JP6688497B2 - 有機酸の製造方法 - Google Patents
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Description
有機酸は、利用価値の高い化合物である。例えば、有機酸である乳酸からは、優れた生分解性プラスチックであるポリ乳酸を製造可能である。なかでもコハク酸は、汎用の化学・工業原料であり、ポリブチレンサクシネート(PBS)の原料や、化学品中間体、溶剤、可塑剤として広く利用されている。例えば、コハク酸を原料として製造されるポリブチレンサクシネートは、農業用マルチフィルム、包装材、農場・土木資材等に使用され、2011年の出荷量は約3100tにのぼる。
現在、コハク酸は、主に石油を原料として製造されているが、石油の代わりにバイオマスを利用しようとする流れがある。例えば、非特許文献1には、従属栄養微生物を用いてコハク酸を生産する技術が開示されている。いくつかの企業ではバクテリア又は酵母の発酵により、コハク酸の生産を開始している。
一方、藍藻は上記微生物とは異なり、光合成により二酸化炭素と光エネルギーを直接資源化することができる。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、藍藻を用いて高効率に有機酸を製造可能な、有機酸の製造方法の提供を課題とする。
前記ヒドロゲナーゼ遺伝子がhoxであり、前記ヒドロゲナーゼがHoxであり、
前記有機酸が、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選ばれる少なくとも一種である、有機酸の製造方法。
(2)前記藍藻が、hoxH遺伝子及び/又は前記hoxH遺伝子の発現調節領域の配列が改変されたものである、前記(1)に記載の有機酸の製造方法。
(3)前記hoxH遺伝子が、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である前記(2)に記載の有機酸の製造方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列との配列同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(4)前記藍藻を培養物中で培養することが、前記藍藻を好気培養した後に嫌気培養することを含む、前記(1)〜(3)のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
(5)前記好気培養において、前記培養物中の窒素イオン濃度が1mM以下の低窒素期間を有する前記(4)に記載の有機酸の製造方法。
(6)前記嫌気培養開始時に藍藻が非休眠状態である、前記(5)に記載の有機酸の製造方法。
(7)前記嫌気培養を暗条件下で行う、前記(4)〜(6)のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
(8)前記有機酸がコハク酸及び/又は乳酸である、前記(1)〜(7)のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
(9)前記培養物が培養液であり、前記培養液中から前記有機酸を採取する、前記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
(10)前記藍藻がシネコシスティス(Synechocystis)属の藍藻である、前記(1)〜(9)のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
以下、本発明の一実施形態の有機酸の製造方法について説明する。
藍藻はシアノバクテリアとも呼ばれ、光合成を行う真正細菌である。他の大部分の藻類が真核生物であるのに対し、原核生物に分類される。
実施形態に係る藍藻は、藍藻が本来有する内在性のヒドロゲナーゼの、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻である。
藍藻において、Hoxヒドロゲナーゼは、5つのタンパク質(HoxEFUYH)から構成されることが知られている(文献:Carrie Eckert et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 52, pp. 43502-43515,"Genetic Analysis of the Hox Hydrogenase in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Reveals Subunit Roles in Association, Assembly, Maturation, and Function"参照)。HoxYとHoxHは、ヒドロゲナーゼ部分を構成する。HoxEとHoxFとHoxUは、NADHからNAD+を生成するジアホラーゼ部分を構成する。このように、ヒドロゲナーゼが複数のタンパク質から構成されている場合、ヒドロゲナーゼの活性に寄与するものであれば、実施形態に係るヒドロゲナーゼに包含される。
