KR100268324B1 - L-리신의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균내에서, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하고, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 및 디아미노피멜산디하이드로게나제를 암호화하는 DNA를 순차 증강시킴에 의해, L-리신 생산 능력 및 생산 속도를 향상시키는 것에 관한 것이다.

Description

L-리신의 제조 방법
사료첨가물로서 사용되고 있는 L-리신은 통상, 코리네형 세균에 속하는 L-리신 생산 변이주를 이용하여 발효법에 의해 생산되고 있다. 현재 공지되어 있는 여러가지의 L-리신 생산균은 코리네형 세균에 속하는 야생균주의 인공 변이에 의해 만들어지고 있다.
한편, 코리네형 세균에 있어서, 균체내에서 자율증식 가능하고 또한, 약제내성 표지 유전자를 가지는 벡터 플라스미드(참조: 미국특허 제4514502호), 균체내로 유전자의 도입 방법(참조: 일본 특허공개 평2-207791호)이 개시되어 있고, 이들의 기술을 사용한 L-트레오닌 또는 L-이소루이신 생산균 육성의 가능성이 개시되어 있다(참조: 미국 특허 제4452890호 및 미국 특허 제4442208호). 또한, L-리신 생산균 육성에 관해서도, 벡터 플라스미드내로 L-리신 생합성에 관여하는 유전자를 도입하고, 균체내에서 이 유전자를 증폭시키는 기술이 공지되어 있다(일본 특허공개 소56-160997호).
L-리신 생합성용 유전자로서는, 예를들면, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(참조: 일본 특허공개 평 7-75578) 및 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(참조: Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)]와 같이, L-리신 생합성에 관여하는 유전자를 클로닝한 예나, 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(일본 특허공개 소 60-87788), 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자(일본 특허공고 평 6-55149), 디아미노피멜산 데카르복실라제 유전자(일본 특허공개 소 60-62994)와 같이, 유전자의 증폭이 L-리신 생산성에 영향을 주는 예가 공지되어 있다.
또한, L-리신 생합성에 관여하는 효소중, 야생형으로서 피이드 백 저해를 받는 효소에 대하여, 피이드 백 저해가 해제된 변이를 가지는 효소 유전자를 도입하여 L-리신 생산성을 향상시킨 예도 공지되어 있다. 이러한 유전자로서 구체적으로는,아스파르토키나제 유전자(WO94/25605 국제공개 팜플렛) 등이 공지되어 있다.
상기한 바와 같이, L-리신 생합성용 유전자의 증폭, 또는 변이 유전자의 도입에 의해서, 일정한 성과가 얻어지고 있다. 예를들면, 리신 및 트레오닌에 의한 협력 저해가 해제된 변이형 아스파르토키나제 유전자를 보유하는 코리네형 세균은, 현저한 량(약 25g/L)의 L-리신을 생산한다. 그러나, 해당 세균은 변이형 아스파르토키나제 유전자를 보유하지 않는 세균과 비교하여 생육 속도가 저하된다. 또한, 아스파르토키나제 변이 유전자외에, 디하이드로디피콜린산 신타제 유전자를 추가 도입함으로써 L-리신 생산성이 향상한다는 보고[참조: Applied and Environmental Microbiology 57(6), 1746-1752(1991)]도 있다. 그러나, 해당 세균의 생장 속도는 한층 더 저하한다.
한편, 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자에 관여하는, 이 유전자를 도입한 코리네형 세균의 디하이드로디피콜린산 리덕타제 활성이 상승된 것은 입증되어 있지만, L-리신 생산성에 있어서의 영향에 관하여는 보고되어 있지 않다(일본 특허공개 평 7-75578).
또한, 코리네형 세균에 있어서, L-리신 생합성용 유전자를 여러개 조합하여, 생장을 억제하지 않고서 L-리신 수율을 대폭적으로 개선시키는 성공한 예는 공지되어 있지 않은 것이 현 상황이다. 또한, L-리신 생합성용 유전자의 증강에 의해 생장의 개선이 도모된 예도 보고되어 있지 않다.
본 발명은 아미노산 등의 발효 생산에 사용되고 있는 코리네형 세균에 유전자 조작 방법을 사용하여 개량 변이을 행하여 수득한 해당 미생물을 배양함에 의한 L-리신의 제조 방법에 관한 것이다.
제1도는 변이형 lysC를 가지는 플라스미드 p399AK9B 및 p399AKYB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제2도는 dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pDPRB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제3도는 dapA 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pDPSB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제4도는 1ysA를 가지는 플라스미드 p299LYSA의 작제 공정을 도시한 것이다.
제5도는 1ysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pLYSAB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제6도는 ddh 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pPK4D의 작제 공정을 도시한 것이다.
제7도는 lysC, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pCRCAB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제8도는 변이형 lysC, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pCB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제9도는 dapA, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pAB의 구축의 과정의 과정을 도시한 것이다.
제10도는 ddh 및 lysA를 가지는 플라스미드 p399DL의 작제 공정을 도시한 것이다.
제11도는 ddh, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pDL의 작제 공정을 도시한 것이다.
제12도는 변이형 lysC, dapA, dapB 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pCAB의 작제 공정을 도시한 것이다.
제13도는 변이형 lysC, dapA, dapB, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pCABL의 작제 공정을 도시한 것이다.
제14도는 변이형 lysC, dapA, dapB, ddh, lysA 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pCABDL의 작제 공정을 도시한 것이다.
본 발명의 목적은, 코리네형 세균의 세포중의 L-리신 생합성의 중요한 효소인 아스파르토키나제(이하 「AK」라고도 하며, AK 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「lysC」라고도 한다), 디하이드로디피콜린산 리덕타제(이하-「DDPR」이라고도 하며 DDPR 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「dapB」라고도 한다), 디하이드로디피콜린산 신타제(이하, 「DDPS」로 약술하며, DDPS 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「dapA」라고도 한다), 디아미노피멜산 데카르복실라제(이하 「DDC」라고도 하며, DDC 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「lysA」라고도 한다), 및 디아미노피멜산 데하이드로게나제(이하, 「DDH」라고도 하며, DDH 단백질을 암호화하는 유전자를 이하 「ddh」라고도 한다)의 각각을 암호화하는 DNA 서열을 유전자 재료에 사용함으로써, 코리네형 세균의 L-리신 생산 능력 및 생장 속도를 개선하려고 하는 것이다.
미생물을 사용하여 목적하는 물질을 발효 생산하는 경우, 투입한 원료에 대한 목적물질의 수율과 더불어, 생산 속도는 극히 중요한 인자이고, 발효설비당 생산 속도를 증가시킴에 의해 목적 물질을 매우 저 비용으로 제조하는 것이 가능하다. 그 때문에, 발효 수율과 생산 속도를 양립시키는 것은 공업적으로 극히 중요하다. 본 발명은 코리네형 세균을 사용함으로써 L-리신은 발효 생산하는데 있어서, 상기와 같은 문제점의 해결방법을 제시하는 것이다.
본 발명의 요지는, 코리네형 세균에 있어서, 리신 및 트레오닌에 의한 협력저해가 해제된 변이형 AK(이하, 단지 「변이형 AK」라고도 한다)를 암호화하는 변이형 lysC(이하, 단지 「변이형 lysC」라고도 한다.)와 dapB를 조합시켜 증강함에 의해, lysC를 단독으로 증강한 경우와 비교하여, 생장이 개선되고, L-리신 생산 속도를 향상시킬 수 있는 것, 또한 dapA, lysA, ddh를 순차 증강시킴에 의해, 단계적으로 L-리신 생산 속도를 향상할 수 있는 것에 있다.
