 （19）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０２約２２００ｂｐ配列番号：19 （20）ｐＰＲＯＢＥ１７ＫＧＹＣ１０３約２３００ｂｐ配列番号：20

【００８６】

【配列表】

【００８７】配列番号：1 配列の長さ：128 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-128 特徴を決定した方法：E 配列 GATCCATGCA CGCGCGTTGC TCGGGCTGAA GGCCTGCTTC CACCTCAGCG GTGTGTTCAC 60 GGCGATCAAT TTCTTTACCA CCGAACACAT ATCCATCACT GGCCCATACT CACCCCGACC 120 TGTAGGAT 128

【００８８】配列番号：2 配列の長さ：413 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-413 特徴を決定した方法：E 配列 GATCCACGCT GAGCATTTGA AAGTAACTAG TCCCGAAGAT CTTCGGAAAT GCATAAAGCA 60 AAAGGCTCTT AGTGGTTTGT CAGCGTATGA TCATCACGTA GAGTAACACC CAAGAGTAAG 120 ACGCAACATC AATCAATGTG CAAGGGTTTC ATTTCTGGAA ATCGTGGTCA CCCCACATTC 180 ACCAGTAATG AACAAGCTTG TTTAATGTGA ATTTGGAGTA GACCACATGC CCACTCTCGG 240 ACCATGGGAA ATTGGAATCA TTGTCCTGCT GATCATCGTG CTGTTCGGCG CGAAGAAGCT 300 GCCTGATGCA GCTCGTTCCA TCGGCCAGAT AACCCGCAGA TCAAGACATC AAACATTCGC 360 ACCATCGGAT TTCTCATCTA CGACGGCGTC TCACCCCTCG ATTTCACTGG ATC 413

【００８９】配列番号：3 配列の長さ：423 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-423 特徴を決定した方法：E 配列 GATCCCTGCC CAGGCGCGCG CCCGTCCTGG CGAGTTCGCA GATCGAAGGG TTTGAACACC 60 GTAGAGGGTG GCGTCGACAA GCAAATTTCT GGTTTGCTGC AAGCCTTGCC CTGTACTGGT 120 GCGCCGCGCT GTGGATCGCG CTGGACGTTG GGTATTTCTG GGGCGACGCG CTCTCGCGCA 180 CCCAAGGCGC CCTATCCGCG CTGTACTCGC GCAACCCCAC GTTGTCGGCG ATCGGTTACG 240 TGTTTACCCC TCTGACCACC GTGGTGCAGA TTCCATTGGT GGCGCTGAGC CCCTGGGTCC 300 CGGAATTCAC GCGCGCCGGG TTGGCAGGCG CATTGGTGTC ATCAGTGTTC ATGGCGGCTT 360 CAGTGAGGCA ATTGTGGTTG ATTGCCAGCG AGCGCAACAT CCGGTATTGG CTCGCGGTGG 420 TAG 423

【００９０】配列番号：4 配列の長さ：241 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-241 特徴を決定した方法：E 配列 GATCTTTCAG CTGCTCACAC GTGATTGTAC CGCGTCAATG GAAGTGATTG GCCGCTTCCT 60 TGCCTTGCTG GAATTGTATA AGGCACGCGC TATTGAAACC TTGCAAGAGG AGCCACTCGG 120 CGAGCTTAAA GTTTCGTGGA CTGGCATTGA TGTCGATCCA GCAGTCGTCG CGGCGAGTGA 180 CTGGGAGTAA TCAGTTTTTC TTAAGGAAAC GTTGCTGAAT TAGTTTTAGT GACCTAAGAT 240 C 241

【００９１】配列番号：5 配列の長さ：595 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-595 特徴を決定した方法：E 配列 GATCTTGTCG ACGCCGCCCG CGACAGTGGC GCACAAATCC TCACGGGCGG CCAACCCTCA 60 GATGGACCTG GAAACTTCTA TCCGGCCACG ATTGTTACAG ACATTGCTCC GGATAATCCT 120 CTGGTTGTTG AAGAACAGTT CGGACCAGCG CTTCCAATAG TCCGATACTC CAATATTGAT 180 GAAGCCATTG GTTGGGCAAA TGGACTTGAA GTAGGTCTTG GAGCTTCTGT GTGGTCCGCT 240 GATCGGAATC GCGCAATGGA TGTAGCTAGG CAGATTCAGG CTGGAACAGT ATGGATTAAT 300 AACCATGCCC GCCCTGATCC AAGAATTCCT TTCGGCGGAA TCAAGCAATC GGGATACGGC 360 CTTGAATTTG GTGCTGATGG CCTCAAAGCG GTTGCGGTCC CCAAGGTCTA CAACGGTTAA 420 TTGTTTGATG TTGAGAATTC TCCGGGCCGA TTATTGTCGT AGTTTTCTGC ATTGGTGCTT 480 GGCAAGGAGA TCTGCCCCTG GTAAAGCTTG ATCAAATCGC ATTTGACCAG GGGATTTGGT 540 GTATTGTTAA CTTGAAGGTA GAGTATATTC TCGTTCCTAA AGGGGCCTAT AGATC 595

【００９２】配列番号：6 配列の長さ：588 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-588 特徴を決定した方法：E 配列 GATCTGAAGC AACACCTGAT CAACCACACC CCTTGGGGCG CAAAGATCAC GGTGGAGATC 60 GATGACATTA ACCAACCGTT CTCCACCGAT ATTACCGGCC CTGCAATGTC CACCCTGGCG 120 TCCTGCCTGA GCGCTGCGTA CGAGGGCAAG GATCTTGTCA CCGAAGGCAG CGGCGGATCC 180 ATTCCACTGT GCACCGAACT GATTGAGGTC AACCCAGAAG CAGAATTGGC ACTCTACGGT 240 GTGGAAGAAC CCCTCACCGT TATCCACTCC GCTAATGAAT CTGTTGACCC CAATGAGATT 300 CGCGATATCG CCACCGCAGA AGCATTGTTC CTGCTCAACT ACACCAAGTA GACTTAGAAG 360 CAGGCATTAA CACTGCCACC TTTGCAAAAT TAACCACCCC CTGATGGGGT GGTTTTTTCA 420 TGAGTTGAAA AAAGTGTCTT GATTCACTTT GTGATGACGG TTACCATAGC CATCGTGACT 480 AAAAACATTG ACCTTAAGCG AGTAGCCAAG GCTACGTACC CTACTGCGGG ATAGATGGAC 540 TGGCTCCCCG CACTAGGGAA GTAGTCGTTA ATCAACACCA AGAAGATC 588

【００９３】配列番号：7 配列の長さ：432 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-432 特徴を決定した方法：E 配列 GATCTCAACG TTTAGCGGCT CTCTGGATCG TGAAATGTCA ACGTTCATGG AAGCCAATGT 60 AGTGGGGTCG CGTCGAAAAG CGCGCTTTAA GGGCGACACG CCCAAAAAGT TTTACCTTTA 120 AAAACTACCC GCACGCAGCA CGAACCTGTT CAGTGATGCA AATCACCGCT AAAATATTGT 180 GGACGTTACC CCCGCCTACC GCTACGATTT CAAAACATGA CCATTTCCTC ACCTTTGATT 240 GACGTCGCCA ACCTTCCAGA CATCAACACC ACTGCCGGCA AGATCGCCGA CTTTAAGGCT 300 CGCCGCGCGG AAGCCCATTT CCCCATGGGT GAAAAGGCAG TAGAGAAGGT CCACGCTGCT 360 GGACGCCTCA CTGCCCGTGA GCGCTTGGAT TACTTACTCG ATGAGGGCTC CTTCATCGAG 420 ACCGATCAGA TC 432

【００９４】配列番号：8 配列の長さ：858 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-858 特徴を決定した方法：E 配列 CCGTTATATA TAAGGAATAG GCAACAAGTC CCACTGGCTG TGCCAATAGC CAGCACACAA 60 ACATTGAATC CCCACAGATC ATCACCCAAA ACTACGGGGC TTGCAGTTCC AATGCGATCA 120 AACCCATGGA CAACATTGCC ATGCGGATGC TTCAGTTTTG AATGAGGAGA GCGGTAGATT 180 AGCCAACCGT CAATTAATGA CAATTGCCAC CACAACAGCT AACGCGAAGA AGAAATCTGC 240 GACGACTGGA AAACCATGGA TTTTCAACAG TGATGACAAC AATGAGATGC CCATGAGGGA 300 ACCAGCCCAC GAGGGGCCCC TTTGTGACAT CGGCGTAGTT GTTCAACTAT AATGGAACGC 360 TGATCGTGGA CAAGAGTTAA CCATGAGATT GATTCACCCC TTTAAGCCTC CAAAGAAGTA 420 GTTGACTCAA CGCATTTCGG CATTTAAAAA AGCCGAGAGC AAATGAGACT TTCCAGGAGA 480 AGGCACCAGG GACATGAACA ATTGATCGGC TGACCAACTC TATAAGAGAT GCACCTCAAG 540 TTTGGGGATA CTTATTCGGC GTTTCTGGGG ACAAATACGT TCCCTATTGT TGTATATAGG 600 TATTCGCACT TAAGAAACAT CTCTCATGGA AAGAAGCTAG GCGGAAAGGG CGTTAAGTAC 660 TTGCCATTTA ATCCTCAGCA TCACTCGGAT CAGTCGGAGA TGTCGATGAA AATGCACCAG 720 GAGCCGTGGA GAGCAGCATG GTAGAAAACA ACGTAGCAAA AAAGACGGTC GCTAAAAAGA 780 CCGCACGCAA GACCGCACGC AAAGCAGCCC CGCGCGTGGC AACCCCATTG GGAGTCGCAT 840 CTGAGTCTCC CATTTCGG 858

【００９５】配列番号：9 配列の長さ：1187 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-1187 特徴を決定した方法：E 配列 TTACCGCAAG CTCAATACGA CTCACTATAG GGGCCCGGTA CCGAGCTCAC TAGTTTAATT 60 AAAAGCTTAT CGGCCTGAGG TGAGAAGGGT TCCGGACCCC AGAATTCTCG CGATAATTAA 120 TTAATAGCCC GCCGTAATGA GCGGGCTTTT TTTTGATCCC CGCCACCATA ACCCACGAAT 180 CCTAACAAGT CCCTGCATTC TCGATGGCTT TTTGGCTTTA ATCCGTTTTG GTTCAGGAAA 240 CTTACAAGAT CTTTTACGCT AGATGAAACT TGCCATCGAA CAGAATCCTG CAGATGAAAT 300 CTTTCAGCAC CATACATATC GGTAATTCAT AAAATGCTCC AGTGTCAAGC TCTCGCAACG 360 TAATCGTTGC TGTTCACGGA GTTCTTACTA GCTGCTCGGG CGATCAATTT GTCATTAGAT 420 TATGCAGTTA TAGGGAGAAC GGACACAAAA GGGAGGGACC TGACTGTACA CTGTACTCCC 480 GCTAGCACGT GTGTGTGATG ACACAGCTCA GAAGCATTGC AGTTGGACAA CCCCTAGATA 540 AGACTGCGCA AAGTAGGACA TATCTCTCAC TTTTCTTATT GTTTTCGGGC AAAACTAATC 600 CAGAACCTTT CTAAAGGCCC TGATCAATCA GGATTTCTGC GTGTCGACGT GATGCCACAC 660 CTGCTTGGGC AAGCACCTTC TGCAGGCGAA CTCCGTCAGA GTCATTGCGG CTTAAGAAAC 720 CCATCGACCA ATCGTCGTCG GATTTTACGT TTTGCTTCTT GGCAGGCTTA GCGTTGGAGA 780 GAAGAATCTC ATCCTTCTTC TGAGGCTGCT GGCGTGTGTT TGGGCGGGAT GATCCTGGCT 840 TGTAGCCACG AACTGAAGAC CGGTATCCGC CAGAGCGATT GCTCTGCTTC TTGTCCGGTG 900 TGCCATCTCG GCGAGCGGGT GGGGTCACGT AAGTGTCCTT AATCTTGAGA GAAAACGTAT 960 GAAATTGAAT CCCGTGAATT CTAGCCTATT TTAGGAGATT TTAATAGTCG GGGCTTTAAC 1020 TGATGCTTTA GAAGTCTTCA TCAATGGAGT CAACATCCGG CAAAAGCGGT GCTAGATCCG 1080 GTAATTTATC CAAAGAATCA ATACCCAACA GCTCAAGCAG GCAATTCCCG TTGTGCCCAT 1140 AGCGGTGCGC GCCCGTTGAT TCGTCCACAT CGACTTCTTT GACTAGG 1187