或いは、発生した水素量に基づき、藍藻におけるヒドロゲナーゼ活性を求めてもよい。例えば、活性測定対象の藍藻または藍藻から得た細胞抽出物を、ヒドロゲナーゼの水素発生条件を満たした密閉容器内で反応させ、反応後の密閉容器内の気体の水素濃度を測定してもよい。コントロールとなる野生型等の藍藻と活性測定対象の藍藻とを比較して、活性測定対象の藍藻のほうが容器内の水素濃度が低く、ヒドロゲナーゼ活性が水素蓄積量の律速となっていると認識できる場合、測定対象の藍藻のヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失していると判断できる。結果の比較は、比較可能な同条件のもとに行われた実験結果によるものとする。野生型の藍藻としては、Synechocystis GT株を例示できる。なお、藍藻におけるヒドロゲナーゼ活性測定方法は上記方法に限定されない。
本実施形態に係る藍藻は、ヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失している藍藻であってもよい。本実施形態に係る藍藻は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制又は喪失しており、ヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失している藍藻であってもよい。
実施形態に係る藍藻が、ヒドロゲナーゼ活性が低下している藍藻の場合、ヒドロゲナーゼ活性の低下の程度は、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、藍藻に有機酸生産能の向上が認められる程度であればよい。
コントロールとなる野生型等の藍藻と、有機酸生産能の測定対象の藍藻とを比較して、生産能測定対象の藍藻のほうで、細胞抽出物中の有機酸濃度が高い場合、測定対象の藍藻の有機酸蓄積能(有機酸生産能)が向上していると判断できる。
コントロールとなる野生型等の藍藻と、有機酸生産能の測定対象の藍藻とを比較して、生産能測定対象の藍藻のほうで、培養物中の有機酸濃度が高い場合、測定対象の藍藻の細胞外への有機酸生産能(有機酸生産能)が向上していると判断できる。
結果の比較は、比較可能な同条件のもとに行われた実験結果によるものとする。野生型の藍藻としては、Synechocystis GT株を例示できる。なお、藍藻における有機酸生産能の測定方法は上記方法に限定されない。
前記有機酸は、コハク酸及び/又は乳酸であることが好ましい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞内のコハク酸蓄積能が2倍以上であってもよく、10倍以上であってもよく、15倍以上であってもよい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞外へのコハク酸生産能が2倍以上であってもよく、3倍以上であってもよく、5倍以上であってもよい。
実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞内の乳酸蓄積能が2倍以上であってもよく、4倍以上であってもよい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞外への乳酸生産能が2倍以上であってもよく、5倍以上であってもよく、10倍以上であってもよい。
一般的に使われるシアノバクテリア野生株であるSynechocystis GT株などは、一般的に培養物にDNAを加えると、それを細胞の中に取り込み、相同組換えが進む(Natural Transformation)。Synechocystis sp.PCC 6803(GT株)は、Natural Transformationが可能である。
HoxHの機能が喪失した藍藻では、Hoxヒドロゲナーゼの活性が喪失することが知られている(Appel et al. (2000) The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Arch. Microbiol. 173(5-6)333-338)。係る観点から、実施形態に係る前記ヒドロゲナーゼ遺伝子はhoxHであることが好ましい。実施形態に係る藍藻は、hoxH遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はHoxHが構成するヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失していてもよく、さらにhoxH遺伝子及び/又はhoxH遺伝子の発現調節領域の配列が改変された藍藻であることが好ましい。
ヒドロゲナーゼ遺伝子の全コピーのうち、改変されるコピーの割合は、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、藍藻に有機酸生産能の向上が認められる程度であればよい。有機酸生産能の向上については上記のとおりである。
有機酸の製造に用いる藍藻のヒドロゲナーゼが既知である場合、その情報に基づき、対象とする藍藻のヒドロゲナーゼ遺伝子を容易に特定可能である。
