JPH0775579A - ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
の染色体ＤＮＡから得られ、ジアミノピメリン酸デカル
ボキシラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該
ＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、および該組換
えプラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌。 【効果】該ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミドに
より形質転換されたコリネ型細菌を用いることで、従来
よりも高効率にＬ−リジンを生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ジアミノピメリン酸デ
カルボキシラーゼ（EC 4.1.1.20）をコードする遺伝子
を含むコリネ型細菌由来のＤＮＡ断片およびその利用に
関し、より詳しくは、ジアミノピメリン酸デカルボキシ
ラーゼをコードする遺伝子を含むブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）由来のＤＮＡ断
片、該ＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド、および
該プラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
（EC 4.1.1.20）は、医薬や食品添加物として用いられ
るＬ−リジンの生合成に関与する工業的に有用な酵素で
ある。ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコード
する遺伝子としては、エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）由来の遺伝子（J. Mol. Biol., 168, 321-331,
1983 参照）、およびコリネバクテリウム・グルタミカ
ム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子（Mol.
Gener. Genet., 212, 105-111, 1988: Mol. Gener. Gen
et., 212, 112-119, 1988: Mol. Microbiol., 4(11), 1
819-1830,1990 参照）についての報告例はあるものの、
本発明者らの知る限りでは、産業上重要な微生物である
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）由来のジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコ
ードする遺伝子についての報告例は見当たらない。 一方、従来提案されている微生物を用いるＬ−リジンの
製造法では、Ｌ−リジンの蓄積等に限界があり、新たな
観点から遺伝子工学的手法による菌株の改良も含め、Ｌ
−リジンをより効率的に生成させる方法の提供が強く求
められている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、コリ
ネ型細菌に属するブレビバクテリウム・フラバム（Brev
ibacterium flavum）由来のジアミノピメリン酸デカル
ボキシラーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を
同種であるコリネ型細菌に導入し、該コリネ型細菌を用
いて新たな観点から効率的にＬ−リジンを製造すること
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意研究を行った結果、コリネ型細菌染色体
からジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片を適
当なベクタープラスミドに導入してコリネ型細菌を形質
転換し、該形質転換されたコリネ型細菌がＬ−リジンの
高生産能力を有することを見いだし、本発明を完成する
に至った。即ち本発明は、（１） ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）由来のジアミノ
ピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含
むＤＮＡ断片、（２） 該ＤＮＡ断片を保有する組換え
プラスミド、（３） 該組換えプラスミドにより形質転
換されたコリネ型細菌、を提供するものである。本発明
の上記ＤＮＡ断片を用いることにより、コリネ型細菌内
でジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを高生産し得
るベクタープラスミドを造成することができ、このベク
タープラスミドでコリネ型細菌を形質転換することによ
り、Ｌ−リジンを効率的に生産し得る工業的に有用なコ
リネ型細菌を育種することが可能である。かくして育種
されたコリネ型細菌を用いてＬ−リジンを効率的に製造
することができる。以下に、本発明についてさらに詳細
に説明する。

【０００５】

【本発明の具体的説明】本発明の、ジアミノピメリン酸
デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片（以下これを「Ａ断片」と略称することがある。）と
は、Ｌ−リジンの前駆体である meso-ジアミノピメリン
酸を脱炭酸してＬ−リジンを合成する酵素、即ちジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.20）をコ
ードする遺伝子ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を意味する。

【０００６】本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシ
ラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片はその塩基
配列が決定された後においては合成することも可能であ
るが、通常は該酵素を生産する微生物から単離およびク
ローニングして取得可能であり、その供給源となる微生
物としてはコリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・
フラバム（Brebibacterium flavum）ＭＪ−２３３（FER
M BP-1497）およびその由来株等が好適に用いられる。
これら供給源微生物からＡ断片を調製するための基本的
操作の１例を以下に示す。

