ES2718638T3

ES2718638T3 - Procedimiento enzimático para producir aminoácidos básicos

Info

Publication number: ES2718638T3
Application number: ES05790247T
Authority: ES
Inventors: Ryo Takeshita; Shinichi Sugimoto
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-10-07
Filing date: 2005-10-07
Publication date: 2019-07-03
Anticipated expiration: 2025-10-07
Also published as: ES2941685T3; KR20090023513A; PL2818556T3; US8198053B2; EP2818554A3; US20070243590A1; CN103088080B; JP4844396B2; EP2818555A3; EP2818555A2; EP1813677A4; BRPI0516261A; CA2813540A1; ES2946983T3; EP2818556A2; KR100921644B1; US20100273221A1; JPWO2006038695A1; RU2350655C2; KR20070061587A

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento enzimático para producir aminoácidos básicos

Campo técnico

La presente invención se refiere a una técnica para la industria microbiana, más precisamente, a un método para producir un aminoácido básico. Por ejemplo, la L-lisina es útil como aditivo para pienso para animales, y la L-arginina y L-histidina son útiles para preparaciones farmacéuticas tales como infusiones.

Técnica antecedente

En los métodos para producir sustancias básicas por fermentación, se cultivan microorganismos que tienen la capacidad de producir una sustancia básica para producir y acumular la sustancia básica en un medio, y la sustancia básica se recoge del medio. En tales métodos, el cultivo se realiza como cultivo discontinuo, cultivo de alimentación o cultivo continuo.

En tal producción de sustancias básicas por fermentación, se han añadido normalmente iones sulfato o cloruro al medio como contraiones para una sustancia objetivo que se disocia para dar un catión en el medio con el fin de mantener el pH del medio en un nivel neutro (patente japonesa abierta a consulta por el público (Kokai) n.os 5-30985 y 5-244969).

En muchos casos, las sustancias básicas se recogen del medio por intercambio iónico, cuando se requiere purificación. Por ejemplo, en el caso de la L-lisina, después de que el caldo de fermentación se haga débilmente ácido, la L-lisina se adsorbe en una resina de intercambio iónico y luego se eluye de la resina con iones amonio. La L-lisina eluida se usa tal cual como base de lisina o puede cristalizarse con ácido clorhídrico para formar clorhidrato de L-lisina.

Cuando se usan iones cloruro como contraiones en el medio en la purificación de L-lisina mencionada anteriormente, puede obtenerse directamente clorhidrato de L-lisina concentrando el medio. Sin embargo, dado que los iones cloruro corroen los tanques de fermentación metálicos, etc., no es preferible que existan en el medio en alta concentración en la producción real.

Por otro lado, cuando la sustancia básica no se purifica, el caldo de fermentación se concentra tal cual, o se hace débilmente ácido con ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, seguido de granulación por pulverización. En este caso, los componentes residuales contienen los contraiones aniones añadidos al medio y, por tanto, la cantidad de la sustancia básica se reduce en el producto de fermentación resultante.

La patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2002-65287 (solicitud de patente estadounidense n.° 2002025564) divulga un método de utilización, en la producción de un aminoácido básico por fermentación, de iones carbonato y bicarbonato como contraiones del aminoácido básico para sustituir una parte de los iones sulfato o cloruro. Los iones carbonato y bicarbonato pueden eliminarse de manera comparativamente fácil del medio de cultivo haciendo que el pH del medio sea ácido, o concentrando el medio, o ambos. La publicación citada anteriormente enseña un método de control de la presión interna en el tanque de fermentación de modo que sea positiva durante la fermentación, o de adición de gas dióxido de carbono o un gas mixto que contiene dióxido de carbono al medio, como medio para añadir iones carbonato e iones bicarbonato al medio. Sin embargo, en condiciones de medio típicas, tales como un pH neutro, sólo una pequeña cantidad de gas dióxido de carbono se disuelve, si es que se disuelve. Por tanto, para mantener la presencia de iones bicarbonato y carbonato en el medio de cultivo de modo que se mantenga el efecto de reducir la concentración de iones sulfato o cloruro, el cultivo debe realizarse a un pH alcalino. Sin embargo, si el pH aumenta, la tasa de crecimiento bacteriano y la productividad de la sustancia objetivo generalmente se reducen.

Divulgación de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para lograr tanto la reducción de iones sulfato e iones cloruro como la producción eficaz de un aminoácido objetivo en la producción de un aminoácido básico mediante fermentación usando un microorganismo que tiene la capacidad de producir el aminoácido básico objetivo y utilizando iones carbonato e iones bicarbonato como contraaniones del aminoácido básico evitando la reducción de la velocidad de crecimiento del microorganismo o la reducción de la productividad del aminoácido objetivo.

Cuando se usan bacterias de Escherichia o corineformes para producir aminoácidos básicos mediante fermentación, si el pH se vuelve demasiado alto, la velocidad de crecimiento bacteriano o la productividad del aminoácido objetivo habitualmente se reduce. Los inventores de la presente invención encontraron que el factor principal que provoca este fenómeno es el amoniaco, que se añade al medio como fuente de nitrógeno para la producción de la sustancia básica, para el crecimiento bacteriano, o como fuente de contraiones del aminoácido básico, y la reducción de la velocidad de crecimiento del microorganismo o la productividad del aminoácido objetivo en una condición de pH alto podría suprimirse notablemente realizando la fermentación con el control de la concentración de amoniaco total para que esté dentro de un intervalo de concentración adecuado.

La presente invención se logró basándose en los hallazgos mencionados anteriormente.

Es decir, la presente invención proporciona lo siguiente.

1. Un método para producir un aminoácido básico mediante fermentación que comprende cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir el aminoácido básico en un medio líquido contenido en un tanque de fermentación para producir y acumular el aminoácido básico en el medio;

en el que la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usados como contraiones de dicho aminoácido básico se reduce ajustando la concentración de amoniaco total en el medio para que esté dentro de un intervalo de concentración específico de 300 mM o menos durante al menos una parte del periodo total del procedimiento de cultivo;

en el que la al menos parte del periodo total incluye un periodo en el que el pH del medio aumenta debido a la escasez de los contraiones provocada por la acumulación de dicho aminoácido básico; y

en el que el microorganismo es una bacteria corineforme o una bacteria de Escherichia coli.

2. El método según el punto 1, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta añadiendo amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa tal como se determina basándose en los indicadores: concentración de oxígeno disuelto en el medio, velocidad de consumo de la fuente de carbono en el medio, turbidez del medio, productividad del aminoácido básico y cambio de pH en el medio.

3. El método según el punto 1, en el que se usa como medio un medio que tiene un medio que tiene la misma composición que la de un medio que contiene iones sulfato y/o iones cloruro como fuente de contraiones del aminoácido básico en una cantidad suficiente para realizar el cultivo a pH 7,2 o inferior, excepto porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro se reduce en una cantidad deseada, y la al menos una parte del periodo total es un periodo en el que el pH del medio no puede mantenerse para que esté a 7,2 o inferior debido a la escasez de contraiones para el aminoácido básico que se ha acumulado en el medio.

4. El método según el punto 1, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para que esté a 200 mM o inferior.

5. El método según los puntos 1 o 4, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para que esté a 100 mM o inferior.

6. El método según el punto 1, que comprende la etapa de hacer que el microorganismo prolifere.

7. El método según el punto 6, en el que la concentración de amoniaco total no se ajusta durante la etapa de hacer que el microorganismo prolifere.

8. El método según el punto 1, en el que el aminoácido básico se selecciona de L-lisina, L-arginina y L-histidina. 9. El método según el punto 8, en el que el aminoácido básico es L-lisina.

10. El método según el punto 8, en el que el aminoácido básico es L-arginina.

11. El método según el punto 1, en el que el medio o un producto procesado del mismo se calienta después de la fermentación para eliminar iones bicarbonato e iones carbonato.

12. El método según uno cualquiera de los puntos mencionados anteriormente, en el que dicho método da como resultado un producto de fermentación que incluye concentrado y producto secado obtenidos del caldo de fermentación, y productos obtenidos procesando el caldo de fermentación o producto secado del mismo.

13. El método según uno cualquiera de los puntos 1 a 12, en el que la bacteria corineforme es Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium lactofermentum.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados del cultivo para la producción de L-lisina realizada usando un medio convencional y el método de cultivo.

La figura 2 muestra los resultados del cultivo para la producción de L-lisina realizada en un medio con una concentración de amonio limitada.

La figura 3 muestra los resultados del cultivo para la producción de L-lisina realizada controlando sólo la concentración de amoniaco total y sin controlar el pH.

La figura 4 muestra cambios de la concentración de amoniaco total y el pH a lo largo del tiempo en un medio convencional y un medio sin sulfato de amonio y cloruro de amonio.

La figura 5 muestra los cambios en el crecimiento, la concentración de amoniaco total, el pH y la cantidad de azúcar restante a lo largo del tiempo en la fermentación de L-arginina en un medio con una concentración de amonio limitada.

La figura 6 muestra los resultados de un cultivo para la producción de L-arginina en un medio con una concentración de amonio limitada.

Realizaciones preferidas de la invención

A continuación en el presente documento, la presente invención se explicará en detalle.

El método de la presente invención es un método para producir un aminoácido básico mediante fermentación, que comprende cultivar un microorganismo que es capaz de producir el aminoácido básico en un medio líquido contenido en un tanque de fermentación para producir y acumular el aminoácido básico en el medio tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones. El método de la presente invención se caracteriza porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usados como contraiones del aminoácido básico se reduce ajustando la concentración de amoniaco total en el medio para que esté dentro de un intervalo de concentración específico de 300 mM o inferior durante al menos una parte del periodo total del procedimiento de cultivo. Es decir, el método de la presente invención es un método para producir el aminoácido básico en el medio en el que se reducen los iones sulfato e iones cloruro usando una concentración de amoniaco total tal que el amoniaco total se garantiza en una cantidad requerida para el crecimiento del microorganismo o la producción del aminoácido básico objetivo como fuente de nitrógeno, y el crecimiento del microorganismo o la producción del aminoácido básico objetivo no se inhibe.

Los ejemplos del intervalo específico de la concentración de amoniaco total incluyen un intervalo que satisface las siguientes condiciones:

(A) la concentración de iones amonio en el medio es a un nivel tal que la suma de los equivalentes iónicos de iones bicarbonato y/o carbonato, y otros aniones disueltos en el medio es mayor que el equivalente iónico de la sustancia básica ionizada a partir de la sustancia básica acumulada en el medio, y

(B) la concentración de amoniaco total en el medio está a un nivel que no inhibe la producción de la sustancia básica por el microorganismo, que se determina de antemano tal como sigue: el microorganismo se cultiva en el medio que tiene diversos valores de pH y diversas concentraciones de amoniaco total, la productividad de la sustancia básica se mide a cada valor de pH y cada concentración de amoniaco total, y se determina la concentración de amoniaco total que proporciona el 50 % o más de productividad de la sustancia básica basándose en la productividad obtenida en condiciones óptimas para cada valor de pH.

Además, el intervalo específico de la concentración de amoniaco total puede determinarse de antemano tal como sigue.

(A') (Procedimiento 1: Evaluación del resultado de la fermentación en condición neutra)

El cultivo se realiza en un medio que contiene una cantidad de iones sulfato y/o cloruro que es suficiente para realizar el cultivo a pH 7,2 o inferior como fuente de contraiones del aminoácido básico objetivo, cuyo pH se mantiene para que esté en el intervalo entre 6,5 y 7,2 añadiendo al menos uno de gas amoniaco, amoniaco acuoso y urea, y se mide la productividad del aminoácido básico.

