JPH0515378A - 組換えプラスミド及びそれを含む微生物並びにそれらを用いるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
組換えプラスミド及びそれを含む微生物並びにそれらを用いるｌ−トリプトフアンの製造法Info
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- JPH0515378A JPH0515378A JP17083991A JP17083991A JPH0515378A JP H0515378 A JPH0515378 A JP H0515378A JP 17083991 A JP17083991 A JP 17083991A JP 17083991 A JP17083991 A JP 17083991A JP H0515378 A JPH0515378 A JP H0515378A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 上流にｔａｃプロモーターが結合したブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来のトリプトファ
ンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミ
ドｐＢＹ５０３由来の複製増殖機能を司る遺伝子を含む
ＤＮＡ断片及び安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片とから成る組換えプラスミド。このプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌を用いて、少くともグルコース
とインドールを含有する水性溶液中で菌体の増殖を伴わ
ない反応形式により酵素反応させてＬ−トリプトファン
を製造した。 【効果】 この発明のプラスミドで形質転換されたコリ
ネ型細菌を用いることによりＬ−トリプトファンを効率
的に製造することができる。
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来のトリプトファ
ンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プラスミ
ドｐＢＹ５０３由来の複製増殖機能を司る遺伝子を含む
ＤＮＡ断片及び安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片とから成る組換えプラスミド。このプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌を用いて、少くともグルコース
とインドールを含有する水性溶液中で菌体の増殖を伴わ
ない反応形式により酵素反応させてＬ−トリプトファン
を製造した。 【効果】 この発明のプラスミドで形質転換されたコリ
ネ型細菌を用いることによりＬ−トリプトファンを効率
的に製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換えプラスミド及びそ
れを含む微生物並びにそれらを用いるＬ−トリプトファ
ンの製造法に関し、更に詳しくは、プロモーターの付与
されたトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ領域と、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖能及
びプラスミド安定化機能を有するＤＮＡ領域から成るプ
ラスミド及びこのプラスミドで形質転換されたビオチン
要求性のコリネ型細菌並びにこの微生物の存在下に、イ
ンドールとグルコースとを菌体の増殖を伴わない反応形
式により酵素反応せしめ、得られた反応液からＬ−トリ
プトファンを採取するＬ−トリプトファンの製造法に関
する。
れを含む微生物並びにそれらを用いるＬ−トリプトファ
ンの製造法に関し、更に詳しくは、プロモーターの付与
されたトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ領域と、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖能及
びプラスミド安定化機能を有するＤＮＡ領域から成るプ
ラスミド及びこのプラスミドで形質転換されたビオチン
要求性のコリネ型細菌並びにこの微生物の存在下に、イ
ンドールとグルコースとを菌体の増殖を伴わない反応形
式により酵素反応せしめ、得られた反応液からＬ−トリ
プトファンを採取するＬ−トリプトファンの製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、組換えプラスミドで形質転換され
たコリネ型細菌を用いるＬ−トリプトファン製造に関連
する技術としては、大腸菌染色体由来のトリプトファン
シンターゼ構造遺伝子とトリプトファンプロモーターか
らなるＤＮＡ領域を保有する組換えプラスミドを用いる
トリプトファンシンターゼの製造法が提案されている
（特開平２−７２８７６号公報参照）。
たコリネ型細菌を用いるＬ−トリプトファン製造に関連
する技術としては、大腸菌染色体由来のトリプトファン
シンターゼ構造遺伝子とトリプトファンプロモーターか
らなるＤＮＡ領域を保有する組換えプラスミドを用いる
トリプトファンシンターゼの製造法が提案されている
（特開平２−７２８７６号公報参照）。
【０００３】しかしながら、かかる異種遺伝子を細胞内
で発現させる方法では、一般に遺伝子産物、すなわち蛋
白質が細胞内の蛋白分解系を受けやすく不安定であると
考えられる。
で発現させる方法では、一般に遺伝子産物、すなわち蛋
白質が細胞内の蛋白分解系を受けやすく不安定であると
考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トリプトフ
ァンシンターゼ構造遺伝子を有する宿主内で安定な組換
えプラスミドを造成し、該プラスミドを保有するビオチ
ン要求性のコリネ型細菌を用いて、新たな観点からより
効率的なＬ−トリプトファンの製造法の確立を目的とし
てなされたものである。
ァンシンターゼ構造遺伝子を有する宿主内で安定な組換
えプラスミドを造成し、該プラスミドを保有するビオチ
ン要求性のコリネ型細菌を用いて、新たな観点からより
効率的なＬ−トリプトファンの製造法の確立を目的とし
てなされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意検討を行った。その結果、今回、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡ領域とプラスミドｐＢＹ５０３の安定化機能を
担う遺伝子を含むＤＮＡ領域を利用すれば、合成プロモ
ーターが付与されたコリネ型細菌由来のトリプトファン
シンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＢ及びｔｒｐＡ）がコリ
ネ型細菌内で安定に高発現可能なことを見い出し、さら
にこのプラスミドを保有するコリネ型細菌を用いて、菌
体の増殖を伴わない反応形式によりインドールとグルコ
ースを酵素反応させれば、効率的にＬートリプトファン
が製造可能なことを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
達成すべく鋭意検討を行った。その結果、今回、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含
むＤＮＡ領域とプラスミドｐＢＹ５０３の安定化機能を
担う遺伝子を含むＤＮＡ領域を利用すれば、合成プロモ
ーターが付与されたコリネ型細菌由来のトリプトファン
シンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＢ及びｔｒｐＡ）がコリ
ネ型細菌内で安定に高発現可能なことを見い出し、さら
にこのプラスミドを保有するコリネ型細菌を用いて、菌
体の増殖を伴わない反応形式によりインドールとグルコ
ースを酵素反応させれば、効率的にＬートリプトファン
が製造可能なことを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】かくして本発明によれば、（１）少くと
も、上流にプロモーターが付与されたコリネ型細菌由来
のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域と、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司
る遺伝子を含むＤＮＡ領域と、プラスミドｐＢＹ５０３
由来のコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ領域とから成る組換えプラスミド、
（２）このプラスミドで形質転換されたビオチン要求性
のコリネ型細菌、（３）この微生物菌体またはその固定
化物を用い、少くともグルコース及びインドールを含有
し且つビオチンを実質的に含有しない水性反応液中で酵
素反応を行ない、該反応液中にＬートリプトファンを生
成させ、該反応液からＬ−トリプトファンを採取するこ
とを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法が提供され
る。
も、上流にプロモーターが付与されたコリネ型細菌由来
のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域と、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司
る遺伝子を含むＤＮＡ領域と、プラスミドｐＢＹ５０３
由来のコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ領域とから成る組換えプラスミド、
（２）このプラスミドで形質転換されたビオチン要求性
のコリネ型細菌、（３）この微生物菌体またはその固定
化物を用い、少くともグルコース及びインドールを含有
し且つビオチンを実質的に含有しない水性反応液中で酵
素反応を行ない、該反応液中にＬートリプトファンを生
成させ、該反応液からＬ−トリプトファンを採取するこ
とを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法が提供され
る。
【０００７】以下、本発明の組換えプラスミド、該プラ
スミドで形質転換されたコリネ型細菌および該微生物を
用いるＬ−トリプトファンの製造法についてさらに詳細
に説明する。本発明に従う上記プラスミドを構成する
「上流にプロモーターが付与されたコリネ型細菌由来の
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域」（以下これを「Ｔ領域」と略称することがある）に
はインドールからのＬートリプトファンの生合成を司る
遺伝子を含む領域が包含され、しかして、Ｔ領域には、
例えばコリネ型細菌に由来するトリプトファン生合成遺
伝子群中のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含む
ＤＮＡ領域、すなわちｔｒｐＢ及びｔｒｐＡを含むＤＮ
Ａ領域に、該構造遺伝子の発現を制御しうるプロモータ
ーが結合したものが挙げられる。
スミドで形質転換されたコリネ型細菌および該微生物を
用いるＬ−トリプトファンの製造法についてさらに詳細
に説明する。本発明に従う上記プラスミドを構成する
「上流にプロモーターが付与されたコリネ型細菌由来の
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領
域」（以下これを「Ｔ領域」と略称することがある）に
はインドールからのＬートリプトファンの生合成を司る
遺伝子を含む領域が包含され、しかして、Ｔ領域には、
例えばコリネ型細菌に由来するトリプトファン生合成遺
伝子群中のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含む
ＤＮＡ領域、すなわちｔｒｐＢ及びｔｒｐＡを含むＤＮ
Ａ領域に、該構造遺伝子の発現を制御しうるプロモータ
ーが結合したものが挙げられる。
【０００８】このＴ領域を構成するトリプトファンシン