【０００７】Ａ断片は上記コリネ型細菌、例えばブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）
株の染色体ＤＮＡ上に存在し、その染色体ＤＮＡを適当
な制限酵素で切断して生じる切断断片の中から分離、取
得することが可能である。まず、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株の培養物から常法により染色体
ＤＮＡを抽出し、該染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例
えばＳａｕ３ＡIを用いて部分分解する。次に得られた
ＤＮＡ断片を、適当なマーカー遺伝子を有するベクター
プラスミド、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有するｐ
ＨＳＧ２９８（宝酒造製）に常法により挿入する。得ら
れたベクタープラスミドを用い、通常の形質転換法、例
えば塩化カルシウム法または電気パルス法等により適当
な宿主細菌、例えばジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼ遺伝子が欠損した大腸菌（エシェリヒア・コリ）変
異株ＣＧＳＣ４３４５［エシェリヒア・コリ ジェネテ
ック・ストック・センター（Escherichia coli Genetic
Stock Center）、デパートメント・オブ・バイオロジ
ー、エール・ユニバーシィティ（Department of Biolog
y, YaleUniversity）：P.O.Box 6666 New-Haven, GT 06
511-74, USA 保存株］を形質転換し、菌体を選択培地上
で培養して形質転換株の有する組換えプラスミドのマー
カー遺伝子発現の有無により、形質転換株を分離、取得
する。得られた形質転換株より、プラスミドＤＮＡを常
法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等により抽出し、適当な
制限酵素で切断する。得られたＤＮＡ断片を常法、例え
ばポリアクリルアミド電気泳動法等により解析すること
により、前記プラスミドＤＮＡに挿入されたブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来のＡ断片を確認
および取得することができる。

【０００８】上記手法により得られるＡ断片の例として
は、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の
染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡIにより部分分解し
て得られる、大きさ約１.５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げる
ことができる。このジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子を含む大きさが約１.５ｋｂの
ＤＮＡ断片を各種制限酵素により切断した際の、制限酵
素認識部位数および切断断片の大きさを下記表１に示
す。

【０００９】

【表１】

【００１０】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片またはプラスミドを、制
限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自
体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および
４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。また、「切断断
片の大きさ」およびプラスミドの大きさは、アガロース
ゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリヒア・コリの
ラムダファージ（λphage）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同
一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる
場合には、エシエリヒア・コリのファイ・エックス１７
４ファージ（φｘ174 phage）のＤＮＡを制限酵素Ｈａ
ｅIIIで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同
一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標
準線に基づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮ
Ａ断片の大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切
断断片それぞれの大きさを加算して求める。なお、各Ｄ
ＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の
大きさついては１％アガロースゲル電気泳動によって得
られる結果を採用し、約０.１ｋｂから１ｋｂ未満の断
片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって得られる結果を採用した。

【００１１】一方、上記したブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Iを用いて部分分解することにより得られる大きさが約
１.５ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプ
ラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）
を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain
termination method, Sanger,F. ら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 74,p5463, 1977）により決定することが
できる。このようにして決定した上記大きさが約１.５
ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列のオープン・リーディング
・フレームの存在から決定したジアミノピメリン酸デカ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子は、４４５個のアミ
ノ酸をコードする１３３５塩基対から構成されている。
その塩基配列を後記配列表の配列番号：１に示す。

【００１２】配列番号：１に示される塩基配列を包含し
てなる本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、天然のコリネ
型細菌染色体ＤＮＡから単離されたもののみならず、通
常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイ
オシステムズ社製３９４型を用いて合成されたものであ
ってもよい。また、配列番号：１に示される塩基配列を
包含してなる本発明のＤＮＡ断片は、ジアミノピメリン
酸デカルボキシラーゼをコードする機能を実質的に損な
うことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基で
置換されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入され
ていてもよく、また一部の塩基が欠損または転位してい
てもよく、これら誘導体のいずれもが、本発明のジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ断片に包含されるものである。以上に詳述し
たジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする
遺伝子を含む大きさ約１.５ｋｂのＤＮＡ断片の各種制
限酵素による切断点地図を図１に示す。

【００１３】本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシ
ラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）
を適当なプラスミドベクター、例えば、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも
保有するプラスミドベクターに導入することにより、コ
リネ型細菌内でジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
を高発現する優れた組換えプラスミドを得ることができ
る。また、本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子を発現させるためのプロモータ
ーは、コリネ型細菌が保有する該遺伝子自身のプロモー
ターのみならず、コリネ型細菌内でジアミノピメリン酸
デカルボキシラーゼ遺伝子の転写を開始させ得るプロモ
ーターであれば、原核生物に由来する天然または合成塩
基配列であっても、その他のいかなる塩基配列であって
もよい。

【００１４】本発明のＡ断片を導入することができ、コ
リネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子
を少なくとも保有するプラスミドベクターとしては、例
えば、プラスミドｐＣＲＹ３０（特開平3-210184号公
報）；プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣ
ＲＹ３ＫＸ(特開平2-276579号公報)；プラスミドｐＣＲ
Ｙ２およびｐＣＲＹ３（特開平1-191686号公報)；プラ
スミドｐＡＭ３３０（特開昭58-67679号公報);プラスミ
ドｐＨＭ１５１９（特開昭58-77895号公報)；プラスミ
ドｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およびｐＡＪ１８４４
（特開昭58-192900号公報）；プラスミドｐＣＧ１（特
開昭57-134500号公報）；プラスミドｐＣＧ２（特開昭5
8-35197号公報）；プラスミドｐＣＧ４およびｐＣＧ１
１（特開昭57-183799号公報）等のプラスミドを例示す
ることができる。これらの中でも、コリネ型細菌内でプ
ラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域お
よびコリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含む
ＤＮＡ領域を保有するプラスミドが好ましく、例えば、
プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２Ｋ
Ｅ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、
ｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に用いられる。

