BRPI0721063B1

BRPI0721063B1 - Method for producing an l-aminoacid

Info

Publication number: BRPI0721063B1
Application number: BRPI0721063-9A
Authority: BR
Inventors: Hara Yoshihiko; Izui Hiroshi; Nakamura Jun; Nishi Ranko
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2017-11-14
Also published as: BRPI0721063A2; EP2100957A1; US20090286290A1; EP2100957A4; CN101563453A; JP2010041920A; WO2008075483A1; US8058035B2; CN101563453B; EP2100957B1

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico [001] A presente invenção se refere a um método para produzir um L-aminoácido tal como ácido L-glutâmico usando um microorganismo. Ácido L-glutâmico é útil como um material de condimentos, e os outros L-aminoácidos são úteis em indústria como aditivos alimentares para animal, ingredientes de alimentos naturais, infusões de aminoácidos, e assim por diante.

Estado da Técnica Anterior [002] Métodos para produzir uma substância alvo tal como um L-aminoácido por fermentação usando uma bactéria incluem métodos de usando uma bactéria tipo selvagem (linhagem tipo selvagem), uma linhagem auxotrófica derivada de uma linhagem tipo selvagem, uma linhagem de regulação metabólica mutante derivada de uma linhagem tipo selvagem como uma linhagem resistente a várias drogas, uma linhagem tendo propriedades tanto de linhagem auxotrófica como mutante de regulação metabólica, e assim por diante.

[003] Por exemplo, ácido L-glutâmico é produzido principalmente por fermentação usando uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico da assim chamada bactéria corineforme pertencendo ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou uma linhagem mutante desta (se referir a, e.g., documento não de patente 1). Além disso, como métodos para produzir ácido L-glutâmico usando outras linhagens, métodos utilizando um microorganismo pertencendo ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium, ou os semelhantes (se referir a, e.g., documento de patente 1), Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, ou os semelhantes (se referir a, e.g., documento de patente 2), Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (atualmente Enterobacter aerogenes), ou os semelhantes (se referir a, e.g., documento de patente 3), uma linhagem mutante de Escherichia coli (se referir a, e.g., documento de patente 4), e assim por diante são conhecidos. Além disso, os requerentes da presente invenção propuseram um método de produzir ácido L-glutâmico usando um microorganismo pertencendo ao gênero Klebsiella, Erwinia, Pantoea, ou Enterobacter (se referir a, e.g., documentos de patente 5 a 7).

[004] Nos anos recentes, técnicas de DNA recombinante foram usadas na produção de substâncias alvo por fermentação. Por exemplo, produtividade de L-aminoácido de uma bactéria é melhorada acentuando expressão de um gene codificando uma enzima biossintética de L-aminoácido (documento de patente 8 e 9), ou acentuando absorção de uma fonte de carbono para o sistema de biossíntese de L-aminoácido (documento de patente 10).

[005] Por exemplo, como para produção de ácido L-glutâmico, foi relatado que introdução de um gene codificando citrato sintase de Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum foi efetiva para acentuação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico em uma bactéria corineforme pertencendo ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium (se referir a, e.g., documento de patente 11). Além disso, foi relatado que introdução de um gene de citrato sintase de uma bactéria corineforme em uma enterobactéria pertencendo ao gênero Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia ou Escherichia foi efetiva para acentuação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico (se referir a, e.g., documento de patente 12).

[006] Também se sabe que microorganismos que são deficientes em a-cetoglutarato desidrogenase (α-KGDH) produzem uma notável quantidade de ácido L-glutâmico (documentos de patente 13 a 15).

[007] Succinato desidrogenase (SDH) é uma enzima que catalisa a reação de converter ácido succínico a ácido fumárico, e foi relatado que uma bactéria corineforme deficiente no gene desta enzima produziu uma pequena quantidade de ácido L-glutâmico (documento de patente 16).

[008] Além disso, embora uma linhagem deficiente em succinato desidrogenase também seja conhecida para Escheríchia coli pertencendo às enterobactérias (documento não de patente 2), relação entre deficiência de succinato desidrogenase e produção de ácido L-glutâmico não foi conhecida.

[009] Além disso, sabe-se que se α-cetoglutarato desidrogenase é deletada em uma linhagem de Escheríchia coli, a linhagem passa a apresentar auxotrofia para ácido succínico, mas dupla deficiência de SDH e a-eetoglutarato desidrogenase cura a linhagem da auxotrofia para ácido succínico (documento nào de patente 2). Entretanto, efeito de dupla deficiência de α-cetoglutarato desidrogenase e succinato desidrogenase em produção de um L-aminoácido tal como ácido L-glutâmico não é conhecido, documento de patente 1: patente US 3.220.929 documento de patente 2: patente US 3.563.857 documento de patente 3: publicação de patente JP (Kokoku) No. S32-9393 documento de patente 4: patente JP Não-examinada (Kokai) No. H5-244970 documento de patente 5: patente JP Não-examinada No, 2000- 106869 documento de patente 6: patente JP Não-examinada No. 2000- 189169 documento de patente 7: patente JP Não-examinada No. 2000- 189175 documento de patente 8: patente US 5.168.056 documento de patente 9: patente US 5.776.736 documento de patente 10: patente US 5.906.925 documento de patente 11: patente JP Não-examinada No. H7- 121228 documento de patente 12: patente JP Não-examinada No. 2000-189175 documento de patente 13: patente EP 771879A documento de patente 14: patente EP 0952221A documento de patente 15: patente EP 1078989A documento de patente 16: patente EP 1106684A documento não de patente 1: Kunihiko Akashi, et. al. "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center, 1986, pp. 195-215 documento não de patente 2: J. Gen. Microbiol., 1978 Jul; 107 (1): 1-13 Descrição da invenção Objetivo a ser atingido pela invenção [0010] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma bactéria que é capaz de produzir eficientemente um L-aminoácido, e fornecer um método de produzir eficientemente um L-aminoácido usando a bactéria.

Meios para atingir o objetivo [0011] Os requerentes da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de atingir o objetivo mencionado acima, como um resultado, encontrado que produtividade de L-aminoácido tal como ácido L-glutâmico em uma bactéria foi melhorada modificando a bactéria de forma que atividade de succinato desidrogenase e atividade de α-cetoglutarato desidrogenase sejam diminuídas, e assim realizada a presente invenção.

[0012] Isto é, a presente invenção fornece os seguintes. (1) Um método para produzir um L-aminoácido, o método compreendendo cultivar em um meio um microorganismo que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido e foi modificado de forma que atividade de succinato desidrogenase e atividade de a-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células do microorganismo, e coletar o L-aminoácido do meio ou células. (2) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que a atividade de succinato desidrogenase ou a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase é diminuída reduzindo expressão de um gene codificando succinato desidrogenase ou α-cetoglutarato desidrogenase ou rompendo o gene. (3) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que o gene codificando succinato desidrogenase é um ou mais tipos de genes selecionados a partir de gene sdhA, gene sdhB, gene sdhC e gene sdhD. (4) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que o gene codificando α-cetoglutarato desidrogenase é um ou mais tipos de genes selecionados a partir de gene sucA, gene odhA e gene sucB. (5) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria pertencendo à família Enterobactenaceae ou uma bactéria corineforme. (6) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é ácido L-glutâmico ou um L-aminoácido que é biossintetizado através de ácido L-glutâmico como um precursor. (7) O método mencionado acima, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é selecionado a partir de L-arginina, L-prolina, L-omitina, L-citrulina e L-glutamina.

Breve Descrição das Ilustrações [0013] Fig. 1 mostra estrutura do plasmídeo ajudante RSF-Red-TER.

[0014] Fig. 2 mostra construção do plasmídeo ajudante RSF-Red-TER.

Melhor modo para realizar a invenção [0015] A seguir, a presente invenção será explicada em detalhe. <1> Microorganismo usado para a presente invenção [0016] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido, que utiliza um microorganismo que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido e que foi modificado de forma que atividade de succinato desidrogenase e atividade de α-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas.

[0017] O microorganismo usado para a presente invenção pode ser obtido modificando um microorganismo que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido usado como uma linhagem parental de forma que atividade de succinato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase do microorganismo é diminuída. O microorganismo usado para a presente invenção também pode ser obtido fornecendo uma capacidade de produzir L-aminoácido para ou acentuando uma capacidade de produzir L-aminoácido de um microorganismo modificado de forma que atividade de succinato desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase do microorganismo é diminuída usado como uma linhagem parental.

[0018] O microorganismo usado na presente invenção pode inerentemente ter uma capacidade de produzir um L-aminoácido, ou a capacidade pode ser concedida por melhoramento usando um método de mutação, uma técnica de DMA recombinante ou os semelhantes.

[0019] As palavras "capacidade de produzir L-aminoácido" se referem a uma capacidade de produzir L-aminoácido a um tal grau que L-aminoácido pode ser coletado do meio ou células quando microorganismo usado na presente invenção é cultivado no meio. Preferivelmente, isto significa que o microorganismo exibe uma capacidade de produzir L-aminoácido em uma quantidade que é maior do que é produzida por uma linhagem tipo selvagem ou não modificada do microorganismo cultivado nas mesmas condições. [00201 Exemplos do L-aminoácido incluem L-lisina, ácido L-glutâmico, L-treonina, L-valína, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, ácido L-asparagínico, L-asparagina, L-glutamina, L-arginina, L-cisteína (cistina), L-metionina, L-fenilalanina, L-triptofano, L-tirosina, L-glicina, L-alanina, L-prolina, L-ornitina, L-citrulina, L-homoserina e assim por diante. Ácido L-glutâmico ou L-aminoácido cujo precursor é ácido L-glutâmico ou L-glutamina é preferido. Dentre estes, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- prolina, L-arginina, L-omitina e L-citrulina são preferidos.

[0021] Microorganismos usados para a presente invenção incluem, mas não são limitados a, bactérias pertencendo a Enterobacteriaceae tal como aquelas de gêneros Escherichia, Pantoea, e Enterobacter, bactérias corineformes tal como Corynebacterium glutamicum e Brevibacterium lactofermentum, e bactérias Bacillus tal como Bacillus subcillis.

[0022] Na presente invenção, bactérias corineformes incluem aquelas bactérias tendo sido até agora classificadas no gênero Brevibacterium, mas classificadas no gênero Corynebacterium no presente (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), e incluem bactérias pertencendo ao gênero Brevibacterium intimamente relacionado ao gênero Corynebacterium. Exemplos de tais bactérias corineformes são listados abaixo.

Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum [0023] Exemplos específicos das bactérias incluem os seguintes. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP- 1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067 Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (iCorynebacterium glutamicum ATCC 13869) Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 [0024] Estas linhagens estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são dados a cada uma das linhagens, e as linhagens podem ser ordenadas usando estes números de registro. Linhagem AJ12340 foi depositada em 27 de Outubro de 1987 em National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), como um número de acesso número de FERM BP-1539 baseado no Tratado de Budapeste.

[0025] Microorganismos pertencendo a Enterobacteriaceae usados para a presente invenção incluem, mas não são limitados a, bactérias pertencendo aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella ou os semelhantes e tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido. Especificamente, bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae de acordo com a classificação mostrada em banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.n1m.nih.gov/hthin-post/T axonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep= 1 &srchmode= 1 &unlock) podem ser usadas. Dentre as bactérias da família Enterobacteriaceae, bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, Enterobacter, ou Pantoea são preferivelmente usadas como a linhagem parental.

[0026] Bactérias Escherichia que podem ser usadas como a linhagem parental incluem, mas não são limitadas a, bactérias Escherichia relatadas por Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C.et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1), tal como Escherichia coli. Exemplos específicos de Escheríchia coli incluem Escherichia coli linhagem W3110 (ATCC 27325), e linhagem MG1655 (ATCC 47076), que é derivada da linhagem K12 tipo selvagem (protótipo) de Escherichia coli, e assim por diante.

[0027] Em particular, bactérias Pantoea, bactérias Erwinia e bactérias Enterobacter são classificadas como γ-proteobactérias, e elas são taxonomicamente muito próximas umas às outras (J. Gen. Appl. Microbiol., Dec. 1997, 43(6), 355-361; International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997, pp.1061-1067). Nos anos recentes, algumas bactérias pertencendo ao gênero Enterobacter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou as semelhantes, com base em experimentos de hibridização DNA-DNA etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989, 39(3).p.337-345). Além disso, algumas bactérias pertencendo ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (se referir a International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1993, 43(1), pp.162-173).

[0028] Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, as linhagens exemplificadas em patente EP 952221A podem ser usadas. Uma linhagem típica do gênero Enterobacter é Enterobacter agglomeranses ATCC 12287.

[0029] Linhagens típicas das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea citrea. Exemplos específicos incluem as linhagens seguintes: Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, EP0952221A) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, EP0952221A) [0030] Embora estas linhagens sejam descritas como Enterobacter agglomerans em patente EP 0952221A, elas atualmente são classificadas como Pantoea ananatis com base em análise de seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA etc., como descrito acima.

[0031] Exemplos das bactérias Erwinia incluem Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola. Exemplos específicos incluem as linhagens seguintes: Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia carotovora ATCC 15713 Klebsiella planticola AJ13399 (FERM BP-6600, EP955368A) Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, EP955368A). <1-1> Fornecimento ou acentuação de capacidade de produção de L-aminoácido [0032] A seguir, métodos para fornecer uma capacidade de produção de L-aminoácido a tais microorganismos como descrito acima, ou métodos para acentuar uma capacidade de produção de L-aminoácido de tais microorganismos como descrito acima, são descritos.

[0033] Para fornecer a capacidade de produzir um L-aminoácido, métodos convencionalmente empregados no melhoramento das bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (veja "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), lst Edition, publicado em 30 de Maio de 1986, pp. 77-100) podem ser aplicados. Tais métodos incluem aquisição de um mutante auxotrófico, uma linhagem resistente a análogo, ou um mutante de regulação metabólica, ou construção de uma linhagem recombinante tendo expressão acentuada de uma enzima de biossíntese de L-aminoácido. No melhoramento de bactérias produtoras de L-aminoácido, uma ou duas ou mais propriedades, tal como mutação auxotrófica, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica podem ser fornecidas. A expressão de uma ou duas ou mais enzimas de biossíntese de L-aminoácido pode ser acentuada. Além disso, o fornecimento de propriedades tal como mutação auxotrófica, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica pode ser combinado com a acentuação de enzimas de biossíntese.

[0034] Uma linhagem mutante auxotrófíca, linhagem resistente a análogo de L-amínoãcido, ou linhagem mutante de regulação metabólica com uma capacidade de produzir um L-aminoácido pode ser obtida sujeitando uma linhagem parental ou linhagem tipo selvagem a uma mutagênese convencional, tal como exposição a raios X ou radiação UV, ou tratamento com um mutagênico tal como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina, etc., e então selecionando aquelas que exibem uma auxotrofia, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica e que também têm a capacidade de produzir um L-aminoácido a partir das linhagens mutantes obtidas. Uma bactéria produtora de L-aminoácido também pode ser obtida acentuando uma atividade enzimática de enzima de biossíntese de L-aminoácido por recombinação gênica.

[00351 Métodos para fornecer uma capacidade de produção de L-aminoácido, e microorganismos aos quais uma capacidade de produzir L-aminoácido é fornecida serão exemplificados abaixo.

[0036] Exemplos de métodos para fornecimento ou acentuação de Capacidade de produção de ácido L-glutâmico por melhoramento incluem modificar um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico de forma que expressão destes genes é acentuada. Exemplos de tais genes incluem, mas não são limitados a, genes codificando glutamato desidrogenase (gdhA\ glutamina sintetase igfnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, etcnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase, piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA\ piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpíA), frutose bisfosfato aldolase (jbp), fosfofmtoquinase (pfkA. pjkB), glicose fosfato isomerase (pgi), metil citrato sintase (ptpC), e assim por diante. As abreviações em parênteses representam os nomes de genes (o mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões daqui por diante).

