BR102016012032B1 - Método para produzir um l-aminoácido - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO A presente invenção fornece um método para produzir um L-aminoácido tal como um L-aminoácido de cadeia ramificada por fermentação usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia, que está modificada para atenuar a expressão do gene gshA.
Description
[001] A presente invenção refere-se, de modo geral, à indústria microbiológica, e especificamente a um método para produzir L-aminoácidos por fermentação de uma bactéria da família Enterobacteriaceae que está modificada para atenuar a expressão do gene gshA, de maneira que a produção de L-aminoácidos seja aumentada.
[002] Convencionalmente, os L-aminoácidos são industrialmente produzidos por métodos de fermentação utilizando cepas de microrganismos obtidas de fontes naturais, ou seus mutantes. Tipicamente, os microrganismos são modificados para aumentar os rendimentos de produção de L- aminoácidos.
[003] Têm sido relatadas muitas técnicas para aumentar os rendimentos de produção de L-aminoácido, incluindo a transformação de microrganismos com DNA recombinante (consulte, por exemplo, Patente U.S. n° 4.278.765 A) e a alteração de regiões regulatórias de expressão como promotores, sequências líderes, e/ou atenuadores, ou outros conhecidos pela pessoa versada na técnica (consulte, por exemplo, US20060216796 A1 e WO9615246 A1). Outras técnicas para aumentar os rendimentos de produção incluem o aumento das atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácido e/ou a dessensibilização das enzimas-alvo à inibição de retroalimentação pelo L-aminoácido resultante (consulte, por exemplo, WO9516042 A1, EP0685555 A1 ou Patentes U.S. n°s 4.346.170 A, 5.661.012 A, e 6.040.160 A).
[004] Outro método para aumentar os rendimentos de produção de L-aminoácidos é atenuar a expressão de um gene ou de vários genes que está/estão envolvido(s) na degradação do L-aminoácido-alvo, de genes que desviam os precursores do L-aminoácido-alvo da rota de biossíntese de L- aminoácido, de genes envolvidos na redistribuição dos fluxos de carbono, de nitrogênio, e de fosfato, e de genes que codificam toxinas, etc.
[005] O gene gshA codifica Y-glutamato-cisteína-ligase que catalisa a primeira das duas etapas na rota para a biossíntese de glutationa a partir de L- glutamato. A enzima é inibida por retroalimentação pela glutationa (Apontoweil P. e Berends W., “Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K 12. Properties of the enzymes and regulation”, Biochim. Biophys. Acta, 1975, 399(1):1-9). Uma cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) tendo a atividade aumentada de serina-acetil-transferase (SAT) e os genes metC, tnaA, gshA e dfp deletados foi utilizada em um método para a produção de L- cisteína por fermentação da bactéria (CN101831397 A).
[006] Entretanto, não têm sido previamente relatados dados que descrevem o efeito de atenuação de expressão do gene gshA sobre a produção de L-aminoácidos por fermentação de uma bactéria produtora de L- aminoácido da família Enterobacteriaceae.
[007] Um aspecto da presente invenção é fornecer um método para produzir L-aminoácidos como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L- aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina usando um bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie Escherichia coli (E. coli), e que está modificada para atenuar a expressão do gene gshA.
[008] Este objetivo foi alcançado pela descoberta de que a atenuação de expressão do gene gshA no cromossomo de uma bactéria produtora de L- aminoácido pertencendo à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie E. coli, confere à bactéria uma produtividade mais alta de L-aminoácidos, mais especificamente, de L-aminoácidos ramificados e, em particular, mas não limitados à, L-valina. Além disso, pode ser aumentado o rendimento de produção de L-aminoácidos, como, por exemplo, de L-aminoácidos ramificados, incluindo L-valina, por fermentação da bactéria modificada da família Enterobacteriaceae. O gene gshA pode ser atenuado, por exemplo, pela inativação de expressão do gene gshA no cromossomo de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie E. coli. Estas descobertas têm resultado no seguinte aspecto não limitador da presente invenção.
[009] Um aspecto da presente invenção é fornecer um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura para produzir o L-aminoácido no meio de cultura, nas células bacterianas, ou em ambos; e (ii) coletar o L-aminoácido do meio de cultura, das células bacterianas, ou de ambos, em que a bactéria está modificada para atenuar a expressão de um gene gshA.
[0010] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.
[0011] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria é Escherichia coli.
[0012] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.
[0013] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria é Pantoea ananatis.
[0014] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a expressão do gene gshA está atenuada devido à inativação do gene gshA.
[0015] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o gene gshA está deletado.
[0016] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o gene gshA é selecionado do grupo que consiste em: (A) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; (B) um DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos variante da SEQ ID NO: 1 devido à degeneração do código genético; (C) um DNA tendo uma identidade menor que 60% com respeito à sequência de nucleotídeos inteira de SEQ ID NO: 1, e em que o dito DNA codifica uma proteína tendo uma atividade de Y-glutamato-cisteína- ligase; (D) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (E) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, mas que inclui uma ou mais mutações compreendendo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e em que a dita proteína tem a atividade de Y- glutamato-cisteína-ligase. (F) um DNA que codifica uma proteína tendo uma identidade não menor que 65% com respeito à sequência de aminoácidos inteira da SEQ ID NO: 2, e em que a dita proteína variante tem a atividade de Y-glutamato- cisteína-ligase.
[0017] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado do grupo consistindo em um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não aromático.
[0018] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido aromático é selecionado do grupo consistindo em L-fenilalanina, L-triptofano, e L-tirosina.
[0019] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido não aromático é selecionado do grupo consistindo em L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, L-treonina e L-valina.
[0020] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido é um L-aminoácido ramificado.
[0021] Ainda um outro aspecto da presente invenção é fornecer um método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido ramificado é selecionado do grupo consistindo em L-isoleucina, L-leucina e L-valina.
[0022] Ainda um outro aspecto da presente invenção é fornecer um método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido é L-valina.
[0023] A presente invenção é descrita em detalhes abaixo.
[0024] Qualquer bactéria produtora de L-aminoácido pertencendo à família Enterobacteriaceae e modificada para atenuar a expressar do gene gshA pode ser usada. A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” pode significar uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tem uma capacidade para produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura e/ou nas células bacterianas quando a bactéria é cultivada no meio.
[0025] A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” também pode significar uma bactéria que é capaz de produzir, excretar ou secretar e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura em uma quantidade maior que aquela de uma cepa parental ou de tipo selvagem, como E. coli K-12. A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” também pode significar uma bactéria que é capaz de causar acumulação em um meio de cultura de uma quantidade, por exemplo, não menor que 0,1 g/L, não menor que 0,5 g/L ou não menor que 1,0 g/L do L-aminoácido-alvo.
[0026] Além disso, a bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae e modificada para atenuar a expressão do gene gshA, que tem uma capacidade para produzir L-aminoácido, pode ser também usada. A bactéria pode inerentemente ter a capacidade para produzir L-aminoácido ou pode ser modificada para ter uma capacidade para produzir L-aminoácido pelo uso de um método de mutação ou de técnicas de recombinação de DNA. A bactéria pode ser obtida por atenuação da expressão do gene gshA em uma bactéria que inerentemente tem a capacidade para produzir um L-aminoácido, ou em uma bactéria que já tem sido conferida com a capacidade para produzir um L-aminoácido. Alternativamente, a bactéria pode ser obtida pela concessão da capacidade para produzir um L-aminoácido a uma bactéria já modificada para atenuar a expressão do gene gshA. Também, a bactéria pode ser uma bactéria que tem adquirido a capacidade para produzir um L- aminoácido pela atenuação da expressão do gene gshA.
[0027] A frase “capacidade de produzir L-aminoácido” pode significar a capacidade da bactéria para produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação do L-aminoácido em um meio de cultura e/ou nas células bacterianas em um tal nível que o L-aminoácido pode ser coletado do meio de cultura e/ou das células bacterianas, quando a bactéria é cultivada no meio.
[0028] A bactéria pode produzir quer um tipo de aminoácido apenas, quer uma mistura de dois ou mais aminoácidos. Especificamente, a bactéria pode produzir tanto um tipo de L-aminoácido exclusivamente ou uma mistura de dois ou mais tipos de L-aminoácidos.
[0029] A frase “aminoácido” pode significar um composto orgânico contendo pelo menos um grupo amino (NH2) e pelo menos um grupo carboxila (COOH). Um L-aminoácido é um exemplo não limitador de um aminoácido.
[0030] A frase “L-aminoácido” pode significar L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L- glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L- tirosina e L-valina.
[0031] A frase “L-aminoácido aromático” inclui, por exemplo, L- fenilalanina, L-triptofano, e L-tirosina. Devido ao fato de que a L-histidina tem uma porção aromática, especificamente, um anel imidazol, a frase “L- aminoácido aromático” pode também incluir, além dos L-aminoácido aromáticos anteriormente mencionados, L-histidina.
[0032] A frase “L-aminoácido não aromático” inclui, por exemplo, L- alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L- metionina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, L-treonina e L-valina. Devido ao fato de que a rota biossintética de L-histidina é diferente das rotas biossintéticas de aminoácidos aromáticos comuns como L-fenilalanina, L- triptofano, e L-tirosina, a frase “L-aminoácido não aromático” pode também incluir, além dos L-aminoácidos não aromáticos anteriormente mencionados, L-histidina.
[0033] Isto é, L-histidina pode ser incluída em qualquer um de, ou em ambos de, “L-aminoácido aromático” e “L-aminoácido não aromático”.
[0034] Um L-aminoácido pode pertencer a uma ou mais famílias de L-aminoácidos. Como um exemplo, a família de glutamato inclui L-arginina, ácido L-glutâmico, L-glutamina e L-prolina; a família de serina inclui L- cisteína, glicina, e L-serina; a família de aspartato inclui L-asparagina, ácido L-aspártico, L-isoleucina, L-lisina, L-metionina, e L-treonina; a família de piruvato inclui L-alanina, L-isoleucina, L-leucina e L-valina; e a família de aromáticos inclui L-fenilalanina, L-triptofano, e L-tirosina. Como um L- aminoácido pode ser um intermediário em uma rota biossintética de outro L- aminoácido, as famílias de aminoácidos anteriormente mencionadas podem também incluir outros L-aminoácidos, como, por exemplo, L-aminoácidos não proteinogênicos. Por exemplo, L-citrulina e L-ornitina são aminoácidos da rota biossintética de L-arginina. Portanto, a família de glutamato pode incluir L-citrulina e L-ornitina, e também L-arginina, ácido L-glutâmico, L- glutamina e L-prolina.
[0035] Um L-aminoácido pode também pertencer a um ou mais grupos de L-aminoácidos. Como um exemplo, L-isoleucina, L-leucina, e L- valina podem pertencer ao grupo de L-aminoácido de cadeia ramificada. Além disso, L-homoleucina e L-homoisoleucina podem também pertencer ao grupo de L-aminoácidos de cadeia ramificada.