【００１５】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法の１例を以下に示す。ブレビバクテリウム・
スタチオニス（Brevibacterium stationis）IFO12144
（FERM BP-2515）からプラスミドｐＢＹ５０３（特開平
1-95785号公報）ＤＮＡを常法により抽出し、これを制
限酵素ＸｈｏＩで処理して、プラスミド複製増殖機能を
司る遺伝子を含む大きさが約４.０ｋｂのＤＮＡ断片を
切り出す。同様にして該プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで処理して、プラスミド安定化
機能を司る遺伝子を含む大きさが約２.１ｋｂのＤＮＡ
断片を切り出す。得られた２つのＤＮＡ断片をプラスミ
ドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ
部位およびＳａｌＩ部位にそれぞれ組込むことにより、
プラスミドｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００１６】次に、上記プラスミドベクターへの本発明
のＡ断片の導入は、例えば、プラスミドベクター中に１
箇所だけ存在する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、
そこに前記Ａ断片および開裂したプラスミドベクターを
必要に応じてＳ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端とす
るか、または適当なアダプターＤＮＡの存在下にＤＮＡ
リガーゼ処理で連結させることにより行うことができ
る。プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のＡ断片の導入
は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素ＢａｍＨＩで開
裂させ、そこに前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）を
ＤＮＡリガーゼで連結させることにより行うことができ
る。

【００１７】かくして造成される本発明のＡ断片をプラ
スミドｐＣＲＹ３０に導入した組換えプラスミドは、ジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼの高産生能力を有
しておりＬ−リジンの製造に好適に利用することができ
る。本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＣ
ＲＹ３０−ｌｙｓＡ”と命名した。本プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０−ｌｙｓＡの作製方法については、後記実施例３
にて詳細に説明する。上記手法により造成される本発明
のジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする
遺伝子を含むコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミ
ドを宿主微生物に導入し、該微生物を形質転換して得ら
れる形質転換微生物を用いて安定して効率良くＬ−リジ
ンを生産することができる。

【００１８】本発明による上記組換えプラスミドで形質
転換しうる宿主微生物としては、コリネ型細菌、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM
BP-1497)、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
−ＡＢ−４１（FERM BP-1498)、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３−ＡＢＴ−１１（FERM BP-1500)、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＡＢＤ−２
１（FERM BP-1499）等が挙げられる。なお、上記 FERM
BP-1498 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親株としてＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノー
ル資化性微生物である（特公昭59-28398号公報参照）。
また、FERM BP-1500 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を
親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高活
性変異株である（特開昭62-51998号公報参照）。さら
に、FERM BP-1499 の菌株は FERM BP-1497 の菌株を親
株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株
である（特開昭61-177993号公報参照）。

【００１９】上記微生物の他に、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC
6871、同 ATCC 13745、同 ATCC 13746、ブレビバクテ
リウム・デバリカム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 4020、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glut
amicum）ATCC 31830等を宿主微生物として用いることも
できる。なお、宿主としてブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株の保有
するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭63-36787号公報参
照）のために形質転換が困難な場合があるので、そのよ
うな場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除
去することが望ましい。プラスミドｐＢＹ５０２を除去
する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことに
より自然に欠落させることも可能であるし、人為的に除
去することも可能である［バクテリオロジカル・レビュ
ー（Bacteriological Review)、第36巻、361頁、1972年
参照]。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除去す
る方法の１例を以下に示す。

【００２０】宿主菌ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の生育を不完全に阻害する濃度、例えば０.２
〜５０ μg/ml 濃度のアクリジンオレンジもしくはエチ
ジウムブロミド等を含有する培地に１ｍｌ当たり約１０
菌体の密度で該宿主菌を植菌し、その生育を不完全に阻
害しながら約３５℃で約２４時間培養する。この培養液
を希釈して寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日間培養
する。得られたコロニーから各々独立にプラスミド抽出
操作を行ない、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてい
る株を選抜する。この一連の操作により、プラスミドｐ
ＢＹ５０２が除去されたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来株が得られる。