有機酸の製造に用いる藍藻のヒドロゲナーゼが未知である場合であっても、当業者であれば、既知ヒドロゲナーゼの配列情報等に基づき、対象とする藍藻におけるヒドロゲナーゼ遺伝子を、容易に特定可能である。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列との配列同一性が80%以上であるアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
したがって、本発明の一実施形態に係るHoxHは、以下の(b)のアミノ酸配列を有するものである。(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1〜数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるポリペプチド。
(b)のポリペプチドにおいて、「塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」とは、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列であってもよく、欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選ばれる少なくとも一種の改変又は変異により、改変前の配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して、1〜数個のアミノ酸の相違が生じたものであってもよい。
したがって、本発明の一実施形態に係るHoxHは、以下の(c)のアミノ酸配列を有するものである。(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(c)のポリポリペプチドにおいて、配列番号1に示されるアミノ酸配列との配列同一性は、80%以上100%未満であり、例えば、85%以上、90%以上、95%以上、又は98%以上であってもよい。
アミノ酸配列同士の配列同一性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)やblastpを用いて算出可能である。
配列番号2で表される塩基配列は、Synechocystis sp. PCC 6803株のhoxHのコーディング領域の塩基配列である。
本発明の一実施形態において、有機酸の製造方法は、上記実施形態の藍藻を培養物で培養して有機酸を製造させ、藍藻内及び/又は培養後の培養物中から前記有機酸を採取することを含む。
藍藻を培養する培養系内を、藍藻が嫌気発酵可能な条件下とする方法としては、例えば、密閉され、光照射が遮られた培養容器内で藍藻を培養することで、藍藻の呼吸により培養容器内の酸素を消費させる方法が挙げられる。したがって、本実施形態の有機酸の製造方法においては、嫌気培養は暗条件下で行うことが好ましい。
別例として、例えば、培養容器内に窒素ガスを流入させ、培養容器内の酸素を窒素で置換する方法が挙げられる。
ここで、低窒素とは、藍藻にとって窒素が欠乏した状態ではなく、その前段階の状態のことを指す。藍藻にとって窒素が欠乏した状態が続くと、藍藻が休眠状態に移行することが知られている。発明者は、窒素が欠乏して休眠状態へ移行した藍藻よりも、その前段階の状態の藍藻のほうが、有機酸の生産能が高いことを見出した。
したがって、嫌気培養開始時に、藍藻は非休眠状態であることが好ましい。藍藻が休眠状態か非休眠状態かを判断するには、藍藻の色の変化を指標とすればよい。休眠状態への移行に伴い、藍藻の色は、緑色から黄色へと変化することが知られている。これは、フィコビリソームと呼ばれる集光装置を壊して、窒素原を回収するためである。
上記に例示したような培地は、好機培養、嫌気培養のいずれにも使用可能であるが、嫌気培養では、主に藍藻内に蓄積された炭素源を用いて有機酸の生産が行われるため、栄養源を含む培地を使用せずともよい。嫌気発酵では、例えば、培地の代わりとして、藍藻を生存させることが可能なバッファーを、培養物として使用できる。
藍藻を培養する期間は、培養物中の藍藻の濃度や有機酸の生産量に応じて適宜定めればよい。上記好気培養の期間は、1時間〜20日程度としてもよく、1日〜10日程度としてもよく、1〜3日程度としてもよい。好機培養は、振とう培養や通気培養により行ってもよい。上記嫌気培養の期間は、1時間〜20日程度としてもよく、1日〜10日程度としてもよく、1〜3日程度としてもよい。
藍藻が藍藻外に有機酸を放出している場合、培養後の培養物中から前記有機酸を採取すればよい。例えば、上記実施形態の藍藻を培養物で培養して有機酸を製造させ、培養後の培養物中からコハク酸及び/又は乳酸を採取してもよい。当該培養後の培養物は、遠心分離や濾過等の分離処理が施され藍藻が分離されたものであってもよく、藍藻が分離されていない状態であってもよい。分離処理された培養物中では、藍藻が完全に除かれてなくともよい。
・pUC119へのクローニング