ターゼ構造遺伝子の供給源微生物としては、コリネ型細
菌であれば特に限定されないが、具体的には、コリネバ
クテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１，
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕ
ｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｍ
Ｊ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）等を挙げること
ができ、これらの中で特にブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）が好適に用
いられる。
ターゼ構造遺伝子の供給源微生物としては、コリネ型細
菌であれば特に限定されないが、具体的には、コリネバ
クテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１，
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕ
ｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｍ
Ｊ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）等を挙げること
ができ、これらの中で特にブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）が好適に用
いられる。
【０００９】これら供給源微生物を用いてＴ領域を調製
するための基本操作としては、上記微生物、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９７）から染色体ＤＮＡを常法により抽出し、制限
酵素ＢａｍＨＩ等を用いて、トリプトファン生合成遺伝
子群を含むＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片をさ
らに制限酵素ＥｃｏＲＶで処理すれば、ｔｒｐＢ及びｔ
ｒｐＡを含むＤＮＡ断片が得られる。
するための基本操作としては、上記微生物、例えばブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９７）から染色体ＤＮＡを常法により抽出し、制限
酵素ＢａｍＨＩ等を用いて、トリプトファン生合成遺伝
子群を含むＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片をさ
らに制限酵素ＥｃｏＲＶで処理すれば、ｔｒｐＢ及びｔ
ｒｐＡを含むＤＮＡ断片が得られる。
【００１０】次に、上記トリプトファンシンターゼ構造
遺伝子を発現制御し得るプロモーターとしては、コリネ
型細菌内で機能するプロモーターであれば特に限定され
ないが、具体的にはｔａｃプロモーター（合成プロモー
ター）、エシエリヒア・コリ由来ｔｒｐプロモーター、
エシエリヒア・コリ由来ｌａｃプロモーター等を挙げる
ことができ、これらの中で特にｔａｃプロモーターが好
適に用いられる。
遺伝子を発現制御し得るプロモーターとしては、コリネ
型細菌内で機能するプロモーターであれば特に限定され
ないが、具体的にはｔａｃプロモーター（合成プロモー
ター）、エシエリヒア・コリ由来ｔｒｐプロモーター、
エシエリヒア・コリ由来ｌａｃプロモーター等を挙げる
ことができ、これらの中で特にｔａｃプロモーターが好
適に用いられる。
【００１１】かくして得られるＴ領域の１つは、上記ブ
レビバクテリウム・フラバム染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切り出すことによって得られる大きさが約１
２．３ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片から制限
酵素ＥｃｏＲＶにより大きさが約３．７ｋｂのｔｒｐＢ
及びｔｒｐＡを含むＤＮＡ断片を切り出し、さらにプラ
スミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア製）のＳｍａＩ
部位に連結酵素で結合した後、制限酵素ＢａｍＨＩで切
り出すことによって得られる大きさが約３．９ｋｂのｔ
ａｃプロモーターとｔｒｐＢ及びｔｒｐＡが結合したＤ
ＮＡ断片を挙げることができる。
レビバクテリウム・フラバム染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切り出すことによって得られる大きさが約１
２．３ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片から制限
酵素ＥｃｏＲＶにより大きさが約３．７ｋｂのｔｒｐＢ
及びｔｒｐＡを含むＤＮＡ断片を切り出し、さらにプラ
スミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア製）のＳｍａＩ
部位に連結酵素で結合した後、制限酵素ＢａｍＨＩで切
り出すことによって得られる大きさが約３．９ｋｂのｔ
ａｃプロモーターとｔｒｐＢ及びｔｒｐＡが結合したＤ
ＮＡ断片を挙げることができる。
【００１２】この大きさが約３．９ｋｂの「Ｔ領域」に
ついては後記実施例１でさらに詳細に説明する。上記し
たＴ領域を組み込むことができるプラスミドベクターと
しては、少くともコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域（以下これを「複製
領域」と略記することがある）と、プラスミドｐＢＹ５
０３由来のコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を
司る遺伝子を含むＤＮＡ領域（以下これを「安定化領
域」と略記することがある）とを同時に保有するもので
あれば特に限定されない。
ついては後記実施例１でさらに詳細に説明する。上記し
たＴ領域を組み込むことができるプラスミドベクターと
しては、少くともコリネ型細菌内でプラスミドの複製増
殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域（以下これを「複製
領域」と略記することがある）と、プラスミドｐＢＹ５
０３由来のコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を
司る遺伝子を含むＤＮＡ領域（以下これを「安定化領
域」と略記することがある）とを同時に保有するもので
あれば特に限定されない。
【００１３】このプラスミドベクターの具体例として
は、例えば、特開平２−２７６５７９号公報に記載のｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲ
Ｙ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３ＫＸ；特願平２−
４２１２号明細書に開示されているｐＣＲＹ３０及びそ
の薬剤耐性遺伝子の異なるｐＣＲＹ４０等を挙げること
ができ、これらの中でもｐＣＲＹ３０及びｐＣＲＹ４０
が特に好適に使用される。
は、例えば、特開平２−２７６５７９号公報に記載のｐ
ＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲ
Ｙ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３ＫＸ；特願平２−
４２１２号明細書に開示されているｐＣＲＹ３０及びそ
の薬剤耐性遺伝子の異なるｐＣＲＹ４０等を挙げること
ができ、これらの中でもｐＣＲＹ３０及びｐＣＲＹ４０
が特に好適に使用される。
【００１４】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０及び
ｐＣＲＹ４０を造成する方法としては、ブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔａｔｉｏｎｉｓ ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを常
法により抽出し、制限酵素ＸｈｏＩ処理により大きさが
約４．０ｋｂの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、制限酵素ＫｐｈＩ処理により大きさが約２．１
ｋｂの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を各々
調製する。これらの両ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ
２９８（宝酒造製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｈＩ部
位及びＳａｌＩ部位に組み込むことによりプラスミドｐ
ＣＲＹ３０を造成することができ、また両ＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に組み込むこと
によりプラスミドｐＣＲＹ４０を造成することができ
る。
ｐＣＲＹ４０を造成する方法としては、ブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔａｔｉｏｎｉｓ ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを常
法により抽出し、制限酵素ＸｈｏＩ処理により大きさが
約４．０ｋｂの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、制限酵素ＫｐｈＩ処理により大きさが約２．１
ｋｂの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を各々
調製する。これらの両ＤＮＡ断片をプラスミドｐＨＳＧ
２９８（宝酒造製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｈＩ部
位及びＳａｌＩ部位に組み込むことによりプラスミドｐ
ＣＲＹ３０を造成することができ、また両ＤＮＡ断片を
プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に組み込むこと
によりプラスミドｐＣＲＹ４０を造成することができ
る。
【００１５】かかるベクタープラスミドへの前記「Ｔ領
域」の導入は、例えばプラスミドｐＣＲＹ４０を適当な
制限酵素、例えばＢａｍＨＩで処理することにより開裂
させ、そこに前記「Ｔ領域」を連結酵素処理により結合
させることにより行うことができる。かくして造成され
る本発明プラスミドの具体例としては、本発明者らがｐ
ＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢと命名したプラスミドを挙げる
ことができる。このプラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡ
Ｂの造成方法の詳細については後記実施例１〜３で述べ
る。
域」の導入は、例えばプラスミドｐＣＲＹ４０を適当な
制限酵素、例えばＢａｍＨＩで処理することにより開裂
させ、そこに前記「Ｔ領域」を連結酵素処理により結合
させることにより行うことができる。かくして造成され
る本発明プラスミドの具体例としては、本発明者らがｐ
ＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢと命名したプラスミドを挙げる
ことができる。このプラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡ
Ｂの造成方法の詳細については後記実施例１〜３で述べ
る。
【００１６】次にコリネ型細菌を、以上に述べた本発明
のプラスミドで形質転換するが、この形質転換しうる宿
主のビオチン要求性コリネ型細菌としては、例えばブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６
８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６；ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅ
ｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリ
ウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０、ブレビ
バクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）及びその由来株等が用いられる。それらの中でも
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３及びその由来
株が特に好適に用いられる。
のプラスミドで形質転換するが、この形質転換しうる宿
主のビオチン要求性コリネ型細菌としては、例えばブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６
８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６；ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅ
ｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリ
ウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３０、ブレビ
バクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）及びその由来株等が用いられる。それらの中でも
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３及びその由来
株が特に好適に用いられる。
【００１７】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
及びその由来株への前記本発明プラスミドの形質転換法
としては、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電することによ
りプラスミドを導入することが可能である〔Ｓａｔｏ
ｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９
（１９９０）参照〕。
及びその由来株への前記本発明プラスミドの形質転換法
としては、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電することによ
りプラスミドを導入することが可能である〔Ｓａｔｏ
ｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１５９
（１９９０）参照〕。
【００１８】上記の方法で形質転換して得られた本発明
プラスミドを保有するビオチン要求性のコリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株
の培養はそれ自体既知の方法で行うことができ、例えば
以下に述べる如くして行なうことができる。微生物菌体
の培養に使用しうる培地の炭素源としては、例えば、グ
ルコース、シュークロース、フラクトース、マルトー
ス、廃糖密等の炭水化物；ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、コハク酸等の各種の有機酸などが使用でき、さらに
微生物の資化性によって、エタノール、メタノール等の
アルコール類；炭化水素等も用いることができる。これ
らの炭素源の中でグルコースを主炭素源として用いるの
が特に好ましい。
プラスミドを保有するビオチン要求性のコリネ型細菌、
例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株
の培養はそれ自体既知の方法で行うことができ、例えば
以下に述べる如くして行なうことができる。微生物菌体
の培養に使用しうる培地の炭素源としては、例えば、グ
ルコース、シュークロース、フラクトース、マルトー
ス、廃糖密等の炭水化物；ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、コハク酸等の各種の有機酸などが使用でき、さらに
微生物の資化性によって、エタノール、メタノール等の
アルコール類；炭化水素等も用いることができる。これ
らの炭素源の中でグルコースを主炭素源として用いるの
が特に好ましい。
【００１９】培地の窒素源としては、例えば、アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各
種の無機および有機アンモニウム塩類；尿素および他の
窒素含有物質；ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スチープ・リカー、カザミノ酸等の窒素含有有機物
などの種々のものを用いることができる。
ウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各
種の無機および有機アンモニウム塩類；尿素および他の
窒素含有物質；ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スチープ・リカー、カザミノ酸等の窒素含有有機物
などの種々のものを用いることができる。
【００２０】さらに、無機物としては、例えば、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、塩化ナトリウム、炭
酸カルシウム等が用いうる。ビタミン、アミノ酸等の成
長促進物質としては、使用する培地の炭素源、窒素源等
によって変え得るが、少なくとも増殖の必須因子である
ビオチンを添加し、また必要に応じてサイアミン等を添
加することができる。
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、塩化ナトリウム、炭
酸カルシウム等が用いうる。ビタミン、アミノ酸等の成
長促進物質としては、使用する培地の炭素源、窒素源等
によって変え得るが、少なくとも増殖の必須因子である
ビオチンを添加し、また必要に応じてサイアミン等を添
加することができる。
【００２１】培養は通気攪拌培養、振盪培養等の好気的
条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃、好まし
くは２５〜３５℃の範囲内とすることができる。培養途
中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近とすること
ができ、培養中のｐＨの調整は酸、アルカリを適宜添加
して行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は好ま
しくは１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜３％
（ｗ／ｖ）の範囲内が適当である。培養期間は一般に
０．５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。
条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４０℃、好まし
くは２５〜３５℃の範囲内とすることができる。培養途
中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近とすること
ができ、培養中のｐＨの調整は酸、アルカリを適宜添加
して行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は好ま
しくは１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜３％
（ｗ／ｖ）の範囲内が適当である。培養期間は一般に
０．５〜３日間、最適期間は１〜２日間である。
【００２２】本発明の方法を実施する場合、上記の如く
培養することにより得られる培養物から菌体を集め、水
や適当な緩衝液で洗浄した後そのまま使用することがで
きる。あるいは該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し
固定化物として使用することができる。微生物菌体の固
定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性モ
ノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナ等の適
当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。
培養することにより得られる培養物から菌体を集め、水
や適当な緩衝液で洗浄した後そのまま使用することがで
きる。あるいは該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し
固定化物として使用することができる。微生物菌体の固
定化法としては、例えば、アクリルアミド等の重合性モ
ノマーを用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナ等の適
当な担体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。
【００２３】本発明に従う方法においては、上記の如く
調製された微生物菌体またはその固定化物の存在下に、
少なくともグルコースとインドールを含有しかつビオチ
ンを含有しない水性反応液中で、グルコースとインドー
ルがエネルギー共役を伴う酵素反応を介して反応せしめ
られ、Ｌ−トリプトファンが製造される。上記水性反応
液中のグルコース濃度は、一般に０．１〜５．０％（ｗ
／ｖ）、好ましくは０．２〜１．０％（ｗ／ｖ）、さら
に好ましくは０．３〜０．８％（ｗ／ｖ）の範囲内とす
ることができる。グルコースは反応中上記範囲内の濃度
に維持されるように連続的または間欠的に水性反応液に
添加するのが好ましい。
調製された微生物菌体またはその固定化物の存在下に、
少なくともグルコースとインドールを含有しかつビオチ
ンを含有しない水性反応液中で、グルコースとインドー
ルがエネルギー共役を伴う酵素反応を介して反応せしめ
られ、Ｌ−トリプトファンが製造される。上記水性反応
液中のグルコース濃度は、一般に０．１〜５．０％（ｗ
／ｖ）、好ましくは０．２〜１．０％（ｗ／ｖ）、さら
に好ましくは０．３〜０．８％（ｗ／ｖ）の範囲内とす
ることができる。グルコースは反応中上記範囲内の濃度
に維持されるように連続的または間欠的に水性反応液に
添加するのが好ましい。
【００２４】水性反応液中のインドールの濃度は、通常
０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２〜１．
０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．３〜０．８％（ｗ
／ｖ）の範囲内とすることができる。インドールもま
た、反応中上記範囲内の濃度に維持されるように連続的
または間欠的に水性反応液に添加することができる。該
水性反応液は、上記のように、グルコースとインドール
を含有し且つビオチンを実質的に含有しない水あるいは
リン酸またはトリス塩酸等の緩衝液であることもできる
が、好ましくはグルコースとインドールを含有し且つビ
オチンを含有しない合成培地が用いられる。
０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２〜１．
０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．３〜０．８％（ｗ
／ｖ）の範囲内とすることができる。インドールもま
た、反応中上記範囲内の濃度に維持されるように連続的
または間欠的に水性反応液に添加することができる。該
水性反応液は、上記のように、グルコースとインドール
を含有し且つビオチンを実質的に含有しない水あるいは
リン酸またはトリス塩酸等の緩衝液であることもできる
が、好ましくはグルコースとインドールを含有し且つビ
オチンを含有しない合成培地が用いられる。
【００２５】上記合成培地には、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー等の天然栄養物質を含まな
