CN103088080B

CN103088080B - 生产碱性物质的方法

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Publication number: CN103088080B
Application number: CN201210148568.9A
Authority: CN
Inventors: 竹下亮; 杉本慎一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2025-10-07
Also published as: ES2718638T3; ES2941685T3; KR20090023513A; PL2818556T3; US8198053B2; EP2818554A3; US20070243590A1; JP4844396B2; EP2818555A3; EP2818555A2; EP1813677A4; BRPI0516261A; CA2813540A1; ES2946983T3; EP2818556A2; KR100921644B1; US20100273221A1; JPWO2006038695A1; RU2350655C2; KR20070061587A

Abstract

本发明提供一种通过发酵来生产碱性物质的方法，包括在发酵罐中含有的液体培养基中培养具有生产所述碱性物质的能力的微生物，从而在所述培养基中产生和积累所述碱性物质，其中在培养过程的总时期的至少一部分期间通过将所述培养基中总氨浓度调节到特定浓度范围之内，来降低用作所述碱性物质的反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的量。

Description

生产碱性物质的方法

本申请是申请号为200580034391.8(国际申请号PCT/JP2005/018657)，申请日为2005年10月7日，发明名称为“生产碱性物质的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及微生物工业的技术，更明确地，涉及通过发酵生产碱性物质的方法。作为可通过发酵生产的碱性物质，例如L-赖氨酸作为动物饲料的添加剂是有用的，L-精氨酸和L-组氨酸对于药物制剂例如输注液(infusion)是有用的。

背景技术

在通过发酵生产碱性物质的方法中，培养具有产生碱性物质的能力的微生物来在培养基中产生和积累碱性物质，并从所述培养基收集所述碱性物质。在这种方法中，作为分批培养、补料培养(feedingculture)或连续培养来进行培养。

在这样的通过发酵生产碱性物质中，一般地将硫酸根离子或氯离子添加到培养基中作为目标物质的反荷阴离子，所述目标物质在培养基中解离成阳离子来将培养基的pH维持在中性水平(特开平5-30985号公报和特开平5-244969号公报)。

在需要进行纯化时，很多情况下通过离子交换从培养基中收集碱性物质。例如，在L-赖氨酸的情况下，将发酵液调整为弱酸性之后，L-赖氨酸被吸附在离子交换树脂上，然后用铵离子从树脂上洗脱。洗脱的L-赖氨酸按原样(asitis)作为赖氨酸碱(lysinebase)来直接使用，或可以与盐酸结晶来形成L-赖氨酸盐酸盐。

当在上述的L-赖氨酸纯化中氯离子被用作培养基中的反荷阴离子时，可以通过浓缩培养基直接获得L-赖氨酸盐酸盐。然而，由于氯离子腐蚀金属发酵罐等等，在实际生产中使它们以高浓度存在于培养基中不是优选的。

另一方面，当不纯化碱性物质时，按照原样浓缩发酵液，或用盐酸或硫酸调为弱酸性，随后喷雾造粒。在这种情况下，残余成分含有添加到培养基的反荷阴离子，因而在得到的发酵产物中碱性物质的含量被降低。

特开2002-65287(美国专利申请No.2002025564)公开了在碱性氨基酸的发酵生产中利用碳酸根离子和碳酸氢根离子作为碱性氨基酸的反荷阴离子来代替一部分硫酸根离子或氯离子的方法。通过将培养基的pH值调为酸性，或浓缩培养基，或这两种途径，可以相对容易地从培养基中除去碳酸根离子和碳酸氢根离子。以上引用的出版物教导了控制发酵罐中的内部压力使它在发酵过程中为正值、或将二氧化碳气体或含有二氧化碳的混合气体添加到培养基中的方法作为向培养基添加碳酸根离子和碳酸氢根离子的手段。然而，在典型培养基条件下，例如中性pH值，就算有的话，也仅有少量的二氧化碳气体溶解。因此，为了维持培养基中碳酸氢根离子和碳酸根离子的存在从而降低维持硫酸根离子或氯离子浓度的影响，必须在碱性pH下进行培养。然而，如果pH值变高，细菌生长速率和目标物质的生产力通常被降低。

发明内容

本发明的目的是提供一种方法，用于在通过使用具有生产目标碱性物质能力的微生物进行发酵的碱性物质生产中实现硫酸根离子和氯离子的降低和目标物质的有效生产，并利用碳酸根离子和碳酸氢根离子作为所述碱性物质的反荷阴离子同时避免微生物生长速率的降低或目标物质生产力的降低。

当使用棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌来发酵生产碱性物质时，如果pH变得过高，细菌生长速率或目标物质的生产力通常被降低。本发明的发明人发现，引起这种现象的主要因素是氨，其被添加到培养基中作为用于碱性物质生产、细菌生长的氮源，或作为碱性物质的反荷离子的来源，通过将总氨浓度控制在适合的浓度范围内进行发酵可以显著地抑制高pH值条件下微生物生长速率或目标物质生产力的降低。

在上述发现的基础上实现了本发明。

也就是说，本发明提供如下。

(1)一种通过发酵来生产碱性物质的方法，包括在发酵罐中含有的液体培养基中培养具有生产所述碱性物质的能力的微生物，从而在所述培养基中产生和积累所述碱性物质，其中在培养过程的总时期的至少一部分期间通过将所述培养基中总氨浓度调节到特定浓度范围之内，来降低用作所述碱性物质的反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的量。

(2)根据(1)的方法，其中所述总氨浓度的特定浓度范围是满足以下条件的范围：

(A)所述培养基中铵离子的浓度是这样的水平，使得溶于所述培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子以及其他阴离子的离子当量的总和大于所述培养基中积累的所述碱性物质中电离的所述碱性物质的离子当量，以及

(B)所述培养基中所述总氨浓度是不抑制所述微生物的碱性物质生产的水平，其是如下预先确定的：

在具有不同pH值和不同总氨浓度的培养基中培养所述微生物，测量每个pH值和每个总氨浓度下的所述碱性物质的生产力，确定各个pH值条件下提供最佳条件下的碱性物质生产力的50％或更高的碱性物质生产力的总氨浓度。

(3)根据(1)的方法，其中所述总氨浓度的特定范围是如下预先测定的：

(A’)在培养基中进行培养，所述培养基含有其量足以在pH7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子作为所述目标碱性物质的反荷离子的来源，通过添加氨气、氨水和尿素的至少一种来将所述培养基的pH值维持在6.5到7.2之间的范围内，并测量所述碱性物质的生产力，

(B’)在与步骤(A’)中使用的培养基相同的培养基中开始培养，只是培养基成分的硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量，在一定时期内用不同的总氨浓度继续进行培养，在所述时期中由于所述目标碱性物质的积累引起的作为碱性物质反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的不足，维持所述培养基的pH值到7.2或更低变得不可能，以根据步骤(A’)中测量的生产力来确定提供了50％或更高生产力的总氨浓度范围。

(4)根据(1)的方法，其中所述总时期的至少一部分包括下列中的至少一个：由于所述目标碱性物质的积累引起的反荷离子的不足而使所述培养基的pH值提高的时期，和由于向所述培养基添加阳离子而使所述pH值提高的时期。

(5)根据(1)的方法，其中当根据如下指标所测定的所述微生物的活性降低或停止时，通过向所述培养基添加氨或尿素来调节所述培养基中的总氨浓度，所述指标是：所述培养基中溶解的氧浓度、所述培养基中碳源的消耗率、所述培养基的混浊度、所述碱性物质的生产力、和观察到的所述培养基中的pH值变化。

(6)根据(1)的方法，其中将与含有其量足以在pH值7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子作为所述碱性物质的反荷离子来源的培养基具有相同组分、只是将硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量的培养基用作培养基，以及

所述总时期的至少一部分是一个时期，在所述时期中由于所述培养基中积累的碱性物质的引起的反荷离子不足，所述培养基的pH值不能被维持在7.2或更低。

(7)根据(2)的方法，其中所述其他阴离子选自硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子和电离的有机酸。

(8)根据(2)或(7)的方法，其中所述其他阴离子的总量是900meq/l或更低。

(9)根据(1)的方法，其中所述培养基中的所述总氨浓度被调节到200mM或更低。

(10)根据(1)的方法，其包括增殖所述微生物的步骤。

(11)根据(10)的方法，其中在增殖所述微生物的所述步骤期间不调节所述总氨浓度。

(12)根据(1)的方法，其中所述碱性物质选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。

(13)根据(12)的方法，其中所述碱性物质是L-赖氨酸。

(14)根据(12)的方法，其中所述碱性物质是L-精氨酸。

(15)根据(1)的方法，其中所述培养基或其处理物在发酵之后被加热以除去碳酸氢根离子和碳酸根离子。

(16)根据(1)的方法，其中所述微生物是棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌。

(17)含有碱性物质的发酵液或发酵产物，其可以通过根据(15)的方法获得。

附图说明

图1显示通过使用常规的培养基和培养方法进行的L-赖氨酸生产的培养结果。

图2显示在限制铵浓度的培养基中进行的L-赖氨酸生产的培养结果。

图3显示通过仅控制总氨浓度而非控制pH值进行的L-赖氨酸生产的培养结果。

图4显示在常规培养基和没有硫酸铵和氯化铵的培养基中总氨浓度和pH值随时间的变化。

图5显示在限制铵浓度的培养基中L-精氨酸发酵的生长、总氨浓度、pH值和残糖量随时间的变化。

图6显示在限制铵浓度的培养基中L-精氨酸生产的培养结果。

发明的优选实施方案

以下，将详细解释本发明。

本发明的方法是通过发酵生产碱性物质的方法，其包括在发酵罐中含有的液体培养基中培养能生产所述碱性物质的微生物，从而在所述培养基中产生和积累所述碱性物质。本发明的方法的特征在于，通过在培养过程的总时期的至少一部分期间将培养基中总氨浓度调节到特定浓度范围之内来降低用作所述碱性物质的反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的量。也就是说，本发明的方法是在培养基中生产碱性物质的方法，在所述培养基中通过使用这样的总氨浓度以确保所述总氨作为氮源处在所述微生物的生长或所述目标物质的生产所需的量，从而降低了硫酸根离子和氯离子，并且所述微生物的生长或所述目标物质的生产不被抑制。

总氨浓度的特定范围的实例包括满足以下条件的范围：

(A)所述培养基中铵离子的浓度是这样的水平，使得溶于所述培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子以及其他阴离子的离子当量的总和大于从所述培养基中积累的所述碱性物质电离的所述碱性物质的离子当量，以及