【００２１】上記コリネ型細菌への前記組換えプラスミ
ドの形質転換法としては、エシエリヒア・コリ（E. col
i）およびエルビニア・カロトボラ（Erwinia carotovor
a）について知られているように［エヌ・エム・カルビ
ン（N.M.Calvin）およびピー・シー・ハナワルト（P.C.
Hanawalt）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Jo
urnal of Bacteriology）170巻、2796頁、1988年；ケー
・イトウ（K.Ito）ら、アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー（Agriculturaland Biol
ogical Chemistry)、52巻、293頁、1988年 参照]、ＤＮ
Ａ受容菌にパルス波を通電する方法［ワイ・サトウ（Y.
Satoh）ら、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マ
イクロバイオロジー（Journal of Industrial Microbio
logy)、5巻、159頁、1990年］等を利用することができ
る。

【００２２】上記の方法で形質転換して得られるジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼ高産生能を有するコリ
ネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３由来株の培養方法を、以下に述べる。得られた形
質転換コリネ型細菌は、炭素源、窒素源、無機非金属ま
たは金属塩、ビタミン類等、該細菌の増殖に必要かつ十
分な栄養成分を含有する培地を用いて、適当な好気、温
度、ｐＨ条件の下に培養することができる。培地に含有
される栄養成分は、培養の開始時に全て添加することも
できるし、また培養の進展に伴い逐次または連続的に添
加することもできる。

【００２３】培地中の炭素源としては、例えば、グルコ
ース、グリセロール、フルクトース、シュクロース、マ
ルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の炭水化物；コハク
酸、フマル酸、酢酸、乳酸等の有機酸；エタノール、メ
タノール等のアルコール類の中から培養対象細菌が資化
可能な炭素源を選択して、単独でまたは組合わせて用い
ることができる。培養開始時の炭素源濃度は１〜５容量
％であることが好ましく、さらに好ましくは２〜３容量
％である。窒素源としては、例えば、アンモニアまたは
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機
あるいは有機アンモニウム塩類；尿素等の他の無機含窒
素化合物；グルタミン酸等のアミノ酸類；ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、カゼミノ酸、コーンスチープリカ
ー等の含窒素天然栄養源等を用いることができる。

【００２４】無機非金属塩または金属塩としては、リン
酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸アンモ
ニウム、硫酸第一鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いることがで
きる。ビタミン類としてはビオチン、チアミンなどを必
要に応じて用いるが、含窒素天然栄養源の中にはこれら
のビタミン類を含有するものがあるので、これをもって
ビタミン類の代替とすることも可能である。 培養は通
常、振盪培養、通気攪拌培養等の好気条件下で行なう。
培養温度は一般に約２０〜４０℃、好ましくは約２５〜
３５℃に、培地のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８の
中性付近に、それぞれ維持することが好ましい。培地の
ｐＨ調整は、適当な酸またはアルカリを添加して行うこ
とができる。培養期間は通常１〜７日間とすることがで
きる。培養菌体は、培養終了後に遠心分離、膜分離等の
適当な手段で培養液から分離回収することができる。

【００２５】上記手法で得られる培養物または培養物か
ら得られる菌体を用いて、発酵法または酵素法によりＬ
−リジンを製造することができる。次に実施例により本
発明をさらに具体的に説明する。当然ながら、下記実施
例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ
挙げたものであり、本発明の範囲を何ら限定するもので
はない。

【００２６】

【実施例】実施例１ ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺
伝子を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
由来のＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素 ２ｇ、硫酸アンモニウ
ム ７ｇ、リン酸一カリウム ０.５ｇ、リン酸二カリウ
ム ０.５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.５ｇ、ＭｎＳＯ₄
・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、
酵母エキス２.５ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン １００μｇ、グルコース ２０ｇ
を蒸留水に溶解して１ｌとする］１ｌを用いてブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-1497）を
対数増殖期後期まで培養し、培養菌体を回収した。得ら
れた菌体を、リゾチームを１０ mg/mｌの濃度で含有す
る溶液［組成：１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス緩
衝液（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ]１５ｍ
ｌに懸濁した。続いて最終濃度１００ μg/mｌ量のプロ
テナーゼＫを添加し、３７℃で１時間インキュベートし
た。さらに最終濃度０.５％量のドデシル硫酸ナトリウ
ムを添加し、５０℃で６時間インキュベートして溶菌し
た。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶
液（１：１、ｖ/ｖ）を添加し、室温で１０分間穏やか
に振盪した後、全量を１０〜１２℃で２０分間、５,０
００×ｇの遠心分離にかけ、その上清画分を分取した。
酢酸ナトリウムをその最終濃度が０.３Ｍとなるように
該画分に添加し、次いで２倍量のエタノールを穏やかに
添加した。水層とエタノール層との間に存在するＤＮＡ
をガラス棒で搦め取り、これを７０％エタノールで洗浄
した後に風乾した。得られたＤＮＡは、溶液［組成；１
０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.５)、１ｍＭＥＤＴＡ・
２Ｎａ］５ｍｌを添加して４℃で一晩静置した後、実験
に供した。