즉, 본 발명은 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA 서열, 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 코리네형 세균 세포내에서 자율증식 가능한재조합 DNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 각 DNA 서열에 추가하여 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열을 또한 포함하는 재조합 DNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 3종의 DNA 서열외에 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA를 제공한다. 또한 다시, 상기 4종의 DNA 서열외에 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열을 또한 포함하는 재조합 DNA를 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하고, 또한 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 또한, 본 발명은 이 코리네형 세균에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 그리고 또한, 이 코리네형 세균에 있어서, 상기의 3종의 DNA외에, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 코리네형 세균에 있어서, 상기의 4종의 DNA외에, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA가 증강된 코리네형 세균을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 코리네형 세균중 하나를 적합한 배지에서 배양하는 단계, 해당 배양물중에 L-리신이 생산 축적되도록 하는 단계 및 해당 배양물로부터 L-리신을 수집하는 단계를 포함하는 L-리신의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명에 있어서 코리네형 세균이란, 버지즈 매뉴얼 오브 디터미네이티브 박테리올로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 제8판 599페이지(1974)에 정의되어 있는 1군의 미생물이고, 비항산성, 포자 형성 능력을 가지지 않는 호기성의 그람 양성, 간균이며, 코리네박테리움속 세균, 및 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있지만, 현재 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 브레비박테리움속 세균, 또한 코리네박테리움속 세균과 매우 근연인 브레비박테리움속 세균을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1 본 발명에 사용되는 L-리신 생합성용 유전자의 제조
본 발명에 사용하는 L-리신 생합성용 유전자는, DNA 공여체인 세균으로부터 염색체 DNA를 제조하는 단계, 플라스미드 벡터 등을 사용하여 염색체 DNA 라이브러리를 작제하는 단계, 이 라이브러리로부터 원하는 유전자를 보유하는 균주를 선별하는 단계 및 선별된균주로부터 상기 유전자가 삽입된 재조합 DNA를 회수하는 단계에 의해 수득된다. 본 발명에 사용하는 L-리신 생합성용 유전자의 DNA 공여체로서는, 원하는 L-리신 생합성용 유전자가 코리네형 세균 세포속에서 작용하는 효소 단백질을 발현하는 것이면, 특히 제한되지 않으나, 코리네형 세균이 바람직하다.
코리네형 세균 유래의 lysC, dapA 및 dapB 유전자는, 어느것이나 서열이 공지되어 있기 때문에, 폴리머라제 쇄 반응법[PCR : polymerase chain reaction, method; White, T.J. et al ; Trends Genet. 5, 185(1989) 참조]에 의해서 증폭함에 의해 수득할 수 있다.
이하에, 본 발명에 사용하는 각 L-리신 생합성용 유전자를 수득하는 방법을 예시한다.
(1) 변이형 lysC의 수득
변이형 lysC를 포함하는 DNA 단편은 AK 활성에 있어 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 변이주로부터 제조할 수 있다(WO94/25605 국제공개 팜플렛). 이러한 변이주는, 예를들면, 코리네형 세균 야생주에, 통상의 변이 처리법, 즉 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이제 처리가 수행된 세포군중에서 기원할 수 있다. AK 활성의 측정은 문헌[참조 : Miyajima, R et al ; The Journal of Biochemistry(1968), 63(2), 139-148]에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 이러한 변이주로서, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 야생주인 ATCC 13869주[현재의 명칭은, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 변경되어 있다]로부터 변이 처리에 의해 유도된 L-리신 생산균 AJ3445(FERM P-1944)가 가장 바람직하다.
또한, 변이형 lysC는, 야생형 lysC를 포함하는 플라스미드 DNA를 실험관내에서 변이 처리함에 의하여도 수득된다. 또한, L-리신 및 L-트레오닌에 의해 AK의 상승적인 피이드 백 저해를 해제하는 변이가 구체적으로 공지되어 있기(WO94/25605 국제공개 팜플렛) 때문에, 이 정보에 기초하여 부위 특이적 돌연변이 유발 등에 의해, 야생형 lysC로부터 변이형 VsC를 제조하는 것도 가능하다.
lysC를 포함하는 단편은 예를들면, 사이토 및 미우라의 방법[참조: H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta, 72. 619(1963)] 등에 의해 염색체 DNA를 제조하는 단계 및 폴리머라제 쇄 반응법[PCR : White.T.J.et al. Trends Genet. 5, 185(1989) 참조]에 의해, lysC를 증폭시키는 단계에 의해 코리네형 세균으로부터 분리할 수 있다.
DNA 프라이머로서는, 예를들면, 코리네박테리움 글루타미쿰에 있어서 이미 공지되어 있는 서열[참조: Molecular Microbiology(1991), 5(5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317-324]를 기초로 하여, lysC를 암호화하는 약 1643bp의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록중 서열 1 및 서열 2에 나타내는 뉴클레오타이드서열을 가지는 23-머 및 21-머의 일본쇄 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성은 Applied Biosystems사제 DNA 합성기 모델 380B 및 포스포아미다이트법[참조: Tetrahedron Letters(1981), 22, 1859]을 사용하여 통상적인 방법에 일상법에 따라서 합성할 수 있다. PCR 반응은, 다까라슈조(주)제 DNA 터멀사이클러 모델(DNA Thermal Cycler Model) PJ2000 형 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여, 공급자에 의해 지정된 방법에 따라서 행할 수 있다.
PCR 법에 의해 증폭된 lysC을, 이. 콜라이(E. Coli) 및/또는 코리네형 세균의 세포내에서 자율증식 가능한 벡터 DNA에 연결하여 재조합 DNA를 제조하고, 이것을 이. 콜라이 세포에 도입하는 것이 바람직하며, 이는 이후 공정을 용이하게 한다. 이. 콜라이 세포내에서 자율증식 가능한 벡터로서는, 숙주의 세포내에서 자립복제 가능한 플라스미드 벡터가 바람직하고, 예를 들면 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010 등을 들 수 있다.
또한, 이들 벡터에 코리네형 세균내에서 플라스미드가 자율증식 가능하게 하는 능력을 가지는 DNA 단편을 삽입하면, 이 벡터를 이. 콜라이 및 코리네형 세균의 양쪽에서 자율증식 가능한 이른바 셔틀 벡터로서 사용할 수 있다.
이러한 셔틀 벡터로서는 다음을 들 수 있다. 또한, 각각의 벡터를 보유하는 미생물 및 국제 기탁 기관의 기탁 번호를 괄호내에 나타내었다.
pHC4 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)AJ12617(FERM BP-3532)
pAJ655 에 스케리키아 콜라이 AJ11882(FERM BP-136)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) SR8201(ATCC 39135)
SR8201(ATCC 39135)
pAJ1844 에스케리키아 콜라이 AJ11883(FERM BP-137)
코리네박테리움 글루타미쿰 SR8202(ATCC 39136)
pAJ611 에스케리키아 콜라이 AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148 코리네박테리움 글루타미쿰 SR8203(ATCC 39137)
pAJ440 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilus) AJ11901(FERM BP-140)
이들의 벡터는, 다음과 같은 기탁 미생물로부터 수득된다. 즉, 대수증식기에 수집된 세포를 라이소자임 및 SDS를 사용하여 용균하고 단계, 30000×g에서 원심분리하여 용균물로부터 수득된 상등액에 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하는 단계 및 이를 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 분별 정제하는 단계.
이. 콜라이에 플라스미드를 도입함으로써 형질전환시키기 위해서는 D. M. Morrison의 방법[참조: Methods in Enzymology, 68, 326, 1979]혹은 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol, Biol., 53, 159(1970)] 등을 행할 수 있다.
상기한 바와 같이 하여 AK 야생주로부터 lysC를 분리하는 경우 야생형 lysC가 수득되고, AK 변이주로부터 lysC를 분리하면 변이형 lysC가 수득된다.
야생형 lysC를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열의 일례를, 서열목록중 서열 3에 나타낸다. 이 뉴클레오타이드 서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 α 아단위의 아미노산 서열을 DNA 서열과 함께는 서열목록중 서열 4에, 아미노산 서열만은 서열 5에 나타낸다. 또한, DNA 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 야생형 AK 단백질의 β 아단위의 아미노산 서열을 DNA와 함께는 서열목록중 서열 6에, 아미노산 서열만은 서열 7에 나타낸다. 또한, 각 아단위 모두에서, 개시코돈으로 GTG가 사용되고 있고, 대응하는 아미노산을 메티오닌으로 표기하고 있지만, 이것은, 메티오닌, 발린, 또는 포르밀메티오닌을 나타내는 것이다.
본 발명에 사용된는 변이형 lysC로서는, L-리신 및 L-트레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해가 해제된 AK를 암호화하는 것이면 특히 제한되지 않으나, 야생형 AK의 아미노산 서열에 있어서, α 아단위으로서는 N 말단에서 279번째의 알라닌잔기가 알라닌 및 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로, β 아단위에서는 30번째의 알라닌 잔기가 알라닌 및 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화하는 변이를 들 수 있다. 여기에서, 야생형 AK의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 α 아단위에서 서열목록중 서열 5에 나타내는 아미노산 서열, β 아단위에로서 서열목록중 서열 7에 나타내는 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 상기의 알라닌 및 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로서 바람직한 것은, 트레오닌 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 페닐알라닌 잔기, 프롤린 잔기, 세린 잔기, 티로신 잔기 및 발린 잔기를 들 수 있다.
