JPH05184371A - ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 - Google Patents
ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用Info
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- JPH05184371A JPH05184371A JP4024401A JP2440192A JPH05184371A JP H05184371 A JPH05184371 A JP H05184371A JP 4024401 A JP4024401 A JP 4024401A JP 2440192 A JP2440192 A JP 2440192A JP H05184371 A JPH05184371 A JP H05184371A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
からジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードするＤ
ＮＡを単離し、この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコ
ードする遺伝子ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複製
増殖可能なプラスミドで形質転換されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３株は、Ｌ−リジンの生成量
が増加した。
からジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードするＤ
ＮＡを単離し、この遺伝子の塩基配列を決定した。 【効果】 このジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコ
ードする遺伝子ＤＮＡを導入したコリネ型細菌内で複製
増殖可能なプラスミドで形質転換されたブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３株は、Ｌ−リジンの生成量
が増加した。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ジヒドロジピコリン酸
シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺
伝子を含むコリネ型細菌由来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子
ＤＮＡを含む組換えプラスミド、該プラスミドで形質転
換されたコリネ型細菌、及び該コリネ型細菌を用いるＬ
−リジンの製造法に関する。
シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺
伝子を含むコリネ型細菌由来の遺伝子ＤＮＡ、該遺伝子
ＤＮＡを含む組換えプラスミド、該プラスミドで形質転
換されたコリネ型細菌、及び該コリネ型細菌を用いるＬ
−リジンの製造法に関する。
【０００２】Ｌ−リジンは、必須アミノ酸として蛋白質
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物等として用い
られている。
中にその存在が知られ、医薬や食品添加物等として用い
られている。
【０００３】
【従来の技術】従来、Ｌ−リジンの工業的製造法として
は、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄養要
求株、各種薬剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いてＬ−
リジンを製造する方法等が知られている［例えば、特公
昭５１−２１０７８号公報、特公昭５３−１８３３号公
報、特公昭６２−８６９２号公報等参照］。また、組換
え菌を用いた製造法も提案されている［特開昭５６−１
６０９９７号公報、特開昭６０−６２９９４号公報、特
開昭６２−７９７８８号公報等参照］。しかしながら、
従来提案されている方法によるＬ−リジンの製造法で
は、対糖収率が低く及び／又はＬ−リジンの蓄積に限界
があり、新たな観点から、遺伝子工学的手法による菌株
の改良等を含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる
方法の提供が強く求められている。
は、グルタミン生産菌であるコリネ型細菌の各種栄養要
求株、各種薬剤耐性株、各種薬剤感受性株を用いてＬ−
リジンを製造する方法等が知られている［例えば、特公
昭５１−２１０７８号公報、特公昭５３−１８３３号公
報、特公昭６２−８６９２号公報等参照］。また、組換
え菌を用いた製造法も提案されている［特開昭５６−１
６０９９７号公報、特開昭６０−６２９９４号公報、特
開昭６２−７９７８８号公報等参照］。しかしながら、
従来提案されている方法によるＬ−リジンの製造法で
は、対糖収率が低く及び／又はＬ−リジンの蓄積に限界
があり、新たな観点から、遺伝子工学的手法による菌株
の改良等を含め、Ｌ−リジンをより効率的に生成させる
方法の提供が強く求められている。
【０００４】一方、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺伝子として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の遺
伝子［Journal of Bacteriology，１０５，ｐ８４４〜
ｐ８５４，１９７１参照］がよく研究されている。ま
た、コリネ型細菌由来のジヒドロジピコリン酸シンセタ
ーゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）としては、コリネバクテ
リウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
が知られている［Molecular General Genetics，２１
２，ｐ１０５〜ｐ１１１，１９８８；Melecular Genera
l Genetics，２２０，ｐ４７８〜４８０，１９９０等参
照］。しかしながら、ブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン
酸シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする
遺伝子については従来の報告例は見当らない。
（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺伝子として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の遺
伝子［Journal of Bacteriology，１０５，ｐ８４４〜
ｐ８５４，１９７１参照］がよく研究されている。ま
た、コリネ型細菌由来のジヒドロジピコリン酸シンセタ
ーゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）としては、コリネバクテ
リウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
が知られている［Molecular General Genetics，２１
２，ｐ１０５〜ｐ１１１，１９８８；Melecular Genera
l Genetics，２２０，ｐ４７８〜４８０，１９９０等参
照］。しかしながら、ブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）由来のジヒドロジピコリン
酸シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする
遺伝子については従来の報告例は見当らない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌由来のジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺伝子を単離
し、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該コ
リネ型細菌を用いて、新たな観点から効率的にＬ−リジ
ンを製造することである。
ネ型細菌由来のジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺伝子を単離
し、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該コ
リネ型細菌を用いて、新たな観点から効率的にＬ−リジ
ンを製造することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子を単離
し、該遺伝子を適当なベクタープラスミドに導入して、
コリネ型細菌を形質転換し、該形質転換されたコリネ型
細菌を用いると、効率的にＬ−リジンを製造しうること
を見い出し本発明を完成するに至った。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌染色
体よりジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子を単離
し、該遺伝子を適当なベクタープラスミドに導入して、
コリネ型細菌を形質転換し、該形質転換されたコリネ型
細菌を用いると、効率的にＬ−リジンを製造しうること
を見い出し本発明を完成するに至った。
【０００７】かくして、本発明によれば、 （１） コリネ型細菌由来のジヒドロジピコリン酸シン
セターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ； （２） 該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミ
ド； （３） 該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型
細菌；及び （４） 該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコ
ースを原料としてＬ−リジンを製造する方法 が提供される。
セターゼをコードする遺伝子ＤＮＡ； （２） 該遺伝子ＤＮＡが導入された組換えプラスミ
ド； （３） 該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型
細菌；及び （４） 該形質転換されたコリネ型細菌を用い、グルコ
ースを原料としてＬ−リジンを製造する方法 が提供される。
【０００８】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。
る。
【０００９】本発明の「ジヒドロジピコリン酸シンセタ
ーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ」は、アスパルテートセ
ミアルデヒドにピルビン酸を付加して、ジヒドロジピコ
リン酸を合成する酵素、すなわちジヒドロジピコリン酸
シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺
伝子ＤＮＡを意味する。
ーゼをコードする遺伝子ＤＮＡ」は、アスパルテートセ
ミアルデヒドにピルビン酸を付加して、ジヒドロジピコ
リン酸を合成する酵素、すなわちジヒドロジピコリン酸
シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺
伝子ＤＮＡを意味する。
【００１０】ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断