い化学構造が既知の無機窒素源及び／又は無機物を含有
する水溶液が包含される。本発明において用いうる合成
培地の無機窒素源としては、例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等を例示することができ、また、無機
物としては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸
鉄等を例示することができる。これらの無機窒素源およ
び無機塩はそれぞれ、単独でまたは２種以上混合して用
いることができる。
ン、コーンスティープリカー等の天然栄養物質を含まな
い化学構造が既知の無機窒素源及び／又は無機物を含有
する水溶液が包含される。本発明において用いうる合成
培地の無機窒素源としては、例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等を例示することができ、また、無機
物としては、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸
鉄等を例示することができる。これらの無機窒素源およ
び無機塩はそれぞれ、単独でまたは２種以上混合して用
いることができる。
【００２６】本発明に従う方法において用いられる合成
培地の一例を示すと次のとおりである：（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 ２ｇ／１、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／１、Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 ０．５ｇ／１、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ
／１、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ。を含有するｐＨ７．６の水溶
液。
培地の一例を示すと次のとおりである：（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 ２ｇ／１、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ／１、Ｋ2 Ｈ
ＰＯ4 ０．５ｇ／１、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ
／１、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ。を含有するｐＨ７．６の水溶
液。
【００２７】本発明の方法に使用される合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は実質的に含有され
ないが、ビオチンの含有されないことの明らかなアミノ
酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。本発明
の方法に使用される本発明のプラスミドで形質転換され
たビオチン要求性のコリネ型細菌は、ビオチンを実質的
に含まない前記培地中では増殖することができない。
ビオチン又はビオチンを含む天然物は実質的に含有され
ないが、ビオチンの含有されないことの明らかなアミノ
酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。本発明
の方法に使用される本発明のプラスミドで形質転換され
たビオチン要求性のコリネ型細菌は、ビオチンを実質的
に含まない前記培地中では増殖することができない。
【００２８】本発明の方法において使用される前記のよ
うにして調製された微生物菌体の使用量は、特に制限さ
れるものではないが、培地の容量を基準にして一般に１
〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜２０％（ｗ／ｖ）
の範囲内の濃度で使用するこができる。上記したとおり
の組成を有する合成培地中における該微生物又はその固
定化物を用いる酵素反応は、一般に約２０〜約５０℃、
好ましくは約３０〜約４０℃の温度で通常約１０〜約７
２時間行うことができる。
うにして調製された微生物菌体の使用量は、特に制限さ
れるものではないが、培地の容量を基準にして一般に１
〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜２０％（ｗ／ｖ）
の範囲内の濃度で使用するこができる。上記したとおり
の組成を有する合成培地中における該微生物又はその固
定化物を用いる酵素反応は、一般に約２０〜約５０℃、
好ましくは約３０〜約４０℃の温度で通常約１０〜約７
２時間行うことができる。
【００２９】この酵素反応は、好気的条件で行うのが好
ましく、該合成培地中の溶存酸素濃度は一般に０．１ｐ
ｐｍ〜３ｐｐｍ、好ましくは０．３ｐｐｍ〜２ｐｐｍの
範囲内に維持されるように反応系中に空気その他の酵素
含有ガスを、連続的又は間欠的に供給して溶存酸素濃度
を調製することが好ましい。上記の酵素反応によって生
成するＬ−トリプトファンの合成培地からの分離、精製
は、それ自体既知の通常用いられる方法に従って行なう
ことができ、例えば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等
の方法を適宜組合せて行うことができる。
ましく、該合成培地中の溶存酸素濃度は一般に０．１ｐ
ｐｍ〜３ｐｐｍ、好ましくは０．３ｐｐｍ〜２ｐｐｍの
範囲内に維持されるように反応系中に空気その他の酵素
含有ガスを、連続的又は間欠的に供給して溶存酸素濃度
を調製することが好ましい。上記の酵素反応によって生
成するＬ−トリプトファンの合成培地からの分離、精製
は、それ自体既知の通常用いられる方法に従って行なう
ことができ、例えば、イオン交換樹脂処理法、晶析法等
の方法を適宜組合せて行うことができる。
【００３０】以上に述べた本発明の方法によれば、従来
の菌体の増殖を伴う発酵法に比較して、Ｌ−トリプトフ
ァンの対原料収率に優れかつ副生物の産生が少く、高収
率でＬ−トリプトファンを得ることができる。また、本
発明の微生物は、発酵法、酵素法等による既知のＬ−ト
リプトファンの製造法にも用いることができる。
の菌体の増殖を伴う発酵法に比較して、Ｌ−トリプトフ
ァンの対原料収率に優れかつ副生物の産生が少く、高収
率でＬ−トリプトファンを得ることができる。また、本
発明の微生物は、発酵法、酵素法等による既知のＬ−ト
リプトファンの製造法にも用いることができる。
【００３１】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。なお、下記の実施例
において％は特にことわらない限りｗ／ｖ％を意味す
る。 実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来のトリプ
トファン生合成遺伝子群を含むＤＮＡ断片のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３の全Ｄ
ＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リットル〕
１リットルに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの
濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ
溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終
濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で
１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終
濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保
温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／ク
ロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振
盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に
存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノー
ルで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ
溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用
いた。
例によりさらに具体的に説明する。なお、下記の実施例
において％は特にことわらない限りｗ／ｖ％を意味す
る。 実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来のトリプ
トファン生合成遺伝子群を含むＤＮＡ断片のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３の全Ｄ
ＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ６ｍｇ、酵母エキス２．５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リットル〕
１リットルに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの
濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ
溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終
濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で
１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終
濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保
温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／ク
ロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振
盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に
存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノー
ルで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ
溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用
いた。
【００３２】（Ｂ）トリプトファン生合成遺伝子群を含
むＤＮＡ断片の調製 上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限
酵素ＢａｍＨＩ（５０ｕｎｉｔｓ）を用い３０℃、１時
間反応で切断し、染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ分解物溶液
を調製した。この分解物溶液に、プラスミドｐＢＲ３２
２（宝酒造製）１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（１ｕｎｉ
ｔ）を用い、３７℃、１時間反応で切断して得た分解物
溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６
℃で１５時間反応させ、結合させた。
むＤＮＡ断片の調製 上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限
酵素ＢａｍＨＩ（５０ｕｎｉｔｓ）を用い３０℃、１時
間反応で切断し、染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ分解物溶液