[0037] Expressão destes genes pode ser acentuada por introdução de um plasmídeo de amplificação obtido introduzindo um fragmento de DNA contendo qualquer destes genes em um plasmídeo apropriado tal como um plasmídeo vetor contendo pelo menos um gene responsável por replicação do plasmídeo em um microorganismo. Outros métodos de aumentar expressão gênica incluem aumentar o número de cópias destes genes no cromossomo bacteriano por conjugação, transferência gênica, etc., ou introduzindo uma mutação na região promotora destes genes (se referir à publicação de pedido internacional W095/34672).

[0038] Quando um gene é introduzido no plasmídeo mencionado acima para amplificação ou cromossomo, o promotor para expressar o gene pode ser qualquer promotor incluindo o promotor nativo para o gene a ser amplificado e um promotor modificado, contanto que ele funcione nas bactérias corineformes escolhidas. A quantidade de expressão gênica pode ser controlada escolhendo um promotor adequado que funciona fortemente em bactérias corineformes ou movendo região -35 ou -10 mais próximo a seqüência consenso. Exemplos de bactérias corineformes que foram modificadas para acentuar expressão do gene de citrato sintase, gene de isocitrato desidrogenase, gene de piruvato desidrogenase, e/ou gene de glutamato desidrogenase são descritos na publicação de pedido internacional WO00/18935 e patente EP 1010755A.

[0039] Além disso, a capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser fornecida reduzindo ou deletando a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de ácido L-glutâmico e produz um outro composto do que ácido L-glutâmico. Exemplos de enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de ácido L-glutâmico e produz um outro composto do que ácido L-glutâmico incluem isocitrato liase, ácido acetohidroxi sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, l-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase, acetil-CoA hidrase (publicação de pedido pedido internacional W02006/057450), e assim por diante.

[0040] Atividades das enzimas descritas acima podem ser diminuídas ou deletadas por um método similar aos métodos para diminuir a atividade de succinato desidrogenase ou atividade de α-cetoglutarato desidrogenase descrita depois.

[0041] Além disso, capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser fornecida a uma bactéria corineforme amplificando o gene yggB (NCgl 1221;NP_600492. Reports small-conductance...[gi: 19552490]) ou introduzindo um gene yggB mutante contendo uma mutação na região de codificação deste (pedido internacional W02006/070944).

[0042] Exemplos de métodos para acentuar capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem introduzir genes codificando D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou fmtose-6-fosfato fosfocetolase (estas são coletivamente chamadas fosfocetolase). Exemplos de microorganismos que têm atividade de fosfocetolase acentuada incluem os seguintes microorganismos (pedido internacional W02006/016705): Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869AsucA (pVK9- xfp) Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869AsucA (pVK9- PS2_xpkA) [0043] Capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser fornecida acentuando a atividade de 6-fosfogluconato desidratase, a atividade de 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato aldolase, ambas estas atividades. Exemplos de microorganismo cuja atividade de 6-fosfogluconato desidratase e a 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato aldolase são aumentadas incluem o microorganismo descrito em patente JP Não-examinada No. 2003-274988. Além disso, capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser fornecida amplificando o gene yhflC, que é um gene de secreção de ácido L-glutâmico (pedido internacional W02005/085419).

[0044] Como um microorganismo produtor de ácido L-glutâmico usado para a presente invenção, um microorganismo tendo uma capacidade de acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido em uma quantidade excedendo a concentração de saturação de ácido L-glutâmico quando ele é cultivado em condições acídicas (de agora em diante também referido como uma capacidade de acumulação de ácido L-glutâmico em condições acídicas) pode ser usado. Por exemplo, obtendo uma linhagem cuja resistência a ácido L-glutâmico em um ambiente de baixo pH é melhorada de acordo com o método descrito em patente EP 1078989A, a capacidade de acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade excedendo a concentração de saturação pode ser fornecida.

[0045] Exemplos específicos do microorganismo originalmente tendo a capacidade de acumulação de ácido L-glutâmico em condições acídicas incluem o Pantoea ananatis linhagem AJ13355 (FERM BP-6614), linhagem AJ13356 (FERM BP-6615), linhagem AJ13601 (FERM BP-7207) (para estas, se referir a patente EP 0952221A), linhagem SC17sucA, linhagem SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, linhagem NP106, linhagem NA1, e assim por diante.

[0046] A linhagem AJ13355 de Pantoea ananatis foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão como uma linhagem que pode se proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em baixo pH. A linhagem AJ13356 foi obtida deletando o gene de subunidade aKGDH-El (,sucA) da linhagem AJ13355.

[0047] Linhagens AJ13355 e AJ13356 de Pantoea ananatis foram depositadas em 19 de Fevereiro de 1998 em National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), como números de acesso de FERM P-16644 e FERM P-16645 respectivamente, o depósito original foi convertido para um depósito internacional baseado no Tratado de Budapeste em 11 de Janeiro de 1999, e depositado como números de acesso de FERM BP-6614 e FERM BP-6615, respectivamente. Estas linhagens foram identificadas quando elas foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans e depositadas como linhagens AJ13354 e AJ13355 de Enterobacter agglomerans, mas estas linhagens foram reclassificadas como Pantoea ananatis baseado em uma análise da seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA (veja exemplos abaixo). Além disso, embora a linhagem AJ13601 descrita abaixo também esteja depositada no depósito como Enterobacter agglomerans, ela é descrita como Pantoea ananatis neste relatório. A linhagem AJ13601 de Pantoea ananatis foi depositada em 18 de Agosto de 1999 em National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), como um número de acesso de FERM P-17516, e o depósito original foi convertido para um depósito internacional baseado no Tratado de Budapeste em 6 de Julho de 2000, como um número de acesso de FERM BP-7207.

[0048] Além disso, exemplos de linhagem de Pantoea ananatis produtora de ácido L-glutâmico incluem bactérias pertencendo ao gênero Pantoea nas quais atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (α-KGDH) é eliminada ou reduzida. Exemplos de tais linhagens incluem a linhagem AJ 13356, e a linhagem SC17sucA (patente US 6.596.517) que é uma linhagem deficiente em gene sitcA derivada da linhagem SC 17 selecionada como uma linhagem mutante com baixa produção de fleuma da linhagem AJ13355, A linhagem SClTsucA foi determinada um número privado de AJ417, depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-i, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) em 26 de Fevereiro de 2004, e determinado um número de acesso de FERM BP-08646.

[0049] A linhagem SC 17sucA/RSFCPG+pSTVCB descrita acima foi obtida introduzindo o plasmídeo RSFCPG contendo o gene de citrato sintase (gltA), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase ippsA) e o gene de glutamato desidrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene de cilrato sintase (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum na linhagem SC17sucA. A linhagem AJ 13601 foi selecionada a partir da linhagem SC 17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma linhagem tendo resistência a ácido L-glutâmico de uma alta concentração em um baixo pH. Além disso, a linhagem NP106 corresponde à linhagem AJ 13601 na qual plasmídeos RSFCPG+pSTVCB são eliminados como descrito nos exemplos.

[0050] Como outros métodos para fornecer ou acentuar capacidade de produção de ácido L-glutâmico, podem ser mencionados métodos de fornecer resistência a um análogo de ácido orgânico, inibidor respiratório ou os semelhantes e métodos de fornecer sensibilidade a um inibidor de síntese de parede celular. Exemplos incluem, por exemplo, fornecer resistência a ácido monofluoroacético (patente JP Não-examinada No. 50-113209), fornecer resistência a adenina ou resistência a ti mina (patente JP Não-examinada No. 57-065198), atenuar urease (patente JP Não-examinada No, 52-038088), fornecer resistência a ácido malônico (patente JP Não-examinada No. 52-038088), fornecer resistência a benzopironas ou naftoquinonas (patente JP Não-examinada No. 56-1889), fornecer resistência a HOQNO (patente JP Não-examinada No. 56-140895), fornecer resistência a ácido a-cetomalônico (patente JP Não-examinada No. 57-2689), fornecer resistência a guanidina (patente JP Não-examinada No. 56-35981), fornecer sensibilidade a penicilina (patente JP Não-examinada No. 4-88994), e assim por diante.

[0051] Exemplos específicos de tais bactérias resistentes incluem as linhagens seguintes.

Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632, patente JP Não-examinada No. 50-113209) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, patente JP Não-examinada No. 57-065198) Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007, patente JP Não-examinada No. 56-1889) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, patente JP Não-examinada No. 56-1889) Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318, patente JP Não-examinada No. 57-2689) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, patente JP Não-examinada No. 57-2689) Brevibacterium flavum AJ11564 (FERM BP-5472, patente JP Não-examinada No. 56-140895) Brevibacterium flavum AJ11439 (FERM BP-5136, patente JP Não-examinada No. 56-35981) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, patente JP Não-examinada No. 04-88994) Brevibacterium lactofermentum AJ11426 (FERM P-5123, patente JP Não-examinada No. 56-048890) Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, patente JP Não-examinada No. 56-048890) Brevibacterium lactofermentum AJ11796 (FERM P-6402, patente JP Não-examinada No. 58-158192) [0052] Exemplos preferidos de microorganismos tendo capacidade de produção de L-glutamina são bactérias nas quais atividade de glutamato desidrogenase é acentuada, bactérias nas quais atividade de glutamina sintetase (glnA) é acentuada, e bactérias nas quais gene de glutaminase é rompido (pedido de patente EP Não-examinado Nos. 1229121 e 1424398). Acentuação da atividade de glutamina sintetase também pode ser atingida rompendo a glutamina adenililtransferase (glnE) ou rompendo a proteína de controle PII (glnB). Além disso, uma linhagem que pertence ao gênero Escherichia e tem uma glutamina sintetase mutante na qual o resíduo de tirosina em posição 397 é substituído por outro resíduo de aminoácido também pode ser exemplificada como uma bactéria produtora de L-glutamina preferida (publicação de pedido de patente US 2003/0148474).

[0053] Outros métodos para fornecer ou acentuar capacidade de produção de L-glutamina são o método de fornecer resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina (patente JP Não-examinada No. 3-232497), fornecer resistência a análogo de purina e resistência a sulfóxido de metionina (patente JP Não-examinada No. 61-202694), fornecer resistência a ácido a-cetomálico (patente JP Não-examinada No. 56-151495), e assim por diante. Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produção de L-glutamina incluem as linhagens seguintes.

Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, patente JP Não-examinada No. 56-161495) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381, patente JP Não-examinada No. 56-161495) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, patente JP Não-examinada No. 61-202694) [0054] Exemplos de microorganismos tendo capacidade de produção de L-prolina incluem, por exemplo, bactérias tendo γ-glutamil quinase que é dessensibilizada para inibição por retroalimentação por L-prolina e bactérias nas quais sistema de decomposição de L-prolina é atenuado. O método de modificar bactérias usando um DNA codificando γ-glutamil quinase dessensibilizada para inibição por retroalimentação por L-prolina é descrito em Dandekar, A.M., Uratsu S.L., J. Bacteriol., 170, 12:5943-5 (1988). Além disso, exemplos do método para obter uma bactéria nas quais sistema de decomposição de L-prolina é atenuado incluem, por exemplo, um método de introduzir uma mutação em um gene de prolina desidrogenase para reduzir sua atividade enzimática. Exemplos de bactérias tendo capacidade de produção de L-prolina incluem as linhagens NRRL B-12403 e NRRL B-12404 de Escherichia coli (patente GB No. 2075056), linhagem VKPM B-8012 de Escherichia coli (publicação de pedido de patente US 2002/0058315), e linhagens tendo o plasmídeo mutante descrito na patente DE No. 3127361 ou o plasmídeo mutante descrito na referência de Bloom F.R. et al. (The 15th Miami Winter Symposium, 1983, p.34).

[0055] Além disso, microorganismos preferidos tendo capacidade de produção de L-prolina também incluem a Escherichia coli linhagem 702 (VKPMB-8011), que é uma linhagem resistente a 3,4-dehidroxiprolina e azetidina-2-carboxilato, linhagem 702ilvA (linhagem VKPMB-8012), que é uma linhagem deficiente em ilvA da linhagem 702, linhagens de E. coli nas quais atividade de proteína codificada pelo gene b2682, b2683, bl242 ou b3434 é acentuada (patente JP Não-examinada No. 2002-300874), e assim por diante.

[0056] Exemplos de linhagens produtoras de L-prolina de bactérias corineformes incluem a linhagem resistente a DL-3,4-dehidroprolina (FERM BP-1219, patente US 4.224.409), as linhagens nas quais atividade de citrato sintetase aumenta 1,4 vezes ou mais se comparadas com linhagens parentais destas (FERM P-5332, FERM P-5333, FERM P-5342, FERMP-5343, patente JP No. 1426823), e a linhagem para a qual auxotrofia para ácido acético é fornecida (FERM P-5931).

[0057] Exemplos de microorganismo tendo capacidade de produção de L-leucina incluem linhagens de Escherichia coli resistentes a 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina tal como linhagem H-9068 (ATCC 21530), linhagem H-9070 (FERM BP-4704) e linhagem H-9072 (FERM BP-4706) (patente US 5.744.331), linhagens de Escherichia coli tendo isopropil malato sintase dessensibilizada para inibição por retroalimentação por L-leucina (patente EP No. 1067191), linhagens de Escherichia coli resistentes a β-2-tienilalanina e β-hidroxileucina tal como linhagem AJ11478 (patente US 5.763.231), linhagem 57 de Escherichia coli (VKPM B-7386, patente Russa No. 2140450), e assim por diante.

[0058] Exemplos de linhagem produtora de L-leucina de bactérias corineformes incluem linhagem resistente a 2-tiazolalanina e β-hidroxileucina (patente JP Não-examinada No. 8-266295), linhagem resistente a análogo de valina (patente JP Não-examinada No. 63-248392), linhagem auxotrófica para valina (publicação de patente JP No. 38-4395), linhagem resistente a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC) (publicação de patente JP No. 51-37347), e linhagem auxotrófica para fenilalanina, valina e isoleucina (publicação de patente JP No. 54-36233).

[0059] Exemplos de microorganismo tendo capacidade de produção de L-cisteína incluem linhagem JM15 de Escherichia coli que é transformada com um alelo cysE codificando serina acetiltransferases dessensibilizada para inibição por retroalimentação (patente US 6.218.168), linhagem W3110 de Escherichia coli tendo genes superexpressos que codificam proteínas adequadas para excretar substâncias tóxicas para células (patente US 5.972.663), linhagem de Escherichia coli tendo atividade diminuída de cisteína dessulfoidrase (patente JP Não-examinada No. 11-155571), linhagem W3110 de Escherichia coli na qual um ativador transcricional para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB é amplificado (pedido internacional WOO1/27307), e assim por diante.

[0060] Exemplos de microorganismo tendo capacidade de produção de L-isoleucina incluem, por exemplo, linhagens mutantes do gênero Escherichia tendo resistência a 6-dimetilaminopurina (patente JP Não-examinada No. 5-304969), mutantes tendo resistência a hidroxamato de L-isoleucina, tiaisoleucina, DL-etionina ou hidroxamato de arginina (patente JP Não-examinada No. 5-130882), linhagens recombinantes nas quais gene de treonina desaminase e gene de acetohidroxato sintase são amplificados (patente JP Não-examinada Nos. 2-458, 2-42988 e 8-47397), e assim por diante.