【００９６】配列番号：10 配列の長さ：713 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-713 特徴を決定した方法：E 配列 CTCAATTGCC TCGTCTGAAG GATGCTGACA CTGAACTGAC AGACGAGGAC CGGGCCTAAG 60 ATTTTTTCGG TGTATGGCGC GGGCTGTGAG GGGGATGTCG TCGATAAGCG TAGGGCCGAA 120 GAAGAAGCCC TCCTCGTGCC GTCTACGGCT GCACGTTACG CCGTCCACGA CTGATCTTGG 180 CAGCCGGTCT GGCCTCAGCG ATGCGACATA AGAAGCGACC TTCTCGCGGT GGCTGCGGTG 240 ATTAGTGGGC CCAGGTCCGC TCAGCCTGCT CGCGCCGGCA CCGTTGCCGA TGCGAAGGGT 300 GTCGATGCGG TCCTTGATCT TCTCAATGAG CTTTATTCCT GGGCTTTGGG AGCTTCAAAC 360 AGGAGGCATC AAATTTGGGG TAGTGCAGGG CCTTTGAATC CCACCTCACA GATAGTATTC 420 AGGCATTTCC TTGTCACGAT GGTTTATCCT TGGACACAAC ATCAAAAGTG GGGTACATCA 480 TATGCTTCCG GTTGAAAGTG ACCTATCTGA AAAGACTTGG CAGAACCTTA AGCAATGGTG 540 TGAACTGCGT TAACGAATTT TGTCGGACGT TAAAATGGCG CATTCTGCTT GCTGAAGTGG 600 CACACCTATG TGTTCTGCTT GGGATAGCAG TGCGGGAAAA ATTTGAAAAA GTCCGATTAC 660 CTTGAGGAGT ATTCAATGTC ATGACGCATT GCTTCAGAAA ACTGCGCTCC AAG 713

【００９７】配列番号：11 配列の長さ：1006 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-1006 特徴を決定した方法：E 配列 CTGAAGGAGT ACACCTTCGA TCTGCTCTAC AGATCTTTAG TGATAACAGA AACTCAGTAC 60 TCCGAAGATC TCTACTGACA GATCTTGGAT GGACCCGAGG ATGTTAAAGC GATTCCCTTC 120 GCTACAACAG CAACAAGGCC CTCAACAACC TTGGCTACGA AGGACTCTTC CCAGCGGATG 180 AAACCAAGGT GTCCCCAAAC ATCTTGTCTG CGCTGTCACC AAACGCTGAT GAGAACCACG 240 ACTTCTTCTC CGGCTCCGGT TCCTCTTACG TTATTGGTAA GGCAGAAAAC ACCCGAGGAT 300 GATGACCTGG GACTTTCTAA CTTTTAAAAA GCTGAAGCGG TCTACCGGCC TGTAGGGTAA 360 CCTCAACCCG TTAGAGCGTT TTCGGGTTTC CTGGTGGGGA CTTAAAGGTG CGGGGTTTTC 420 CGAAGCCGCA ATATCAGGGG TAAGGGACGA CCAGGCACCC CTGTGGCCCC TCGGCAGCGC 480 ATCACGCTTT AGGAGAAAAC GCCCCTGGAA TGGCGTCTCA ACCATTCAGA TTGAACCCCG 540 GCAGGGGGGA ATTATGAAAT CTGTGACAGG GGTTAACCGT GGGGGTGGGC TTCCTGGCAG 600 AAATGTCCGT CAAATTGTGA ACCCCTTCAC ACCTTTGGTT GAAAGCACTG CCCACAAGTG 660 ACTGAACCTG GCAGCGACCT CATGAATTGT TTGAAAAACA TTTTTTTTGG CACGAAAACG 720 GGGATACACG TTAGCTGCAT ACCAGCCTTT TTGGGTTGCA TCAGGATCCT GCCTGTGGCC 780 TTATGATCAG GCAGTGTTGT TAAAGGACGA TCGGTAATCC GAATGGTTCG TCCCGTAGTC 840 AGGAGGAACC TATGACCGCT GTGGCGCCTA GGGTCGACGG GCACGTGCCC CTCTACGAGG 900 CCCGAGCCCG ACAGGCCATG CACGCAAGGG CAGAAAGCAT GGTTAATGAT GACCACCACC 960 GGACCACAAG CAGCTTGGGC ATTATGTACA TCATTATGTC CTTCAG 1006

【００９８】配列番号：12 配列の長さ：737 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-737 特徴を決定した方法：E 配列 CTGCGTTGGC CTTAAGGGAG ATCACTTCAA TTTCTTCATT GTGAGGCAGC CAGAACTCCA 60 CCACCTTTTC CTGCTCTGAA AGTCCATCCA CTGTGAAGCA CCTGCGGATC TTCCAGACGC 120 CGTTCCGTGG CGCCGGTGAT GAAATTGACT TCCGTGGTCT CGCCCCCGGA GGTTGGCGTG 180 GAAGATGTGG GGGCGCCGTC GATAAGCACA TCAATCTTGC CGCCCGGCCG GCCGGAATCG 240 AGGTACACCA CCGAGTGGAN TACGTGGTCA GCGTGAAGGA GGTGGCGGTT GGTGCGACAC 300 ACACGGCACG CCCGTTGGTT GGCGTTCCAT CGCGCTAACT TGGGATCACA GTACGGTCTA 360 CTTATTCCTT TGCTGAGCCA ATCGGGCGAA GGCCCCTTGT TAGTGGTTCA ATTTCGGTTG 420 CGCCGTGAAT TAAATTCGGG ATTTCATGAG CTTAACCGTA CCGCTCTTGC AGAGTTCACA 480 GGGTAAACCC TAAATGGAAC AACCCATTGC CAATATGTTG GTTAAGTTGT ACGCAAGTAA 540 ATCTTTTCAA TCGTGGAAGC AGGGCTCACA GTCTAATGGC ACGTATGCAG GAAAGCGCCG 600 ATCTTCCAAA TGTTCCTTCT GCGGAAAGAG CCAAAAGCAG GTAAAAAAAC TTCATCGCGG 660 GTGGCGCCGG TATATATCTT GTGATGAGTG CATTGAGCTT GTGCAACGAG ATTATTGAAG 720 AAGAACTCAG GTCAAGA 737

【００９９】配列番号：13 配列の長さ：2203 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-2203 特徴を決定した方法：E 配列 CTACTTCTTC TTCACCGAAG TATTCCTTAG GGTCGATCTC GTTACCCTCG GAGTCCTTCA 60 CGTTTACGCG GCAGATAGCC TGTGCAAGAG CCTTGCCACG GCGAACGTCG GAGAAGAGGT 120 TCGCGATCTG GCCGGACTGC TGCAGCTGAC CGATGAACTG GTTTGGGTCC ATGCCGTAAG 180 ACTGTGCGGT GAACAGGATG TGGTCGGTGA GCTCCTCGTG CCGCTGATGC GACTTCGAGT 240 CCGATCCAGC CACCACCGAT GAGGACCAGC TTTTTACCTT CACCGAAGTT GCCTTGATCG 300 CGTCAGAGTC TTCCACGGCG CGCAGGTAGT GCACATTAGA GCCGTCGGCT CCGGAATTGG 360 AAGTTTGCGA CTGCTGAGCA AGTAGCAAGA ACTAGTTTGT CGTAGTTAAT GGTCTCAGTG 420 TTTCCGCCAT CATCAACGGT GACTTGGCGT GAACCCGCAT CAATTGCCGT GACGCACACC 480 TTGACGCAGC GTGACATTGT TTTCTTTGTA CCACCCCGCC GGGTGAACAA TCGCCTTTTC 540 AAAGCCTACT TTTCCCGCCA TGTACTCCTT TGACAGCGGT GGGCGTTCAT ATGGCAGATG 600 ATTTTCTGCT GCGATGAGCG TGATGGAGCC TTCATGCCCG TTTACACGCA GTGCCTCTGC 660 GGTTTTCGCT CCGGCTGAAC CGCCGCCGAT GATGACGATG CTTTGTGGTG TGCTCATGCT 720 GTACTCCTAG TCCCTAAAAA GTGGACGGTC AGGCGCAAGG TCGACCGCAT GGTCTATACG 780 CCATGCTAGT TAAAAGGCCG AAACCCTCGG CGAGCGCGCT AAATACCCGG CCCCAATTGG 840 GGGTGTGAGG CAGCACACAA GACGAAACCC TAACGAAATC GCCAGACTCC TCGCAATCAC 900 AAGAAGCGAC GACTAGCCTG TGGGGACAAA CTATCTCAAG AATTTATTCA ACAAAGGAGT 960 TCTTCGCACA TGAAGGAAGT AGCAGTCAAC GAAGTCCCAG CAGGCGCGCA GCTAATGCAC 1020 TGTCACTGTT TCGACGTGAT GTGCATCGGT TTACGTGGTG GCGTGGTTCA CACATTGCTC 1080 CATCGGGCAT TGGTGCGTCA ATCGGTTTGG GTTTTTAAGT TTTGTGCGGG GGTGGTCACC 1140 CCTGTTGTGA ACTTTGCAAA GTTATGACTT CGCAGAAAAA GTCGGCGGGG GAGTTGCTAG 1200 TACGGATGTA CTGGGCAAAT GCTCTGAAAT GGGAAAATGC AGGCACCACA ACTTTCCGTA 1260 GTTTTGAAGG TGTGACCTAG ATAAAAGTCG GGGTTAGGCG GGGGTAAATG ACTAGGTAAA 1320 GGTTCGCAAA CCCCCTTTTG TTGGTGACGG TGATCACTTA GTCTGATCAC ATCGCCAAAC 1380 ACGATAAGGG TTGAAATCGA AAGAAGAGCG GCACCTAGAT TCCAGAGGTA GCCAGAGTGC 1440 TTTTCTTAAA AGAGTTTTCA CAACCGTTAA CGGCGTAGCC AAACAAGAAG GATTCGCATT 1500 NCAGCTTCTG GTTTAGGCAC AGGTCATCTA AAACCCATGC TTTAAAAGGA GCCTTCAATG 1560 ACTGAACAGG AACTGTTGTC TGCTCAGACT GCCGACAACG CTGGAACTGA CAGCACCGAA 1620 CGCGTTGACG CGGGCGGAAT GCAGGTTGCA AAAGTTCTCT ACGACTTTGT AACCGAAGCG 1680 GTACTCCCTC GCGTGGGTGT GGATGCGGAA AAGTTCTGGT CCGGATTCGC CGCCATCGCC 1740 CGGGACCTCA CCCCACGCAA CCGCGAACTG CTTGCTCGTC GCGATGAACT GCAGACGCTT 1800 ATCGACGACT ACCACCGCAA CAACTCCGGC ACCATCGACC AAGACGCGTA CGAGGATTTC 1860 CTTAAAGAAA TCGGATACTT GGTTGAGGAG CCAGAAGCTG CAGAAATCCG TACCCAAAAC 1920 GTCGATACGG AAATCTCCAG CACCGCAGAC CTCAGCTGGT TGTGCCAATT CTGAACGCAC 1980 GTTCGCGCTG AATGCTGCCA ATGCTCGTTG GGGTTCCCTC TACGATGCGT TGTACGGCAC 2040 CAACGCCATC CCAGAAACTG ATGGCGCTGA AAAGGGCAAG GAGTACAACC CGGTCCGCGG 2100 CCAGAAGGTC ATCGAGTCGG GTCGTCAATT CCTCGACAGC GTTGTCCCAC TGGACGGGTG 2160 CTTCGCATGC CGATGTTGAG AAGTACAACA TCACGGATGG AAA 2203