片」と略称することがある）は、その塩基配列が決定さ
れた後は合成することも可能であるが、一般にはジヒド
ロジピコリン酸シンセターゼ生産性を有する微生物から
クローニングすることができ、その供給源となる微生物
としては、コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）および
その由来株が有利に使用される。
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断
片」と略称することがある）は、その塩基配列が決定さ
れた後は合成することも可能であるが、一般にはジヒド
ロジピコリン酸シンセターゼ生産性を有する微生物から
クローニングすることができ、その供給源となる微生物
としては、コリネ型細菌、殊にブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）および
その由来株が有利に使用される。
【００１１】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限
酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下
に述べる方法で分離、取得することができる。
【００１２】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用
いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩを用
いて染色体ＤＮＡを完全に分解する。
【００１３】得られるＤＮＡ断片をクローニングベクタ
ー、例えばｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）に挿入し、この
ベクターを用いてジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺
伝子が欠損した大腸菌（エシェリヒア・コリ）変異株Ｊ
Ｅ７６２７（国立遺伝学研究所遺伝実験微生物保存研究
センター 〒４１１ 三島市谷田１１１１番地保存菌株）
を形質転換し、選択培地に塗抹することにより、形質転
換株を取得する。 得られる形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを抽出し、制限酵素で解析することにより挿入さ
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色
体由来のＡ断片を確認・取得することができる。
ー、例えばｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）に挿入し、この
ベクターを用いてジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺
伝子が欠損した大腸菌（エシェリヒア・コリ）変異株Ｊ
Ｅ７６２７（国立遺伝学研究所遺伝実験微生物保存研究
センター 〒４１１ 三島市谷田１１１１番地保存菌株）
を形質転換し、選択培地に塗抹することにより、形質転
換株を取得する。 得られる形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを抽出し、制限酵素で解析することにより挿入さ
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色
体由来のＡ断片を確認・取得することができる。
【００１４】かくして得られるＡ断片をさらに適当な制
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを通常用いられる形質転換法、例えば、塩
化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換により
前記ジヒドロジピコリン酸シンセターゼが欠損した大腸
菌変異株に導入し、選択培地に塗抹する。
限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌
で複製可能なベクタープラスミドに挿入し、このベクタ
ープラスミドを通常用いられる形質転換法、例えば、塩
化カルシウム法、電気パルス法等による形質転換により
前記ジヒドロジピコリン酸シンセターゼが欠損した大腸
菌変異株に導入し、選択培地に塗抹する。
【００１５】得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより、挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由
来のＡ断片を確認・取得することができる。
を抽出し、制限酵素で解析することにより、挿入された
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由
来のＡ断片を確認・取得することができる。
【００１６】このようにして得られるＡ断片の一つは、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＳａｌＩで切断することに
よって得られる大きさが約２.５ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩの完全分解により切り
出し、さらにそれを制限酵素ＳａｌＩで切断することに
よって得られる大きさが約２.５ｋｂのＤＮＡ断片を挙
げることができる。
【００１７】この約２.５ｋｂのジヒドロジピコリン酸
シンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、
各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断
片の大きさを下記表１に示す。
シンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、
各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及び切断断
片の大きさを下記表１に示す。
【００１８】
【表１】 なお、本明細書において、制限酵素による「認識部位
数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在
下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法
に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数か
ら決定した値を採用した。
数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在
下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法
に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数か
ら決定した値を採用した。
【００１９】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λphage）
のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４
phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λphage）
のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４
phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩで切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
【００２０】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩによって切断することにより得られる大き
さが約２.５ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配
列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒
造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideox
y chain termination 法、Sanger，F.et.al.，Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA，７４，ｐ５４６３，１９７７）により
決定することができる。このようにして決定した上記約
２.５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリーディ
ングフレームの存在から決定したジヒドロジピコリン酸
シンセターゼをコードする遺伝子は、次に示す配列を有
するものであり、３０１個のアミノ酸をコードする９０
３塩基対から構成されている。
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩによって切断することにより得られる大き
さが約２.５ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配
列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒
造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideox
y chain termination 法、Sanger，F.et.al.，Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA，７４，ｐ５４６３，１９７７）により
決定することができる。このようにして決定した上記約
２.５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープンリーディ
ングフレームの存在から決定したジヒドロジピコリン酸
シンセターゼをコードする遺伝子は、次に示す配列を有
するものであり、３０１個のアミノ酸をコードする９０
３塩基対から構成されている。
【００２１】
【化３】上記の塩基配列を包含して成る本発明のジヒド
ロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分
離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばベックマン社製 System-1 Plus を用いて合
成されたものであってもよい。
ロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分
離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばベックマン社製 System-1 Plus を用いて合
成されたものであってもよい。
【００２２】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
をコードする機能を実質的に損なうことがない限り、塩
基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく
又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入さ
れていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されてい
るものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、