[0061] Exemplos de linhagens produtoras de L-isoleucina de bactérias corineformes incluem a bactéria corineforme na qual o gene bmE codificando uma proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada é amplificado (patente JP Não-examinada No. 2001-169788), bactérias corineformes às quais capacidade de produção de L-isoleucina é fornecida por fusão de protoplastos com uma bactéria produtora de L-lisina (patente JP Não-examinada No. 62-74293), bactérias corineformes com homoserina desidrogenase acentuada (patente JP Não-examinada No. 62-91193), linhagens resistentes a hidroxamato de treonina (patente JP Não-examinada No. 62-195293), linhagens resistentes a ácido α-cetomalônico (patente JP Não-examinada No. 61-15695), e as linhagens resistentes a metilisina (patente JP Não-examinada No. 61-15696).

[0062] Capacidade de produção de L-valina pode ser fornecida aumentando as atividades de enzimas sintéticas de L-valina codificadas pelo operon ilvGMEDA, em particular, atividade de acetohidroxilato sintase codificada pelo gene ilvG (publicação de patente JP No. 02-748418). Tais enzimas sintéticas de L-valina podem ser dessensibilizadas para a inibição por retroalimentação por L-valina. Capacidade de produção de L-valina também pode ser fornecida diminuindo expressão de gene de acetolactato sintase III (ilvIH gene).

[0063] Além disso, capacidade de produção de L-valina também pode ser fornecida fornecendo resistência a análogo de aminoácido a uma bactéria. Exemplos de tais bactérias incluem linhagens mutantes que são auxotróficas para L-isoleucina e L-metionina e resistentes a D-ribose, nucleosídeo de purina, ou ribonucleosídeo de pirimidina (FERM P-1841 e P-5556; patente JP Não-examinada No. 53-025034), e uma linhagem mutante que é resistente a policetídeo (FERM P-9325, patente JP No. 1934507).

[0064] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina também incluem linhagens com aminoacil t-RNA sintetase mutantes (patente US 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS codificando isoleucina tRNA sintetase, pode ser usado. E. coli VL1970 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 24 de Junho de 1988 sob um número de acesso VKPM B-4411.

[0065] Além disso, mutantes requerendo ácido lipóico para crescimento e/ou carecendo de H+-ATPase (pedido internacional WO96/06926) também podem ser usados como linhagens parentais.

[0066] Exemplos de linhagem produtora de L-valina de bactérias corineformes incluem, por exemplo, uma linhagem modificada de forma que expressão de um gene codificando uma enzima que participa na biossíntese de L-valina é acentuada. Exemplos da enzima que participa na biossíntese de L-valina incluem, por exemplo, aquelas codificadas pelo operon ilvBNC, i.e., tal como ácido acetohidroxi sintase codificada por ilvBN e isomerorredutase (ilvC) (pedido internacional WO00/50624). Em adição, uma vez que o operon ilvBNC está sob o controle do operon por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, é desejável eliminar a atenuação a fim de eliminar a supressão de expressão por L-valina a ser produzida.

[0067] Exemplos de microorganismos tendo uma capacidade de produção de L-alanina incluem bactérias corineformes deficientes na atividade de H+-ATPase (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Nov; 57(4): 534-40), bactérias corineformes nas quais gene de aspartato β-descarboxilase é amplificado (patente JP Não-examinada No. 07-163383), e assim por diante.

[0068] Exemplos de microorganismos tendo uma capacidade de produção de L-arginina incluem linhagens mutantes de Escherichia coli que têm resistência a α-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, hidroxamato de arginina, AEC (S-(2-aminoetil)-cisteína), α-metilserina, β-2-tienilalanina, ou sulfaguanidina (se referir a patente JP Não-examinada No. 56-106598). A linhagem 237 de Escherichia coli que é uma linhagem produtora de L-arginina que abriga N-acetilglutamato sintase altamente ativa tendo uma mutação para resistência a inibição por retroalimentação por L-arginina (pedido de patente Russa No. 2000117677) também é uma bactéria produtora de L-arginina preferida. A linhagem 237 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII Genetika) em 10 de Abril de 2000 sob um número de acesso de VKPM B-7925, e o depósito original foi convertido para um depósito internacional baseado no Tratado de Budapeste em 18 de Maio de 2001. A linhagem 382 de Escherichia coli, que é uma derivada da linhagem 237 e é uma linhagem produtora de L-arginina tendo capacidade melhorada de assimilar ácido acético (patente JP Não-examinada No. 2002-017342), também pode ser usada. A linhagem 382 de Escherichia coli foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 10 de Abril de 2000 sob um número de acesso de VKPM B-7926.

[0069] Como microorganismo tendo uma capacidade de produção de L-arginina, linhagens nas quais a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-arginina é aumentada também podem ser usadas. Exemplos da enzima biossintética de L-arginina incluem uma ou mais enzimas selecionadas a partir de N-acetilglutaminato sintetase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetil omiti na transaminase (argD), acetílornitina deacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininosuccínico sintetase (argG), ácido argininosuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (cctrAB). É mais preferível usar um gene de N-acetilglutamato sintase (argA) mutante codificando a enzima na qual a sequência de aminoácidos correspondendo a posições 15 a 19 de uma enzima tipo selvagem é substituída e a inibição por retroalimentação por L-arginina é com isso cancelada (patente EP 1170361 A). 10070] Embora bactérias corineformes produtoras de L-arginina não sejam particularmente limitadas contanto que elas tenham uma capacidade de produção de L-arginina, exemplos incluem linhagens tipo selvagem de bactérias corineformes; bactérias corineformes resistentes a certos agentes incluindo drogas sulfa, 2-tiazolalanina, ácido a-amino-p-hidroxivalérico e assim por diante; bactérias corineformes exibindo auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina ou L-triptofano em adição à resistência a 2-tiazolalanina (patente JP Não-examinada No. 54-4409); bactérias corineformes resistentes a ácido cetomalônico, ácido fluoromalônico ou ácido monofluoroacético (patente JP Não-examinada No. 57-18989); bactérias corineformes resistentes a argininol (patente JP Não-examinada No. 62-24075); bactérias corineformes resistentes a X-guanidina (X representa um derivado de ácido graxo ou cadeia alifática, patente JP Não-examinada No. 2-186995), e assim por diante* 10071] Uma bactéria corineformc tendo capacidade de produção de L-arginina pode ser gerada como uma linhagem resistente a 5-azauracil, 6-azauracil, 2-tiouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-azacitosina, 6-azacitosina e assim por diante; linhagem resistente a hidroxamato de arginina e 2-tiouracil; linhagem resistente a hidroxamato de arginina e 6-azauracil (patente JP Não-examinada No. 49-126819); linhagem resistente a um análogo de histidina ou análogo de triptofano (patente JP Não-examinada No. 52-114092); linhagem auxotrófica para pelo menos um de metionina, histidina, treonina, prolina, isoleucina, lisina, adenina, guanina e uracil (ou precursor de uracil) (patente JP Não-examinada No. 52-99289); linhagem resistente a hidroxamato de arginina (publicação de patente JP No. 51-6754); linhagem auxotrófica para ácido succínico ou resistente a um análogo de base de ácido nucléico (patente JP Não-examinada No. 58-9692); linhagem deficiente em capacidade de decomposição de arginina, resistente a um antagonista de arginina e canavanina e auxotrófica para lisina (patente JP Não-examinada No. 52-8729); linhagem resistente a arginina, hidroxamato de arginina, homoarginina, D-arginina e canavanina, ou resistente a hidroxamato de arginina e 6-azauracil (patente JP Não-examinada No. 53-143288); linhagem resistente a canavanina (patente JP Não-examinada No. 53-3586); ou os semelhantes.

[0072] Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produção de L-arginina incluem as linhagens seguintes.

Brevibacteriumflavum AJ11169 (FERM P-4161) Brevibacterium lactofermentum AJ12092 (FERM P-7273) Brevibacterium flavum AJ11336 (FERM P-4939) Brevibacterium flavum AJ11345 (FERM P-4948) Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERM BP-2228) [0073] Além disso, uma linhagem deficiente em ArgR, que é um repressor de arginina (pedido Publicado de patente US 2002/0045223) e uma linhagem na qual atividade de glutamina sintetase é aumentada (pedido Publicado de patente US 2005/0014236) também podem ser usadas.

[0074] L-Citrulina e L-omitina compartilham vias biossintéticas comuns com L-arginina, e a capacidade de produzir L-citrulina e L-omitina pode ser fornecida aumentando as atividades enzimáticas de N- acetílglutamato sintase (argA), N-acetílglut a mil fosfato redutase {argQ, ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e acetilornitina deacetilase (argE) (pedido iniernacional WO2006/35831).

[0075J Exemplos de microorganismo tendo uma capacidade de produção de L-lisina incluem linhagens resistentes a análogo de L-lisina e mutantes de regulação metabólica tendo capacidade de produção de L-lisina, Exemplos específicos incluem a linhagem AJ11442 de Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185, veja patente JP Nào-examinada No. 56-18596 e patente US 4,346.170) e a linhagem VL611 de Escherichia coli (patente JP Não-examinada No. 2000-189180). Â linhagem WC196 (pedido internacional W096/17930) também pode ser usada como uma bactéria Escherichia coli produtora de L-lisina. Esta linhagem bacteriana foi gerada conferindo resistência a AEC (S-(2-aminoetil)-cisteína) à linhagem W3110, que é derivada de Escherichia coli K-12. Esta linhagem foi denominada Escherichia coli AJ 13069 e foi depositada em 6 de Dezembro de 1994 em National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão), como um número de acesso de FERM P-14690, e o depósito original foi convertido para um depósito internacional baseado no Tratado de Budapeste em 29 de Setembro de 1995, como um número de acesso número de FERM BP-5252, [0076J Exemplos de bactérias corineformes produtoras de L-lisina incluem linhagens mutantes resistentes a S-(2-aminoetiI)cisteína (abreviado como “AEC” a seguir) (linhagem, AJ 11082 de fírevihacterium factofermentum (NRRL B-l 1470) etc., se referir a publicação de patente JP Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7-112438); linhagens mutantes requerendo um aminoácido tal como L-homoserina para seu crescimento (se referir a publicação de patente JP Nos. 48-28078 e 56-6499); linhagens mutantes tendo resistência a AEC e adicionalmente requerendo um aminoácido tal como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina e L-valina (se referir a patente Norte-Americana Nos. 3.708.395 e 3.825.472); linhagens mutantes produtoras de L-lisina tendo resistência a DL-a-amino-s-caprolactama, α-amino-laurilactama, análogo de ácido aspártico, droga sulfa, quinóide e N-lauroil-leucina; linhagens mutantes produtoras de L-lisina tendo resistência a oxaloacetato descarboxilase ou um inibidor de enzima de trato respiratório (patente JP Não-examinada Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, publicação de patente JP Nos. 53-43591 e 53-1833); linhagens mutantes produtoras de L-lisina requerendo inositol ou ácido acético (patente JP Não-examinada Nos. 55-9784 e 56-8692); linhagens mutantes produtoras de L-lisina que são sensíveis a ácido fluoropirúvico ou uma temperatura de 34°C ou superior (patente JP Não-examinada Nos. 55-9783 e 53-86090); linhagens mutantes produtoras de L-lisina de bactérias Brevibacterium ou Corynebacterium tendo resistência a etileno glicol (patente US 4.411.997) e assim por diante.

[0077] Microorganismos aos quais capacidade de produção de L-lisina é fornecida também podem ser obtidos acentuando a atividade de uma enzima biossintética de L-lisina. Atividade de uma enzima biossintética de L-lisina pode ser acentuada aumentando o número de cópias do gene codificando a enzima biossintética de L-lisina ou modificando uma seqüência reguladora de expressão do gene codificando a enzima.

[0078] Exemplos de genes codificando enzimas biossintéticas de L-lisina incluem genes codificando enzimas de via de síntese de diaminopimelato tal como gene de dihidrodipicolinato sintase (dapA), gene de aspartoquinase (lysC), gene de díhidrodipicolinato redutase (dapB), gene de d iami nopi me 1 ato descarboxilase (lysA), gene de diami nopi melato desidrogenase (ddh) (pedido internacional WO96/40934 para todos os genes precedentes), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (patente JP Não-examinada No. 60-87788), gene de aspaitato aminotransferase (aspC) (publicação de patente JP No. 6-102028), gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (patente JP Não-examinada No. 2003-135066), e gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (pedido internacional WOOO/61723), e genes codificando enzimas de via de síntese de ácido aminoadípico tal como gene de homoaconitato hidratase (patente JP Não-examinada No. 2000-157276). 10079] O gene codificando aspartoquinase ÍIÍ (lysC) é preferivelmente modificado de forma que a enzima é dessensibilizada para inibição por retroalimentaçâo por L-lisina. Um tal gene lysC modificado pode ser obtido pelo método descrito em patente US 5.932.453. 10080] Os microorganismos tendo capacidade de produção de L-lisina podem ter atividade reduzida de uma enzima que catalisa uma reação que produz um outro composto do que L-lisina ou pode ser deficiente em uma tal atividade, ou pode ter atividade reduzida de uma enzima que atua negativamente em produção de L-lisina ou pode ser deficiente em uma tal atividade. Exemplos de tais enzimas incluem h orno se ri na desidrogenase, lisina descarboxilase {cadA, fdcC), e enzima málica. As linhagens nas quais atividades das enzimas são diminuídas ou deletadas são descritas em pedido internacional W095/23864, pedido internacional W096/17930, pedido internacional W02005/010175, e assim por diante. 10081] Microorganismos preferidos tendo uma capacidade de produção de L-triptofano são linhagens nas quais uma ou mais das atividades das enzimas selecionadas a partir de antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato desidrogenase (jerA), e triptofano sintase são acentuadas. A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são ambas sujeitas à inibição por retroalimentação por L-triptofano e L-serina, respectivamente, e, portanto as atividades enzimáticas podem ser acentuadas fazendo os microorganismos conterem uma enzima mutante do tipo dessensibilizada. Especificamente, uma bactéria abrigando uma enzima do tipo dessensibilizada pode ser obtida, por exemplo, mutando o gene de antranilato sintase e/ou gene de fosfoglicerato desidrogenase de forma que as enzimas codificadas são dessensibilizadas para a inibição por retroalimentação e introduzindo os genes mutantes na bactéria. Exemplos específicos de uma tal bactéria incluem um transformante obtido introduzindo o plasmídeo pGH5 (pedido internacional W094/08031) que contém um gene ser A mutante que foi mutado de forma que ele codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para inibição por retroalimentação na linhagem SV164 de Escherichia coli que tem uma antranilato sintase dessensibilizada.

[0082] Capacidade de produção de L-triptofano também pode ser fornecida introduzindo um DNA recombinante contendo o operon de triptofano. Exemplos específicos incluem Escherichia coli transformada com o operon de triptofano que contém um gene codificando antranilato sintase dessensibilizada (patente JP Não-examinada Nos. 57-71397 e 62-244382, patente US 4.371.614). Além disso, capacidade de produção de L-triptofano também pode ser aumentada conferida acentuando expressão de um gene que codifica triptofano sintase (trpBA) no operon de triptofano. A triptofano sintase consiste de subunidades α e β, que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente.

[0083] Capacidade de produção de L-triptofano também pode ser fornecida deletando trpR codificando o repressor do operon de triptofano, ou introduzindo uma mutação em trpR de forma que a atividade do repressor é diminuída (patente US 4.371.614 e pedido internacional W02005/056776).

