CN117230050B

CN117230050B - 色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用

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Publication number: CN117230050B
Application number: CN202311492466.3A
Authority: CN
Inventors: 林振泉; 乔玮博; 马成伟; 刘云慧; 金祥
Original assignee: Beijing Liangwei Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Liangwei Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2023-11-10
Filing date: 2023-11-10
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2043-11-10
Also published as: CN117230050A

Abstract

本发明涉及色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用，对来源于Pyrococcus furiosus的耐高温色氨酸合酶PfTrps进行突变，提高其在低温下催化合成L‑半胱氨酸的酶活性。所得PfTrps突变体用于酶催化方法制备L‑半胱氨酸和L‑胱氨酸，能有效提高L‑胱氨酸粗品的纯度，并大大降低生产过程中的染菌风险，达到简化生产工艺、降低生产成本的目的。

Description

色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用

技术领域

本发明涉及L-半胱氨酸和L-胱氨酸的酶催化合成方法，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

L-半胱氨酸和L-胱氨酸是含硫的非必需氨基酸，是组成各种蛋白质的基本单元之一，在人类和动物的毛发及指爪等的角蛋白中含量较高。L-半胱氨酸和L-胱氨酸广泛用于医药、食品、化妆品、饲料等的加工制造，尤其可以替代价格更高的甲硫氨酸作为饲料添加剂而使用，因此具有广阔的市场需求和前景。目前，工业生产L-胱氨酸的主要采用化学水解法，以人或动物的毛发经酸水解或碱水解后提纯制取。该方法产量低、能耗高、原料受限，并且水解过程产生难闻气体及大量的废酸废碱，对环境影响较大。基于上述问题，采用微生物发酵法和体外酶催化法等绿色环保的方法生产胱氨酸和半胱氨酸已成为人们研究和关注的方向。

微生物发酵法生产L-半胱氨酸和L-胱氨酸是微生物在细胞内利用丝氨酸乙酰转移酶（CysE）和半胱氨酸合酶（CysK和CysM）催化丝氨酸和硫辛烷基（-SH供体）生成L-半胱氨酸，L-半胱氨酸通过氧化转换成L-胱氨酸。该方法生产成本低、对环境友好、不受原料限制，工业化生产前景广阔。但由于微生物体内半胱氨酸合成途径复杂且-SH的来源问题尚未得到彻底解决，因此发酵法生产半胱氨酸目前仍然仅停留在实验室阶段，距工业化大规模生产尚有距离。

体外酶催化法是通过工程菌株表达所需的催化酶，处理后得到的酶或酶液在体外催化丝氨酸和硫氢化物反应生成半胱氨酸；反应结束后进行氧化处理，将L-半胱氨酸氧化为L-胱氨酸；再利用L-胱氨酸在水中溶解度极低、易于沉淀的特性，从反应液中分离得到较高纯度的L-胱氨酸粗品。体外酶催化法具有工艺简单、副产物少、易于纯化等优点，发展前景十分广阔。

色氨酸合酶（Tryptophan synthase，Trps）由β-亚基（TrpB）和α-亚基（TrpA）两个亚基组成，是生物体内色氨酸合成途径中的关键酶，催化吲哚与丝氨酸反应合成色氨酸。研究发现，来源于大肠杆菌的色氨酸合酶（EcTrps）不仅具有合成色氨酸的功能，还能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成半胱氨酸，这为半胱氨酸的酶催化生产开辟了新思路。迄今为止，除大肠杆菌的色氨酸合酶外，尚无其他种类的色氨酸合酶（Trps）被报道同样具有催化丝氨酸和硫氢化钠生成半胱氨酸的功能。EcTrps属于常温酶，在高温下容易失活。

目前酶催化生产L-半胱氨酸和L-胱氨酸主要是以EcTrps为催化酶，催化底物丝氨酸和硫氢化钠合成半胱氨酸，半胱氨酸再经氧化形成胱氨酸。为了简化工艺、降低成本，酶催化法通常是将表达EcTrps的工程菌株的细胞培养物高压破碎后得到的粗酶液作为酶源参与催化反应。使用粗酶液进行催化，虽然省略了酶的提纯和/或固定化步骤，工艺简单、成本低廉，但是却会增加L-胱氨酸粗品中菌体蛋白等杂质的量，不利于后续的进一步纯化和精制。另外，粗酶液富含多种菌体蛋白和培养基等营养成分，这也使得反应体系存在较高的染菌风险，从而影响酶催化反应的正常进行。因此，希望寻找一种既可以使用粗酶液作为酶源又可以不增加反应体系的染菌风险并且提高L-胱氨酸粗品纯度的酶催化生产方法。