本発明のジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
をコードする機能を実質的に損なうことがない限り、塩
基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく
又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入さ
れていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されてい
るものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、
本発明のジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２３】以上に詳述した大きさが約２.５ｋｂのＤ
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。
ＮＡ断片の制限酵素による切断点地図を図１に示す。
【００２４】本発明のジヒドロジピコリン酸シンセター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、
適当なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少くとも含む
プラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細
菌内でジヒドロジピコリン酸シンセターゼの高発現可能
な組換えプラスミドを得ることができる。
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）は、
適当なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内で
プラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少くとも含む
プラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細
菌内でジヒドロジピコリン酸シンセターゼの高発現可能
な組換えプラスミドを得ることができる。
【００２５】また、本発明のジヒドロジピコリン酸シン
セターゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモ
ーターは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロ
モーターであることができるが、それに限られるもので
はなく、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子の転
写を開始させるための原核生物由来の塩基配列であれ
ば、いかなるプロモーターであってもよい。
セターゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモ
ーターは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロ
モーターであることができるが、それに限られるもので
はなく、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子の転
写を開始させるための原核生物由来の塩基配列であれ
ば、いかなるプロモーターであってもよい。
【００２６】本発明のＡ断片を導入することができる、
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。
コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少くと
も含むプラスミドベクターとしては、例えば、特開平３
−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３
０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣ
ＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平
１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２
及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載
のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載
のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に
記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４
４；特開昭５７−１３４５００号に記載のｐＣＧ１；特
開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭
５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ
１１等を挙げることができる。
【００２７】中でもコリネ型細菌の宿主ベクター系で用
いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。
いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ等が好適に使用される。
【００２８】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Brevibacterium stationis）ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４.０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２.１ｋｂのプラスミド
の安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
す。これらの両断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒
造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に
組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
を調製することができる。
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Brevibacterium stationis）ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩで大
きさが約４.０ｋｂのプラスミドの複製増殖機能を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２.１ｋｂのプラスミド
の安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
す。これらの両断片をプラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒
造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及びＳａｌＩ部位に
組み込むことにより、プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
を調製することができる。
【００２９】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
個所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
個所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。
【００３０】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記ジヒドロジピコリン酸シン
セターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断
片）をＤＮＡリガーゼで連結させることにより行うこと
ができる。
片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで開裂させ、そこに前記ジヒドロジピコリン酸シン
セターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断
片）をＤＮＡリガーゼで連結させることにより行うこと
ができる。
【００３１】このようにして造成されるプラスミドｐＣ
ＲＹ３０に本発明の大きさが約２.５ｋｂのＡ断片を導
入した組換えプラスミドは、Ｌ−リジンの製造に好適に
用いることができる組換えプラスミドの一つであり、本
発明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡと
命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡの作成方
法の詳細については、後記実施例４で説明する。
ＲＹ３０に本発明の大きさが約２.５ｋｂのＡ断片を導
入した組換えプラスミドは、Ｌ−リジンの製造に好適に
用いることができる組換えプラスミドの一つであり、本
発明者らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡと
命名した。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡの作成方
法の詳細については、後記実施例４で説明する。
【００３２】このようにして造成されるジヒドロジピコ
リン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含むコリネ型
細菌内で複製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導
入して該微生物の培養物を用いてＬ−リジンを安定に効
率よく生産することが可能となる。
リン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含むコリネ型
細菌内で複製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導
入して該微生物の培養物を用いてＬ−リジンを安定に効
率よく生産することが可能となる。
【００３３】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。
【００３４】なお、上記のＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。
菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
ール資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００
の菌株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の菌株を親株とし
たＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。
【００３５】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴ
ＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴ
ＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０；