또한, 치환되는 아미노산 잔기에 상응하는 코돈은, 아미노산 잔기를 암호화하는 한 종류에 있어 제한되지 않는다. 또한, 균종이나 균주의 차이에 의해 유지되는 야생형 AK의 아미노산 서열은 약간 상이할 수 있다. 이러한 효소의 활성에 관여하지 않는 하나 이상의 위치에서 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입 등에 의한 변이를 가지는 AK도 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, AK 활성 및 L-리신과 L-트레오닌에 의한 상승적인 피이드 백 저해의 해제에 실질적으로 영향이 없는 한, 다른 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 혹은 삽입 등에 의한 변이를 가지는 AK도 사용될 수 있다.
브레비박테리움 락토퍼멘툼 야생형주인 AJ12036 (FERM BP-734)내에 변이형 lysC 플라스미드 p399AK93을 도입한 균주 AJ12691은, 1992년 4월 10일에 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라기켄 스쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-12918로서 기탁되고, 1995년 2월 10일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되고, FERM BP-4999의 수탁번호로 기탁되어 있다.
(2) dapB의 제조
dapB를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869 주를 들 수 있다.
DDPR를 암호화하는 DNA 서열은, 브레비박테리움 락토퍼멘툼에 있어서 이미 공지되어 있으며[참조: Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749(1993)], 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록중 서열 8 및 9에 기재된 뉴클레오타이드 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23머의 DNA를 예시할 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 dapB를 포함하는 플라스미드의 제조 등은 상기의 lysC인 경우와 같은 방법으로 수행할 수 있다.
dapB를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 10에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 11에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편이외에, 서열 11의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉, DDPR 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 마찬가지로 사용할 수 있다.
이.콜라이 JM109 주내로 하기 실시예에서 수득된 dapB를 포함하는 플라스미드 pCRDAPB를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13107주는, 1995년 5월 26일로부터 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5114의 수탁번호로, 부다페스트조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
(3) dapA의 제조
dapA를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균의 염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특별히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869주를 들 수 있다.
DDPS를 암호화하는 DNA 서열은, 코리네박테리움 글루타이쿰의 경우 이미 공지되어 있고[참조: Nucleic Acids Research 18(21), 6421(1990), EMBL 수탁번호 X53993), 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 12 및 13의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23머의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 dapA를 포함하는 플라스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 같은 방법으로 수행할 수 있다.
dapA를 포함하는 DNA 단편의 튜클레오타이드 서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열의 일례를 서열 14에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 15에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편이외에, 서열 15의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉 DDPS 활성에 실절적으로 영향이 없는 한, 하나이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 또한 사용할 수 있다.
이.콜라이 JM109 주내로 하기 실시예에서 수득된 dapA를 포함하는 플라스미드 pCRDAPA를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ106주는, 1995년 5월 26일부터 통상산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5113의 수탁번호로, 부다페스트 조약에 근거하여 국제기탁되어 있다.
(4) lysA의 제조
lysA를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균 염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869주를 들 수 있다.
코리네형 세균에 있어서, lysA는 argS(아르기닐-tRNA 신타제 유전자)와 함께 오페론을 형성하고 있고, argS의 하류방향에 lysA가 존재한다. lysA의 발현은 argS의 상부에 있는 프로모터에 의해서 조절된다[참조: Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362(1993)]. 이들의 유전자의 DNA 서열은, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 이미 공지되어 있고[참조: Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830(1990), Molecular and General Genetics 212, 112-119(1988)], 이것을 기초로 하여 PCR용 DNA 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서 구체적으로는, 서열목록의 서열 16[Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830(1990)에 기재되어 있는 뉴클레오타이드 서열에 있어서 뉴클레오타이드 번호 11 내지 33번에 상당한다] 및 서열 17[Molecular and General Genetics 212, 112-119(1988)에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 있어서 뉴클레오타이드 번호 1370 내지 1392에 상당한다]에 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23머의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응, 수득된 lysA를 포함하는 플라스미드의 제조 등은, 상기의 lysC인 경우와 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
하기 실시예에서는, lysA를 증강하기 위해서, 프로모터, argS 및 lysA를 포함하는 DNA 단편을 사용하였지만, argS는 본 발명에 필수적인 것이 아니며, lysA가 프로모터의 바로 하부에 연결된 DNA 단편을 이용하는 것도 가능하다.
argS 및 lysA를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열이 암호화하는 것으로 예상되는 아미노산 서열의 일례를 서열 18에 나타낸다. 또한, argS가 암호화하는 아미노산 서열의 일례를 서열 19에, lysA가 암호화하는 아미노산 서열의 일례를 서열 20에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편이외에, 서열 20의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉, DDC 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 동일하게사용할 수 있다.
(5) ddh의 제조
ddh를 포함하는 DNA 단편은, 코리네형 세균의 염색체로부터 PCR에 의해 제조할 수 있다. DNA 공여균으로서는 특히 제한되지 않지만, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869주를 들 수 있다.
DDH 유전자는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 이미 공지되어 있으며[참조: Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)], 이것을 기초로 하여 PCR용 프라이머를 제조할 수 있다. 이러한 DNA 프라이머로서는 구체적으로, 서열목록중의 서열 21 및 22에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 20머의 DNA를 들 수 있다. DNA의 합성, PCR 반응 및 수득된 ddh를 포함하는 플라스미드의 제조는, 상기의 lysC인 경우와 동일하게 수행할 수 있다.
ddh를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 23에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 24에 나타낸다. 본 발명에는, 이 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편이외에, 서열 24에 나타내는아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 즉 DDH 활성에 실질적으로 영향이 없는 한, 하나이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 등에 의한 변이를 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편도 동일하게 사용할 수 있다.
2 본 발명의 재조합 DNA 및 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제(변이형 AK)를 보존 유지하고, 또한 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA(dapB)가 증강된 것이다. 바람직한 양태로써, 본 발명의 코리네형 세균은 또한, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA(dapA)가 증강된 코리네형 세균이다. 더욱 바람직한 양태로써, 본 발명의 코리네형 세균은, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA(lysA)가 추가로 증강된 코리네형 세균이다. 더욱 바람직한 양태로써, 본 발명의 코리네형 세균은 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA(ddh)가 추가로 증강된 코리네형 세균이다.
본원에서 DNA를 「증강」한다라는 것은, 유전자의 카피수를 증가시키는 방법, 강력한 프로모터를 사용하는 방법, 특이활성이 높은 효소를 암호화하는 유전자를 사용하는 방법 또는 이들을 조합시키는 방법으로, 이 DNA에 의해 암호화된 효소의 세포내 활성을 사용시키는 것을 말한다.
변이형 AK을 유지하는 코리네형 세균은 돌연변이에 의해서 변이형 아스파르토키나제를 생산하도록 되어진 세균 또는, 변이형 lysC를 도입함으로써 형질전환된 세균일 수 있다.
상기 DNA를 도입하기 위해 사용된 코리네형 세균의 예로서는, 예를 들면 다음과 같은 L-리신 생산성 야생주를 들 수 있다.