を調製した。この分解物溶液に、プラスミドｐＢＲ３２
２（宝酒造製）１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（１ｕｎｉ
ｔ）を用い、３７℃、１時間反応で切断して得た分解物
溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１６
℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００３３】この溶液を用い、常法〔Ｍ．Ｍａｎｄｅ
ｌ、Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１
５９（１９７０）参照〕に従って大腸菌変異株、エシエ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ
ＴＣＣ２３７１８（トリプトファンシンターゼ欠損変異
株およびトリプトファンシンターゼ要求性株）を形質転
換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ
2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 、Ｓ
Ｏ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グルコース
２ｇ、寒天１６ｇ、蒸留水１リットル〕に塗抹した。
ｌ、Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１
５９（１９７０）参照〕に従って大腸菌変異株、エシエ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ
ＴＣＣ２３７１８（トリプトファンシンターゼ欠損変異
株およびトリプトファンシンターゼ要求性株）を形質転
換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ
2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 、Ｓ
Ｏ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グルコース
２ｇ、寒天１６ｇ、蒸留水１リットル〕に塗抹した。
【００３４】この培地上の生育株をＬ培地にアンピシリ
ンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３７
℃で７時間培養した後、菌体を遠心分離（８，０００×
ｇ、１０分間、４℃）により集めた。この株より、アル
カリ−ＳＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”ｐ９０〜９１（１９８２）参
照〕によりプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し分子量をアガロースゲル電気泳
動を用いて調べたところ、プラスミドｐＢＲ３２２のＢ
ａｍＨＩ部位に約１２．３ｋｂのＤＮＡの挿入がみられ
た。
ンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３７
℃で７時間培養した後、菌体を遠心分離（８，０００×
ｇ、１０分間、４℃）により集めた。この株より、アル
カリ−ＳＤＳ法〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”ｐ９０〜９１（１９８２）参
照〕によりプラスミドを抽出し、このプラスミドを制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し分子量をアガロースゲル電気泳
動を用いて調べたところ、プラスミドｐＢＲ３２２のＢ
ａｍＨＩ部位に約１２．３ｋｂのＤＮＡの挿入がみられ
た。
【００３５】（Ｃ）トリプトファン要求性大腸菌変異株
への相補試験 トリプトファン生合成系路の各ステップの欠損したトリ
プトファン要求性大腸菌変異株、エシエリヒア・コリＡ
ＴＣＣ２３７２０（ｔｒｐＤ）、同ＡＴＣＣ２３７１９
（ｔｒｐＣ）、同ＡＴＣＣ２３７１８（ｔｒｐＢ）、同
ＡＴＣＣ２３７１７（ｔｒｐＡ）に上記（Ｂ）項で調製
したプラスミド溶液を用いて形質転換したところ、それ
ぞれの変異株に約１０5 ｃｅｌｌｓ／μｇＤＮＡの頻度
で選択培地に生育する形質転換株を得た。
への相補試験 トリプトファン生合成系路の各ステップの欠損したトリ
プトファン要求性大腸菌変異株、エシエリヒア・コリＡ
ＴＣＣ２３７２０（ｔｒｐＤ）、同ＡＴＣＣ２３７１９
（ｔｒｐＣ）、同ＡＴＣＣ２３７１８（ｔｒｐＢ）、同
ＡＴＣＣ２３７１７（ｔｒｐＡ）に上記（Ｂ）項で調製
したプラスミド溶液を用いて形質転換したところ、それ
ぞれの変異株に約１０5 ｃｅｌｌｓ／μｇＤＮＡの頻度
で選択培地に生育する形質転換株を得た。
【００３６】このことから、上記（Ｂ）項で調製したプ
ラスミドにおけるＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ、１２．３ｋ
ｂＤＮＡ断片上には、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、
ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡよりなるトリプトファン生合成遺伝
子群（トリプトファンオペロン）が含まれることを確認
した。上記の如く調製されたプラスミドをプラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｔｒｐＯと命名した。 （Ｄ）トリプトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のｐＫＫ２２３−３へのサブクローニング 上記（Ｃ）で得られたｐＢＲ３２２−ｔｒｐＯからトリ
プトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を
特定化するため、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア製）へ、下記のとおりサブクローニング
した。
ラスミドにおけるＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ、１２．３ｋ
ｂＤＮＡ断片上には、ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、
ｔｒｐＢ、ｔｒｐＡよりなるトリプトファン生合成遺伝
子群（トリプトファンオペロン）が含まれることを確認
した。上記の如く調製されたプラスミドをプラスミドｐ
ＢＲ３２２−ｔｒｐＯと命名した。 （Ｄ）トリプトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のｐＫＫ２２３−３へのサブクローニング 上記（Ｃ）で得られたｐＢＲ３２２−ｔｒｐＯからトリ
プトファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を
特定化するため、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア製）へ、下記のとおりサブクローニング
した。
【００３７】上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＢＲ３２
２−ｔｒｐＯを制限酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断
したものと、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制
限酵素ＳｍａＩで切断したものを混合し、Ｓ１スクレア
ーゼで処理することにより平滑末端とした後、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の
濃度は最終濃度である）、１６℃で１５時間反応させ、
結合させた。
２−ｔｒｐＯを制限酵素ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断
したものと、ｔａｃ発現ベクターｐＫＫ２２３−３を制
限酵素ＳｍａＩで切断したものを混合し、Ｓ１スクレア
ーゼで処理することにより平滑末端とした後、５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト
ール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の
濃度は最終濃度である）、１６℃で１５時間反応させ、
結合させた。
【００３８】この溶液を用い、常法〔Ｍ．Ｍａｎｄｅ
ｌ、Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１
５９（１９７０）参照〕に従ってエシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２系株
（トリプトファンシンターゼ欠損変異株およびトリプト
ファンシンターゼ要求性株）を形質転換し、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、
ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グルコース２ｇ、寒天１６ｇ、
蒸留水１ｌ〕に塗抹した。
ｌ、Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１
５９（１９７０）参照〕に従ってエシエリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２系株
（トリプトファンシンターゼ欠損変異株およびトリプト
ファンシンターゼ要求性株）を形質転換し、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、
ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グルコース２ｇ、寒天１６ｇ、
蒸留水１ｌ〕に塗抹した。
【００３９】この培地上の生育株をＬ培地にアンピシリ
ンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３７
℃で７時間培養した後、菌体を遠心分離（８，０００×
ｇ、１０分間、４℃）により集めた。この株より、前記
アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、該プラ
スミドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳
動を用いて調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３
の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさが約３．
７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
ンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３７
℃で７時間培養した後、菌体を遠心分離（８，０００×
ｇ、１０分間、４℃）により集めた。この株より、前記
アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、該プラ
スミドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳
動を用いて調べたところ、プラスミドｐＫＫ２２３−３
の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさが約３．
７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
【００４０】上記の如く調製されたプラスミドを、プラ
スミドｐＫＫ２２３−ｔｒｐＡＢと命名した。このプラ
スミドｐＫＫ２２３−ｔｒｐＡＢから、大きさが約３．
７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片とｔａｃプロモーターが結合し