[0084] Linhagens nas quais malato sintase-isocitrato liase-isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase operon (operon ace) é constitutivamente expressa ou expressão do operon é acentuada também são linhagens produtoras de L-triptofano preferidas. Especificamente, é preferido que o promotor do operon ace não seja suprimido pelo repressor iclR, ou a supressão por iclR seja eliminada. Tais linhagens podem ser obtidas rompendo o gene iclR.

[0085] Uma linhagem na qual a expressão do operon ace é acentuada pode ser obtida ligando um DNA compreendendo o operon ace a um promotor forte, e introduzindo-o em células usando um plasmídeo ou por recombinação homóloga, ou transferindo-o com um transposon, de forma que múltiplas cópias dos DNAs estão presentes no DNA cromossômico.

[0086] Exemplos de microorganismo tendo uma capacidade de produção de L-triptofano incluem adicionalmente a Escherichia coli linhagem AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263), que é auxotrófica para L-fenilalanina e L-tirosina, e linhagem aroP AGX6 (pGX50) (NRRL B-12264) que abriga plasmídeo pGX50 compreendendo operon de triptofano (se referir a patente US 4.371.614 para ambas).

[0087] As bactérias corineformes tendo capacidade de produção de L-triptofano, Corynebacterium glutamicum AJ12118 que é resistente a sulfaguanidina (FERM BP-478, patente JP No. 1681002), uma bactéria corineforme na qual o operon de triptofano é introduzido (patente JP Não-examinada No. 63-240794), e uma bactéria corineforme na qual um gene codificando chiquimato quinase de uma bactéria corineforme é introduzido (patente JP Não-examinada No. 01-994749) podem ser usadas.

[0088] L-Triptofano, L-fenilalanina, e L-tirosina são todos aminoácidos aromáticos e têm a via de biossíntese comum. Exemplos dos genes codificando enzimas de biossíntese para estes aminoácidos aromáticos incluem deoxiarabino-heptulosonato fosfato sintase (aroG), 3-dehidroquinato sintase (aroB), ácido chiquímico desidrogenase (aroE), chiquimato quinase (iaroL), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (patente EP 763127A). Portanto, introduzindo múltiplas cópias de genes codificando esta enzima em célula com um plasmídeo ou em genoma, capacidade de produzir um aminoácido aromático pode ser melhorada. Sabe-se que estes genes podem ser controlados por um repressor de tirosina (tyrR), e portanto uma atividade enzimática de biossíntese de aminoácido aromático também pode ser aumentada deletando o gene tyrR (veja patente EP No. 763127).

[0089] Exemplos de microorganismo tendo capacidade de produção de L-fenilalanina incluem, mas não são limitados a, linhagens pertencendo ao gênero Escherichia tal como E. coli AJ12739 (íyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197) deficiente em tyrA e tyrR, E. coli HW1089 (ATCC 55371) abrigando um gene pheA34 mutante (patente US 5.354.672), E. coli MWEClOl-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (patente US 4.407.952). E. coli K-12 [W3110 (íyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (íyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (íyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (íyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], também chamada AJ12604 (FERM BP-3579) também podem ser usadas (publicação de patente EP No. 488424 Bl). Exemplos incluem adicionalmente as linhagens nas quais genes yedA e yddG são amplificados, que são genes que secretam L-fenilalanina (pedido internacional W003/044192, pedidos Publicados de patentes Norte-Americanas No. 2003/0148473 e 2003/0157667).

[0090] Como linhagens produtoras de fenilalanina de bactérias corineformes, as linhagens de Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP-2062) e K78 (FERM BP-2063) nas quais atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase ou piruvato quinase é diminuída (EP331145A, patente JP Não-examinada No. 02-303495), linhagem auxotrófica para tirosina (patente JP Não-examinada No. 05-049489), e assim por diante podem ser usadas.

[0091J Exemplos preferidos de microorganismos tendo capacidade produtora de L-treonína incluem microorganismos pertencendo à família En terobacte ria cea e nos quais uma ou mais atividades de enzimas do sistema de biossíntese de L-treonina são acentuadas. Exemplos de genes codificando enzimas bi os sintéticas de L-treonina incluem gene de aspartoquinase III (/y.vC), gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd), gene de aspartoquinase I (thrA), gene de homoserina quinase (thrB\ e gene de trconina sintase ithrC) codificados pelo operon de treonina. As abreviações dos nomes de genes são indicadas nos parênteses. Dois ou mais tipos destes genes podem ser introduzidos. Os genes codificando as enzimas biossintéticas de L-treonina podem ser introduzidos em uma bactéria Escherichia na qual decomposição de treonina é reprimida. Exemplos da bactéria Escherichia na qual decomposição de treonina é diminuída incluem, por exemplo, a linhagem TDH6 que é deficiente em atividade de treonina desidrogenase (patente JP Não-examinada No. 2001-346578), c assim por diante.

[0092] As atividades das enzimas biossintéticas de L-treonina são inibidas pelo endoproduto, L-treonina, e, portanto genes biossintéticos de L-treonina são preferivelmente modificadas de forma a serem dessensibilizadas para inibição por retroalimentação por L-treonina para construir linhagens produtoras de L-treonina. Os genes thrA, thrB e ihrC descritos acima constituem um operon de treonina, e o operon de treonina forma uma estrutura atenuadora. Uma vez que a expressão de operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também inibida por atenuação, o operon de treonina é preferivelmente modificado removendo sequência líder ou atenuador na região de atenuação (Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.I., and Gardner, J.F.J., Mol. BioL 194:59-69 (1987); pedido internacional WO02/26993; pedido i ntem ac i on a l W02005/049808).

[0093] O promotor nativo do operon de treonina localizado antes do operem de treonina pode ser substituído por um promotor não nativo (pedido internacional WO98/04715), ou o operon de treonina pode ser construído de forma que expressão de genes envolvidos na síntese de treonina é controlada pelo repressor e promotor de λ-fago (patente EP No. 0593792). Além disso* bactérias Escherichia mutantes que são dessensibilizadas para inibição por retroalimentação por L-treonina podem ser obtidas triando para linhagens resistentes a ácido a-arnino-p-hidroxiisovalérico (AHV), |0094] É preferível aumentar o número de cópias do operon de treonina que é modificado de forma a ser dessensibilizado para inibição por retroalimentação por L-treonina em um hospedeiro ou aumentar a expressão do operon modificado conectando ele a um promotor potente, O número de cópias pode ser aumentada, além de amplificação com um plasmídeo, usando um transposon ou Mu-fago de forma que o operon é transferido para um cromossomo de um hospedeiro. 10095] Bactéria produtora de L-treonina também pode ser preferivelmente obtida acentuando expressão de genes envolvidos na via glicolítica, ciclo TC A, ou cadeia respiratória, genes que regulam a expressão destes genes, ou genes envolvidos em absorção de açúcar, além dos genes de enzimas biossintéticas de L-treonina. Exemplos destes genes que são efetivos para produção de L-treonina incluem o gene de transidrogenase (pntAB) (publicação de patente EP No. 733712B), gene de fosfoenolpíruvato carboxilase ipepC) (pedido internacional WO95/06114), gene de fosfoenolpíruvato sintase (pps) (publicação de patente EP No. 877090B), gene de piruvaio carboxilase derivado de bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (pedido internacional W099/18228, patente EP I092776A).

[0096] Bactéria produtora de L-treonina também pode ser preferivelmente obtida acentuando expressão de um gene que fornece resistência a L-treonina e/ou a gene que fornece resistência a L-homoserina, ou fornecendo resistência a L-treonina e/ou resistência a L-homoserina a uma bactéria hospedeira. Exemplos dos genes que concedem a resistência incluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), gene rhtB (patente EP 0994190A), gene rhtC (patente EP 1013765A), gene yfiK, e gene yeaS (patente EP 1016710A). Métodos para fornecer resistência a L-treonina a um hospedeiro são descritos em patente EP 0994190A ou pedido internacional W090/04636.

[0097] Escherichia coli VKPM B-3996 (patente US 5.175.107) também pode ser exemplificada como um microorganismo tendo capacidade produtora de L-treonina. A linhagem VKPM B-3996 foi depositada em 19 de Novembro de 1987 na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika sob um número de acesso VKPM B-3996. A linhagem VKPM B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 (pedido internacional W090/04636) que foi obtido inserindo genes biossintéticos de treonina (operon de treonina: thrABC) em um plasmídeo vetor pAYC32 com ampla variação de hospedeiro contendo o marcador de resistência de estreptomicina (Chistorerdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). O operon de treonina em pVIC40 contém um gene thrA que codifica aspartoquinase I-homoserina desidrogenase I que é dessensibilizada para inibição por retroalimentação por treonina.

[0098] A linhagem B-5318 de Escherichia coli (publicação de patente EP No. 0593792B) também pode ser exemplificada como uma bactéria que forneceu capacidade produtora de L-treonina preferida. A linhagem B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika em 19 de Novembro de 1987 sob um número de acesso de VKPM B-5318. A linhagem VKPM B-5318 é prototrófica com relação a L-isoleucina, e abriga um DNA de plasmídeo recombinante que contém o operon de treonina, i.e., genes envolvidos na biossíntese de treonina, deficiente na região atenuadora, que é uma região de controle de transcrição originalmente contida, e localizada depois do repressor sensível a temperatura Cl, promotor PR, e porção N-terminal de proteína Cro derivada de λ fago, e é construída de forma que a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de treonina é regulada pelo repressor e promotor derivado de λ fago.

[0099] Na bactéria que produz L-aminoácido usada para a presente invenção, genes envolvidos em absorção de açúcar, metabolismo de açúcar (sistema de glícólise) e metabolismo de energia podem ser amplificados, além de genes codificando enzimas biossintéticas inerentes. 100100] Exemplos dos genes envolvidos em metabolismo de açúcar incluem genes codificando uma enzima na via glicolítica ou enzima envolvida em absorção de açúcar, tal como o gene de glicose-6-fosfato isomerase (/>#/, pedido internacional WOO1/02542), gene de fosfoenolpiruvato sintase (pps, patente EP 877090A), gene de fosfoglucomutase (j)gtn, pedido internacional W003/04598), gene de frutose bisfosfato aldolase (Jbap, pedido internacional W003/04664), gene de piruvato quinase ipykF, pedido internacional W003/008609), gene de transaldolase (talB, pedido internacional W003/008611), gene de fu mar ase (ftim, pedido internacional WOO 1/02545), gene de fosfoenolpiruvato sintase ipps, patente EP 877090A), gene de absorção de sacarose não PTS (cac, patente EP 149911 A), e gene de assimilação de sacarose (operon scrAB, pedido internacional W090/04636).

[00101] Exemplos de genes codificando enzimas envolvidas em metabolismo de energia incluem gene de transidrogenase (pntAB, patente US 5.830.716) e gene de citocromo tipo bo oxidase (cyoB, patente EP 1070376A).

[00102] O microorganismo usado para a presente invenção é um tal microorganismo tendo um capacidade de produção de L-aminoácido como descrito acima e modificado de forma que atividade de suceinato desidrogenase e atividade de α-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas. <l-2> Diminuição de atividade de suceinato desidrogenase e atividade de α-cetoglutarato desidrogenase [00103] Na presente invenção, a expressão "atividades das enzimas são diminuídas" significa que a atividade de succinato desidrogenase e a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase são menores do que aquelas de uma linhagem não modificada tal como linhagem selvagem e linhagem parental, o que inclui um estado em que as atividades enzimáticas desapareceram completamente.

[00104] A succinato desidrogenase (de agora em diante também referida como "SDH") é uma enzima de EC: 1.3.99.1, que catalisa reversivelmente a reação seguinte. Na presente invenção, atividade de SDH significa a atividade para catalisar esta reação. Ácido succínico + FAD <-> Ácido fumárico + FADH2 [00105] SDH é constituída por estruturas de três ou quatro subunidades dependendo do tipo de microorganismo, e isto pode ser conseguido modificando pelo menos uma destas proteínas de forma que ela não funcione normalmente. Especificamente, SDH consiste das subunidades seguintes (nomes de genes codificando as subunidades são indicados em parênteses), e a proteína âncora de membrana é codificada somente por sdhC ou por sdhC e sdhD dependendo de espécie. SDHA: subunidade de flavoproteína (sdhA) SDHB: subunidade de proteína Fe-S (sdhB) SDHC: proteína âncora de membrana (sdhC) SDHD: proteína âncora de membrana (sdhD) [00106] Além disso, o complexo de subunidades de SDH pode ter as atividades tanto de SDH como fumarato redutase. Por exemplo, o complexo de subunidades de SDH de bactérias corineformes tem as atividades tanto de SDH como fumarato redutase (pedido internacional W02005/021770).

[00107] A atividade de SDH pode ser confirmada medindo redução de 2,6-dicloroindofenol (DCIP) como um índice indicativo. Um método específico é descrito em Tatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch.

Microbiol., (2005) 183:317-324.

[00108] Na presente invenção, os genes codificando as subunidades de SDH, e o operon contendo estes podem ser genericamente chamados os "genes codificando SDH." [00109] Como genes codificando SDH de enterobactérias, as seqüências de nucleotídeos de tais genes de Pantoea ananatis e as seqüências de aminoácidos das subunidades são mostradas em SEQID NOS: 1 a 6.

[00110] Como os genes codificando SDH de bactérias corineformes, por exemplo, são descritas as seqüências do operon sdh de Corynebacterium glutamicum (No. de Acesso de GenBank NCgl0359 (sdhC) NCgl0360 (sdhA) NCgl0361 (sdhB)), e o operon sdh de Brevibacterium flavum (patente JP Não-examinada No. 2005-095169, patente EP 672077A1).

[00111] Como os genes codificando SDH de bactérias corineformes, as seqüências de nucleotídeos dos genes de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, e as seqüências de aminoácidos das subunidades são mostradas em SEQ ID NOS: 73 a 76, e as seqüências de nucleotídeos dos genes de Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869 e as seqüências de aminoácidos das subunidades são mostradas em SEQ ID NOS: 77 a 80.

[00112] Na presente invenção, a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase (de agora em diante também referida como "a-KGDH") significa uma atividade de catalisar a reação descarboxilando oxidativamente ácido a-cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico) para gerar succinil-CoA. A reação mencionada acima é catalisada por três tipos de enzimas, a-KGDH (Elo, a-cetoglutarato desidrogenase, EC: 1.2.4.2), dihidrolipoamida S-succiniltransferase (E2o, EC: 2.3.1.61), e dihidrolipoamida desidrogenase (E3, EC: 1.8.1.4). Isto é, estes três tipos de subunidades catalisam as reações seguintes, respectivamente, e a atividade para catalisar uma reação consistindo de uma combinação destes três tipos de reações é chamada de a atividade de α-KGDH. A atividade de α-KGDH pode ser confirmada por medida de acordo com o método de Shiio et al. (Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric. Biol. Chem., 44 (8), 1897-1904, 1980).

Elo: 2-oxoglutarato + [resíduo de dihidrolipoil-lisina succiniltransferase] lipoilisina = [resíduo de dihidrolipoil-lisina succiniltransferase] S-succinildihidrolipoil-lisina + CO2 E2o: CoA + enzima N6-(S-succinildihidrolipoil)lisina = succinil-CoA + enzima N6-(dihidrolipoil)lisina E3: proteína N6-(dihidrolipoil)lisina + NAD+ = proteína N6-(lipoil)lisina + NADH + H+ α-KGDH também é chamada oxoglutarato desidrogenase ou 2-oxoglutarato desidrogenase.