在具有不同的pH值和不同的总氨浓度的培养基中培养所述微生物，测量每个pH值和每个总氨浓度下的所述碱性物质的生产力，确定各个pH值条件下提供最佳条件下的碱性物质生产力的50％或更高的碱性物质生产力的总氨浓度。

此外，在本发明的另一个实施方式中，所述总氨浓度的特定范围如下预先测定。

(A’)(步骤1：在中性条件下评估发酵结果)

在培养基中进行培养，所述培养基含足以在pH7.2或更低的pH下进行培养的量的硫酸根离子和/或氯离子作为所述目标碱性物质的反荷离子的来源，通过添加氨气、氨水和尿素的至少一种来将所述培养基的pH值维持在6.5到7.2之间的范围内，并测量所述碱性物质的生产力，

(B’)(步骤2：降低硫酸根离子和氯离子的量，改变铵离子浓度时的发酵结果的评价)

在与如上所述步骤1(步骤A’)中使用的培养基相同的培养基中开始培养，只是培养基成分的硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量，用不同的总氨浓度继续进行培养一段时间，在所述期间由于所述目标碱性物质的积累，导致作为碱性物质反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子不足，从而维持所述培养基的pH值到7.2或更低变得不可能，根据步骤(A’)中测量的生产力来确定提供了50％或更高生产力的总氨浓度范围。

此外，在本发明的另一个实施方式中，当没有预先测定总氨浓度的特定范围时，可以将总氨浓度调节到所述预定范围之内。具体地，当根据所述培养基中溶解的氧浓度、所述培养基中碳源的消耗率、所述培养基的混浊度、所述碱性物质的生产力、和观察到的所述培养基中的pH值变化作为指标而测定的所述微生物的活性降低或停止时，通过向所述培养基添加氨或尿素来调节所述培养基中的总氨浓度。所述培养基具有与含有其量足以在pH值7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子作为所述碱性物质的反荷离子来源的培养基相同的组分，只是将硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量。所述总时期的至少一部分的实例包括一个时期，在所述时期中由于所述培养基中积累的碱性物质而使反荷离子不足，所述培养基的pH值不能被维持在7.2或更低。

其他阴离子的实例包括氯离子、硫酸根离子、磷酸根离子、有机酸(乙酸、乳酸、琥珀酸等)的离子，等等。此外，溶于所述培养基的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子起到碱性物质的反荷阴离子的作用。

在本发明中，离子当量是通过每种离子的摩尔浓度乘以该离子的化合价获得的值，它以eq/l的单位来表示。也就是说，1mM单价离子的离子当量是1meq/l，1mM二价离子的离子当量是2meq/l。

调节上述的总氨浓度来使培养基中存在的总氨处在微生物的生长或碱性物质的产生所需的量，并且处于不抑制微生物的碱性物质生产的浓度，从而所述培养基被自动地调节到适合于溶解作为碱性物质的反荷阴离子所需的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的pH值。

在本发明中，“总氨”是指未解离的氨(NH₃)和铵离子(NH₄ ⁺)的总和。当调节所述总氨浓度时，可以测量未离解的氨或铵离子，或可以测量这两者。

一般地，向培养基添加硫酸铵和氯化铵作为碱性物质的反荷阴离子的来源和氮源，一般而言。此外，由于氨和尿素一般用于调节培养基的pH值，在培养基中存在高浓度的氨和铵离子。当降低硫酸铵或氯化铵的量以降低添加到培养基的硫酸根离子或氯离子的量时，以相应于被降低量的量来提供氮源例如氨。对于这种操作，必须的是开发一种提供氨的方法，其考虑到阳离子和阴离子之间的平衡，所述阳离子包括由细菌产生的和随培养的进展而增加的那些阳离子，例如目标碱性物质的阳离子、从添加的氨电离的阳离子、添加到培养基的阳离子例如钠离子和钾离子等等，所述阴离子为由于细菌的呼吸作用或向培养基添加而产生的在培养基中增加的阴离子。如果不能维持这种平衡，发酵将不会发展，因为氨浓度会变得过高，或pH值会变得过高，或反之，氨会被耗尽。根据本发明，开发添加氨来将总氨浓度调节到特定范围之内的方法可以有利地维持阳离子和阴离子的上述平衡，因而甚至在培养基中存在的硫酸根离子和氯离子的量降低的条件下，也可以实现微生物的良好生长和碱性物质的顺利产生。

通过向培养基添加氨气、氨溶液和尿素的至少一种来调节培养基中的总氨浓度，使得培养基中的总氨浓度处在可接受的水平。此外，也可以添加铵盐，例如氯化铵或硫酸铵，只要无损于本发明的效果。此外，也可以使用含有碳酸氢根离子或碳酸根离子作为反荷离子的铵盐，其可以在完成培养之后作为气体容易地除去。通过使用培养基或排气(exhaustgas)中的铵离子或氨浓度的测量值作为指标，可以调节总氨浓度。此外，还可能的是，通过预先测定提供了可接受的总氨浓度的pH值来调节总氨浓度，此时用氨或添加氨来调节pH值从而可以获得这样的pH值。在这种情况下，如果需要，在培养期间可以变化如上所述测定的pH值。

此外，当根据所述培养基中溶解的氧浓度、所述培养基中碳源的消耗率、所述培养基的混浊度、所述碱性物质的生产力、和观察到的所述培养基中的pH值变化作为指标所测定的所述微生物的活性降低或停止时，通过向所述培养基添加氨或尿素，也可以调节所述培养基中的总氨浓度。也就是说，如果培养基中的氮源变得不足或被耗尽，微生物的增殖或微生物的活性，例如目标物质的生产被降低或停止。微生物的活性通常表现为培养基中溶解氧和碳源的消耗、培养基混浊度的提高、目标物质的生产和由于通过呼吸作用的氨消耗或二氧化碳释放引起的培养基的pH降低。因此，当微生物的活性降低或停止时，在每单位时间的通气量和搅拌速度恒定时培养基中溶解氧的浓度增加，二氧化碳分泌和氨消耗的下降，从而培养基的pH值提高。此外，碳源的消耗速度、培养基混浊度的增加速度和目标物质的生产速度降低。因此，在除氮源之外的培养基成分充足的状态之下根据这些项目作为指标观察到微生物活性的停滞(stagnation)时，氮源变得不足或被耗尽。如果这种情况发生，以微生物的生长或目标物质的生产所需的量向培养基添加氨或尿素。通过重复这个步骤，作为结果，培养基中的总氨浓度被维持在特定范围之内。如果向培养基添加尿素来进行培养，尿素被微生物利用，氨被释放到培养基中。如果如上所述重复氨或尿素的添加，培养基的pH值逐渐地增加。每次添加的氨或尿素的量可以是，例如，300mM，优选200mM，更优选100mM，表示为培养基中总氨的终浓度。作为选择，可以添加氨或尿素，从而在添加氨或尿素之后pH值增加0.3或更少，优选0.15或更少，更优选0.1或更少。

例如，通过使用溶解氧电极，可以测量培养基中的溶解氧浓度。

通过测量碳酸氢根离子、碳酸根离子和其他阴离子的浓度以及所述碱性物质的浓度，可以确认全部溶于培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子以及其他阴离子的离子当量的总和是否高于在培养基中积累的碱性物质的离子当量。此外，通过进行初步实验来测定满足上述条件的pH值和/或氨添加量，并在预先测定的pH值和/或添加预先测定量的氨进行培养，也可以满足以上条件。

在本发明中，培养物的pH值可以是或可以不是恒定的。此外，当控制培养基的pH值时，可以通过使用pH值本身作为指标、或间接地通过控制总氨浓度而不直接控制pH值来进行控制。此外，如果如上所述使用微生物的活性作为指标来添加氨或尿素，调节培养基中的总氨浓度使它处在合适的浓度范围之内，pH值随着碱性物质的积累逐渐地增加。此外，如果将总氨浓度控制到特定范围之内来进行培养，pH值作为培养基中各种阳离子和阴离子的积累平衡变化的结果而变化。无论选择哪种方法，作为结果培养基中的总氨浓度被调节到特定浓度范围之内，因而可以降低用作碱性物质的反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的量。

在本发明中，表述“不抑制碱性物质的生产”是指用于本发明的微生物良好地生长，碱性物质顺利地产生。当微生物的生长不充分时，或当尽管微生物生长良好但不能有效产生碱性物质时，认为是碱性物质的生产被抑制。

具体地，用于本发明的微生物被培养在不同pH值水平和总氨浓度的培养基中，测量培养基中积累的碱性物质的生产力，与在最佳条件，例如通常使用的中性pH值的一般条件下可获得的碱性物质的生产力相比，导致在每种pH值下以优选50％或更高、更优选70％或更高、特别优选90％或更高的碱性物质生产力的总氨浓度，被认为是“不抑制碱性物质的生产”的浓度。在本发明中，“生产力”是指产率、生产速度或总生产量。“产率”是指基于能被同化的、培养基中存在的碳源，碱性物质的生产量，“生产速度”是指每单位时间的生产量。此外，当单独地使用术语“生产量”或“生产的量”时，是指一旦完全消耗了碳源，在培养基中积累的碱性物质的量。

作为选择，在最佳条件下，例如通常使用的中性pH值的一般条件下，培养用于本发明的微生物，并测量培养基中积累的碱性物质的生产力。然后，在具有相同组成只是硫酸根离子和/或氯离子的量降低了期望的量的培养基中进行培养，并测量碱性物质的生产力。在这种情况下，存在一个时期，在所述时期中由于随着目标碱性物质的积累作为反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子不足，培养基的pH值将增加。对于这个时期，将总氨浓度维持到特定浓度范围之内进行培养。对于控制浓度的范围，用1到500mM范围内的各种浓度进行培养，将提供了在最佳条件下可获得的生产力的优选50％或更高、更优选70％或更高、特别优选90％或更高的碱性物质生产力的范围内的浓度，确定为“不抑制碱性物质的生产”的浓度。用于上述“通常使用的中性pH值的一般条件”的培养基的实例包括含有其量足以在pH7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子的培养基。

硫酸根离子和/或氯离子降低的期望的量没有具体的限制，只要可以获得碱性物质的目标生产力。

例如，被定义为“不抑制碱性物质的生产”的总氨浓度也可以如下测定。将用于本发明的微生物在培养基的不同pH值水平和总氨浓度下培养，并测量培养基中积累的碱性物质的量。将在各种条件下获得的碱性物质积累量与最佳条件下积累的量进行比较。因而，可以确定不抑制碱性物质的生产的总氨浓度。最佳条件被定义为如通常使用的中性pH值的一般条件中的、在中性pH值使用足够反荷离子的培养条件。