WEB公開されたSynechocystis sp. PCC 6803株のゲノム情報(http://genome.microbedb.jp/cyanobase/Synechocystis)の、hoxHの遺伝子情報(ID:sll1226)に基づき、Synechocystis sp. PCC 6803株から、以下のプライマーセットでhoxHを増幅した[hoxHF: 5’−TTCCGCATGCTTACAAGATCCGGCTTTC−3’(配列番号3)、hoxHR: 5’−TTAAGATATCAGCCCGTTGCCGATATT−3’(配列番号4)]。hoxHFプライマーとhoxHRプライマーには、それぞれ、SphI(Forward)サイト、EcoRV(Reverse)サイトを付けている。
増幅したhoxHをSphIとEcoRVで切断し、pUC119プラスミドのSphI、SmaIサイトに導入し、得られたプラスミドをpUC−hoxHと名付けた。
pTGP2031Vプラスミドの薬剤マーカー領域及びプロモータ領域を、下記のプライマーセットで増幅した[pUC−Reg45−IntegF: 5’−TATTCTGGGCCCTTTGCTTCATCGCTCGAG−3’(配列番号5)、pUC−Reg45−IntegR: 5’−TATCAAGGGCCCATCCAATGTGAGGTTAAC−3’(配列番号6)]。プライマーには、それぞれ、ApaIサイトを付けている。
上記で得られたpUC−hoxHをMscIで切断し、MscIサイトに上記で得られたpTGP2031Vプラスミドの薬剤マーカー領域及びプロモータ領域を連結した。得られたプラスミドを、pTGP1226と名付けた。
pTGP1226では、hoxH遺伝子の構造遺伝子配列の一部に、薬剤マーカー及びプロモータの配列などが挿入された配列を有している。
Synechocystis sp.PCC 6803株をBG−11液体培地に植菌し、通常の培養条件(30℃、1% CO2、50〜100μmol photons m−2s−1)で3〜4日培養した。OD730=3〜4の培養物100〜500μLに対し、上記で得られたpTGP1226プラスミドを100〜300ng/μlの濃度で含む溶液を1〜2μl加え、プラスミド混合培養液を得た。
BG−11 plate上に、ニトロセルロース膜(ミリポア、Immobilon−NC、Cat.No.HATF08250、Pore size 0.45 μm、Cut size 82mm)を載せ、その上にプラスミド混合培養液を塗り広げ、一晩培養した。
終濃度3μg/mlのゲンタマイシンを含むBG−11プレートに、上記培養後のメンブレンを移し3〜4週間培養した。得られたコロニーを別の上記BG−11プレートに再播種して数日間培養した。培養及び再播種を2、3回繰り返した。BG−11培地の組成を以下に示す。
上記で得られた形質転換体候補株に対しhoxH発現解析を行った。形質転換体候補株からmRNAを抽出してcDNAを合成し、リアルタイムPCRでhoxHのmRNA量を測定した。hoxHのmRNA量の測定に用いたプライマーセットは、以下のとおりである[hoxHF: 5’−GGCAATTTGGCCAAACGGTA−3’(配列番号7)、hoxHR: 5’−TCCACAATCCATTGTCTGCC−3’(配列番号8)]。
結果を図1に示す。発現解析の結果、野生型のGT株と比べて、hoxHのmRNAの発現量が約半分にまで低下したhoxH発現抑制株(△hoxH)が得られたことが確認できた。
上記hoxH発現抑制株又はGT株を、OD730=20になるよう10 mL HEPES−KOH(pH7.8)に濃縮し、暗条件下の密閉容器内で3日間嫌気培養した。培養後の密閉容器内の気相に対し、GC−TCD(ガスクロマトグラフ−熱伝導度検出器)を用いて水素量を測定した。
結果を図2に示す。野生型のGT株と比べ、hoxH発現抑制株では密閉容器内に蓄積した水素量の値が低下していた。
(好機培養)
50 ml程度のBG−11液体培地に、hoxH発現抑制株をプレートから植菌し、30℃、空気(1%CO2)、白色光50〜80 μmol photonsm−2s−1の明条件で3〜4日間、前培養した。70ml BG−110 (窒素源の入っていない培地) +5mM NH4Clに、OD730=0.4となるように、遠心して回収した前培養の細胞を加え、上記と同じ明条件で3日間培養した。3日間培養後の培地中のアンモニアの濃度は1mM以下(検出限界以下)であった。また、3日間培養後の藍藻の細胞は、低窒素条件下であっても、休眠していない状態であった。
(嫌気培養)
上記好機培養後の細胞を回収し、10mLの20mM Hepes−KOH(pH7.8)にOD730=20となるよう、細胞を再懸濁した。この再懸濁物をガスクロバイアル瓶に入れ、ブチルゴムで密栓して栓にシリンジを2本連結した。片方のシリンジから、1時間N2ガスをガスクロバイアル瓶に吹き込み、瓶内の空気をN2ガスに置換した。N2ガスを止めてシリンジを栓から抜き、瓶をアルミ箔で覆い、密閉状態で3日間、暗条件で振盪培養し培養液を得た。BG−11培地0+5mM NH4Clの組成を以下に示す。
上記実施例1において、瓶内の空気をN2ガスに置換せず、嫌気培養に代えて好機培養を行った以外は、実施例1と同様にして培養を行い、培養液を得た。