【０１００】配列番号：14 配列の長さ：551 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-551 特徴を決定した方法：E 配列 CCTCATGGAT GTTGACATCG ATATGGATTC CGACATCTGA GCAGATCCTC TCCTGGCGGA 60 CACAGACGCA TCCCTGCTCT CCCTGGAAGC TGGCACCTGT GACCGTTGCC TTCGACACGA 120 CACATGCTGA CCACCCTGGA GAACTCCGGC CTATCGTGCC GATCGTTCCA GGCGCTGTGA 180 TTTTTGATTT GTTGGTGGGC GATCCCAAAA ACAGGCCGCT GAGAAAGTTT TCCACACTAA 240 AATAGTGTGA TTCTGCCGAA TCTGTTGTTT TACTTTTGAA ACTGCGGGAT CATGAAAAGT 300 AGTGAAAAGT GAATTTTAGT TCTGTGCTTT CTCTTCCCTT TAAGTGAACC TTTTGTTGGA 360 TCTTCATTAA AAAAATGAAA ACCTCGTCGG AATGCAACTT GGGATCACTG TCTCGGGCAA 420 GAAACGGCCT TAAAAAAGGG GAGTGATTGT GAGTGCTTGA TTTCTTAGCT GCGAACCCGC 480 TTGATTGCTG CTTGGTGGTT ATTTTGGCCA CGGGTGACCA CTCCCAGACT CAGCTGCCAG 540 GTGGTCAGTG G 551

【０１０１】配列番号：15 配列の長さ：549 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-549 特徴を決定した方法：E 配列 GATCCTCATG GATGTTGACA TCGATATGGA TTCCGACATC GAGCAGATCC TCTCCGGCGG 60 ACACGACGCA TCCCTGCTCT CCCTGGAAGC TGGCACCTGT GACGTTGCCT TCGCACACGA 120 CACCATGCTG ACCACCCTGG AGAACTCCGG CCTATCGTGC CGATCGTTCC AGGCGCTGTG 180 ATTTTTGATT TGTTGGTGGG CGATCCCAAA AACAGGCCGC TGAGAAAGTT TTCCACACTA 240 AAATAGTGTG ATTCTGTCCG AATCTGTTGT TTTAGTTTTG AAACTGCGGG ATCATGGAAA 300 GTAGTGAAAA GTGAATTTTA GTTCTGTGCT TTCTCTGCCC TTTAAGTGAA CCTTTTGTTG 360 GATCTTGCAT TAAAAAAATG AAAACCTCGT CGGGAATGCA ACTTGGGATC ACGTCTCGGG 420 CAAGAAACGT CCTTAAAAAA GGGGAGTGAT TGTGAGTGCT TGATTTCTTA GCTGCGAACC 480 CGCTGATTGC GCTGGTGGTT ATTTTGGCCA CGGTGACCAC TCCCGACTCG GCGCCGGTGG 540 TCGTGGATC 549

【０１０２】配列番号：16 配列の長さ：2248 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-2248 特徴を決定した方法：E 配列 TGGGGCCGGT GGCAATGCAT CAGGGAGATT TGGATATACG GCCCACAATT CTTTGGTTCC 60 GGTCGATGGG GTAGTGAAGG TGACACGGGA TCCGATGGTG ACGTTGCTGA TCTCTGTTTC 120 TTTTACATTC GCGGTGATCT TCAGTTCGGA ATCATCAGCA ACACTCAACA GTGCGCCGGC 180 TGCTGGTTGA CCTTGGGCTG CCTGCCACGG ATGAACAATG CCTGAGTATG GGGATCGACG 240 GTGGTGTGTT GATATCATCC GAACTGGGAC GTGATCTGGT GGCGCTTAAT ATCTACTGAT 300 GCAACCTAAA GTGCATAATG CGCTTATTTT CTCCAATGGT GTTGGTGAAA ATCCCGTCTC 360 GAGCCAAGTT TGCGCTTGTG TGCTATTGGG CTCATCACGG CGCCTGTGCA GCGGCTAGTC 420 TGAGTCAACT TTTCCGAGTG AATCAATGTA GATCCGCTCG GCTTTTTCTA GACCTTCAGT 480 GGTGGATGCA ACGCGTCGCT CAGTTTCCTC CAAAACGGTG TAGGACTGCA AGTTAGGCTG 540 GTCCTGGCTA GGCCACTGGA GGTTTTGGAA GCAATGATGT ACCGGCCTGC AACCTTGCTA 600 TAATGCGGGG TACACGGTTT CCACTGCGGC GCGTGCTTCT GCTGCAGGAC TGCCTCTAGG 660 TCACCTTCCA ACGCGGGCTT GAGCAAGTTC GGATTCCGAG AAGCAAATAT CTCTCTCATC 720 GAAAGCCATT TGCATCGTGA GGTTCTGCGA TCGTGGTGAA AGTCAAAGTC GGCGAGCGTC 780 AGTCGGTCAA TTTCAAGCAG CATCCAGTCG TTCAATTTCA GCAGCATCTG CTTGCTCACG 840 GGCTGCCTTG AGAGCATCCG ATTCAGCGAC CATGGTGGAA TCCAATCCGC ATCCACATCT 900 CGGTTCTTCG CTTCAAAACT GCGGATCGAT CCTGATATGC TGTGAGGACG CCGAACAGGG 960 ACGGCGCGAG TTGATCTCCG GGTCAAACCA TATCAAGAGT CCCTGGCTGT TATATGTTCT 1020 GCGCTGCGCG TGGATTCGGT CGCATGTTCA CGCGATTGTT GGATAGTTCA TCACTGTCGT 1080 TCAGGGAGAG GATCACTCAG CCACACTGTC AGTGCACACG GTACACCGAA CCGGAAGTGG 1140 GACGGACAGT ACCTGTGTAA TGGTGGTGGT TCGCGCAGCT TCAATATTCC GTTGACTCTC 1200 AAACAAAGGA ATTAAATATT AAGCGCGCCC CCCCTTAAAT TCCTTAAAAA ACTTAAATCC 1260 CAGGGAACTC CCAATCAAAA GAAACCGGGG GTCCCTTTAA CCAAATAATC TGCACCCATG 1320 ATAAAATAGC CAGGCGCATG GTATTCTGGG CCAGAAACAA GTGTATCCGC ATTAATGCCC 1380 CAAACCAGTA CCCGGGAACC TTCAAAGTCT TACAAAGCTA ACCAAATGCA GGTCGAAATC 1440 CATCCAGACA TCCGGACCAC TACTTGTTTC CCTAGAACCC CCATTCATCA CTCCGAATGG 1500 GTATGCTGAC GATAATGAGT CCTTATCGAC AGGCTGATTC TGCTGGAACC CCACATTTGG 1560 AACGTACGCG AGAACCTTCG GCGAAGCTTT TCGGTCGCGG CCGTTATCTT TTTAAGAGGA 1620 GAAATTTTAG ATGAGCACGT CCACCATCAG GGTTGCCATT GCCGGAGTCG GAAATGCGCG 1680 ACCTCCCTCA TTCAGGGTGT GGAATATACC GAAATGCGGA ACCTCCGAAA TGTCCCGGTT 1740 TGCTGCACTT CAATTCGGTG ATTACCACGT TGGCGCATGA TTCGTTGCCG GTTCACGTCG 1800 ACGCCGAAAA GTAGCAGGAA TTCCCCGCAC GGGGTTACAA ACTGCATTAT CAAATGCCAG 1860 TCCGAGCCGA ATAACGGTGT TGGCCGATTT GAGGCTGGGT TCATACGGGA CATGACGGTC 1920 ACGCGGGCAT GGCGTGTCAG GGTTATGCGG AAAACCCTTT TTGAGCCCAC CTCATGGTCC 1980 AGAGCGCAAT TTCGGAAGCG AAAATTCTAC GCACAAGCGC CATCGATTGC AGTGCGCCTT 2040 TGTCAACGCT CTCCCAGTAT TCATCGCCTC CGACCCTGAG TGGGCTAAGA AGTTAACTGA 2100 GGCTGGCATC CCAATTGTTG GCGATGACAT CAAATCCCAG ATCGGTGCAA CCATCACCCA 2160 CCGTGTCCTC GCACGCCTTT TTGAAGAACG TGTCGTTCGC GTAGATCGCC ACCTGCCGGA 2220 CCATTCTGGG AACTGGACAG CAGAATAT 2248

【０１０３】配列番号：17 配列の長さ：567 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-567 特徴を決定した方法：E 配列 GATCCAAAAA GTCGGCGCAG CTGACTGGAG CTTCTGGGAA GCCAAAGTCC GCGCCCGCGA 60 CTACGCCCTG GACGAAACCG AACTGCGCAA CTACTTCCCA CTGAACCAAG TACTCTGTGA 120 CGGCGTCTTC TTCGCTGCTA ACCGCCTCTA CGGAATCACC GTGGAACCAC GCCCTGACCT 180 GCGCGGTTAC GCCGAGGGCG TGGACGTCTG GGAAGTCCTC GATTCTGACG GCTCCGGCAT 240 CGGCCACAAG TGCGATGCGC CCCTTCCGGG TCGGCGAGGC GGTGATCTTG CGGTGTCTAC 300 CTGGGGTCGA CTGTCGAGTC GTGGTCCGCA TTGAACTTCT TTCCGTGGTG TTTATCTTTT 360 CATCACAAAC AATCACGACG GTATACCCAT CGGAGACGAT ATCGTGATCT TTCTGTTACC 420 TGCGGAAGGT AACATTAGTA TTTCAACTCG ACAGAGTCCA TCCTGGAAGC GTGTATGACG 480 ATTTCTTCAC ACATTCTTTA CAATGGCCTT TCGTGCGATA ATGCTAGGCA TGCTTCGATG 540 GACTACAGCA GGTGAATCCC ACGGATC 567

【０１０４】配列番号：18 配列の長さ：1107 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-1107 特徴を決定した方法：E 配列 CTGGTTTTGG CGGTAGGCAA ACATGCCTTT GAGGGTAGAT GCCGGTAGGC GGAGTGCTCA 60 CGGAATCTGT GATGAGTGTG CCGCCGTCTT GGTCGATGAA ATTGTGCACG TGACGCCAGT 120 TTGCGAGGGC CTTTACGGGG GCGGTCAGAC AGACGTCGGT GAAGCGTGAA CCATTCAAAA 180 ATCCCGATAA ATCATGGCGC GCCACCCATT TAAGTCCCGC AGGAAGGCTG AAAATGGTGG 240 TGCCATCGGA GAGGCGTTCT GCCTGCGCAA TGGGGTTAAG GGGGACGAAT GGCGGAGTCA 300 GACGTGTGAC AGCGCCCTTA CGGGTATGCC AATCCCAGAC CATTTCTCGG GGAAAAGGAA 360 TAAAATGGCT TGTGGTCAGA CTCACAGGGG CTTCTCCAAG TCAGTGGATT TATGAGGTCC 420 CAGTGGGTAC ACACCGGGTG TCCTACAACG ATCAATTGTC ACAGATTCGA CTGGCATGCT 480 GTACCATCTG CTTTAAGCAT TTTGGTGTTT CACTGTTGTT AACAGTGTTT CACCGTGGAG 540 CACTACCTAA AGATCATAGT CAGCATCTTG GGGTGAATGT GACACGGTAC GCTATAGTGT 600 CAGACAACAA CCAGGAAACT GGTCGTTGCA GAGTTTTTGC AAAATTGGAC ATCCTTTAAC 660 GGACCGCACA GAGAGGCGGG AAGGAGGTCA CGATGAGCGA ACGTAATAGT GCTGTACTAG 720 AACTCCTCAA TGAGGACGAC GTCAGCCGTA CCATCGCACG CATCGCGCAC CAGATTATTG 780 AGAAAACCGC GCTTGATTCC AAATACGCGG ATCGGGTCAT GTTGTTAGGC ATTCCTTCAG 840 GTGGAGTCCC GCTGGCCCGA AGGCTTGCTG AAAAGATCGA AGAATTTTCC GGCGTTTCGG 900 TAGATACCGG CGCTGTTGAT ATCACCTTGT ACAGGGATGA TCTTCGAAAC AAACCGCACC 960 GCGCACTGCA GCCCACCTCT ATTCCGGCAG GTGGTATCGA TAACACCACC GTGATTTTGG 1020 TGGATGATGT GCTGTTTTCC GGTCGTACTA TNCGCGCTGC ACTTGATGCA TTGCGCGACG 1080 TTGGACGCCC AAACTATATC CAATTAG 1107