(B') (Procedimiento 2: Evaluación de los resultados de la fermentación con una cantidad reducida de iones sulfato e iones cloruro a diversas concentraciones de amonio)

El cultivo se inicia en el mismo medio que el usado en el procedimiento 1 (etapa A') descrito anteriormente, excepto porque los iones sulfato y/o cloruro de los componentes del medio son inferiores en una cantidad deseada, y el cultivo continúa con diversas concentraciones de amoniaco total durante un período en el que resulta imposible mantener el pH del medio a 7,2 o inferior debido a la escasez de iones sulfato y/o iones cloruro como contraiones de la sustancia básica provocada por la acumulación del aminoácido básico objetivo para determinar el intervalo de concentración de amoníaco total que proporciona el 50 % o más de productividad basándose en la productividad medida en la etapa (A').

Además, cuando el intervalo específico de concentración de amoniaco total no se determina de antemano, la concentración de amoniaco total puede ajustarse para que esté dentro del intervalo predeterminado. Específicamente, la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta añadiendo amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa tal como se determina basándose en la concentración de oxígeno disuelto en el medio, la velocidad de consumo de la fuente de carbono en el medio, la turbidez del medio, la productividad del aminoácido básico y el cambio de pH en el medio observado como índices. El medio tiene la misma composición que la de un medio que contiene iones sulfato y/o iones cloruro como fuente de contraiones de la sustancia básica en una cantidad suficiente para realizar el cultivo a pH 7,2 o inferior excepto porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro se reduce en una cantidad deseada. Los ejemplos de la al menos una parte del periodo total incluyen un periodo cuando el pH del medio no puede mantenerse para que esté a 7,2 o inferior debido a la escasez de contraiones para el aminoácido básico que se ha acumulado en el medio.

Los ejemplos de los otros aniones incluyen iones cloruro, iones sulfato, iones fosfato, iones de ácidos orgánicos (ácido acético, ácido láctico, ácido succínico etc.), y así sucesivamente. Además, iones bicarbonato y/o iones carbonato disueltos en el medio funcionan como contraaniones del aminoácido básico.

En la presente invención, un equivalente iónico es un valor obtenido multiplicando la concentración molar de cada ion por la valencia del ión, y se representa en una unidad de eq/l. Es decir, el equivalente iónico de 1 mM de un ión monovalente es 1 meq/l, y el equivalente iónico de 1 mM de un ión divalente es 2 meq/l.

La concentración de amoniaco total mencionada anteriormente se ajusta con el fin de hacer que el amoniaco total exista en el medio en una cantidad requerida para el crecimiento del microorganismo o la producción del aminoácido básico, y a una concentración que no inhibe la producción del aminoácido básico por el microorganismo, y el medio se ajusta de ese modo automáticamente a un pH adecuado para disolver iones bicarbonato y/o iones carbonato requeridos como contraaniones del aminoácido básico.

En la presente invención, “el amoniaco total” significa la suma de amoniaco no disociado (NH3) e iones amonio (NH/). Cuando se ajusta la concentración de amoniaco total, pueden medirse amoniaco no disociado o iones amonio, o pueden medirse ambos.

Normalmente, se añaden sulfato de amonio y cloruro de amonio al medio como fuentes de contraaniones de la sustancia básica y fuente de nitrógeno, en general. Además, puesto que se usan normalmente amoniaco y urea para ajustar el pH del medio, está presente una alta concentración de amoniaco e iones amonio en el medio. Cuando se reduce la cantidad de sulfato de amonio o cloruro de amonio con el fin de reducir la cantidad de iones sulfato o cloruro añadidos al medio, se suministra una fuente de nitrógeno tal como amoniaco en una cantidad correspondiente a la cantidad que va a reducirse. Para una operación de este tipo, ha sido necesario desarrollar un método para suministrar amoniaco, que tiene en consideración el equilibrio entre cationes incluyendo los producidos por bacterias y que aumentan con el progreso del cultivo tales como los del aminoácido básico objetivo, cationes que se ionizan a partir del amoniaco añadido, cationes añadidos al medio tales como iones de sodio y potasio, y así sucesivamente, y aniones que aumentan en el medio debido a la generación mediante respiración de bacterias o adición al medio. Si este equilibrio no se mantiene, la fermentación no progresará, porque la concentración de amoniaco se hará excesivamente alta, o el pH se hará excesivamente alto, o a la inversa, el amoniaco podría agotarse. El desarrollo de un método para añadir amonia

esté dentro de un intervalo específico puede permitir el mantenimiento favorable del equilibrio mencionado anteriormente de cationes y aniones, y por tanto pueden realizarse el crecimiento favorable de un microorganismo y la generación favorable de un aminoácido básico incluso en una condición en la que la cantidad de iones sulfato e iones cloruro presentes en el medio se reduce.

La concentración de amoniaco total en el medio se ajusta añadiendo al menos uno de gas amoniaco, disolución de amoniaco y urea al medio de modo que la concentración de amoniaco total en el medio esté a un nivel aceptable. Además, puede añadirse también una sal de amonio tal como cloruro de amonio o sulfato de amonio, a menos que sea perjudicial para el efecto de la invención. Además, puede usarse también una sal de amonio que contiene ión bicarbonato o ión carbonato como contraión, que puede eliminarse fácilmente como un gas tras la finalización del cultivo. La concentración de amoniaco total puede ajustarse usando valores medidos de concentración de amoniaco o ión amonio en el medio o gas de escape como índice. Además, también es posible ajustar la concentración de amoniaco total determinando de antemano el pH que proporciona una concentración aceptable de amoniaco total cuando se ajusta el pH con amoniaco y añadiendo amoniaco de modo que pueda obtenerse un pH de este tipo. En tal caso, el pH determinado tal como se describió anteriormente puede cambiarse durante el cultivo, si es necesario. Además, la concentración de amoniaco total en el medio puede ajustarse también añadiendo amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa tal como se determina basándose en la concentración de oxígeno disuelto en el medio, la velocidad de consumo de la fuente de carbono en el medio, la turbidez del medio, la productividad del aminoácido básico y el cambio en el pH del medio observado como índices. Es decir, si la fuente de nitrógeno en el medio escasea o se agota, la proliferación del microorganismo o la actividad del microorganismo, tal como la producción de un aminoácido básico objetivo, se reduce o cesa. La actividad de un microorganismo aparece habitualmente como consumo de oxígeno disuelto y una fuente de carbono en un medio, aumento de la turbidez del medio, producción de un aminoácido básico objetivo y reducción en el pH del medio debido al consumo de amoniaco o la liberación de dióxido de carbono por la respiración. Por tanto, cuando la actividad de un microorganismo se reduce o cesa, la concentración de oxígeno disuelto en el medio aumenta cuando las velocidades de aireación y agitación por tiempo unitario son constantes, y el pH del medio aumenta debido a una disminución en el consumo de amoniaco y la secreción de dióxido de carbono. Además, la velocidad de consumo de una fuente de carbono, el aumento de la tasa de turbidez de un medio y la velocidad de producción de un aminoácido básico objetivo se reducen. Por tanto, cuando se observa un estancamiento de la actividad de un microorganismo basándose en estos puntos usados como índices en un estado en el que componentes del medio distintos de una fuente de nitrógeno son suficientes, la fuente de nitrógeno escasea o se ha agotado. Si se produce esto, se añade amoniaco o urea al medio en una cantidad que se requiere para el crecimiento del microorganismo o la producción del aminoácido básico objetivo. Repitiendo este procedimiento, la concentración de amoniaco total en el medio se mantiene para que esté dentro de un intervalo específico como resultado. Si el cultivo se realiza con la adición de urea al medio, el microorganismo utiliza urea, y se libera amoniaco al medio. Si la adición de amoniaco o urea se repite tal como se describió anteriormente, el pH del medio aumenta gradualmente. La cantidad de amoniaco o urea añadida a cada punto de tiempo es de 300 mM, preferiblemente 200 mM, más preferiblemente 100 mM, expresada como la concentración final de amoniaco total en el medio. Alternativamente, pueden añadirse amoniaco o urea de modo que el pH aumenta en 0,3 o menos, preferiblemente 0,15 o menos, más preferiblemente 0. 1 o menos, tras la adición de amoniaco o urea, siempre que se satisfagan las condiciones según la reivindicación 1.

La concentración de oxígeno disuelto en el medio puede medirse, por ejemplo, usando un electrodo de oxígeno disuelto.

Puede confirmarse que la suma de los equivalentes iónicos de iones bicarbonato y/o iones carbonato y los otros aniones, que están todos disueltos en el medio, es mayor que el equivalente iónico del aminoácido básico que se ha acumulado en el medio midiendo las concentraciones de iones bicarbonato, iones carbonato y otros aniones así como la concentración del aminoácido básico. Además, las condiciones anteriores pueden satisfacerse también realizando un experimento preliminar para determinar el pH y/o la cantidad de adición de amoniaco que satisface las condiciones mencionadas anteriormente, y realizando el cultivo al pH predeterminado y/o adición de cantidad predeterminada de amoniaco.

En la presente invención, el pH del cultivo puede ser o no constante. Además, cuando el pH del medio se controla, puede controlarse usando el propio pH como índice, o indirectamente controlando la concentración de amoniaco total sin controlar directamente el pH. Además, si se añade amoniaco o urea usando la actividad del microorganismo como índice tal como se describió anteriormente, la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta de modo que esté dentro de un intervalo de concentración apropiado, y el pH aumenta gradualmente con la acumulación del aminoácido básico. Además, si el cultivo se realiza con el control de la concentración de amoniaco total para que esté dentro de un intervalo específico, el pH cambia como resultado del cambio del equilibrio de acumulación de diversos cationes y aniones en el medio. Cualquier sea el medio elegido, la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para que esté dentro de un intervalo de concentración específico, 300 mM o inferior, como resultado, y por tanto la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usados como contraiones de la sustancia básica puede reducirse.

La expresión “que no inhibe la producción de una sustancia básica” significa que el microorganismo usado para la presente invención crece favorablemente, y el aminoácido básico se produce favorablemente. Cuando el crecimiento del microorganismo es insuficiente, o cuando el aminoácido básico no se produce eficazmente a pesar del crecimiento favorable del microorganismo, se considera que la producción del aminoácido básico se inhibe.

Específicamente, el microorganismo usado para la presente invención se cultiva a diversos niveles de pH y se miden las concentraciones de amoniaco total del medio, las productividades del aminoácido básico acumulado en el medio, y las concentraciones de amoniaco total que dan como resultado la producción del aminoácido básico a una tasa de preferiblemente el 50 % o más, más preferiblemente el 70 % o más, de manera particularmente preferible el 90 % o más, en comparación con la cantidad del aminoácido básico que puede obtenerse en condiciones óptimas, por ejemplo, condiciones generales convencionalmente usadas a un pH neutro, a cada valor de pH, se considera que son concentraciones “que no inhiben la producción de la sustancia básica”. En la presente invención, “productividad” se refiere al rendimiento, la velocidad de producción o la cantidad total producida. El “rendimiento” se refiere a la cantidad de producción del aminoácido básico basándose en la fuente de carbono presente en el medio que puede consumirse, y la “velocidad de producción” se refiere a una cantidad de producción por tiempo unitario. Además, cuando el término “cantidad de producción” o “cantidad producida” se usa de manera única, se refiere a la cantidad del aminoácido básico que se acumula en el medio una vez que la fuente de carbono se consume completamente.

Alternativamente, el microorganismo usado para la presente invención se cultiva en condiciones óptimas, por ejemplo, condiciones generales convencionalmente usadas a un pH neutro, y se mide la productividad del aminoácido básico que se ha acumulado en el medio. Entonces, se realiza el cultivo en un medio que tiene la misma composición excepto porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro se reduce en una cantidad deseada, y se mide la productividad del aminoácido básico. En este caso, hay un periodo en el que el pH del medio aumentará debido a la escasez de iones sulfato y/o iones cloruro como contraiones con la acumulación del aminoácido básico objetivo. Durante ese periodo, el cultivo se realiza manteniendo la concentración de amoniaco total para que esté dentro del intervalo de concentración específico. En cuanto al intervalo dentro del cual se controla la concentración, el cultivo se realiza con diversas concentraciones dentro del intervalo de 1 a 300 mM, y las concentraciones dentro de un intervalo que proporciona una productividad de la sustancia básica de preferiblemente el 50 % o más, más preferiblemente el 70 % o más, de manera particularmente preferible el 90 % o más, de la productividad obtenible en condiciones óptimas se determina que son concentraciones “que no inhiben la producción de la sustancia básica”. Los ejemplos del medio usado para las “condiciones generales convencionalmente usadas a un pH neutro” mencionadas anteriormente incluyen un medio que contiene iones sulfato y/o iones cloruro en una cantidad suficiente para realizar el cultivo a pH 7,2 o inferior.