[0036] L-Alanina, L-isoleucina, L-leucina, L-valina, L-homoleucina, e L-homoisoleucina são exemplos específicos de L-aminoácido. L-Alanina, L-isoleucina, L-leucina, e L-valina são exemplos específicos de L- aminoácido. L-isoleucina, L-leucina, e L-valina são exemplos mais específicos de L-aminoácido. L-Valina é um exemplo ainda mais específico de L-aminoácido.
[0037] A frase “L-aminoácido” pode referir-se não apenas a um aminoácido sob uma forma livre, mas também incluir um sal ou um hidrato do aminoácido, ou um aduto formado pelo aminoácido e outro composto orgânico ou inorgânico. Exemplos de sais de aminoácidos incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, carbonatos, sais de amônio, sais de sódio, sais de potássio e cloridratos. Exemplos específicos de sais de aminoácidos incluem, mas não se limitam a, sal de monocloridrato de L-lisina (L-lisina^HCl) e sal de monocloridrato de L-arginina (L-arginina^HCl). Exemplos de hidratos de aminoácidos incluem, por exemplo, mono-hidratos e di-hidratos. Um exemplo específico de um hidrato de um aminoácido inclui L-cisteína mono-hidrato (L-Cys^O).
[0038] As bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae podem ser dos gêneros Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Yersinia, etc., e podem ter a capacidade para produzir um L-aminoácido. Especificamente, podem ser utilizadas aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543). Exemplos de bactéria da família Enterobacteriaceae que podem ser modificadas incluem uma bactéria do gênero Escherichia, Enterobacter, ou Pantoea.
[0039] A bactéria Escherichia que podem ser modificadas para se obterem bactérias Escherichia de acordo com o assunto presentemente revelado não são particularmente limitadas, e especificamente, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. podem ser usadas (Bachmann, B.J., “Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12”, p. 2460-2488. Em F.C. Neidhardt et al. (ed.), “E. coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology”, 2a ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996). A espécie E. coli é um exemplo particular. Exemplos específicos de E. coli incluem E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076), etc., que são derivadas da cepa protótipo de tipo selvagem, cepa E. coli K-12. Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, junto à “American Type Culture Collection” (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são concedidos a cada uma das cepas, e as cepas podem ser requisitadas pelo uso destes números de registro (referir- se a www.atcc.org). Os números de registro das cepas estão listados no catálogo da “American Type Culture Collection”.
[0040] Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etc. Exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis (P. ananatis), etc. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, ou Pantoea stewartii com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. Uma bactéria pertencendo a qualquer dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada desde que ela seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de P. ananatis é gerada por técnicas de engenharia genética, a cepa P. ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), a cepa P. ananatis AJ13356 (FERM BP-6615), a cepa P. ananatis AJ13601 (FERM BP-7207), e seus derivados podem ser usadas (usados). Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, elas foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA etc. conforme descrito acima.
[0041] Daqui por diante, as bactérias produtoras de L-aminoácido serão especificamente exemplificadas. Qualquer uma das propriedades das bactérias produtoras de L-aminoácido e modificações para conceder ou aumentar a capacidade para produzir L-aminoácido, como aquelas exemplificadas abaixo, podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada.
[0042] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- arginina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S. n° 2002058315 A1) e suas cepas derivadas hospedando N-acetilglutamato- sintase mutante (Patente Russa n° 2215783 C2), cepa E. coli 382 (VKPM B- 7926, EP1170358 A1), que é uma cepa derivada de uma cepa 237 e tem uma abilidade de assimilação de ácido acético melhorada, cepa E. coli 382 ilvA+, que é obtida da cepa 382 pela introdução na mesma do alelo de tipo selvagem de gene ilvA da cepa E. coli K-12, e semelhantes. Exemplos de N- acetilglutamato-sintase mutante incluem, por exemplo, uma N- acetilglutamato-sintase mutante dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-arginina pela substituição dos resíduos de aminoácido correspondendo às posições 15 a 19 da enzima de tipo selvagem (EP1170361 A1).
[0043] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina está intensificada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam N-acetil-Y- glutamilfosfato-redutase (argC), ornitina-acetiltransferase (argJ), N- acetilglutamato-quinase (argB), N-acetilornitina-aminotransferase (argD), ornitina-carbamoiltransferase (argF), argininossuccinato-sintase (argG), argininossuccinato-liase (argH), e carbamoil-fosfato-sintetase (carAB), além do gene que codifica N-acetilglutamato-sintase (argA).
[0044] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina também incluem cepas tendo resistência aos análogos de aminoácido, etc. Exemplos de tais cepas incluem cepas mutantes de Escherichia coli tendo resistência à α-metilmetionina, à p-fluorofenilalanina, à D-arginina, ao hidroxamato de arginina, à S-(2-aminoetil)-cisteína, à α-metilserina, à β-2- tienilalanina, ou à sulfaguanidina (consultar o Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (Kokai) n° 56-106598).
[0045] Exemplos de bactérias produtoras de L-citrulina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- citrulina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas E. coli 237/pMADS11, 237/pMADS12, e 237/pMADS13 (RU2215783 C2, Patente Europeia n° 1170361 B1, Patente U.S. n° 6.790.647 B2), que hospedam N-acetil-glutamato-sintase mutante, cepas E. coli 333 (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086), ambas hospedando carbamoil-fosfato-sintetase mutante resistente às retroalimentação (Patente Russa n° 2264459 C2), cepas E. coli nas quais a atividade de α-cetoglutarato-sintase está aumentada, e atividades de ferredoxina-NADP+-redutase, piruvato-sintase, e/ou α-cetoglutarato- desidrogenase estão adicionalmente modificadas (EP2133417 A1), e cepa P. ananantis NA1sucAsdhA, na qual as atividades de succinato-desidrogenase e de α-cetoglutarato-desidrogenase estão decrescidas (Pedido de Patente U.S. n° 2009286290 A1), e semelhantes.
[0046] Como a L-citrulina é um intermediário da rota biossintética de L-arginina, exemplos de bactérias produtoras de L-citrulina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- citrulina, incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam aos, genes que codificam N- acetilglutamato-sintase (argA), N-acetilglutamato-quinase (argB), N- acetilglutamil-fosfato-redutase (argC), acetilornitina-transaminase (argD), acetilornitina-desacetilase (argE), ornitina-carbamoiltransferase (argF/I), e carbamoil-fosfato-sintetase (carAB), e suas combinações.
[0047] Uma bactéria produtora de L-citrulina pode ser também facilmente obtida de qualquer bactéria produtora de L-arginina, por exemplo cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), por inativação de argininossuccinato- sintase codificada pelo gene argG.
[0048] Exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- cisteína incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli JM15 transformadas com alelos cysE diferentes que codificam serina-acetiltransferases resistentes à retroalimentação (Patente U.S. n° 6.218.168 B1, Patente Russa n° 2279477 C2), E. coli W3110 tendo genes superexpressados que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para células (Patente U.S. n° 5.972.663 A), cepas E. coli tendo uma atividade de cisteína-dessulfo-hidrase diminuída (JP11155571 A2), E. coli W3110 tendo uma atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulon cisteína codificado pelo gene cysB (WO0127307 A1), e semelhantes. Exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- cisteína incluem também a cepa E. coli JM15(ydeD), que é derivada de E. coli JM15 (Patente U.S. n° 6.218.168 B1), e está transformada com DNA contendo o gene ydeD (Patente U.S. n° 5.972.663).
[0049] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433 A1). A E. coli VL334 (VKPM B-1641) é cepa auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina tendo mutações nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. n° 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago P1 crescido nas células da cepa de tipo selvagem E. coli K-12 (VKPM B-7). Como um resultado, foi obtida uma cepa VL334thrC+ (VKPM B-8961) auxotrófica para L-isoleucina, que é capaz de produzir ácido L-glutâmico.
[0050] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas não se limitam às cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam glutamato-desidrogenase (gdhA), glutamina-sintetase (glnA), glutamato-sintetase (gltBD), isocitrato-desidrogenase (icdA), aconitato- hidratase (acnA, acnB), citrato-sintase (gltA), piruvato-carboxilase (pyc), piruvato-desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato-quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato-sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato-quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (gapA), triose-fosfato-isomerase (tpiA), frutose-bisfosfato-aldolase (fbp), e glicose-fosfato-isomerase (pgi).
[0051] Exemplos de cepas modificadas de modo que a expressão do gene codificador de citrato-sintetase, do gene codificador de fosfoenolpiruvato-carboxilase, e/ou do gene codificador de glutamato- desidrogenase está/estão aumentada(s) incluem aquelas reveladas em EP1078989 A2, EP955368 A2, e EP952221 A2.
[0052] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas tendo uma atividade decrescida ou eliminada de uma enzima que catalisa a síntese de um composto diferente de ácido L-glutâmico pela ramificação de uma rota de biossíntese de ácido L- glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem isocitrato-liase (aceA), α- cetoglutarato-desidrogenase (sucA), acetolactato-sintase (ilvI), formiato- acetiltransferase (pfl), lactato-desidrogenase (ldh), glutamato-descarboxilase (gadAB), e succinato-desidrogenase (sdhABCD). São mostrados entre parênteses após os nomes das enzimas, exemplos dos genes que codificam as enzimas (o mesmo deve aplicar-se às mesmas ocorrências daqui por diante). As bactérias pertencendo ao gênero Escherichia deficientes na atividade de α- cetoglutarato- desidrogenase ou tendo uma atividade reduzida de α- cetoglutarato-desidrogenase e métodos para obtê-las são descritas (descritos) em Patentes U.S. n°s 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::KmR, E. coli AJ12624 (FERM BP-3853), E. coli AJ12628 (FERM BP-3854), E. coli AJ12949 (FERM BP-4881).
[0053] E. coli W3110sucA::KmR é uma cepa obtida pela disrupção do gene codificador de α-cetoglutarato-desidrogenase (daqui em diante chamado de “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em α-cetoglutarato-desidrogenase.
[0054] Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem as cepas que pertencem ao gênero Escherichia e têm resistência a um antimetabólito de ácido aspártico (ácido aspártico análogo). Estas cepas podem também ser deficientes na atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase e seus exemplos incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente U.S. n° 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que adicionalmente tem uma capacidade abaixada para decompor ácido L-glutâmico (Patente U.S. n° 5.393.671), E. coli AJ13138 (FERM BP- 5565) (Patente U.S. n° 6.110.714), e semelhantes.