【０１０５】配列番号：19 配列の長さ：2115 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-2115 特徴を決定した方法：E 配列 GGATCCGGTA ACCGTTTTTA TCAGGCTCTG GGAGGCAGAA TAAATGATCA TATCGTCAAT 60 TATTACCTCC ACGGGGAGAG CCTGAGCAAA CTGGCCTCAG GCATTTAAGA AGCACACGGT 120 CACACTGCTT CCGGTAGTCA ATAAACCGGT AAACCAGCAA TAGACATAAG CGGCTATTTA 180 ACGACCCTGC CCTGAACCGA CGACCGGGTC GAATTTGCTT TCGATATCTG CCATTCATCC 240 GCTTATTATC ACTTATTCAG GCGTAGAACC AGGCGTTTAA GGGCACCAAT AACTGCCTTA 300 AAAAAATTAC GCCCGCCCTG CCACTCATCG CAGTACTGTT GTAATTCATT AAGCATTCTG 360 CCGACATGGG AGGCCATCAC AAACGGGCAT GATGAACCTG AATCGCCAGC GGGCATCAGC 420 ACTTGGTCGC CTTGCGTATA AATATTTGCC CCTGGTGGAA AACGGGGGCG AAGAGGTTGT 480 CCCATATTTG GCCACGGTTT AAATCAAAAT TGGTGGAACT CACCCTGGGT TTGGCTAGCG 540 ATCCGGGTTG ACATCTGCAG GCGGGAAATT GAAAAGGCCG GATAAAACTG GTGCCTATTT 600 CCTTTAACGG TCTTTAAAAA AGGCCCGTAA TACCCAACTG AAACGGTCTG GTTATAGTAA 660 CATTGGACAA CTGGACTGGA AATGCCCTCC AAATGGTCCT TTACGATGCC CAATTGGGGA 720 TATATCCAAC GGTGGTATAA CCCAGTGATT TTTTTTCCTC CCATTTTTAG CTTCCTTTAG 780 CTCCTGAAAA TCTCGATAAC TCAAAAAAAT ACGCCCGGTA GTGATCTTAT TTCATTATGG 840 TGAAAGTTGG AACCTCTTAC GTGCCGATCA ACGTCTCATT TTCGCCAAAA GTTGGCCCAG 900 GGCTTCCCGG TATCAACAGG GACACCAGGA TTATTTATTC TGCGAAGTGA TCTTCCGTCA 960 CAGGTATTTA TTCGGCGCAA AGTGCGTCGG GTGATGCTGC CAACTTACTG ATTTAGTGTA 1020 TGATGGTGTT TTTGAGGTGC TCCAGTGGCT TCTGTTTCTA TCAGCTGTCC CTCCTGTTCA 1080 GCTATTGACG GGGTGGTGCG TAACGGAAAA GCACCGCCGG ACATCACCGG ATCTCAAGAA 1140 GACCTTTGAA CTGTTCAACG GATCCCCAGG GGCAGGCGGT ACACCGCGCC CTCGGACGTA 1200 TCGGAGTTTC TGGCGTTTCC GATGTCCGTC AGGGAAAGCG CTTCGAGCTT GAGGTAGATG 1260 ATTCCGTCAC CGAAGCTGAC CTAAAGAAAA TTGCTGAAAC CCTCCTCGCA AACACCGTCA 1320 TCGAAGACTT CGATGTGGTG GGAGTTGAGG TCGCGAAGTG AGCGCCAAAA TCGGTGTCAT 1380 TACCTTCCCA GGCACCCTTG ACGATGTAGA TGCAGCACGC GCTGTTCGCA TCGCAGGTGC 1440 AGAAGTAATC AGCCTGTGGC ACGCTGACGA GGATCTCAAG GGCGTCGACG CAGTTGTCGT 1500 TCCCGGTGGA TTCCTCCTAC GGCGATTACC TGCGCACCGG TGCAATCTCT GCACTGGCGC 1560 CAGTAATGCA GTCCGTGATT GAGCAGGCCG GTAAGGGTAT GCCAGTCTTG GGCATTTGCA 1620 ACGGCTTCCA GATCCTCACC GANGCACGCC TGCTTCCAGG CGCGCTGACC CGCAACAAGG 1680 GTCTGCACTT TCACTGTGTA GACGCACACC TCGTTGTAGA GAACAACACC ACTGCATGGA 1740 CCAACACTTT GGAAAAGGGG CAGCAGATCC TTATTCCTGC AAAGCACGGT GAAGGTCGCT 1800 TCCAGGCAGA CGGCAGAGAC CATTCGCCCA GCTTTGAGGG TGAAGGCCGC GTGGTGTTCC 1860 GTTACAACGA TAACTTCAAC GGTTTCCGTA GACCTACCAA GCCGGTATCA CTAATGAAAC 1920 TGGTCGCATC GTCGGTCTCA TGCCGCACCC GGAACATGCC GTCGAAAAGC TAACCGGCCC 1980 ATCTATTGAT GGCCTGGAGC TGTTCCTGTC CGCCGTTGGC ACCATCGCGG CTTAAGAGGA 2040 GTCAAAATAT GAGCACTTTT GTCAATGACA CCGTCGAGAG CAATCAAGAC CCCTGAGATC 2100 AATTCTGGGA TCTGA 2115

【０１０６】配列番号：20 配列の長さ：2213 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類： Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteriu
m flavum) 株名：MJ-233 配列の特徴特徴を表す記号：promoter 存在位置： 1-2213 特徴を決定した方法：E 配列 ATATTCTGCT GTCCAGTTCC CAGAATGGTC CGGCAGGTGG CGATCTACGC GAACGACACG 60 TTCTTCAAAA AGGCGTGCGA GGACACGGTG GGTGATGGTT GCACCGATCT GGGATTTGAT 120 GTCATCGCCA ACAATTGGGA TGCCAGCCTC AGTTAACTTC TTAGCCCACT CAGGGTCGGA 180 GGCGATGAAT ACTGGGAGAG CGTTGACAAA GGCGCACTGC AATCGATGGC GCTTGTGCGT 240 AGAATTTTCG CTTCCGAAAT TGCGCTCTGG ACCATGAGGT GGGCTCAAAA AGGGTTTTCC 300 GCATAACCCT GACACGCCAT GCCCGCGTGA CCGTCATGTC CCGTATGAAC CCAGCCTCAA 360 ATCGGCCAAC ACCGTTATTC GGCTCGGACT GGCATTTGAT AATGCAGTTT GTAACCCCGT 420 GCGGGGAATT CCTGCTACTT TTCGGCGTCG ACGTGAACCG GCAACGAATC ATGCGCCAAC 480 GTGGTAATCA CCGAATTGAA GTGCAGCAAA CCGGGACATT TCGGAGGTTC CGCATTTCGG 540 TATATTCCAC ACCCTGAATG AGGGAGGTCG CGCATTTCCG ACTCCGGCAA TGGCAACCCT 600 GATGGTGGAC GTGCTCATCT AAAATTTCTC CTCTTAAAAA GATAACGGCC GCGACCGAAA 660 AGCTTCGCCG AAGGTTCTCG CGTACGTTCC AAATGTGGGG TTCCAGCAGA ATCAGCCTGT 720 CGATAAGGAC TCATTATCGT CAGCATACCC ATTCGGAGTG ATGAATGGGG GTTCTAGGGA 780 AACAAGTAGT GGTCCGGATG TCTGGATGGA TTTCGACCTG CATTTGGTTA GCTTTGTAAG 840 ACTTTGAAGG TTCCCGGGTA CTGGTTTGGG GCATTAATGC GGATACACTT GTTTCTGGCC 900 CAGAATACCA TGCGCCTGGC TATTTTATCA TGGGTGCAGA TTATTTGGTT AAAGGGACCC 960 CCGGTTTCTT TTGATTGGGA GTTCCCTGGG ATTTAAGTTT TTTAAGGAAT TTAAGGGGGG 1020 GCGCGCTTAA TATTTAATTC CTTTGTTTGA GAGTCAACGG AATATTGAAG CTGCGCGAAC 1080 CACCACCATT ACACAGGTAC TGTCCGTCCC ACTTCCGGTT CGGTGTACCG TGTGCACTGA 1140 CAGTGTGGCT GAGTGATCCT CTCCCTGAAC GACAGTGATG AACTATCCAA CAATCGCGTG 1200 AACATGCGAC CGAATCCACG CGCAGCGCAG AACATATAAC AGCCAGGGAC TCTTGATATG 1260 GTTTGACCCG GAGATCAACT CGCGCCGTCC CTGTTCGGCG TCCTCACAGC ATATCAGGAT 1320 CGATCCGCAG TTTTGAAGCG AAGAACCGAG ATGTGGATGC GGATTGGATT CCACCATGGT 1380 CGCTGAATCG GATGCTCTCA AGGCAGCCCG TGAGCAAGCA GATGCTGCTG AAATTGAACG 1440 ACTGGATGCT GCTTGAAATT GACCGACTGA CGCTCGCCGA CTTTGACTTT CACCACGATC 1500 GCAGAACCTC ACGATGCAAA TGGCTTTCGA TGAGAGAGAT ATTTGCTTCT CGGAATCCGA 1560 ACTTGCTCAA GCCCGCGTTG GAAGGTGACC TAGAGGCAGT CCTGCAGCAG AAGCACGCGC 1620 CGCAGTGGAA ACCGTGTACC CCGCATTATA GCAAGGTTGC AGGCCGGTAC ATCATTGCTT 1680 CCAAAACCTC CAGTGGCCTA GCCAGGACCA GCCTAACTTG CAGTCCTACA CCGTTTTGGA 1740 GGAAACTGAG CGACGCGTTG CATCCACCAC TGAAGGTCTA GAAAAAGCCG AGCGGATCTA 1800 CATTGATTCA CTCGGAAAAG TTGACTCAGA CTAGCCGCTG CACAGGCGCC GTGATGAGCC 1860 CAATAGCACA CAAGCGCAAA CTTGGCTCGA GACGGGATTT TCACCAACAC CATTGGAGAA 1920 AATAAGCGCA TTATGCACTT TAGGTTGCAT CAGTAGATAT TAAGCGCCAC CAGATCACGT 1980 CCCAGTTCGG ATGATATCAA CACACCACCG TCGATCCCCA TACTCAGGCA TTGTTCATCC 2040 GTGGCAGGCA GCCCAAGGTC AACCAGCAGC CGGCGCACTG TTGAGTGTTG CTGATGATTC 2100 CGAACTGAAG ATCACCGCGA ATGTAAAAGA AACAGAGATC AGCAACGTCA CCATCGGATC 2160 CCGTGTCACC TTCACTACCC CATCGACCGG AACCAAAGAA TTGTGGGCCG TAT 2213

【０１０７】配列番号：21 配列の長さ：61 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AATTCTCGCG ATAATTAATT AATAGCCCGC CTAATGAGCG GGCTTTTTTT TGATATCAAT 60 T 61

【０１０８】配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATCAGATCC CAGAATTGAT 20

【０１０９】配列番号：23 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGAGCGGGCT TTTTTTTGAT 20

【０１１０】配列番号：24 配列の長さ：40 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATCTCAAGA AGATCCTTTG ATCTTTTCTA CGGATCCCAG 40