코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870
(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806
(Corynebactrium acetoglutamicum)
코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991
(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032
브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020
(Brevibacterium divanicatum)
브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869
코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990
(Corynebacterium lilium)
브레비박테리움 프라붐 ATCC 14067
(Brevibacterium flavum)
코리네박테리움 멜라세코라 ATCC 17965
(Corynebacterium melassecola)
브레비박테리움 사카롤리티쿰 ATCC 14066
(Brevobacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 임마리오필 ATCC 14068
(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 로제움 ATCC 13825
(Brevibacterium rpseum)
브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240
(Brevibacterium thiogenitalis)
마이크로박테리움 암모니아필탈 룸 ATCC 15354
(Microbacterium ammoniaphilym)
코리네박테리움 터모아미노게네스 AJ12340(FERM BP-1539)
(Corynebacterium thermoaminaganes)
또한, 상기 균주 이외에도, 이들의 균주로부터 유도된 L-리신 생산능력을 가지는 변이주 등도 숙주로서 이용할 수 있다. 이러한 인공변이주로서는 다음과 같은 것이 있다. S-(2-아미노에틸)-시스테인(이하, 「AEC」라고 약술한다) 내성 변이주(예를들면, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11082(NRRL B-11470), 일본 특허공보 소 56-1914, 일본 특허공보 소 56-1915, 일본 특허공보 소 57-14157, 일본 특허공보 소 57-14158, 일본 특허공보 소 57-30474, 일본 특허공보 소 58-10075, 일본 특허공보 소 59-4993, 일본 특허공보 소 61-35840, 일본 특허공보 소 62-24074, 일본 특허공보 소62-36673, 일본 특허공보 평 5-11958, 일본 특허공보 평 7-112437, 일본 특허공보 평 7-112438 참조), 성장에 L-호모세린과 같은 아미노산을 필요로 하는 변이주(참조: 일본 특허공보 소 48-28078 및 일본 특허공보 소 56-6499), AEC에 대해 내성을 나타내고, L-루이신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌 및 L-발린과 같은 아미노산을 요구하는 변이주(참조: 미국 특허 제3,708,395호 및 제3,825,472호), DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파라긴산-동족체, 설파제, 퀴노이드 및 N-라우로일루이신에 대해 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주, 옥시알로 아세트산 데카복실라제 또는 호흡계 효소 저해제에 대해 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주(참조: 일본 특허공개 소 50-53588, 일본 특허공개 소 50-31093, 일본 특허공개 소 52-102498, 일본 특허공개 소 53-9394, 일본 특허공개 소 53-86089, 일본 특허공개 소 55-9783, 일본 특허공개 소 55-9759, 일본 특허공개 소 56-32995, 일본 특허공개 소 56-39778, 일본 특허공보 소 53-43591, 일본 특허공보 소 53-1833), 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-리신 생산 변이주(참조: 일본 특허공개 소 55-9784, 일본 특허공개 소 56-8692), 플루오르피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 대하여 감수성을 나타내는 L-리신 생산 변이주(참조: 일본 특허공개 소 55-9783 및 일본 특허공개 소 53-86090), 에틸렌 글리콜에 대해 내성을 나타내고, L-리신을 생산하는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 생산 변이주(미국 특허 제4,411,997호).
상기한 바와 같은 숙주에 있어서 L-리신 생합성용 유전자를 증강하기 위해서는, 구체적인 예로서, 이들의 유전자를 플라스미드 벡터, 트랜스포존(thansposon), 파아지 벡터 등을 사용하여 숙주에 도입한다. 도입시 저카피형의 벡터를 사용하여도 어느 정도의 증강은 기대할 수 있지만, 다중 카피형의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 벡터로서, 예를 들면 상기 pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 및 pAJ440 등의 플라스미드 벡터가 포함된다. 또한, 코리네형 세균 유래의 트랜스포존은, WO O2/02627 국제공개 팜플렛, WO93/18151 국제공개 팜플렛, 유럽 특허 공보 제445385호, 일본 특허공개 재(평) 6-46867호, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581(1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6(1995), 일본 특허공개 제(평) 7-107976호, 일본 특허공개 제(평) 7-327680호 등에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 변이형 lysC는 반드시 증강되어 있을 필요는 없으며, 상기한 바와같이 염색체 DNA 상의 lysC에 변이를 가지는 것 또는 변이형 lysC가 염색체 DNA에 도입된 것도 사용가능하며, 또한 플라스미드 벡터를 사용하여 변이형 lysc를 도입시킬 수도 있다. 한편, dapA, dapB, lysA 및 ddh는, L-리신을 효율적으로 생산시키기 위하여 증강되어 있는 것이 바람직하다.
lysC, dapA, dapB, lysA 및 ddh의 각 유전자는 각각 상이한 벡터를 사용하여 숙주내로 순차 도입시킬수 있으며, 또한 단일의 벡터를 사용하여 2종류, 3종류, 4종류, 또는 5종류의 유전자를 동시에 도입시킬 수도 있다. 상이한 벡터를 사용하는 경우에는, 유전자는 어떠한 순서로도 도입될 수 있으나, 숙주내에서의 안정한 유지 메카니즘을 지니며, 상호 공존 가능한 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
변이형 AK를 유지하고, 또한 dapB가 증강된 코리네형 세균은, 예를 들면, 변이형 lysC 및 dapB를 포함하며, 코리네형 세균 세포내에서 자율 증식가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써, 수득된다.
또한, 변이형 lysC 및 dapB외에 dapA가 증강된 코리네형 세균은 예를 들면, 변이형 lysC, dapB 및 dapA를포함하고, 코리네형 세균의 세포내에서 자율 증식가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
또한, 변이형 lysC, dapB 및 dapA외에, lysA가 증강된 코리네형 세균은 예를 들면, 변이형 lysC, dapB,dapA 및 lysA를 포함하며, 코리네형 세균의 세포내에서 자율 증식가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
또한, 변이형 lysC, dapB, dapA 및 lysA외에 ddh가 증강된 코리네형 세균은 예를 들면, 변이형 lysC, dapB, dapA, lysA 및 ddh를 포함하며, 코리네형 세균 세포내에서 자율 증식가능한 재조합 DNA를 숙주 코리네형 세균에 도입함으로써 수득된다.
상기한 바와 같이 재조합 DNA는, 예를 들면, 플라스미드 벡터, 트랜스포존 및 파아지 벡터와 같은 벡터에, L-리신 생합성용 유전자 각각을 삽입함으로써 수득될 수 있다.
플라스미드가 벡터로서 사용되는 경우, 숙주내로의 재조합 DNA의 도입 방법은, 전기펄스법(참조: Sygimoto 등 일본 특허공개 평 2-207791)에 의해서 수행할 수 있다. 트랜스포존을 사용한 유전자의 증폭은, 플라스미드에 트랜스포존을 탑재시켜 세포내에 도입하고, 트랜스포존의 전위를 유도함에 의해 행할 수 있다.
3 L-리신의 제조 방법
상기한 바와 같이 L-리신 생합성용 유전자가 증강된 코리네형 세균을 적합한 배지로 배양하는 단계, 해당 세균의 배양물중에 L-리신을 생산 축적시키는 단계 및 해당 배양물로부터 L-리신을 수집하는 단계에 의해 L-리신을 효율적으로 제조할 수 있다.
사용하는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기 이온 그 밖의 유기성분을 함유하는 통상의 배지를 들 수 있다.
탄소원으로서는, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 당밀 및 전분의 가수분해물과 같은 당류, 푸마르산, 시트로산, 석산산과 같은 유기산류를 사용할 수 있다.
질소원으로서는, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄과 같은 무기 암모늄염, 대두 가수분해물 등의 유기질소, 암모니아 가스 및 암모니아수 등을 사용할 수 있다.
유기 미량 영양원으로서는, 비타민 B1 및 L-호모세린과 같은 요구물질 또는 효모엑기스 등을 적량 함유시키는 것이 바람직하다. 이들 이외에, 필요에 따라, 인산 칼륨, 황산 마그네슘, 철, 이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다.
배양은 호기적 조건하에서 30 내지 90시간 수행하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 25℃ 내지 37℃로, 배양중 pH는 5 내지 8로 조절하는 것이 바람직하다. 또한, pH 조정에는 무기 혹은 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또는 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. L-리신은 통상의 이온교환 수지법, 침전법 및 다른 공지의 방법을 조합시킴에 의해 배양물로부터 수집할 수 있다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
브레비박테리움 락토퍼멘툼으로부터 야생형 lysC 유전자 및 변이형 lysC 유전자의 제조
1 야생형 및 변이형 lysC의 제조, 및 이를 포함하는 플라스미드의 제조
브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869주, 및 ATCC 13869주에서 변이 처리에 의해 수득된 L-리신 생산성 변이주 AJ3445(FERM P-1944)를 염색체 DNA의 공여체로서 사용한다. AJ3445주는 변이에 의해 리신 및 트레오닌에 의한 협력 저해가 실질적으로 해제되도록 lyscC가 변화되어 있다[참조: Journal of Biochemistry 68, 701-710(1970)].
염색체 DNA로부터 PCR법[참조: White, T. J. et al ; Trends Genet. 5, 185(1989)]에 의해 lysC를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머를 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이미 공지되어있는 서열[참조: Molecular Microbiology(1991), 5(5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet.(1990) 224, 317-324]를 기초로 하여 lysC를 암호화하는 약 1643bp의 영역을 증폭하기 위하여, 서열 1 및 서열 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 23머 및 21머의 일본쇄 DNA를 합성한다. DNA의 합성은 Applied Biosystems 사제 DNA 합성기 model 380B 및 포스포아미다이트법[참조: Tetrahedron Letters(1981), 22, 1859]을 사용하여 통상적인 방법에 따라서 합성한다.