[0055] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem bactérias Pantoea, como a cepa P. ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), a cepa P. ananatis SC17 (FERM BP- 11091), e a cepa P. ananatis SC17(0) (VKPM B-9246). A cepa AJ13355 é uma cepa isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão, como uma cepa que pode se proliferar em um meio de pH baixo contendo ácido L-glutâmico como uma fonte de carbono. A cepa SC17 é uma cepa selecionada como uma cepa mutante baixa produtora de muco proveniente da cepa AJ13355 (Patente U.S. n° 6.596.517). A cepa SC17 foi depositada na agência administrativa independente, “National Institute of Advanced Industrial Science and Technology”, “International Patent Organism Depository” (atualmente agência administrativa independente, “National Institute of Technology and Evaluation”, “International Patent Organism Depositary” (“NITE IPOD”), n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 4 de fevereiro de 2009, e designada com um número de acesso de FERM BP- 11091. A cepa AJ13355 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology”, “Ministry of International Trade and Industry” (atualmente, NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e designada com um número de acesso de FERM P16644. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e designado com um número de acesso de FERM BP-6614.
[0056] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientes na atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase ou têm uma atividade decrescida de α-cetoglutarato-desidrogenase, e podem ser obtidas conforme descrito acima. Tais cepas incluem P. ananatis AJ13356. (Patente U.S. n° 6.331.419 B1). P. ananatis AJ13356 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology”, “Ministry of International Trade and Industry” (atualmente “NITE IPOD”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu- shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 sob o número de acesso FERM P-16645. Foi então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. P. ananatis AJ13356 é deficiente em atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase como um resultado da disrupção do gene codificador da subunidade αKGDH-E1 (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como a Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA etc. Embora AJ13356 esteja depositada no depósito anteriormente mencionado como Enterobacter agglomerans, para as finalidades deste relatório descritivo, é descrita como P. ananatis.
[0057] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem as cepas pertencendo ao gênero Pantoea como a cepa P. ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, a cepa P. ananatis AJ13601, a cepa P. ananatis NP106, e a cepa P. ananatis NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida pela introdução do plasmídeo RSFCPG contendo o gene codificador de citrato-sintase (gltA), o gene codificador de fosfoenolpiruvato-carboxilase (ppc), e o gene codificador de glutamato-desidrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli, e do plasmídeo pSTVCB contendo o gene codificador de citrato-sintase (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum, para dentro da cepa SC17sucA. A cepa AJ13601 é uma cepa selecionada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma cepa resistente a uma concentração alta de ácido L-glutâmico em um pH baixo. A cepa NP106 foi obtida da cepa AJ13601 pela cura dos plasmídeos RSFCPG e pSTVCB. A cepa AJ13601 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology”, “Ministry of International Trade and Industry” (atualmente, “NITE IPOD”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 18 de agosto de 1999, e designada com um número de acesso de FERM P-17516. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e designado com um número de acesso de FERM BP-7207.
[0058] Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como a cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677 C1), a cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536 C1), E. coli NRRL B-12116 - B- 12121 (Patente U.S. n° 4.388.,405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H- 9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. n° 6.344.347 B1), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087 A2), E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. n° 6.258.554 B1), e semelhantes.
[0059] Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-histidina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil-AMP-ciclo-hidrolase (hisI), fosforribosil-AMP-ciclo-hidrolase/fosforribosil-ATP-pirofosfatase (hisIE), fosforribosilformimino-5-aminoimidazol-carboxamida-ribotídeo-isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol-fosfato-aminotransferase (hisC), histidinol-fosfatase (hisB), histidinol-desidrogenase (hisD), etc.
[0060] É sabido que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e por hisBHAFI são inibidas pela L-histidina, e portanto uma capacidade para produzir L-histidina pode também ser eficientemente aumentada pela introdução de uma mutação na ATP-fosforribosiltransferase que confere resistência à inibição de retroalimentação (Patentes Russas n°s 2003677 C1 e 2119536 C1).
[0061] Exemplos específicos de cepas tendo uma capacidade para produzir L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048, que estão transformadas com um vetor transportando um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E. coli transformadas com rht, um gene para uma proteína exportadora de aminoácido (EP1016710 A2), cepa E. coli 80, que possui resistência à sulfaguanidina, à DL-1,2,4-triazol-3-alanina, e à estreptomicina (VKPM B- 7270, RU2119536 C1), E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR (RU2119536 e Doroshenko V.G. et al., “The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants”, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (em russo), 2013, 49(2):149-154.), etc.
[0062] Exemplos de bactérias produtoras de L-isoleucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- isoleucina incluem, mas não se limitam às, cepas mutantes tendo resistência à 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), cepas mutantes tendo resistência a um análogo de isoleucina como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, e cepas mutantes adicionalmente tendo resistência à DL-etionina e/ou ao hidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, como treonina-desaminase e aceto-hidroxato-sintase, podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-isoleucina ou cepas parentais da mesma (JP 2-458 A, EP0356739 A1, e Patente U.S. n° 5.998.178).
[0063] Exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas de E. coli resistentes à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. n° 6.124.121)); cepas de E. coli resistentes aos análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5- trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WO96/06926; E. coli H- 9068 (JP 8-70879 A), e semelhantes.
[0064] Exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes do operon leuABCD, que pode ser representado por um gene leuA mutante que codifica α-isopropilmalato-sintase isenta de inibição de retroalimentação por L-leucina (Patente U.S. n° 6,403,342 B1). Além disso, exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana está aumentada. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (ygaZH) (EP1239041 A2).
[0065] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Escherichia e tendo resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, mas esta inibição é parcial ou completamente dessensibilizada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos do análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-AminoEtil)-L-Cisteína (AEC), Y-metil-lisina, α-clorocaprolactama, etc. Cepas mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo as bactérias pertencendo ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; consulte a Patente U.S. n° 4.346.170) e E. coli VL611. Nestas cepas, a inibição de retroalimentação de aspartoquinase por L-lisina está dessensibilizada.
[0066] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-lisina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam aos, genes que codificam di- hidrodipicolinato-sintase (dapA), aspartoquinase III (lysC), di- hidrodipicolinato-redutase (dapB), diaminopimelato-descarboxilase (lysA), diaminopimelato-desidrogenase (ddh) (Patente U.S. n° 6.040.160), fosfoenolpiruvato-carboxilase (ppc), aspartato-semialdeído-desidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (EP1253195 A1). Além disso, as bactérias produtoras de L-lisina ou cepas parentais da mesma podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP1170376 A1), o gene que codifica nicotinamida-nucleotídeo-trans- hidrogenase (pntAB) (Patente U.S. n° 5.830.716 A), o gene ybjE (WO2005/073390), ou suas combinações. Visto que aspartoquinase III é propensa à inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase III dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-lisina (Patente U.S. n° 5.932.453) pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima. Ademais, visto que a di-hidrodipicolinato- sintase é propensa à inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene dapA mutante que codifica uma di-hidrodipicolinato-sintase dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-lisina pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima.
[0067] As bactérias produtoras de L-lisina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-lisina podem ter uma atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que catalisa uma reação que causa uma ramificação da rota de biossíntese de L-lisina e resulta na produção de outro composto. Também, bactérias produtoras de L- lisina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina podem ter uma atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que negativamente atua sobre a síntese ou a acumulação de L-lisina. Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homosserina-desidrogenase, lisina-descarboxilase (cadA, ldcC), enzima málica, etc., e cepas nas quais as atividades destas enzimas estão decrescidas ou deletadas são reveladas em WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175, etc.
[0068] A expressão de ambos os genes cadA e ldcC que codificam lisina-descarboxilase pode ser decrescida com a finalidade de decrescer ou deletar a atividade de lisina-descarboxilase. A expressão de ambos os genes pode ser decrescida, por exemplo, pelo método descrito em WO2006/078039.
[0069] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem a cepa E. coli WC196 (Patente U.S. n° 5.827.698), a cepa E. coli WC196ΔcadAΔldc, e a cepa E. coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO2006/078039).
[0070] A cepa WC196 foi gerada a partir da cepa W3110, que foi derivada da E. coli K-12, pela concessão à cepa W3110 de resistência à AEC (S-(2-AminoEtil)-L-Cistema) (Patente U.S. n° 5.827.698). A cepa WC196 foi chamada de E. coli AJ13069, depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente “NITE IPOD”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 6 de dezembro de 1994 D, e designada com um número de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e designada com um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. n° 5.827.698).
[0071] A cepa WC196ΔcadAΔldc foi construída a partir da cepa WC196 por disrupção dos genes cadA e ldcC que codificam lisina- descarboxilase. A cepa WC196ΔcadAΔldcC foi designada AJ110692 e depositada na agência administrativa independente, “National Institute Advanced Industrial Science and Technology”, “International Patent Organism Depositary” (atualmente “NITE IPOD”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional sob o número de acesso FERM BP- 11027.
[0072] A cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 foi construída pela introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes para a biossíntese de lisina na cepa WC196ΔcadAΔldcC (Patente U.S. n° 6.040.160). O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e que codifica uma di-hidrodipicolinato-sintase (DDPS) tendo uma mutação para dessensibilização de inibição de retroalimentação por L-lisina, (H118Y), um gene mutante lysC derivado de Escherichia coli e que codifica aspartoquinase III tendo uma mutação para dessensibilização à inibição de retroalimentação por L-lisina, (T352I), o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica di-hidrodipicolinato-redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica diaminopimelato-desidrogenase.
[0073] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). A cepa AJIK01 foi designada E. coli AJ111046, e depositada em “NITE IPOD” (n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 29 de janeiro de 2013. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 15 de maio de 2014, e designada com um número de acesso de NITE BP-01520.
[0074] Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- metionina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas de E. coli AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) (Patent GB2075055); e cepas de E. coli 218 (VKPM B-8125) (RU2209248 C2) e 73 (VKPM B-8126) (RU2215782 C2) resistentes à norleucina, ao análogo de L-metionina, ou semelhantes. A cepa E. coli 73 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; FGUP GosNII Genetika, (“Federação Russa”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 14 de maio de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8126. Então ela e foi convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de 2002. Ademais, uma cepa deficiente em repressor metionina e cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-metionina como homosserina-transsuccinilase e cistationina-Y-sintase (JP 2000-139471 A) podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-metionina ou cepas parentais da mesma.
[0075] Como L-ornitina é um intermediário da rota biossintética de L- arginina, exemplos de bactérias produtoras de L-ornitina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-ornitina, incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina, como aquelas descritas acima, está aumentada.
[0076] Uma bactéria produtora de L-ornitina pode ser facilmente obtida a partir de qualquer bactéria produtora de L-arginina, por exemplo cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), pela inativação de ornitina-carbamoiltransferase codificada por ambos os genes argF e argI. Métodos para inativação de ornitina-carbamoiltransferase são descritos neste documento.