La cantidad deseada en la que se reducen los iones sulfato y/o iones cloruro no está particularmente limitada, siempre que pueda obtenerse la productividad objetivo del aminoácido básico.

La concentración de amoniaco total que se define como “que no inhibe la producción de la sustancia básica” puede determinarse también, por ejemplo, tal como sigue. El microorganismo usado para la presente invención se cultiva a diversos niveles de pH y se miden la concentración de amoniaco total del medio, y la cantidad del aminoácido básico que se acumula en el medio. La cantidad acumulada de la sustancia básica que se obtiene en diversas condiciones se compara con la cantidad acumulada en las condiciones óptimas. Por tanto, puede determinarse la concentración de amoniaco total que no inhibe la producción del aminoácido básico. Las condiciones óptimas se definen como condiciones de cultivo usando contraiones suficientes a un pH neutro como en las condiciones generales normalmente usadas a un pH neutro.

Además, otro método para determinar la concentración de amoniaco total que se define como “que no inhibe la producción de la sustancia básica” es, por ejemplo, tal como sigue. El microorganismo usado para la presente invención se cultiva en condiciones óptimas, por ejemplo, condiciones generales normalmente usadas a un pH neutro, y se mide la productividad del aminoácido básico que se acumula en el medio. Entonces, se realiza el cultivo en un medio que tiene la misma composición excepto porque se reducen los iones sulfato y/o iones cloruro en una cantidad deseada, y se examina la productividad. En este caso, hay un periodo en el que el pH del medio aumentará debido a la escasez de iones sulfato y/o iones cloruro como contraiones con la acumulación del aminoácido básico objetivo. Durante ese periodo, el cultivo se realiza manteniendo la concentración de amoniaco total para que esté dentro del intervalo de concentración específico. Como para el intervalo dentro del cual se controla la concentración, el cultivo se realiza con diversas concentraciones dentro del intervalo de 1 a 300 mM, y las productividades obtenidas de ese modo se comparan con aquellas en condiciones óptimas.

La concentración que se define como “que no inhibe la producción de la sustancia básica” incluye, por ejemplo, una concentración que permite la producción de la sustancia básica preferiblemente al 50 % o más, más preferiblemente al 70 % o más, de manera particularmente preferible al 90 % o más, en comparación con la productividad de la sustancia básica en condiciones óptimas. Específicamente, la concentración de amoniaco total en el medio es de 300 mM o menos, más preferiblemente 200 mM o menos, de manera particularmente preferible 100 mM o menos. El grado en que el amoniaco se disocia se reduce a medida que aumenta el pH. El amoniaco no disociado es más tóxico para las bacterias en comparación con el ión amonio. Por tanto, el límite superior de la concentración de amoniaco total también depende del pH del medio. Es decir, a medida que el pH del medio aumenta, la concentración de amoniaco total aceptable disminuye. Por tanto, en cuanto a la concentración de amoniaco total mencionada anteriormente que se define como “que no inhibe la producción de la sustancia básica”, un intervalo de concentración de amoniaco total aceptable para el pH más alto durante el cultivo puede considerarse como el intervalo de concentración de amoniaco total durante todo el cultivo.

Por otro lado, la concentración total de amoniaco como fuente de nitrógeno, que se requiere para el crecimiento del microorganismo y la producción del aminoácido básico, no está particularmente limitada, siempre que la productividad del aminoácido básico objetivo proporcionada por el microorganismo no se reduzca debido a la escasez de la fuente de nitrógeno durante el cultivo, y puede determinarse apropiadamente. Por ejemplo, la concentración de amoniaco se mide a lo largo del tiempo durante el cultivo, y cuando se agota el amoniaco en el medio, puede añadirse una pequeña cantidad de amoniaco al medio. Aunque la concentración tras la adición de amoniaco no está particularmente limitada, es, por ejemplo, preferiblemente de 1 mM o superior, más preferiblemente de 5 mM o superior, de manera particularmente preferible de 10 mM o superior, en cuanto a la concentración de amoniaco total.

El método de la presente invención puede incluir una etapa de cultivo que es principalmente para hacer que prolifere el microorganismo que tiene la capacidad de producir un aminoácido básico y una etapa de cultivo que es principalmente para permitir que el microorganismo produzca el aminoácido básico. Además, en el método de la presente invención, la proliferación del microorganismo y la producción del aminoácido básico pueden realizarse en paralelo. Además, aparte de tal cultivo como el descrito anteriormente, que también puede denominarse fermentación principal, cultivo principal o similar, también puede realizarse un precultivo independientemente.

En la presente invención, además de ajustar la concentración de amoníaco total en el medio tal como se describió anteriormente, también puede realizarse una operación que facilite la disolución de iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio. Los ejemplos de una operación de este tipo incluyen controlar la presión en el tanque de fermentación durante el cultivo para que sea positiva, suministrar gas dióxido de carbono o un gas mixto que contiene gas dióxido de carbono al medio, limitar la aireación en el tanque de fermentación para que los iones bicarbonato y/o iones carbonato se disuelvan en el medio, aumentar el pH del medio añadiendo cationes distintos de los iones amonio tales como iones de sodio e iones de potasio al medio, y así sucesivamente.

Para hacer que la presión en el tanque de fermentación sea positiva, por ejemplo, la presión del suministro de aire al tanque de fermentación puede hacerse más alta que la presión del escape. Al hacer más alta la presión en el tanque de fermentación, el gas dióxido de carbono generado por la fermentación se disuelve en el medio de cultivo y produce iones bicarbonato o iones carbonato. Específicamente, la presión en el tanque de fermentación puede ser de 0,13 a 0,3 MPa, preferiblemente de 0,15 a 0,25 MPa.

Además, el gas dióxido de carbono puede disolverse en el medio de cultivo suministrando gas dióxido de carbono o un gas mixto que contiene gas dióxido de carbono al medio. Alternativamente, al limitar la aireación al tanque de fermentación, el gas dióxido de carbono generado por la fermentación también puede disolverse en el medio. Puede determinarse una tasa de aireación adecuada, por ejemplo, midiendo la cantidad de iones bicarbonato o iones carbonato en el medio, o midiendo el pH y la concentración de amoniaco del medio. Cuando se suministra gas dióxido de carbono al medio, por ejemplo, puede burbujearse gas dióxido de carbono puro o un gas mixto que contiene el 5 % en volumen o más de gas dióxido de carbono en el medio. Los métodos mencionados anteriormente para disolver iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio pueden usarse independientemente o como una combinación de dos o más.

La operación de ajuste de la concentración de amoníaco total en el medio y la operación de facilitar la disolución de los iones bicarbonato y/o iones carbonato en el medio, si es necesario, pueden realizarse durante al menos una parte del período total del procedimiento de cultivo.

Aunque la “al menos una parte del período total” no está particularmente limitada siempre que se obtenga la productividad deseada, puede ser específicamente de, por ejemplo, 1/10 o más, preferiblemente 1/5 o más, del procedimiento de cultivo total del cultivo principal. Más específicamente, los ejemplos del período incluyen un período en el que el pH del medio aumenta debido a la escasez de contraiones tales como iones sulfato y/o iones cloruro, con acumulación del aminoácido básico objetivo, o un período en el que el pH del medio aumenta debido a la adición de cationes, o ambos de estos períodos.

El medio utilizado para la presente invención no está particularmente limitado, siempre que pueda hacerse al menos que la concentración de amoníaco total esté dentro del intervalo mencionado anteriormente mediante la operación de ajuste de la concentración total de amoníaco, y puede usarse adecuadamente un medio que contiene nutrientes orgánicos e inorgánicos tales como una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y otros nutrientes en cantidades traza dependiendo del microorganismo que va a usarse.

Puede utilizarse cualquier fuente de carbono, siempre que pueda consumirla el microorganismo, y los ejemplos incluyen sacáridos tales como sacarosa, glucosa, fructosa, melazas e hidrolizado de almidón, ácidos orgánicos tales como ácido acético, alcoholes tales como etanol e hidrocarburos tales como metano.

Los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas tales como amoníaco, hidrolizados de proteínas, extracto de levadura, y así sucesivamente. Los ejemplos de nutrientes en cantidades traza incluyen aminoácidos, vitaminas y oligoelementos metálicos.

Los ejemplos de aniones distintos de iones bicarbonato y/o iones carbonato que están presentes en el medio incluyen iones cloruro, iones sulfato, iones fosfato, ácidos orgánicos ionizados, iones hidróxido, y así sucesivamente. La suma de los equivalentes iónicos de estos otros iones es habitualmente de 900 meq/l o menos, preferiblemente 700 meq/l o menos, más preferiblemente 500 meq/l o menos, todavía más preferiblemente 300 meq/l o menos, de manera particularmente preferible 200 meq/l o menos.

Uno de los objetivos de la presente invención es reducir la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro utilizados, y el equivalente iónico de iones sulfato o iones cloruro, o la suma de los equivalentes iónicos de estos iones presentes en el medio es generalmente de 700 meq/l o menos, preferiblemente 500 meq/l o menos, más preferiblemente 300 meq/l o menos, todavía más preferiblemente 200 meq/l o menos, de manera particularmente preferible 100 meq/l o menos.

El esquema de fermentación no está particularmente limitado, y puede ser un cultivo discontinuo en el que no se alimenta medio, un cultivo de alimentación en el que se alimenta el medio después de que se consuma el azúcar cargado, un cultivo continuo en el que se extrae el medio cuando el volumen del medio excede el volumen aceptable para un tanque de fermentación, un método de recirculación de células en el que las células bacterianas se recirculan, y así sucesivamente. La temperatura del cultivo puede determinarse de manera apropiada dependiendo del microorganismo elegido. Habitualmente, es de 25 a 45 °C, preferiblemente de 30 a 40 °C. Además, es preferible agitar suficientemente de modo que esté presente suficiente oxígeno durante la fermentación.

El cultivo para producir el aminoácido básico objetivo se realiza específicamente, por ejemplo, tal como sigue. Se prepara un medio que contiene componentes de medio típicos, pero la mayoría, si no todas, las sales de amonio, como el sulfato de amonio y el cloruro de amonio, se eliminan. Un microorganismo que se ha cultivado por separado se inocula en este medio y se cultiva mientras se controla que la concentración de amoníaco total se encuentre dentro de un intervalo adecuado para el microorganismo elegido, que se determina como se describió anteriormente. La concentración de amoníaco en el medio en el tanque de fermentación o el medio muestreado puede medirse utilizando, por ejemplo, un medidor de iones disponible comercialmente o similar. Usando los valores medidos como un índice, puede controlarse la concentración de amoníaco total. Para mantener la concentración de amoníaco total dentro del intervalo de concentración predeterminado, puede añadirse gas amoníaco, amoníaco acuoso o urea al medio. La concentración de amoníaco total en el medio también puede medirse indirectamente midiendo la concentración de amoníaco en el gas de escape del tanque de fermentación usando un electrodo de amoníaco común.

Además, en la presente invención, la concentración total de amoníaco en el medio puede ajustarse mediante el siguiente método utilizando el pH del medio como índice, tal como se describió anteriormente.