다까라슈조(주) 제조의 DNA 터멀 사이클러 모티노(Thermal Cycler Model) PJ2000형 및 TaqDNA 폴리머라제를 사용하여, 공급자에 의해 지정된 방법에 따라 PCR로 유전자를 증폭시킨다. 증폭된 1643kb의 유전자 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인한 후, 겔에서 잘라낸 해당 단편을 통상적인 방법에 의해 정제하고, 제한효소 NruI(다까라슈조(주) 제) 및 EcoRI(다까라슈조(주) 제)로써 분해한다.
유전자 단편용 클론화 벡터로서 pHSG399[참조: Takeshita, S et al ; Gene(1987), 61, 63-74]를 사용한다. pHSG399를 제한효소 Smal(다까라슈조(주) 제) 및 제한효소 EcoRI으로 분해하고, 증폭된 lysC 단편과 연줄시킨다. DNA는 DNA 연결 키트(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로 연결시킨다. 이렇게 하여 pHSG399와 브레비박테리움 락토퍼멘툼 염색체로부터 증폭된 lysC 단편이 연결된 플라스미드를 제조한다. 야생주인 ATCC 13869 주 유래의 lysC를 가지는 플라스미드를 P399AKY, L-리신 생산균인 AJ3463 유래의 lysC를 가지는 플라스미드를 p399AK9라 지정한다.
p399AKY 및 p399AK9 각각에, 각각 코리네박테리움속에 속하는 세균내에서 플라스미드를 자율증식 가능하게 하는 능력을 갖는 DNA 단편(이하 「Brevi.-ori」라고 기재한다)을 도입하고, 코리네박테리움속에 속하는 세균내에서 자율증식 가능한 lysC를 탑재한 플라스미드를 제조한다. brevi.-ori는, 이것을 포함하며, 이.콜라이와, 코리네박테리움속에 속하는 세균 모두내에서 자율 증식가능한 플라스미드 벡터 pHX4로부터 제조한다. pHK4는, pHC4를 KpnI(다까라슈조(주) 제) 및 BamHI(다까라슈조(주) 제)으로 분해하고, Brevi.-ori 단편을 추출하고, 또한 KpnI 및 BamHI으로 분해한 pHSG298에 연결시킴으로써 작제된다(참조: 일본 특허공개 평 5-7491). pHK4는 숙주에 가나마이신 내성을 부여한다. 또한, pHK4를 유지하는 이.콜라이를 이.콜라이 AJ13136으로 지정하고, 1995년 8월 1일 통상산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5186으로서 기탁한다.
pHK4를, 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 분해하고, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로 형성시킨다. 평활말단이 형성된 후, 인산화된 BamHI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결시켜, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 BamHI 하나만에 의한 분해도 제거되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 BamHI으로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 BamHI로 분해한 p399AKY 및 p399AK9와 연결시켜 코리네박테리움속에 속하는 세균내에서 자율증식 가능하고 또한 lysC 유전자를 포함하는 플라스미드를 제작하였다.
p399 AKY 기원의 야생형 lysC 유전자를 포함하는 플라스미드를 p399AKYB라 지정하고, p399AK9 기원의 변이형 lysC 유전자를 포함하는 플라스미드를 p399AK9B라 지정한다. p399AK9B 및 p399AKYB의 작제 공정을 도 1에 나타낸다. 브레비박테리움 락토퍼멘툼 야생주인 AJ12036주(FERM BP-734)내로 변이형 lysC 플라스미드 p399AK9B를 도입하여 수득한 균주 AJ12691은, 1992년 4월 10일에 통상 산업성 공업 기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-12918로서 기탁되고, 1995년 2월 10일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁에 이관되어, FERM BP-4999의 수탁번호로 기탁되어 있다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 야생형 lysC 및 변이형 lysC의 뉴클레오타이드 서열의 결정
야생형 lysC를 포함하는 플라스미드 p399AKY 및 변이형 lysC를 포함하는 플라스미드 p399AK9를 각각의 형질전환체로부터 제조하여, 야생형 및 변이형 lysC의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 뉴클레오타이드 서열의 결정은 생거의 방법[참조: F.Sanger et al., :Proc. Natl. Acad. Sci. 74. 5463(1977)]에 따라 수행한다.
p399AKY에 암호화되어 있는 야생형 lysC의 뉴클레오타이드 서열을 서열목록의 서열 3에 나타낸다. 한편, p399AK9에 암호화되어 있는 변이형 lysC의 뉴클레오타이드 서열은 야생형 lysC와 비교하여, 서열 3에 있어서 1051번째의 G가 A로 변화된 1개의 뉴클레오타이드 변이만을 가지고 있었다. 코르네박테리움 글루타미쿰의 lysC는, 동일한 DNA 쇄에 α, β의 2개의 아단위가 동일의 판독 프레임으로 암호화되어 있는 것이 공지되어 있지만[참조: Kalinowski, J et al., Molecular Microbiology(1991) 5(5), 1197-1204] 상동성으로부터 판단하여 본 유전자도 동일한 DNA 쇄에 α, β의 2개의 아단위가 동일한 판독프레임으로 암호화되어 있는 것으로 고려된다.
DNA 뉴클레오타이드 서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 α 아단위의 아미노산 서열을 DNA 서열과 함께 서열목록의 서열 4에, 아미노산 서열만을 서열 5에 나타낸다. 또한, DNA의 뉴클레오타이드 서열에서 추정되는 야생형 AK 단백질의 β 아단위의 아미노산 서열을 DNA와 함께 서열목록의 서열 6에, 아미노산 서열만을 서열 7에 나타낸다. 또한, 각 아단위의 경우, 개시코돈으로서 GTG가 사용되고 있고, 상응하는 아미노산을 메티오닌으로 표기하고 있으나, 이것은 메티오닌, 발린 또는 포르밀 메티오닌을 나타내는 것이다.
한편, 변이형 lysC 서열상의 변이는, 야생형 AK 단백질의 아미노산 서열(서열 5 및 서열 7)에 있어서, α 아단위의 279번째 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로, β 아단위의 30번째 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로 아미노산 잔기가 치환된 것을 의미한다.
[실시예 2] 브레비박테리움 락토퍼멘툼으로부터 dapB의 제조
1 dapB의 제조 및 이를 함유하는 플라스미드의 제조
브레비박테리움 락토퍼멘툼 야생주 ATCC 13869 주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용한다. ATCC 13869주로부터 통상적인 방법에 따라서, 염색체 DNA를 제조한다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 dapB를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭에 사용된 DNA 프라이머는 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 경우 이미 공지되어 있는 서열[참조: Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749(1993)]를 기초로 하여 DDPR을 암호화하는 약 2.0kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록중의 서열 8 및 9에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23머의 DNA 단편을 합성한다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행한다. 증폭된 2001bp의 유전자 단편용 클로닝 벡터로서 pCR-Script(Invitrogen사 제)를 사용하여, 증폭된 dapB 단편과 연결시킨다. 이렇게 하여 pCR-Script에 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 염색체로부터 증폭된 2001bp의 dapB 단편이 연결된 플라스미드를 작제한다. 이렇게 하여 수득된 ATCC 13869로부터 기원한 dapB를 가지는 플라스미드를 pCRDAPB로 명명한다. 이.콜라이 JM109주내로 pCRDAPB를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13107주는, 1995년 5월 26일부터 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5114의 수탁번호로, 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다.
또한, pCRDAPB를 EcoRV와 SphI로 분해함으로써 DDPR의 구조 유전자를 포함하는 1101bp의 단편을 추출한다. 이 단편을, HincII 및 SphI로 분해된 PHSG 399와 연결시켜 플라스미드를 제조한다. 이렇게 제조한 플라스미드를 p399DPR이라 명명하였다.
제조한 p399DPR에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균내에서 자율증식 가능한 dapB를 탑재한 플라스미드를 작제한다. pHK4를 제한효소 KpnI(다까라슈조(주)제)로써 분쇄하고, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 형성시킨다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화 된 BamHI 링커(다까라슈조(주)제)를 연결시켜, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 BamHI 하나만에 의한 분해에 의해서 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 BamHI으로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 BamHI으로 분해시킨 p399DPR과 연결하여, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 dapB를 포함하는 플라스미드를 제조한다. 제조한 플라스미드를 pDPRB로 지명한다. pDPRB의 공정을 도 2에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘툼 dapB의 뉴클레오타이드 서열의 결정
p399DPR를 유지하는 AJ13107주로부터 플라스미드 DNA를 제조하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정한 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 10에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 11에 나타낸다.