发明内容

为了降低酶催化法生产L-胱氨酸过程中的染菌风险，同时也为了提高L-胱氨酸粗品纯度。本发明对不同物种来源的色氨酸合酶（Trps）进行筛选，发现来源于超嗜热菌Pyrococcus furiosus的色氨酸合酶（PfTrps）具有非常好的高温热稳定性，且具备催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的活性（本发明后述所涉及酶活、酶活性、反应酶活、酶功能、催化功能等或具有相同含义的类似表述，如未特殊说明，均指催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的活性或功能）。对表达PfTrps的生产菌株的细胞破碎液进行高温处理，PfTrps由于具有良好的热稳定性不会发生沉淀，而大部分不耐高温的菌体蛋白等杂质蛋白则会在高温下变性沉淀，过滤去除沉淀得到基本不含杂质蛋白的PfTrps粗酶液，作为酶源催化丝氨酸和硫氢化钠生成L-半胱氨酸，可以大大降低反应过程中的染菌风险，并且还减少了最终L-胱氨酸粗品中杂质的含量。

本发明提供一种耐高温的色氨酸合酶，其是来源于Pyrococcus furiosus的PfTrps，包括α-亚基（PfTrpA，Uniplot ID Q8U094）和β-亚基（PfTrpB，Uniplot ID Q8U093）两个亚基，能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成L-半胱氨酸。

本发明提供一种耐高温的色氨酸合酶的用途，用于制备L-半胱氨酸或L-胱氨酸。所述色氨酸合酶是来源于Pyrococcus furiosus的PfTrps，包括α-亚基（PfTrpA，UniplotID Q8U094）和β-亚基（PfTrpB，Uniplot ID Q8U093）两个亚基，所述用途是催化丝氨酸和硫氢化钠生成L-半胱氨酸。

所述PfTrps中，PfTrpB的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，PfTrpA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

PfTrps的最适催化温度是80℃，在常温等低温条件下催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的活性较低。而硫氢化钠水溶液在反应过程中会释放部分硫化氢气体，与空气混合后在高温状态下存在爆炸的风险。为了降低上述风险，本发明进一步在保持PfTrps热稳定性的基础上对其主要执行催化活性的PfTrpB亚基进行突变，得到在例如常温等低温条件下能够高效催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的耐高温PfTrps突变体。

本发明提供一种色氨酸合酶突变体，其是对来源于Pyrococcus furiosus的PfTrps进行氨基酸取代的突变而得到的，所述PfTrps包括α-亚基（PfTrpA，Uniplot IDQ8U094）和β-亚基（PfTrpB，Uniplot ID Q8U093）两个亚基，所述突变位于β-亚基（PfTrpB）上，是在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的基础上进行选自如下位点的氨基酸取代得到的：

第13位谷氨酸突变为谷氨酰胺氨酸；

第54位酪氨酸突变为苏氨酸；

第56位丙氨酸突变为半胱氨酸；

第85位天冬酰胺氨酸突变为谷氨酰胺氨酸；

第275位组氨酸突变为苯丙氨酸；

第301位酪氨酸突变为苯丙氨酸；

第307位谷氨酸突变为谷氨酰胺氨酸。

优选的，上述突变位点选自：第275位组氨酸突变为苯丙氨酸、第301位酪氨酸突变为苯丙氨酸。

所述突变体具有热稳定性，优选于60-80℃处理20-60min后酶活基本不降低。

本发明还提供编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子。

本发明还提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

本发明还提供表达所述色氨酸合酶突变体的重组微生物。所述重组微生物优选：地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、汉逊酵母等，特别优选大肠杆菌。

本发明还提供所述色氨酸合酶突变体、编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料用于制备L-半胱氨酸或L-胱氨酸的用途。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以大肠杆菌为宿主细胞，在该重组细胞中表达了色氨酸合酶突变体。所述大肠杆菌菌株可以是基因工程领域常用的工程菌株，优选例如BL21(DE3)、BW25113、W3110、W3110(DE3)、M5 HiPer BLR(DE3)、BL21(DE3)DUOs，特别优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供一种L-半胱氨酸或L-胱氨酸的制备方法，其特征在于使用所述色氨酸合酶突变体、编码所述色氨酸合酶突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料。