El cultivo se realiza en un medio que tiene la misma composición que un medio que contiene iones sulfato y/o iones cloruro en una cantidad suficiente para mantener el cultivo a pH 7,2 o inferior, excepto porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro se reduce en una cantidad deseada a diversos niveles de pH, en el que el nivel de pH se cambia añadiendo al menos uno cualquiera de gas amoniaco, amoníaco acuoso y urea, y el cultivo continúa mientras se mantiene la concentración de amoníaco total en el medio de modo que se encuentre dentro del intervalo de concentración preferido añadiendo al menos uno cualquiera de gas amoníaco, amoníaco acuoso y urea al medio basándose en indicadores tales como el cambio en la concentración de oxígeno disuelto en el medio, el cambio en la velocidad de consumo de la fuente de carbono en el medio, el cambio en la turbidez del medio, el cambio de pH en el medio, o similares de una manera indirecta durante un período en el que el pH del medio no puede mantenerse a 7,2 o menos debido a la escasez de contraiones para el aminoácido básico que se ha acumulado en el medio. Los ejemplos del aminoácido básico producido por el método de la presente invención incluyen, específicamente, L-lisina, L-arginina y L-histidina. Entre estos, se prefiere L-lisina.

El microorganismo que es capaz de producir un aminoácido básico es una bacteria corineforme o una bacteria de Escherichia coli.

A continuación en el presente documento se explicarán bacterias corineformes y bacterias de Escherichia coli. Las bacterias corineformes usadas para la presente invención incluyen bacterias de Corynebacterium y aquellas bacterias que se han clasificado previamente en el género Brevibacterium pero se han reclasificado en el género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), y además incluyen bacterias que pertenecen al género Brevibacterium, que es muy cercano al género Corynebacterium. Los ejemplos específicos incluyen los siguientes: Corynebacterium acetoacidophilum

Corynebacterium acetoglutamicum

Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes

Corynebacterium efficiens

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitalis

Brevibacierium album

Brevibacterium cerinum

Microbacterium ammoniaphilum

Específicamente, se incluyen las siguientes cepas:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511

Corynebacterium callunae ATCC 15991

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060

Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC 13868

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240

Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871

Brevibacterium album ATCC 15111

Brevibacterium cerinum ATCC 15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

Los ejemplos de las bacterias incluyen Escherichia coli. Cuando se cría Escherichia coli usando técnicas de ingeniería genética, puede elegirse la cepa de E. coli K12 y derivados de la misma, es decir, la cepa E. coli MG1655 (n.° de la ATCC 47076), la cepa W3110 (n.° de la ATCC 27325). Se aisló la cepa de E. coli K12 en la Universidad de Stanford en 1922, y es una bacteria lisogénica de fago X. Además, es una cepa altamente versátil que tiene el factor F, para la que pueden crearse recombinantes genéticos mediante conjugación o similar. Además, se ha determinado la secuencia genómica de la cepa de E. coli K12, y la información genética está disponible públicamente. La cepa de E. coli K12 y derivados de la misma pueden obtenerse de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC, dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América).

Los ejemplos de bacterias corineformes que son capaces de producir L-lisina incluyen cepas mutantes resistentes a S-(2-aminoetil)cisteína (abreviada como “AEC” a continuación en el presente documento), cepas mutantes que requieren un aminoácido tal como L-homoserina para el crecimiento (publicaciones de patentes japonesas (Kokoku) n.os 48-28078 y 56-6499), cepas mutantes con resistencia a AEC y que además requieren un aminoácido tal como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina y L-valina (patentes estadounidenses n.os 3.708.395 y 3.825.472), cepas mutantes productoras de L-lisina con resistencia a DL-a-amino-g-caprolactama, a-amino-laurillactama, análogo de ácido aspártico, fármaco de sulfamida, quinoide y N-lauroil-leucina, cepas mutantes productoras de L-lisina con resistencia a oxaloacetato descarboxilasa o un inhibidor de la enzima del tracto respiratorio (patentes japonesas abiertas a consulta por el público n.os 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55 9759, 56-32995, 56-39778, publicaciones de patentes japonesas n.os 53-43591 y 53-1833), cepas mutantes productoras de L-lisina que requieren inositol o ácido acético (patentes japonesas abiertas a consulta por el público n.° 55-9784 y 56-8692), cepas mutantes productoras de L-lisina que son susceptibles al ácido fluoropirúvico o una temperatura de 34 °C o más (patentes japonesas abiertas a consulta por el público n.os 55-9783 y 53-86090), cepas mutantes productoras de L-lisina de bacterias de Brevibacterium o Corynebacterium con resistencia a etilenglicol (solicitud de patente estadounidense n.° 333.455).

Los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, las cepas de Brevibacterium lactofermentum ATCC 31269, Brevibacterium flavum ATCC 21475 y Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491.

Además, la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869/pVK-C*, plysE descrita en los ejemplos es también una bacteria corineforme productora de L-lisina preferida. Esta cepa se obtuvo mediante la incorporación de un plásmido pVK-C* que contiene el gen que codifica la aspartocinasa que está insensibilizada a la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina y L-treonina (lysC*) y un plásmido plysE (solicitud de patente estadounidense n.° 2003113899) que contiene el gen lysE que es homólogo al gen que promueve la secreción de L-lisina conocido para las bacterias de Corynebacterium (publicación de patente internacional 9723597A2) en la cepa ATCC 13869, que es una cepa de tipo silvestre de Brevibacterium lactofermentum.

El gen lysC* puede aislarse a partir de, por ejemplo, la cepa mutante productora de L-lisina AJ3463 (FERM P-1987) (véase la publicación de patente japonesa n.° 51-34477) que se genera por mutagénesis de la cepa ATCC 13869. La cepa AJ3463 se depositó en el Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (anteriormente Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 8566, Japón) el 22 de marzo de 1973, y se le asignó el número de registro FERM P-1987. Además, un fragmento del gen lysC * también puede aislarse de la cepa de Brevibacterium lactofermentum AJ12691 que contiene un plásmido p399AK9B que contiene el gen. La cepa AJ12691 se depositó en el Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada el 10 de abril de 1992, y se le asignó el número de registro FERM P-12918. Luego, se convirtió en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 10 de febrero de 1995, y se le asignó el número de registro FERM BP-4999. El plásmido p399AK9B (patente estadounidense n.° 5.766.925) se obtuvo insertando un fragmento de ADN que permite la replicación autónoma del plásmido en bacterias de Corynebacterium dentro de un plásmido p399AK9 que se obtuvo insertando lysC derivado de la cepa AJ3463 en el vector de clonación pHSG399 (véase Takeshita, S et al, Gene (1987), 61, 63-74).

En la aspartocinasa desensibilizada mencionada anteriormente, el residuo de alanina en la posición 279 de la subunidad a y el residuo de alanina en la posición 30 de la subunidad p de la aspartocinasa de tipo silvestre se reemplazan cada uno por un residuo de treonina. La subunidad a y la subunidad p se codifican ambas en el mismo marco del gen lysC. La secuencia de nucleótidos del gen lysC * y la secuencia de aminoácidos de la subunidad a de la aspartocinasa desensibilizada se muestran en el listado de secuencias como SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente, y la secuencia de nucleótidos del mismo gen y la secuencia de aminoácidos de la subunidad p de la aspartocinasa desensibilizada se muestran como SEQ ID NOS: 7 y 8, respectivamente.

El gen lysE de las bacterias corineformes puede obtenerse por PCR (reacción en cadena de la polimerasa, véase White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando cebadores basados en la secuencia de nucleótidos notificada (registro de GenBank X96471), por ejemplo, los cebadores mostrados como SEQ ID NOS: 3 y 4, y un ADN cromosómico de bacteria corineforme como molde. Una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que contiene los genes lysG y lysE de Corynebacterium glutamicum (registro de GenBank X96471) se muestra como SEQ ID NO: 10, y la secuencia de aminoácidos de la proteína LysE codificada por este gen se muestra como SEQ ID NO: 9. LysG está codificada por una secuencia complementaria correspondiente a los números de nucleótidos 1723 a 2352 en SEQ ID NO: 8.

Los ADN que codifican la subunidad a, la subunidad p y la proteína LysE de la aspartocinasa incluyen ADN que codifican proteínas que pueden incluir deleciones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácido en una o varias posiciones en cada proteína, siempre que las actividades de las proteínas no se pierdan.

Aunque el número de residuos de aminoácido que se entiende por el término “varios” puede variar dependiendo de las posiciones en las estructuras tridimensionales de las proteínas y los tipos de residuos de aminoácido, es preferiblemente de 2 a 30, más preferiblemente de 2 a 20, de manera particularmente preferible de 2 a 10, para cada proteína. Esto se basa en los siguientes motivos. Es decir, es porque algunos aminoácidos son altamente homólogos entre sí, y las diferencias entre tales aminoácidos no afectan en gran medida a las estructuras tridimensionales y las actividades de las proteínas. Por tanto, cada proteína puede ser una que tiene una homología del 50 % o más, preferiblemente del 70 % o más, más preferiblemente del 90 % o más, de manera particularmente preferible del 95 % o más, con los residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 6, 8 o 10 y que tiene la actividad de la proteína aspartocinasa o LysE.

Tal modificación de las proteínas tal como se describió anteriormente es una mutación conservadora que mantiene la actividad de cada proteína. La sustitución es un cambio en el que se elimina al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos, y se inserta allí otro residuo. Los ejemplos de la sustitución por un residuo de aminoácido de un residuo de aminoácido original considerada como sustitución conservativa incluyen sustitución de ala por ser o thr, sustitución de arg por gln, his o lys, sustitución de asn por glu, gln, lys, his o asp, sustitución de asp por asn, glu o gln, sustitución de cys por ser o ala, sustitución de gln por asn, glu, lys, his, asp o arg, sustitución de glu por asn, gln, lys o asp, sustitución de gly por pro, sustitución de his por asn, lys, gln, arg o tyr, sustitución de ile por leu, met, val o phe, sustitución de leu por ile, met, val o phe, sustitución de lys por asn, glu, gln, his o arg, sustitución de met por ile, leu, val o phe, sustitución de phe por trp, tyr, met, ile o leu, sustitución de ser por thr o ala, sustitución de thr por ser o ala, sustitución de trp por phe o tyr, sustitución de tyr por his, phe o trp y sustitución de val por met, ile o leu.

Un ADN codifica para sustancialmente la misma proteína que la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NOS: 6, 8 o 10 puede obtenerse modificando la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NOS: 6, 8 o 10 usando, por ejemplo, mutagénesis específica de sitio, de modo que se produce la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios residuos de aminoácido. Un ADN modificado de este tipo puede obtenerse de una manera convencional mediante tratamiento con un reactivo o en condiciones que provocan una mutación. Los ejemplos de un tratamiento de este tipo incluyen tratar el ADN que codifica la proteína de la presente invención con hidroxilamina, irradiación con rayos ultravioleta de un microorganismo que contiene el ADN, tratamiento con un reactivo tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina o ácido nitroso.

Un ADN que codifica una proteína modificada de este tipo tal como se describió anteriormente también puede obtenerse aislando un ADN que es capaz de hibridarse con el gen lysC, el gen lysE o una porción de estos genes en condiciones rigurosas y todavía codifica para una proteína que tiene actividad aspartocinasa o la actividad de la proteína LysE. El término “condiciones rigurosas” incluye una condición cuando se forma un denominado híbrido específico, y no se forma un híbrido no específico. Las condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, condiciones en la que ADN que tienen alta homología entre sí, por ejemplo, ADN que tienen una homología de no menos del 70 %, preferiblemente no menos del 80 %, más preferiblemente no menos del 90%, de manera particularmente preferible no menos de 95%, son capaces de hibridarse. Las condiciones rigurosas también incluyen condiciones de lavado típicas de hibridación de tipo Southern, es decir, 1 x SSC, SDS al 0,1%, preferiblemente 0,1 x SSC, SDS al 0,1%, a 60 °C.

Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina que pertenecen al género Escherichia incluyen mutantes que tienen resistencia a análogos de L-lisina. El análogo de L-lisina inhibe el crecimiento de bacterias de Escherichia, pero esta inhibición se elimina completa o parcialmente cuando coexiste L-lisina en un medio. Los ejemplos de análogos de L-lisina incluyen oxalisina, hidroxamato de lisina, (S)-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metil-lisina, aclorocaprolactama, y así sucesivamente. Pueden obtenerse mutantes que tienen resistencia a estos análogos de lisina sometiendo microorganismos de Escherichia a un tratamiento de mutación artificial convencional. Los ejemplos específicos de cepas bacterianas usadas para producir L-lisina incluyen las cepas de E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 56-18596 y la patente estadounidense n.° 4.346.170) y E. coli VL611. La cepa AJ11442 se depositó en el Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (anteriormente Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 1 de mayo de 1981, y se le asignó el número de registro FERM P-5084. Luego, se convirtió en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 29 de octubre de 1987, y se le asignó el número de registro FERM BP-1543. En estos microorganismos, se desensibilizó la inhibición por retroalimentación de aspartocinasa mediante L-lisina.

Además, por ejemplo, también pueden usarse bacterias con expresión potenciada de un gen que codifica una enzima implicada en la biosíntesis de L-lisina distinta de aspartocinasa desensibilizada como bacteria productora de L-lisina preferida. Los ejemplos de una enzima de este tipo incluyen enzimas implicadas en la ruta de diaminopimelato, tales como dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato descarboxilasa, diaminopimelato deshidrogenasa (publicación de patente internacional WO96/40934 para todas las enzimas anteriores), fosfoenolpiruvato carboxilasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 60-87788), aspartato aminotransferasa (publicación de patente japonesa n.° 6-102028), diaminopimelato epimerasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2003-135066) y aspartato semialdehído deshidrogenasa (publicación de patente internacional WO00/61723), enzimas implicadas en la ruta de aminoadipato, tales como homoaconitato hidratasa (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2000-157276).

Los ejemplos específicos de cepas de E. coli que tienen capacidad de producción de L-lisina incluyen la cepa de E. coli W3110(tyrA)/pCABD2 (publicación de patente internacional WO95/16042). La cepa de E. coli W3110(tyrA)/pCABD2 se obtuvo introduciendo el plásmido pCABD2 que contiene genes que codifican enzimas del sistema de biosíntesis de L-lisina en W3110(tyrA), que es una cepa deficiente en tyrA de E. coli (se designó AJ12604, depositada en el Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (anteriormente Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, dirección: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 8566, Japón) el 28 de enero de 1991, y se le asignó el número de registro FERM P-11975, y luego se convirtió el depósito en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 1991, y se le asignó el número de registro FERM BP-3579).

El plásmido pCABD2 contiene un gen que codifica una dihidrodipicolinato sintasa mutante, en la que el residuo de histidina en la posición 118 se muta a un residuo de tirosina, y se desensibiliza la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina, un gen que codifica una aspartocinasa III mutante, en la que el residuo de treonina en la posición 352 se muta a un residuo de isoleucina, y se desensibiliza la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina, y genes que codifican dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato deshidrogenasa.

Además, la cepa de E. coli W3110(tyrA) puede obtenerse tal como se describe a continuación. Es decir, muchas cepas obtenidas introduciendo un plásmido en la cepa W3110(tyrA) se divulgan en la publicación de patente europea abierta a consulta por el público n.° 488424/1992. Por ejemplo, una cepa obtenida introduciendo un plásmido pHATerm se designó cepa de E. coli W3110(tyrA)/pHATerm, y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, y se le asignó el número de registro FERM BP-3653. La cepa W3110(tyrA) puede obtenerse, por ejemplo, eliminando el plásmido pHATerm de la cepa de E. coli W3110(tyrA)/pHATerm. La eliminación del plásmido puede realizarse de una manera convencional.

Además, la cepa WC196 (véase la publicación de patente internacional WO96/17930) puede usarse también como cepa productora de L-lisina de E. coli. La cepa de WC196 se crió confiriendo resistencia a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) a la cepa W3110 derivada de E. coli K-12. Esta cepa se designó E. coli AJ13069, y se depositó en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (en la actualidad Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón)) el 6 de diciembre de 1994, y se le asignó el número de registro FERM P-14690. Luego, se convirtió el depósito en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 29 de septiembre de 1995, y se le asignó el número de registro FERM BP-5252.

El microorganismo utilizable para la presente invención puede tener una actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción para la generación de compuestos distintos de L-lisina por medio de una ruta que se ramifica de la ruta de biosíntesis de L-lisina, o una enzima que regula por disminución la producción de L-lisina, o puede ser deficiente en una enzima de este tipo. Los ejemplos ilustrativos de la enzima implicada en la producción de L-lisina incluyen homoserina deshidrogenasa, lisina descarboxilasa (cadA, ldcC) y enzima málica. Se describen cepas en las que las actividades de estas enzimas están disminuidas o son deficientes en las publicaciones de patentes internacionales WO95/23864, WO96/17930 y WO2005/010175.

Para reducir o eliminar las actividades enzimáticas, pueden mutarse genes que codifican las enzimas en un cromosoma mediante un método de mutagénesis común de modo que las actividades intracelulares de las enzimas se reduzcan o se eliminen. Por ejemplo, esto puede lograrse usando recombinación genética para eliminar estos genes que codifican las enzimas en un cromosoma o para modificar una secuencia de control de la expresión, tal como un promotor o la secuencia de Shine-Dalgarno (SD). También puede lograrse introduciendo una sustitución de aminoácido (mutación de cambio de sentido), introduciendo un codón de terminación (mutación sin sentido), introduciendo una mutación de desplazamiento del marco que añade o deleciona uno o dos nucleótidos en regiones codificantes de las enzimas en el cromosoma, o delecionando una parte de los genes (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997)). Las actividades enzimáticas también pueden disminuirse o eliminarse construyendo un gen que codifica una enzima mutante, en el que la región codificante se deleciona, y se reemplaza el gen de tipo silvestre en el cromosoma mediante recombinación homóloga o similar por el gen mutado, o introduciendo un transposón o factor de IS en el gen.

Por ejemplo, pueden emplearse los siguientes métodos para introducir una mutación que provoca una disminución en las actividades de las enzimas mencionadas anteriormente o elimina las actividades mediante recombinación genética. El gen objetivo en un cromosoma puede reemplazarse por un gen mutante que no puede producir una enzima que normalmente funciona modificando una secuencia parcial del gen objetivo para preparar el gen mutante, y transformando una bacteria corineforme con un ADN que contiene el gen mutante para provocar la recombinación entre el gen mutante y el gen en el cromosoma. Tal mutagénesis específica de sitio basada en sustitución génica usando recombinación homóloga ya se ha establecido, y se conocen métodos que usan ADN lineal, métodos que usan plásmidos que contienen un origen de replicación sensible a la temperatura (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 12, págs. 6640-6645; patente estadounidense n.° 6.303.383; patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 05-007491). Además, tal mutagénesis específica de sitio basada en sustitución génica usando recombinación homóloga tal como se describió anteriormente también puede realizarse con un plásmido que no es capaz de replicarse en el huésped.

Además, también pueden usarse para la presente invención microorganismos que se han modificado de modo que la cantidad de expresión del gen de secreción de L-lisina y L-arginina, ybjE, se aumenta (publicación de patente internacional WO2005/073390).

Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina que pertenecen al género Serratia incluyen bacterias de Serratia transformadas con un ADN que codifica dihidrodipicolinato sintasa que tiene una mutación que desensibiliza la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina, y bacterias de Serratia que contienen aspartocinasa que se desensibiliza para la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina (publicación de patente internacional WO96/41871).

Los ejemplos de bacterias corineformes productoras de L-arginina incluyen cepas de tipo silvestre de bacterias corineformes: bacterias corineformes resistentes a determinados agentes incluyendo fármacos de sulfamida, 2-tiazolalanina, ácido a-amino-p-hidroxivalérico y así sucesivamente: bacterias corineformes que presentan auxotrofía para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina o L-triptófano además de ser resistentes a 2-tiazolalanina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 54-44096); bacterias corineformes resistentes a ácido cetomalónico, ácido fluoromalónico o ácido monofluoroacético (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 57-18989); bacterias corineformes resistentes a argininol (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 62-24075); bacterias corineformes resistentes a X-guanidina (X representa un derivado de ácido graso o cadena alifática, patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-186995) y así sucesivamente. Además, las bacterias corineformes que son deficientes en el represor de L-arginina (solicitud de patente estadounidense n.° 20020045233) y las bacterias corineformes con actividad glutamato deshidrogenasa aumentada (publicación de patente europea abierta a consulta por el público n.° 1057893) son también cepas adecuadas para la producción de L-arginina.

Específicamente, los ejemplos incluyen las cepas de Brevibacterium flavum AJ11169 (FERM BP-6892), Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906), Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM BP-6893), Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM ^bP-6894) y Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228). Las cepas AJ11169 y AJ12092 son resistentes a 2-tiazolalanina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 54-44096). La cepa AJ11336 es resistente a argininol y sulfadiazina (publicación de patente japonesa n.° 62-24075). La cepa AJ11345 es resistente a arginino, 2-tiazolalanina y sulfaguanidina, y es auxótrofa para histidina (publicación de patente japonesa n.° 62-24075). La cepa AJ12430 es resistente a octilguanidina y 2-tiazolalanina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2-186995).

La Corynebacterium glutamicum AJ12092 se depositó en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (en la actualidad Depositario de Organismos de Patentes Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukubashi, Ibarakiken, 305-8566, Japón) el 6 de diciembre de 1994, y se le asignó el número de registro FERM P-12092. Luego, se convirtió el depósito en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 1 de octubre de 1999, y se le asignó el número de registro FERM BP-6906.

Los ejemplos de bacterias de Escherichia que son capaces de producir L-arginina incluyen E. coli transformada con el gen argA (véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 57-5693), y la cepa de E. coli 237 (solicitud de patente rusa n.° 2000117677), que es un derivado productor de L-arginina de la cepa mutante que es capaz de asimilar un ácido acético. La cepa 237 se depositó en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM), GNII Genetika (dirección: Rusia, 117545, Moscú, 1 Dorozhnyproezd, 1) el 10 de abril de 2000, y se le asignó el número VKPM B-7925. Se convirtió el depósito en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001. La cepa de E. coli 382 es un mutante que es resistente a la inhibición por retroalimentación mediante L-arginina (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2002-017342), que es un derivado de la cepa 237, y también puede emplearse. La cepa de E. coli 382 se depositó en la Colección Nacional Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM) con el número VKPM B-7926 el 10 de abril de 2000, y se convirtió el depósito en un depósito internacional conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest el 18 de mayo de 2001.

Los ejemplos de bacterias de Serratia que son capaces de producir L-arginina incluyen Serratia marcescens que es incapaz de descomponer L-arginina y es resistente a un antagonista de arginina y canavanina, y es auxótrofa para lisina (véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 52-8729).

Los ejemplos de bacterias corineformes que son capaces de producir L-histidina incluyen microorganismos que pertenecen al género Brevibacterium que son resistentes a un antagonista de tiamina, específicamente, las cepas de Brevibacterium lactofermentum FERM P-2170, FERM P-2316, FERM P-6478, FERM P-6479, FERM P-6480 y FERM P-6481 (publicación de patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 59-63194). Además, los ejemplos incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Brevibacterium o Corynebacterium que son resistentes a policétidos y con capacidad productora de L-histidina, específicamente, las cepas FERM P-4161, FERM P-7273, FERM P-8371, FERM P-8372 y ATCC 14067.

Los ejemplos de bacterias de Escherichia que son capaces de producir L-histidina incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Escherichia que son resistentes a un análogo de histidina, por ejemplo, la cepa de E. coli R-344, y bacterias de Escherichia transformadas con genes de enzimas del sistema de síntesis de L-histidina aislados de la cepa R-344. Específicamente, los ejemplos incluyen las cepas de E. coli NRRL-12116, NRRL-12118, NRR-L-12119, Nr RL-12120 y NRRL-12121 (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 56-5099).

Los ejemplos de bacterias de Bacillus capaces de producir L-histidina incluyen cepas mutantes que pertenecen al género Bacillus que son resistentes a un análogo de histidina, y bacterias de Bacillus transformadas con un gen obtenido de estas cepas mutantes que están implicadas en la resistencia a antagonista de histidina. Específicamente, los ejemplos incluyen las cepas FERM BP-218, PERM BP-224 y FERM BP-219 (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 58-107192).