此外，例如，用于测定被定义为“不抑制碱性物质的生产”的总氨浓度的另一种方法如下。将用于本发明的微生物在最佳条件，例如通常使用的中性pH值的一般条件下培养，并测量培养基中积累的碱性物质的生产力。然后，在具有相同组成只是将硫酸根离子和/或氯离子降低了期望的量的培养基中进行培养，检查生产力。在这种情况下，存在一个时期，在所述时期中由于随着目标碱性物质的积累作为反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子不足，培养基的pH值将增加。对于这个时期，将总氨浓度维持到特定浓度范围之内进行培养。对于控制浓度的范围，用1到500mM范围内的各种浓度进行培养，并将由此获得的生产力与最佳条件下的进行比较。

被定义为“不抑制碱性物质的生产”的浓度包括，例如，与最佳条件下的碱性物质生产力相比，容许优选50％或更高、更优选70％或更高、特别优选90％或更高的碱性物质生产的浓度。具体地，培养基中的总氨浓度是，例如，优选300mM或更低、更优选200mM或更低、特别优选100mM或更低。随着pH值增加，氨解离的程度降低。与铵离子相比，未解离的氨对于细菌是更有毒性的。因此，总氨浓度的上限还取决于培养基的pH值。也就是说，当培养基的pH值增加时，可接受的总氨浓度变得更低。因此，对于上述被定义为“不抑制碱性物质的生产”的总氨浓度，在培养期间对于最高pH值可接受的总氨浓度范围可以被看作是整个培养的总氨浓度范围。

另一方面，微生物的生长和碱性物质的产生所需的作为氮源的氨总浓度没有具体的限制，只要微生物提供的目标物质的生产力在培养期间不因为氮源不足而降低，而且它可以适当地确定。例如，在培养期间随时间测量氨浓度，当培养基中的氨被耗尽时，可以将少量氨添加到培养基中。虽然添加氨之后的浓度没有具体的限制，但就总氨浓度而言，它是，例如，优选1mM或更高、更优选5mM或更高、特别优选10mM或更高。

本发明的方法可以包括主要用于增殖具有产生碱性物质能力的微生物的培养步骤，和主要用于容许微生物产生碱性物质的培养步骤。此外，在本发明的方法中，微生物的增殖和碱性物质的生产可以并行地进行。此外，除了如上所述的这种培养，其也可被称为主发酵、主培养等之外，也可以独立地进行预培养。

在本发明中，除了如上所述调节培养基中的总氨浓度之外，也可以进行促进培养基中碳酸氢根离子和/或碳酸根离子溶解的操作。这种操作的实例包括在培养期间控制发酵罐中的压力使得它是正的，向培养基提供二氧化碳气体或含有二氧化碳气体的混合气体，限制向发酵罐中通气使得碳酸氢根离子和/或碳酸根离子溶于培养基中，通过向培养基添加铵离子以外的阳离子例如钠离子和钾离子来提高培养基的pH值，等等。

为了使发酵罐中的压力为正，例如，可以使供应到发酵罐的空气压力比排气的压力更高。通过使发酵罐中的压力更高，由发酵产生的二氧化碳气体溶于培养基中并产生碳酸氢根离子或碳酸根离子。具体地，发酵罐中的压力可以是0.13到0.3MPa，优选0.15到0.25MPa。

此外，通过向培养基提供二氧化碳气体或含有二氧化碳气体的混合气体，可将二氧化碳气体溶于培养基中。作为选择，通过限制对发酵罐的通气，由发酵产生的二氧化碳气体也可以溶于培养基中。通过，例如，测量培养基中碳酸氢根离子或碳酸根离子的量、或测量培养基的pH值和氨浓度，可以确定适合的通气速率。当向培养基提供二氧化碳气体时，例如，可将纯二氧化碳气体或含有5体积％或更多二氧化碳气体的混合气体鼓泡到培养基中。用于将碳酸氢根离子和/或碳酸根离子溶解到培养基中的上述方法可以独立地、或作为两种或多种的组合来使用。

调节培养基中总氨浓度的操作，以及如果需要促进培养基中碳酸氢根离子和/或碳酸根离子的溶解的操作，可以在培养过程的总时期的至少一部分期间进行。

虽然“总时期的至少一部分”没有具体的限制，只要获得了期望的生产力，但具体地它可以是，例如，主培养的总培养过程的1/10或更多、优选1/5或更多。更具体地，所述时期的实例包括，由于随着所述目标碱性物质的积累，反荷离子例如硫酸根离子和/或氯离子的不足引起所述培养基的pH值提高的时期，或由于添加阳离子而使所述pH值提高的时期，或这两个时期。

本发明使用的培养基没有具体的限制，只要通过调节总氨浓度的操作至少总氨浓度可以被调节到上述范围之内，并且取决于使用的微生物，可以适当地使用含有有机和无机营养物，例如碳源和氮源和其他痕量营养物的培养基。

可以使用任何碳源，只要它能被所述微生物同化，而实例包括糖类例如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜和淀粉水解物，有机酸例如乙酸，醇类例如乙醇，和烃类例如甲烷。

氮源的实例包括无机物例如氨，蛋白水解物，酵母提取物，等等。痕量营养物的实例包括氨基酸，维生素和痕量金属元素。

存在于培养基中除碳酸氢根离子和/或碳酸根离子之外的阴离子的实例包括氯离子、硫酸根离子、磷酸根离子、离子化的有机酸、氢氧根离子，等等。这些其他离子的离子当量的总和通常是900meq/l或更低，优选700meq/l或更低，更优选500meq/l或更低，还更优选300meq/l或更低，特别优选200meq/l或更低。

本发明的目的之一是降低使用的硫酸根离子和/或氯离子的量，硫酸根离子或氯离子的离子当量、或培养基中存在的这些离子的离子当量的总和通常是700meq/l或更低，优选500meq/l或更低，更优选300meq/l或更低，还更优选200meq/l或更低，特别优选100meq/l或更低。

发酵方案没有具体的限制，并可以是其中不添加培养基的分批培养，其中在加料的糖类被消耗之后进料培养基的补料培养，其中当培养基的体积超出发酵罐可接受的体积时抽取培养基的连续培养，其中细菌细胞再回收的细胞再循环方法，等等。培养温度可以取决于选择的微生物适当地确定。其通常是25到45℃，优选30到40℃。此外，优选充分地搅拌使得发酵期间存在充足的氧气。

例如，具体地如下进行用于生产目标碱性物质的培养。制备含有典型培养基成分的培养基，但是除去部分或者全部的铵盐，例如硫酸铵和氯化铵。将已经单独地培养的微生物接种到此培养基中，并将总氨浓度控制到如上述确定的适合于选择的微生物的范围之内进行培养。通过使用，例如，商业上可获得的离子计等，可以测量发酵罐中的培养基中或采样的培养基中的氨浓度。通过使用测量的值作为指标，可以控制总氨浓度。为了将总氨浓度维持在预定的浓度范围之内，可以向培养基添加氨气、氨水或尿素。通过使用普通的氨电极测量来自发酵罐的排气中的氨浓度，也可以间接地测量培养基中的总氨浓度。

此外，在本发明中，如上所述，通过使用培养基的pH值作为指标的如下方法，可以调节培养基中的总氨浓度。

在培养基中进行培养，所述培养基具有与含有其量足以在pH7.2或更低的条件下维持培养的硫酸根离子和/或氯离子的培养基相同的成分，只是将硫酸根离子和/或氯离子的量在各个pH值水平降低了期望的量，其中通过添加氨气、氨水和尿素的至少一种来改变pH值水平，以及

继续培养，同时根据指标，例如培养基中溶解氧浓度的变化、培养基中碳源消耗速度的变化、培养基混浊度的变化、培养基中pH值的变化等等，通过向培养基添加氨气、氨水和尿素的任何一种，在一定时期内以间接的方式维持培养基中的总氨浓度使它在优选的浓度范围之内，在所述时期中由于对培养基中积累的碱性物质的反荷离子的不足而不能将培养基的pH值维持在7.2或更低。

通过本发明的方法生产的碱性物质的实例包括碱性氨基酸，具体地，L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。其中，L-赖氨酸是优选的。

能生产碱性物质的微生物没有具体的限制，可以选择任何微生物只要它可以通过发酵生产碱性物质。具体地，优选即使在高培养基pH值下，也能在培养基的总氨浓度低的条件下良好地生产碱性物质的微生物，。这种微生物的实例包括属于棒状杆菌型细菌、埃希氏菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)或芽孢杆菌属(Bacillus)。

以下将说明棒状杆菌型细菌和埃希氏菌属细菌，然而，用于本发明的方法的微生物不限于这些细菌。

用于本发明的棒状杆菌型细菌包括棒杆菌属(Corynebacterium)细菌和早先已经被分类为短杆菌属(Brevibacterium)、但已经重新分类为棒杆菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1981))的那些细菌，并进一步包括属于短杆菌属的细菌，其极其接近于棒杆菌属。具体的实例包括以下：

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)

烷醇棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)

美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacteriumlilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)

嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)

Corynebacteriumefficiens

力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)

二歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)(谷氨酸棒杆菌)

黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)(谷氨酸棒杆菌)

Brevibacteriumimmariophilum

乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)

解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)

生硫短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)

白色短杆菌(Brevibacteriumalbum)

蜡状短杆菌(Brevibacteriumcerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)

具体地，包括如下菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

烷醇棒杆菌ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060

百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

二歧短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826,ATCC14067

BrevibacteriumimmariophilumATCC14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13665,ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨短杆菌(产氨棒杆菌)ATCC6871

白色短杆菌ATCC15111

蜡状短杆菌ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

埃希氏菌属细菌的实例包括大肠杆菌(Escherichiacoli)。当使用遗传工程技术培育大肠杆菌时，可以选择大肠杆菌K12菌株和其衍生物，即大肠杆菌MG1655菌株(ATCCNo.47076)、W3110菌株(ATCCNo.27325)等等。大肠杆菌K12菌株是1922年在斯坦福大学分离的，并且是λ噬菌体的溶原细菌。另外，它是具有F因子的多用途菌株，通过接合等等可以构建它的遗传重组体。此外，已经确定了大肠杆菌K12菌株的基因组序列，该遗传信息是公众可获得的。大肠杆菌K12菌株和其衍生物可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica)获得。