[0077] Exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- fenilalanina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) hospedando o gene pheA34 mutante (Patente U.S. n° 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B- 12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (Patente U.S. n° 4.407.952), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR- aroG4, pACMAB] nomeada como AJ12604 (FERM BP-3579) (EP488424 B1). Ademais, bactérias produtoras de L-fenilalanina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenilalanina também incluem as cepas pertencendo ao gênero Escherichia e tendo uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (Pedidos de Patentes U.S. n°s 7.259.003 e 7.666.655).
[0078] Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012), que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP1172433 A1). Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina está aumentada. Exemplos de tais genes que podem ser usados em bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB que codifica glutamato-quinase com inibição de retroalimentação dessensibilizada por L-prolina (DE3127361 A1). Além disso, exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas responsáveis pela excreção de L-aminoácido da célula bacteriana está aumentada. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).
[0079] Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia que têm uma capacidade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB n° 2075056), VKPM B- 8012 (Patente Russa n° 2207371 C2), mutantes de plasmídeo descritos em DE3127361 A1, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F.R. et al. em “The 15th Miami Winter Symposium”, 1983, p.34, e semelhantes.
[0080] Exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- treonina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patentes U.S. n°s 5.175.107 e 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U.S. n° 5.631.157), E. coli NRRL B-21593 (Patente U.S. n° 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. n° 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. n° 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner M. et al., Genetika (em russo), 1978, 14:947-956), E. coli VL643 e VL2055 (EP1149911 A2), E. coli VKPM B-5318 (EP0593792 A1), e semelhantes.
[0081] A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, sendo também assimilativa de sacarose, e o seu gene ilvA tem uma mutação hipomórfica. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, cuja mutação concede resistência às concentrações altas de treonina ou de homosserina. A cepa VKPM B-3996, que contém o plasmídeo pVIC40, foi obtida pela introdução do plasmídeo pVIC40 na cepa TDH-6. O plasmídeo pVIC40 foi obtido pela inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA mutante codifica aspartoquinase- homosserina-desidrogenase I que está substancialmente dessensibilizada para inibição de retroalimentação por treonina. A cepa VKPM B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no “All-Union Scientific Center of Antibiotics” (“Federação Russa”, 117105 Moscou, Rua Nagatinskaya 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa VKPM B-3996 foi também depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM ; “FGUP GosNII Genetika”, “Federação Russa”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso VKPM B- 3996.
[0082] A cepa B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina; e hospeda o plasmídeo pPRT614, que corresponde ao plasmídeo pVIC40 do qual a região regulatória de operon de treonina é substituída com um repressor C1 de fago-lambda sensível à temperatura e o promotor PR. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) em 3 de maio de 1990 sob o número de acesso VKPM B-5318.
[0083] As bactérias produtoras de L-treonina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-treonina podem ser modificadas para aumentar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartoquinase- homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homosserina-quinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína de transmembrana putativa do sistema de efluxo de treonina e de homosserina; - o gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido- desidrogenase; e - o gene aspC que codifica aspartato-aminotransferase (aspartato-transaminase).
[0084] O gene thrA que codifica aspartoquinase I e homosserina- desidrogenase I de E. coli foi elucidado (“KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”, entrada n° b0002; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 337 a 2.799; Gene ID: 945803). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12.
[0085] O gene thrB que codifica homosserina-quinase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0003; GenBank, número de acesso NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 2.801 a 3.733; Gene ID: 947498). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12.
[0086] O gene thrC que codifica treonina-sintase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0004; GenBank, número de acesso NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 3.734 a 5.020; Gene ID: 945198). O gene thrC está localizado entre os genes thrB e yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon treonina thrABC. Para aumentar a expressão do operon treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (WO2005049808 A1, WO2003097839 A1).
[0087] O gene thrA mutante que codifica aspartoquinase I e homosserina-desidrogenase I resistentes à inibição de retroalimentação por L- treonina, e também, os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon a partir de plasmídeo pVIC40 bem conhecido que está presente na cepa de E. coli VKPM B-3996 produtora de L-treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente U.S. n° 5.705.371.
[0088] O gene rhtA que codifica uma proteína do sistema de efluxo de treonina e de homosserina (uma proteína transportadora da membrana interna) de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0813; GenBank, número de acesso NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 848.433 a 849.320, complemento; Gene ID: 947045). O gene rhtA está localizado entre os genes dps e ompX no cromossomo de E. coli K-12 próximos ao operon glnHPQ, que codificam componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao gene ybiF (KEGG, entrada n° b0813).
[0089] O gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido- desidrogenase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b3433; GenBank, número de acesso NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 3.571.798 a 3.572.901, complemento; Gene ID: 947939). O gene asd está localizado entre os genes glgB e gntU na mesma fita (o gene yhgN na fita oposta) no cromossomo de E. coli K-12.
[0090] Também, o gene aspC que codifica aspartato-aminotransferase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0928; GenBank, número de acesso NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 983.742 a 984.932, complemento; Gene ID: 945553). O gene aspC está localizado entre o gene ycbL na fita oposta e o gene ompF na mesma fita no cromossomo de E. coli K-12.
[0091] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- triptofano incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) que tem um gene trpS mutante codificando um triptofanoil- tRNA-sintetase parcialmente inativado (Patente U.S. n° 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) tendo um alelo serA que codifica fosfoglicerato-desidrogenase isenta de inibição de retroalimentação por serina e um alelo trpE que codifica antranilato-sintase isenta de inibição de retroalimentação por triptofano (Patente U.S. n° 6.180.373 B1), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanoase (Patente U.S. n° 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps tendo uma capacidade aumentada para produzir fosfoenolpiruvato (WO97/08333, Patente U.S. n° 6,319,696 B1), e semelhantes. Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem as cepas pertencendo ao gênero Escherichia e tendo uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (Pedidos de Patentes U.S. n°s 2003148473 A1 e 2003157667 A1).
[0092] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- triptofano também incluem as cepas nas quais uma ou mais atividades das enzimas selecionadas dentre antranilato-sintase, fosfoglicerato-desidrogenase, e triptofano sintase estão aumentadas. As antranilato-sintase e fosfoglicerato- desidrogenase são ambas propensas à inibição de retroalimentação por L- triptofano e L-serina, e consequentemente, uma mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo uma tal mutação incluem E. coli SV164, que hospeda antranilato-sintase dessensibilizada, e uma cepa transformante obtida pela introdução na E. coli SV164 (WO94/08031 A1) do plasmídeo pGH5, que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato-desidrogenase dessensibilizada para retroalimentação.
[0093] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- triptofano também incluem cepas nas quais está introduzido o operon triptofano que contém um gene que codifica antranilato-sintase dessensibilizada (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, Patente U.S. n° 4.371.614). Além disso, a capacidade para produzir L-triptofano pode ser concedida pelo aumento da expressão de um gene que codifica triptofano- sintase, dentre os operons triptofano (trpBA). A triptofano-sintase consiste em subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade para produzir L-triptofano pode ser aprimorada pelo aumento da expressão do operon isocitrato-liase-malato- sintase (WO2005/103275).
[0094] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina incluem, mas não se limitam às, cepas que estão modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. n° 5.998.178). É desejável remover a região do operon ilvGMEDA que é necessária para atenuação de modo que a expressão do operon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Ademais, o gene ilvA no operon é desejavelmente disrupcionado de maneira que a atividade de treonina-desaminase seja decrescida.
[0095] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem cepas mutantes tendo uma mutação em aminoacil-tRNA-sintetase (Patente U.S. n° 5.658.766). Exemplos de tais cepas incluem E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina-tRNA-sintetase. E. coli VL1970 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; FGUP GosNII Genetika, “Federação Russa”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411.
[0096] Ademais, cepas mutantes que necessitam de ácido lipoico para crescerem e/ou estão isentas de H+-ATPase podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-valina ou cepas parentais da mesma. (WO96/06926 A1).
[0097] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem as cepas E. coli H81 (VKPM B-8066; consulte, por exemplo, EP1942183 B1), E. coli NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente U.S. n° 4.391.907), E. coli VKPM B-4411 (Patente U.S. n° 5,658,766), E. coli VKPM B-7707 (EP1016710 A2), ou semelhantes.
[0098] A bactéria da presente invenção pertencendo à família Enterobacteriaceae está modificada para atenuar a expressão do gene gshA.
[0099] A frase “gene gshA” pode significar um gene que codifica uma enzima tendo uma atividade de Y-glutamato-cisteína-ligase. Um exemplo específico do gene que codifica a enzima tendo atividade de Y-glutamato- cisteína-ligase inclui o gene gshA que codifica Y-glutamato-cisteína-ligase. Isto é, o gene que codifica a enzima tendo a atividade de Y-glutamato-cisteína- ligase pode ser o gene gshA. A descrição mais específica do gene gshA gene é fornecida em seguida.
[00100] O gene gshA (sinônimo: gsh-I) codifica Y-glutamato-cisteína- ligase GshA (sinônimo: Y-glutamilcisteína-sintetase, YGCS) (KEGG, “Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”, n° de entrada b2688; “Protein Knowledgebase”, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P0A6W9). O gene gshA (GenBank, número de acesso NC_000913.3; posições de nucleotídeo: 2814883 a 2816439, complemento; Gene ID: 944881) está localizado entre o gene yqaA na mesma fita e no gene micA na fita oposta no cromossomo de cepa E. coli K-12. São conhecidas a sequência de nucleotídeos do gene gshA (SEQ ID NO: 1) de cepa E. coli K-12 e a sequência de aminoácidos da proteína YGCS (SEQ ID NO: 2) codificada pelo gene gshA de cepa E. coli K- 12. Isto é, o gene gshA pode ter a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, e a proteína YGCS codificada pelo gene gshA pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. A frase “um gene ou uma proteína tem uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de aminoácidos” inclui os casos nos quais um gene ou uma proteína compreende a sequência de nucleotídeos ou a sequência de aminoácidos, e os casos nos quais um gene ou uma proteína consiste na sequência de nucleotídeos ou na sequência de aminoácidos.
[00101] A frase “uma bactéria está modificada para atenuar a expressão do gene gshA” pode significar que a bactéria está modificada em uma tal maneira que na bactéria modificada a expressão do gene gshA está atenuada. A frase “uma bactéria está modificada para atenuar a expressão do gene gshA” pode especificamente significar que a bactéria está modificada em uma tal maneira que na bactéria modificada a expressão do gene gshA está atenuada em comparação com uma bactéria não modificada. Por exemplo, a expressão do gene gshA pode ser atenuada devido à inativação do gene gshA.