El caldo de fermentación o el producto procesado del mismo que contiene el aminoácido básico obtenido mediante el método de la presente invención contendrá iones carbonato o iones bicarbonato como contraaniones para el aminoácido básico disociado. Estos iones carbonato o iones bicarbonato se emiten como gas dióxido de carbono cuando el medio de cultivo se calienta o se concentra, o si el pH del medio se disminuye añadiendo un ácido fuerte tal como ácido clorhídrico. Por tanto, la cantidad relativa del aminoácido básico entre los componentes sólidos en el caldo de fermentación aumenta.

Según la presente invención, al usar iones bicarbonato, iones carbonato o similares en lugar en lugar de iones cloruro e iones sulfato, la cantidad de los iones cloruro puede reducirse incluso hasta un nivel que no provoca corrosión de los equipos, o pueden reducirse los iones sulfato. Además, tras la fermentación, pueden reemplazarse iones bicarbonato e iones carbonato por iones cloruro sólo añadiendo ácido clorhídrico al medio, puede obtenerse clorhidrato de lisina sólo concentrando adicionalmente el medio sin usar intercambio iónico, y además, pueden separarse directamente cristales de clorhidrato de lisina.

En la presente divulgación, el “producto de fermentación” incluye concentrado y producto obtenidos a partir del caldo de fermentación, y productos obtenidos procesando el caldo de fermentación o producto secado del mismo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción de bacteria corineforme productora de L-lisina

Se introdujeron un gen que codifica aspartocinasa desensibilizada y un gen que codifica un factor de secreción de lisina en una bacteria corineforme silvestre para preparar una bacteria productora de L-lisina.

(1) Adquisición de un gen que codifica aspartocinasa desensibilizada

Se aisló un gen (lysC*) que codifica aspartocinasa (Ask*) que está desensibilizada para la inhibición por retroalimentación mediante L-lisina y L-treonina por PCR de una cepa mutante productora de L-lisina, AJ3463 (FERM P-1987, véase la publicación de patente japonesa n.° 51-34477) derivada de la cepa de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 por mutagénesis.

Se cultivó la cepa AJ3463 en medio CM-Dex y se extrajo ADN cromosómico de las células obtenidas mediante un método típico (Biochem. Biophys Acta., 72, 619-629 (1963)). Usando este ADN cromosómico como molde con un oligonucleótido ASK-F (SEQ ID NO: 1) para introducir un sitio de enzima de restricción BamHI en el extremo 5' del fragmento de ADN objetivo y un oligonucleótido ASK-R (SEQ ID NO: 2) para introducir un sitio de enzima de restricción Kpnl en el extremo 3' del fragmento de ADN objetivo como cebadores para PCR, se amplificó un fragmento de ADN génico que contiene lysC* como gen objetivo. Para la amplificación, se repitió 25 veces un ciclo que consistía en una etapa de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, una etapa de reasociación a 55 °C durante 30 segundos y una etapa de extensión a 72 °C durante 2 minutos. La enzima, ADN polimerasa de Pyrobest (Takara Shuzo), se utilizó según las instrucciones del fabricante.

El fragmento de ADN amplificado se purificó mediante un tratamiento con fenol/cloroformo y precipitación con etanol, y luego se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Kpnl. La mezcla de reacción obtenida se desarrolló mediante electroforesis en gel de agarosa, se cortó la banda que contenía el gen lysC* y se purificó el fragmento génico mediante métodos convencionales.

Se trató por separado un vector lanzadera para E. coli y Corynebacterium glutamicum, pVK7 (véase la patente estadounidense n.° 6.004.773) con las enzimas de restricción BamHI y Kpnl de manera similar, y se ligó al fragmento de lysC* mencionado anteriormente. Se transformaron células competentes de la cepa de E. coli JM109 (Takara Shuzo) con la mezcla de reacción de ligación según el protocolo del fabricante, y se seleccionaron varias colonias resistentes a kanamicina.

Se construyó el pVK7 ligando un plásmido críptico de Brevibacterium lactofermentum, pAM330, a un vector para E. coli, pHSG299 (KmF, véase Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)) de la siguiente manera (véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 11-266881, la publicación de patente internacional WO99/07853). Se preparó pAM330 a partir de la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Se digirió pHSG299 con AvaII (Takara Shuzo), cuyos extremos se habían vuelto romos con la ADN polimerasa de T4, luego se digirió con Hindlll (Takara Shuzo) y se ligó a pAM330 de extremos romos con ADN polimerasa de T4. Así, se obtuvo pVK7. pVK7 puede replicarse de manera autónoma en células de E. coli y Brevibacterium lactofermentum, y contiene un sitio de clonación múltiple derivado de pHSG299, lacZ, y un gen de resistencia a kanamicina como marcador.

Se extrajeron ADN plasmídicos de las colonias resistentes a kanamicina obtenidas tal como se describió anteriormente de manera convencional, y el plásmido que contiene el gen lysC* objetivo se designó pVK-C*.

(2) Adquisición de un gen que codifica el factor de secreción de lisina lysE

Usando ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como molde, se aisló el gen lysE mediante PCR (véase la solicitud de patente estadounidense n.° 2003113899). Es conocido que el gen lysE funciona en bacterias de Corynebacterium promoviendo la secreción de L-lisina (publicación de patente internacional WO 97/23597). Se preparó el ADN cromosómico de la cepa de la misma manera que se describió anteriormente.

Se usaron LysE-F (SEQ ID NO: 3) y LysE-R (SEQ ID NO: 4) como cebadores. Se realizó la PCR usando Pyrobest (Takara Shuzo) con un tratamiento térmico a 94 °C durante 90 segundos, y el siguiente ciclo se repitió 30 veces: desnaturalización a 94 °C durante 20 segundos, reasociación a 55 °C durante 30 segundos y reacción de extensión a 72 °C durante 60 segundos. Entonces se incubó la reacción a 72 °C durante 10 minutos. Se obtuvo un fragmento de ADN del tamaño predicho mediante esta reacción. Se purificó este fragmento de ADN, y luego se clonó en el vector de clonación pCR2.1 (Invitrogene) según el protocolo del fabricante. Se transformaron células competentes de la cepa de E. coli JM109 (Takara Shuzo) con la mezcla de reacción de ligación según el protocolo del fabricante, y se seleccionaron varias colonias resistentes a ampicilina. Se extrajeron ADN plasmídicos de estas colonias, y el plásmido que tenía la estructura deseada se designó pCRlysE.

Entonces, se digirió pCRlysE con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para obtener un fragmento que contenía el gen lysE. Un vector lanzadera para E. coli y Corynebacterium glutamicum, pKC (véase la solicitud de patente estadounidense n.° 2003113899) se trató por separado con las enzimas de restricción BamHI y KpnI de manera similar, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para obtener un fragmento génico que contenía el gen de resistencia a cloranfenicol. Se purificó este gen y luego se ligó en el fragmento de lysE mencionado anteriormente. Usando esta mezcla de reacción de ligación, se transformaron células competentes de la cepa de E. coli JM109 (Takara Shuzo) según el protocolo del fabricante, y se eligieron varias colonias resistentes a cloranfenicol. Se prepararon plásmidos a partir de las colonias obtenidas tal como se describió anteriormente para obtener el plásmido de expresión de LysE, plysE.

Se preparó pKC4 tal como sigue. Un plásmido pHK4 (véase la patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 5-7491) que tenía un origen de replicación derivado del plásmido pHM1519 ya obtenido, que puede replicarse de manera autónoma en bacterias corineformes (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), se digirió con las enzimas de restricción BamHI y KpnI para obtener un fragmento génico que contenía el origen de replicación. Se volvieron romos los extremos del fragmento obtenido con un kit de formación de extremos romos de ADN (Takara Shuzo), y se insertó en el sitio KpnI de pHSG399 (Takara Shuzo) mediante ligación usando un ligador de KpnI (Takara Shuzo). Se transformaron células competentes de la cepa de E. coli JM109 (Takara Shuzo) con esta mezcla de reacción de ligación según el protocolo del fabricante, y se seleccionaron varias colonias resistentes a cloranfenicol. Se prepararon plásmidos a partir de las colonias obtenidas tal como se describió anteriormente para obtener pKC4. (3) Construcción de bacteria corineforme productora de L-lisina

Los dos plásmidos descritos anteriormente, pVK-C* y plysE, se introdujeron en la cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 mediante electroporación. Se realizó la electroporación usando el instrumento Gene Pulser (BIO-RAD). La distancia entre los electrodos en la cubeta era de 0,1 cm y las condiciones de aplicación de pulsos eléctricos fueron 25 |iF, 200 Q y 1,8 kV. Las cepas que contenían los plásmidos se seleccionaron en una placa de agar CM-Dex (véase a continuación para la composición del medio) que contenía 5 |ig/l de cloranfenicol y 25 |ig/l de kanamicina. La cepa que contenía el plásmido se cultivó durante la noche a 31,5 °C con agitación en el medio líquido CM-Dex que contenía 5 |ig/l de cloranfenicol y 25 |ig/l de kanamicina. Se realizó el cultivo en 3 ml del medio de cultivo en un tubo de ensayo con agitación.

Se preparó el medio CM-Dex tal como sigue. Se mezclaron todos los componentes enumerados en la tabla 1, se ajustaron a pH 7,5 con KOH y luego se esterilizaron mediante tratamiento en autoclave a 120 °C durante 20 minutos.

En el medio de agar, se añadió agar hasta una concentración final de 20 g/l.

Tabla 1: Composición del medio CM-Dex (por 1 l)

(Llenado hasta 1 l con agua esterilizada)

Tal como se describió anteriormente, se obtuvo una bacteria cometerme productora de L-lisina, ATCC 13869/pVK.-C*,plysE.

Ejemplo 2: Crecimiento de bacteria productora de L-lisina en un medio alcalino, y efecto de la concentración de amoniaco total sobre la producción de L-lisina

Usando la bacteria productora de L-lisina construida en el ejemplo 1, se investigó la concentración de amoniaco total que no inhibe la productividad de L-lisina en un medio alcalino.

En primer lugar, se usó un método de cultivo convencional. Es decir, se añadió un medio (medio B) obtenido añadiendo sulfato de amonio al medio A (la composición se muestra en la tabla 2) en una cantidad del 55 % (p/p) basándose en la glucosa. El pH del medio se mantuvo constante con gas amoniaco durante el cultivo, para realizar la fermentación de L-lisina. Se controló el pH para que estuviera a 7,0 u 8,0.

Tabla 2: Composición del medio A (por 1 l)

Específicamente, se realizó el cultivo tal como sigue. Se inoculó la cepa anteriormente mencionada en 3 ml del medio de cultivo CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31,5 °C con agitación, y se extendieron uniformemente 200 |il del medio sobre el medio de agar CM-Dex. Se realizó el cultivo durante la noche a 31,5 °C como cultivo estacionario. Entonces, un tercio de las células bacterianas productoras de L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en 300 ml de medio B en un fermentador de jarra y se cultivaron. Durante el cultivo, se aireó el medio con 300 ml por minuto de aire esterilizado con filtro, se mantuvo la velocidad de agitación a 700 rpm y se mantuvo la temperatura del medio a 31,5 °C. Los resultados se muestran en la figura 1.

Como resultado, a pH 7,0, se acumularon 17,4 g/l de L-lisina, y la velocidad de producción era de 0,725 g/l/h. Por otro lado, a pH 8,0, el crecimiento de las células era casi inexistente, y la fermentación no progresó (figura 1).