能够生产L-赖氨酸的棒状杆菌型细菌的实例包括S-(2-氨基乙基)半胱氨酸(以下缩写为“AEC”)抗性突变菌株、需要氨基酸例如L-高丝氨酸用于生长的突变菌株(特公昭48-28078号和特公昭56-6499号)、具有对AEC的抗性并且进一步需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的突变菌株(美国专利Nos.3,708,395和3,825,472)、具有对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂基内酰胺(α-amino-lauryllactam)、天冬氨酸类似物、磺胺药(sulfadrug)、类醌(quinoid)和N-月桂酰基亮氨酸(N-lauroylleucine)的抗性的生产L-赖氨酸的突变菌株、具有对草酰乙酸脱羧酶或呼吸道酶抑制物的抗性的生产L-赖氨酸的突变菌株(特开昭50-53588,特开昭50-31093，特开昭52-102498，特开昭53-9394，特开昭53-86089，特开昭55-9783，特开昭55-9759，特开昭56-32995，特开昭56-39778，特公昭53-43591和特公昭53-1833)、需要环己六醇(inositol)或乙酸的生产L-赖氨酸的突变菌株(特开昭55-9784和特开昭56-8692)、对氟丙酮酸(fluoropyruvicacid)或34℃或更高的温度敏感的生产L-赖氨酸的突变菌株(特开昭55-9783和特开昭53-86090)、具有对乙二醇的抗性的短杆菌属或棒杆菌属细菌的生产L-赖氨酸的突变菌株，等等。

具体实例包括，例如，乳发酵短杆菌ATCC31269、黄色短杆菌ATCC21475和醋谷棒杆菌ATCC21491菌株。

此外，在实施例中描述的乳发酵短杆菌ATCC13869/pVK-C^*,plysE菌株也是优选的生产L-赖氨酸的棒状杆菌型细菌。通过将含有编码天冬氨酸激酶的基因的质粒pVK-C^*和含有lysE基因的质粒plysE(美国专利申请No.2003113899)掺入到ATCC13869菌株中来获得这个菌株，所述天冬氨酸激酶是对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制脱敏感的(lysC^*)，所述lysE基因与已知促进棒杆菌属细菌的L-赖氨酸分泌的基因是同源的(国际专利公开9723597A2)，所述ATCC13869菌株是乳发酵短杆菌的野生型菌株。

lysC^*基因可以从例如生产L-赖氨酸的突变菌株AJ3463(FERMP-1987)(参见特公昭51-34477号公报)分离，所述菌株是通过诱变ATCC13869菌株产生的。AJ3463菌株于1973年3月22日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(以前为工业技术院生命工学工业技术研究所)(地址：TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)，分配的登记号是FERMP-1987。此外，lysC^*基因片段也可以从含有质粒p399AK9B的乳发酵短杆菌AJ12691菌株分离，所述质粒含有该基因。AJ12691菌株于1992年4月10日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，分配的登记号是FERMP-12918。之后，于1995年2月10日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，分配的登记号是FERMBP-4999。通过将允许质粒在棒杆菌属细菌中自主复制的DNA片段插入质粒p399AK9来获得质粒p399AK9B(美国专利No.5,766,925)，质粒p399AK9是通过将来自AJ3463菌株的lysC插入克隆载体pHSG399来获得的(参见，Takeshita,S等,Gene(1987),61,63-74)。

在上述脱敏感的天冬氨酸激酶中，野生型天冬氨酸激酶的α-亚基的位置279处的丙氨酸残基和β-亚基的位置30处的丙氨酸残基各自被替换为苏氨酸残基。α-亚基和β-亚基都在lysC基因的相同阅读框内编码。lysC^*基因的核苷酸序列和脱敏感的天冬氨酸激酶的α-亚基的氨基酸序列在序列表中示出，分别为SEQIDNO:5和6，同一个基因的核苷酸序列和脱敏感的天冬氨酸激酶的β-亚基的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:7和8。

使用根据报道的核苷酸序列(GenBank登记号X96471)的引物，例如SEQIDNO:3和4所示的引物和棒状杆菌型细菌的染色体DNA作为模板，通过PCR(聚合酶链式反应，参见White,T.J.等,TrendsGenet.,5,185(1989))可以获得棒状杆菌型细菌的lysE基因。含有谷氨酸棒杆菌lysG和lysE基因(GenBank登记号X96471)的DNA片段的核苷酸序列在SEQIDNO:9中示出，由这个基因编码的LysE蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:10中示出。LysG由相应于SEQIDNO:8中核苷酸编号1723到2352的互补序列编码。

编码天冬氨酸激酶的α-亚基、β-亚基和LysE蛋白的DNA包括编码蛋白的DNA，所述蛋白可以在每个蛋白中一个或几个位置包括一个或几个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加，只要不丧失所述蛋白的活性。虽然术语“几个”意指的氨基酸残基数目可以取决于蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置和种类而变化，对于每个蛋白它优选为2到30个、更优选2到20个、特别优选2到10个。这基于以下理由。也就是，由于某些氨基酸相互间是高度同源的，这些氨基酸之中的差异不会很大地影响蛋白质的三维结构和活性。因此，每个蛋白可以是与SEQIDNO:6、8或10的氨基酸残基具有50％或更高、优选70％或更高、更优选90％或更高、特别优选95％或更高的同源性，并具有天冬氨酸激酶或LysE蛋白的活性的蛋白质。

如上所述的这种蛋白质修饰是维持每个蛋白活性的保守突变。取代是一种改变，其中氨基酸序列中至少一个残基被除去，并在此插入另一个残基。被认为是保守性取代的氨基酸残基对原始氨基酸残基的取代的实例包括ser或thr对ala的取代，gln、his或lys对arg的取代，glu、gln、lys、his或asp对asn的取代，asn、glu或gln对asp的取代，ser或ala对cys的取代，asn、glu、lys、his、asp或arg对gln的取代，asn、gln、lys或asp对glu的取代，pro对gly的取代，asn、lys、gln、arg或tyr对his的取代，leu、met、val或phe对ile的取代，ile、met、val或phe对leu的取代，asn、glu、gln、his或arg对lys的取代，ile、leu、val或phe对met的取代，trp、tyr、met、ile或leu对phe的取代，thr或ala对ser的取代，ser或ala对于thr的取代，phe或tyr对trp的取代，his、phe或trp对tyr的取代和met、ile或leu对val的取代。

编码与具有SEQIDNO:6、8或10所示氨基酸序列的蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA，可以通过使用例如位点特异性诱变，从而发生一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，修饰编码SEQIDNO:6、8或10所示氨基酸序列的核苷酸序列来获得。这种修饰的DNA可以通过用试剂处理或在引起突变的条件下处理以常规方式来获得。这种处理的实例包括用羟胺处理编码本发明的蛋白的DNA、紫外线照射含有所述DNA的微生物、用试剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理。

编码如上所述这种修饰的蛋白的DNA也可以通过分离DNA来获得，被分离的DNA能在严格条件下与lysC基因、lysE基因或这些基因的一部分杂交并仍编码具有天冬氨酸激酶活性或LysE蛋白的活性的蛋白。术语“严格条件”包括这样的条件，在这些条件下形成所谓的特异性杂合体(specifichybrid)，而不形成非特异性杂合体。严格条件包括，例如，这样的条件，在这些条件下相互具有高同源性的DNA，例如具有不低于70％、优选不低于80％、更优选不低于90％、特别优选不低于95％的同源性的DNA能够杂交。严格条件还包括Southern杂交的典型的洗涤条件，例如，在60℃，1xSSC，0.1％SDS，优选0.1xSSC，0.1％SDS。

属于埃希氏菌属的生产L-赖氨酸的细菌的实例包括具有对L-赖氨酸类似物的抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制埃希氏菌属细菌的生长，但当L-赖氨酸同时存在于培养基中时这种抑制完全地或部分地消除了。L-赖氨酸类似物的实例包括氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、(S)-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺(α-chlorocaprolactam)，等等。具有对这些赖氨酸类似物的抗性的突变体可以通过使埃希氏菌属微生物经受常规的人工突变处理来获得。用于生产L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERMBP-1543，NRRLB-12185；参见特开昭56-18596和美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611菌株。AJ11442菌株于1981年5月1日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(以前为工业技术院生命工学工业技术研究所)(地址：TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)，分配的登记号是FERMP-5084。之后，这个保藏物于1987年10月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，分配的登记号是FERMBP-1543。在这些微生物中，L-赖氨酸的天冬氨酸激酶反馈抑制被脱敏了。

此外，例如，除了脱敏的天冬氨酸激酶之外，具有编码涉及L-赖氨酸生物合成的酶的基因的增强表达的细菌也可用作优选的生产L-赖氨酸的细菌。这种酶的实例包括二氨基庚二酸(diaminopimelate)途径中涉及的酶，例如二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶(对于所有上述的酶，国际专利公开WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(特开昭60-87788)、天冬氨酸转氨酶(特公平6-102028)、二氨基庚二酸表异构酶(特开2003-135066)和天冬氨酸半醛脱氢酶(国际专利公开WO00/61723)，氨基己二酸途径中涉及的酶，例如高乌头酸水合酶(homoaconitatehydratase)(特开2000-157276)，等等。

具有生产L-赖氨酸的能力的大肠杆菌菌株的具体实例包括大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2菌株(国际专利公开WO95/16042)等等。大肠杆菌W3110(tyrA)/pCABD2菌株是通过向W3110(tyrA)中导入含有编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因的质粒pCABD2来获得的，W3110(tyrA)是大肠杆菌的tyrA缺陷菌株(它被称为AJ12604，于1991年1月28日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(以前为工业技术院生命工学工业技术研究所)(地址：TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本)，分配登记号FERMP-11975，然后该保藏物根据布达佩斯条约的规定在1991年9月26日转为国际保藏，分配登记号FERMBP-3579)。

质粒pCABD2含有编码突变二氢吡啶二羧酸合酶的基因，其中位置118的组氨酸残基被突变为酪氨酸残基，L-赖氨酸的反馈抑制被脱敏，编码突变天冬氨酸激酶III的基因，其中位置352的苏氨酸残基被突变为异亮氨酸残基，L-赖氨酸的反馈抑制被脱敏，和编码二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱氢酶的基因。

此外，可以如下所述获得大肠杆菌W3110(tyrA)菌株。也就是说，通过将质粒导入W3110(tyrA)菌株获得的许多菌株在欧洲专利公开No.488424/1992中公开。例如，通过导入质粒pHATerm获得的菌株被称为大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株，并保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所，分配登记号FERMBP-3653。通过，例如，从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株消除质粒pHATerm可以获得W3110(tyrA)菌株。质粒的消除可以按常规方式进行。