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibac
terium lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネ
バクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutam
icum）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用いる
こともできる。
【００３６】なお、宿主としてブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Bact.Rev.，３６，ｐ.３６１〜４０５（１９７２）参
照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する
方法の一例を示せば次のとおりである。
ラバムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が
保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７
８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミド
ｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプ
ラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例え
ば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させるこ
とも可能であるし、人為的に除去することも可能である
［Bact.Rev.，３６，ｐ.３６１〜４０５（１９７２）参
照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去する
方法の一例を示せば次のとおりである。
【００３７】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去
されている株を選択する。この操作によりプラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来菌株が得られる。
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０.２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去
されている株を選択する。この操作によりプラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来菌株が得られる。
【００３８】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Calvi
n，N.M．and Hanawalt，P.C.，Journal of Bacteriolog
y，１７０，２７９６（１９８８）；Ito，K.，Nishid
a，T．and Izaki．K.，Agricultural and Biological C
hemistry，５２，２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受
容菌へのパルス波通電［Satoh，Y．et al.，Journal of
Industrial Microbiology，５，１５９（１９９０）参
照］によりプラスミドを導入することが可能である。
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシェリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Calvi
n，N.M．and Hanawalt，P.C.，Journal of Bacteriolog
y，１７０，２７９６（１９８８）；Ito，K.，Nishid
a，T．and Izaki．K.，Agricultural and Biological C
hemistry，５２，２９３（１９８８）参照］、ＤＮＡ受
容菌へのパルス波通電［Satoh，Y．et al.，Journal of
Industrial Microbiology，５，１５９（１９９０）参
照］によりプラスミドを導入することが可能である。
【００３９】上記の方法で形質転換して得られるジヒド
ロジピコリン酸シンセターゼ産生能を有するコリネ型細
菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来株の培養方法を以下に述べる。
ロジピコリン酸シンセターゼ産生能を有するコリネ型細
菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来株の培養方法を以下に述べる。
【００４０】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無
機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二
水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この
他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の
栄養素を培地に添加することができる。
【００４１】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気条
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。
件下に、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近とすることができ、培養中
のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加して行うことができ
る。
【００４２】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適
期間は３日間である。
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。ま
た、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適
期間は３日間である。
【００４３】このようにして得られる培養物から各々菌
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−リジン
生成反応に使用することができる。
体を集めて、水又は適当な緩衝液で洗浄し、Ｌ−リジン
生成反応に使用することができる。
【００４４】Ｌ−リジン生成反応においては、これらの
菌体をそのまま用いることができ、あるいは超音波処理
等を加えた菌体破砕物又はそれから分離された粗酵素も
しくは精製酵素として、あるいは適当な担体に固定化し
て用いることができる。以上に述べた如き菌体の破砕
物、粗もしくは精製酵素、固定化物等を本明細書ではま
とめて「菌体処理物」という。
菌体をそのまま用いることができ、あるいは超音波処理
等を加えた菌体破砕物又はそれから分離された粗酵素も
しくは精製酵素として、あるいは適当な担体に固定化し
て用いることができる。以上に述べた如き菌体の破砕
物、粗もしくは精製酵素、固定化物等を本明細書ではま
とめて「菌体処理物」という。
【００４５】しかして本発明に従えば、グルコースを、
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジン
を生成せしめることからなるＬ−リジンの製造法が提供
される。
上記培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジン
を生成せしめることからなるＬ−リジンの製造法が提供
される。
【００４６】グルコースと上記の培養菌体又は菌体処理
物との接触は、通常の酵素反応と同様に、水性媒体中で
好ましくは約２０〜約４０℃、特に約２５〜約３５℃の
温度で行なうことができる。
物との接触は、通常の酵素反応と同様に、水性媒体中で
好ましくは約２０〜約４０℃、特に約２５〜約３５℃の
温度で行なうことができる。
【００４７】生成するＬ−リジンはそれ自体既知の手
段、例えば、高速液体クロマトグラフィー等の手段によ
り反応液から分離回収することができる。
段、例えば、高速液体クロマトグラフィー等の手段によ
り反応液から分離回収することができる。
【００４８】
【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。
例によりさらに具体的に説明する。
【００４９】実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のジヒ
ドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化 （Ａ） ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸
５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、
グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ］１ｌに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得
られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む
１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.
０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁し
た。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍ
ｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さら
にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になる
ように添加し、５０℃で６時間保温して容菌した。この
溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、
上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよ
うに添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加え
た。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス
棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾し
た。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.
５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４
℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
ドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化 （Ａ） ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸
５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、
グルコース２０ｇ、蒸留水１ｌ］１ｌに、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得
られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む
１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.
０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁し
た。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍ
ｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さら
にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０.５％になる
ように添加し、５０℃で６時間保温して容菌した。この
溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加
し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心
分離（５,０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、
上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０.３Ｍとなるよ
うに添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加え
た。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス
棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾し
た。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.
５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４
℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。
【００５０】（Ｂ） 組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ ５０units を用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＢａｍＨＩ分解ＤＮＡにクローニングベク
ターｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市販）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。
−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μｌを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ ５０units を用い、３７℃で１時間反応させ完全分
解した。このＢａｍＨＩ分解ＤＮＡにクローニングベク
ターｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市販）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを混合
し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各
成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応さ
せ、結合させた。
【００５１】（Ｃ） ジヒドロジピコリン酸シンセター
ゼをコードする遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選抜に用いた欠損大腸菌変異株は、エシェ
リヒア・コリＪＥ７６２７（ｄａｐＡ）である［（ ）
内はジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子型（Geno
type）を示す］。上記（Ｂ）項で得られたプラスミド混
液を用い、塩化カルシウム法（Journalof Molecular Bi
ology，５３，１５９，１９７０）により前記エシェリ
ヒア・コリＪＥ７６２７株を形質転換し、クロラムフェ
ニコール５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、
ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ、リジン２０ｍｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
ゼをコードする遺伝子を含むプラスミドの選択 上記遺伝子の選抜に用いた欠損大腸菌変異株は、エシェ
リヒア・コリＪＥ７６２７（ｄａｐＡ）である［（ ）
内はジヒドロジピコリン酸シンセターゼ遺伝子型（Geno
type）を示す］。上記（Ｂ）項で得られたプラスミド混
液を用い、塩化カルシウム法（Journalof Molecular Bi
ology，５３，１５９，１９７０）により前記エシェリ
ヒア・コリＪＥ７６２７株を形質転換し、クロラムフェ
ニコール５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、
ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ、リジン２０ｍｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
【００５２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約８ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約８ｋｂの挿入Ｄ
ＮＡ断片が認められた。
【００５３】本プラスミドをｐＨＳＧ３９９−ｄａｐＡ
と命名した。
と命名した。
【００５４】（Ｄ） ジヒドロジピコリン酸シンセター
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）断片のサ
ブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３９９−ｄａｐ
に含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造より市
販）へジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコートする
遺伝子を含むＤＮＡ断片を下記のとおりサブクローニン
グした。
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ）断片のサ
ブクローニング 上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３９９−ｄａｐ
に含まれるＤＮＡ挿入断片を、必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造より市
販）へジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコートする
遺伝子を含むＤＮＡ断片を下記のとおりサブクローニン
グした。
【００５５】上記（Ｃ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３
９９−ｄａｐＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断
したものと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＳａｌＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度
は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合
させた。
９９−ｄａｐＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断
したものと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＳａｌＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度
は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合
させた。
【００５６】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Journal of Molecular Biology，５３，１５
９，１９７０）により前記エシェリヒア・コリＪＥ７６
２７株を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択
培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2
ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース
２０ｇ、リジン２０ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに
溶解］に塗抹した。
シウム法（Journal of Molecular Biology，５３，１５
９，１９７０）により前記エシェリヒア・コリＪＥ７６
２７株を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択
培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2
ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース
２０ｇ、リジン２０ｍｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに
溶解］に塗抹した。
【００５７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２.５ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約２.５ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＵＣ１１９の長さ
３.２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２.５ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約２.５ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
【００５８】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
【００５９】
【表２】 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＵ
Ｃ１１９−ｄａｐＡと命名した。
Ｃ１１９−ｄａｐＡと命名した。
【００６０】以上によりジヒドロジピコリン酸シンセタ
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさが約２.５ｋｂの
ＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片）を得ることが
できた。
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさが約２.５ｋｂの
ＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片）を得ることが
できた。
【００６１】実施例２ ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子
の塩基配列の決定 実施例１の（Ｄ）項で得られたジヒドロジピコリン酸シ
ンセターゼをコードする遺伝子を含む長さが約２.５ｋ
ｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列をプラスミドｐ
ＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法（dideoxy chain termination 法）（Sa
hger，F.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci．USA ７４、５４
６３、１９７７）により図２に示した戦略図に従って決
定した。
の塩基配列の決定 実施例１の（Ｄ）項で得られたジヒドロジピコリン酸シ
ンセターゼをコードする遺伝子を含む長さが約２.５ｋ
ｂのＤＮＡ断片について、その塩基配列をプラスミドｐ
ＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌク
レオチド酵素法（dideoxy chain termination 法）（Sa
hger，F.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci．USA ７４、５４
６３、１９７７）により図２に示した戦略図に従って決
定した。
【００６２】その塩基配列中のオープンリーディングフ
レームの存在から、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
をコードする遺伝子は、下記配列に示す塩基配列を有す
る３０１個のアミノ酸をコードする９０６の塩基対より
構成されていることが判明した。
レームの存在から、ジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
をコードする遺伝子は、下記配列に示す塩基配列を有す
る３０１個のアミノ酸をコードする９０６の塩基対より
構成されていることが判明した。
【００６３】
【化４】実施例３ コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミドベクターｐＣ
ＲＹ３０の作成 （Ａ） プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.
５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４
４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られ
た菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液［０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）Ｓ
ＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１
５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液
［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、
蒸留水２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分
混和してから氷水中に１５分間静置した。
ＲＹ３０の作成 （Ａ） プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１
５）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のよう
にして調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ
4)2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.
５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍ
ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２.５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２００μｇ、塩酸チアミ
ン２００μｇ、グルコース２０ｇ及び蒸留水１ｌ］１ｌ
に、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４
４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られ
た菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む緩衝
液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース］２０ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液にアル
カリ−ＳＤＳ液［０.２Ｎ ＮａＯＨ、１％（Ｗ／Ｖ）Ｓ
ＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混和して室温にて１
５分間静置した。次に、この反応液に酢酸カリウム溶液
［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢酸１１.５ｍｌ、
蒸留水２８.５ｍｌの混合液］３０ｍｌを添加し、充分
混和してから氷水中に１５分間静置した。
【００６４】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。
間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得
た。
【００６５】これに等量のフェノール−クロロホルム液
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
（フェノール：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５,００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５,０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。
【００６６】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８.０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１.３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６,０００×ｇの遠心分離を行った。
０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８.０に調
整］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５
倍濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇ
を溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１.３９２ｇ／
ｍｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６,０００×ｇの遠心分離を行った。
【００６７】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。
【００６８】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コールで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
コールで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加し
た後、２倍量エタノールを加え、−２０℃１時間静置し
た。この溶液を１５,０００×ｇの遠心分離にかけてＤ
ＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ得
た。
【００６９】（Ｂ） プラスミドベクターｐＣＲＹ３０
の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５units）を３７℃１時間反応させ、
プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
の作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０.５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５units）を３７℃１時間反応させ、
プラスミドＤＮＡを完全に分解した。
【００７０】前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１unit）を３７℃
で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
た。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素
を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処理した
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit になるように各成分を強化し、１６℃
で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・
コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転
換した。
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１unit）を３７℃
で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
た。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素
を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処理した
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７.６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit になるように各成分を強化し、１６℃
で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・
コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転
換した。
【００７１】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７.
