CN114315999A

CN114315999A - leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L-缬氨酸中的应用

Info

Publication number: CN114315999A
Application number: CN202210262641.9A
Authority: CN
Inventors: 赵春光; 孟刚; 魏爱英; 贾慧萍; 毕国东; 田斌
Original assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Yipin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-17
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L‑缬氨酸中的应用。该leuD蛋白突变体为下述任一种：b1）氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；b2）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；b3）与b1）‑b2）中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；b4）在b1）‑b3）中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。本发明有助于L‑缬氨酸产量及转化率的提高。

Description

leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L-缬氨酸中的应用

技术领域

本发明属于微生物变异或遗传工程技术领域，具体涉及leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L-缬氨酸中的应用。

背景技术

L-缬氨酸（L-Valine），又称L-2-氨基-3-甲基丁酸（L-2-Amino-3-methylbutyricacid），是支链氨基酸（Branched Chain Amino Acid，BCAA）中的一种，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进身体正常生长，调节血糖，增强机体的免疫防护作用，抗中枢疲劳，抗外周疲劳，加快运动后机体的修复等作用，因此在食品、医药、化妆品行业具有广泛的应用及商业价值。而且L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，可以制备形成水凝胶，在组织工程、光化学、电化学等领域也已被广泛运用。

L-缬氨酸生产方法包括微生物发酵法、酶法、化学合成法和蛋白质水解提取法。其中酶法中的合成酶活性较低，蛋白质水解提取法分离成本高，化学合成法生产成本高、反应复杂、步骤多，且有许多副产物，因此均未能大规模工业化生产。微生物发酵法具有原料成本低，生产条件温和，发酵产率较高且易于大规模生产等优点，是目前L-缬氨酸的主要生产方法。

随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的过量积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，选育高产菌种有利于促进L-缬氨酸产业化的进程。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种leuD蛋白突变体。

本发明提供了leuD蛋白突变体，所述leuD蛋白突变体为下述任一种：

b1）氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

b2）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

b3）与b1）-b2）中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

b4）在b1）-b3）中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

将上述leuD蛋白突变体命名为leuD^A84V。

本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子为下述任一种：

1）编码上述leuD蛋白突变体的核酸分子；

2）编码序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

本发明还提供了上述leuD蛋白突变体的相关生物材料，所述相关生物材料为所述生物材料为下述任一种：

c1）含有上述任一核酸分子的表达盒；

c2）含有上述任一核酸分子的重组载体、或含有c1）所述表达盒的重组载体；

c3）含有上述任一核酸分子的重组微生物、或含有c1）所述表达盒的重组微生物、或含有c2）所述重组载体的重组微生物。

可选地，c2）所述的重组载体为具有SEQ ID NO.3所示的DNA分子的质粒，例如下述实施例制备的pK18-leuD^C251T、pK18-leuD^C251TOE或pXMJ19-leuD^C251T。

可选地，c3）所述的重组微生物为具有SEQ ID NO.3所示的DNA分子的重组微生物，例如下述实施例制备的YPV-067、YPV-069或YPV-071。

本发明还提供了上述的leuD蛋白突变体、上述的相关生物材料、蛋白质leuD或蛋白质leuD的相关生物材料在如下任一中的应用：

（1）制备L-缬氨酸；

（2）提高微生物L-缬氨酸的产量；

（3）构建产L-缬氨酸工程菌。

可选地，根据上述的应用，所述蛋白质leuD为下述任一种：

a1）氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

a2）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

a3）与a1）-a2）中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

a4）在a1）-a3）中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

可选地，根据上述的应用，所述蛋白质leuD的相关生物材料为下述任一种：

d1）编码上述蛋白质leuD的核酸分子；

d2）含有d1）所述核酸分子的表达盒；

d3）含有d1）所述核酸分子的重组载体、或含有d2）所述表达盒的重组载体；

d4）含有d1）所述核酸分子的重组微生物、或含有d2）所述表达盒的重组微生物、或含有d3）所述重组载体的重组微生物。

可选地，d1）所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：

1）编码序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2）核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

3）与1）或2）限定的核苷酸序列具有90%或90%以上同一性，来源于谷氨酸棒杆菌且编码上述蛋白质leuD的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质leuD的DNA分子。