所述制备方法，具体包括如下步骤：

（1）培养表达所述色氨酸合酶突变体的重组微生物；

（2）对培养物进行细胞破碎处理；

（3）对细胞破碎物进行高温处理；

（4）离心，得到的上清液即为含有所述色氨酸合酶突变体的粗酶液；

（5）使用所述粗酶液催化丝氨酸和硫氢化钠反应合成L-半胱氨酸；

可选择的，所述制备方法还进一步包括：

（6）对L-半胱氨酸进行氧化处理得到L-胱氨酸；

（7）过滤得到L-胱氨酸粗品。

上述方法中，所述高温处理是在60-80℃保持20-60min，优选在65℃保持30min。

上述方法中，步骤（5）所述反应的反应液包括：L-丝氨酸、硫氢化钠、磷酸吡哆醛（PLP）、含有所述色氨酸合酶突变体的粗酶液。

反应条件为40℃、pH 8.0.~9.0。

上述方法中，步骤（6）所述氧化处理为向反应液加入FeCl₂并进行通气氧化。优选的，所述FeCl₂的加入量为终浓度200mg/L。

附图说明

图1 不同物种来源色氨酸合酶酶活筛选

图2 PfTrps突变体酶活比较

图3 PfTrps突变体热稳定性测定

a.65℃处理前后突变体SDS-PAGE电泳图，其中

M: Marker；

1-4：PfTrps-H275F，上清、沉淀、65℃热处理后上清、65℃热处理后沉淀

5-8：PfTrps-Y301F，上清、沉淀、65℃热处理后上清、65℃热处理后沉淀

9-12：EcTrps，上清、沉淀、65℃热处理后上清、65℃热处理后沉淀

b.65℃热处理后的剩余酶活（%）

图4 不同处理方式胱氨酸粗品照片

a.酶液经65℃处理后最终纯化所得胱氨酸粗品

b.酶液未经65℃处理最终纯化所得胱氨酸粗品

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。

实施例1：耐高温色氨酸合酶的筛选

（1）基因获得

选择来源于Weizmannia coagulans的色氨酸合酶WcTrps、来源于Meiothermus ruber的色氨酸合酶MrTrps、来源于Bacillus methanolicus PB1的色氨酸合酶BmTrps以及来源于Pyrococcus furiosus的色氨酸合酶PfTrps四种色氨酸合酶进行筛选，四种微生物的最适生长温度分别为50℃、65℃、45℃、80℃。使用带有两个启动子的大肠杆菌双表达载体pETDuet-1同时对色氨酸合酶的两个亚基进行表达，将每个色氨酸合酶Trps的β-亚基（TrpB）克隆至pETDuet-1的多克隆位点1、α-亚基（TrpA）克隆至pETDuet-1的多克隆位点2。上述四种色氨酸合酶的两个亚基的编码序列经密码子优化后由上海朗晶生物科技有限公司分别合成至pETDuet-1上的相应位点，得到表达载体pETDuet-1-WcTrps、pETDuet-1-MrTrps、pETDuet-1-BmTrps、pETDuet-1-PfTrps。

上述四种色氨酸合酶的各亚基的氨基酸序列编号以及相应的密码子优化后的核苷酸编码序列编号如表1所示。

表1 四种色氨酸合酶的氨基酸序列及密码子优化后的核苷酸编码序列编号

（2）蛋白表达

将步骤（1）合成的四个表达载体分别转入BL21(DE3)，获得表达色氨酸合酶WcTrps（WcTrpB和WcTrpA）的菌株BL21-WcTrps、表达色氨酸合酶MrTrps（MrTrpB和MrTrpA）的菌株BL21-MrTrps、表达色氨酸合酶BmTrps（BmTrpB和BmTrpA）的菌株BL21-BmTrps和表达色氨酸合酶PfTrps（PfTrpB和PfTrpA）的菌株BL21-PfTrps。将上述构建的表达菌株按1:100的比例接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃，220 rpm条件下振荡培养，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，在菌液中加入0.4mM诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），然后转入30℃，220rpm条件下，继续诱导培养。诱导过夜后，收获细胞并用0.2M磷酸钾缓冲液（pH 8.0）洗涤，高压均质机破碎，12000rpm离心15min收集上清得到分别含有相应色氨酸合酶的四种酶液。

（3）催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的酶活性筛选

酶活测定反应体系组成如表2所示（1mL）：

表2 酶活测定反应体系

按上述反应体系添加后，分别于四种色氨酸合酶的较适温度50℃（WcTrps）、60℃（MrTrps）、45℃（BmTrps）、80℃（PfTrps）温度下催化1h后，等体积1M盐酸终止，稀释10倍后进行HPLC检测。

结果如图1所示，仅有来源于Pyrococcus furiosus的PfTrps能够催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸，酶活为21 IU，其余三种色氨酸合酶均未测定出活性。