【００２７】（Ｂ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドの創製
および選抜 前記（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液 ９０μｌを、１ unit の
制限酵素Ｓａｕ３ＡIと３７℃で１５分間反応させて部
分分解した。該分解物及びカナマイシン耐性遺伝子を有
するクローニングベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）
の制限酵素ＳａｌＩ分解物の５'突出末端の内側の２ｂ
ｐを相補的なデオキシヌクレオチドでうめた。得られた
それぞれのＤＮＡ分解物溶液を６５℃で１０分間加熱し
て制限酵素を失活させた後に混合し、該液に、それぞれ
の最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液(ｐＨ７.６)、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるよ
うに各成分を添加し、４℃で１５時間反応させて、ＤＮ
Ａを結合させた。

【００２８】上記手順により得られたプラスミド混液を
用い、塩化カルシウム法［J. Mol.Biol., 53, 159 (197
0)］により前記ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
欠損大腸菌変異株、エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＣＧＳＧ４３４５（ｌｙｓＡ）［(）内はジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子型を示す］を形
質転換した。形質転換した前記エシエリヒア・コリＣＧ
ＳＧ４３４５（ｌｙｓＡ）株を、カナマイシン ５０ｍ
ｇを含有する選択培地［組成；Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂
ＰＯ₄２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.１ｇ、グルコース ２０ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留
水 １ｌに溶解する］に塗抹した。この培地上に生育し
たジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする
遺伝子を含むプラスミドを保持する菌株を、常法により
液体培養して培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、得られた
分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結果、プラス
ミドｐＨＳＧ２９８の大きさ２.７ｋｂのＤＮＡ断片に
加え、大きさ約１.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本発明者らは、このプラスミドを“プラスミドｐＨ
ＳＧ２９８−ｌｙｓＡ”と命名した。

【００２９】（Ｃ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）の
サブク−ロニング 前記（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｌｙ
ｓＡに含まれる挿入ＤＮＡ断片を下記手順にてプラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造製）にサブクローニングした。
前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｌｙｓＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよび制限酵素ＨｉｎｄIIIと反応させて得ら
れる分解物と、プラスミドｐＵＣ１１８を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよび制限酵素ＨｉｎｄIIIと反応させて得られ
る分解物とを混合した。この混合液を６５℃で１０分間
加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終濃度が
５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １unit となるように
各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ
分解物を結合させた。

【００３０】得られたプラスミド混液を用いて、塩化カ
ルシウム法（J．Mol．Biol., 53,159, 1970)により前記
エシエリヒア・コリＣＧＳＧ４３４５株を形質転換し、
カナマイシンを５０ｍｇ含有する選択培地［組成：Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ｇ、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２０ｇおよ
び寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとする］に塗抹
した。この培地上に生育した菌株を常法により液体培養
し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し
た。抽出したプラスミドを制限酵素により分解し、得ら
れた分解物をアガロースゲル電気泳動に供した結果、プ
ラスミドｐＵＣ１１８の大きさ約３.２ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、大きさ約１.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認め
られた。確認された大きさ約１.５ｋｂの挿入ＤＮＡ断
片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したと同一で
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。また、上記手法により得られたプラスミドを各種
制限酵素で切断したときの制限酵素認識部位数および切
断断片の大きさを下記表２に示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】上記表２に示した制限酵素の切断断片によ
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＵＣ１
１８−ｌｙｓＡ”と命名した。以上により、ジアミノピ
メリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む
大きさ約１.５ｋｂのＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄIII断片；Ａ断片）を取得した。

【００３３】実施例２ ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺
伝子のＤＮＡ塩基配列の決定 実施例１（Ｃ）項で得たジアミノピメリン酸デカルボキ
シラーゼをコードする遺伝子を含む大きさ約１.５ｋｂ
のＤＮＡ断片の塩基配列を、プラスミドｐＵＣ１１８ま
たはｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素
法（dideoxychain termination 法）により、図２に示
した戦略図に従って決定した。得られた塩基配列中のオ
ープン・リーディング・フレームの存在からジアミノピ
メリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は後記
配列表の配列番号：１に示す塩基配列を有する４４５個
のアミノ酸をコードする１３３５塩基対より構成されて
いることが判明した。