[00102] A frase “o gene gshA está inativado” pode significar que o gene modificado codifica uma proteína completamente inativa ou não funcional, isto é, Y-glutamato-cisteína-ligase completamente inativa ou não funcional. Também é aceitável que a região de DNA modificada seja incapaz de naturalmente expressar o gene devido à deleção de uma parte do gene ou à deleção do gene inteiro, à substituição de uma ou mais bases para causar uma substituição de aminoácido na proteína codificada pelo gene (mutação de sentido trocado ou incorreto), introdução de um códon de terminação (mutação sem sentido), deleção de uma ou duas bases para causar um deslocamento da matriz de leitura do gene, inserção de um gene para resistência a fármaco e/ou de sinal de terminação de transcrição, ou modificação de uma região adjacente do gene, incluindo sequencias que controlam a expressão de gene expressão como promotor(es), intensificador(es), atenuador(es), sítio(s) de ligação ao ribossomo, etc. Inativação do gene pode também ser realizada, por exemplo, por métodos convencionais como tratamento de mutagênese usando irradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese sítio- direcionada, disrupção de gene usando recombinação homóloga, e/ou mutagênese por inserção-deleção (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128) com base em “integração conduzida por Red/ET (“Red/ET- driven integration”) ou integração mediada por XRed/ET (“XRed/ET-mediated integration”).
[00103] A frase “a expressão do gene gshA está atenuada” também pode significar que a bactéria modificada contém uma região funcionalmente ligada ao gene gshA, incluindo sequências que controlam a expressão de gene como promotores, intensificadores, atenuadores e sinais de terminação de transcrição, sítios de ligação ao ribossomo, e outros elementos de controle de expressão, que está modificada resultando no decréscimo do nível de expressão do gene gshA; e outros exemplos (consulte, por exemplo, WO95/34672; Carrier T.A. e Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64). A frase “funcionalmente ligada ao gene” pode significar que a região regulatória está ligada (as regiões regulatórias estão ligadas) à sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico ou do gene em uma tal maneira que permite a expressão (por exemplo, expressão intensificada, aumentada, constitutiva, basal, antiterminada, atenuada, desregulada, decrescida, ou reprimida) da sequência de nucleotídeos, especificamente, a expressão de um produto de gene codificado pela sequência de nucleotídeos.
[00104] A frase “a expressão do gene gshA está atenuada” pode também significar que a quantidade do produto de expressão do gene gshA, tal como a quantidade de mRNA do gene ou a quantidade da proteína YGCS codificada pelo gene, na bactéria modificada, na qual a expressão do gene gshA está atenuada, é reduzida para, por exemplo 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela em uma bactéria não modificada.
[00105] A frase “uma bactéria está modificada para atenuar a expressão do gene gshA” pode também significar que a bactéria está modificada em uma tal maneira que na bactéria modificada a atividade enzimática total do produto do gshA tal como a proteína YGCS está decrescida em comparação com uma bactéria não modificada. A bactéria pode ser modificada de modo que a atividade da proteína YGCS por célula é decrescida para, por exemplo 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela em uma bactéria não modificada.
[00106] Exemplos de uma bactéria não modificada que serve como uma referência para as comparações acima podem incluir as cepas de tipo selvagem de uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia, tal como a cepa E. coli MG1655 (ATCC 47076) e a cepa E. coli W3110 (ATCC 27325), ou uma bactéria pertencendo ao gênero Pantoea, tal como a cepa P. ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), etc. Exemplos de uma bactéria não modificada que serve como uma referência para as comparações acima pode também incluir uma cepa parental que não está modificada para atenuar a expressão do gene gshA ou uma bactéria na qual a expressão do gene gshA está não atenuada.
[00107] A frase “atividade de y-glutamato-cisteína-ligase” pode significar a atividade enzimática de catalisar a seguinte reação (número EC: 6.3.2.2): L-cisteína + L-glutamato + ATP θ Y-L-glutamil-L-cisteína + ADP + fosfato + H+, onde ATP pode significar trifosfato de adenosina e ADP pode significar difosfato de adenosina.
[00108] A atividade enzimática de y-glutamato-cisteína-ligase pode ser determinada pela avaliação da formação de difosfato de adenosina (ADP) usando um ensaio acoplado de piruvato-quinase/lactato-desidrogenase (Seelig G.F. e Meister A., “Glutathione biosynthesis; gamma-glutamylcysteine synthetase from rat kidney”, Methods Enzymol., 1985; 113:379-390) ou a formação de dipeptídeo usando um L-α-[14C]aminobutirato (Griffith O.W. e Meister A., “Selective inhibition of gamma-glutamyl-cycle enzymes by substrate analogs”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74(8):3330-3334). A medição direta de Y-glutamilcisteína por cromatografia líquida de alta eficiência e detecção eletroquímica também pode ser usada (Gegg M.E. et al., “Determination of glutamate-cysteine ligase (gamma-glutamylcysteine synthetase) activity by high-performance liquid chromatography and electrochemical detection”, Anal. Biochem., 2002, 304(1):26-32). A concentração de proteína pode ser determinada pelo ensaio de proteína de Bradford usando albumina de soro bovino como um padrão (Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254).
[00109] A expressão de um gene gshA pode ser atenuada pela substituição de uma sequência de controle de expressão do gene, tal como um promotor no DNA cromossômico, por uma mais fraca. A força de um promotor é definida pela frequência de atuações de iniciação de síntese de RNA. Exemplos de métodos para avaliar a força de promotores e de promotores fortes estão descritos em Goldstein M.A. et al. (Goldstein M.A. e Doi R.H., “Prokaryotic promoters in biotechnology”, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128), etc. Ademais, também é possível introduzir uma ou mais substituições de nucleotídeos em uma região de promotor do gene e assim modificar o promotor para um enfraquecido conforme revelado em WO0018935 A1. Ademais, é sabido que a substituição de vários nucleotídeos na sequência de Shine-Dalgarno (SD), e/ou na sequência espaçadora entre a sequência de SD e o códon de iniciação, e/ou uma sequência imediatamente a montante e/ou a jusante do códon de iniciação no sítio de ligação ao ribossomo (RBS, “ribosome-binding site”) afeta enormemente a eficiência de tradução de mRNA. Esta modificação de tal região pode ser combinada com decréscimo da transcrição de um gene gshA.
[00110] A expressão de um gene gshA pode também ser atenuada pela inserção de um transposon ou de uma sequência de inserção (IS, “insertion sequence”) na região codificadora do gene (Patente U.S. n° 5.175.107) ou na região controladora de expressão de gene, ou por métodos convencionais como mutagênese com irradiação ultravioleta (UV) ou nitrosoguanidina (N- metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, NTG). Ademais, a incorporação de uma mutação sítio-específica pode ser conduzida por métodos de edição cromossômica com base, por exemplo, em recombinação mediada por XRed/ET (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645).
[00111] O número de cópias, a presença ou ausência do gene gshA podem ser medidos, por exemplo, por restrição do DNA cromossômico seguida por transferência de Southern (“Southern blotting”) usando uma sonda com base na sequência de gene, hibridização fluorescente in situ (FISH, “fluorescence in situ hybridization”), e semelhantes. O nível de expressão de gene pode ser determinado pela medição da quantidade de mRNA transcrito a partir do gene usando vários métodos bem conhecidos, incluindo transferência de Northern (“Northern blotting”), RT-PCR quantitativa, e semelhantes. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguida por ensaio de imunotransferência (“immunoblotting assay”) (análise por transferência de Western, “Western blotting analysis”), ou análise por espectrometria de massa das amostras de proteínas, e semelhantes.
[00112] Métodos para manipulação com moléculas recombinantes de DNA e clonagem molecular como a preparação de DNA plasmídeo, as digestão, ligação e transformação de DNA, a seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador, a incorporação de mutações, e semelhantes podem ser métodos comuns bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ou Green M.R. e Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak e Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009).
[00113] Pode haver algumas diferenças em sequências de DNA entre os gêneros, as espécies, ou as cepas da família Enterobacteriaceae. Portanto, o gene gshA não é limitado ao gene mostrado em SEQ ID NO: 1, mas pode incluir genes que são sequências de nucleotídeos variantes de SEQ ID NO: 1, e que codificam a proteína YGCS. Isto é, a frase “o gene gshA” não é limitada ao gene gshA mostrado em SEQ ID NO: 1, mas pode corretivamente se referir ao gene gshA mostrado em SEQ ID NO: 1 e suas sequências de nucleotídeos variantes.
[00114] Similarmente, a frase “a yGCS” ou “a proteína yGCS” não é limitada à proteína yGCS mostrada em SEQ ID NO: 2, mas pode corretivamente se referir à proteína yGCS mostrada em SEQ ID NO: 2 e suas proteínas variantes.
[00115] A frase “uma proteína variante” pode significar uma proteína que tem uma ou mais mutações na sequência em comparação com a SEQ ID NO: 2, quer elas são substituições, deleções, inserções, e/ou adições de um ou vários resíduos de aminoácido, mas que ainda mantém uma atividade ou função similar àquela da proteína yGCS, tal como a atividade de y-glutamato- cisteína-ligase conforme descrito acima, ou em que a estrutura tridimensional não está significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem. O número de alterações na proteína variante depende da posição de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de resíduos de aminoácido. Ele pode ser também, mas não estritamente limitado a, 1 a 100, em outro exemplo 1 a 50, em outro exemplo 1 a 30, em outro exemplo 1 a 15, em outro exemplo 1 a 10, e em outro exemplo 1 a 5, na SEQ ID NO: 2. Isto é porque alguns aminoácidos têm homologia alta uns com os outros de modo que a atividade ou função da proteína não é afetada por uma alteração entre tais aminoácidos, ou a estrutura tridimensional de proteína não é significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem. Portanto, as proteínas variantes codificadas pelo gene gshA podem ter uma homologia, definida como o parâmetro “identidade” quando se usa o programa de computador BLAST, não menor que 65%, não menor que 70%, não menor que 75%, não menor que 80%, não menor que 85%, não menor que 90%, não menor que 95%, não menor que 98%, ou não menor que 99% com respeito à sequência de aminoácidos inteira mostrada em SEQ ID NO: 2, desde que a atividade ou função da proteína YGCS seja mantida, ou a estrutura tridimensional da proteína YGCS não seja significativamente alterada em relação à proteína YGCS.
[00116] As substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificadoras de um ou vários resíduos de aminoácido pode ser uma mutação conservativa (mutações conservativas). A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. A substituição conservativa pode ser, mas não se limita a, uma substituição, em que a substituição ocorre mutuamente dentre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; dentre Ala, Leu, Ile e Val, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; dentre Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, His e Thr, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofílico; dentre Gln e Asn, se o sítio de substituição for um aminoácido polar; dentre Lys, Arg e His, se o sítio de substituição for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o sítio de substituição for um aminoácido acídico; e dentre Ser e Thr, se o sítio de substituição for um aminoácido tendo grupo hidroxila. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Val.
[00117] As substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificadoras de um ou vários resíduos de aminoácido pode também ser uma substituição não conservativa (substituições não conservativa) desde que a(s) mutação (mutações) seja(m) compensada(s) por uma ou mais mutações secundárias na posição diferente (nas posições diferentes) de sequência de aminoácidos de maneira que a atividade ou função similar àquela da proteína YGCS, de modo que a atividade de Y-glutamato-cisteína-ligase conforme descrito acima seja mantida, ou a estrutura tridimensional de YGCS não seja significativamente alterada em relação à proteína YGCS de tipo selvagem.