实施例2：色氨酸合酶PfTrps基因的突变体构建

将实施例1筛选得到的PfTrps进行突变体构建，过程如下所示：

（1）PCR扩增：以petDuet-1-PfTrps为模板，利用突变引物PfTrps-E13Q-F和引物PfTrps-E13Q-R（引物序列如表3所示），进行聚合酶链式反应（PCR），对PfTrps的β-亚基PfTrpB（氨基酸序列如SEQ ID NO ：1所示）的相应位点进行突变。

（2）PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。

（3）纯化后产物转化E. coliDH5α感受态，涂布到含50 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，次日PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒petDuet-1-PfTrps-E13Q，再通过测序进行鉴定。

（4）其余突变体均按照上述方法构建，获得分别含有相应突变的重组质粒petDuet-1-PfTrps-Y54T、petDuet-1-PfTrps-A56C、petDuet-1-PfTrps-N85Q、petDuet-1-PfTrps-H275F、petDuet-1-PfTrps-Y301F、petDuet-1-PfTrps-E307Q。

表3 突变所用引物序列

实施例3：突变体催化产胱氨酸检测

（1）将实施例2构建好的7个PfTrps突变体重组质粒转入BL21(DE3)分别得到相应的突变体表达菌株，同时将未突变的petDuet-1-PfTrps转入BL21(DE3)作为对照，按1:100的比例接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃，220 rpm条件下振荡培养，当OD600为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），然后转入30℃，220rpm条件下，继续培养，诱导过夜。

（2）收获细胞并用0.2M磷酸钾缓冲液（pH 8.0）洗涤，高压均质机破碎菌体细胞，12000rpm离心15min收集上清，进行催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的酶活性检测。

（3）按如表2所示反应体系测定酶活，添加各组分后，40℃催化反应1h用等体积1M盐酸终止，稀释10倍进行HPLC检测。

结果如图2所示，7个PfTrps突变体相较于突变前的PfTrps，在40℃时的酶活均有明显提升，其中PfTrps-H275F、PfTrps-Y301F这两个突变体酶活最高，分别达到74.2 IU和61.2 IU。

上述结果表明，通过突变得到的PfTrps突变体获得了在低温下催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸的高酶活性。

实施例4：突变体热稳定性检测

（1）同样方法构建表达常温酶大肠杆菌色氨酸合酶EcTrps的重组质粒petDuet-1-EcTrps，转入BL21(DE3)中作为对照，其中EcTrpB的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：17所示，EcTrpA的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：18所示。

（2）将实施例3中得到的低温酶活较高的PfTrps-H275F和PfTrps-Y301F突变体表达菌株培养物以及对照菌株培养物分别利用高压均质机进行细胞破碎得到细胞破碎液（压力800-1000 bar）。取少量细胞破碎液于12000rpm离心30min得到上清和沉淀，作为热处理前的样品进行SDS-PAGE检测，同时再取少量上清液作为热处理前的样品进行酶活检测。

（3）对剩余细胞破碎液分别进行65℃、30min热处理。热处理后，取少量样品12000rpm离心30min，得到上清和沉淀，作为热处理后的样品进行SDS-PAGE检测，同时再取少量上清液作为热处理后的样品进行酶活检测。

（4）对热处理前后的上清液样品进行酶活检测，反应体系按照表2所示，添加各组分后，40℃催化1h，用等体积1M盐酸终止反应，稀释10倍进行HPLC检测。另外，热处理前后的沉淀样品用等体积水重悬，连同热处理前后的上清样品一同进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE结果如图3a所示，突变体PfTrps-H275F、PfTrps-Y301F的样品经过65℃，30min热处理后，高表达的突变体蛋白大部分集中在上清中，上清中的杂质蛋白明显减少；对照EcTrps经过热处理后大部分发生了变性而集中在沉淀中（图3a）。

酶活检测结果如图3b所示，突变体PfTrps-H275F、PfTrps-Y301F的酶活相较于热处理前基本未发生改变，剩余酶活（热处理后的酶活÷热处理前的酶活×100%）均接近100%，而作为对照的常温酶EcTrps经热处理后酶活基本完全丧失，剩余酶活接近0。

上述结果表明，突变体PfTrps-H275F、PfTrps-Y301F具有十分优秀的热稳定性，并且在经热处理后酶活基本无损失。

实施例5 利用突变体催化生产L-半胱氨酸或L-胱氨酸

（1）培养上述酶活较高的PfTrps-H275F、PfTrps-Y301F突变体表达菌株，分别收集10g湿菌体，用水重悬菌体后利用高压均质机（800-1000bar）对培养物进行细胞破碎得到细胞破碎液。