[실시예 3] 브레비박테리움 락토퍼멘툼 dapA의 제조
1 dapA의 제조 및 이를 함유하는 플라스미드의 작제
브레비박테리움 락토퍼멘툼의 야생주 ATCC 13869주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용한다. ATCC 13869주로부터 통상적인 방법에 따라서, 염색체 DNA를 제조한다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 dapA를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 증폭에 사용된 DNA 프라이머를 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 이미 공지되어 있는 서열[참조: Nucleic Acids Research 18(21), 6421(1990), EMBL 수탁번호 X53993 호)를 기초로 하여 DDPS를 암호화하는 약 1.5kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록중 서열 12 및 서열 13에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23머의 DNA를 합성한다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예1과 동일한 방법으로 수행한다. 증폭된 1411bp의 유전자 단편용 클론닝 벡터로서 pCR1000[참조: Invitrogen사 제 ; Bio/Technology 9, 657-663(1991)]를 사용하여, 증폭된 dapA 단편과 연결시킨다. DNA의 연결은 DNA 라이게이션 키트(다까라슈조(주)제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 수행한다. 이렇게 하여 pCR1000에 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 염색체로부터 증폭된 1611bp의 dapA 단편이 연결된 플라스미드를 작제한다. 이렇게 하여 수득한 ATCC 13869 기원의 dapA를 가지는 플라스미드를 pCRDAPA라 지명한다.
이.콜라이 JM109주내로 pCRDAPA를 도입하여 수득된 형질전환주 AJ13106주는, 1995년 5월 26일로부터 통상 산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소(우편번호 305 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고)에 수탁번호 FERM BP-5113의 수탁번호로 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다.
제조한 pCRDAPA에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균내에서 자율증식 가능한 dapA를 탑재한 플라스미드를 작작하였다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI(다까라슈조(주) 제)로써 분해하여, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로 형성시킨다. 평활말단이 형성된 후, 인산화된 SmaI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편을 SmaI 하나에만 의한 분해에 의해서 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 SmaI에 의해 분해하여, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 SmaI으로써 분해한 pCRDAPA와 연결시켜, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 dapA를 포함하는 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드를 pDPSB라 지명한다. pDPSB(KMr)의 작제 공정을 도 3에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘툼 dapA의 뉴클레오타이드 서열의 결정
pCRDAPA를 유지하는 AJ13106주로부터 플라스미드 DNA를 제조하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정한 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열로부터 예상되는 아미노산 서열을 서열 14에 나타낸다. 또한, 아미노산 서열만을 서열 15에 나타낸다.
[실시예 4] 브레비박테리움 락토퍼멘툼 lysA의 제조
1 lyaA의 제조 및 이를 함유하는 플라스미드의 작제
브레비박테리움 락토퍼멘툼 야생주 ATCC 13869주를 염색체 DNA의 공여체로서 사용한다. ATCC 13869주로부터 통상적인 방법에 따라서, 염색체 DNA를 제조하였다. 염색체 DNA로부터 PCR에 의해, argS, dapA 및 이들을 포함하는 오페론의 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용한 DNA 프라이머를 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 이미 공지되어 있는 서열[참조: Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830(1990), MOlecular and General Genetics 212, 112-119(1988) 참조)를 기초로하여 아르기닌-tRNA 신타제 및 DDC를 암호화하는 약 3.6kb의 영역을 증폭하기 위하여, 서열목록중의 서열 16 및 17에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 각각 23-머의 합성 DNA를 사용하였다. DNA의 합성 및 PCR 반응은, 실시예 1와 동일한 방법으로 수행한다. 증폭된 3579bp의 유전자 단편용 클론닝 벡터로서 pHSG399을 사용한다. pHSG399를 제한효소 SmaI(다까라슈조(주) 제)으로써 분해하고, 증폭된 lysA를 포함하는 DNA 단편과 연결시킨다. 이렇게 하여 수득한 ATCC 13869 기원의 lysA를 가지는 플라스미드를 p99LYSA라 명명한다.
또한, p399LYSA를 KpnI(다까라슈조(주) 제)와 BamHI(다까라슈조(주) 제)로 분해함에 의해, lysA를 포함하는 DNA 단편을 추출한다. 이 DNA 단편을, KpnI과 BamHI으로 분해한 PHSG299와 연결한다. 수득된 플라스미드를 p299LYSA라 명명한다. p299LYSA 작제 과정을 도 4에 나타낸다.
수득된 p299LYSA에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균내에서 자율증식 가능한 lysA를 탑재한 플라스미드를 작제한다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 분해하여, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 형성시킨다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화 된 KpnI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 KpnI 하나에만 의한 분해에 의해서 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 KpnI에 의해 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 KpnI으로 절단한 p299LYSA에 연결시켜, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 lysA를 포함하는 플라스미드를 작제한다. 작제한 플라스미드를 pLYSAB라 지명한다. pLYSAB의 작제 공정을 도 5에 나타낸다.
2 브레비박테리움 락토퍼멘툼으로부터 lysA의 뉴클레오타이드 서열의 결정
p299LYSA의 플라스미드 DNA를 제조하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정한 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열이 암호화한다고 예상되는 아미노산 서열을 서열 18에 나타낸다. 또한, 뉴클레오타이드 서열중, argS가 암호화하는 아미노산 서열 및 lysA가 암호화하는 아미노산 서열을, 각각 서열 19 및 20에 나타낸다.
[실시예 5] 브레비박테리움 락토퍼멘툼으로부터 ddh의 제조
ddh 유전자는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 ddh 유전자의 이미 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열[참조: Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)]을 바탕으로 제조한 2종의 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열 21 및 서열 22)를 사용한 PCR법에 의해, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC 13869의 염색체 DNA에서 ddh 유전자를 증폭시켜 수득한다. 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoT22I와 AvaI으로 절단하고, 말단을 평활화한 후, pMW119의 SmaI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pDDH를 수득한다.
다음에, pDDH를 SalI과 EcoRI으로 분해하여, 평활말단화한 후, 수득된 단편을 SmaI으로 분해한 PUC18과 연결한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pUC18DDH라 지명한다.
pUC18DDH에 Brevi.-ori를 도입하여, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능한 ddh를 탑재한 플라스미드를 작제한다. pHK4를 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 분해하여, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로 행한다. 평활말단화한 후, 인산화된 PstI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결하여, pHSG299의 PstI 부위에 삽입한다. 이렇게하여 작제한 플라스미드를 pPK4라 지명한다. 다음에, pUC18DDH를 XbaI와 KpnI로 분해하고, 생성된 ddh 단편을 KpnI와 XbaI로 분해한 pPK4에 연결시킨다. 이렇게하여, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고, ddh를 포함하는 플라스미드를 작제하여, 이 플라스미드를 pPK4D라 지명한다. pPK4D의 작제 공정은 도 6에 나타낸다.
[실시예 6] 변이형 lysC 및 dapA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
dapA를 가지는 플라스미드 pCRDAPA와 변이형 lysC 및 Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 p399AK9B로부터, 변이형 lysC, dapA 및 코리네형 세균의 복제 오리진을 가지는 플라스미드를 작제한다. p399AK9B를 SalI으로 완전 분해한 후, 평활말단화하여, 여기에, EcoRI 링커를 연결함으로써 SalI 부위가 EcoRI 부위로 변형된 플라스미드를 작제한다. 수득된 플라스미드를 p399AK9BSE라 명명한다. p399AK9BSE를 EcoRI으로 부분 분해함으로써 변이형 lysC과 Brevi.-ori를 하나의 단편으로 절단한다. 이 단편을 EcoRI으로 분해된 PCRDAOA와 연결한다. 수득된 플라스미드를 pCRCAB라 지명한다. 이 플라스미드는 이.콜라이와 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고, 또한 숙주에서 가나마이신 내성을 부여하며, 변이형 lysC과 dapA를 모두 갖고 있는 플라스미드이다. pCRCAB의 작제과정을 도 7에 나타낸다.
[실시예 7] 변이형 lysC 및 dapB를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
변이형 lysC를 가지는 플라스미드 p399AK9와 dapB를 가지는 플라스미드 p399DPR로부터, 변이형 lysC 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 작제한다. p399DPR를 EcoRV와 SphI으로 분해함에 의해, DDPR의 구조 유전자를 포함하는 1101bp의 단편을 추출한다. 이 단편을, SalI으로 분해된 후 평활말단화되고, 추가로 SphI으로 분해된 p399ak9와 연결하여, 변이형 lysC과 dapB를 모두 가지는 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드를 p399AKDDPR이라 지명한다.