[00113] Em bactérias Enterobacteriaceae tal como Pantoea ananatis, as subunidades de proteína que têm cada um dos três tipos de atividades enzimáticas formam um complexo. As subunidades são codificadas por sucA, sucB e Ipd, respectivamente, e os genes sucA e sucB se localizam depois do gene de proteína ferro-enxofre succinato desidrogenase (sdhB) (patente US 6.331.419). Embora estes genes sejam descritos como genes de Enterobacter agglomerans AJ13355 na patente mencionada acima, esta linhagem foi posteriormente reclassificada em Pantoea ananatis.

[00114] Como genes codificando α-KGDH de enterobactérias, as seqüências de nucleotídeos dos genes sucA e sucB e o gene sucC localizado depois destes e as seqüências de aminoácidos das subunidades de Pantoea ananatis são mostradas em SEQ ID NOS: 7 a 11. Além disso, sucA, sucB e sucC codificando α-KGDH de Escherichia coli foram descritos como Genbank NP_415254 e NP_415255, respectivamente.

[00115] Em bactérias corineformes, a subunidade Elo é codificada pelo gene odhA (registrado como NCgll084 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, que também é chamado de gene sucA), e a subunidade E3 é codificada pelo gene Ipd (No. de Acesso de GenBank Y16642). Por outro lado, é estimado que a subunidade E2o seja codificada pelo gene odhA e constitua uma proteína bifuncional junto com a subunidade Elo (Usuda et al., Microbiology, 142, 3347-3354, 1996), ou codificada pelo gene registrado como NCgl2126 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, que é diferente do gene odhA. Portanto, na presente invenção, embora o gene odhA codifique a subunidade Elo, ele também pode codificar E2o.

[00116] A seqüência de nucleotídeos do gene odhA de Brevibacterium lactofermentum e a seqüência de aminoácidos da subunidade Elo codificada através desta (NCgll084 de No. de Acesso de GenBank NC_003450, pedido internacional W02006/028298) são mostradas em SEQ ID NOS: 12 e 13. Além disso, a seqüência de nucleotídeos da NCgl2126 mencionada acima de No. de Acesso de GenBank NC_003450 e a seqüência de aminoácidos da subunidade E2o codificada através desta são mostradas em SEQ ID NOS: 14 e 15.

[00117] Na presente invenção, genes codificando cada uma das subunidades de α-KGDH, e o agrupamento de genes contendo estas podem ser genericamente chamados os "genes codificando a-KGDH".

[00118] As atividades enzimáticas podem ser diminuídas, por exemplo, pelos seguintes métodos. (1) Método de romper genes que codificam enzimas por recombinação gênica [00119] Modificando um gene codificando SDH ou α-KGDH (de agora em diante também referida simplesmente como "enzima") por recombinação gênica, número das moléculas da proteína enzimática codificada por qualquer destes genes por célula pode ser diminuído se comparado com uma linhagem parental ou linhagem tipo selvagem, ou a molécula de proteína enzimática pode ser feita para não ser produzida de maneira nenhuma. Além disso, atividade enzimática por molécula da proteína enzimática pode ser reduzida, ou a atividade pode ser eliminada. Número de moléculas de proteína enzimática pode ser diminuído diminuindo expressão do gene codificando a enzima. Diminuir expressão de um gene inclui diminuir transcrição de mRNA transcrito a partir do gene e diminuir tradução do mRNA. Além disso, uma molécula de proteína enzimática pode ser feita para não ser produzida de maneira nenhuma, ou atividade enzimática por molécula da proteína enzimática pode ser diminuída, ou a atividade pode ser eliminada por ruptura do gene codificando a enzima. Exemplos da linhagem tipo selvagem usada como um objeto da comparação incluem a linhagem AJ13355 de Pantoea ananatis, linhagem AJ13399 de Klebsiella planticola, linhagem ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum, linhagem ATCC 13869 de Brevibacterium lactofermentum, linhagem ATCC 14067 de Brevibacterium flavum, e assim por diante.

[00120] O gene codificando SDH a ser modificado pode corresponder a um ou mais dos genes codificando as subunidades de SDH, ou o operon inteiro, e uma mutação pode ser introduzida em qualquer dos genes codificando as subunidades (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD).

[00121] Embora o gene codificando α-KGDH a ser modificado possa corresponder a um ou mais dos genes codificando as subunidades de a-KGDH ou ao agrupamento de genes inteiro, ele é preferivelmente um gene codificando a subunidade Elo (sucA ou odhA), ou um gene codificando a subunidade E2o (sucB).

[00122] Uma vez que as seqüências de nucleotídeos dos genes codificando as subunidades de SDH ou α-KGDH podem diferir dependendo de espécie a qual o microorganismo pertence ou linhagem, os genes codificando estas podem ser variantes das seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 14, 73, 77 e 81. Variantes dos genes podem ser procuradas usando BLAST (http://blast.genome.jp/) ou os semelhantes com referência às seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 14, 73, 77 e 81. As variantes dos genes incluem homólogos dos genes, tal como genes que podem ser amplificados por PCR usando um cromossomo de um microorganismo tal como aqueles de Enterobacteriaceae e bactérias corineformes como um modelo e oligonucleotídeos sintéticos preparados com base, por exemplo, nas seqüências de nucleotídeos de SEQID NOS: 1, 7, 12, 14, 73 e 81.

[00123] Exemplos das subunidades de SDH incluem proteínas tendo uma das seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 a 4, 6, 74 to 76 e 78 a 80, e exemplos das subunidades de α-KGDH incluem proteínas tendo uma das seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 8 a 11, 13, 15 e 81. Entretanto, uma vez que códons usados podem diferir e, portanto as seqüências de nucleotídeos dos genes podem diferir dependendo de espécie ou linhagens de bactérias, os genes podem codificar uma proteína tendo qualquer das seqüências de aminoácidos incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácidos, contanto que a função da proteína codificada seja mantida. O número do(s) “diversos” resíduos de aminoácidos é, por exemplo, 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5. Estas substituições, deleções, inserções, ou adições de um ou diversos aminoácidos preferivelmente são mutações conservativas preservando funções normais das proteínas. Uma tal mutação conservativa é uma mutação caracterizada pelo fato de que substituição ocorre mutuamente enfie Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; enfie Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição é um aminoácido hidrofóbico; enfie Gin e Asn, se ele é um aminoácido polar; enfie Lys, Arg e His, se ele é um aminoácido básico; enfie Asp e Glu, se ele é um aminoácido ácido; e enfie Ser e Thr, se ele é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos típicos de mutações conservativas são substituições conservativas. Exemplos de substituições consideradas substituições conservativas incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gin, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu ou Gin por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin; substituição de Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por He; substituição de Ile, Met, Vai ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys; substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

[00124] As variantes dos genes não são limitadas a genes tendo uma seqüência de nucleotídeos das regiões de codificação nas seqüências de nucleotídeos de SEQID NOS: 1, 7, 12, 14, 73, 77 e 81, e podem ser um DNA que hibridiza com uma seqüência de nucleotídeos complementar a qualquer destas seqüências de nucleotídeos e seqüências de nucleotídeos das regiões de codificação ou uma sonda preparada a partir de qualquer destas seqüências de nucleotídeos em condições estringentes. O termo “condições estringentes” se refere a condições onde um assim chamado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. Exemplos destas incluem condições onde DNAs tendo alta homologia, por exemplo, homologia de 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 97% ou mais, particularmente preferivelmente 99% ou mais, hibridizam uns com os outros e DNAs tendo homologia menor do que o valor descrito acima não hibridizam uns com os outros; e especificamente incluem condições de lavagem de hibridização Southern típica, e.g., lavagem a 60°C, lxSSC, 0,1% SDS, preferivelmente 60°C, 0,lxSSC, 0,1% SDS, mais preferivelmente 68°C, 0,lxSSC, 0,1% SDS, uma vez ou preferivelmente duas vezes ou três vezes. Embora o comprimento da sonda seja adequadamente escolhido dependendo das condições de hibridização, ele normalmente é de 100 bp a 1 kbp.

[00125] Modificação de genes é atingida, por exemplo, deletando uma parte de ou região de codificação inteira de um gene em um cromossomo, modificando uma seqüência de controle de expressão tal como um promotor e a seqüência Shine-Dalgamo (SD), e assim por diante. Além disso, expressão de um gene também pode ser diminuída por modificação de uma outra região de não tradução do que seqüência de controle de expressão. Além disso, o gene inteiro incluindo região flanqueadora em ambos os lados do gene no cromossomo pode ser deletado. Além disso, isto também pode ser atingido introduzindo uma mutação para uma ou mais substituições de aminoácidos (mutação de sentido incorreto), introduzindo um códon de parada (mutação sem sentido), ou introduzindo uma mutação de mudança de quadro que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos por recombinação gênica (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20833-20839 (1991)).

[00126] Além disso, em enterobactérias, os genes sucA e sucB se localizam antes do operon sdh, e portanto é contemplado introduzir uma mutação para diminuir expressão do operon sdh e com isso diminuir expressão dos genes sucA e sucB. Uma tal mutação também cai dentro do conceito da presente invenção.

[00127] Na presente invenção, a expressão de "modificar um gene por recombinação gênica" significa deletar uma parte de ou toda uma seqüência de controle de expressão tal como região promotora, uma região de codificação, ou uma região não codificante do gene em um cromossomo, ou inserir outra seqüência em qualquer destas regiões usando recombinação homóloga, e com isso diminuir atividade enzimática intracelular. Na presente invenção, uma modificação de genes é preferivelmente realizada em um grau tal que inativação do gene não deve mais ser restaurada por mutação espontânea.

[00128] Entretanto, na presente invenção, a modificação pode ser realizada com uma mutagênese convencional tal como raios X ou radiação ultravioleta ou um tratamento com um mutagênico tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, contanto que as atividades de SDH e α-KGDH sejam diminuídas.

[00129] A seqüência de controle de expressão é preferivelmente modificada por um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente preferivelmente três ou mais nucleotídeos. Quando deleção é realizada para uma região de codificação, a região a ser deletada pode ser uma região na região de término N, uma região interna, ou uma região na região de término C, ou ainda a região de codificação inteira, contanto que a função da proteína enzimática seja diminuída ou eliminada. Deleção de uma região maior normalmente irá assegurar inativação do gene. Além disso, os quadros de leitura antes e depois da região deletada preferivelmente não são os mesmos.

[00130] Também, quando outra seqüência é inserida na região de codificação, a seqüência pode ser inserida em qualquer região, e inserir uma região maior normalmente irá assegurar inativação do gene. Os quadros de leitura antes e depois do sítio de inserção preferivelmente não são os mesmos. A outra seqüência não é particularmente limitada contanto que a seqüência diminua ou elimine a função da proteína enzimática, e exemplos incluem um transposon carregando um gene de resistência a antibiótico ou um gene útil para produção de ácido L-glutâmico.

[00131] Um gene no cromossomo pode ser modificado como descrito acima, por exemplo, preparando uma versão tipo deleção do gene no qual uma seqüência parcial do gene é deletada de forma a não produzir uma proteína enzimática que pode funcionar normalmente, e transformando uma bactéria com um DNA contendo o gene tipo deleção para causar recombinação homóloga entre o gene tipo deleção e o gene no cromossomo, e com isso substituir o gene tipo deleção pelo gene no genoma. A proteína enzimática codificada pelo gene tipo deleção tem uma conformação diferente daquela da proteína enzimática tipo selvagem, se ela chega a ser produzida, e assim a função é diminuída ou eliminada. Tal ruptura gênica baseada em substituição de genes utilizando recombinação homóloga já foi estabelecida, e pode ser realizada por métodos usando um DNA linear tal como integração dirigida por Red (Datsenko, K.A, and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97:6640-6645 (2000)), e integração dirigida por Red em combinação com um sistema excisivo derivado de λ fago descrito em Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002) (pedido internacional W02005/010175), usando um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura, ou um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, métodos utilizando um vetor suicida que não tem uma origem de replicação utilizável no hospedeiro escolhido (patente US 6.303.383, patente JP Não-examinada No. 05-007491) etc.

[00132] Como mostrado em Exemplo de Referência 1, uma linhagem resistente a um produto de gene λ Red, por exemplo, a linhagem SC 17(0) de Pantoea ananatis, pode ser adequadamente usada para a integração dirigida por Red. A linhagem SC17(0) foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika em 21 de Setembro de 2005 sob um número de acesso de VKPM B-9246.

[00133] Transcrição diminuída dos genes pode ser confirmada por comparação dos níveis de mRNA dos genes com aqueles na linhagem tipo selvagem ou não modificada. Exemplos de métodos para medir expressão incluem hibridização Northern e PCR via Transcriptase Reversa (RT-PCR) (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), (2001)). A diminuição de transcrição pode ser em qualquer nível contanto que ela seja diminuída como comparada àquela de uma linhagem tipo selvagem ou não modificada, e, por exemplo, o nível é desejavelmente diminuído para 75% ou menos, 50% ou menos, 25% ou menos, 10% ou menos, como comparado com uma linhagem tipo selvagem ou não modificada, e é particularmente preferível que a expressão não ocorra.

[00134] Diminuição em quantidade de proteína codificada por um gene pode ser confirmada por Western blotting usando um anticorpo (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), (2001)). A diminuição de quantidade de proteína pode ser em qualquer nível contanto que ela seja diminuída se comparada com aquela de uma linhagem tipo selvagem ou não modificada, e, por exemplo, o nível é desejavelmente diminuído para 75% ou menos, 50% ou menos, 25% ou menos, 10% ou menos, como comparado a uma linhagem tipo selvagem ou não modificada e é particularmente preferível que a proteína não seja produzida de todo (atividade é completamente desaparecida). (2) Aquisição de linhagem com atividade de a-KGDH diminuída utilizando auxotrofia [00135] Uma linhagem com atividade de α-KGDH diminuída pode ser obtida pelo método de (1) descrito acima, e também pode ser obtida pelo método seguinte utilizando auxotrofia.

[00136] Por exemplo, células microbianas são sujeitas a uma mutagênese comum usando N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (por exemplo, 250 pg/ml, 30°C, 20 minutos), e então cultivadas em um meio sólido para permitir formação de colônias. Separando uma linhagem mutada que não pode crescer em um meio contendo ácido L-glutâmico como uma única fonte de carbono e única fonte de nitrogênio das colônias pela transferência simultânea para duas placas, uma linhagem com atividade de a-KGDH diminuída pode ser isolada.

[00137] Exemplos de linhagem com atividade de α-KGDH diminuída incluem, por exemplo, as linhagens seguintes.

Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172, patente US 5.492.818) Brevibacteríum flavum AJ12822 (FERM BP-4173, patente US 5.492.818) Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, patente US 5.492.818) Brevibacteríum lactofermentum linhagem AS (pedido internacional W095/34672) Corynebacterium glutamicum OAGN, OA2-2, OAGN2-2 (pedido internacional W02006/028298) Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207) Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617) Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614) (3) Aquisição de linhagem com atividade de SDH diminuída usando auxotrofia para ácido succínico como índice indicativo [00138] Uma linhagem com atividade de α-KGDH diminuída requer ácido succínico para crescimento devido à diminuição de fornecimento de succinil-CoA. Por outro lado, sabe-se que uma linhagem com deficiência dupla de α-KGDH e SDH é recuperada da auxotrofia para ácido succínico (J. Gen. Microbiol., 1978 Jul;107(l):l-13). Portanto, selecionando uma linhagem que se recuperou de auxotrofia para ácido succínico a partir de linhagens com atividade de α-KGDH diminuída, uma linhagem com atividade diminuída de α-KGDH e SDH pode ser obtida. Especificamente, linhagens com atividade de α-KGDH diminuída são emplacadas em um meio mínimo não contendo ácido succínico, e deixadas para formar colônias. Em uma linhagem com atividade de α-KGDH diminuída que pode crescer no meio mínimo não contendo ácido succínico, o gene codificando SDH altamente contém freqüentemente uma mutação. <3> Método para produzir L-aminoácido da presente invenção [00139] Cultivando um tal microorganismo como descrito acima em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células e coletando o L-aminoácido do meio ou das células, L-aminoácido pode ser produzido.