可选地，d3）所述的重组载体为具有SEQ ID NO.1所示的DNA分子的质粒，例如下述实施例制备的pK18-leuDOE或pXMJ19-leuD。

可选地，d4）所述的重组微生物为具有SEQ ID NO.1所示的DNA分子的重组微生物，例如下述实施例制备的YPV-068或YPV-070。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

本发明还提供了一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法M1），包括在微生物中过表达leuD蛋白突变体基因或提高微生物中leuD蛋白突变体的丰度或提高leuD蛋白突变体的活性；所述leuD蛋白突变体为上述leuD蛋白突变体，所述leuD蛋白突变体基因为编码上述leuD蛋白突变体的基因，实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高。

可选地，过表达leuD蛋白突变体基因的实现方式包括：在微生物中导入leuD蛋白突变体基因或含有leuD蛋白突变体基因的质粒。含有leuD蛋白突变体基因的质粒例如为下述实施例制备的pK18-leuD^C251T、pK18-leuD^C251TOE或pXMJ19-leuD^C251T。

本发明还提供了一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法M2），包括在微生物中过表达蛋白质leuD基因或提高微生物中蛋白质leuD的丰度或提高微生物中蛋白质leuD的活性；所述蛋白质leuD为上述的蛋白质leuD，所述蛋白质leuD基因为编码上述的蛋白质leuD的基因，实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高。

可选地，过表达蛋白质leuD基因的实现方式包括：在微生物中导入蛋白质leuD基因或含有蛋白质leuD基因的质粒。含有蛋白质leuD基因的质粒例如为下述实施例制备的pK18-leuDOE或pXMJ19-leuD。

本发明还提供了一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法M3），包括将微生物基因组中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变（如碱基置换、碱基插入或碱基缺失），实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高。

可选地，根据上述的方法，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第84位的丙氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

可选地，根据上述的方法，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第84位的丙氨酸残基突变为缬氨酸残基。

可选地，根据上述的方法，所述突变通过定点突变方法将SEQ ID No.1所示DNA分子中第251位的核苷酸C进行核酸改造。

可选地，根据上述的方法，所述突变为通过定点突变方法将SEQ ID No.1所示DNA分子中第251位的核苷酸C突变为T。

所述突变是指通过定点突变改变基因中的某个或某几个碱基，导致对应的蛋白质氨基酸组成发生改变，产生新的蛋白质或使原蛋白质产生新的功能，即基因定点突变。基因的定点突变技术如寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变或盒式突变等是本领域技术人员所熟知的。

本发明还提供了一种构建产L-缬氨酸工程菌的方法，所述方法包括下述任一种：

F1）将leuD蛋白突变体基因导入微生物，得到所述产L-缬氨酸工程菌；

F2）将蛋白质leuD基因导入微生物，得到所述产L-缬氨酸工程菌；

F3）将微生物基因组蛋白质leuD基因替换为leuD蛋白突变体基因，得到所述产L-缬氨酸工程菌；

所述蛋白质leuD基因为编码上述的蛋白质leuD的基因，所述leuD蛋白突变体基因为编码上述leuD蛋白突变体的基因。

所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

可选地，将微生物基因组蛋白质leuD基因替换为leuD蛋白突变体基因的实现方式包括：将具有SEQ ID NO.3所示的DNA分子的质粒，例如下述实施例制备的pK18-leuD^C251T，导入所述微生物。

可选地，所述替换为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。

本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，所述方法包括利用上述方法构建的产L-缬氨酸工程菌生产L-缬氨酸。

可选地，利用上述方法构建的产L-缬氨酸工程菌生产L-缬氨酸具体可为发酵所述产L-缬氨酸工程菌。

本领域技术人员可以采用现有技术中的发酵方法进行发酵。也可通过常规试验进行发酵方法的优化和改进。可以在本领域中已知的发酵条件下在合适的培养基中进行细菌的发酵。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。具体可为pK18mobsacB或pXMJ19。

本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属（Brevibacterium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、埃希氏菌属（Escherichia）、气杆菌属（Aerobacter）、微球菌属（Micrococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）或芽孢杆菌属（Bacillus）等。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、产谷氨酸微球菌（Micrococcus glutamicus）、产氨短杆菌（Brevibacterum ammoniagenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）或产气气杆菌（Aerobacter aerogenes）但不限于此。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCCNo.21260，或谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067。