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
［T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，“Molecular
cloning"（１９８２）ｐ９０〜９１参照］により抽出
した。
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び蒸留水１ｌ、ｐＨ７.
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これらの生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
［T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook，“Molecular
cloning"（１９８２）ｐ９０〜９１参照］により抽出
した。
【００７２】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４.０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４.０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。
【００７３】次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２.１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２.１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラス
ミドベクターｐＣＲＹ３０を調製した。
【００７４】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡの作成及びコリネ型
細菌への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９−ｄａｐＡ ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
を各５units 用い、３７℃で１時間反応させ分解し、平
滑末端処理したものと、ＢａｍＨＩリンカー(宝酒造よ
り市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１
unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ結合させた。
細菌への導入 実施例１の（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９
９−ｄａｐＡ ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
を各５units 用い、３７℃で１時間反応させ分解し、平
滑末端処理したものと、ＢａｍＨＩリンカー(宝酒造よ
り市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１
unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ結合させた。
【００７５】このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ ３units
を用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施
例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０ １
μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ １unit を用い、３７℃で１
時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最
終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
ェリヒア・コリＪＥ７６２７株を形質転換し、カナマイ
シン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７
ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ、リジン２０ｍ
ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
を用い３７℃で１時間反応させ分解したものと、実施
例３の（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＣＲＹ３０ １
μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ １unit を用い、３７℃で１
時間反応させ分解したものを混合し、５０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ１unit の各成分を添加し（各成分の濃度は最
終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ結合させ
た。このプラスミドを用いて、前記方法に従い前記エシ
ェリヒア・コリＪＥ７６２７株を形質転換し、カナマイ
シン５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ2ＨＰＯ4 ７
ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ、グルコース２０ｇ、リジン２０ｍ
ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹した。
【００７６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ２.５ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ
８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ２.５ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。
【００７７】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡ
を、コリネ型細菌へ形質転換した。
を、コリネ型細菌へ形質転換した。
【００７８】形質転換は、電気パルス法を用いて次のと
おり行った。
おり行った。
【００７９】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Sucrose、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐ
Ｈ７.４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間
培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含
む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養し
た。出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例３
（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。この
プラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の表３に示す。
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０
２除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニット／ｍｌになるように
添加して、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ
Sucrose、７ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ｐ
Ｈ７.４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０.７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間
培養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含
む前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養し
た。出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例３
（Ａ）項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。この
プラスミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大き
さを測定した。その結果を下記の表３に示す。
【００８０】
【表３】 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ３０−ｄａｐＡと命名した。
Ｙ３０−ｄａｐＡと命名した。
【００８１】なお、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡ
により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＡは、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年１２
月１６日付で：微工研菌寄第１２６５９号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６５９）として寄託されている。
により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＡは、茨城県つくば市東１丁目１番３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、平成３年１２
月１６日付で：微工研菌寄第１２６５９号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６５９）として寄託されている。
【００８２】実施例５ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｄａｐＡの安定性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＡを植菌し、３０℃にて２４時間振盪
培養を行つた後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０cells の割合に
なるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養
を行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カ
ナマイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及
び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗
抹し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例４で得た形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３−ｄａｐＡを植菌し、３０℃にて２４時間振盪
培養を行つた後、同様にして調製したＡ培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５
分間滅菌したものに、１ｍｌ当たり５０cells の割合に
なるように植継し、同じく３０℃にて２４時間振盪培養
を行った。次に遠心分離して集菌し、菌体を洗浄後、カ
ナマイシンを１５μｇ／ｍｌの割合で添加したＡ培地及
び無添加のＡ培地を用いて調製した平板培地に一定量塗
抹し、３０℃にて１日培養後生育コロニーをカウントし
た。
【００８３】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培
地生育コロニーは全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認し
た。
【００８４】実施例６ Ｌ−リジンの生産 培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、ＫＨ2
ＰＯ4 ０.０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、Ｆ
ｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２
ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ
１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−ｄａ
ｐＡ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５９）を植菌し、無菌的に
グルコースを５ｇ／ｌの濃度になるように加え、３０℃
にて２日間振盪培養を行つた。
ＰＯ4 ０.０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、Ｆ
ｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２
ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ
１００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−ｄａ
ｐＡ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６５９）を植菌し、無菌的に
グルコースを５ｇ／ｌの濃度になるように加え、３０℃
にて２日間振盪培養を行つた。
【００８５】次に、本培養培地（グルコース５％、硫酸
アンモニウム２.３％、ＫＨ2ＰＯ4０.０５％、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣ
ｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.３％、酵母エキス
０.３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培養物の２
０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６にて２４時間培養を行っ
た。
アンモニウム２.３％、ＫＨ2ＰＯ4０.０５％、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4 ０.０５％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％、Ｆｅ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
２０ｐｐｍ、ビオチン２００μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣ
ｌ １００μｇ／ｌ、カザミノ酸０.３％、酵母エキス
０.３％）の１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌槽に仕込
み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、前記前培養物の２
０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ、通気量１ｖ
ｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６にて２４時間培養を行っ
た。
【００８６】培養終了後、培養物５００ｍｌから遠心分
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液［（ＮＨ4)2ＳＯ4 ２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／
ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１００μｇ
／ｌ；ｐＨ７.６］の１０００ｍｌに懸濁後、該懸濁液
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇを添加し
て、回転数３００ｒｐｍ、通気量０.１ｖｖｍ、温度３
３℃、ｐＨ７.６にて２４時間反応を行った。
離にて集菌後、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応
液［（ＮＨ4)2ＳＯ4 ２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／
ｌ；ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.