[00140] Como o meio usado para a cultura, um meio comum contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais minerais assim como nutrientes traço orgânicos tal como aminoácidos e vitaminas, se requerido. Ou um meio sintético ou um meio natural podem ser usados. Qualquer tipo de fonte de carbono e fonte de nitrogênio pode ser usado contanto que elas possam ser utilizadas por uma linhagem a ser cultivada.

[00141] Açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisados de amido e melaço podem ser usados como a fonte de carbono. Em adição, ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido cítrico, e álcoois tal como etanol também podem ser usados sozinhos ou em uma combinação com outras fontes de carbono. Amônia, sais de amônio tal como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico e assim por diante podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléicos, aqueles contendo aquelas substâncias tal como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição de proteína de soja e assim por diante podem ser usados como os nutrientes traço orgânicos. Quando uma linhagem mutante auxotrófica que requer um aminoácido ou os semelhantes para seu crescimento é usada, é preferível suplementar o nutriente requerido. Sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante podem ser usados como os sais minerais.

[00142] A cultura preferivelmente é realizada em condições aeróbicas, enquanto que a temperatura de fermentação é controlada para ser 20 a 45 °C, e pH ser 3 a 9. Para ajuste de pH, uma substância ácida ou alcalina inorgânica ou orgânica, gás amônia ou os semelhantes podem ser usados. Uma quantidade substancial de L-aminoácido é acumulada no meio de cultura ou células preferivelmente depois de 10 a 120 horas de cultura de uma maneira tal como descrito acima.

[00143] Além disso, quando o L-aminoácido de objetivo é ácido L-glutâmico, a cultura pode ser realizada para produzir e acumular ácido L-glutâmico com ácido L-glutâmico precipitante em um meio usando, como o meio, um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição na qual ácido L-glutâmico é precipitado. Exemplos de condição na qual ácido L-glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente 4,5 a 4,0, mais preferivelmente 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente 4,0. A fim de obter tanto melhora de crescimento em uma condição acídica como eficiente precipitação de ácido L-glutâmico, pH é preferivelmente 5,0 a 4.0, mais preferivelmente 4,5 a 4,0, ainda mais preferivelmente 4,3 a 4,0. A cultura pode ser realizada no pH mencionado acima por todo o período de cultura ou uma parte deste.

[00144] Coleta de L-aminoácido do meio de cultura depois da cultura pode ser realizada de uma maneira convencional. Por exemplo, depois das células terem sido removidas do meio de cultura, L-aminoácido pode ser coletado concentrando o meio para cristalizar o L-aminoácido, cromatografia de troca iônica, ou os semelhantes. Quando a cultura é realizada em condições nas quais ácido L-glutâmico é precipitado, ácido L-glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifugação ou filtração. Neste caso, ácido L-glutâmico dissolvido no meio pode ser precipitado e então separado junto.

[00145] Em adição, a cultura pode ser realizada em um meio contendo trealose. Como para concentração de trealose contida no meio, ela é preferivelmente adicionada em uma concentração de 0,1 g/L ou superior, mais preferivelmente 0,2 g/L ou superior, ainda mais preferivelmente 0,5 g/L ou superior. Quando uma bactéria corineforme é usada, em particular, ela é preferivelmente adicionada em uma concentração de 0,5 g/L ou superior, mais preferivelmente 0,75 g/L ou superior, ainda mais preferivelmente 2 g/L ou superior. Como trealose adicionada ao meio, trealose cristalina pode ser dissolvida, ou trealose contida em um licor mãe obtido depois de uma substância alvo ser coletada de um licor de fermentação produzido em um processo de fermentação também podem ser usadas. Além disso, trealose produzida em um meio de fermentação como um subproduto também está dentro do conceito de trealose contida no meio referido na presente invenção.

[00146] Além disso, na presente invenção, se betaína (N-metilglicina, N,N-dimetilglicina, Ν,Ν,Ν-trimetilglicina, [2-hidroxietil]trimetil amônio) é adicionada em adição a trealose, produtividade da substância alvo é adicionalmente melhorada. Ela é preferivelmente adicionada em uma concentração de 0,1 g/L ou superior, mais preferivelmente 0,25 g/L ou superior, ainda mais preferivelmente 0,5 g/L ou superior.

Exemplos [00147] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhe se referindo a exemplos.

Exemplo de Referência 1: Construção de linhagem de Pantoea ananatis que é resistente ao produto de gene λ Red [00148] Para romper o gene sdhA em Pantoea ananatis, foi construída uma linhagem receptora que realiza eficientemente o método chamado "integração dirigida por Red" ou "integração mediada por Red" (Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)).

[00149] Primeiro, o novo plasmídeo ajudante RSF-Red-TER que expressa os genes gam, bet e exo de λ (de agora em diante referido como "genes λ Red") foi construído (Fig. 1). Os detalhes disto serão descritos em Exemplo de Referência 2.

[00150] Este plasmídeo pode ser usado em uma ampla variedade de hospedeiros tendo diferentes constituições genéticas. Isto é por que 1) este plasmídeo ter o replicon do plasmídeo de amplo espectro de hospedeiros RSF1010 (Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987), que pode ser estavelmente mantido em muitos tipos de bactérias gram negativas e gram positivas, e mesmo células vegetais, 2) os genes λ Red, gam, bet e genes exo, estão sob o controle do promotor PlacUV5, que é reconhecido pelas RNA polimerases de muitos tipos de bactérias (por exemplo, Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)), e 3) o fator de auto-regulação Piacuv5-lael e o terminador de transcrição não dependente de p (TrmB) do operon rrnB de Escherichia coli diminuem o nível basal de expressão dos genes λ Red (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). Além disso, o plasmídeo RSF-Red-TER contém o gene de levansucrase (sacB), e usando este gene, o plasmídeo pode ser coletado de células em um meio contendo sacarose.

[00151] Em Escherichia coli, a freqüência de integração de um fragmento de DNA gerado por PCR junto com a região flanqueadora curta fornecida pelo plasmídeo RSF-Red-TER é tão alta quanto a freqüência que pode ser alcançada usando o plasmídeo ajudante pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)). Entretanto, expressão dos genes λ Red é tóxica para Pantoea ananatis. Células transformadas com o plasmídeo ajudante RSF-Red-TER crescem extremamente lentamente no meio LB contendo IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo, 1 mM) e um antibiótico apropriado (25 pg/ml de cloranfenicol ou 40 pg/ml de canamicina), e a eficiência de recombinação mediada por λ Red é extremamente baixa (10'8), se observada como um todo.

[00152] Uma linhagem variante de Pantoea ananatis que é resistente a expressão de todos os três genes λ Red foi selecionada. Para este propósito, o plasmídeo RSF-Red-TER foi introduzido na linhagem SC 17 de Pantoea ananatis (patente US 6.596.517) por eletroporação. Depois de uma cultura de 18 horas, cerca de 106 de transformantes foram obtidos, e dentre estes, 10 clones formaram colônias de tamanho grande, e todos os remanescentes formaram colônias extremamente pequenas. Depois de uma cultura de 18 horas, as colônias grandes tiveram um tamanho de cerca de 2 mm, e as colônias pequenas tiveram um tamanho de cerca de 0,2 mm. Ao passo que as colônias pequenas não cresceram mais mesmo se a cultura fosse prolongada até 24 horas, as colônias grandes continuaram a crescer. Uma das linhagens mutantes de Pantoea ananatis de colônia grande e resistentes a expressão de todos os três genes λ Red (gam, bet, e exo) foi usada para a análise posterior.

[00153] O DNA de plasmídeo RSF-Red-TER foi isolado de um clone dos clones de colônia grande, e de diversos clones de colônias pequenas, e transformado de novo em Escherichia coli MG1655 para avaliar a capacidade do plasmídeo de sintetizar um produto de gene Red ativo. Por um experimento de controle para integração dependente de Red nos transformantes obtidos, foi demonstrado que apenas o plasmídeo isolado do clone de colônia grande induziu expressão dos genes λ Red requeridos para a integração dependente de Red. A fim de investigar se a integração mediada por Red ocorre no clone de colônia grande selecionado, eletroporação foi realizada usando um fragmento de DNA linear produzido por PCR. Este fragmento foi construído de forma que ele deve conter um marcador KmR e uma região flanqueadora de 40 bp homóloga ao gene hisD. Este fragmento é integrado no gene hisD de Pantoea ananatis no sítio de reconhecimento de Smal. Dois clones de colônia pequena foram usados como controle. A seqüência de nucleotídeos do gene hisD de Pantoea ananatis é mostrada em SEQ ID NO: 16. Para PCR, os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 17 e 18 foram usados como iniciadores, e o plasmídeo pMW 118-(Xatt-Kmr-Xatt) foi usado como o modelo. Os dois clones de colônia pequena que não foram resistentes aos genes λ Red, foram usados como um controle. Construção do plasmídeo pMWl 18-(XattL-Kmr-XattR) será explicada em detalhe em Exemplo de Referência 3.

[00154] O plasmídeo RSF-Red-TER pode induzir expressão dos genes Red pelo gene lacl carregado no plasmídeo. Dois tipos de condições de indução foram investigados. No primeiro grupo, IPTG (1 mM) foi adicionado 1 hora antes da eletroporação, e no Segundo grupo, IPTG foi adicionado no início da cultura para preparação de células cuja eletroporação é possível. A taxa de crescimento das células abrigando RSF-Red-TER derivado do clone de colônia grande não foi significativamente menor do que aquela de uma linhagem não tendo o plasmídeo SC17. A adição de IPTG diminuiu apenas levemente a taxa de crescimento destas culturas. Por outro lado, a progênie dos clones de colônia pequena cresceu extremamente lentamente mesmo sem a adição de IPTG, e depois de indução, crescimento foi substancialmente interrompido. Depois de eletroporação das células da progênie do clone de colônia grande, muitos clones KmR cresceram (18 clones depois de um tempo curto de indução, e cerca de 100 clones depois de um tempo prolongado de indução). Todos os 100 clones que foram investigados tiveram um fenótipo His', e cerca de 20 clones foram confirmados por PCR como tendo a estrutura esperada de cromossomo nas células. Por outro lado, mesmo quando eletroporação foi realizada com a progênie dos clones de colônia pequena, uma linhagem integrada não foi obtida.

[00155] O clone de colônia grande obtido foi cultivado em uma placa contendo 7% de sacarose para eliminar o plasmídeo, e transformado novamente com RSF-Red-TER. A linhagem sem o plasmídeo foi designada SC 17(0). Esta linhagem foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, GNII Genetica (endereço: Rússia, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd. 1) em 21 de Setembro de 2005, e determinado um número de acesso de VKPM B-9246.

[00156] Todos os clones que cresceram depois da retransformação mencionada acima mostraram tamanhos grandes de colônia como o clone de linhagem parental SC17(0). O experimento de integração mediada por Red foi realizado na linhagem SC 17(0) re-transformada com o plasmídeo RSF-Red- TER. Três dos transformantes independentes foram investigados usando o mesmo fragmento de DNA que aquele usado para o experimento prévio. O tempo de indução curto (1 hora antes de eletroporação) foi empregado. KmR clones excedendo dez clones cresceram em cada experimento. Todos os clones avaliados tiveram o fenótipo His'. Desta maneira, uma linhagem mutante designada SC17(0) resistente à expressão dos genes λ Red foi selecionada. Esta linhagem pode ser usada como uma linhagem receptora adequada para a integração dependente de Red no cromossomo de Pantoea ananatis.

Exemplo de Referência 2: Construção de plasmídeo ajudante RSF-Red-TER

[00157] O esquema de construção do plasmídeo ajudante RSF-Red-TER é mostrado em Fig. 2.

[00158] Como uma primeira etapa da construção, um vetor RSFsacBPlacMCS foi construído. Para este propósito, fragmentos de DNA contendo o gene cat do plasmídeo pACYC184 e a região de gene estrutural do gene sacB de Bacillus subtilis foram amplificados por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 19 e 20, e 21 e 22, respectivamente. Estes oligonucleotídeos continham sítios de enzimas de restrição BglII, Saci, Xbal e BamHI, requeridos e convenientes para clonagem adicional, nas regiões de extremidade 5’, respectivamente. O fragmento de sacB obtido de 1,5 kb foi clonado no vetor pMW119-PiaclacI previamente obtido no sítio Xbal-BamHI. Este vetor foi construído da mesma maneira que aquela descrita para o vetor pMW118-PiaclacI (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). Entretanto, este vetor continha uma unidade de poliligante derivado de pMW219 ao invés do plasmídeo pMW218.

[00159] Então, o fragmento de cat mencionado acima de 1,0 kb foi tratado com BglII e Saci, e clonado no plasmídeo RSF-PiaclacIsacB obtido na etapa prévia no sítio BamHI-SacI. O plasmídeo obtido pMW-PiaclacIsacBeat continha o fragmento PlacUV5-lacI-sacB-cat. A fim de subclonar este fragmento no vetor RSF1010, pMW-PiaclacIsacBcat foi digerido com BgHl, terminação abrupta com fragmento Klenow de DNA polimerase I, e sucessivamente digerido com Saci. Um fragmento Bg/II-SacI de 3,8 kb do plasmídeo pMWPiaclacIsacBcat foi eluído a partir de 1% agarose gel, e ligado com o vetor RSF1010 que havia sido tratado com Pstl e Saci. Escherichia coli TG1 foi transformada com a mistura de ligação, e emplacada no meio LB contendo cloranfenicol (50 mg/L). Os plasmídeos isolados dos clones cultivados foram analisados com enzimas de restrição para obter um plasmídeo RSFsacB. A fim de construir um vetor RSFsacBPiacMCS, um fragmento de DNA contendo o promotor Piacuvs foi amplificado por PCR usando oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 23 e 24 como iniciadores e o plasmídeo pMW119-PiaclacI como o modelo. O fragmento obtido de 146 bp foi digerido com Saci e Notl, e ligado com o fragmento Sacl-Notl grande do plasmídeo RSFsacB. Então, por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 25 e 26 como iniciadores, e o plasmídeo pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645 (2000)) como o modelo, um fragmento de DNA de 2,3 kb contendo os genes λΡεάαβγ e o terminador de transcrição tL3 foi amplificado. O fragmento obtido foi clonado no vetor RSFsacBPiacMCS no sítio Pvul-NotI. Desta maneira, o plasmídeo RSFRed foi construído.

[00160] A fim de eliminar a leitura através de transcrição dos genes Red, um terminador de transcrição dependente de p do operon rmB de Escherichia coli foi inserido em uma posição entre o gene cat e o promotor Piacuvs· Para este propósito, um fragmento de DNA contendo o promotor Piacuvs e o terminador TrmB foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 27 e 24 como iniciadores e o cromossomo de Escherichia coli BW3350 como um modelo. Estes fragmentos obtidos foram tratados com Kpnl e ligados. Então, o fragmento de 0,5 kb contendo tanto Piacuvs como TrmB foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQID NOS: 24 e 28 como iniciadores. O fragmento de DNA obtido foi digerido com EcoRI, terminado abruptamente por um tratamento com fragmento Klenow de DNA polimerase I, digerido com BamHI, e ligado com o fragmento grande Ecll36II-BamHI do vetor RSFsacBPlacMCS. O plasmídeo obtido foi designado RSF-Red-TER.