本发明实施例表明，leuD基因及其突变基因参与了L-缬氨酸的生物合成，通过对leuD基因进行过表达或敲除、或定点突变可以调控L-缬氨酸在微生物内的积累量。对leuD基因编码区进行突变或在生产菌中过表达leuD基因或其突变基因leuD^C251T，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对leuD基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。可利用leuD基因及其变体（如leuD^C251T基因）来构建生产L-缬氨酸的基因工程菌种，以促进L-缬氨酸产量提高。

保藏说明。

菌种名称：谷氨酸棒杆菌

拉丁名：Corynebacterium glutamicum

分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

菌株编号：YPFV1

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得，并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏登记号为CGMCC No. 21260。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。

实施例1、构建包含突变的leuD基因编码区片段的重组载体

依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067基因组序列，设计并合成两对扩增leuD基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的leuD基因）的leuD基因编码区（SEQ ID No.1）中引入点突变，所述点突变为将leuD基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中的第251位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），得到SEQ IDNo.3所示的DNA分子（突变的leuD基因，名称为leuD^C251T）。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质（所述蛋白质名称为蛋白质leuD）。

SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质（所述突变蛋白质名称为leuD^A84V）。所述突变蛋白质leuD^A84V氨基酸序列（SEQ ID No.4）中的第84位缬氨酸（V）由丙氨酸（A）突变而来。

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下（上海invitrogen公司合成），加粗字体的碱基为突变位置：

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG TCAAGATCGA CACCGTCTTC3'（SEQ ID No.15），

P2: 5' AGCCGTAGTC CATGAGTACC CAGACGGCGT GCTC 3'（SEQ ID No.16），

P3: 5' GAGCACGCCG TCTGGGTACT CATGGACTAC GGCT 3'（SEQ ID No.17），

P4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CATGCGTTCT AGGTAATGGT3'（SEQ ID No.18）。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为710 bp和654 bp的leuD基因编码区的DNA片段（leuDUp和leuD Down）。

PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg²⁺（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL；

PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min，（94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将上述两条DNA片段（leuDUp和leuD Down）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，用Xbal I/BamH I酶切）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化后长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-leuD^C251T. 该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。将酶切正确的重组载体pK18-leuD^C251T送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变（C-T）的重组载体pK18-leuD^C251T保存备用。

此重组载体pK18-leuD^C251T中leuD^C251T Up-Down DNA大小1330bp，（leuD^C251TUp-Down，SEQ ID No.5）含有突变位点，能够导致菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中leuD基因编码区的第251位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），最终导致编码蛋白的第84位丙氨酸（A）变为缬氨酸（V）。

所述重组载体pK18-leuD^C251T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段（小片段）替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1292位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pK18-leuD^C251T含有SEQ ID No.3所示的突变基因leuD^C251T的第1-594位所示的DNA分子。

实施例2、构建包含基因leuD^C251T的工程菌株

构建方法：将实施例1中的等位替换质粒（pK18-leuD^C251T）通过电击转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC No.21260中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1337 bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：

P5: 5'CTGGCGCCAA AACGACCCCA 3'（SEQ ID No.19），

P6: 5' CACAGAAGTT CGATGTCGGA 3'（SEQ ID No.20）。

将得到的PCR扩增产物（240bp）通过95 ℃高温变性10 min、冰浴5 min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳（以质粒pK18-leuD^C251T扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照，水作为空白对照），SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增等位替换成功的菌株leuD基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变（C-T）的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPV-067。

重组菌YPV-067含有SEQ ID No.3所示的突变的基因leuD^C251T。与谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260相比，重组菌YPV-067的差异仅在于将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组中的SEQ ID No.1所示的leuD基因替换为SEQ ID No.3所示的leuD^C251T基因。

表1 培养基的组成和培养条件

成分	配方（其余为水）
		蔗糖	10 g/L
多聚蛋白胨	10 g/L
		牛肉膏	10 g/L
酵母粉	5 g/L
		尿素	2 g/L
氯化钠	2.5 g/L
		琼脂粉	20 g/L
pH	7.0
		培养条件	32 ℃

表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

成分	用量（丙烯酰胺终浓度为8%）
		40%丙烯酰胺	8 mL
ddH<sub>2</sub>O	26 mL
		甘油	4 mL
10×TBE	2 mL
		TEMED	40 μL
10%APS	600 μL
		电泳条件	将电泳槽置入冰中，使用1×TBE缓冲液电压120 V，电泳时间10 h