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いるプロモーター検出用ベクター
の構成図。

【図２】本発明で用いるプラスミドｐＢＲＣＭ１０２
およびｐＣＭＴ４４の構築操作図。

【図３】本発明で用いるプラスミドｐＣＫＴ１１およ
びｐＰＲＯＢＥ１７の構築操作図。

【図４】プラスミド検出用ベクターｐ１７Ｂ−ｇａｌ
の制限酵素切断点地図。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌染色体から得られるコリネ
型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であっ
て、コリネ型細菌内でｔａｃプロモーターよりも強いプ
ロモーター機能を有するＤＮＡ断片。
【請求項２】コリネ型細菌染色体が、ブレビバクテリ
ウム・フラバム（Br evibacterium flavum）ＭＪ−２３
３から得られる染色体である請求項１記載のＤＮＡ断
片。
【請求項３】下記の配列番号：１〜配列番号：１２で
示される塩基配列より成る群から選ばれる少くとも１つ
の塩基配列を含むコリネ型細菌内でｔａｃプロモーター
よりも強いプロモーター機能を有するＤＮＡ断片。配列番号：１ GATCCATGCA CGCGCGTTGC TCGGGCTGAA GGCCTGCTTC CACCTCAGCG GTGTGTTCAC 60 GGCGATCAAT TTCTTTACCA CCGAACACAT ATCCATCACT GGCCCATACT CACCCCGACC 120 TGTAGGAT 128 配列番号：２ GATCCACGCT GAGCATTTGA AAGTAACTAG TCCCGAAGAT CTTCGGAAAT GCATAAAGCA 60 AAAGGCTCTT AGTGGTTTGT CAGCGTATGA TCATCACGTA GAGTAACACC CAAGAGTAAG 120 ACGCAACATC AATCAATGTG CAAGGGTTTC ATTTCTGGAA ATCGTGGTCA CCCCACATTC 180 ACCAGTAATG AACAAGCTTG TTTAATGTGA ATTTGGAGTA GACCACATGC CCACTCTCGG 240 ACCATGGGAA ATTGGAATCA TTGTCCTGCT GATCATCGTG CTGTTCGGCG CGAAGAAGCT 300 GCCTGATGCA GCTCGTTCCA TCGGCCAGAT AACCCGCAGA TCAAGACATC AAACATTCGC 360 ACCATCGGAT TTCTCATCTA CGACGGCGTC TCACCCCTCG ATTTCACTGG ATC 413 配列番号：３ GATCCCTGCC CAGGCGCGCG CCCGTCCTGG CGAGTTCGCA GATCGAAGGG TTTGAACACC 60 GTAGAGGGTG GCGTCGACAA GCAAATTTCT GGTTTGCTGC AAGCCTTGCC CTGTACTGGT 120 GCGCCGCGCT GTGGATCGCG CTGGACGTTG GGTATTTCTG GGGCGACGCG CTCTCGCGCA 180 CCCAAGGCGC CCTATCCGCG CTGTACTCGC GCAACCCCAC GTTGTCGGCG ATCGGTTACG 240 TGTTTACCCC TCTGACCACC GTGGTGCAGA TTCCATTGGT GGCGCTGAGC CCCTGGGTCC 300 CGGAATTCAC GCGCGCCGGG TTGGCAGGCG CATTGGTGTC ATCAGTGTTC ATGGCGGCTT 360 CAGTGAGGCA ATTGTGGTTG ATTGCCAGCG AGCGCAACAT CCGGTATTGG CTCGCGGTGG 420 TAG 423 配列番号：４ GATCTTTCAG CTGCTCACAC GTGATTGTAC CGCGTCAATG GAAGTGATTG GCCGCTTCCT 60 TGCCTTGCTG GAATTGTATA AGGCACGCGC TATTGAAACC TTGCAAGAGG AGCCACTCGG 120 CGAGCTTAAA GTTTCGTGGA CTGGCATTGA TGTCGATCCA GCAGTCGTCG CGGCGAGTGA 180 CTGGGAGTAA TCAGTTTTTC TTAAGGAAAC GTTGCTGAAT TAGTTTTAGT GACCTAAGAT 240 C 241 配列番号：５ GATCTTGTCG ACGCCGCCCG CGACAGTGGC GCACAAATCC TCACGGGCGG CCAACCCTCA 60 GATGGACCTG GAAACTTCTA TCCGGCCACG ATTGTTACAG ACATTGCTCC GGATAATCCT 120 CTGGTTGTTG AAGAACAGTT CGGACCAGCG CTTCCAATAG TCCGATACTC CAATATTGAT 180 GAAGCCATTG GTTGGGCAAA TGGACTTGAA GTAGGTCTTG GAGCTTCTGT GTGGTCCGCT 240 GATCGGAATC GCGCAATGGA TGTAGCTAGG CAGATTCAGG CTGGAACAGT ATGGATTAAT 300 AACCATGCCC GCCCTGATCC AAGAATTCCT TTCGGCGGAA TCAAGCAATC GGGATACGGC 360 CTTGAATTTG GTGCTGATGG CCTCAAAGCG GTTGCGGTCC CCAAGGTCTA CAACGGTTAA 420 TTGTTTGATG TTGAGAATTC TCCGGGCCGA TTATTGTCGT AGTTTTCTGC ATTGGTGCTT 480 GGCAAGGAGA TCTGCCCCTG GTAAAGCTTG ATCAAATCGC ATTTGACCAG GGGATTTGGT 540 GTATTGTTAA CTTGAAGGTA GAGTATATTC TCGTTCCTAA AGGGGCCTAT AGATC 595 配列番号：６ GATCTGAAGC AACACCTGAT CAACCACACC CCTTGGGGCG CAAAGATCAC GGTGGAGATC 60 GATGACATTA ACCAACCGTT CTCCACCGAT ATTACCGGCC CTGCAATGTC CACCCTGGCG 120 TCCTGCCTGA GCGCTGCGTA CGAGGGCAAG GATCTTGTCA CCGAAGGCAG CGGCGGATCC 180 ATTCCACTGT GCACCGAACT GATTGAGGTC AACCCAGAAG CAGAATTGGC ACTCTACGGT 240 GTGGAAGAAC CCCTCACCGT TATCCACTCC GCTAATGAAT CTGTTGACCC CAATGAGATT 300 CGCGATATCG CCACCGCAGA AGCATTGTTC CTGCTCAACT ACACCAAGTA GACTTAGAAG 360 CAGGCATTAA CACTGCCACC TTTGCAAAAT TAACCACCCC CTGATGGGGT GGTTTTTTCA 420 TGAGTTGAAA AAAGTGTCTT GATTCACTTT GTGATGACGG TTACCATAGC CATCGTGACT 480 AAAAACATTG ACCTTAAGCG AGTAGCCAAG GCTACGTACC CTACTGCGGG ATAGATGGAC 540 TGGCTCCCCG CACTAGGGAA GTAGTCGTTA ATCAACACCA AGAAGATC 588 配列番号：７ GATCTCAACG TTTAGCGGCT CTCTGGATCG TGAAATGTCA ACGTTCATGG AAGCCAATGT 60 AGTGGGGTCG CGTCGAAAAG CGCGCTTTAA GGGCGACACG CCCAAAAAGT TTTACCTTTA 120 AAAACTACCC GCACGCAGCA CGAACCTGTT CAGTGATGCA AATCACCGCT AAAATATTGT 180 GGACGTTACC CCCGCCTACC GCTACGATTT CAAAACATGA CCATTTCCTC ACCTTTGATT 240 GACGTCGCCA ACCTTCCAGA CATCAACACC ACTGCCGGCA AGATCGCCGA CTTTAAGGCT 300 CGCCGCGCGG AAGCCCATTT CCCCATGGGT GAAAAGGCAG TAGAGAAGGT CCACGCTGCT 360 GGACGCCTCA CTGCCCGTGA GCGCTTGGAT TACTTACTCG ATGAGGGCTC CTTCATCGAG 420 ACCGATCAGA TC 432 配列番号：８ CCGTTATATA TAAGGAATAG GCAACAAGTC CCACTGGCTG TGCCAATAGC CAGCACACAA 60 ACATTGAATC CCCACAGATC ATCACCCAAA ACTACGGGGC TTGCAGTTCC AATGCGATCA 120 AACCCATGGA CAACATTGCC ATGCGGATGC TTCAGTTTTG AATGAGGAGA GCGGTAGATT 180 AGCCAACCGT CAATTAATGA CAATTGCCAC CACAACAGCT AACGCGAAGA AGAAATCTGC 240 GACGACTGGA AAACCATGGA TTTTCAACAG TGATGACAAC AATGAGATGC CCATGAGGGA 300 ACCAGCCCAC GAGGGGCCCC TTTGTGACAT CGGCGTAGTT GTTCAACTAT AATGGAACGC 360 TGATCGTGGA CAAGAGTTAA CCATGAGATT GATTCACCCC TTTAAGCCTC CAAAGAAGTA 420 GTTGACTCAA CGCATTTCGG CATTTAAAAA AGCCGAGAGC AAATGAGACT TTCCAGGAGA 480 AGGCACCAGG GACATGAACA ATTGATCGGC TGACCAACTC TATAAGAGAT GCACCTCAAG 540 TTTGGGGATA CTTATTCGGC GTTTCTGGGG ACAAATACGT TCCCTATTGT TGTATATAGG 600 TATTCGCACT TAAGAAACAT CTCTCATGGA AAGAAGCTAG GCGGAAAGGG CGTTAAGTAC 660 TTGCCATTTA ATCCTCAGCA TCACTCGGAT CAGTCGGAGA TGTCGATGAA AATGCACCAG 720 GAGCCGTGGA GAGCAGCATG GTAGAAAACA ACGTAGCAAA AAAGACGGTC GCTAAAAAGA 780 CCGCACGCAA GACCGCACGC AAAGCAGCCC CGCGCGTGGC AACCCCATTG GGAGTCGCAT 840 CTGAGTCTCC CATTTCGG 858 配列番号：９ TTACCGCAAG CTCAATACGA CTCACTATAG GGGCCCGGTA CCGAGCTCAC TAGTTTAATT 60 AAAAGCTTAT CGGCCTGAGG TGAGAAGGGT TCCGGACCCC AGAATTCTCG CGATAATTAA 120 TTAATAGCCC GCCGTAATGA GCGGGCTTTT TTTTGATCCC CGCCACCATA ACCCACGAAT 180 CCTAACAAGT CCCTGCATTC TCGATGGCTT TTTGGCTTTA ATCCGTTTTG GTTCAGGAAA 240 CTTACAAGAT CTTTTACGCT AGATGAAACT TGCCATCGAA CAGAATCCTG CAGATGAAAT 300 CTTTCAGCAC CATACATATC GGTAATTCAT AAAATGCTCC AGTGTCAAGC TCTCGCAACG 360 TAATCGTTGC TGTTCACGGA GTTCTTACTA GCTGCTCGGG CGATCAATTT GTCATTAGAT 420 TATGCAGTTA TAGGGAGAAC GGACACAAAA GGGAGGGACC TGACTGTACA CTGTACTCCC 480 GCTAGCACGT GTGTGTGATG ACACAGCTCA GAAGCATTGC AGTTGGACAA CCCCTAGATA 540 AGACTGCGCA AAGTAGGACA TATCTCTCAC TTTTCTTATT GTTTTCGGGC AAAACTAATC 600 CAGAACCTTT CTAAAGGCCC TGATCAATCA GGATTTCTGC GTGTCGACGT GATGCCACAC 660 CTGCTTGGGC AAGCACCTTC TGCAGGCGAA CTCCGTCAGA GTCATTGCGG CTTAAGAAAC 720 CCATCGACCA ATCGTCGTCG GATTTTACGT TTTGCTTCTT GGCAGGCTTA GCGTTGGAGA 780 GAAGAATCTC ATCCTTCTTC TGAGGCTGCT GGCGTGTGTT TGGGCGGGAT GATCCTGGCT 840 TGTAGCCACG AACTGAAGAC CGGTATCCGC CAGAGCGATT GCTCTGCTTC TTGTCCGGTG 900 TGCCATCTCG GCGAGCGGGT GGGGTCACGT AAGTGTCCTT AATCTTGAGA GAAAACGTAT 960 GAAATTGAAT CCCGTGAATT CTAGCCTATT TTAGGAGATT TTAATAGTCG GGGCTTTAAC 1020 TGATGCTTTA GAAGTCTTCA TCAATGGAGT CAACATCCGG CAAAAGCGGT GCTAGATCCG 1080 GTAATTTATC CAAAGAATCA ATACCCAACA GCTCAAGCAG GCAATTCCCG TTGTGCCCAT 1140 AGCGGTGCGC GCCCGTTGAT