Entonces, se realizó fermentación usando las bacterias productoras de L-lisina en un medio sin sulfato de amonio. Se inoculó la cepa anteriormente mencionada en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31,5 °C con agitación, y 200 |il del medio se extendieron uniformemente sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31,5 °C. Se pusieron 300 ml de medio A (sin sulfato de amonio) en un fermentador de jarra, y se ajustó el pH a 7,8, 8,2 u 8,9 burbujeando gas amoniaco a través del medio. Un tercio de las células bacterianas productoras de L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio y se cultivaron. Durante el cultivo, se aireó el medio con 300 ml por minuto de aire esterilizado con filtro, se mantuvo la velocidad de agitación a 700 rpm y se mantuvo la temperatura del medio constante a 31,5 °C. Durante el cultivo, se mantuvo un pH constante burbujeando gas amoniaco a través del medio. Como resultado, se confirmó que, a pH 8,9, después de que la concentración de amoniaco total en el medio excediera de 100 mM, el crecimiento y la producción de L-lisina, en particular, se inhibieron fuertemente.

En el método de cultivo anteriormente mencionado, el gas dióxido de carbono generado por las bacterias productoras de L-lisina se disolvió en el medio como iones carbonato o iones bicarbonato, lo que da como resultado un pH disminuido a medida que progresa el cultivo. Por tanto, la cantidad de amoniaco añadido necesaria para controlar el pH al nivel predeterminado aumenta. Además, el nivel de pH al que el medio se había ajustado aumentó, las concentraciones de iones carbonato e iones bicarbonato disueltos aumentaron y, por tanto, la concentración del amoniaco añadido con el fin de ajustar el pH al valor predeterminado aumentó.

El amoniaco no disociado penetra fácilmente en las células dando como resultado daño celular de las células. Puesto que un pH superior da como resultado una menor cantidad de disociación de amoniaco, el crecimiento de las bacterias se inhibió a medida que aumenta el pH, incluso si la concentración de amoniaco total se mantiene a un nivel constante. Por tanto, se concluyó que a pH 8,9 o inferior, si la concentración de amoniaco total se controla para que sea baja, por ejemplo, a 100 mM o inferior, la inhibición del crecimiento bacteriano y la acumulación de L-lisina no es significativa.

Entonces, se realizó el cultivo para la producción de L-lisina al tiempo que la concentración de amoniaco total en el medio se controló a 100 mM o inferior a pH 7,8, 8,2 y 8,9.

Se inoculó la cepa anteriormente mencionada en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31,5 °C con agitación, y 200 |il del medio se extendieron uniformemente sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31,5 °C. Se colocaron 300 ml de medio A (sin sulfato de amonio) en un fermentador de jarra, y se ajustó el pH a 7,5, 7,8, 8,2 u 8,9 burbujeando gas amoniaco a través del medio. Un tercio de las células bacterianas productoras de L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio y se cultivaron. Durante el cultivo, se aireó el medio con 300 ml por minuto de aire esterilizado con filtro, se mantuvo la velocidad de agitación a 700 rpm y se mantuvo la temperatura del medio a 31,5 °C. Durante el cultivo, se mantuvo el pH a cada uno de los niveles predeterminados con hidróxido de potasio 6 N en lugar de amoniaco.

Se midió la concentración de amoniaco total en el medio usando un electrodo de amoniaco y un medidor de iones (Orion). Se tomaron muestras periódicas del medio, y se controló la concentración de amoniaco total para que estuviera dentro de 0 a 100 mM añadiendo disolución de amoniaco acuosa al 10 % según se requiriera. Además, monitorizando la concentración de oxígeno disuelto en el medio, se detectó un aumento brusco en la concentración de oxígeno disuelto cuando se agotó el amoniaco. Cuando se produjo esto, se añadió una disolución de amoniaco acuosa al 10 % para impedir el agotamiento continuo del amoniaco en el medio. Los resultados se muestran en la figura 2.

Como resultado, se observaron un crecimiento y una producción de L-lisina favorables a todos los niveles de pH desde 7,8 hasta 8,9. En comparación con la fermentación realizada a pH 7,0 usando el método de cultivo convencional, se observó una tasa de producción del 115 % o superior.

Ejemplo 3: Producción de L-lisina

En este ejemplo, se realizó la fermentación de L-lisina controlando sólo la concentración de amoniaco total, pero sin controlar el pH. El intervalo de la concentración de amoniaco total se mantuvo a 100 mM o menos. Este intervalo se eligió basándose en los resultados del ejemplo 2.

Se inoculó la cepa anteriormente mencionada en 3 ml del medio líquido CM-Dex y se cultivó durante la noche a 31,5 °C con agitación, y 200 |il del medio se extendieron uniformemente sobre el medio de agar CM-Dex y se dejaron durante la noche a 31,5 °C. Se colocaron 300 ml de medio A (sin sulfato de amonio) en un fermentador de jarra, y se ajustó la concentración de amoniaco total del medio a 23,8 mM burbujeando gas amoniaco a través del medio. Un tercio de las células bacterianas productoras de L-lisina que crecieron sobre el medio de agar sobre una placa se inocularon en el medio, y se cultivaron. Durante el cultivo, se aireó el medio con 300 ml por minuto de aire esterilizado con filtro, se mantuvo la velocidad de agitación a 700 rpm y se mantuvo la temperatura del medio a 31,5 °C. Se midió periódicamente la concentración de amoniaco total, y se añadió una cantidad apropiada de amoniaco acuoso al 10 % al medio según se requiriera de modo que la concentración de amoniaco total se mantuvo entre 0 y 100 mM. Como resultado, se acumularon 15,9 g/l de lisina, y la fermentación de L-lisina progresó (figura 3).

Ejemplo 4: Construcción de bacteria de E. coli productora de L-lisina

<1> Construcción de una cepa en la que los genes cadA y IdcC que codifican lisina descarboxilasa están alterados

En primer lugar, se construyó una cepa deficiente en lisina descarboxilasa. Las lisina descarboxilasas están codificadas por el gen cadA (n.° de registro de Genbank NP_418555, SEQ ID NO: 15) y el gen IdcC (n.° de registro de Genbank NP_414728, ^sE^qID NO: 17) (véase la publicación de patente internacional WO96/l7930). En este ejemplo, se usó la cepa WC196 como cepa original.

Los genes cadA y IdcC que codifican lisina descarboxilasa se delecionaron usando el método desarrollado por primera vez por Datsenko y Wanner denominado “integración impulsada por Red” (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 12, págs. 6640-6645), y un sistema de escisión derivado del fago X (J. Bacteriol, septiembre de 2002, 184 (18): 5200-3, Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex, Cho EH, Gumport RI, Gardner JF). Según el método de “integración impulsada por Red”, puede usarse un producto de PCR obtenido usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos en los que una parte del gen objetivo está diseñado en el lado 5' y una parte de un gen de resistencia a antibiótico está diseñado en el lado 3', para obtener un cepa con alteración génica en una etapa. Además, usando el sistema de escisión derivado del fago X en combinación, puede eliminarse el gen de resistencia a antibióticos que se había incorporado en la cepa con alteración génica (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2005-058227).

(1) Alteración del gen cadA

Se usó el plásmido pMW118-attL-Cm-attR (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2005-058827) como molde en PCR. Se obtuvo pMW118-attL-Cm-attR insertando los genes attL y attR que son los sitios de unión del fago X, y el gen cat que es un gen de resistencia a antibióticos en pMW118 (Takara Bio). El orden de inserción es attL-cat-attR.

Se realizó la PCR con los cebadores oligonucleotídicos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 11 y 12 que tienen secuencias correspondientes a ambos extremos de attL y attR en los extremos 3' de los cebadores, y una secuencia correspondiente a una porción del gen cadA objetivo en los extremos 5' de los cebadores.

Se purificó el producto de PCR amplificado sobre gel de agarosa y se introdujo mediante electroporación en la cepa de E. coli WC169 que contiene el plásmido pKD46 que puede replicarse de manera sensible a la temperatura. El plásmido pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, n.° 12, págs. 6640-6645) contiene un fragmento de ADN de 2154 nucleótidos en total del fago X que contiene genes que codifican la recombinasa Red del sistema de recombinación homóloga Red de X (genes X, p, exo) controlados por el promotor ParaB inducible por arabinosa (n.° de registro de GenBank/EMBL J02459, nucleótidos en las posiciones 31088 a 33241). El plásmido pKD46 se requiere para incorporar el producto de PCR en el cromosoma de la cepa WC196.

Se prepararon células competentes para la electroporación tal como sigue. Es decir, la cepa de E. coli WC196 cultivada durante la noche a 30 °C en el medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina se diluyó 100 veces con 5 ml del medio SOB (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contenía ampicilina (20 mg/l) y L-arabinosa (1 mM). Se hicieron crecer las células en el cultivo diluido a 30 °C con aireación hasta que la DO600 alcanzó aproximadamente 0,6, y luego se concentró el cultivo 100 veces y se lavó tres veces con glicerol al 10 % de modo que las células podían usarse para la electroporación. Se realizó la electroporación usando 70 |il de las células competentes y aproximadamente 100 ng del producto de PCR. Tras la electroporación, se añadieron las células a 1 ml del medio SOC (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), se cultivaron a 37 °C durante 2,5 horas y luego se cultivaron a 37 °C como cultivo en placa sobre medio de agar L que contenía 25 mg/l de Cm (cloranfenicol), y se seleccionaron recombinantes resistentes a Cm. Entonces, con el fin de eliminar el plásmido pKD46, se subcultivaron las células dos veces a 42 °C en el medio de agar L que contenía Cm, y se examinó la resistencia a ampicilina de las colonias para obtener una cepa sensible a ampicilina sin pKD46.

La deleción del gen cadA en el mutante identificado basándose en el gen de resistencia a cloranfenicol se confirmó mediante PCR. La cepa deficiente en cadA obtenida se designó cepa WC196AcadA::att-cat.

Entonces, con el fin de eliminar el gen att-cat que se había introducido en el gen cadA, se usó un plásmido auxiliar pMW-intxis-ts (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2005-058827). pMW-intxis-ts porta un gen que codifica integrasa (Int) y un gen que codifica escisionasa (Xis) del fago X, y puede replicarse de manera sensible a la temperatura.

Se prepararon células competentes de la cepa WC196AcadA::att-cat obtenida anteriormente de manera convencional, se transformaron con el plásmido auxiliar pMW-intxis-ts y se cultivaron sobre medio de agar L que contenía 50 mg/l de ampicilina a 30 °C como cultivo en placa, y se seleccionaron cepas resistentes a ampicilina.

Entonces, con el fin de eliminar el plásmido pMW-intxis-ts, se subcultivaron las cepas seleccionadas dos veces sobre medio de agar L a 42 °C, y se examinaron la resistencia a ampicilina y resistencia a cloranfenicol de las colonias obtenidas para obtener una cepa sensible a cloranfenicol y ampicilina con cadA alterado sin att-cat y pMW-intxis-ts. Esta cepa se designó WC196AcadA.

(2) Deleción del gen IdcC de la cepa WC196AcadA

Se delecionó el gen IdeC de la cepa WC196AcadA según el método anteriormente mencionado usando los cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 14 como cebadores para la alteración de IdcC. Se obtuvo de ese modo una cepa con cadA y IdcC alterados, WC196AcadAAldcC.

<2> Introducción de plásmido para la producción de Lys en la cepa WC196AcadAAldcC

Se transformó la cepa WC196AcadAAldcC con el plásmido pCABD2 para la producción de Lys que portaba los genes dapA, dapB y lysC (publicación de patente internacional WO01/53459) de manera convencional para obtener la cepa WC196AcadAAldcC/pCABD2 (WC196LC/pCABD2).

Ejemplo 5: Producción de L-lisina usando E. coli

Este ejemplo muestra un ejemplo de la presente invención aplicado a la producción de L-lisina por E. coli. En este ejemplo, se produjo L-lisina mediante fermentación sin añadir sulfato de amonio ni cloruro de amonio, que se añaden generalmente a los medios con el propósito de suministrar nitrógeno y contraiones para L-lisina en la producción de L-lisina mediante fermentación. Específicamente, se realizó el cultivo sin controlar el pH, pero controlando la concentración de amoniaco en el medio. El intervalo dentro del cual debe controlarse la concentración de amoniaco en el medio se examinó de antemano. Como resultado, se confirmó que la concentración de amoniaco total está preferiblemente en el intervalo de 50 a 100 mM. Por tanto, en el cultivo principal práctico, la concentración de amoniaco total se controló para que fuera de 100 mM o inferior burbujeando gas amoniaco. Además, cuando la concentración de amoniaco total disminuyó hasta 50 mM, se controló con gas amoniaco para mantener esa concentración.