实施例3、构建基因组上过表达leuD基因或leuD^C251T基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及leuD或leuD^C251T基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入leuD或leuD^C251T基因。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P7: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GTAGTGCCGT GCGTACCCCA 3'（SEQ ID No.21），

P8: 5' TGAAATGTAA GATTCAAAGA CCCAACCCCA ATCGCAATGT 3'（SEQ ID No.22），

P9: 5' ACATTGCGAT TGGGGTTGGG TCTTTGAATC TTACATTTCA 3'（SEQ ID No.23），

P10: 5' TGGGTGGTAA ATTTTTCCAT GGAACTCACC GTCCTTACAG 3'（SEQ ID No.24），

P11: 5' CTGTAAGGAC GGTGAGTTCC ATGGAAAAAT TTACCACCCA 3'（SEQ ID No.25），

P12: 5' GTGCGGGTTG GGGTTTTTGA TTAAGCGTTA GTGCGTGGCT 3'（SEQ ID No.26），

P13: 5' AGCCACGCAC TAACGCTTAA TCAAAAACCC CAACCCGCAC 3'（SEQ ID No.27），

P14: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GTTGGTTTAG CGGAGCTGCA3'（SEQ ID No.28）。

构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或YPV-067为模板，分别以引物P7/P8、P9/P10和P11/P12、P13/P14进行PCR扩增，获得上游同源臂片段795 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区，序列如SEQ ID No.6所示），leuD基因及其启动子片段887 bp（序列如SEQ ID No.7所示）或leuD^C251T基因及其启动子片段887 bp（序列如SEQ ID No.8所示）及下游同源臂片段769 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260 CEY17_RS02575基因及其与CEY17_RS02570的间隔区，序列如SEQ IDNo.9所示）。

PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，质粒上含有卡那霉素抗性标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒（重组载体），分别为pK18-leuDOE、pK18-leuD^C251TOE，因该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL，Mg²⁺（25 mM）4 μL，引物（10 pM）各2 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，总体积50 μL。

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s（30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

pK18-leuDOE含有SEQ ID No.1所示的leuD基因，用于将基因leuD基因整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达野生型leuD基因。

pK18-leuD^C251TOE含有SEQ ID No.3所示的leuD^C251T基因，用于将基因leuD^C251T基因整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达leuD^C251T基因。

将测序正确的整合质粒（pK18-leuDOE、pK18-leuD^C251TOE）分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P15/P16引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1445 bp的片段（SEQ IDNo.10）的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P17/P18引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1368 bp的片段（SEQ ID No.11）的菌为leuD或leuD^C251T基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-068（不含突变点）和YPV-069（含突变点）。

重组菌YPV-068含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的leuD基因；具体地，重组菌YPV-068是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为leuD基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝leuD基因的重组菌可以显著和稳定地提高leuD基因的表达量。

重组菌YPV-069含有SEQ ID No.3所示的突变的leuD^C251T基因；具体地，重组菌YPV-069是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为leuD^C251T基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。

PCR鉴定引物如下所示：

P15: 5' CGGTTAGATT TTTTGGCCCC 3'（对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧）（SEQID No.29），

P16: 5' TCGAGGCCCG GGGTTTGTTC 3'（对应leuD基因内部）（SEQ ID No.30），

P17: 5' GGCGTTGGCG TTCCACTGCA 3'（对应leuD基因内部）（SEQ ID No.31），

P18: 5' TCTGGACTGG GTGTTGCGCT 3'（对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧）（SEQID No.32）。

实施例4、构建质粒上过表达leuD基因或leuD^C251T基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成一对扩增leuD或leuD^C251T基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P19: 5' GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC TCTTTGAATC TTACATTTCA 3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.33），

P20: 5' ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC TTAAGCGTTA GTGCGTGGCT 3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.34）。