【００３４】実施例３ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡの作成およびコリネ
型細菌への導入（Ａ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡの調製 実施例１（Ｂ）で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−
ｌｙｓＡ ５μｇを、各々 ５ units の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＨｉｎｄIIIと、３７℃で１時間反応させて
分解し、そのＤＮＡ分解物の末端部位を常法により処理
して平滑末端とした。このＤＮＡ分解物とＢａｍＨＩリ
ンカー（宝酒造製） １μｇとを混合した。混合液を６
５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞ
れの最終濃度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.
６）、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ un
it となるように各成分を添加し、１２℃で１５時間反
応させて、結合させた。

【００３５】得られた連結ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
３ units と３７℃で１時間反応させて得られたＤＮＡ
分解物と、特開平3-210184号公報に記載の方法に基いて
調製したプラスミドｐＣＲＹ３０ １μｇを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ １ unit と３７℃で１時間反応させて得られ
たＤＮＡ分解物とを混合し、この混合液を６５℃で１０
分間加熱して酵素を失活させた後に、それぞれの最終濃
度が ５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７.６）、１０ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ unit となるように
各成分を添加し、１２℃で１５時間反応させて、ＤＮＡ
分解物を結合させた。得られたプラスミド混液を用い
て、前記実施例１（Ｂ）に記載の方法により、前記エシ
ェリヒア・コリＣＧＳＧ４３４５株を形質転換し、カナ
マイシンを５０μg/mlの濃度で含有する選択培地［組
成：Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ
₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ、グルコース ２
０ｇおよび寒天 １６ｇを蒸留水に溶解して１ｌとす
る］に塗抹した。この培地上に生育した菌株を常法によ
り液体培養し、該培養液から常法によりプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。抽出したプラスミドを制限酵素により分
解し、得られた分解物をアガロースゲル電気泳動に供し
た結果、プラスミドｐＣＲＹ３０の大きさ約８.６ｋｂ
のＤＮＡ断片に加え、大きさ約１.５ｋｂの挿入ＤＮＡ
断片が認められた。

【００３６】（Ｂ）プラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡ
のコリネ型細菌への導入 上記の如く調整されたプラスミドＤＮＡを、電気パルス
法を用いて次のとおりコリネ型細菌へ形質転換した。ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM BP-14
97）プラスミド除去株を１００ｍｌの前記Ａ培地で対数
増殖期初期まで培養した後、ペニシリンＧを１ unit/m
ｌ となるように添加してさらに２時間振盪培養した。
培養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍｌのパルス用溶液
［組成：２７２ｍＭ シュークロース、７ｍＭ ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂；ｐＨ７.４］にて洗浄した。再
度、遠心分離にて菌体を集め、５ｍｌのパルス用溶液に
懸濁し、０.７５ｍｌの細胞と前記（Ａ）で得られたプ
ラスミド溶液５０μｌとを混合し、氷中にて２０分間静
置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ボルト、２５μＦＤに設定し、パルスを印加後
氷中に２０分間静置した。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に
移し、３０℃にて１時間培養後、カナマイシン １５ μ
g/mｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に植菌して３
０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性
株より、常法によりプラスミドを得た。このプラスミド
を各種制限酵素で切断し、得られた切断断片の大きさを
測定した。その結果を下記表３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】上記表３に示した制限酵素の切断断片によ
り特徴付けられるプラスミドを、“プラスミドｐＣＲＹ
３０−ｌｙｓＡ"、該プラスミドを保持する菌株を“ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｌｙｓＡ”と
それぞれ命名した。上記表３から明らかな如く、前記プ
ラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断することにより、プラスミドｐＨＳＧ２９８に由
来する大きさ８.６ｋｂのＤＮＡ断片に加えて、ジアミ
ノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を
含む大きさ約１.５ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。な
お、複合プラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡにより形質
転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−
ｌｙｓＡは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技
術院生命工学工業技術研究所に、平成５年８月６日付け
で受託番号：FERM P-13789 として寄託されている。

【００３９】実施例４ プラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡの安定性の確認 前記Ａ培地 １００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した後、この培地
に実施例３で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２
３３−ｌｙｓＡを植菌し、３０℃で２４時間の振盪培養
を行った。次いで、同様にしてＡ培地１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコに分注して１２０℃で１５分間滅
菌した培地に、培地１ｍｌ当たり５０細胞の密度で植継
し、再度３０℃で２４時間の振盪培養を行った。培養物
を遠心分離して菌体を回収し、回収した菌体を洗浄し
た。得られた菌体を、カナマイシンを１５ μg/ml の濃
度で添加した平板Ａ培地およびカナマイシン無添加の平
板Ａ培地に一定量塗抹し、３０℃で１日培養した後に、
生育したコロニーの数を計測した。また、カナマイシン
無添加のＡ培地上に生育したコロニーの菌株について
は、カナマイシン添加Ａ培地上での生育の可否も調査し
た。その結果、カナマイシン添加Ａ培地および無添加Ａ
培地における生育コロニー数は同数であり、さらにカナ
マイシン無添加Ａ培地上に生育したコロニーの菌株は全
てカナマイシン添加Ａ培地上に生育可能であった。これ
により、本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡが
高度の安定性を有することが確認された。