다음에, 수득된 p399AKDPR에 Brevi.-ori를 도입한다. Brevi.-ori를 포함하는 플라스미드 pHK4를 제한효소 KpnI(다까라슈조(주) 제)로써 분해하고, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여,지정된 방법으로 수행한다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화된 BamHI 링커(다까라슈조(주) 제)와 연결하여, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 BamHI 하나에만 의해 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 BamHI으로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 BamHI으로 분해한 p399ADDPR에 연결시켜, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하게 또한 변이형 lysC 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 작제하며 이를 pCB이라 지명한다. pCB의 작제 공정을 도 8에 나타낸다.
[실시예 8] dapA 및 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드의 작제
dapA를 가지는 플라스미드 pCRDAPA를 KpnI 및 EcoRI으로 분해하고, dapA를 포함하는 DNA 단편을 추출하고, 이를 벡터 플라스미드 KpnI 및 EcoRI으로 분해한 PHSG399와 연결한다. 수득된 플라스미드를 p399DPS라 지명한다.
한편, dapB를 가지는 플라스미드 pCRDAPB를 SacII 및 EcoRI으로 분해하여, DDPR를 암호화하는 영역을 포함하는 2.0kb의 DNA 단편을 추출하고, 이를 SacII 및 EcoRI으로 분해한 p399DPS와 연결시켜, dapA와 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드를 분해한다. 수득된 플라스미드를 p399AB라 지명한다.
다음에, p399AB에 Brevi.-ori를 도입한다. Brevi.-ori를 포함하는 pHK4를 제한효소 BamHI(다까라슈조(주) 제)로써 분해하고, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로써 형성시킨다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화된 KpnI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결시켜, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 KpnI 하나에 의한 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 KpnI으로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 KpnI으로 분해한 p399AB에 연결시켜, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 dapA 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 작제하여, pAB라 명명한다. pAB의 작제 공정을 도 9에 나타낸다.
[실시예 9] ddh 및 lysA를 겸하여 가지는 플라스미드의 작제
ddh를 가지는 플라스미드를 pUC18DDH를 EcoRI 및 XbaI로서 분해하고, ddh를 포함하는 DNA 단편을 추출한다. 이 ddh 단편을, BamHI 및 Xbal로써 분해한 후, 절단면을 평활말단화시킨 lysA를 가지는 플라스미드 P399CYSA와 연결시킨다. 플라스미드 P399lysa와 연결시킨다. 수득된 플라스미드를 p399DL로 지명한다. p399DL 구축 작제공정을 도 10에 나타낸다.
다음에, p399DL에 Brevi.-ori를 도입한다. pHK4를 Xbal 및 BamHI으로 분해하여, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화된 XbaI 링커를 연결하여, pH4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 XbaI 하나에 의한 분해에 의해서 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 Xbal로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 XbaI로 분해한 p399DL와 연결시켜 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 ddh 및 lysA를 포함하는 플라스미드를 작제하고, 이를 pDL로 지명한다. pDL의 작제 공정을 도 11에 나타낸다.
[실시예 10] 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 겸하여 가지는 플라스미드의 작제
p399DPS를 EcoRI 및 SphI으로 분해하여, 평활말단화한 후, dapA 유전자 단편을 추출한다. 이 단편을, SalI로 분해하고 평활말단화한 p399AK9와 연결시켜 돌연변이체 lysC과 dapA가 공존하는 플라스미드 p399CA를 작제한다.
dapB를 가지는 플라스미드 pCRDAPB를 EcoRl으로 분해하고 평활말단화한 후, SacI으로 분해하여 dapB를 포함하는 2.0kb의 DNA 단편을 추출한다. dapA 및 변이형 lysC를 가지는 플라스미드 p399CA를 SpeI로써 분해하여 평활말단화한 후, SacI으로분해하고, 추출한 dapB 단편과 연결시켜, 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 포함하는 플라스미드를 수득한다. 이 플라스미드를 p399CAB라 지명한다.
다음에, p399CAB에 Brevi.-ori를 도입시킨다. Brevi.-ori를 가지는 플라스미드 pHX4를 제한효소 BamHI(다까라슈조(주) 제)으로서 분해하고, 절단면을 평활말단화한다. 평활말단은 DNA Blunting kit(다까라슈조(주) 제)를 사용하여, 지정된 방법으로 형성시킨다. 평활말단을 형성시킨 후, 인산화된 KpnI 링커(다까라슈조(주) 제)를 연결시켜, pHK4로부터 Brevi.-ori 부분에 상응하는 DNA 단편이 KpnI 하나에 의한 분해에 의해서 절단되도록 변형시킨다. 이 플라스미드를 KpnI으로 분해하고, 생성된 Brevi.-ori DNA 단편을 또한 KpnI으로 분해된 p399CAB와 연결시켜 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하여, 이를 pCAB라 명명한다. pCAB의 작제 공정을 도 12에 나타낸다.
[실시예 11] 변이형 lysC, dapA, dapB 및 lsyA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
lysA를 가지는 플라스미드 p299LYSA를 KpnI 및 BamHI으로 분해하고, 평활말단화한 후, lysA 유전자 단편을 추출한다. 이 단편을, HpaI(다까라슈조(주) 제)로써 분해하여 평활말단화한 pCAB와 연결시켜, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 변이형 lysC, dapA, dapB, 및 lysA를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하고, 이를 pCABL이라 지명한다. pCABL의 작제 공정을 도 13에 나타낸다. 또한, pCABL 중에서, lysA 유전자 단편은 dapB 유전자를 포함하는 DNA 단편내의 HpaI 부위에 삽입되어 있지만, 이 HpaI 부위는, dapB 유전자의 프로모터보다도 상류(서열 10중 뉴클레오타이드 번호 611번 내지 616번)에 위치하고 있고, dapB 유전자는 분리되어 있지 않다.
[실시예 12] 변이형 lysC, dapA, dapB, ddh 및 lysA를 겸하여 가진 플라스미드의 작제
pHSG299를 XbaI 및 XpnI로서 분해하고, XbaI 및 KPnI으로 분해된 ddh 및 lysA를 가지는 플라스미드 p399DL과 연결한다. 작제된 플라스미드를 p299DL이라 지명한다. 이 p299DL를 XbaI 및 KpnI로써 분해하여, 평활말단화한다. 평활말단을 형성시킨 후, ddh 및 lysA를 포함하는 DNA 단편을 추출한다. 이 DNA 단편을, HpaI으로 분해하여 평활말단화된 변이형 lysC, dapA 및 dapB를 더불어 가지는 플라스미드 pCAB와 연결하여, 코리네형 세균내에서 자율 증식가능하고 또한 변이형 lysC, dapA, dapB, lysA 및 ddh를 더불어 가지는 플라스미드를 작제하며, 이를 pCABDL이라 지명한다. pCABDL 작제 공정을 도 14에 나타낸다.
[실시예 13] L-리신 생합성 유전자를 포함하는 플라스미드의 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 L-리신 생산균으로의 도입
상기한 바와 같이 하여 작제된 L-리신 생합성용 유전자를 가지는 플라스미드 즉 p399AK9B(Cmr), pDPSB(Kmr), pDPRB(Cmr), pLYSAB(Cmr), pPK4D(Cmr), pCRCAB(Kmr), pAB(Cmr), pCB(Cmr), pDL(Cmr), pCAB(Cmr), pCABL(Cmr), pCABDL(Cmr)을 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 L-리신 생산균인 AJ11082(NRRL B-11470)내에 도입한다. AJ11082주는, AEC 내성을 가진다. 플라스미드를 전기펄스법(참조: sugimoto 등, 일본 특허공개 평 2-207791)에 따라 도입시킨다. 형질전환체는 각각의 플라스미드가 가지는 약제 내성 표지를 기준으로 선별한다. 클로람페니콜 내성 유전자를 가지는 플라스미드가 도입된 경우에는 5㎍/㎖의 클로람페니콜을 포함하는 완전배지로써, 또는 가나마이신 내성 유전자를 가지는 플라스미드가 도입된 경우에는 25㎍/㎖의 가나마이신을 포함하는 완전배지상에서 형질전환체를 선별한다.
[실시예 14] L-리신의 제조
실시예 13에서 수득한 각 형질전환체를 L-리신 생산 배지내에서 배양하고, 이의 L-리신 생산성을 평가한다. L-리신 생산배지의 조성은 하기와 같다.