上記実施例1において、hoxH発現抑制株に代えて野生株(GT株)を用いた以外は、実施例1と同様にして培養を行い、培養液を得た。
上記比較例1において、瓶内の空気をN2ガスに置換せず、嫌気培養に代えて好機培養を行った以外は、比較例1と同様にして培養を行い、培養液を得た。
上記の暗条件で振盪培養して得られた実施例1、参考例1、比較例1及び比較例2の培養液のそれぞれを、OD730=1×10ml分サンプリングし、フィルター濾過し、フィルターに細胞を集めた。
1μMの10−カンファースルホン酸を含む500μLメタノールを氷冷したものを抽出液として用意した。この抽出液に上記のフィルターを浸して、ボルテックスミキサーを用いて20秒間撹拌した。撹拌後の抽出液に、氷冷した500μLクロロホルム及び氷冷した200μLの滅菌水を加えた後、ボルテックスミキサーを用いて30秒間撹拌し、その後15,000rpm×5分, 4℃の条件で遠心分離させた。分離した上清300μlを新しいチューブに移し、1mM ピメリン酸を7μL加えたものを定法に沿って調製し、ガスクロマトグラフ質量分析計(GC−MS)により成分を分析した。
実施例1の培養液から得られた藍藻(hoxH_Anaerobic)では、参考例1の培養液から得られた藍藻(hoxH_Aerobic)、比較例1の培養液から得られた藍藻(GT_Anaerobic)、及び比較例2の培養液から得られた藍藻(GT_Aerobic)と比べて、細胞内の有機酸(ピルビン酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸)の量が顕著に増加していることが明らかとなった。
上記の暗条件で振盪培養して得られた実施例1及び比較例1の培養液のそれぞれを遠心分離し、上清1mlを集めた。上清を凍結乾燥させ、得られた固体成分を移動相である3mM HClO4溶液100μlに溶解し、これらを高速液体クロマトグラフィー(HPLC) LC−2000 Plus(日本分光)を用い、定法に沿って成分分析した。
移動相:3mM過塩素酸水溶液
反応液:0.2mMブロモチモールブルー(BTB),15mM リン酸水素ナトリウム(Na2HPO4・12H2O)
カラム:Shodex RSpak KC−811 x2
図4に示す結果から、hoxH発現抑制株により有機酸(コハク酸、乳酸)の細胞外生産が可能であることが示された。実施例1で得られた培養液(hoxH)では、比較例1で得られた培養液(GT)と比べて、培養液中の有機酸(コハク酸、乳酸)の量が顕著に増加していることが明らかとなった。
Claims (10)
- ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻、を培養物で培養して有機酸を製造させ、前記藍藻内及び/又は前記培養後の前記培養物中から前記有機酸を採取することを含み、
前記ヒドロゲナーゼ遺伝子がhoxであり、前記ヒドロゲナーゼがHoxであり、
前記有機酸が、ピルビン酸、乳酸、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選ばれる少なくとも一種である、有機酸の製造方法。 - 前記藍藻が、hoxH遺伝子及び/又は前記hoxH遺伝子の発現調節領域の配列が改変されたものである、請求項1に記載の有機酸の製造方法。
- 前記hoxH遺伝子が、以下の(a)〜(c)からなる群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である請求項2に記載の有機酸の製造方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列との配列同一性が90%以上であるアミノ酸配列を有し、Hoxにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 - 前記藍藻を培養物中で培養することが、前記藍藻を好気培養した後に嫌気培養することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
- 前記好気培養において、前記培養物中の窒素イオン濃度が1mM以下の低窒素期間を有する請求項4に記載の有機酸の製造方法。
- 前記嫌気培養開始時に藍藻が非休眠状態である、請求項5に記載の有機酸の製造方法。
- 前記嫌気培養を暗条件下で行う、請求項4〜6のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
- 前記有機酸がコハク酸及び/又は乳酸である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
- 前記培養物が培養液であり、前記培養液中から前記有機酸を採取する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
- 前記藍藻がシネコシスティス(Synechocystis)属の藍藻である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
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