た部分を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて切り出した大き
さが約３．９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｔ領域）を、アガロー
ス電気泳動及びポリアクリルアミド電気泳動を用いて測
定した制限酵素認識部位数及び切断断片の大きさを下記
表１に、制限酵素切断点地図を図１に示す。
スミドｐＫＫ２２３−ｔｒｐＡＢと命名した。このプラ
スミドｐＫＫ２２３−ｔｒｐＡＢから、大きさが約３．
７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片とｔａｃプロモーターが結合し
た部分を、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて切り出した大き
さが約３．９ｋｂのＤＮＡ断片（Ｔ領域）を、アガロー
ス電気泳動及びポリアクリルアミド電気泳動を用いて測
定した制限酵素認識部位数及び切断断片の大きさを下記
表１に、制限酵素切断点地図を図１に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例２コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ４０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。
ＲＹ４０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。
【００４３】半合成培地Ａ培地〔尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００
μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び
蒸留水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで
培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
５０ｍＭグルコース〕２．０ｍｌに懸濁し、３７℃で１
時間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２
ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やかに
混和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応液
に酢酸カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、
酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液〕３０
ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中に１５分間静置
した。
2 ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００
μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び
蒸留水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム
・スタチオニスＩＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで
培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度にリゾチームを含む緩衝液〔２５ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、
５０ｍＭグルコース〕２．０ｍｌに懸濁し、３７℃で１
時間反応させた。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液〔０．２
ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ〕４０ｍｌを添加し、緩やかに
混和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応液
に酢酸カリウム溶液〔５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、
酢酸１１．５ｍｌ、蒸留水２８．５ｍｌの混合液〕３０
ｍｌを添加し、充分混和してから氷水中に１５分間静置
した。
【００４４】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノ
ール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸濁した
後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇ
の遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍量のエ
タノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０
分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収
した。
【００４５】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液〔トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
整〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調
整〕２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液〔５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液〕１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６，０００×ｇの遠心分離を行った。
【００４６】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
スミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。次いでこ
の分画液を等量のイソアミルアルコールで４回処理して
エチジウムブロマイドを抽出除去し、その後にＴＥ緩衝
液に対して透析を行った。このようにして得られたプラ
スミドｐＢＹ５０３を含む透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−２０℃１時間静置した。この溶液を１５，
０００×ｇの遠心分離にかけてＤＮＡを沈降させ、プラ
スミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得た。
【００４７】（Ｂ）プラスミドベクターｐＣＲＹ４０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。前記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。
作成 プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。前記（Ａ）項
で調製したプラスミドｐＢＹ５０３の２μｇに制限酵素
ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３７℃で３０分間反応させ、
プラスミドＤＮＡを部分分解した。
【００４８】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を
強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンビテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を
強化し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いて
エシェリヒア・コリＪＭ１０９コンビテントセル（宝酒
造製）を形質転換した。
【００４９】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌ（最終濃
度）のＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド）、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１
０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１リッ
トル；ｐＨ７．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育
株として得られた。これらの生育株のうち、白いコロニ
ーで生育してきたものを選択し、各々プラスミドを前記
アルカリ−ＳＤＳ法により抽出した。
のクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌ（最終濃
度）のＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド）、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇ
ａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１
０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１リッ
トル；ｐＨ７．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育
株として得られた。これらの生育株のうち、白いコロニ
ーで生育してきたものを選択し、各々プラスミドを前記
アルカリ−ＳＤＳ法により抽出した。
【００５０】その結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断面を上記プラスミドｐＨＳＧ３９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ４０を調製した。
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ｏｒ
ｉが得られた。次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で
得られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐ
ｎＩ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断面を上記プラスミドｐＨＳＧ３９８−ｏｒｉ
のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラ
スミドベクターｐＣＲＹ４０を調製した。
【００５１】実施例３プラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢの作製
実施例１で得られたプラスミドｐＢＲ３２２−ｔｒｐＡ
Ｂ ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（５ｕｎｉｔ
ｓ）用い、３７℃で１時間反応させ完全分解したもの
と、実施例２で得られたプラスミドｐＣＲＹ４０１μｇ
を制限酵素ＢａｍＨＩ（１ｕｎｉｔ）を用い、３７℃で
１時間反応させ完全分解したものを混合し、上記方法に
て結合させ、この用液を用いて、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（ト
リプトファンシンターゼ欠失変異株およびトリプトファ
ンシンターゼ要求性株）を常法に従い形質転換した。形
質転換株はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含む選