TCGTCCACAT CGACTTCTTT GACTAGG 1187 配列番号：１０ CTCAATTGCC TCGTCTGAAG GATGCTGACA CTGAACTGAC AGACGAGGAC CGGGCCTAAG 60 ATTTTTTCGG TGTATGGCGC GGGCTGTGAG GGGGATGTCG TCGATAAGCG TAGGGCCGAA 120 GAAGAAGCCC TCCTCGTGCC GTCTACGGCT GCACGTTACG CCGTCCACGA CTGATCTTGG 180 CAGCCGGTCT GGCCTCAGCG ATGCGACATA AGAAGCGACC TTCTCGCGGT GGCTGCGGTG 240 ATTAGTGGGC CCAGGTCCGC TCAGCCTGCT CGCGCCGGCA CCGTTGCCGA TGCGAAGGGT 300 GTCGATGCGG TCCTTGATCT TCTCAATGAG CTTTATTCCT GGGCTTTGGG AGCTTCAAAC 360 AGGAGGCATC AAATTTGGGG TAGTGCAGGG CCTTTGAATC CCACCTCACA GATAGTATTC 420 AGGCATTTCC TTGTCACGAT GGTTTATCCT TGGACACAAC ATCAAAAGTG GGGTACATCA 480 TATGCTTCCG GTTGAAAGTG ACCTATCTGA AAAGACTTGG CAGAACCTTA AGCAATGGTG 540 TGAACTGCGT TAACGAATTT TGTCGGACGT TAAAATGGCG CATTCTGCTT GCTGAAGTGG 600 CACACCTATG TGTTCTGCTT GGGATAGCAG TGCGGGAAAA ATTTGAAAAA GTCCGATTAC 660 CTTGAGGAGT ATTCAATGTC ATGACGCATT GCTTCAGAAA ACTGCGCTCC AAG 713 配列番号：１１ CTGAAGGAGT ACACCTTCGA TCTGCTCTAC AGATCTTTAG TGATAACAGA AACTCAGTAC 60 TCCGAAGATC TCTACTGACA GATCTTGGAT GGACCCGAGG ATGTTAAAGC GATTCCCTTC 120 GCTACAACAG CAACAAGGCC CTCAACAACC TTGGCTACGA AGGACTCTTC CCAGCGGATG 180 AAACCAAGGT GTCCCCAAAC ATCTTGTCTG CGCTGTCACC AAACGCTGAT GAGAACCACG 240 ACTTCTTCTC CGGCTCCGGT TCCTCTTACG TTATTGGTAA GGCAGAAAAC ACCCGAGGAT 300 GATGACCTGG GACTTTCTAA CTTTTAAAAA GCTGAAGCGG TCTACCGGCC TGTAGGGTAA 360 CCTCAACCCG TTAGAGCGTT TTCGGGTTTC CTGGTGGGGA CTTAAAGGTG CGGGGTTTTC 420 CGAAGCCGCA ATATCAGGGG TAAGGGACGA CCAGGCACCC CTGTGGCCCC TCGGCAGCGC 480 ATCACGCTTT AGGAGAAAAC GCCCCTGGAA TGGCGTCTCA ACCATTCAGA TTGAACCCCG 540 GCAGGGGGGA ATTATGAAAT CTGTGACAGG GGTTAACCGT GGGGGTGGGC TTCCTGGCAG 600 AAATGTCCGT CAAATTGTGA ACCCCTTCAC ACCTTTGGTT GAAAGCACTG CCCACAAGTG 660 ACTGAACCTG GCAGCGACCT CATGAATTGT TTGAAAAACA TTTTTTTTGG CACGAAAACG 720 GGGATACACG TTAGCTGCAT ACCAGCCTTT TTGGGTTGCA TCAGGATCCT GCCTGTGGCC 780 TTATGATCAG GCAGTGTTGT TAAAGGACGA TCGGTAATCC GAATGGTTCG TCCCGTAGTC 840 AGGAGGAACC TATGACCGCT GTGGCGCCTA GGGTCGACGG GCACGTGCCC CTCTACGAGG 900 CCCGAGCCCG ACAGGCCATG CACGCAAGGG CAGAAAGCAT GGTTAATGAT GACCACCACC 960 GGACCACAAG CAGCTTGGGC ATTATGTACA TCATTATGTC CTTCAG 1006 配列番号：１２ CTGCGTTGGC CTTAAGGGAG ATCACTTCAA TTTCTTCATT GTGAGGCAGC CAGAACTCCA 60 CCACCTTTTC CTGCTCTGAA AGTCCATCCA CTGTGAAGCA CCTGCGGATC TTCCAGACGC 120 CGTTCCGTGG CGCCGGTGAT GAAATTGACT TCCGTGGTCT CGCCCCCGGA GGTTGGCGTG 180 GAAGATGTGG GGGCGCCGTC GATAAGCACA TCAATCTTGC CGCCCGGCCG GCCGGAATCG 240 AGGTACACCA CCGAGTGGAN TACGTGGTCA GCGTGAAGGA GGTGGCGGTT GGTGCGACAC 300 ACACGGCACG CCCGTTGGTT GGCGTTCCAT CGCGCTAACT TGGGATCACA GTACGGTCTA 360 CTTATTCCTT TGCTGAGCCA ATCGGGCGAA GGCCCCTTGT TAGTGGTTCA ATTTCGGTTG 420 CGCCGTGAAT TAAATTCGGG ATTTCATGAG CTTAACCGTA CCGCTCTTGC AGAGTTCACA 480 GGGTAAACCC TAAATGGAAC AACCCATTGC CAATATGTTG GTTAAGTTGT ACGCAAGTAA 540 ATCTTTTCAA TCGTGGAAGC AGGGCTCACA GTCTAATGGC ACGTATGCAG GAAAGCGCCG 600 ATCTTCCAAA TGTTCCTTCT GCGGAAAGAG CCAAAAGCAG GTAAAAAAAC TTCATCGCGG 660 GTGGCGCCGG TATATATCTT GTGATGAGTG CATTGAGCTT GTGCAACGAG ATTATTGAAG 720 AAGAACTCAG GTCAAGA 737
【請求項４】コリネ型細菌染色体から得られるコリネ
型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片であっ
て、宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の少くとも１
つの物質を宿主コリネ型細菌が利用可能な少くとも１つ
の他の物質に変更することにより、該ＤＮＡ断片の有す
るプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片。
【請求項５】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の
少くとも１つの物質がグルコース、フルクトース、エタ
ノール、カゼイン加水分解物および酵母抽出物より成る
群から選ばれる少くとも１つの物質であり、宿主コリネ
型細菌が利用可能な他の少くとも１つの物質がグルコー
ス、フルクトース、エタノール、カゼイン加水分解物お
よび酵母抽出物より成る群から選ばれる少くとも１つの
物質である請求項４記載のＤＮＡ断片。
【請求項６】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の
少くとも１つの物質がグルコースであり、宿主コリネ型
細菌が利用可能な他の少くとも１つの物質がエタノール
である請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の
少くとも１つの物質がエタノールであり、宿主コリネ型
細菌が利用可能な他の少くとも１つの物質がグルコース
である請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項８】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の
少くとも１つの物質がグルコースであり、宿主コリネ型
細菌が利用可能な他の少くとも１つの物質がフルクトー
スである請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項９】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中の
物質がグルコース、カゼイン加水分解物および酵母抽出
物であり、宿主コリネ型細菌が利用可能な他の物質がグ
ルコースである請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項１０】宿主コリネ型細菌が利用可能な培地中
の物質がグルコースであり、宿主コリネ型細菌が利用可
能な他の物質がグルコース、カゼイン加水分解物および
酵母抽出物である請求項５記載のＤＮＡ断片。
【請求項１１】コリネ型細菌染色体が、ブレビバクテ
リウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２
３３から得られる染色体である請求項４記載のＤＮＡ断
片。
【請求項１２】下記配列番号：１３および配列番号：
１４で示される塩基配列より成る群から選ばれる少くと
も１つの塩基配列を含むコリネ型細菌内でプロモーター
機能を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で、
培地中のグルコースをエタノールに変更することによ
り、該ＤＮＡ断片の有するプロモーター機能が制御可能
なＤＮＡ断片。配列番号：１３ CTACTTCTTC TTCACCGAAG TATTCCTTAG GGTCGATCTC GTTACCCTCG GAGTCCTTCA 60 CGTTTACGCG GCAGATAGCC TGTGCAAGAG CCTTGCCACG GCGAACGTCG GAGAAGAGGT 120 TCGCGATCTG GCCGGACTGC TGCAGCTGAC CGATGAACTG GTTTGGGTCC ATGCCGTAAG 180 ACTGTGCGGT GAACAGGATG TGGTCGGTGA GCTCCTCGTG CCGCTGATGC GACTTCGAGT 240 CCGATCCAGC CACCACCGAT GAGGACCAGC TTTTTACCTT CACCGAAGTT GCCTTGATCG 300 CGTCAGAGTC TTCCACGGCG CGCAGGTAGT GCACATTAGA GCCGTCGGCT CCGGAATTGG 360 AAGTTTGCGA CTGCTGAGCA AGTAGCAAGA ACTAGTTTGT CGTAGTTAAT GGTCTCAGTG 420 TTTCCGCCAT CATCAACGGT GACTTGGCGT GAACCCGCAT CAATTGCCGT GACGCACACC 480 TTGACGCAGC GTGACATTGT TTTCTTTGTA CCACCCCGCC GGGTGAACAA TCGCCTTTTC 540 AAAGCCTACT TTTCCCGCCA TGTACTCCTT TGACAGCGGT GGGCGTTCAT ATGGCAGATG 600 ATTTTCTGCT GCGATGAGCG TGATGGAGCC TTCATGCCCG TTTACACGCA GTGCCTCTGC 660 GGTTTTCGCT CCGGCTGAAC CGCCGCCGAT GATGACGATG CTTTGTGGTG TGCTCATGCT 720 GTACTCCTAG TCCCTAAAAA GTGGACGGTC AGGCGCAAGG TCGACCGCAT GGTCTATACG 780 CCATGCTAGT TAAAAGGCCG AAACCCTCGG CGAGCGCGCT AAATACCCGG CCCCAATTGG 840 GGGTGTGAGG CAGCACACAA GACGAAACCC TAACGAAATC GCCAGACTCC TCGCAATCAC 900 AAGAAGCGAC GACTAGCCTG TGGGGACAAA CTATCTCAAG AATTTATTCA ACAAAGGAGT 960 TCTTCGCACA TGAAGGAAGT AGCAGTCAAC GAAGTCCCAG CAGGCGCGCA GCTAATGCAC 1020 TGTCACTGTT TCGACGTGAT GTGCATCGGT TTACGTGGTG GCGTGGTTCA CACATTGCTC 1080 CATCGGGCAT TGGTGCGTCA ATCGGTTTGG GTTTTTAAGT TTTGTGCGGG GGTGGTCACC 1140 CCTGTTGTGA ACTTTGCAAA GTTATGACTT CGCAGAAAAA GTCGGCGGGG GAGTTGCTAG 1200 TACGGATGTA CTGGGCAAAT GCTCTGAAAT GGGAAAATGC AGGCACCACA ACTTTCCGTA 1260 GTTTTGAAGG TGTGACCTAG ATAAAAGTCG GGGTTAGGCG GGGGTAAATG ACTAGGTAAA 1320 GGTTCGCAAA CCCCCTTTTG TTGGTGACGG TGATCACTTA GTCTGATCAC ATCGCCAAAC 1380 ACGATAAGGG TTGAAATCGA AAGAAGAGCG GCACCTAGAT TCCAGAGGTA GCCAGAGTGC 1440 TTTTCTTAAA AGAGTTTTCA CAACCGTTAA CGGCGTAGCC AAACAAGAAG GATTCGCATT 1500 NCAGCTTCTG GTTTAGGCAC AGGTCATCTA AAACCCATGC TTTAAAAGGA GCCTTCAATG 