Exemplo de Referência 3: Construção do plasmídeo pMW118-(XattL-Kmr-ÀattR) [00161] O plasmídeo pMW118-(lattL-Kmr-lattR) foi construído a partir do plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR (pedido internacional W02005/010175) substituindo o marcador de gene de resistência a tetraciclina pelo gene de resistência a canamicina do plasmídeo pUC4K. Para tal propósito, o fragmento grande EcoRI-HindIII de plasmídeo pMW118-attL-Tc-attR foi ligado a dois fragmentos do plasmídeo pUC4K: fragmento HindIII-PstI (676 bp) e fragmento EcoRl-Hindlll (585 bp). pMW118-attL-Tc-attR básico foi obtido por ligação dos quatro fragmentos seguintes. 1) O fragmento BglU-EcoRl (114 bp) incluindo attL (SEQ ID NO: 31) que foi obtido por amplificação por PCR da região correspondendo a attL do cromossomo de Escherichia coli W3350 (contendo profago λ) usando os iniciadores PI e P2 (SEQ ID NOS: 29 e 30) (estes iniciadores continham os sítios subsidiários de reconhecimento para BglII e EcoRI). 2) O fragmento Pstl-Hinálll (182 bp) incluindo attR (SEQ ID NO: 34) que foi obtido por amplificação por PCR da região correspondendo a attR do cromossomo de Escherichia coli W3350 (contendo profago λ) usando os iniciadores P3 e P2 (SEQ ID NOS: 32 e 33) (estes iniciadores continham os sítios subsidiários de reconhecimento para Pstl e Hinálll). 3) O fragmento grande BglU-HindUl (3916 bp) de pMW118-ter_rmB. O plasmídeo pMW118-ter_rmB foi obtido por ligação dos três fragmentos de DNA seguintes: - O fragmento grande de DNA (2359 bp) incluindo o fragmento AatlI-EcoRI de pMW118 que foi obtido digerindo pMW118 com EcoRl, tratando com fragmento Klenow de DNA polimerase I, e então digerindo com AatlI; - O fragmento pequeno Aatll-BgHl (1194 bp) de pUC19 incluindo o gene bla para resistência a ampicilina (ApR), que foi obtido por amplificação por PCR da região correspondente do plasmídeo pUC19 usando os iniciadores P5 e P6 (SEQ ID NOS: 35 e 36) (estes iniciadores continham os sítios subsidiários de reconhecimento para Pstl, Aatll e BglII); - O fragmento pequeno BgllI-PstI (363 bp) do terminador de transcrição ter_rmB, que foi obtido por amplificação por PCR da região correspondente do cromossomo de Escherichia coli W3350 usando os iniciadores P7 e P8 (SEQ ID NOS: 37 e 38) (estes iniciadores continham os sítios subsidiários de reconhecimento para Pstl e BglII). 4) O fragmento pequeno EcoRl-Pstl (1388 bp) (SEQ ID NO: 39) de pML-Tc-ter_thrL incluindo o gene de resistência a tetraciclina e o terminador de transcrição ter_thrL; o plasmídeo pML-Tc-ter_thrL foi obtido pelas duas etapas seguintes: - o plasmídeo pML-ter_thrL foi obtido digerindo o plasmídeo pML-MCS (Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (em Russo), 2001, no. 5, 3-20) com a Xbal e BamHl, seguido por ligação do fragmento grande (3342 bp) com o fragmento Xbal-BamHl (68 bp) carregando terminador ter_thrL obtido por amplificação por PCR da região correspondente do cromossomo de Escherichia coli MG1655 usando os iniciadores P9 e PIO (SEQ ID NOS: 40 e 41)(estes iniciadores continham os sítios subsidiários de reconhecimento para Pstl, Xbal e BamHl); - o plasmídeo pML-Tc-ter_thrL foi obtido digerindo o plasmídeo pML-ter_thrL com Kpnl e Xbal seguido por tratamento com fragmento Klenow de DNA polimerase I e ligado com o fragmento pequeno EcoRA-Van9\\ (1317 bp) de pBR322 incluindo o gene de resistência a tetraciclina (pBR322 foi digerido com EcoRl e Van91I e então tratado com fragmento Klenow de DNA polimerase I).

Exemplo 1: Efeito de ruptura de gene sdhA e gene sucA em Pantoea ananatis (1) Construção de plasmídeo RSFPPG produtor de ácido glutâmico [00162] Foi construído um plasmídeo RSFPPG no qual genes de sistema de biossíntese de ácido L-glutâmico, gene prpC (publicação de pedido internacional WOW02006/051660), gene ppc e gene gdh (patente EP 0999282A) foram amplificados.

[00163] O iniciador 1 (SEQ ID NO: 42) e o iniciador 2 (SEQ ID NO: 43) para amplificar uma parte de RSFCPG (patente EP 1233068A) outra do que ORF do gene gltA foram construídos. Usando estes iniciadores e RSFCPG como o modelo, PCR foi realizado para obter um fragmento de cerca de 14,9 kb. Como para prpC, PCR foi realizado usando o iniciador 3 (SEQ ID NO: 44) e o iniciador 4 (SEQ ID NO: 45) e o DNA cromossômico da linhagem W3110 de E. coli como o modelo para obter um fragmento de cerca de 1,2 kb. Ambos os produtos de PCR foram tratados com Bglll e Kpnl, ligados, e então usados para transformar a linhagem JM109 de E. coli. Todas as colônias emergidas foram coletadas, e plasmídeos foram extraídos das colônias como uma mistura. A linhagem ME8330 de E. coli que é uma linhagem deficiente em citrato sintase (CS) foi transformada com a mistura de plasmídeos, e a suspensão celular foi aplicada no meio mínimo M9 (contendo 5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L de água pura) contendo 50 mg/L de uracil e 5 mg/L de tiamina HC1. A partir das linhagens emergidas, um plasmídeo foi extraído e designado RSFPPG. Este plasmídeo RSFPPG foi introduzido na linhagem NP 106 de Pantoea ananatis, que é uma linhagem produtora de ácido L-glutâmico, para construir uma linhagem produtora de ácido L-glutâmico, NP106/RSFPPG (esta linhagem é referida como “linhagem NA1”).

[00164] A linhagem NP 106 foi obtida como segue. A linhagem AJ13601 de Pantoea ananatis descrita acima foi cultivada durante a noite a 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e então o meio foi diluído de forma que 100 a 200 colônias aparecem por uma placa e aplicado a uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina. As colônias que apareceram foram replicadas para uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol, e uma linhagem que foi sensível a cloranfenicol foi selecionada para obter uma linhagem da qual pSTVCB foi eliminado, que foi designada G106S. A linhagem G106S foi adicionalmente cultivada durante a noite a 34°C no meio líquido LBGM9 com agitação, e o meio foi diluído de forma que 100 a 200 colônias devem aparecer por uma placa, e aplicado a uma placa LBGM9 sem drogas. As colônias que apareceram foram replicadas para uma placa LBGM9 contendo 12,5 mg/L de tetraciclina e uma placa LBGM9 sem drogas, e uma linhagem que foi sensível a tetraciclina foi selecionada para obter uma linhagem da qual RSFCPG foi eliminado, que foi designada NP106. A NP106 obtida como descrito acima é uma linhagem não contendo ambos os plasmídeos RSFCPG e pSTVCB, que são abrigados pela linhagem AJ13601. (2) Construção de linhagem com gene sdhA rompido [00165] PCR foi realizado usando pMW-attL-Kmr-attR como o modelo e os iniciadores de SEQ ID NOS: 46 e 47 para amplificar um fragmento gênico contendo um gene de resistência a canamicina, seqüências de attL e attR de λ fago em ambas as extremidades do gene de resistência, e seqüência anterior de 50 bp e seqüência posterior de 50 bp do gene sdhA adicionadas às extremidades exteriores das seqüências de λ fago. Este fragmento foi purificado usando Wizard PCR Prep DNA Purification System (produzido por Promega).

[00166] Então, a linhagem SC17(0) foi transformada com RSF-Red-TER para obter uma linhagem SC17(0)/RSF-Red-TER. Esta linhagem foi cultivada durante a noite no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl em 1 L de água pura, pH 7,0) contendo 25 mg/L de cloranfenicol, e o meio de cultura depois da cultura noturna foi inoculado para 100 mL do meio L contendo 25 mg/L de cloranfenicol e 1 mM de isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo em volume de 1/100, e cultura foi realizada a 34°C por 3 horas. As células preparadas como descrito acima foram coletadas, lavadas três vezes com ghcerol a 10% resfriado em gelo, e finalmente suspensas em 0,5 mL de ghcerol a 10%. As células suspensas foram usadas como células competentes, e 100 ng do fragmento de PCR preparado como descrito acima foi introduzido nas células usando GENE PULSERII (produzido por BioRad) nas condições de uma força de campo de 18 kV/cm, capacidade de capacitor de 25 pF e resistência de 200 Ω. Meio SOC resfriado em gelo (20 g/L de Bacto triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 0,5 g/L de NaCl, e 10 g/L de ghcose) foi adicionado à suspensão celular, e cultura foi realizada a 34°C por 2 horas com agitação. A cultura foi aplicada a um meio preparado adicionando ingredientes de meio mínimo (meio contendo 5 g de ghcose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L) e 40 mg/L de canamicina ao meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0). As colônias emergidas foram purificadas com o mesmo meio, e então foi confirmado que o gene sdhA foi substituído pelo gene de resistência a canamicina por PCR.

[00167] A partir desta linhagem deficiente em gene sdhA, cromossomo foi extraído usando Bacterial Genomic DNA Purification Kit produzido por Edge Biosystems. Separadamente, a linhagem NA1 foi cultivada durante a noite em um meio de ágar obtido adicionando os ingredientes do meio mínimo descrito acima e 12,5 mg/L de tetraciclina ao meio L. As células foram refugadas com uma abertura estreita, lavadas três vezes com glicerol a 10% resfriado em gelo, e finalmente suspensas em glicerol a 10% de forma a ter um volume final de 500 pL. As células suspensas foram usadas como células competentes, e 600 ng do DNA de cromossomo mencionado acima foi introduzido nas células usando GENE PULSER II (produzido por BioRad) nas condições de uma força de campo de 17,5 kV/cm, capacidade de capacitor de 25 pF e resistência de 200 Ω. Meio SOC resfriado em gelo foi adicionado à suspensão celular, e cultura foi realizada a 34°C por 2 horas com agitação. Então, a cultura foi aplicada a um meio de ágar preparado adicionando ingredientes do meio mínimo descrito acima, 12,5 mg/L de tetraciclina e 40 mg/L de canamicina ao meio L. As colônias emergidas foram purificadas com o mesmo meio, e então foi confirmado que o gene sdhA foi substituído pelo gene de resistência a canamicina por PCR.

[00168] A linhagem NA1 é deficiente no gene sucA codificando a subunidade El de α-KGDH. Por outro lado, nenhuma mutação está contida no gene sucA da linhagem SC17(0)/RSF-Red-TER. O gene sdhA e o gene sucA se localizam em posições extremamente próximas uma à outra, e o gene sucA tipo selvagem também é transferido em uma certa proporção junto com o sdhA mutado no momento da transformação com o DNA cromossômico da linhagem deficiente em gene sdhA. Portanto, as linhagens NA1 deficientes em sdhA obtidas incluem dois tipos de linhagens, uma deficiente no gene sucA e uma retomada ao tipo selvagem. Portanto, regiões correspondendo ao sítio de mutação do gene sucA de NA1 foram amplificadas por PCR, e foi confirmado se elas foram deficientes em sucA ou se o gene sucA retomou ao tipo selvagem com base em se elas devem ser digeridas com a enzima de restrição Bglll para obter uma linhagem deficiente em único sdhA e uma linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA.

(3) Avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico de linhagem deficiente em sdhA e linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA

[00169] Então, a fim de avaliar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da linhagem deficiente em sdhA e da linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA obtidas como descrito acima, cada uma destas linhagens foi inoculada em 5 mL de um meio tendo a composição mostrada abaixo contida em um tubo de teste, e cultura foi realizada por 18 horas. Ao passo que a linhagem NA1 que é a linhagem com deficiência única de sucA quase não cresceu no meio, e mostrou acumulação de ácido L-glutâmico de apenas cerca de 3,3 g/L, a linhagem com deficiência única de sdhA mostrou 13,2 g/L de acumulação de ácido L-glutâmico, o que notoriamente excedeu o resultado da linhagem com deficiência única de sucA. Por outro lado, a linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA mostrou 14,7 g/L de acumulação de ácido L-glutâmico, e foi confirmada ter capacidade de produção de ácido L-glutâmico maior do que aquela das linhagens deficientes em um de sucA e sdhA, e mostra crescimento notoriamente melhorado. (Composição de meio para avaliação de produção de ácido L- glutâmico) (parte A) Sacarose 30 g/L

MgS04-7H20 0,5 g/L (parte B) (NH4)2S04 20 g/L

KH2P04 2 g/L

FeS04-7H20 20mg/L

MnS04· 5H20 20 mg/L

Extrato de levedura (Difco) 2 g/L

Pantotenato de cálcio 18 mg/L (parte C) Carbonato de cálcio 20 g/L

[00170] Os ingredientes das partes A e B Ibram esterlizados a 115°C por 10 minutos por autoclavagem, e o ingrediente da parte C foi esterlizado a 180°C por 3 horas com calor seco, Depois dos ingredientes das três partes lerem sido resfriados para temperatura ambiente, eles foram misturados e usados.

Tabela l RS: Açúcar residual Exemplo 2: Efeito de ruptura de gene odhA e gene sdhA em bactéria corine forme (1) Construção de linhagem com gene odhA rompido [00171] A partir da linhagem ATCC 14067 de Brevibacferium flavum (atualmente classificada em Corynebacteríum glutamicum), uma linhagem deficiente no gene odhA, na qual C em posição 837 do gene yggB (SEQ 1D NO: 56) foi substituído por A, e o promotor do gene gdh foi modificado, foi construída. Embora a linhagem ATCC 14067 de B. flavum tenha sido usada como a linhagem parental neste exemplo, linhagens tendo propriedades similares podem ser construídas usando a linhagem ATCC 13032 de C. glutamicum ou a linhagem ATCC 13869 de B. iactofermentum como linhagem parental [00172] Primeiro, foi construído um plasmídeo pBS3AsucA47 para deletar odhA. PCR foi realizado usando o DNA sintético mostrado em SEQ JD NO: 48 e o DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 49 como iniciadores e o DNA cromossômico de B. flavum ATCC 14067 como o modelo para preparar um fragmento de lado N-termínal. De uma maneira similar, um fragmento de lado C-terminal foi preparado usando os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 50 e 51 como iniciadores. Então, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades iguais dos fragmentos de lado N-terminal e C-terminal como o modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 52 e 53 (seqüência de BamHl foi adicionada) como os iniciadores para obter um fragmento do odhA cuja região de codificação foi deletada. O fragmento de odhA mutante obtido foi tratado com BamHl, e inserido em pBS3 (publicação de pedido internacional WOW02006/070944) no sítio BamHl, e o plasmídeo obtido foi designado como pBS3AsucA47.