此外，WC196菌株(参见国际专利公开WO96/17930)也可以被用作大肠杆菌的生产L-赖氨酸的菌株。WC196菌株是通过给源自大肠杆菌K-12的W3110菌株赋予AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)抗性而培育的。这个菌株被称为大肠杆菌AJ13069，并于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本))，分配的登记号是FERMP-14690。之后，该保藏物于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，分配的登记号是FERMBP-5252。

本发明可以使用的微生物可以具有降低的酶活性，所述酶经由作为L-赖氨酸生物合成途径的分支的途径，催化产生除L-赖氨酸外的化合物的反应，或是下调L-赖氨酸生产，或可以在这种酶中有缺陷。在L-赖氨酸生产中，这样的酶的说明性实例包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA,ldcC)和苹果酸酶。其中这些酶的活性被降低或有缺陷的菌株在国际专利公开WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175，等等中描述。

为了降低或消除酶的活性，可以通过常规的诱变方法来突变染色体上编码酶的基因，使得酶的细胞内活性被降低或消除。例如，这可以通过使用遗传重组消除染色体上编码酶的这些基因，或修饰表达控制序列，例如启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列来实现。这也可以通过导入氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、添加或缺失染色体上酶的编码区中一个或两个核苷酸导入移码突变，或缺失一部分基因来实现(JournalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997))。也可以通过构建编码突变的酶的基因，其中编码区被缺失，并通过同源重组等等用突变的基因取代染色体上的野生型基因，或向基因导入转座子或IS因子，来降低或消除酶的活性。

例如，可以采用以下方法来导入突变，所述突变引起上述酶的活性的下降，或通过遗传重组消除活性。通过修饰目标基因的部分序列来制备突变基因，并用含有突变基因的DNA转化棒状杆菌型细菌来引起突变基因和染色体上基因之间的重组，染色体上的目标基因可以被取代为不产生正常起作用的酶的突变基因。已经建立了使用同源重组基于基因置换(genesubstitution)的这种位点特异性诱变，并且已知使用线性DNA的方法、使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645;U.S.专利No.6,303,383;特开平05-007491)等等。此外，如上所述使用同源重组基于基因置换的这种位点特异性诱变也可以用不能在宿主中复制的质粒来进行。

此外，已经被修饰使得L-赖氨酸和L-精氨酸分泌基因ybjE的表达量提高的微生物也可用于本发明(国际专利公开WO2005/073390)。

属于沙雷氏菌属的生产L-赖氨酸的细菌的实例包括用编码二氢吡啶二羧酸合酶的DNA转化的沙雷氏菌属细菌，所述二氢吡啶二羧酸合酶具有脱敏化L-赖氨酸反馈抑制的突变，和含有天冬氨酸激酶的沙雷氏菌属细菌，所述天冬氨酸激酶是对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的(国际专利公开WO96/41871)。

生产L-精氨酸的棒状杆菌型细菌的实例包括棒状杆菌型细菌的野生型菌株；对某些试剂包括磺胺药类、2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)、α-氨基-β-羟基戊酸(α-amino-β-hydroxyvalericacid)等等有抗性的棒状杆菌型细菌；除了对2-噻唑丙氨酸有抗性之外显示对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸的营养缺陷的棒状杆菌型细菌(特开昭54-44096)；对酮基丙二酸(ketomalonicacid)、氟丙二酸(fluoromalonicacid)或单氟乙酸(monofluoroaceticacid)有抗性的棒状杆菌型细菌(特开昭57-18989)；对argininol有抗性的棒状杆菌型细菌(特开昭62-24075)；对X-胍有抗性的棒状杆菌型细菌(X代表脂肪酸或脂肪族链的衍生物，特开平2-186995)等等。此外，在L-精氨酸抑制物方面有缺陷的棒状杆菌型细菌(美国专利申请No.20020045233)，和具有提高的谷氨酸脱氢酶活性的棒状杆菌型细菌(欧洲专利申请公开1057893)也是用于L-精氨酸生产的合适的菌株。

具体地，实例包括黄色短杆菌AJ11169(FERMBP-6892)、谷氨酸棒杆菌AJ12092(FERMBP-6906)、黄色短杆菌AJ11336(FERMBP-6893)、黄色短杆菌AJ11345(FERMBP-6894)和乳发酵短杆菌AJ12430(FERMBP-2228)菌株。AJ11169和AJ12092菌株对2-噻唑丙氨酸有抗性(特开昭54-44096)。AJ11336菌株对argininol和磺胺嘧啶(sulfadiazine)有抗性(日本专利公开No.62-24075)。AJ11345菌株对arginino、2-噻唑丙氨酸和磺胺胍有抗性，且对组氨酸是营养缺陷的(特公昭62-24075)。AJ12430菌株对辛基胍(octylguanidine)和2-噻唑丙氨酸有抗性(特开平2-186995)。

谷氨酸棒杆菌AJ12092于1983年9月29日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(TsukubaCentral6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566，日本)，分配的登记号是FERMP-12092。之后，该保藏物于1999年10月1日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，分配的登记号是FERMBP-6906。

能生产L-精氨酸的埃希氏菌属细菌的实例包括用argA基因转化的大肠杆菌(参见特开昭57-5693)和大肠杆菌菌株237(俄国专利申请No.2000117677)，其是能够同化乙酸的突变菌株的生产L-精氨酸的衍生物。237菌株于2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNIIGenetika(地址：Russia,117545,Moscow，1Dorozhnyproezd,1)，分配编号VKPMB-7925。该保藏物于2001年5月18日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏。大肠杆菌菌株382是对L-精氨酸的反馈抑制有抗性的突变体(特开2002-017342号公报)，其是237菌株的衍生物，而且也可以采用。大肠杆菌菌株382于2000年4月10日以编号VKPMB-7926保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，于2001年5月18日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏。

能生产L-精氨酸的沙雷氏菌属细菌的实例包括粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，其不能分解L-精氨酸并对精氨酸拮抗剂和刀豆氨酸(canavanine)有抗性，并且对赖氨酸是营养缺陷的(参见日本专利Laid-openNo.52-8729)。

能生产L-组氨酸的棒状杆菌型细菌的实例包括属于短杆菌属对硫胺素拮抗剂有抗性的微生物，具体地，乳发酵短杆菌FERMP-2170、FERMP-2316、FERMP-6478、FERMP-6479、FERMP-6480和FERMP-6481菌株(特开昭59-63194)。此外，实例包括属于短杆菌属或棒杆菌属的突变菌株，其对聚酮化合物(polyketides)有抗性和L-组氨酸生产能力，具体地，FERMP-4161、FERMP-7273、FERMP-8371、FERMP-8372和ATCC14067菌株。

能生产L-组氨酸的埃希氏菌属细菌的实例包括属于埃希氏菌属对组氨酸类似物有抗性的突变菌株，例如，大肠杆菌R-344菌株，和用分离自菌株R-344的L-组氨酸合成系统酶基因转化的埃希氏菌属细菌。具体地，实例包括大肠杆菌NRRL-12116、NRRL-12118、NRRL-12119、NRRL-12120和NRRL-12121菌株(特开昭56-5099)。

能生产L-组氨酸的芽孢杆菌属细菌的实例包括属于芽孢杆菌属对组氨酸类似物有抗性的突变菌株，和用从这些突变菌株获得的基因转化的芽孢杆菌属细菌，所述基因涉及对组氨酸拮抗剂的抗性。具体地，实例包括FERMBP-218、FERMBP-224和FERMBP-219菌株(特开昭58-107192)。

含有通过本发明获得的碱性物质的发酵液或其处理物将含有碳酸根离子或碳酸氢根离子作为离解的碱性物质的反荷阴离子。当培养基被加热或浓缩时，或如果培养基的pH值通过添加强酸例如盐酸被降低时，这些碳酸根离子或碳酸氢根离子作为二氧化碳气体逸出。在发酵液或发酵产物中的固体成分之中碱性物质的相对量因而被提高。

根据本发明，通过使用碳酸氢根离子、碳酸根离子等来代替氯离子和硫酸根离子，氯离子的量可以甚至降低到不引起设备腐蚀的水平，或可以减少硫酸根离子。此外，在发酵之后，仅通过向培养基添加盐酸，碳酸氢根离子和碳酸根离子可以被氯离子取代，仅通过进一步浓缩培养基而不使用离子交换可以获得赖氨酸盐酸盐，并进一步，可以直接分离赖氨酸盐酸盐的晶体。

在本发明中，“发酵产物”包括从发酵液获得的浓缩物和干燥产物，和通过加工发酵液或其干燥产物获得的产物。

实施例

以下，将参考如下实施例更具体地说明本发明。

实施例1：生产L-赖氨酸的棒状杆菌型细菌的构建

将编码脱敏的天冬氨酸激酶的基因和编码赖氨酸分泌因子的基因导入野生棒状杆菌型细菌来制备生产L-赖氨酸的细菌。

(1)获取编码脱敏的天冬氨酸激酶的基因

通过PCR从生产L-赖氨酸的突变菌株AJ3463(FERMP-1987，参见特公昭51-34477)来分离编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶(Ask^*)的基因(lysC^*)，所述生产L-赖氨酸的突变菌株AJ3463通过诱变源自谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ATCC13869。

在CM-Dex培养基中培养AJ3463菌株，通过一般方法从获得的细胞提取染色体DNA(Biochem.Biophys.Acta.,72,619-629(1963))。通过使用这个染色体DNA作为模板，用在目标DNA片段的5′末端导入限制性酶BamHI位点的寡核苷酸ASK-F(SEQIDNO:1)和在目标DNA片段的3′末端导入限制性酶KpnI位点的寡核苷酸ASK-R(SEQIDNO:2)作为PCR的引物，扩增含有作为目标基因的lysC^*基因的DNA片段。为了扩增，将由98℃10秒的变性步骤、55℃30秒的退火步骤、72℃2分钟的延伸步骤组成的循环重复25次。根据厂家的说明书使用酶，PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzo)。

通过苯酚/氯仿处理和乙醇沉淀来纯化扩增的DNA片段，然后用限制性酶BamHI和KpnI消化。通过琼脂糖凝胶电泳展开(develop)获得的反应混合物，切下含有lysC^*基因的条带，通过常规方法纯化基因片段。

大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体pVK7(参见美国专利No.6,004,773)按类似的方式单独地用限制性酶BamHI和KpnI处理，并连接到上述lysC^*片段。根据厂家的规程用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo)的感受态细胞，选择几个卡那霉素抗性菌落。