[00118] Para avaliar o grau de homologia de proteína ou de DNA, vários métodos de cálculo podem ser usados, como pesquisa em BLAST, pesquisa em FASTA e método ClustalW. A pesquisa em BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) é o algoritmo de pesquisa heurístico utilizado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx; estes programas atribuem significância às suas descobertas usando o método estatístico de Karlin S. e Altschul S.F. (“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; Karlin S. e Altschul S.F., “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877). O programa de computador BLAST calcula três parâmetros: escore, identidade e similaridade. O método de pesquisa em FASTA é descrito por Pearson W.R. (“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98). O método ClustalW é descrito por Thompson J.D. et al. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680).
[00119] Exemplos de proteínas variantes da proteína YGCS mostrada na SEQ ID NO: 2 inclui proteínas homólogas de YGCS (YGCS homólogas) a partir da bactéria diferente da família Enterobacteriaceae. Isto é, yGCS homólogas de bactérias diferentes da família Enterobacteriaceae, que têm a atividade de y-glutamato-cisteína-ligase conforme descrito acima. Exemplos de tais yGCS homólogas das bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae são descritos a seguir neste documento (Tabela 1) com indicação de um valor de homologia (como “identidade”, que é a identidade de aminoácidos), dados de taxonomia, e números de registro de sequência e de acesso de sequências de aminoácidos na base de dados do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/). Tabela 1.
* - na base de dados do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”, www.ncbi.nlm.nih.gov/)
[00120] O gene gshA pode ser qualquer gene que codifica a proteína YGCS. Por exemplo, o gene gshA pode ser uma sequência de nucleotídeos variante. A frase “uma sequência de nucleotídeos variante” pode significar uma sequência de nucleotídeos que codifica “uma proteína variante” conforme descrita acima, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer tipo selvagem de proteína yGCS de modo que a proteína yGCS mostrada em SEQ ID NO: 2 usando quaisquer códons de aminoácido sinônimos de acordo com o código genético padrão (consulte, por exemplo, Lewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458). Portanto, o gene gshA pode ser uma sequência de nucleotídeos variante devido à degeneração do código genético, de modo que a sequência de nucleotídeo variante de SEQ ID NO: 1 se deva à degeneração do código genético.
[00121] A frase “uma sequência de nucleotídeos variante” também pode significar, mas não se limita a, uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes com a sequência de nucleotídeos complementar à sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes desde que ela codifique uma proteína funcional. “Condições estringentes” incluem aquelas sob as quais é formado um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia, definida como o parâmetro “identidade” quando se usa o programa de computador BLAST, de não menor que 60%, não menor que 65%, não menor que 70%, não menor que 75%, não menor que 80%, não menor que 85%, não menor que 90%, não menor que 95%, não menor que 96%, não menor que 97%, não menor que 98%, ou não menor que 99%, e não é formado um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia menor que a acima. Por exemplo, as condições estringentes podem ser exemplificadas por lavagem uma ou mais vezes, ou em outro exemplo, duas ou três vezes, em uma concentração salina de SSCxl (citrato de sódio padrão ou cloreto de sódio padrão), SDS (“sodium dodecyl sulphate”, dodecilsulfato de sódio) 0,1%, ou em outro exemplo, SSCx0,1, SDS 0,1% a 60°C ou 65°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para transferência (“blotting”) e, por via de regra, pode ser aquela que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de náilon positivamente carregada Amersham HybondTM-N+ (GE Healthcare) sob condições estringentes é 15 minutes. A etapa de lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Como a sonda, uma parte da sequência complementar à sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 pode também ser usada. Uma tal sonda pode ser produzida por PCR usando oligonucleotídeos como iniciadores preparados com base na sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 e um fragmento de DNA contendo a sequência de nucleotídeos como um molde. É recomendado que o comprimento da sonda seja >50 pb; ele pode ser adequadamente selecionado dependendo das condições de hibridização, e é habitualmente 100 pb a 1 kpb. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem após a hibridização podem ser exemplificadas por SSCx2, SDS 0,1% a 50°C, 60°C ou 65°C.
[00122] Visto que o gene que codifica a proteína YGCS da espécie E. coli já foi elucidado (veja acima), as sequências de nucleotídeos variantes que codificam a proteína yGCS podem ser obtidas por PCR (“Polymerase Chain Reaction”, reação em cadeia da polimerase; consultar White T.J. et al., “The polymerase chain reaction”, Trends Genet., 1989, 5:185-189) utilizando iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene gshA; ou o método de mutagênese sítio-direcionada pelo tratamento de um DNA contendo o gene gshA de tipo selvagem in vitro, por exemplo, com hidroxilamina, ou um método para tratamento de um microrganismo, por exemplo, uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae hospedando o gene gshA de tipo selvagem com irradiação ultravioleta (UV) ou um agente mutagênico como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso habitualmente utilizados para o tal tratamento; ou quimicamente sintetizada como estrutura de gene de comprimento total. Isto é, os genes que codificam a proteína YGCS de outras bactérias da família Enterobacteriaceae podem ser assim obtidos.
[00123] A frase “uma proteína de tipo selvagem” pode significar uma proteína nativa produzida na natureza por uma cepa bacteriana de tipo selvagem ou parental da família Enterobacteriaceae, por exemplo, pela cepa de tipo selvagem E. coli MG1655. Uma proteína de tipo selvagem pode ser codificada pelo “gene de tipo selvagem”, que pode estar presente no genoma de uma bactéria de tipo selvagem.
[00124] As descrições acima com respeito às variantes dos genes e das proteínas pode também ser aplicada, com as mudanças que se fazem necessárias, às proteínas arbitrárias como enzimas da biossíntese de L- aminoácido e genes que as codificam.
[00125] A bactéria pode ter, além das propriedades já mencionadas, outras propriedades como requisitos de vários nutrientes, resistência a fármaco, sensibilidade a fármaco, dependência de fármaco, sem se desviar do escopo da presente invenção.
[00126] Um método da presente invenção inclui o método para produzir um L-aminoácido como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina, ou um seu sal, ou uma sua mistura. Especificamente, um método da presente invenção inclui o método para produzir L-aminoácidos de cadeia ramificada, tais como L-isoleucina, L-leucina, L-histidina, e L-valina, ou uma sua mistura. Mais especificamente, um método da presente invenção inclui o método para produzir L-valina.
[00127] O método para produzir um L-aminoácido pode incluir as etapas de cultivar a bactéria conforme descrita neste documento em um meio de cultura para permitir que o L-aminoácido seja produzido, excretado, e/ou acumulado no meio de cultura ou nas células bacterianas, ou em ambos, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura e/ou das células bacterianas. O L- aminoácido coletado pode ser adicionalmente purificado. O L-aminoácido- alvo pode ser produzido sob uma sua forma livre, uma sua forma de sal ou uma sua forma de hidrato, ou uma sua forma de aduto com outro composto orgânico ou inorgânico, ou como uma combinação das mesmas. Isto é, a frase “L-aminoácido” pode referir-se a um L-aminoácido sob uma forma livre, uma sua forma de sal, uma sua forma de hidrato, uma sua forma de aduto, ou uma mistura das mesmas. Também, a frase “L-aminoácido” pode especificamente se referir a um L-aminoácidos sob uma forma livre, sob uma forma de seu sal, ou uma mistura das mesmas. Por exemplo, sais de amônio, de sódio, de potássio, e semelhantes ou um sal interno como um zwiteríon do L- aminoácido podem ser produzidos pelo método. Isto é possível porque os aminoácidos podem reagir uns com os outros sob condições de fermentação ou com um agente neutralizador tal como uma substância ácida ou básica inorgânica ou orgânica em uma típica reação de neutralização de ácido-base para formar um sal que é a característica química de aminoácidos o que é evidente para uma pessoa versada na técnica. Especificamente, um sal de monocloridrato de um L-aminoácido pode ser produzido pelo método tal com o sal de monocloridrato de L-lisina (L-lisina-HCl) ou o sal de monocloridrato de L-arginina (L-arginina-HCl); ou o sal de monocloridrato mono-hidrato de um L-aminoácido pode ser produzido pelo método tal como monocloridrato mono-hidrato de L-histidina (L-liistidina-HCT^O).
[00128] O cultivo da bactéria, e a coleta e a purificação de L- aminoácidos podem ser realizadas em uma maneira similar àquela dos métodos de fermentação convencionais nos quais um L-aminoácido é produzido usando um microrganismo. O meio de cultura para a produção do L-aminoácido pode ser um meio quer sintético quer natural como um meio típico que contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos e inorgânicos conforme a necessidade. Como a fonte de carbono, sacarídeos como glicose, lactose, galactose, frutose, arabinose, maltose, xilose, trealose, ribose, sacarose, e hidrolisados de amidos; álcoois como etanol, glicerol, manitol, e sorbitol; ácidos orgânicos como ácido glicônico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido málico, e ácido succínico; ácidos graxos; e semelhantes podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, sais inorgânicos de amônio como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio; nitrogênio orgânico como hidrolisados de feijão-soja; gás amônia; amônia aquosa; e semelhantes podem ser utilizados. Além disso, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho, e assim por diante, podem também ser utilizados. A fonte de enxofre pode incluir sulfato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, e semelhantes. O meio pode conter uma fonte de fósforo além da fonte de carbono, da fonte de nitrogênio, e da fonte de enxofre. Como a fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, polímeros de fosfato como ácido polifosfórico etc. podem ser usados. Vitaminas como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; substâncias necessárias, por exemplo, nutrientes orgânicos como ácidos nucleicos como adenina e RNA aminoácidos, peptona, casaminoácido, ou extrato de levedura; e semelhantes podem estar presentes em quantidades apropriadas, mesmo se em quantidades-traço. Além destas, quantidades pequenas de fosfato de cálcio, de íons de ferro, de íons de manganês, e semelhantes podem ser adicionadas, se necessárias.
[00129] A cultivação pode ser realizada sob condições aeróbicas durante 16 h até 72 h, ou durante 16 h a 65 h; a temperatura da cultura durante a cultivação pode ser controlada dentro da faixa de 30°C a 37°C; e o pH pode ser ajustado entre 5 e 8, ou entre 6,0 e 7,5. O pH pode ser ajustado pelo uso de uma substância acídica ou alcalina inorgânica ou orgânica, e também de gás amônia.