択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ 2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グ
ルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕で３
７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。
Ｂ ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（５ｕｎｉｔ
ｓ）用い、３７℃で１時間反応させ完全分解したもの
と、実施例２で得られたプラスミドｐＣＲＹ４０１μｇ
を制限酵素ＢａｍＨＩ（１ｕｎｉｔ）を用い、３７℃で
１時間反応させ完全分解したものを混合し、上記方法に
て結合させ、この用液を用いて、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（ト
リプトファンシンターゼ欠失変異株およびトリプトファ
ンシンターゼ要求性株）を常法に従い形質転換した。形
質転換株はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含む選
択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ 2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、グ
ルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕で３
７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。
【００５２】上記で得られた形質転換株を常法により液
体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プ
ラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、アガロー
スゲル電気泳動を用いて切断断片の大きさを調べたとこ
ろ、プラスミドｐＣＲＹ４０の長さ８．２ｋｂのＤＮＡ
断片に加え、長さ３．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片（ｐＫＫ
２２３−３由来ｔａｃプロモーター断片とトリプトファ
ンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片が認められ
た。
体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プ
ラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、アガロー
スゲル電気泳動を用いて切断断片の大きさを調べたとこ
ろ、プラスミドｐＣＲＹ４０の長さ８．２ｋｂのＤＮＡ
断片に加え、長さ３．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片（ｐＫＫ
２２３−３由来ｔａｃプロモーター断片とトリプトファ
ンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片が認められ
た。
【００５３】このプラスミドを各種の制限酵素で切断
し、アガロース電気泳動及びポリアクリルアミド電気泳
動を用いて測定した制限酵素認識部位数及び切断断片の
大きさを下記表２に、制限酵素切断点地図を図２に示
す。
し、アガロース電気泳動及びポリアクリルアミド電気泳
動を用いて測定した制限酵素認識部位数及び切断断片の
大きさを下記表２に、制限酵素切断点地図を図２に示
す。
【００５４】
【表２】
【００５５】上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドを“ｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢ”と命名した。 実施例４プラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢのコリネ型細菌へ
の形質転換 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラ
スミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンＧを１ｕｎｉｔ／ｍｌになる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液〔２７２
ｍＭシュークロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ），７ｍＭ ＫＨ
2 ＰＯ4 ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；ｐＨ７．４〕にて洗浄
する。更に菌体を遠心分離にて集め、５ｍｌのパルス用
溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と前記実施例３で得
られたプラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢ ＤＮＡ溶
液５０μｌ（プラスミドＤＮＡ１μｇ含有）を混合し、
氷中にて２０分間静置する。ジーンパルサー（バイオラ
ド社製）を用いて、２，５００ボルト、２５μＦＤに認
定し、パルスを印加後、氷中に２０分間静置する。その
全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養
後、前記Ａ培地にクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ
（最終濃度）及び寒天１．５ｇ／ｌを添加した寒天培地
に植菌し、３０℃で２〜３日間培養する。形質転換株は
この培地上に生育株として得られ、それを常法により液
体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、各種
の制限酵素による切断パターンより、該ＤＮＡがプラス
ミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢであることを確認した。
ミドを“ｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢ”と命名した。 実施例４プラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢのコリネ型細菌へ
の形質転換 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラ
スミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖期初
期まで培養し、ペニシリンＧを１ｕｎｉｔ／ｍｌになる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液〔２７２
ｍＭシュークロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ），７ｍＭ ＫＨ
2 ＰＯ4 ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；ｐＨ７．４〕にて洗浄
する。更に菌体を遠心分離にて集め、５ｍｌのパルス用
溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細胞と前記実施例３で得
られたプラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢ ＤＮＡ溶
液５０μｌ（プラスミドＤＮＡ１μｇ含有）を混合し、
氷中にて２０分間静置する。ジーンパルサー（バイオラ
ド社製）を用いて、２，５００ボルト、２５μＦＤに認
定し、パルスを印加後、氷中に２０分間静置する。その
全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培養
後、前記Ａ培地にクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ
（最終濃度）及び寒天１．５ｇ／ｌを添加した寒天培地
に植菌し、３０℃で２〜３日間培養する。形質転換株は
この培地上に生育株として得られ、それを常法により液
体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、各種
の制限酵素による切断パターンより、該ＤＮＡがプラス
ミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡＢであることを確認した。
【００５６】なお、プラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡ
Ｂにより形質転換されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ｔｒｐＡＢは、茨城県つくば市東１丁目１
番３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年
５月９日付で：微工研菌寄第１２２３０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２２３０）として寄託されている。 実施例５Ｌ−トリプトファンの製造 以下の実施例において、Ｌ−トリプトファンの定性は、
ペーパークロマトグラフのＲｆ値、微生物定量法による
生物活性値により確認した。定量は高速液体クロマトグ
ラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行った。また、反
応液中のグルコースの定量は、グルコースアナライザー
（東亜電波工業製 ＧＬＵ−１）を用いて行った。
Ｂにより形質転換されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ｔｒｐＡＢは、茨城県つくば市東１丁目１
番３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年
５月９日付で：微工研菌寄第１２２３０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２２３０）として寄託されている。 実施例５Ｌ−トリプトファンの製造 以下の実施例において、Ｌ−トリプトファンの定性は、
ペーパークロマトグラフのＲｆ値、微生物定量法による
生物活性値により確認した。定量は高速液体クロマトグ
ラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行った。また、反
応液中のグルコースの定量は、グルコースアナライザー
（東亜電波工業製 ＧＬＵ−１）を用いて行った。
【００５７】培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム
１．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．
０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ
2 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｐ
ｐｍ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチ
ン２００μｇ／ｌ、チアミン・塩酸１００μｇ／ｌ、カ
ザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注、減菌（減菌後ｐＨ
７．０）した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ｔｒｐＡＢを植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ
／ｌの濃度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培
養を行った。