1560 ACTGAACAGG AACTGTTGTC TGCTCAGACT GCCGACAACG CTGGAACTGA CAGCACCGAA 1620 CGCGTTGACG CGGGCGGAAT GCAGGTTGCA AAAGTTCTCT ACGACTTTGT AACCGAAGCG 1680 GTACTCCCTC GCGTGGGTGT GGATGCGGAA AAGTTCTGGT CCGGATTCGC CGCCATCGCC 1740 CGGGACCTCA CCCCACGCAA CCGCGAACTG CTTGCTCGTC GCGATGAACT GCAGACGCTT 1800 ATCGACGACT ACCACCGCAA CAACTCCGGC ACCATCGACC AAGACGCGTA CGAGGATTTC 1860 CTTAAAGAAA TCGGATACTT GGTTGAGGAG CCAGAAGCTG CAGAAATCCG TACCCAAAAC 1920 GTCGATACGG AAATCTCCAG CACCGCAGAC CTCAGCTGGT TGTGCCAATT CTGAACGCAC 1980 GTTCGCGCTG AATGCTGCCA ATGCTCGTTG GGGTTCCCTC TACGATGCGT TGTACGGCAC 2040 CAACGCCATC CCAGAAACTG ATGGCGCTGA AAAGGGCAAG GAGTACAACC CGGTCCGCGG 2100 CCAGAAGGTC ATCGAGTCGG GTCGTCAATT CCTCGACAGC GTTGTCCCAC TGGACGGGTG 2160 CTTCGCATGC CGATGTTGAG AAGTACAACA TCACGGATGG AAA 2203 配列番号：１４ CCTCATGGAT GTTGACATCG ATATGGATTC CGACATCTGA GCAGATCCTC TCCTGGCGGA 60 CACAGACGCA TCCCTGCTCT CCCTGGAAGC TGGCACCTGT GACCGTTGCC TTCGACACGA 120 CACATGCTGA CCACCCTGGA GAACTCCGGC CTATCGTGCC GATCGTTCCA GGCGCTGTGA 180 TTTTTGATTT GTTGGTGGGC GATCCCAAAA ACAGGCCGCT GAGAAAGTTT TCCACACTAA 240 AATAGTGTGA TTCTGCCGAA TCTGTTGTTT TACTTTTGAA ACTGCGGGAT CATGAAAAGT 300 AGTGAAAAGT GAATTTTAGT TCTGTGCTTT CTCTTCCCTT TAAGTGAACC TTTTGTTGGA 360 TCTTCATTAA AAAAATGAAA ACCTCGTCGG AATGCAACTT GGGATCACTG TCTCGGGCAA 420 GAAACGGCCT TAAAAAAGGG GAGTGATTGT GAGTGCTTGA TTTCTTAGCT GCGAACCCGC 480 TTGATTGCTG CTTGGTGGTT ATTTTGGCCA CGGGTGACCA CTCCCAGACT CAGCTGCCAG 540 GTGGTCAGTG G 551
【請求項１３】下記配列番号：１５で示される塩基配
列を含むコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で培地中のエタノー
ルをグルコースに変更することにより、該ＤＮＡ断片の
有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片。配列番号：１５ GATCCTCATG GATGTTGACA TCGATATGGA TTCCGACATC GAGCAGATCC TCTCCGGCGG 60 ACACGACGCA TCCCTGCTCT CCCTGGAAGC TGGCACCTGT GACGTTGCCT TCGCACACGA 120 CACCATGCTG ACCACCCTGG AGAACTCCGG CCTATCGTGC CGATCGTTCC AGGCGCTGTG 180 ATTTTTGATT TGTTGGTGGG CGATCCCAAA AACAGGCCGC TGAGAAAGTT TTCCACACTA 240 AAATAGTGTG ATTCTGTCCG AATCTGTTGT TTTAGTTTTG AAACTGCGGG ATCATGGAAA 300 GTAGTGAAAA GTGAATTTTA GTTCTGTGCT TTCTCTGCCC TTTAAGTGAA CCTTTTGTTG 360 GATCTTGCAT TAAAAAAATG AAAACCTCGT CGGGAATGCA ACTTGGGATC ACGTCTCGGG 420 CAAGAAACGT CCTTAAAAAA GGGGAGTGAT TGTGAGTGCT TGATTTCTTA GCTGCGAACC 480 CGCTGATTGC GCTGGTGGTT ATTTTGGCCA CGGTGACCAC TCCCGACTCG GCGCCGGTGG 540 TCGTGGATC 549
【請求項１４】下記配列番号：１６で示される塩基配
列を含むコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で、培地中のグルコ
ースをフルクトースに変更することにより該ＤＮＡ断片
の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片。配列番号：１６ TGGGGCCGGT GGCAATGCAT CAGGGAGATT TGGATATACG GCCCACAATT CTTTGGTTCC 60 GGTCGATGGG GTAGTGAAGG TGACACGGGA TCCGATGGTG ACGTTGCTGA TCTCTGTTTC 120 TTTTACATTC GCGGTGATCT TCAGTTCGGA ATCATCAGCA ACACTCAACA GTGCGCCGGC 180 TGCTGGTTGA CCTTGGGCTG CCTGCCACGG ATGAACAATG CCTGAGTATG GGGATCGACG 240 GTGGTGTGTT GATATCATCC GAACTGGGAC GTGATCTGGT GGCGCTTAAT ATCTACTGAT 300 GCAACCTAAA GTGCATAATG CGCTTATTTT CTCCAATGGT GTTGGTGAAA ATCCCGTCTC 360 GAGCCAAGTT TGCGCTTGTG TGCTATTGGG CTCATCACGG CGCCTGTGCA GCGGCTAGTC 420 TGAGTCAACT TTTCCGAGTG AATCAATGTA GATCCGCTCG GCTTTTTCTA GACCTTCAGT 480 GGTGGATGCA ACGCGTCGCT CAGTTTCCTC CAAAACGGTG TAGGACTGCA AGTTAGGCTG 540 GTCCTGGCTA GGCCACTGGA GGTTTTGGAA GCAATGATGT ACCGGCCTGC AACCTTGCTA 600 TAATGCGGGG TACACGGTTT CCACTGCGGC GCGTGCTTCT GCTGCAGGAC TGCCTCTAGG 660 TCACCTTCCA ACGCGGGCTT GAGCAAGTTC GGATTCCGAG AAGCAAATAT CTCTCTCATC 720 GAAAGCCATT TGCATCGTGA GGTTCTGCGA TCGTGGTGAA AGTCAAAGTC GGCGAGCGTC 780 AGTCGGTCAA TTTCAAGCAG CATCCAGTCG TTCAATTTCA GCAGCATCTG CTTGCTCACG 840 GGCTGCCTTG AGAGCATCCG ATTCAGCGAC CATGGTGGAA TCCAATCCGC ATCCACATCT 900 CGGTTCTTCG CTTCAAAACT GCGGATCGAT CCTGATATGC TGTGAGGACG CCGAACAGGG 960 ACGGCGCGAG TTGATCTCCG GGTCAAACCA TATCAAGAGT CCCTGGCTGT TATATGTTCT 1020 GCGCTGCGCG TGGATTCGGT CGCATGTTCA CGCGATTGTT GGATAGTTCA TCACTGTCGT 1080 TCAGGGAGAG GATCACTCAG CCACACTGTC AGTGCACACG GTACACCGAA CCGGAAGTGG 1140 GACGGACAGT ACCTGTGTAA TGGTGGTGGT TCGCGCAGCT TCAATATTCC GTTGACTCTC 1200 AAACAAAGGA ATTAAATATT AAGCGCGCCC CCCCTTAAAT TCCTTAAAAA ACTTAAATCC 1260 CAGGGAACTC CCAATCAAAA GAAACCGGGG GTCCCTTTAA CCAAATAATC TGCACCCATG 1320 ATAAAATAGC CAGGCGCATG GTATTCTGGG CCAGAAACAA GTGTATCCGC ATTAATGCCC 1380 CAAACCAGTA CCCGGGAACC TTCAAAGTCT TACAAAGCTA ACCAAATGCA GGTCGAAATC 1440 CATCCAGACA TCCGGACCAC TACTTGTTTC CCTAGAACCC CCATTCATCA CTCCGAATGG 1500 GTATGCTGAC GATAATGAGT CCTTATCGAC AGGCTGATTC TGCTGGAACC CCACATTTGG 1560 AACGTACGCG AGAACCTTCG GCGAAGCTTT TCGGTCGCGG CCGTTATCTT TTTAAGAGGA 1620 GAAATTTTAG ATGAGCACGT CCACCATCAG GGTTGCCATT GCCGGAGTCG GAAATGCGCG 1680 ACCTCCCTCA TTCAGGGTGT GGAATATACC GAAATGCGGA ACCTCCGAAA TGTCCCGGTT 1740 TGCTGCACTT CAATTCGGTG ATTACCACGT TGGCGCATGA TTCGTTGCCG GTTCACGTCG 1800 ACGCCGAAAA GTAGCAGGAA TTCCCCGCAC GGGGTTACAA ACTGCATTAT CAAATGCCAG 1860 TCCGAGCCGA ATAACGGTGT TGGCCGATTT GAGGCTGGGT TCATACGGGA CATGACGGTC 1920 ACGCGGGCAT GGCGTGTCAG GGTTATGCGG AAAACCCTTT TTGAGCCCAC CTCATGGTCC 1980 AGAGCGCAAT TTCGGAAGCG AAAATTCTAC GCACAAGCGC CATCGATTGC AGTGCGCCTT 2040 TGTCAACGCT CTCCCAGTAT TCATCGCCTC CGACCCTGAG TGGGCTAAGA AGTTAACTGA 2100 GGCTGGCATC CCAATTGTTG GCGATGACAT CAAATCCCAG ATCGGTGCAA CCATCACCCA 2160 CCGTGTCCTC GCACGCCTTT TTGAAGAACG TGTCGTTCGC GTAGATCGCC ACCTGCCGGA 2220 CCATTCTGGG AACTGGACAG CAGAATAT 2248
【請求項１５】下記配列番号：１７で示される塩基配
列を含むコリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で、培地中のグルコ
ース、カゼイン加水分解物および酵母抽出物の混合物を
グルコースに変更することにより、該ＤＮＡ断片の有す
るプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断片。配列番号：１７ GATCCAAAAA GTCGGCGCAG CTGACTGGAG CTTCTGGGAA GCCAAAGTCC GCGCCCGCGA 60 CTACGCCCTG GACGAAACCG AACTGCGCAA CTACTTCCCA CTGAACCAAG TACTCTGTGA 120 CGGCGTCTTC TTCGCTGCTA ACCGCCTCTA CGGAATCACC GTGGAACCAC GCCCTGACCT 180 GCGCGGTTAC GCCGAGGGCG TGGACGTCTG GGAAGTCCTC GATTCTGACG GCTCCGGCAT 240 CGGCCACAAG TGCGATGCGC CCCTTCCGGG TCGGCGAGGC GGTGATCTTG CGGTGTCTAC 300 CTGGGGTCGA CTGTCGAGTC GTGGTCCGCA TTGAACTTCT TTCCGTGGTG TTTATCTTTT 360 CATCACAAAC AATCACGACG GTATACCCAT CGGAGACGAT ATCGTGATCT TTCTGTTACC 420 TGCGGAAGGT AACATTAGTA TTTCAACTCG ACAGAGTCCA TCCTGGAAGC GTGTATGACG 480 ATTTCTTCAC ACATTCTTTA CAATGGCCTT TCGTGCGATA ATGCTAGGCA TGCTTCGATG 540 GACTACAGCA GGTGAATCCC ACGGATC 567
【請求項１６】下記配列番号：１８〜配列番号：２０
で示される塩基配列より成る群から選ばれる少くとも１
つの塩基配列を含むコリネ型細菌内でプロモーター機能
を有するＤＮＡ断片であって、コリネ型細菌内で、培地
中のグルコースをグルコース、カゼイン加水分解物およ
び酵母抽出物の混合物に変更することにより、該ＤＮＡ
断片の有するプロモーター機能が制御可能なＤＮＡ断