[00130] Após a cultivação, o L-aminoácido-alvo pode ser coletado do meio de cultura. Também, após a cultivação, as células podem ser rompidas com, por exemplo, ondas supersônicas ou semelhantes, o sobrenadante pode ser obtido pela remoção de sólidos tais como as células e a suspensão de células rompidas (também chamadas de fragmentos celulares), por exemplo, por centrifugação ou filtração por membrana, e então o L-aminoácido-alvo pode ser coletado do sobrenadante. A coleta de L-aminoácido do meio de cultura ou do sobrenadante etc. pode ser realizada por qualquer combinação de técnicas convencionais como concentração, cromatografia de troca de íons, e cristalização.
[00131] A composição de L-aminoácido-alvo coletada pode conter células microbianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos subprodutos do microrganismo além do L-aminoácido-alvo. A pureza do L- aminoácido coletado pode ser 50% ou maior, preferencialmente 85% ou maior, particularmente preferencialmente 95% ou maior (Patente U.S. n° 5.431.933, Patente Japonesa n° 1214636, Patentes U.S. n°s 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6,238.714, Pedido Publicado de Patente U.S. n° 2005/0025878).
[00132] A presente invenção será mais especificamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitadores.
[00133] Uma cepa de E. coli tendo um gene gshA inativado foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado “integração mediada por XRed/ET” (“ÂRed/ET- mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com este método, foram construídos os iniciadores de PCR: P1 (SEQ ID NO: 3) e P2 (SEQ ID NO: 4), cada um destes é homólogo à região adjacente ao gene gshA em qualquer extremidade, e uma região adjacente ao gene cat que confere resistência ao cloranfenicol (CmR) no plasmídeo molde em outra extremidade, foi construído. O plasmídeo pMIV-5JS (JP2008-99668, EP1942183 A1) foi usado como o molde. As condições para a PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os 2 ciclos iniciais: 1 min a 95°C, 30 s a 34°C, 1 min a 72°C; perfil para os 30 ciclos finais: 30 s a 95°C, 30 s a 50°C, 1 min a 72°C; alongamento final: 5 min a 72°C.
[00134] O produto-1 de PCR obtido (SEQ ID NO: 5; 1.378 pb) foi purificado por eletroforese em gel de agarose e usado para eletroporação da cepa E. coli MG1655 contendo o plasmídeo pKD46 tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) inclui um fragmento de DNA de 2.154 nucleotídeos de fago X (posições de nucleotídeos de 31088 a 33241, GenBank, número de acesso J02459), e assim contém os genes do sistema de recombinação homóloga XRed (genes y, β, e exo) sob o controle do promotor ParaB induzível por arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para a integração do produto de PCR no cromossomo da cepa E. coli MG1655 (ATCC 47076). A cepa E. coli MG1655 contendo o plasmídeo pKD46 pode ser obtida junto ao “E. coli Genetic Stock Center”, Yale University, New Haven, EUA (Número de Acesso CGSC7669).
[00135] Células eletrocompetentes foram preparadas como segue: E. coli MG1655/pKD46 foi crescida de um dia para outro a 30°C em meio-LB (caldo de Luria-Bertani, também chamado de caldo lisogênico; Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) contendo ampicilina (100 mg/L); então a cultura foi diluída 100 vezes com 5 mL de meio-SOB (Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) contendo ampicilina (100 mg/L) e L-arabinose (1 mM). A cultura diluída foi crescida com aeração (250 rpm) a 30°C para OD600 de cerca de 0,6 e então tornada eletrocompetente por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes com H2O desionizada gelada. Eletroporação foi realizada usando 70 μL de células e cerca de 100 ng do produto-1 de PCR. As células eletroporadas foram incubadas com 1 mL de meio-SOC (Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a 37°C durante 2,5 horas, postas sobre placas contendo o caldo lisogênico (Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), ágar (1,5%) e cloranfenicol (10 mg/L), e crescidas a 37°C para selecionar KmR-recombinantes. Para eliminar o plasmídeo pKD46, foram realizadas duas passagens em L-ágar suplementado com cloranfenicol (10 mg/L) a 42°C, e as colônias obtidas foram testadas para a sensibilidade à ampicilina. Dessa forma foi obtida a cepa E. coli MG1655ΔgshA tendo o gene marcador CmR, que é também chamada de a cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR.
[00136] A deleção do gene gshA marcado com gene para resistência ao cloranfenicol (cat) na cepa mutante E. coli MG1655ΔgshA foi verificada por PCR. Iniciadores P3 (SEQ ID NO: 6) e P4 (SEQ ID NO: 7) lócus-específicos foram usados para a verificação. As condições para a PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 s a 94°C, 30 s a 55°C, 2 min a 72°C; alongamento final: 6 min a 72°C. O produto-2 de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico como o molde a partir da cepa parental E. coli MG1655 tendo gene gshA nativo, foi de comprimento de 2.155 pb (SEQ ID NO: 8). O produto-3 de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico como um molde da cepa mutante E. coli MG1655ΔgshA::CmR, foi de comprimento de 1.858 pb (SEQ ID NO: 9).
[00137] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-valina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima (Exemplo 1.1) foram transferidos para a cepa E. coli H81 produtora de L-valina por transdução-P1 (Miller J.H., “Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, 1972) para obter a cepa E. coli H81ΔgshA::CmR. A cepa H81 (EP1239041 A2) foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 30 de janeiro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8066 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de 2002. A cepa E. coli H81 tendo o gene gshA inativado foi selecionada sobre as placas contendo o caldo lisogênico, ágar (1,5%) e cloranfenicol (10 mg/L). Dessa forma foi obtida a cepa E. coli H81ΔgshA::CmR. A deleção de gshA marcado com o gene de resistência ao cloranfenicol foi verificada por PCR conforme descrito no Exemplo 1.2.
[00138] A cepa E. coli H81ΔgshA::CmR modificada e a cepa de controle E. coli H81 foram separadamente cultivadas em 2 mL de meio LB durante 18 horas a 34°C. Então, 0,2 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados em 2 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados durante 72 horas a 34°C em um agitador rotativo (250 rpm) até o consumo de glicose.
[00139] A composição do meio de fermentação (g/L) foi a seguinte:
[00140] O meio de fermentação foi esterilizado a 116°C durante 30 min. Glicose e CaCO3 foram esterilizados separadamente como segue: glicose a 110°C durante 30 min e CaCO3 a 116°C durante 30 min. O pH foi ajustado para 7,0 por KOH 6M antes da esterilização.
[00141] Após a cultivação, a quantidade de L-valina, que acumulou no meio, foi determinada por cromatografia em camada fina (TLC, “Thin Layer Chromatography”). Foram usadas as 10 placas de TLC de 20 cm revestidas com gel de sílica 60 da Merck sem indicador fluorescente (Merck, Darmstadt, Alemanha). As amostras foram aplicadas sobre as placas com o uso do aplicador de amostras Camag Linomat 5. As placas da Merck foram eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 16 : 16 : 5 : 10 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%, p/v) em acetona foi utilizada como um reagente de visualização. Após a eluição, as placas foram secadas e escaneadas com o escâner Camag TLC Scanner 3 no modo de absorbância com detecção a 520 nm com o uso do programa de computador winCATS (versão 1.4.2).
[00142] Os resultados de quatro fermentações independentes em tubos de ensaio (como valores médios) são mostrados na Tabela 2. Como pode ser visto na Tabela 2, a cepa E. coli H81ΔgshA::CmR modificada foi capaz de produzir uma quantidade mais alta (g/L) de L-valina (Val) em comparação com a cepa parental E. coli H81. A Tabela 2 também mostra que a cepa E. coli H81ΔgshA::CmR modificada foi capaz de produzir L-valina com rendimento mais alto (%, relativa à glicose consumida) em comparação com a cepa parental E. coli H81. Tabela 2.
[00143] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-arginina, os fragmentos de DNA do cromossomo da E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para a cepa E. coli 382 produtora de arginina por transdução-P1 para obter a cepa E. coli 382ΔgshA. A cepa 382 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 10 de abril de 2000 sob o número de acesso VKPM B-7926 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.
[00144] As cepas E. coli 382 e 382ΔgshA são separadamente cultivadas com agitação (220 rpm) a 37°C durante 18 horas em 3 mL de caldo nutriente. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 2 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados a 32°C durante 48 horas em um agitador rotativo (220 rpm).
[00145] Após a cultivação, a quantidade de L-arginina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em n-butanol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-arginina é cortada, L-arginina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-arginina é estimada espectrofotometricamente a 540 nm.
[00146] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00147] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.
[00148] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-citrulina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli 382ΔargG produtora de citrulina por transdução-P1 para obter a cepa E. coli 382ΔargGΔgshA. A cepa 382ΔargG é obtida pela deleção de gene argG no cromossomo da cepa E. coli 382 produtora de arginina (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado de integração mediada por XRed/ET (“XRed/ET- mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com este procedimento, são construídos os iniciadores de PCR cada um destes é homólogo tanto à uma região adjacente ao gene argG quanto a uma região adjacente ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo molde. O plasmídeo pMW118- X attL - cat-XattR (WO05/010175) é usado como o molde na PCR.
[00149] As cepas E. coli 382ΔargG e 382ΔargGΔgshA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 horas em 3 mL de caldo nutriente. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 2 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados a 32°C durante 48 horas em um agitador rotativo.
[00150] Após a cultivação, a quantidade de L-citrulina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo citrulina é cortada, L-citrulina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-citrulina é estimada espectrofotometricamente a 540 nm.
[00151] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00152] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.
[00153] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-cisteína, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli JM15(ydeD) produtora de cisteína por transdução-P1 para obter a cepa E. coli JM15(ydeD)ΔgshA. A cepa JM15(ydeD) é uma cepa derivada de E. coli JM15 (Patente U.S. n° 6.218.168 B1), que está transformada com DNA contendo o gene ydeD (Patente U.S. n° 5.972.663). O gene ydeD codifica uma proteína de membrana, e não está envolvido em uma rota biossintética de nenhum L-aminoácido.
[00154] As condições de fermentação e o procedimento para a avaliação de produção de L-cisteína foram descritos em detalhe no Exemplo 6 da Patente U.S. n° 6.218.168 B1.
[00155] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de ácido L-glutâmico, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli VL334thrC+ produtora de glutamato (EP1172433 A1) por transdução-P1 para obter a cepa E. coli VL334thrC+ΔgshA. A cepa VL334thrC+ foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 8 de dezembro de 2004.
[00156] As cepas E. coli VL334thrC+ e VL334thrC+ΔgshA são separadamente cultivadas durante 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então, uma alça das células é transferida para dentro de 20 tubos de ensaio de 200 mm contendo 2 mL de meio de fermentação. A cultivação é realizada a 30°C durante 3 dias com agitação.
[00157] Após a cultivação, a quantidade de ácido L-glutâmico que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v) com coloração subsequente por ninhidrina (solução 1% em acetona), eluição de ácido L-glutâmico em etanol 50% com 0,5% de CdCl2 e estimativa adicional da quantidade de ácido L-glutâmico a 540 nm.
[00158] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00159] Glicose e CaCO3 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado para 7,2.