构建方法：分别以YPV-068和YPV-069为模板，以引物P19/P20进行PCR扩增，获得leuD基因及其启动子片段（序列如SEQ ID No.12所示）和leuD^C251T基因及其启动子片段917bp（序列如SEQ ID No.13所示），对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I/KpnI酶切回收的穿梭质粒pXMJ19（购自Addgene公司，质粒上含有氯霉素抗性标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-leuD（含有leuD基因）和pXMJ19-leuD^C251T（含有leuD^C251T基因），将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

pXMJ19-leuD是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。pXMJ19-leuD用于将基因leuD通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达leuD基因。

pXMJ19-leuD^C251T是将pXMJ19载体的EcoR I和KpnI识别位点间的片段（小片段）替换为核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的DNA片段，保持pXMJ19载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。pXMJ19- leuD^C251T用于将基因leuD^C251T通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达leuD^C251T基因。

将测序正确的pXMJ19-leuD和pXMJ19-leuD^C251T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R（-48）/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小956 bp片段的为阳性菌株，其被命名为YPV-070（不含突变点）和YPV-071（含突变点）。

重组菌YPV-070含有SEQ ID No.1所示的leuD基因；其为在质粒上过表达野生型leuD基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-leuD在染色体外进行过表达。

重组菌YPV-071含有SEQ ID No.3所示的突变的leuD^C251T基因；其为在质粒上过表达leuD^C251T基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-leuD^C251T在染色体外进行过表达。

实施例5、构建基因组上缺失leuD基因的工程菌株

采用NEBuilder重组技术进行载体构建，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列，合成两对扩增leuD基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段，以同源重组的方式敲除谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中leuD基因。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：

P21: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG ACCCTGCCAA CCGACGAAGG 3'（SEQ ID No.35），

P22: 5' TTTCGCTATC AGACTGAAAC TCTTTTTCTA GCCTTCCTTA 3'（SEQ ID No.36），

P23: 5' TAAGGAAGGC TAGAAAAAGA GTTTCAGTCT GATAGCGAAA 3'（SEQ ID No.37），

P24: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CCGTCAACCG ACTGTTCGGC3'（SEQ ID No.38）。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P21/P22和P23/P24进行PCR扩增，获得leuD的上游同源臂片段682bp及leuD的下游同源臂片段678bp。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，该载体上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50 ℃连接30 min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔleuD，此重组载体pK18-ΔleuD中包含ΔleuD的 Up-Down DNA 1320bp（序列如SEQ ID No.14所示）。

将该载体中ΔleuD的 Up-Down DNA进行测序，将测序正确的敲除质粒pK18-ΔleuD电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：

P25: 5' ACCCTGCCAA CCGACGAAGG 3'（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260leuC基因内部）（SEQ ID No.39），

P26: 5' CCGTCAACCG ACTGTTCGGC 3'（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_ RS07110基因内部）（SEQ ID No.40）。

上述PCR同时扩增出大小1320 bp及1840 bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1840bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15%蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P25/P26引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1320 bp条带的菌株为leuD基因编码区被敲除的阳性菌株leuD。再次通过P25/P26引物PCR扩增阳性菌株leuD片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-072（谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的leuD基因被敲除）。

实施例6、L-缬氨酸发酵实验

将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对leuD基因编码区进行点突变leuD^C251T及过表达，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。

表3 发酵培养基配方（其余为水）

成分	配方
		硫酸铵	14 g/L
磷酸二氢钾	1 g/L
		磷酸氢二钾	1 g/L
硫酸镁	0.5 g/L
		酵母粉	2 g/L
硫酸亚铁	18 mg/L
		硫酸锰	4.2 mg/L
生物素	0.02 mg/L
		维生素B1	2 mg/L
antifoam（CB-442）消泡剂）	0.5 mL/L
		70%葡萄糖（底糖）	40 g/L

表4 发酵控制工艺

校正DO 100%	温度33 ℃、风量1 L/min、转速400 rpm、罐压0.01 mpa，5 min后标定
		接种量	3.5%
培养温度℃	33 ℃
		pH	pH7.0±0.05
溶氧DO	10-20%
		初始条件	温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.1 L/min、转速400 rpm
全程控制	温度33℃、pH 7.0、罐压0 Mpa、风量0.2 L/min、转速400 rpm
		残糖控制	F12h前0.1-0.2%；F12h后结合DO要求控制残糖≤0.02%
培养成熟标准	OD<sub>610 </sub>30-35；OD<sub>610</sub>＞30后停止通风静止2小时（根据批次实验目的，进行菌体分离或连续催化）
		流加物料	氨水、70%浓糖、5%泡敌
发酵周期	18-20 h左右