５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；ＭｎＳＯ4
・４〜６Ｈ2Ｏ ２０ｐｐｍ；チアミン塩酸塩１００μｇ
／ｌ；ｐＨ７.６］の１０００ｍｌに懸濁後、該懸濁液
を２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、グルコース９ｇを添加し
て、回転数３００ｒｐｍ、通気量０.１ｖｖｍ、温度３
３℃、ｐＨ７.６にて２４時間反応を行った。
【００８７】反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は
１.１ｇ／ｌであった。
１５分間、４℃）にて除菌した上清液中のＬ−リジンを
定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は
１.１ｇ／ｌであった。
【００８８】この反応終了後の培養液５００ｍｌを、強
酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+ 型）のカラムに通してＬ−
リジンを吸着させ、水洗後、０.５Ｎアンモニア水で溶
出させた後、Ｌ−リジン画分を濃縮し、冷エタノールで
Ｌ−リジンの結晶を折出させた。その結果、３００ｍｇ
のＬ−リジン結晶が得られた。
酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+ 型）のカラムに通してＬ−
リジンを吸着させ、水洗後、０.５Ｎアンモニア水で溶
出させた後、Ｌ−リジン画分を濃縮し、冷エタノールで
Ｌ−リジンの結晶を折出させた。その結果、３００ｍｇ
のＬ−リジン結晶が得られた。
【００８９】また、比較例として、同様の条件にて、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を培養
し、同様の条件にて反応させた後上清液中のＬ−リジン
を定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は
０.６ｇ／ｌであった。
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を培養
し、同様の条件にて反応させた後上清液中のＬ−リジン
を定量した。その結果、上清液中のＬ−リジン生成量は
０.６ｇ／ｌであった。
【００９０】
【化５】
【図１】本発明のジヒドロジピコリン酸シンセターゼを
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素による切
断点地図。
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素による切
断点地図。
【図２】大きさが約２.５ｋｂの本発明ＤＮＡ断片の塩
基配列決定のための概略図。
基配列決定のための概略図。
【化２その１】
【化２その２】
【化３その１】
【化３その２】
【化３その３】
【化４その１】
【化４その２】
【化４その３】
【化５その１】
【化５その２】
【化５その３】
【化５その４】
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三 菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (8)
- 【請求項１】 コリネ型細菌由来のジヒドロジピコリン
酸シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする
遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項２】 コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ２３３である請
求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列 【化１】 で示されるジヒドロジピコリン酸シンセターゼ（Ｅ.Ｃ.
４.２.１.５２）をコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項４】 次のアミノ酸配列 【化２】で示されるジヒドロジピコリン酸シンセターゼ
（Ｅ.Ｃ.４.２.１.５２）をコードする遺伝子ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
ＤＮＡが導入された組換えプラスミド。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子
ＤＮＡと、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子
を含むＤＮＡを保有する組換えプラスミド。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換えプラスミドで形質
転換されたコリネ型細菌。 - 【請求項８】 グルコースを、請求項７記載のコリネ型
細菌の培養菌体又は菌体処理物と接触させて、Ｌ−リジ
ンを生成させることを特徴とするＬ−リジンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4024401A JPH05184371A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4024401A JPH05184371A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184371A true JPH05184371A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=12137145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4024401A Pending JPH05184371A (ja) | 1992-01-14 | 1992-01-14 | ジヒドロジピコリン酸シンセターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05184371A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
-
1992
- 1992-01-14 JP JP4024401A patent/JPH05184371A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
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