[00160] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-histidina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR produtora de L-histidina com o uso de transdução-P1 para obter a cepa E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔgshA. A cepa MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR foi descrita em RU2119536 C1 e Doroshenko V.G. et al., “The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants” [“A modificação dirigida de Escherichia coli MG1655 para obter mutantes produtoras de histidina”], Prikl. Biochim. Mikrobiol. (em russo), 2013, 49(2):149-154.
[00161] As cepas E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR e MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔgshA são separadamente cultivadas durante 3 horas a 30°C em 2 mL de caldo-L (Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Então, 0,1 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados para dentro de 2 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados durante 65 horas a 30°C em um agitador rotativo (250 rpm).
[00162] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: *Mameno é o hidrolisado de farinha de feijão-soja (Ajinomoto Co, Inc.).
[00163] Glicose, sulfato de magnésio, betaína, e CaCO3 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado para 6,0 por solução de KOH 6M antes da esterilização.
[00164] Após a cultivação, a quantidade de L-histidina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em camada fina (TLC). São usadas as 10 placas de TLC de 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Federação Russa). As placas Sorbfil são eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetona : amônia aquosa 25% : água = 6 : 6 : 1.5 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%, p/v) em acetona é usada como um reagente de visualização. Após a eluição, as placas são secadas e escaneadas com o escâner Camag TLC Scanner 3 no modo de absorbância com detecção a 520 nm com o uso do programa de computador winCATS (versão 1.4.2).
[00165] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-leucina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para a cepa E. coli 57 produtora de leucina (VKPM B-7386, Patente U.S. n° 6.124.121) por transdução-P1 para obter a cepa E. coli 57ΔgshA. A cepa 57 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 19 de maio de 1997 sob o número de acesso VKPM B-7386.
[00166] As cepas E. coli 57 e 57ΔgshA são separadamente cultivadas durante 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma cultura- semente, as cepas são, cada uma, crescidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32°C durante 18 horas em 20 tubos de ensaio de 200 mm contendo 2 mL de caldo-L (Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) suplementado com sacarose (4%). Então, o meio de fermentação é inoculado com 0,2 mL de cultura de semente (10%). A fermentação é realizada em 2 mL de um meio de fermentação mínimo em 20 tubos de ensaio de 200 mm. As células são crescidas durante 48-72 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.
[00167] Após a cultivação, a quantidade de L-leucina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v).
[00168] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00169] Glicose é esterilizada separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,2.
[00170] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-lisina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli AJ11442 produtora de lisina por transdução-P1 para obter a cepa E. coli AJ11442ΔgshA. A cepa AJ11442 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente, “NITE IPOD”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 1 de maio de 1981 sob o número de acesso de FERM P-5084 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 29 de outubro de 1987 designado com o número de acesso de FERM BP-1543.
[00171] As cepas E. coli AJ11442 e AJ11442ΔgshA são separadamente cultivadas em meio-L contendo estreptomicina (20 mg/L) a 37°C. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 20 mL de meio de fermentação contendo os fármacos necessários em um frasco de 500 mL. A cultivação é realizada a 37°C durante 16 horas pelo uso de um agitador recíproco na velocidade de agitação de 115 rpm.
[00172] Após a cultivação, a quantidade de L-lisina que se acumula no meio e a glicose residual são determinadas por um método conhecido (Biotech-analyzer AS210, Sakura Seiki Co.). Então, o rendimento de L-lisina é calculado em relação à glicose consumida por cada uma das cepas.
[00173] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00174] O pH é ajustado para 7,0 por KOH, e o meio é autoclavado a 115°C durante 10 min. Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 horas e adicionado ao meio para uma concentração final de 30 g/L.
[00175] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-ornitina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli 382ΔargFΔargI produtora de ornitina por transdução-P1 para obter a cepa E. coli 382ΔargFΔargI,ΔgshA. A cepa 382ΔargFΔargI é obtida pelas deleções consecutivas dos genes argF e argI no cromossomo da cepa E. coli 382 produtora de arginina (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado integração mediada por kRed/ET (“ÀRed/E-T-mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com este procedimento, são construídos dois pares de iniciadores de PCR homólogos tanto à região adjacente ao gene argF ou argI quando ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo molde. O plasmídeo pMW118-k attL - cat -k attR (WO05/010175) é usado como o molde na PCR.
[00176] As cepas E. coli 382ΔargFΔargI e 382ΔargFΔargI,ΔgshA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 horas em 3 mL de caldo nutriente. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 2 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados a 32°C durante 48 horas em um agitador rotativo.
[00177] Após a cultivação, a quantidade de L-ornitina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo ornitina é cortada, ornitina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de ornitina é estimada espectrofotometricamente a 540 nm.
[00178] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00179] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.
[00180] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-fenilalanina, os fragmentos de DNA do cromossomo da E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli AJ12739 produtora de fenilalanina por transdução-P1 para obter a cepa AJ12739ΔgshA. A cepa AJ12739 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 6 de novembro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8197 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 23 de agosto de 2002.
[00181] As cepas E. coli AJ12739 e AJ12739ΔgshA são separadamente cultivadas a 37°C durante 18 horas em um caldo nutriente. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 3 mL de meio de fermentação em 20 tubos de ensaio de 200 mm e cultivados a 37°C durante 48 horas com agitação em um agitador rotativo.
[00182] Após a cultivação, a quantidade de L-fenilalanina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em camada fina (TLC). São usadas as 10 placas de TLC de 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Federação Russa). As placas Sorbfil são eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol: acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização.
[00183] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00184] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.
[00185] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-prolina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli 702ilvA produtora de prolina por transdução-P1 para obter a cepa E. coli 702ilvAΔgshA. A cepa 702ilvA foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 18 de julho de 2000 sob o número de acesso VKPM B-8012 e então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.
[00186] As cepas E. coli 702ilvA e 702ilvAΔgshA são separadamente cultivadas durante 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Então, estas cepas são, cada uma, cultivadas sob condições iguais às do Exemplo 7 (produção de ácido L-glutâmico).
[00187] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-treonina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma cepa E. coli VKPM B-3996 produtora de treonina por transdução-P1 para obter a cepa B-3996ΔgshA. A cepa VKPM B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no “All-Union Scientific Center of Antibiotics” (Federação Russa, 117105 Moscou, Nagatinskaya Street, 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa foi também depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM; “FGUP GosNII Genetika”, Federação Russa, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 19 de dezembro de 2002 sob o número de acesso VKPM B-3996.
[00188] As cepas E. coli VKPM B-3996 e B-3996ΔgshA são separadamente cultivadas durante 18-24 horas a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma cultura-semente, as cepas são, cada uma, crescidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32°C durante 18 horas em 20 tubos de ensaio de 200 mm contendo 2 mL de caldo-L (Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) suplementado com glicose (4%). Então, o meio de fermentação é inoculado com 0,2 mL (10%) de cultura de semente. A fermentação é realizada em 2 mL de meio mínimo em 20 tubos de ensaio de 200 mm. As células são crescidas durante 65 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.
[00189] Após a cultivação, a quantidade de L-treonina que se acumula no meio é determinada por cromatografia em papel com o uso de uma fase móvel consistindo em butan-1-ol: ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-treonina é cortada, L-treonina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-treonina é estimada espectrofotometricamente a 540 nm.
[00190] A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue:
[00191] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0. O antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.
[00192] Para testar o efeito da inativação do gene gshA sobre a produção de L-triptofano, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔgshA::CmR descrita acima são transferidos para uma E. coli SV164(pGH5) cepa produtora de triptofano por transdução-P1 para obter a cepa E. coli SV164(pGH5)ΔgshA. A cepa SV164(pGH5) é uma cepa obtida pela introdução do plasmídeo pGH5 na cepa E. coli SV164. A cepa SV164 (JP 3032013 B) tem o alelo trpE que codifica antranilato-sintase isenta de inibição de retroalimentação pelo triptofano. A cepa SV164 é uma cepa obtida pela introdução de uma mutação no gene trpE na cepa E. coli YMC9 (ATCC 33927). A cepa YMC9 está disponível na American Type Culture Collection (Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). O plasmídeo pGH5 hospeda um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato- desidrogenase isenta de inibição de retroalimentação pela serina. A cepa SV164(pGH5) foi descrita em detalhe na Patente U.S. n° 6.180.373 B1 ou no documento EP0662143 B1.
[00193] As cepas E. coli SV164(pGH5) e SV164(pGH5)ΔgshA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 horas em 3 mL de caldo nutriente suplementado com tetraciclina (20 mg/L, marcador de plasmídeo pGH5). Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas são inoculados em 3 mL de um meio de fermentação contendo tetraciclina (20 mg/L) em 20 tubos de ensaio de 200 mm, e cultivados a 37°C durante 48 horas em um agitador rotativo a 250 rpm.
[00194] Após a cultivação, a quantidade de L-triptofano que se acumula no meio é determinada por TLC conforme descrito no Exemplo 12 (produção de L-fenilalanina). Os componentes do meio de fermentação estão listados na Tabela 3, mas devem ser esterilizados em grupos separados (A, B, C, D, E, F, G e H), conforme mostrado, para se evitarem interações adversas durante a esterilização. Tabela 3.
O pH da solução A é ajustado para 7,1 com NH4OH. * Mameno é o hidrolisado de farinha de feijão-soja (Ajinomoto Co., Inc.).
[00195] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às suas modalidades preferias, será evidente para uma pessoa versada na técnica que várias alterações podem ser feitas, e equivalentes utilizados, sem se desviarem do escopo da invenção. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas como uma parte deste pedido.
[00196] De acordo com a presente invenção, pode ser aprimorada a produção de L-aminoácidos como L-aminoácidos de cadeia ramificada por uma bactéria da família Enterobacteriaceae.
Claims (10)
1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado por compreender: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura para produzir o L-aminoácido no meio de cultura, nas células bacterianas ou em ambos; e (ii) coletar o dito L-aminoácido do meio de cultura, das células bacterianas, ou de ambos, em que a dita bactéria está modificada para atenuar a expressão de um gene gshA, e em que dito L-aminoácido é um L-aminoácido de cadeia ramificada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita bactéria pertencer ao gênero Escherichia.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a dita bactéria ser Escherichia coli.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita bactéria pertencer ao gênero Pantoea.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a dita bactéria ser Pantoea ananatis.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a dita expressão do gene gshA estar atenuada devido à inativação do gene gshA.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o dito gene gshA estar deletado.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o dito gene gshA ser selecionado do grupo consistindo em: 1) ) um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; e 8) ) um DNA consistindo em uma sequência de nucleotídeos variante de SEQ ID NO: 1 devido à degeneração do código genético.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o dito L-aminoácido de cadeia ramificada ser selecionado do grupo consistindo em L-isoleucina, L-leucina e L-valina.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito L-aminoácido ser L-valina.
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