【００４０】実施例５ ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの酵素活性測定（Ａ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性測定
用粗酵素液の調製 培地［組成：尿素 ０.４％、硫酸アンモニウム １.４
％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０５％、ＣａＣｌ₂
・２Ｈ₂Ｏ ２ｐｐｍ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２ｐｐｍ、
ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ２ｐｐｍ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ２ｐｐｍ、ＮａＣｌ ２ｐｐｍ、ビオチン ２００μ
ｇ/ｌ、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カザミノ酸 ０.
１％、酵母エキス ０.１％を蒸留水に溶解する］１００
ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注して滅菌（滅菌
後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−ｌｙｓＡを植菌した。次いで、５ｇ/ｌ
（最終濃度）のグルコースを無菌的に添加し、３０℃で
２日間振盪培養を行った。次に、本培養培地［組成：グ
ルコース ５％ｇ、硫酸アンモニウム ２.３％、リン酸
一カリウム ０.０５％、リン酸二カリウム ０.０５％、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０５％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
２０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ２０ｐｐｍ、ビオ
チン ２００μｇ/l、塩酸チアミン １００μｇ/ｌ、カ
ザミノ酸 ０.３％、酵母エキス ０.３％を蒸留水に溶解
する］１０００ｍｌを２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、１２
０℃で２０分間滅菌した後、この槽に前記振盪培養によ
り得られた培養物 ２０ｍｌを添加し、回転数１０００
ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、培地のｐＨ７.
６の培養条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、
培養物 ５００ｍｌを遠心分離にかけて培養菌体を回収
した。得られた菌体を脱塩蒸留水にて２回洗浄した後、
該菌体を０.１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６.８） ３〜５ｍ
ｌに懸濁し、これを超音波処理（３分間単位で３回、処
理温度−１０℃）して菌体を破砕した。菌体を破砕した
後、破砕液を４℃で２０分間、６,０００ｒｐｍの遠心
分離に供し、その上澄画分を分取した。得られた上澄
液、即ち菌体抽出液を粗酵素液としてジアミノピメリン
酸デカルボキシラーゼ活性の測定に供した。

【００４１】（Ｂ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラ
ーゼの酵素活性測定 リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.６）に上記（Ａ）で得
た粗酵素液を１０容量％の割合で、基質であるジアミノ
ピメリン酸を１ mg/ml の濃度で、それぞれ添加してジ
アミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性測定用反応液
（ｐＨ７.６）とした。この反応液を３３℃で３時間反
応させた後で液体クロマトグラフィーに供し、生成した
Ｌ−リジンの量を測定した。測定の結果、反応液中にお
けるＬ−リジン生成量は１５ nmol/min/mgであった。ま
た、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（FERM
BP-1497）を上記（Ａ）と同一条件にて培養して粗酵素
液を調製し、その粗酵素液を上記と同一条件にて基質と
反応させて、生成したＬ−リジンの量を測定した。測定
の結果、Ｌ−リジンの生成量は７ nmol/min/mg であっ
た。以上の結果から、本発明によるジアミノピメリン酸
デカルボキシラーゼをコードするコリネ型細菌に由来す
る遺伝子を含むＤＮＡ断片が導入されたプラスミドによ
り形質転換されたコリネ型細菌は、従来に比べて効率的
にＬ−リジンを生産し得ることが認められた。

【００４２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1335 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体 DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：MJ-233 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1-1335 特徴を決定した方法：E 配列 ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA CTT CCC GCA CAC GTG TGG CCC 48 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG 96 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC 144 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC 192 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA TCC AAA GCG TTC CTG ACC AAG 240 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCG 288 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 TCC ATC AAT GAA CTG GGC ATT GCC CTG GCT GCT GGT TTC CCC GCC AGC 336 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAG GGC GTG GAC TTC CTC CGC GCG 384 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Asp Phe Leu Arg Ala 115 120 125 TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA 432 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT GGT GAA GGC AAG ATC CAG GAC 480 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC 528 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC 576 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG 624 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC 672 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asn Ala 210 215 220 GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG 720 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC 768 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA 816 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA 864 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC 912 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC 960 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA 1008 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC 1056 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GTC GAA GGA GAA CCA GTA AAC ACC CGC 1104 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Val Glu Gly Glu Pro Val Asn Thr Arg 355 360 365 ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA 1152 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC 1200 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA 1248 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG 1296 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 CGA CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC TCA TTA GAG GCA 1335 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を含む大きさ約１.５ｋｂのＤＮ
Ａ断片の制限酵素による切断点地図である。