[00173] pBS3AsucA47 foi introduzido na linhagem ATCC 14067 de B. flavum pelo método de pulso elétrico, e as células foram aplicadas ao meio de ágar CM-Dex (5 g/1 de glicose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2P04, 0,4 g/1 de MgS047H20, 0,01 g/1 de FeS04-7H20, 0,01 g/1 de MnS04 4-5H20, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de solução de hidrólise de proteína de soja, e 20 g/1 de ágar, ajustado para pH 7,5 com NaOH, autoclavado a 120°C por 20 minutos) contendo 25 pg/ml de canamicina. A linhagem que cresceu depois da cultura realizada a 31,5°C por dois dias foi designada como linhagem ATCC14067-pBS3AsucA na qual pBS3AsucA47 foi inserido no cromossomo. Então, a linhagem ATCC14067-pBS3AsucA foi cultivada durante a noite no meio líquido CM-Dex, a suspensão obtida foi aplicada ao meio de ágar S10 (100 g/1 de sacarose, 10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 1 g/1 de KH2P04, 0,4 g/1 de MgS04 7H20, 0,01 g/1 de FeS04 7H20, 0,01 g/1 de MnS04 4-5H20, 3 g/1 de uréia, 1,2 g/1 de solução de hidrólise de proteína de soja, e 20 g/1 de ágar, ajustado para pH 7,5 com NaOH, autoclavada a 120°C por 20 minutos), e cultura foi realizada a 31.5°C. Entre as colônias emergidas, linhagens que foram sensíveis a canamicina foram selecionadas, e adicionalmente purificadas no meio de ágar CM-Dex. DNAs cromossômicos foram preparados a partir destas linhagens, PCR foi realizado com os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 52 e 53 como iniciadores, e uma linhagem para qual um fragmento de amplificação de cerca de 1,9 kb foi confirmado foi designada com linhagem 8L3.

[00174] PCR foi realizado usando DNA cromossômico da linhagem 8L3 como o modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 54 e 55 (seqüência de Saci foi adicionada) como iniciadores, e a seqüência do fragmento de amplificação obtido foi determinada. Como um resultado, foi revelado que a alanina em posição 111 de SEQ ID NO: 57 foi substituída por treonina. Isto é, 8L3 foi uma linhagem com mutação dupla na qual a mutação acima foi acidentalmente introduzida no momento da introdução da deficiência de odhA. Como uma linhagem tendo a mesma mutação de yggB que aquela de 8L3, a linhagem ATCC14067yggB8 é conhecida (publicação de pedido internacional WOW02006/070944). Introduzindo pBS3AsucA47 na linhagem ATCC14067yggB e realizando as etapas mencionadas acima, uma linhagem deficiente em odhA tendo a mesma mutação de yggB que aquela de 8L3 pode ser construída.

[00175] Então, foi construído um plasmídeo pBS4gdh3 para introduzir uma mutação na região promotora de gdh. PCR foi realizado usando o DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 60 e o DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 61 como iniciadores e DNA cromossômico da linhagem ATCC 13869 de B. lactofermentum como o modelo para obter um fragmento de lado N-terminal. De uma maneira similar, um fragmento de lado C-terminal foi preparado usando os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 62 e 63 como iniciadores. Então, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades iguais dos fragmentos de lado N-terminal e C-terminal como o modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 64 e 65 (seqüência de Smal foi adicionada) como iniciadores para obter um fragmento do gene gdh no qual uma mutação foi introduzida na região promotora. O fragmento de gdh mutante obtido foi tratado com Smal, e inserido em pBS4S (publicação de pedido internacional WOW02006/070944) no sítio Smal, e o plasmídeo obtido foi designado como pBS4gdh3.

[00176] pBS4gdh3 foi introduzido na linhagem 8L3 pelo método de pulso elétrico, e as células foram aplicadas ao meio de ágar CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina. A linhagem que cresceu depois da cultura realizada a 31,5°C por três dias foi isolada como linhagem 8L3-pBS4gdh3 na qual pBS4gdh3 foi inserido no cromossomo. Então, a linhagem 8L3-pBS4gdh3 foi cultivada durante a noite no meio líquido CM-Dex, a suspensão obtida foi aplicada ao meio de ágar S10, e cultura foi realizada a 31,5°C. Entre as colônias emergidas, linhagens tendo sensibilidade para canamicina foram selecionadas, e adicionalmente purificadas no meio de ágar CM-Dex. DNAs cromossômicos foram preparados a partir destas linhagens, uma seqüência de região de codificação antes de gdh foi determinada. Uma linhagem tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 66 foi designada como linhagem 8L3G.

(2) Construção de linhagem deficiente em SDH

[00177] Foi construído um plasmídeo pBS3Asdh47 para deletar sdhA. PCR foi realizado usando o DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 67 e o DNA sintético mostrado em SEQ ID NO: 68 como iniciadores e o DNA cromossômico de B. flavum ATCC 14067 como o modelo para preparar um fragmento de lado N-terminal. De uma maneira similar, um fragmento de lado C-terminal foi preparado usando os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 69 e 70 como iniciadores. Então, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades iguais dos fragmentos de lado N-terminal e C-terminal como o modelo e os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 71 e 72 como iniciadores para obter um fragmento do sdhA cuja região de codificação foi deletada. O fragmento de sdhA mutante obtido foi tratado com BamHl, e inserido em pBS3 (publicação de pedido internacional WOW02006/070944) no sítio BamHl, e o plasmídeo obtido foi designado como pBS3AsdhA47.

[00178] pBS3AsdhA47 foi introduzido na linhagem 8L3G pelo método de pulso elétrico, e as células foram aplicadas ao meio de ágar CM-Dex contendo 25 pg/ml de canamicina. A linhagem que cresceu depois da cultura realizada a 31,5°C por dois dias foi designada como linhagem 8L3G-pBS3AsdhA na qual pBS3AsdhA47 foi inserido no cromossomo. Então, a linhagem 8L3G-pBS3AsdhA foi cultivada durante a noite no meio líquido CM-Dex, a suspensão obtida foi aplicada no meio de ágar S10, e cultura foi realizada a 31,5°C. Entre as colônias emergidas, linhagens que foram sensíveis a canamicina foram selecionadas, e adicionalmente purificadas no meio de ágar CM-Dex. DNAs cromossômicos foram preparados a partir destas linhagens, PCR foi realizado com os DNAs sintéticos de SEQ ID NOS: 71 e 72 (seqüência de BamHI foi adicionada) como iniciadores, e uma linhagem para qual um fragmento de amplificação de cerca de 1 kb foi confirmado foi designada como linhagem 8L3GASDH.

(6) Avaliação de capacidade de produção de ácido L-glutâmico de linhagem deficiente em sdhA e linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA

[00179] Então, a fim de avaliar capacidade de produção de ácido L-glutâmico da linhagem 8L3G e da linhagem deficiente em SDH desta obtida como descrito acima, a linhagem 8L3GASDH, cada uma destas linhagens foi cultivada durante a noite em um meio de placa CM-Dex, e então a quantidade total das células foram refugadas, inoculadas em 300 mL de um meio tendo a composição mostrada abaixo contida em um pote, e cultivadas a 31,5°C. pH foi controlado para ser 7,2 usando gás amônia durante a cultura, e agitação para aeração foi controlada de forma que concentração de oxigênio dissolvido é mantida como sendo 5% ou superior. Como mostrado em Tabela 2, os resultados foram que a linhagem com deficiência dupla de sucAsdhA, 8L3GASDH, mostrou uma taxa de produção maior de ácido glutâmico se comparada com a linhagem com deficiência única de sucA, 8L3G. A acumulação de ácido L-glutâmico depois da cultura por 12,5 horas era 19 g/L com a linhagem 8L3GASDH. Assim, a linhagem 8L3GASDH notoriamente excedeu a linhagem com deficiência única de sue A, a linhagem 8L3G. Estes resultados demonstraram que deficiência tanto de sucA como sdhA é efetiva para produção de ácido L-glutâmico também em bactérias corineformes.

[00180] (Composição de meio para avaliação de produção de ácido L-glutâmico) Glicose 60 g/L

MgS04-7H20 0,9 g/L

H3PO4 1,54 g/L

KOH 1,45 g/L

FeS04-7H20 10 mg/L

Hidrolisado de soja 1,54 g (como nitrogênio)/L

Biotina 3,2 mg/L

VB1 0,67 mg/L

DL-Metionina 0,28 g/L

[00181] O meio foi ajustado para pH 4,0 com amônia aquosa, então esterilizado a I20°C por 15 minutos, adicionalmente ajustado para pH 7,2 com gás amônia imediatamente antes da cultura, e usado para a cultura.

Tabela 2 Explicação de Listagem de Sequências: 100182] SEQ ID NO: 1: Sequência de nucleotídeos de operon sdh de Pantoea ananatis (sequências de aminoácidos de SDHD, SDHA e SDHB também são mostradas) sdhC: 527-913 sdhD: 910-1254 sdhA: 1258-3021 sdhB: 3039-3752 SEQID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de SDHD SEQ ID NO: 3: Seqüência de aminoácidos de SDHA SEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de SDHB SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos de operon sdh de Pantoea ananatis (seqüência de aminoácidos de SDHC também é mostrada) SEQ ID NO: 6: Seqüência de aminoácidos de SDHC SEQ ID NO: 7: Seqüências de nucleotídeos de genes de subunidade α-KGDH e genes vizinhos de Pantoea ananatis sdhB: 2-121 sucA: 322-3129 sucB: 3145-4368 sucC: 4437-4556 SEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de proteína ferro-enxofre succinato desidrogenase (parte) SEQ ID NO: 9: Seqüência de aminoácidos de subunidade a- KGDH Elo SEQ ID NO: 10: Seqüência de aminoácidos de subunidade a- KGDH E2o SEQ ID NO: 11: Parte de subunidade β de succinil-CoA sintetase SEQ ID NO: 12: Seqüência de nucleotídeos de gene odhA de Brevibacterium lactofermentum SEQ ID NO: 13: Seqüência de aminoácidos de subunidade Elo codificada por odhA SEQ ID NO: 14: Seqüência de nucleotídeos de gene codificando subunidade E2o de Brevibacterium lactofermentum (NCgl2126 de No. de Acesso de GenBank NC_003450) SEQ ID NO: 15: Seqüência de aminoácidos de subunidade E2o codificada por NCgl2126 SEQ ID NO: 16: Seqüência de nucleotídeos de gene hisD de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 17: Iniciador para amplificação de fragmento para integração de gene Kmr em gene hisD

SEQ ID NO: 18: Iniciador para amplificação de fragmento para integração de gene Kmr em gene hisD SEQ ID NO: 19: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO: 20: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO: 21: Iniciador para amplificação de gene sacB SEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação de gene sacB SEQ ID NO: 23: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor Piacuv5 SEQ ID NO: 24: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor Piacuv5 SEQ ID NO: 25: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo genes XRedapy e tL3 SEQ ID NO: 26: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo genes XRedapy e tL3 SEQ ID NO: 27: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor Piacuv5 e TrmB

SEQ ID NO: 28: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor Piacuv5 e TrmB

SEQ ID NO: 29: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 30: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 31: Seqüência de nucleotídeos de attL SEQ ID NO: 32: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 33: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 34: Seqüência de nucleotídeos de attR SEQ ID NO: 35: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene bla SEQ ID NO: 36: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene bla SEQ ID NO: 37: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rmB

SEQ ID NO: 38: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rmB

SEQ ID NO: 39: Seqüência de nucleotídeos de fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 40: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 41: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL

SEQ ID NO: 42: Iniciador para amplificação de unidades de gene gltA outras do que ORF

SEQ ID NO: 43: Iniciador para amplificação de unidades de gene gltA outras do que ORF

SEQ ID NO: 44: Iniciador para amplificação de gene prpC

SEQ ID NO: 45: Iniciador para amplificação de gene prpC

SEQ ID NO: 46: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA para ruptura de sdhA

SEQ ID NO: 47: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA para ruptura de sdhA

SEQ ID NO: 48: Iniciador para amplificação de fragmento antes de gene sucA

SEQ ID NO: 49: Iniciador para amplificação de fragmento antes de gene sucA SEQ ID NO: 50: Iniciador para amplificação de fragmento depois de gene sucA

SEQ ID NO: 51: Iniciador para amplificação de fragmento depois de gene sucA SEQ ID NO: 52: Iniciador para amplificação de gene sucA SEQ ID NO: 53: Iniciador para amplificação de gene sucA SEQ ID NO: 54: Iniciador para amplificação de gene yggB SEQ ID NO: 55: Iniciador para amplificação de gene yggB SEQ ID NO: 56: Seqüência de nucleotídeos de gene yggB SEQ ID NO: 57: Seqüência de aminoácidos de YggB SEQ ID NO: 58: Seqüência de nucleotídeos de gene yggB mutante SEQ ID NO: 59: Seqüência de aminoácidos de YggB mutante SEQ ID NO: 60: Iniciador para amplificação de região antes de gene gdh (mutação é introduzida) SEQ ID NO: 61: Iniciador para amplificação de região antes de gene gdh SEQ ID NO: 62: Iniciador para amplificação de região depois de gene gdh SEQ ID NO: 63: Iniciador para amplificação de região depois de gene gdh (mutação é introduzida) SEQ ID NO: 64: Iniciador para amplificação de gene gdh SEQ ID NO: 65: Iniciador para amplificação de gene gdh SEQ ID NO: 66: Seqüência de nucleotídeos de região de codificação antes de gene gdh mutante SEQ ID NO: 67: Iniciador para amplificação de região antes de gene sdhA SEQ ID NO: 68: Iniciador para amplificação de região antes de gene sdhA (mutação é introduzida) SEQ ID NO: 69: Iniciador para amplificação de região depois de gene sdhA SEQ ID NO: 70: Iniciador para amplificação de região depois de gene sdhA (mutação é introduzida) SEQID NO: 71: Iniciador para amplificação de gene sdhA SEQ ID NO: 72: Iniciador para amplificação de gene sdhA SEQ ID NO: 73: Seqüência de nucleotídeos de operon sdh de C. glutamicum ATCC 13032 (seqüências de aminoácidos de SDHC, SDHA e SDHB também são mostradas) sdhC: 449-1219 sdhA: 1239-3257 sdhB: 3260-4006 SEQ ID NO: 74: Seqüência de aminoácidos de SDHC SEQ ID NO: 75: Seqüência de aminoácidos de SDHA SEQ ID NO: 76: Seqüência de aminoácidos de SDAB SEQ ID NO: 77: Seqüência de nucleotídeos de operon sdh de B. lactofermentum ATCC 13869 (seqüências de aminoácidos de SDHC, SDHA e SDHB também são mostradas) sdhC: 449-1219 sdhA: 1239-3257 sdhB: 3260-4006 SEQ ID NO: 78: Seqüência de aminoácidos de SDHC SEQ ID NO: 79: Seqüência de aminoácidos de SDHA SEQ ID NO: 80: Seqüência de aminoácidos de SDHB Aplicabilidade Industrial [00183] De acordo com o método de a presente invenção, L- aminoácidos tal como ácido L-glutâmico podem ser eficientemente produzidos por fermentação.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, o método caracterizado por compreender: cultivar em um meio um microorganismo que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido e foi modificado de forma que atividade de succinato desidrogenase e atividade de a-cetoglutarato desidrogenase são diminuídas para produzir e acumular um L-aminoácido no meio, e coletar o L-aminoácido do meio, em que o microorganismo é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae ou uma batéria corineforme, em que a atividade de succinato desidrogenase é diminuída reduzindo expressão de um gene codificando succinato desidrogenase ou rompendo o gene, em que a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase é diminuída reduzindo expressão de um gene codificando a-cetoglutarato desidrogenase ou rompendo o gene, e em que o ammoácido é ácido L-glutamico.

2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene codificando succinato desidrogenase é um ou mais tipos de genes selecionados a partir de gene sdhA, gene sdhB^ gene sdhC e gene sdhD.

3. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene codificando a-cetoglutarato desidrogenase é um ou mais tipos de genes selecionados a partir de gene sucA, gene odhA e gene sucB.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Pantoea anematis ou Corynebacteríum glutamicum.