通过将乳发酵短杆菌的隐蔽性质粒(crypticplasmid)pAM330连接到大肠杆菌的载体pHSG299(Km^r,参见Takeshita,S.等,Gene,61,63-74,(1987))来构建pVK7如下(参见特开平11-266881，国际专利公开WO99/07853)。从乳发酵短杆菌ATCC13869菌株制备pAM330。用AvaII(TakaraShuzo)消化pHSG299，其已经用T4DNA聚合酶平端化(blunt-ended)，然后用HindIII(TakaraShuzo)消化，并连接到用T4DNA聚合酶平端化的pAM330。因而，获得pVK7。pVK7可在大肠杆菌和乳发酵短杆菌的细胞中自主复制，并含有来自pHSG299的多克隆位点、lacZ’和卡那霉素抗性基因作为标记物。

按常规方式从如上所述获得的卡那霉素抗性菌落提取质粒DNA，将含有目标lysC^*基因的质粒称为pVK-C^*。

(2)获取编码赖氨酸分泌因子lysE的基因

通过使用来自乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，通过PCR分离lysE基因(参见美国专利申请No.2003113899)。已知lysE基因在棒杆菌属细菌中起作用来促进L-赖氨酸的分泌(国际专利公开9723597A2)。按与上述相同的方式制备菌株的染色体DNA。

将LysE-F(SEQIDNO:3)和LysE-R(SEQIDNO:4)用作引物。使用Pyrobest(TakaraShuzo)用94℃的热处理90秒并将以下循环重复30次来进行PCR：94℃变性20秒，55℃退火30秒和72℃延伸反应60秒。然后在72℃温育反应10分钟。通过这个反应获得了预计大小的DNA片段。纯化这个DNA片段，然后根据厂家的规程克隆到克隆载体pCR2.1(Invitrogene)中。根据厂家的规程用连接反应混合物转化大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo)的感受态细胞，并选择几个氨苄青霉素抗性菌落。从这些菌落提取质粒DNA，并将具有期望结构的质粒称为pCRlysE。

然后，用限制性酶BamHI和XbaI消化pCRlysE，进行琼脂糖凝胶电泳来获得含有lysE基因的片段。将大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体pKC(参见美国专利申请No.2003113899)按类似的方式单独用限制性酶BamHI和XbaI处理，并进行琼脂糖凝胶电泳来获得含有氯霉素抗性基因的基因片段。纯化这个基因，然后连接到上述lysE片段。通过使用这个连接反应混合物，根据厂家的规程转化大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo)的感受态细胞，并选择几个氯霉素抗性菌落。从如上所述获得的菌落制备质粒以获得LysE表达质粒plysE。

如下制备pKC4。具有源自已经获得的质粒pHM1519的复制起点的质粒pHK4(参见特开平5-7491)，该复制起点可在棒状杆菌型细菌中自主复制(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))，用限制性酶BamHI和KpnI消化来获得含有复制起点的基因片段。用DNABlunting试剂盒(TakaraShuzo)将获得的片段平端化，通过使用KpnI接头(TakaraShuzo)的连接来插入pHSG399(TakaraShuzo)的KpnI位点。根据厂家的规程用这个连接反应混合物转化大肠杆菌JM109菌株(TakaraShuzo)的感受态细胞，选择几个氯霉素抗性菌落。从如上所述获得的菌落制备质粒来获得pKC4。

(3)构建生产L-赖氨酸的棒状杆菌型细菌

以上描述的两个质粒pVK-C^*和plysE通过电穿孔导入乳发酵短杆菌ATCC13869菌株。通过使用GenePulser(BIO-RAD)进行电穿孔。电转杯中电极之间的距离是0.1cm，电脉冲施加条件是25μF、200Ω和1.8kV。在含有5μg/l氯霉素和25μg/l卡那霉素的CM-Dex琼脂平板(培养基的组成参见下文)上选择含有质粒的菌株。将含有质粒的菌株在含有5μg/l氯霉素和25μg/l卡那霉素的CM-Dex液体培养基中在31.5℃摇动培养过夜。在3ml培养基中在试管中摇动进行培养。

如下制备CM-Dex培养基。混合表1中列出的所有成分，用KOH调节到pH7.5，然后通过高压蒸锅在120℃灭菌20分钟。在琼脂培养基中，琼脂添加到20g/L的终浓度。

表1：CM-Dex培养基的成分(每1L)

(用灭菌的水添加到1L)

如上所述，获得生产L-赖氨酸的棒状杆菌型细菌ATCC13869/pVK-C^*,plysE。

实施例2：生产L-赖氨酸的细菌在碱性培养基中的生长，以及总氨浓度对L-赖氨酸生产的影响

通过使用实施例1中构建的生产L-赖氨酸的细菌，研究了在碱性培养基中不抑制L-赖氨酸生产力的总氨浓度。

首先，使用了常规的培养方法。也就是说，使用通过向培养基A(成分如表2所示)中相对葡萄糖加入55％(w/w)的硫酸铵而获得的培养基(培养基B)。在培养期间用氨气将培养基的pH值维持恒定，来进行L-赖氨酸发酵。pH值控制到7.0或8.0。

表2：培养基A成分(每1L)

葡萄糖	100g
		酵母提取物	10g
KH₂PO₄	1g
		MgSO₄·7H₂O	1g
维生素B1盐酸盐	2mg
		生物素	0.5mg
烟酰胺	5mg
		FeSO₄·7H₂O	10mg
MnSO₄·4H₂O～5H₂O	10mg

10％GD-113(消泡剂)

0.05mL

具体地，如下进行培养。将上述菌株接种到3mlCM-Dex液体培养基，在31.5℃摇动培养过夜，并将200μl培养基均匀地涂布在CM-Dex琼脂培养基上。在31.5℃静置培养过夜来进行培养。然后，将在一个平板上的琼脂培养基上生长的生产L-赖氨酸的细菌细胞的三分之一接种到釜式发酵器(jarfermenter)中300ml培养基B中，并进行培养。在培养期间，用300ml每分钟的过滤灭菌空气对培养基通气，将搅拌速度维持在700rpm，培养基的温度维持在31.5℃。结果在图1中示出。

结果，在pH7.0，积累了17.4g/L的L-赖氨酸，生产率是0.725g/Lhr。另一方面，在pH8.0，细胞几乎不存在生长，发酵不进行(图1)。

然后，使用上述生产L-赖氨酸的细菌在没有硫酸铵的培养基中进行发酵。

将上述菌株接种到3mlCM-Dex液体培养基中，在31.5℃摇动培养过夜，200μl培养基均匀地涂布在CM-Dex琼脂培养基上并在31.5℃放置过夜。将300ml培养基A(没有硫酸铵)置于釜式发酵器中，通过将氨气鼓泡通过培养基来调节pH值到7.8、8.2或8.9。将在一个平板上的琼脂培养基上生长的生产L-赖氨酸的细菌细胞的三分之一接种到培养基中，并进行培养。在培养期间，用300ml每分钟的过滤灭菌空气对培养基通气，搅拌速度维持在700rpm，培养基的温度在31.5℃维持恒定。在培养期间，通过将氨气鼓泡通过培养基来维持恒定的pH值。结果，证实的是，在pH8.9，在培养基中总氨浓度超过100mM之后，特别地，生长和L-赖氨酸生产被强烈抑制。

在上述培养方法中，随着培养的进行，由生产L-赖氨酸的细菌产生的二氧化碳气体溶于培养基中作为碳酸根离子或碳酸氢根离子，导致pH值下降。因此，将pH值控制在预定水平所必须添加的氨的量提高。此外，调节的培养基pH值水平越高，溶解的碳酸根离子和碳酸氢根离子的浓度越高，因此添加以将pH值调节到预定值的氨浓度越高。

未离解的氨容易地渗透细胞，引起细胞的细胞损伤。由于pH值越高氨的解离度越低，随pH值提高细菌的生长更加被抑制，即使总氨浓度被维持在恒定的水平。因此，可以断定，在pH8.9或更低时，如果控制总氨浓度很低，例如，100mM或更低，细菌生长和L-赖氨酸积累的抑制作用不显著。

然后，在将培养基中的总氨浓度控制在100mM或更低，在pH7.8、8.2和8.9时，进行生产L-赖氨酸的培养。

将上述菌株接种到3mlCM-Dex液体培养基中，在31.5℃摇动培养过夜，将200μl培养基均匀地涂布在CM-Dex琼脂培养基上并在31.5℃放置过夜。将300ml培养基A(没有硫酸铵)置于釜式发酵器中，通过将氨气鼓泡通过培养基来调节pH值到7.5、7.8或8.2。将在一个平板上的琼脂培养基上生长的生产L-赖氨酸的细菌细胞的三分之一接种到培养基中，并进行培养。在培养期间，用300ml每分钟的过滤灭菌空气对培养基通气，搅拌速度维持在700rpm，培养基的温度维持在31.5℃。在培养期间，用6N氢氧化钾代替氨将pH值维持在各个预定水平。

对培养基周期性地取样，通过使用氨电极和离子计(Orion)来测量培养基中的总氨浓度。根据需要通过添加10％氨水溶液将总氨浓度控制到0到100mM之内。此外，通过监测培养基中的溶解氧浓度，当氨被耗尽时检测到溶解氧浓度的急剧增加。当这发生时，添加10％氨水溶液以防止培养基中氨的继续耗尽。结果在图2中示出。

结果，在从7.8到8.9的所有pH值水平观察到了良好的生长和L-赖氨酸生产。与使用常规培养方法在pH7.0进行的发酵相比，观察到115％或更高的生产率。

实施例3：L-赖氨酸的生产

在这个实施例中，通过仅控制总氨浓度，而不是控制pH值来进行L-赖氨酸发酵。总氨浓度的范围被维持在100mM或更低。根据实施例2中结果选择这个范围。

将上述菌株接种到3mlCM-Dex液体培养基中，在31.5℃摇动培养过夜，将200μl培养基均匀地涂布在CM-Dex琼脂培养基上并在31.5℃放置过夜。将300ml培养基A(没有硫酸铵)置于釜式发酵器中，通过将氨气鼓泡通过培养基来将培养基的总氨浓度调节到23.8mM。将在一个平板上的琼脂培养基上生长的生产L-赖氨酸的细菌细胞的三分之一接种到培养基中，并进行培养。在培养期间，用300ml每分钟的过滤灭菌空气对培养基通气，搅拌速度维持在700rpm，培养基的温度维持在31.5℃。周期性地对培养基取样并测量总氨浓度，根据需要将合适量的10％氨水添加给培养基从而使总氨浓度维持在0到100mM之间。结果，积累了15.9g/L的赖氨酸，L-赖氨酸发酵得以进行(图3)。