【図２】本発明のジアミノピメリン酸デカルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を含む大きさ約１.５ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列決定のための戦略図である。

【図３】本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｌｙｓＡの
制限酵素による切断点地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
   acterium flavum）由来のジアミノピメリン酸デカルボ
   キシラーゼ（EC 4.1.1.20）をコードする遺伝子を含む
   ＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 前記ブレビバクテリウム・フラバム（Br
   evibacterium flavum）がブレビバクテリウム・フラバム
   （Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３である請求項
   １に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 次のＤＮＡ塩基配列： ATGGCTACAG TTGAAAATTT CAATGAACTT CCCGCACACG TGTGGCCCCG CAATGCCGTG 60 CGCCAAGAAG ACGGCGTTGT CACCGTCGCT GGTGTGCCTC TGCCTGACCT CGCTGAAGAA 120 TACGGAACCC CACTGTTCGT AGTCGACGAG GACGATTTCC GTTCCCGCTG TCGCGACATG 180 GCTACCGCAT TCGGTGGACC AGGCAATGTG CACTACGCAT CCAAAGCGTT CCTGACCAAG 240 ACCATTGCAC GTTGGGTTGA TGAAGAGGGG CTGGCACTGG ACATTGCGTC CATCAATGAA 300 CTGGGCATTG CCCTGGCTGC TGGTTTCCCC GCCAGCCGTA TCACCGCGCA CGGCAACAAC 360 AAGGGCGTGG ACTTCCTCCG CGCGTTGGTT CAAAACGGTG TGGGACACGT GGTGCTGGAC 420 TCCGCACAGG AACTAGAACT GTTGGATTAC GTTGCCGCTG GTGAAGGCAA GATCCAGGAC 480 GTGTTGATCC GCGTAAAGCC AGGCATCGAA GCACACACCC ACGAGTTCAT CGCCACTAGC 540 CACGAAGACC AGAAGTTCGG ATTCTCCCTG GCATCCGGTT CCGCATTCGA AGCAGCAAAA 600 GCCGCCAACA ACGCAGAAAA CCTGAACCTG GTTGGCCTGC ACTGCCACGT TGGTTCCCAG 660 GTGTTCGACG CCGAAGGCTT CAAGCTGGCA GCAGAACGCG TGTTGGGCCT GTACTCACAG 720 ATCCACAGCG AACTGGGCGT TGCCCTTCCT GAACTGGATC TCGGTGGCGG ATACGGCATT 780 GCCTATACCG CAGCTGAAGA ACCACTCAAC GTCGCAGAAG TTGCCTCCGA CCTGCTCACC 840 GCAGTCGGAA AAATGGCAGC GGAACTAGGC ATCGACGCAC CAACCGTGCT TGTTGAGCCC 900 GGCCGCGCTA TCGCAGGCCC CTCCACCGTG ACCATCTACG AAGTCGGCAC CACCAAAGAC 960 GTCCACGTAG ACGACGACAA AACCCGCCGT TACATCGCCG TGGACGGAGG CATGTCCGAC 1020 AACATCCGCC CAGCACTCTA CGGCTCCGAA TACGACGCCC GCGTAGTATC CCGCTTCGTC 1080 GAAGGAGAAC CAGTAAACAC CCGCATCGTG GGCTCCCACT GCGAATCCGG CGATATCCTG 1140 ATCAACGATG AAATCTACCC ATCTGACATC ACCAGCGGCG ACTTCCTTGC ACTCGCAGCC 1200 ACCGGCGCAT ACTGCTACGC CATGAGCTCC CGCTACAACG CCTTCACACG GCCCGCCGTC 1260 GTGTCCGTCC GCGCTGGCAG CTCCCGCCTC ATGCTGCGAC GCGAAACGCT CGACGACATC 1320 CTCTCATTAG AGGCA 1335 で表されるジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（EC
   4.1.1.20）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 次のアミノ酸配列： Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Asp Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Val Glu Gly Glu Pro Val Asn Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445 で表されるジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（EC
   4.1.1.20）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかひとつに記載の
   ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかひとつに記載の
   ＤＮＡ断片と、コリネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺
   伝子を含むＤＮＡ断片を保有する組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項５〜６のいずれかひとつに記載の
   組換えプラスミドにより形質転換されたコリネ型細菌。