（2）对细胞破碎液进行65℃水浴热处理30min，热处理后的样品离心后得到的上清即为粗酶液。

（3）把粗酶液加入到催化反应体系催化丝氨酸和硫氢化钠合成L-半胱氨酸，催化反应体系其余组分组成为：L-丝氨酸300 mM、硫氢化钠330 mM、磷酸吡哆醛0.05 mM、磷酸氢二钾50 mM，总反应体积为0.5 L，于1.2 L生物反应器进行，反应条件：40℃反应20h，反应期间用2 M 盐酸调节pH维持在8.0。反应结束后，体系中的主要反应产物即为L-半胱氨酸。

（4）如需进一步制备L-胱氨酸，则在反应结束后，将反应体系pH调至7.0，通入空气，通气量为1.67 vvm，通气30min后加入200mg/L FeCl₂，氧化2h。

（5）取1mL样品，用0.1M 盐酸稀释50倍，用HPLC检测丝氨酸和反应生成的胱氨酸的量。

结果显示，突变体PfTrps-H275F以及PfTrps-Y301F产量分别达到143.5mM和125.5mM，转化率分别为95.6%和83.7%。

（注：在整个反应过程中，1分子L-丝氨酸通过酶催化生成1分子L-半胱氨酸，2分子L-半胱氨酸经过氧化转化为1分子L-胱氨酸。）

表4 突变体催化生产L-胱氨酸产量及转化率

实施例6 L-胱氨酸结晶的制备

将实施例5步骤（4）中由突变体PfTrps-H275F催化转化所得的氧化产物，经布氏漏斗抽滤分离反应液和胱氨酸沉淀，再用0.125 L浓度为10 μM稀盐酸溶液（pH≈5）淋洗2次，收集沉淀物经干燥结晶后获得15g白色粉末结晶（图4a），其透光率为98%、比旋光度-206°、纯度99%，回收率为98.6%。

对照实施例

培养PfTrps-H275F突变体表达菌株，收集10g湿菌体，利用高压均质机（800-1000bar）对菌液进行细胞破碎。破碎结束后的样品不进行热处理，直接离心后收集上清，将上清液作为酶源加入催化反应液中，催化反应其余组分为：L-丝氨酸300 mM、硫氢化钠330mM、磷酸吡哆醛0.05 mM、磷酸氢二钾50 mM，总反应体积为0.5 L，于1.2 L生物反应器进行。反应条件：40℃反应20h，反应期间用2 M 盐酸调节pH维持在8.0。反应结束后，将反应体系pH调至7.0，通入空气，通气量为1.67 vvm，通气30min后加入200mg/L FeCl₂，氧化2h后。取1mL样品，用0.1M 盐酸稀释50倍，用HPLC检测丝氨酸和反应生成的胱氨酸。产量最高分别可达145mM，转化率为96.6%。

氧化产物经布氏漏斗抽滤分离反应液和胱氨酸沉淀，再用0.125 L浓度为10 μM稀盐酸溶液（pH≈5）淋洗2次，收集沉淀物经干燥结晶后获得15.5g灰白色粉末结晶（图4b），其透光率为77%、比旋光度-186°、纯度90%，回收率为91.7%。

表5 粗酶液热处理对胱氨酸结晶产物纯度和品质的影响

上述结果表明，在酶催化反应前，增加对突变体表达菌株培养物的细胞破碎液进行高温热处理的步骤，能有效提高所得L-胱氨酸结晶的纯度和品质，从而大大简化对产物的提纯工艺、有效降低生产成本。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种色氨酸合酶突变体，其特征在于，由α-亚基和β-亚基组成，其中α-亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，β-亚基是以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为基础，进行选自如下位点的突变：第275位组氨酸突变为苯丙氨酸或第301位酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成L-半胱氨酸。

2.一种如权利要求1所述的色氨酸合酶突变体在制备L-半胱氨酸或L-胱氨酸中的用途。

3.一种L-半胱氨酸或L-胱氨酸的制备方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的色氨酸合酶突变体。

4.一种如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）培养表达如权利要求1所述色氨酸合酶突变体的重组微生物；

（2）对所述重组微生物的培养物进行细胞破碎处理；

（3）对细胞破碎物进行高温处理；

如需制备L-胱氨酸，则所述制备方法还进一步包括对L-半胱氨酸进行氧化处理：

（6）向步骤（5）得到的反应液中通入空气，再加入FeCl₂进行氧化；

（7）过滤得到L-胱氨酸粗品；

上述步骤（3）中所述高温处理是在60-80℃保持20-60min。