实施例4：生产L-赖氨酸的大肠杆菌细菌的构建

<1>构建在其中编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因被破坏的菌株

首先构建赖氨酸脱羧酶缺陷菌株。赖氨酸脱羧酶由cadA基因(Genbank登录号NP_418555，SEQIDNO:15)和ldcC基因(Genbank登录号NP_414728，SEQIDNO:17)编码(参见国际专利公开WO96/17930)。在这个实施例中，WC196菌株用作亲本菌株。

通过使用由Datsenko和Wanner首先开发的称为“Red-驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645)和源自λ噬菌体的切除系统(J.Bacteriol.,2002Sep.,184(18):5200-3，Interactionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephagelambdaexcisivenucleoproteincomplex,ChoEH,GumportRI,GardnerJF)，来缺失编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因。根据“Red驱动整合”方法，使用合成的寡核苷酸引物获得的PCR产物，所述引物中目标基因的部分被设计在5′端，而抗生素抗性基因的部分被设计在3’端，可以用于一步获得破坏基因的菌株。此外，通过组合使用来自λ噬菌体的切除系统，可以消除已经整合到破坏基因的菌株中的抗生素抗性基因(特开2005-058227)。

(1)破坏cadA基因

将质粒pMW118-attL-Cm-attR(特开2005-058827)用作PCR中的模板。通过在pMW118(TakaraBio)中插入attL和attR基因以及cat基因来获得pMW118-attL-Cm-attR，attL和attR基因是λ噬菌体的附着位点，cat基因是抗生素抗性基因。插入的顺序是attL-cat-attR。

用如SEQIDNO:11和12所示的合成寡核苷酸引物进行PCR，它们在引物的3′端具有相应于attL和attR的两端的序列，并在5′端具有相应于目标cadA基因的一部分的序列。

在琼脂糖凝胶上纯化扩增的PCR产物，并通过电穿孔导入大肠杆菌WC196菌株中，上述大肠杆菌WC196菌株含有温度敏感性可复制的质粒pKD46。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645含有λ噬菌体的2154核苷酸的DNA片段，其中含有阿拉伯糖-可诱导的ParaB启动子(GenBankEMBL登录号J02459，位置31088到33241的核苷酸)控制下的编码λRed同源重组系统的Red重组酶的基因(λ、β、exo基因)。质粒pKD46是将PCR产物整合到WC196菌株的染色体中所需的。

用于电穿孔的感受态细胞如下制备。也就是说，将在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中30℃培养过夜的大肠杆菌WC196菌株用含氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mLSOB培养基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,J.等,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))稀释100倍。使稀释的培养物中的细胞在30℃通气生长直到OD600达到约0.6，然后将培养物浓缩100倍，并用10％甘油洗涤三次，使得细胞可以用于电穿孔。通过使用70μl的感受态细胞和约100ngPCR产物进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞添加到1mLSOC培养基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,Sambrook,J.等,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))，在37℃培养2.5小时，然后在37℃在含有25mg/LCm(氯霉素)的L琼脂培养基上平板培养，选择Cm抗性重组体。然后，为了除去pKD46质粒，细胞在含有Cm的L琼脂培养基上在42℃传代培养两次，检查菌落的氨苄青霉素抗性来获得没有pKD46的氨苄青霉素敏感菌株。

通过PCR确认在氯霉素抗性基因的基础上鉴定的突变体中cadA基因的缺失。获得的cadA缺陷菌株被称为WC196ΔcadA::att-cat菌株。

然后，为了除去已经被导入cadA基因的att-cat基因，使用辅助质粒pMW-intxis-ts(特开2005-058827)。pMW-intxis-ts携带编码整合酶(Int)的基因和编码λ噬菌体的切除酶(excisionase)(Xis)的基因，并且是温度敏感性可复制的。

按常规方式制备以上获得的WC196ΔcadA::att-cat菌株的感受态细胞，用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在含有50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂培养基上在30℃作为平板培养来进行培养，并选择氨苄青霉素抗性菌株。

然后，为了除去pMW-intxis-ts质粒，选择的菌株在42℃在L-琼脂培养基上传代培养两次，并检查获得的菌落的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性来获得没有att-cat和pMW-intxis-ts的氯霉素和氨苄青霉素敏感性的破坏cadA的菌株。这个菌株被称为WC196ΔcadA。

(2)从WC196ΔcadA菌株缺失ldcC基因

根据上述方法使用SEQIDNO:13和14的引物作为用于破坏ldcC的引物来从WC196ΔcadA菌株缺失ldcC基因。从而获得破坏cadA和ldcC的菌株WC196ΔcadAΔldcC。

<2>将用于Lys生产的质粒导入WC196ΔcadAΔldcC菌株

用携带dapA、dapB和lysC基因以用于生产Lys的质粒pCABD2(国际专利公开WO01/53459)按常规方式转化WC196ΔcadAΔldcC菌株来获得WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株(WC196LC/pCABD2)。

实施例5：使用大肠杆菌生产L-赖氨酸

这个实施例显示了应用来通过大肠杆菌生产L-赖氨酸的本发明的实施例。在这个实施例中，通过发酵生产L-赖氨酸而不添加硫酸铵和氯化铵，它们一般被添加到培养基目的是在L-赖氨酸发酵生产中提供氮和L-赖氨酸的反荷离子。具体地，进行培养，不控制pH值，但控制培养基中的氨浓度。预先检查培养基中氨浓度应当控制的范围。结果，确认了总氨浓度优选在50到100mM的范围内。因此，在实际的主培养(mainculture)中，通过氨气鼓泡将总氨浓度控制为100mM或更低。此外，当总氨浓度降低到50mM时，用氨气控制来维持该浓度。

将WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2用于赖氨酸生产。使用置于釜式发酵器中的表3中所示用于大肠杆菌的300ml的L-赖氨酸生产培养基。通过氨气鼓泡将总氨浓度调节到95mM。通过在含有20μg/L链霉素的LB琼脂培养基的完整表面上涂布生产L-赖氨酸的菌株，并将它在37℃培养24小时获得的细胞，接种到这个培养基中。接种的细胞的量相应于在三个琼脂培养基平板上生长的细胞。培养基的温度维持在37℃、过滤灭菌的空气每分钟50ml的通气、700rpm的搅拌速度，进行培养。当培养基中溶解氧浓度降低到20％饱和度时，通气速度变为100mL每分钟。表4中所示的大肠杆菌的补料溶液适当地逐滴添加到培养基中，使得葡萄糖不被耗尽，而且在培养基中其浓度不变为30g/L或更高。最后，当消耗了36g葡萄糖时，终止培养。结果，可以顺利地进行培养，从而在33小时后所有添加的葡萄糖被消耗，积累了13.4g的L-赖氨酸，L-赖氨酸的生产速率(productionrate)是1.2g/L/hr。这种生产的得率(yield)是37％。

作为对照，显示了用相同菌株通过添加硫酸铵而不是控制总氨浓度，但控制pH值，类似于碱性氨基酸的常见生产方法而进行的L-赖氨酸生产的结果。按类似方式将相同菌株接种到培养基中，所述培养基由添加了13g/L硫酸铵的表3中所示用于大肠杆菌的L-赖氨酸生产培养基组成，通过适当的氨气鼓泡将pH值控制恒定在6.7的同时来培养。培养温度、通气速度和搅拌速度与上述的那些情况相同。在这种情况下，加入添加有112.5g/L硫酸铵的用于大肠杆菌的补料溶液(含有硫酸铵，表5)代替表4所示用于大肠杆菌的补料溶液，使得葡萄糖不被耗尽，培养基中葡萄糖浓度不应变为30g/L或更高，最后消耗了36g葡萄糖。结果，在33小时后所有添加的葡萄糖被消耗，积累了14.7g的L-赖氨酸，L-赖氨酸的生产率是1.3g/L/hr。这种生产的得率是40％。

所有如上所述的赖氨酸浓度按照赖氨酸盐酸盐来显示。此外，培养期间总氨浓度和pH值随时间的变化在图4中示出。根据这些结果的比较，确认的是，当使用本发明的方法时，与添加硫酸铵的常见发酵生产中获得的情况相比，可以以约92％的生产速率、约93％的得率和约91％的L-赖氨酸生产量进行L-赖氨酸发酵生产而不添加硫酸铵或氯化铵。

表3：用于大肠杆菌的L-赖氨酸生产培养基的成分(每1L)

葡萄糖	30g
		KH₂PO₄	1g
MgSO₄·7H₂O	1.2g
		豆浓(大豆蛋白水解物，按照氮重量换算)	0.77g
FeSO₄·7H₂O	30mg
		MnSO₄·4H₂O～5H₂O	30mg
对-氨基苯甲酸	2mg
		L-苏氨酸	300mg
DL-甲硫氨酸	200mg
		胱氨酸	150mg
甜菜碱	3.5g
		GD-113(消泡剂)	0.01mL

将葡萄糖和FeSO₄·7H₂O称重作为部分A，将其他成分称重作为部分B，并将部分A按照原样，将部分B调节到pH5.0，通过高压蒸锅在115℃单独灭菌10分钟，然后混合。将20μg/L的链霉素在使用前添加到培养基中。

表4：用于大肠杆菌的补料溶液的成分(每1L)

葡萄糖	561g
		GD-113	7μl
KH₂PO₄	1.48g
		L-Thr	0.44g

成分通过高压蒸锅在120℃灭菌20分钟。

将20μg/L链霉素在使用前添加到培养基中。

表5：含有硫酸铵的用于大肠杆菌的补料溶液的成分(每1L)