１．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．
０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＣａＣｌ
2 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｐ
ｐｍ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチ
ン２００μｇ／ｌ、チアミン・塩酸１００μｇ／ｌ、カ
ザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注、減菌（減菌後ｐＨ
７．０）した後、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ｔｒｐＡＢを植菌し、無菌的にグルコースを５ｇ
／ｌの濃度になるように加え、３０℃にて２日間振盪培
養を行った。
【００５８】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２．３％、ＫＨ2 ＰＯ 4 ０．０５％、Ｋ2
ＨＰＯ4 ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4 ・
ｎＨ2 Ｏ ２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チア
ミン・塩酸１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３％、酵母
エキス０．３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気攪拌槽に
仕込み、減菌（１２０℃、２０分間）後、前記培養物の
２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１
ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間培養を行
った。
アンモニウム２．３％、ＫＨ2 ＰＯ 4 ０．０５％、Ｋ2
ＨＰＯ4 ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4 ・
ｎＨ2 Ｏ ２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チア
ミン・塩酸１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０．３％、酵母
エキス０．３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気攪拌槽に
仕込み、減菌（１２０℃、２０分間）後、前記培養物の
２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１
ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６にて２４時間培養を行
った。
【００５９】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液〔（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ２ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐ
ｍ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン
・塩酸１００μｇ／ｌ；ｐＨ７．６〕の１０００ｍｌに
懸濁液、該懸濁液を２ｌ容通気攪拌槽に仕込み、グルコ
ース２０ｇとインドール２ｇを添加して、回転数３００
ｐｐｍ、通気量０．１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６
にて２４時間反応を行った。
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液〔（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ２ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５
ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐ
ｍ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン
・塩酸１００μｇ／ｌ；ｐＨ７．６〕の１０００ｍｌに
懸濁液、該懸濁液を２ｌ容通気攪拌槽に仕込み、グルコ
ース２０ｇとインドール２ｇを添加して、回転数３００
ｐｐｍ、通気量０．１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７．６
にて２４時間反応を行った。
【００６０】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンを定量した。この反応終了後の培養液５００ｍｌ
を、強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１
Ｂ、三菱化成製）のカラムに通してＬ−トリプトファン
を吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出させ
たのち、Ｌ−トリプトファン画分を濃縮し、冷エタノー
ルでＬ−トリプトファンの結晶を析出させた。その結果
を下記表３に示す。
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−トリプト
ファンを定量した。この反応終了後の培養液５００ｍｌ
を、強酸性陽イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１
Ｂ、三菱化成製）のカラムに通してＬ−トリプトファン
を吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出させ
たのち、Ｌ−トリプトファン画分を濃縮し、冷エタノー
ルでＬ−トリプトファンの結晶を析出させた。その結果
を下記表３に示す。
【００６１】なお、比較例として、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を用
いる以外は、上記と同様に実験を行い、生成したＬ−ト
リプトファン量を測定した。その結果を下記表３に示
す。
・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を用
いる以外は、上記と同様に実験を行い、生成したＬ−ト
リプトファン量を測定した。その結果を下記表３に示
す。
【００６２】
【表３】
【図１】大きさが約３．９ｋｂの、ｔａｃプロモーター
とトリプトファンシンターゼ構造遺伝子が結合したＤＮ
Ａ断片（Ｔ領域）の制限酵素切断点地図である。
とトリプトファンシンターゼ構造遺伝子が結合したＤＮ
Ａ断片（Ｔ領域）の制限酵素切断点地図である。
【図２】この発明のプラスミドｐＣＲＹ４０−ｔｒｐＡ
Ｂの制限酵素切断点地図である。
Ｂの制限酵素切断点地図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(Ｃ１２Ｎ 15/31
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(Ｃ１２Ｐ 13/22
Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (3)
- 【請求項１】 少くとも、上流にプロモーターが付与さ
れたコリネ型細菌由来のトリプトファンシンターゼ構造
遺伝子を含むＤＮＡ領域と、コリネ型細菌内でプラスミ
ドの複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域と、プ
ラスミドｐＢＹ５０３由来のコリネ型細菌内でプラスミ
ドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域とから成
ることを特徴とする組換えプラスミド。 - 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドで形質転換さ
れたビオチン要求性のコリネ型細菌。 - 【請求項３】 請求項２記載の微生物菌体またはその固
定化物を用い、少くともグルコース及びインドールを含
有し且つビオチンを実質的に含有しない水性反応液中で
酵素反応を行ない、該反応液中にＬ−トリプトファンを
生成させ、該反応液からＬ−トリプトファンを採取する
ことを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17083991A JPH0515378A (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物並びにそれらを用いるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17083991A JPH0515378A (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物並びにそれらを用いるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0515378A true JPH0515378A (ja) | 1993-01-26 |
Family
ID=15912289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17083991A Pending JPH0515378A (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物並びにそれらを用いるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0515378A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0629699A2 (en) * | 1993-06-15 | 1994-12-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| US5726299A (en) * | 1991-06-03 | 1998-03-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
-
1991
- 1991-07-11 JP JP17083991A patent/JPH0515378A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693781A (en) * | 1991-06-03 | 1997-12-02 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| US5726299A (en) * | 1991-06-03 | 1998-03-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| EP0629699A2 (en) * | 1993-06-15 | 1994-12-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| EP0629699A3 (en) * | 1993-06-15 | 1996-04-24 | Mitsubishi Petrochemical Co | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria. |
| EP0803575A1 (en) * | 1993-06-15 | 1997-10-29 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promotor DNA fragment from coryneform bacteria |
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