表5 L-缬氨酸发酵实验结果

菌株	OD<sub>610</sub>	L-缬氨酸产量（g/L）
			谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260	98.4	84.2
YPV-067	99.4	84.5
			YPV-068	99.0	84.6
YPV-069	99.6	85.2
			YPV-070	99.3	86.0
YPV-071	100.2	85.6
			YPV-072	96.5	82.8

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 北京中科伊品生物科技有限公司

<120> leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L-缬氨酸中的应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaaat ttaccaccca caccggcgtt ggcgttccac tgcagcgatc caacgtggac 60

accgaccaga tcatccccgc cgtctacctc aagcgcgtca cccgcacagg cttcgaagac 120

ggactgtttt ccaactggcg ccaaaacgac cccaactttg tcctcaacac cgacacctac 180

aagaacggct ccgttctcgt agcaggccct gactttggca ccggctcctc ccgcgagcac 240

gccgtctggg cactcatgga ctacggcttc cgcgctgtct tctcctcacg attcgccgac 300

atcttccgcg gcaactccgg aaaagctggc atgctcgccg gcatcatgga acagtccgac 360

atcgaacttc tgtggaagct catggaacaa accccgggcc tcgaactgac cgtgaacctg 420

gaaaagcaga tcgtcactgc aggcgacgta gtgatcagct tcgaagttga cccttacatt 480

cgctggcgtt tgatggaagg cctcgacgac gctggcctga ccctgcgcaa gctcgatgaa 540

attgaagact acgaggctaa gcgccctgcg tttaagccac gcactaacgc ttaa 594

<210> 2

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Lys Phe Thr Thr His Thr Gly Val Gly Val Pro Leu Gln Arg

1 5 10 15

Ser Asn Val Asp Thr Asp Gln Ile Ile Pro Ala Val Tyr Leu Lys Arg

20 25 30

Val Thr Arg Thr Gly Phe Glu Asp Gly Leu Phe Ser Asn Trp Arg Gln

35 40 45

Asn Asp Pro Asn Phe Val Leu Asn Thr Asp Thr Tyr Lys Asn Gly Ser

50 55 60

Val Leu Val Ala Gly Pro Asp Phe Gly Thr Gly Ser Ser Arg Glu His

65 70 75 80

Ala Val Trp Ala Leu Met Asp Tyr Gly Phe Arg Ala Val Phe Ser Ser

85 90 95

Arg Phe Ala Asp Ile Phe Arg Gly Asn Ser Gly Lys Ala Gly Met Leu

100 105 110

Ala Gly Ile Met Glu Gln Ser Asp Ile Glu Leu Leu Trp Lys Leu Met

115 120 125

Glu Gln Thr Pro Gly Leu Glu Leu Thr Val Asn Leu Glu Lys Gln Ile

130 135 140

Val Thr Ala Gly Asp Val Val Ile Ser Phe Glu Val Asp Pro Tyr Ile

145 150 155 160

Arg Trp Arg Leu Met Glu Gly Leu Asp Asp Ala Gly Leu Thr Leu Arg

165 170 175

Lys Leu Asp Glu Ile Glu Asp Tyr Glu Ala Lys Arg Pro Ala Phe Lys

180 185 190

Pro Arg Thr Asn Ala

195

<210> 3

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaaaaat ttaccaccca caccggcgtt ggcgttccac tgcagcgatc caacgtggac 60

accgaccaga tcatccccgc cgtctacctc aagcgcgtca cccgcacagg cttcgaagac 120

ggactgtttt ccaactggcg ccaaaacgac cccaactttg tcctcaacac cgacacctac 180

aagaacggct ccgttctcgt agcaggccct gactttggca ccggctcctc ccgcgagcac 240

gccgtctggg tactcatgga ctacggcttc cgcgctgtct tctcctcacg attcgccgac 300

atcttccgcg gcaactccgg aaaagctggc atgctcgccg gcatcatgga acagtccgac 360

atcgaacttc tgtggaagct catggaacaa accccgggcc tcgaactgac cgtgaacctg 420

gaaaagcaga tcgtcactgc aggcgacgta gtgatcagct tcgaagttga cccttacatt 480

cgctggcgtt tgatggaagg cctcgacgac gctggcctga ccctgcgcaa gctcgatgaa 540

attgaagact acgaggctaa gcgccctgcg tttaagccac gcactaacgc ttaa 594

<210> 4

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Lys Phe Thr Thr His Thr Gly Val Gly Val Pro Leu Gln Arg