葡萄糖	561g
		GD-113	7μl
KH₂PO₄	1.48g
		L-thr	0.44g
(NH₄)₂SO₄	112.5g/L

成分通过高压蒸锅在120℃灭菌20分钟。

将20μg/L链霉素在使用前添加到培养基中。

实施例6：L-精氨酸的生产

这个实施例显示了应用来通过棒状杆菌型细菌生产L-精氨酸的本发明的实施例。将谷氨酸棒杆菌AJ12092(FERMBP-6906)用作生产L-精氨酸的菌株。

首先，作为对照，显示了用相同菌株通过添加硫酸铵不控制总氨浓度，但控制pH值，类似于碱性氨基酸的常见生产方法而进行的L-精氨酸生产的结果。具有表6所示成分的用于L-精氨酸生产的培养基，添加了65g/L硫酸铵，并且，葡萄糖浓度变为40g/L。将300ml这种培养基置于釜式发酵器中，并通过氨气鼓泡将pH值控制为7.0。通过在CM-Dex琼脂培养基的全表面上涂布谷氨酸棒杆菌AJ12092菌株，31.5℃培养24小时获得的两个平板的细胞接种到这个培养基中。在维持31.5℃的培养基温度，以过滤灭菌空气的150ml每分钟通气和700rpm速度的搅拌进行培养。此外，在培养期间，通过添加已经单独灭菌的6NKOH溶液将pH值控制为6.9。随着培养的进展，葡萄糖浓度降低。为了维持葡萄糖浓度在30到40g/L，适当地添加单独灭菌的692g/L葡萄糖溶液。培养进行54小时。结果，积累了23.4g/L的L-精氨酸，L-精氨酸的产物得率是消耗的葡萄糖的26.7％，生产速率是0.43g/L/hr。在培养期间消耗的葡萄糖数量是每个分批29.1g。

然后不向培养基添加硫酸铵，同时仅控制总氨浓度但不控制pH值，进行L-精氨酸的生产。以下显示了结果。将300ml具有表6所示成分但不含有硫酸铵的L-精氨酸生产培养基置于釜式发酵器中，通过氨气鼓泡将总氨浓度调节到12.6mM。将以与对照相同的方式培养的生产L-精氨酸的菌株的两个平板的细胞接种到这个培养基中。按照与对照相同的方式进行培养，并维持温度在31.5℃、150ml每分钟过滤灭菌空气的通气，及维持搅拌速度在700rpm。通过周期性地对培养基采样并测量培养基的总氨浓度或使用氨浓度控制装置，控制培养基中的总氨，从而在培养期间它处在各种水平。结果，证实了根据需要通过添加氨气控制培养基中总氨浓度为约20mM提供了有利的结果。基于上述结果控制培养基中总氨浓度为约20mM进行的培养顺利地进行，在51小时后积累了24.2g/L的L-精氨酸，因而完成了L-精氨酸发酵。培养期间消耗的葡萄糖是每个分批35.1g，L-精氨酸的产物得率是消耗的葡萄糖的20.6％，生产速率是0.47g/L/hr。此外，培养基的pH值从开始时的7.92提高到培养结束时的8.02。

根据这些结果与对照实验的结果的比较，证实了与添加硫酸铵的常见发酵生产中获得的情况相比，不添加硫酸铵或氯化铵可以以约77％的收率和高出约9％的生产速率进行L-精氨酸的发酵生产。

表6：L-精氨酸生产培养基的成分(每1L)

葡萄糖	150g
		KH₂PO₄	1g
MgSO₄·7H₂O	0.4g
		豆浓(大豆蛋白水解物，按照氮重量换算)	0.23g
维生素B1盐酸盐	0.5mg
		生物素(biotin)	0.5mg
FeSO₄·7H₂O	10mg

MnSO₄·4H₂O～5H₂O	10mg
		GD-113(消泡剂)	0.05mL

用氢氧化钾水溶液调节培养基到pH7.0，直至1L，通过高压蒸锅在115℃灭菌10分钟。

序列表的说明

SEQIDNO:1：用于克隆lysC基因的引物序列

SEQIDNO:2：用于克隆lysC基因的引物序列

SEQIDNO:3：用于克隆lysE基因的引物序列

SEQIDNO:4：用于克隆lysE基因的引物序列

SEQIDNO:5：lycC^*基因的核苷酸序列和抑制作用脱敏的天冬氨酸激酶的α-亚基的氨基酸序列

SEQIDNO:6：抑制作用脱敏的天冬氨酸激酶的α-亚基的氨基酸序列

SEQIDNO:7：lycC^*基因的核苷酸序列和抑制作用脱敏的天冬氨酸激酶的β-亚基的氨基酸序列

SEQIDNO:8：抑制作用脱敏的天冬氨酸激酶的β-亚基的氨基酸序列

SEQIDNO:9：lysE基因的核苷酸序列和LysE蛋白的氨基酸序列

SEQIDNO:10：LysE蛋白的氨基酸序列

SEQIDNO:11：用于破坏cadA基因的引物

SEQIDNO:12：用于破坏cadA基因的引物

SEQIDNO:13：用于破坏ldc基因的引物

SEQIDNO:14：用于破坏ldc基因的引物

SEQIDNO:15：cadA基因的核苷酸序列和赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列

SEQIDNO:16：赖氨酸脱羧酶(cadA)的氨基酸序列

SEQIDNO:17：ldc基因的核苷酸序列和赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列

SEQIDNO:16：赖氨酸脱羧酶(ldc)的氨基酸序列

工业实用性

根据本发明，通过甚至在高pH值下发酵可以产生碱性物质，其允许降低工业原料例如硫酸铵的量，而不明显地降低常规的普通培养方法原本的性能，例如生产力。

虽然通过本发明的方法获得的发酵液含有碳酸根离子和/或碳酸氢根离子，这些通过加热容易地逸出到空气中，因而可以获得具有作为固体出现的大量碱性物质的发酵液或发酵产物。此外，当需要纯化时，如果将比碳酸更强的酸添加到发酵液，可以容易地用更强的酸取代碳酸盐而不用进行常规生产方法中通常进行的离子交换。此外，赖氨酸盐酸盐的晶体可以通过浓缩发酵液直接获得。

Claims

1.一种通过发酵来生产碱性氨基酸的方法，包括在发酵罐中含有的液体培养基中培养具有生产所述碱性氨基酸的能力的微生物，从而在所述培养基中产生和积累所述碱性氨基酸，其中在所述培养过程的总时期的至少一部分期间通过将所述培养基中总氨浓度调节到特定浓度范围之内，来降低用作所述碱性氨基酸的反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的量，其中所述总时期的至少一部分包括下列中的至少一个：由于所述目标碱性氨基酸的积累引起的反荷离子的不足而使所述培养基的pH值提高的时期，和由于向所述培养基添加阳离子而使所述pH值提高的时期，

其中所述总氨浓度的特定浓度范围是满足以下条件的范围：

(A)所述培养基中铵离子的浓度是这样的水平，使得溶于所述培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子以及其他阴离子的离子当量的总和大于所述培养基中积累的所述碱性氨基酸中电离的所述碱性氨基酸的离子当量，以及

(B)所述培养基中所述总氨浓度是不抑制所述微生物的碱性氨基酸生产的水平，其是如下预先确定的：

(A’)在培养基中进行培养，所述培养基含有其量足以在pH7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子作为所述目标碱性氨基酸的反荷离子的来源，通过添加氨气、氨水和尿素的至少一种来将所述培养基的pH值维持在6.5到7.2之间的范围内，并测量所述碱性氨基酸的生产力，

(B’)在与步骤(A’)中使用的培养基相同的培养基中开始培养，只是培养基成分的硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量，在一定时期内用不同的总氨浓度继续进行培养，在所述时期内由于所述目标碱性氨基酸的积累引起的作为碱性氨基酸反荷离子的硫酸根离子和/或氯离子的不足，维持所述培养基的pH值到7.2或更低变得不可能，以根据步骤(A’)中测量的生产力来确定提供了50％或更高生产力的总氨浓度范围。

2.根据权利要求1的方法，其中当根据如下指标所测定的所述微生物的活性降低或停止时，通过向所述培养基添加氨或尿素来调节所述培养基中的总氨浓度，所述指标是：所述培养基中溶解的氧浓度、所述培养基中碳源的消耗率、所述培养基的混浊度、所述碱性氨基酸的生产力、和所述培养基中的pH值变化。

3.根据权利要求1的方法，其中将与含有其量足以在pH值7.2或更低的条件下进行培养的硫酸根离子和/或氯离子作为所述碱性氨基酸的反荷离子来源的培养基具有相同组分、只是将硫酸根离子和/或氯离子降低期望的量的培养基用作培养基，以及

所述总时期的至少一部分是一个时期，在所述时期中由于所述培养基中积累的碱性氨基酸引起的反荷离子不足，所述培养基的pH值不能被维持在7.2或更低。

4.根据权利要求1的方法，其中所述其他阴离子选自硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子和电离的有机酸。

5.根据权利要求1或4的方法，其中所述其他阴离子的总量是900meq/l或更低。

6.根据权利要求1的方法，其中所述培养基中的所述总氨浓度被调节到300mM或更低。

7.根据权利要求6的方法，其中所述培养基中的所述总氨浓度被调节到200mM或更低。

8.根据权利要求6或7的方法，其中所述培养基中的所述总氨浓度被调节到100mM或更低。

9.根据权利要求1的方法，其包括增殖所述微生物的步骤。

10.根据权利要求9的方法，其中在增殖所述微生物的所述步骤期间不调节所述总氨浓度。

11.根据权利要求1的方法，其中所述碱性氨基酸选自L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。

12.根据权利要求11的方法，其中所述碱性氨基酸是L-赖氨酸。

13.根据权利要求11的方法，其中所述碱性氨基酸是L-精氨酸。

14.根据权利要求1的方法，其中所述培养基或其处理物在发酵之后被加热以除去碳酸氢根离子和碳酸根离子。

15.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是棒状杆菌型细菌或大肠杆菌。

16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中所述方法产生发酵产物，所述发酵产物包括从发酵液获得的浓缩物和干燥产物，和通过加工发酵液或其干燥产物获得的产物。

17.含有碱性氨基酸的发酵液，其可以通过如下方法获得，所述方法包括：

i)在发酵罐中含有的液体培养基中培养具有生产所述碱性氨基酸的能力的微生物，从而在所述培养基中产生和积累所述碱性氨基酸，

其中所述微生物是棒状杆菌型细菌或大肠杆菌细菌，

其中将糖、醇或烃类用作碳源，

其中所述培养基中不加入硫酸铵或氯化铵，而且在选自如下的时期期间通过将所述培养基中总氨浓度调节到200mM或更低，来降低用作所述碱性氨基酸的反荷离子的硫酸根离子或氯离子的量：

(A)由于所述碱性氨基酸的积累引起的反荷离子的不足而使所述培养基的pH值提高的时期，和

(B)由于向所述培养基添加阳离子而使所述pH值提高的时期；和

ii)在发酵之后加热所述培养基或其处理物以除去碳酸氢根离子和碳酸根离子。

18.从权利要求17的发酵液获得的浓缩物或干燥产物。