Se usó WC196AcadAAldcC/pCABD2 para la producción de lisina. Se usaron 300 ml del medio de producción de L-lisina para E. coli mostrado en la tabla 3 colocados en un fermentador de jarra. Se ajustó la concentración de amoniaco total a 95 mM burbujeando gas amoniaco. En este medio, se inocularon células obtenidas cultivando la cepa productora de L-lisina sobre toda la superficie del medio de agar LB que contenía 20 |ig/l de estreptomicina y cultivándola a 37 °C durante 24 horas. La cantidad de las células inoculadas correspondía a las células hechas crecer sobre tres placas del medio de agar. Se realizó el cultivo con la temperatura del medio mantenida a 37 °C, aireación de 50 ml por minuto de aire esterilizado con filtro y una velocidad de agitación de 700 rpm. Cuando la concentración de oxígeno disuelto en el medio disminuyó hasta el 20 % de saturación, se cambió la velocidad de aireación a 100 ml por minuto. La disolución de alimentación para E. coli mostrada en la tabla 4 se añadió apropiadamente gota a gota al medio de modo que no se agotara la glucosa, y la concentración de la misma no llegara a ser de 30 g/l o superior en el medio. Finalmente, cuando se consumieron 36 g de glucosa, se terminó el cultivo. Como resultado, el cultivo pudo realizarse favorablemente de modo que toda la glucosa añadida se consumió tras 33 horas, se acumularon 13,4 g de L-lisina y la velocidad de producción de L-lisina fue de 1,2 g/l/h. El rendimiento de esta producción fue del 37 %.

Como control, se muestran resultados para la producción de L-lisina realizada con la misma cepa añadiendo sulfato de amonio, y sin controlar la concentración de amoniaco total, pero controlando el pH, similar a métodos de producción comunes para aminoácidos básicos. Se inoculó la misma cepa de manera similar en un medio que consistía en el medio de producción de L-lisina para E. coli mostrado en la tabla 3 con adición de 13 g/l de sulfato de amonio, y se cultivó al tiempo que se controlaba el pH para que fuera constante a 6,7 burbujeando apropiadamente gas amoniaco. La temperatura, la velocidad de aireación y la velocidad de agitación del cultivo fueron las mismas que las descritas anteriormente. En este caso, se añadió la disolución de alimentación para E. coli con adición de 112,5 g/l de sulfato de amonio (que contenía sulfato de amonio, tabla 5) en lugar de la disolución de alimentación para E. coli mostrada en la tabla 4, de modo que no se agotó la glucosa, y la concentración de glucosa no debe llegar a ser de 30 g/l o superior en el medio, y finalmente se consumieron 36 g de glucosa. Como resultado, toda la glucosa añadida se consumió después de 33 horas, se acumularon 14,7 g de L-lisina y la velocidad de producción de L-lisina fue de 1,3 g/l/h. El rendimiento de esta producción fue del 40 %.

Todas las concentraciones de lisina descritas anteriormente se muestran en cuanto a clorhidrato de lisina. Además, en la figura 4 se muestran cambios en la concentración de amoniaco total y el pH durante los cultivos. A partir de la comparación de estos resultados, se confirmó que, cuando se usó el método de la presente invención, podía realizarse la producción de L-lisina mediante fermentación sin añadir sulfato de amonio o cloruro de amonio a una velocidad de producción de aproximadamente el 92 %, un rendimiento de aproximadamente el 93 % y una cantidad de producción de L-lisina de aproximadamente el 91 % en comparación los obtenidos en la producción fermentativa común en la que se añadió sulfato de amonio.

Tabla 3: Composición del medio de producción de L-lisina para E. coli (por 1 l)

Se pesaron glucosa y FeSO4'7H2O como porción A, se pesaron los otros componentes como porción B, y la porción A tal cual y la porción B ajustada a pH 5,0 se esterilizaron por separado mediante tratamiento en autoclave a 115 °C durante 10 minutos, y luego se mezclaron. Se añadieron 20 |ig/l de estreptomicina al medio antes de su uso.

Tabla 4: Composición de la disolución de alimentación para E coli (por 1 l)

Se esterilizaron los componentes mediante tratamiento en autoclave a 120 °C durante 20 minutos. Se añadieron 20 |ig/l de estreptomicina al medio antes de su uso.

Tabla 5: Composición de la disolución de alimentación para E. coli que contenía sulfato de amonio (por 1 l)

Ejemplo 6: Producción de L-arginina

Este ejemplo muestra un ejemplo de la presente invención aplicado a la producción de L-arginina mediante una bacteria corineforme. Se usó Corynebacterium glutamicum AJ12092 (FERM BP-6906) como cepa productora de L-arginina.

En primer lugar, como control, se muestran resultados para la producción de L-arginina realizada con la misma cepa añadiendo sulfato de amonio, y sin controlar la concentración de amoniaco total, pero controlando el pH, similar a métodos comunes para la producción de un aminoácido básico. Un medio para la producción de L-arginina que tiene la composición mostrada en la tabla 6, con la adición de 65 g/l de sulfato de amonio. Además, la concentración de glucosa se cambió a 40 g/l. Se colocaron 300 ml de este medio en un fermentador de jarra, y se controló el pH para que estuviera a 7,0 burbujeando gas amoniaco. En este medio, se inocularon dos placas de células obtenidas cultivando la cepa de Corynebacterium glutamicum AJ12092 sobre toda la superficie de medio de agar CM-Dex a 31,5 °C durante 24 horas. Se realizó el cultivo a una temperatura del medio mantenida a 31,5 °C con aireación de 150 ml per minuto de aire esterilizado con filtro y agitando a una velocidad de 700 rpm. Además, durante el cultivo, se controló el pH para que estuviera a 6,9 añadiendo una disolución de KOH 6 N que se había esterilizado por separado. A medida que el cultivo progresa, la concentración de glucosa disminuye. Con el fin de mantener la concentración de glucosa a de 30 a 40 g/l, se añadió apropiadamente una disolución de glucosa esterilizada de 692 g/l. Se realizó el cultivo durante 54 horas. Como resultado, se acumularon 23,4 g/l de L-arginina, el rendimiento de producción de L-arginina fue del 26,7 % de la glucosa consumida y la velocidad de producción fue de 0,43 g/l/h. La cantidad de glucosa consumida durante el cultivo era de 29,1 g por lote.

Se realizó producción de L-arginina cuando no se añade sulfato de amonio al medio, y al tiempo que se controla sólo la concentración de amoniaco total, pero no el pH. Los resultados se muestran a continuación en el presente documento. Se colocaron 300 ml del medio de producción de L-arginina que tenía la composición mostrada en la tabla 6 pero que no contenía sulfato de amonio en un fermentador de jarra, y se ajustó la concentración de amoniaco total a 12,6 mM burbujeando gas amoniaco. En este medio, se inocularon dos placas de células de la cepa productora de L-arginina cultivada de la misma manera que la del control. Se realizó el cultivo de la misma manera que el del control manteniendo la temperatura a 31,5 °C, aireando 150 ml por minuto de aire esterilizado con filtro y manteniendo la velocidad de agitación a 700 rpm. Midiendo la concentración de amoniaco total del medio periódicamente o usando un aparato de control de la concentración de amoniaco, se controló el amoniaco total en el medio de modo que estuviera a diversos niveles durante el cultivo. Como resultado, se confirmó que la concentración de amoniaco total en el medio controlado para que fuera de aproximadamente 20 mM añadiendo gas amoniaco según se requiriera proporcionó resultados favorables. El cultivo realizado con el control de la concentración de amoniaco total en el medio para que fuera de aproximadamente 20 mM basándose en el resultado anterior progresó favorablemente, se acumularon 24,2 g/l de L-arginina tras 51 horas y por tanto se logró la fermentación de L-arginina (figura 4). La glucosa consumida durante el cultivo fue de 35,1 g por lote, el rendimiento de producción de L-arginina fue del 20,6 % de la glucosa consumida y la velocidad de producción fue de 0,47 g/l/h. Además, el pH del medio aumentó desde 7,92 al inicio del cultivo hasta 8,02 al final del cultivo.

A partir de la comparación de estos resultados con los del experimento de control, se demostró que la producción de L-arginina mediante fermentación podía realizarse sin añadir sulfato de amonio o cloruro de amonio a un rendimiento de aproximadamente el 77 % y una tasa de producción superior en aproximadamente el 9 % en comparación con los obtenidos en la producción fermentativa común en la que se añadió sulfato de amonio.

Tabla 6: Composición del medio de producción de L-arginina (por 1 l)

Se ajustó el medio a pH 7,0 con disolución acuosa de hidróxido de potasio, hasta 1 l, y se esterilizó mediante tratamiento en autoclave a 115 °C durante 10 minutos.

Explicación del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1: Secuencia de cebador para la clonación del gen lysC

SEQ ID NO: 2: Secuencia de cebador para la clonación del gen lysC

SEQ ID NO: 3: Secuencia de cebador para la clonación del gen lysE

SEQ ID NO: 4: Secuencia de cebador para la clonación del gen lysE

Claims

REIVINDICACIONES

i . Método para producir un aminoácido básico mediante fermentación que comprende cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir el aminoácido básico en un medio líquido contenido en un tanque de fermentación para producir y acumular el aminoácido básico en el medio;

en el que la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro usados como contraiones de dicho aminoácido básico se reduce ajustando la concentración de amoniaco total en el medio para que esté dentro de un intervalo de concentración específico de 300 mM o inferior durante al menos una parte del periodo total del procedimiento de cultivo;

en el que la al menos parte del periodo total incluye un periodo en el que el pH del medio aumenta debido a la escasez de los contraiones provocada por la acumulación de dicho aminoácido básico; y

en el que el microorganismo es una bacteria corineforme o una bacteria de Escherichia coli.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta añadiendo amoniaco o urea al medio cuando la actividad del microorganismo se reduce o cesa tal como se determina basándose en los indicadores: concentración de oxígeno disuelto en el medio, velocidad de consumo de la fuente de carbono en el medio, turbidez del medio, productividad del aminoácido básico y cambio de pH en el medio.
3. Método según la reivindicación 1, en el que se usa como medio un medio que tiene la misma composición que la de un medio que contiene iones sulfato y/o iones cloruro como fuente de contraiones del aminoácido básico en una cantidad suficiente para realizar el cultivo a pH 7,2 o inferior excepto porque la cantidad de iones sulfato y/o iones cloruro se reduce en una cantidad deseada, y la al menos una parte del periodo total es un periodo en el que pH del medio no puede mantenerse para que esté a 7,2 o inferior debido a la escasez de contraiones para el aminoácido básico que se ha acumulado en el medio.
4. Método según la reivindicación 1, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para que esté a 200 mM o inferior.
5. Método según las reivindicaciones 1 o 4, en el que la concentración de amoniaco total en el medio se ajusta para que esté a 100 mM o inferior.
6. Método según la reivindicación 1, que comprende la etapa de hacer que el microorganismo prolifere.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la concentración de amoniaco total no se ajusta durante la etapa de hacer que el microorganismo prolifere.
8. Método según la reivindicación 1, en el que el aminoácido básico se selecciona de L-lisina, L-arginina y L-histidina.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el aminoácido básico es L-lisina.
10. Método según la reivindicación 8, en el que el aminoácido básico es L-arginina.
11. Método según la reivindicación 1, en el que el medio o un producto procesado del mismo se calienta después de la fermentación para eliminar iones bicarbonato e iones carbonato.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en el que dicho método da como resultado un producto de fermentación que incluye concentrado y producto secado obtenidos del caldo de fermentación, y productos obtenidos procesando el caldo de fermentación o producto secado del mismo.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la bacteria corineforme es Corynebacterium glutamicum o Brevibacterium lactofermentum.