[L-리신 생산 배지]
탄산칼슘 이외의 하기 성분(1L중)을 용해하고, KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조정하고, 115℃에서 15분 살균한 후, 별도로 무수 상태의 더운 공기 중에서 멸균시킨 탄산칼슘 50g을 가한다.
글루코스 100g
(NH4)2SO455g
KH2PO41g
MgSO4·7H2O 1g
바이오틴 500㎍
티아민 2000㎍
FeSO4·7H2O 0.01g
MgSO4·7H2O 0.01g
니코틴아미드 5㎎
단백질 가수분해물(豆濃) 30㎖
탄산칼슘 50g
상기 조성의 배지에 각종 형질전환체 및 모균주각각을 접종하여 31.5℃에서 왕복 진탕배양한다. 배양한지 40시간 또는 72시간후의 L-리신 생성량, 및 72시간후의 생장(OD562)를 표 1에 나타낸다. 표중, lysC*는 변이형 lysC를 나타낸다. 생장은 101배 희석한 후, 560nm로서 OD를 측정함에 의해 정량한다.
표 1에 나타낸 바와같이, 변이형 lysC, dapA, 또는 dapB의 단독의 증강에서는, 배양 72시간후 L-리신 생산량이 모균주보다 많거나 같으며, 배양 40시간 후에는 모균주보다도 생산량이 적다. 즉 단기간 배양시 L-리신 생산 속도는 저하된다. 유사하게, 변이형 lys 및 dapA 또는 dapA 및 dapB를 조합시켜 증강시킨 경우, 배양 72시간후에는 L-리신 생산량은 모균주보다도 많으나, 배양 40시간후에는 모균주보다도 생산량이 적으며, L-리신 생산속도도 저하된다.
한편, lysA 또는 ddh를 단독으로 증강시킨 경우 또는 lysA 및 ddh를 조합하여 증강시킨 경우, 배양 40시간 후는 L-리신 생산량은 모균주보다도 많으나, 생장이 저하했기 때문에 장시간 배양후에는 모균주보다 L-리신의 생산량이 적다.
반대로, 변이형 lysC과 함께 dap8를 증강시킨 균주의 경우에는 생장이 개선되고, 단기간 배양시 L-리신 생산속도를 완전히 회복시킬 수 있으며, 장기간 배양시에도 L-리신 축적량이 향상된다. 또한, 변이형 lysC, dapA 및 dapB의 3개가 동시에 증강된 균주의 경우, L-리신 생산성은 더욱 향상된다. 또한, 다시 lysA 및 ddh를 순차 증강시킴으로써, 단계적으로 L-리신의 생산 속도 및 축적량 모두가 향상된다. 또한, lysA 및 ddh만을 조합하여 증강시킨 경우에도, 모균주와 비교하여 L-리신 생산 속도가 향상된다.
본 발명에 의해, 코리네형 세균의 L-리신 생산성을 향상시킬 수 있고, 생장 속도도 또한 개선시킬 수 있다.
코리네형 L-리신 생산균에 있어서, 변이형 lysC와 함께 dapB를 증강시킴에 의해, L-리신 생산 속도를 향상시킬 수 있으므로 생산성도 향상시킬 수 있다. 이들의 유전자외에, dapA, lysA 및 ddh를 순차 증강시킴으로써, L-리신 생산 속도 및 생산성을 더욱 더 향상시킬 수 있다.
서열목록
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인 : 아지노모토 가부시키가이샤
(ⅱ) 발명의 명칭 : L-리신의 제조방법
(ⅲ) 서열수 :
(ⅳ) 연락처 :
(A) 수신자명 :
(B) 번지 :
(C) 시(市) :
(D) 주(州) :
(E) 나라(國) :
(F) ZIP :
(ⅴ) 컴퓨터 판독 가능 형식
(A) 매체 :
(B) 컴퓨터 :
(C) 운용시스템 :
(D) 소프트웨어 :
(ⅵ) 현출원 데이터
(A) 출원번호
(B) 출원일
(C) 분류
(ⅷ) 대리인/사무소정보
(A) 이름 :
(B) 등록번호 :
(C) 정리번호 :
(ⅸ) 통신정보
(A) 전화번호 :
(B) 팩시밀리번호 :
(2) 서열 1의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티 센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 1]
(2) 서열 2의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 21개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티 센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 2]
(2) 서열 3의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(xi) 서열 :
[서열 3]
(2) 서열 4의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 217..1482
(xi) 서열 :
[서열 4]
(2) 서열 5의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 421개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 5]
(2) 서열 6의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1643개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(D) 쇄수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게농성 DNA
(vi) 기원:
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락도퍼멘툼
(B) 균주형 : ATCC 13869
(ix) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 조재위치 : 964... 1482
(xi) 서열 :
[서열 6]
(2) 서열 7의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 172개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 7]
(2) 서열 8의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 선형
(D) 위상 : 직쇄
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 8]
(2) 서열 9의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 9]
(2) 서열 10의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 2001개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ix) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 730..1473
(xi) 서열 :
[서열 10]
(2) 서열 11의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 248개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 11]
(2) 서열 12의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 12]
(2) 서열 13의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 13]
(2) 서열 14의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1411개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅳ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(xi) 서열특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 311.. 1213
(xi) 서열 :
[서열 14]
(2) 서열 15의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 :301개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(C) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 15]
(2) 서열 16개 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 16]
(2) 서열 17의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 17]
(2) 서열 18의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 3579개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 533..2182
(ix) 서열의 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 2188..3522
(xi) 서열 :
[서열 18]
(2) 서열 19의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 550개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(C) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 19]
(2) 서열 20의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 445개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 20]
(2) 서열 21의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 20개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 없음
(xi) 서열 :
[서열 21]
(2) 서열 22의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 20개 염기
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 기타 핵산 합성 DNA
(ⅳ) 안티센스 : 있음
(xi) 서열 :
[서열 22]
(2) 서열 23의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 1034개 염기쌍
(B) 서열 형태 : 핵산
(C) 쇄 수 : 이본쇄
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열의 종류 : 게놈성 DNA
(ⅵ) 기원 :
(A) 생물명 : 브레비박테리움 락토퍼멘툼
(B) 균주명 : ATCC 13869
(ⅸ) 서열 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : CDS
(B) 존재위치 : 61..1020
(xi) 서열 :
[서열 23]
(2) 서열 24의 서열 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 320개 아미노산
(B) 서열 형태 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ⅱ) 서열 종류 : 단백질
(xi) 서열 :
[서열 24]

Claims (18)

  1. L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA 서열, 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는, 코리네형 세균세포내에서 자율 증식가능한 재조합 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  3. 제2항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제가, 코리네형 세균으로부터 기원한 아스파르토키나제이고, 이의 α 아단위에서는 N 말단으로부터 279번째의 알라닌 잔기가 알라닌 및 다른 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화되고, 이의 β 아단위에서는 30번째의 알라닌 잔기가 알라닌 및 다른 산성 아미노산 이외의 아미노산 잔기로 변화된 변이형 아스파르토키나제인 재조합 DNA.
  6. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 서열이, 서열목록중 서열 15의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  7. 제2항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 DNA 서열이 서열목록중 서열 11의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  8. 제3항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 DNA 서열이 서열목록중 서열 19의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  9. 제4항에 있어서, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 서열이 서열목록중 서열 24의 아미노산 서열 또는 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA.
  10. L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피이드 백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제를 보존 유지하며 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 포함하는 코리네형 세균.
  11. 제10항에 있어서, 제1항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  12. 제10항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 신타제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  13. 제12항에 있어서, 제2항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  14. 제12항에 있어서, 디아미노피멜산 데카르복실라제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  15. 제14항에 있어서, 제3항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  16. 제14항에 있어서, 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 증강된 DNA 서열을 추가로 포함하는 코리네형 세균.
  17. 제16항에 있어서, 제4항에 따른 재조합 DNA의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 세균.
  18. 제10항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 코리네형 세균을 적합한 배지중에서 배양하는 단계, 해당 세균의 배양물중의 L-리신을 생산 및 축적시키는 단계 및 해당 세균의 배양물로부터 L-리신을 수집하는 단계를 포함하는 L-리신의 제조 방법.
KR1019970709002A 1995-06-07 1996-06-05 L-리신의 제조 방법 KR100268324B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP14061495 1995-06-07
JP95-140614 1995-06-07

Publications (2)

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