片。配列番号：１８ CTGGTTTTGG CGGTAGGCAA ACATGCCTTT GAGGGTAGAT GCCGGTAGGC GGAGTGCTCA 60 CGGAATCTGT GATGAGTGTG CCGCCGTCTT GGTCGATGAA ATTGTGCACG TGACGCCAGT 120 TTGCGAGGGC CTTTACGGGG GCGGTCAGAC AGACGTCGGT GAAGCGTGAA CCATTCAAAA 180 ATCCCGATAA ATCATGGCGC GCCACCCATT TAAGTCCCGC AGGAAGGCTG AAAATGGTGG 240 TGCCATCGGA GAGGCGTTCT GCCTGCGCAA TGGGGTTAAG GGGGACGAAT GGCGGAGTCA 300 GACGTGTGAC AGCGCCCTTA CGGGTATGCC AATCCCAGAC CATTTCTCGG GGAAAAGGAA 360 TAAAATGGCT TGTGGTCAGA CTCACAGGGG CTTCTCCAAG TCAGTGGATT TATGAGGTCC 420 CAGTGGGTAC ACACCGGGTG TCCTACAACG ATCAATTGTC ACAGATTCGA CTGGCATGCT 480 GTACCATCTG CTTTAAGCAT TTTGGTGTTT CACTGTTGTT AACAGTGTTT CACCGTGGAG 540 CACTACCTAA AGATCATAGT CAGCATCTTG GGGTGAATGT GACACGGTAC GCTATAGTGT 600 CAGACAACAA CCAGGAAACT GGTCGTTGCA GAGTTTTTGC AAAATTGGAC ATCCTTTAAC 660 GGACCGCACA GAGAGGCGGG AAGGAGGTCA CGATGAGCGA ACGTAATAGT GCTGTACTAG 720 AACTCCTCAA TGAGGACGAC GTCAGCCGTA CCATCGCACG CATCGCGCAC CAGATTATTG 780 AGAAAACCGC GCTTGATTCC AAATACGCGG ATCGGGTCAT GTTGTTAGGC ATTCCTTCAG 840 GTGGAGTCCC GCTGGCCCGA AGGCTTGCTG AAAAGATCGA AGAATTTTCC GGCGTTTCGG 900 TAGATACCGG CGCTGTTGAT ATCACCTTGT ACAGGGATGA TCTTCGAAAC AAACCGCACC 960 GCGCACTGCA GCCCACCTCT ATTCCGGCAG GTGGTATCGA TAACACCACC GTGATTTTGG 1020 TGGATGATGT GCTGTTTTCC GGTCGTACTA TNCGCGCTGC ACTTGATGCA TTGCGCGACG 1080 TTGGACGCCC AAACTATATC CAATTAG 1107 配列番号：１９ GGATCCGGTA ACCGTTTTTA TCAGGCTCTG GGAGGCAGAA TAAATGATCA TATCGTCAAT 60 TATTACCTCC ACGGGGAGAG CCTGAGCAAA CTGGCCTCAG GCATTTAAGA AGCACACGGT 120 CACACTGCTT CCGGTAGTCA ATAAACCGGT AAACCAGCAA TAGACATAAG CGGCTATTTA 180 ACGACCCTGC CCTGAACCGA CGACCGGGTC GAATTTGCTT TCGATATCTG CCATTCATCC 240 GCTTATTATC ACTTATTCAG GCGTAGAACC AGGCGTTTAA GGGCACCAAT AACTGCCTTA 300 AAAAAATTAC GCCCGCCCTG CCACTCATCG CAGTACTGTT GTAATTCATT AAGCATTCTG 360 CCGACATGGG AGGCCATCAC AAACGGGCAT GATGAACCTG AATCGCCAGC GGGCATCAGC 420 ACTTGGTCGC CTTGCGTATA AATATTTGCC CCTGGTGGAA AACGGGGGCG AAGAGGTTGT 480 CCCATATTTG GCCACGGTTT AAATCAAAAT TGGTGGAACT CACCCTGGGT TTGGCTAGCG 540 ATCCGGGTTG ACATCTGCAG GCGGGAAATT GAAAAGGCCG GATAAAACTG GTGCCTATTT 600 CCTTTAACGG TCTTTAAAAA AGGCCCGTAA TACCCAACTG AAACGGTCTG GTTATAGTAA 660 CATTGGACAA CTGGACTGGA AATGCCCTCC AAATGGTCCT TTACGATGCC CAATTGGGGA 720 TATATCCAAC GGTGGTATAA CCCAGTGATT TTTTTTCCTC CCATTTTTAG CTTCCTTTAG 780 CTCCTGAAAA TCTCGATAAC TCAAAAAAAT ACGCCCGGTA GTGATCTTAT TTCATTATGG 840 TGAAAGTTGG AACCTCTTAC GTGCCGATCA ACGTCTCATT TTCGCCAAAA GTTGGCCCAG 900 GGCTTCCCGG TATCAACAGG GACACCAGGA TTATTTATTC TGCGAAGTGA TCTTCCGTCA 960 CAGGTATTTA TTCGGCGCAA AGTGCGTCGG GTGATGCTGC CAACTTACTG ATTTAGTGTA 1020 TGATGGTGTT TTTGAGGTGC TCCAGTGGCT TCTGTTTCTA TCAGCTGTCC CTCCTGTTCA 1080 GCTATTGACG GGGTGGTGCG TAACGGAAAA GCACCGCCGG ACATCACCGG ATCTCAAGAA 1140 GACCTTTGAA CTGTTCAACG GATCCCCAGG GGCAGGCGGT ACACCGCGCC CTCGGACGTA 1200 TCGGAGTTTC TGGCGTTTCC GATGTCCGTC AGGGAAAGCG CTTCGAGCTT GAGGTAGATG 1260 ATTCCGTCAC CGAAGCTGAC CTAAAGAAAA TTGCTGAAAC CCTCCTCGCA AACACCGTCA 1320 TCGAAGACTT CGATGTGGTG GGAGTTGAGG TCGCGAAGTG AGCGCCAAAA TCGGTGTCAT 1380 TACCTTCCCA GGCACCCTTG ACGATGTAGA TGCAGCACGC GCTGTTCGCA TCGCAGGTGC 1440 AGAAGTAATC AGCCTGTGGC ACGCTGACGA GGATCTCAAG GGCGTCGACG CAGTTGTCGT 1500 TCCCGGTGGA TTCCTCCTAC GGCGATTACC TGCGCACCGG TGCAATCTCT GCACTGGCGC 1560 CAGTAATGCA GTCCGTGATT GAGCAGGCCG GTAAGGGTAT GCCAGTCTTG GGCATTTGCA 1620 ACGGCTTCCA GATCCTCACC GANGCACGCC TGCTTCCAGG CGCGCTGACC CGCAACAAGG 1680 GTCTGCACTT TCACTGTGTA GACGCACACC TCGTTGTAGA GAACAACACC ACTGCATGGA 1740 CCAACACTTT GGAAAAGGGG CAGCAGATCC TTATTCCTGC AAAGCACGGT GAAGGTCGCT 1800 TCCAGGCAGA CGGCAGAGAC CATTCGCCCA GCTTTGAGGG TGAAGGCCGC GTGGTGTTCC 1860 GTTACAACGA TAACTTCAAC GGTTTCCGTA GACCTACCAA GCCGGTATCA CTAATGAAAC 1920 TGGTCGCATC GTCGGTCTCA TGCCGCACCC GGAACATGCC GTCGAAAAGC TAACCGGCCC 1980 ATCTATTGAT GGCCTGGAGC TGTTCCTGTC CGCCGTTGGC ACCATCGCGG CTTAAGAGGA 2040 GTCAAAATAT GAGCACTTTT GTCAATGACA CCGTCGAGAG CAATCAAGAC CCCTGAGATC 2100 AATTCTGGGA TCTGA 2115 配列番号：２０ ATATTCTGCT GTCCAGTTCC CAGAATGGTC CGGCAGGTGG CGATCTACGC GAACGACACG 60 TTCTTCAAAA AGGCGTGCGA GGACACGGTG GGTGATGGTT GCACCGATCT GGGATTTGAT 120 GTCATCGCCA ACAATTGGGA TGCCAGCCTC AGTTAACTTC TTAGCCCACT CAGGGTCGGA 180 GGCGATGAAT ACTGGGAGAG CGTTGACAAA GGCGCACTGC AATCGATGGC GCTTGTGCGT 240 AGAATTTTCG CTTCCGAAAT TGCGCTCTGG ACCATGAGGT GGGCTCAAAA AGGGTTTTCC 300 GCATAACCCT GACACGCCAT GCCCGCGTGA CCGTCATGTC CCGTATGAAC CCAGCCTCAA 360 ATCGGCCAAC ACCGTTATTC GGCTCGGACT GGCATTTGAT AATGCAGTTT GTAACCCCGT 420 GCGGGGAATT CCTGCTACTT TTCGGCGTCG ACGTGAACCG GCAACGAATC ATGCGCCAAC 480 GTGGTAATCA CCGAATTGAA GTGCAGCAAA CCGGGACATT TCGGAGGTTC CGCATTTCGG 540 TATATTCCAC ACCCTGAATG AGGGAGGTCG CGCATTTCCG ACTCCGGCAA TGGCAACCCT 600 GATGGTGGAC GTGCTCATCT AAAATTTCTC CTCTTAAAAA GATAACGGCC GCGACCGAAA 660 AGCTTCGCCG AAGGTTCTCG CGTACGTTCC AAATGTGGGG TTCCAGCAGA ATCAGCCTGT 720 CGATAAGGAC TCATTATCGT CAGCATACCC ATTCGGAGTG ATGAATGGGG GTTCTAGGGA 780 AACAAGTAGT GGTCCGGATG TCTGGATGGA TTTCGACCTG CATTTGGTTA GCTTTGTAAG 840 ACTTTGAAGG TTCCCGGGTA CTGGTTTGGG GCATTAATGC GGATACACTT GTTTCTGGCC 900 CAGAATACCA TGCGCCTGGC TATTTTATCA TGGGTGCAGA TTATTTGGTT AAAGGGACCC 960 CCGGTTTCTT TTGATTGGGA GTTCCCTGGG ATTTAAGTTT TTTAAGGAAT TTAAGGGGGG 1020 GCGCGCTTAA TATTTAATTC CTTTGTTTGA GAGTCAACGG AATATTGAAG CTGCGCGAAC 1080 CACCACCATT ACACAGGTAC TGTCCGTCCC ACTTCCGGTT CGGTGTACCG TGTGCACTGA 1140 CAGTGTGGCT GAGTGATCCT CTCCCTGAAC GACAGTGATG AACTATCCAA CAATCGCGTG 1200 AACATGCGAC CGAATCCACG CGCAGCGCAG AACATATAAC AGCCAGGGAC TCTTGATATG 1260 GTTTGACCCG GAGATCAACT CGCGCCGTCC CTGTTCGGCG TCCTCACAGC ATATCAGGAT 1320 CGATCCGCAG TTTTGAAGCG AAGAACCGAG ATGTGGATGC GGATTGGATT CCACCATGGT 1380 CGCTGAATCG GATGCTCTCA AGGCAGCCCG TGAGCAAGCA GATGCTGCTG AAATTGAACG 1440 ACTGGATGCT GCTTGAAATT GACCGACTGA CGCTCGCCGA CTTTGACTTT CACCACGATC 1500 GCAGAACCTC ACGATGCAAA TGGCTTTCGA TGAGAGAGAT ATTTGCTTCT CGGAATCCGA 1560 ACTTGCTCAA GCCCGCGTTG GAAGGTGACC TAGAGGCAGT CCTGCAGCAG AAGCACGCGC 1620 CGCAGTGGAA ACCGTGTACC CCGCATTATA GCAAGGTTGC AGGCCGGTAC ATCATTGCTT 1680 CCAAAACCTC CAGTGGCCTA GCCAGGACCA GCCTAACTTG CAGTCCTACA CCGTTTTGGA 1740 GGAAACTGAG CGACGCGTTG CATCCACCAC TGAAGGTCTA GAAAAAGCCG AGCGGATCTA 1800 CATTGATTCA CTCGGAAAAG TTGACTCAGA CTAGCCGCTG CACAGGCGCC GTGATGAGCC 1860 CAATAGCACA CAAGCGCAAA CTTGGCTCGA GACGGGATTT TCACCAACAC CATTGGAGAA 1920 AATAAGCGCA TTATGCACTT TAGGTTGCAT CAGTAGATAT TAAGCGCCAC CAGATCACGT 1980 CCCAGTTCGG ATGATATCAA CACACCACCG TCGATCCCCA TACTCAGGCA TTGTTCATCC 2040 GTGGCAGGCA GCCCAAGGTC AACCAGCAGC CGGCGCACTG TTGAGTGTTG CTGATGATTC 2100 CGAACTGAAG ATCACCGCGA ATGTAAAAGA AACAGAGATC AGCAACGTCA CCATCGGATC 2160 CCGTGTCACC TTCACTACCC CATCGACCGG AACCAAAGAA TTGTGGGCCG TAT 2213