1 5 10 15

Ser Asn Val Asp Thr Asp Gln Ile Ile Pro Ala Val Tyr Leu Lys Arg

20 25 30

Val Thr Arg Thr Gly Phe Glu Asp Gly Leu Phe Ser Asn Trp Arg Gln

35 40 45

Asn Asp Pro Asn Phe Val Leu Asn Thr Asp Thr Tyr Lys Asn Gly Ser

50 55 60

Val Leu Val Ala Gly Pro Asp Phe Gly Thr Gly Ser Ser Arg Glu His

65 70 75 80

Ala Val Trp Val Leu Met Asp Tyr Gly Phe Arg Ala Val Phe Ser Ser

85 90 95

Arg Phe Ala Asp Ile Phe Arg Gly Asn Ser Gly Lys Ala Gly Met Leu

100 105 110

Ala Gly Ile Met Glu Gln Ser Asp Ile Glu Leu Leu Trp Lys Leu Met

115 120 125

Glu Gln Thr Pro Gly Leu Glu Leu Thr Val Asn Leu Glu Lys Gln Ile

130 135 140

Val Thr Ala Gly Asp Val Val Ile Ser Phe Glu Val Asp Pro Tyr Ile

145 150 155 160

Arg Trp Arg Leu Met Glu Gly Leu Asp Asp Ala Gly Leu Thr Leu Arg

165 170 175

Lys Leu Asp Glu Ile Glu Asp Tyr Glu Ala Lys Arg Pro Ala Phe Lys

180 185 190

Pro Arg Thr Asn Ala

195

<210> 5

<211> 1330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtcaa gatcgacacc gtcttcctgg 60

gatcctgcac caacgcccgc atcgaagacc tgcagatcgc cgctgacatc ctcaagggcc 120

acaaaatcgc cgacggcatg cgcatgatgg tcgtgccttc ctccacctgg atcaagcaag 180

aggccgaagc actcggactg gacaaaatct tcaccgacgc tggcgctgaa tggcgtaccg 240

caggctgctc catgtgcctg ggcatgaacc cagaccaact gaagccaggc gagcgctctg 300

catccacctc caaccgaaac ttcgaaggac gccaaggacc aggaggccgc acccacctgg 360

tatccccagc agtcgcagcc gccaccgcaa tccgcggcac cctgtcctca cctgcagata 420

tctaaggaag gctagaaaaa gaatggaaaa atttaccacc cacaccggcg ttggcgttcc 480

actgcagcga tccaacgtgg acaccgacca gatcatcccc gccgtctacc tcaagcgcgt 540

cacccgcaca ggcttcgaag acggactgtt ttccaactgg cgccaaaacg accccaactt 600

tgtcctcaac accgacacct acaagaacgg ctccgttctc gtagcaggcc ctgactttgg 660

caccggctcc tcccgcgagc acgccgtctg ggtactcatg gactacggct tccgcgctgt 720

cttctcctca cgattcgccg acatcttccg cggcaactcc ggaaaagctg gcatgctcgc 780

cggcatcatg gaacagtccg acatcgaact tctgtggaag ctcatggaac aaaccccggg 840

cctcgaactg accgtgaacc tggaaaagca gatcgtcact gcaggcgacg tagtgatcag 900

cttcgaagtt gacccttaca ttcgctggcg tttgatggaa ggcctcgacg acgctggcct 960

gaccctgcgc aagctcgatg aaattgaaga ctacgaggct aagcgccctg cgtttaagcc 1020

acgcactaac gcttaagttt cagtctgata gcgaaagcac cccgcaacct tcattgtcgc 1080

ggggtgcatt tgtgcgtctt ggtgggcgag tggagtgggc atgtctggaa tagaccaaga 1140

ggccctggat tcccttaagg tcttggtctt tttcgtacgt tttgaggcct gggaagtgca 1200

tatccagacc aagggacccc ggcaagccaa gacccttggt ttaatatgac gttccgcccc 1260

gagcaagccg aaaccattac ctagaacgca tggggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg 1320

gtcatagctg 1330

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt accccattag 60

aaagtgaaaa ttcactgatt ctagccagtc acgctgggaa tcattacatg ggccttcttc 120

gatcattcca tgatcgacaa gaaaagcctc acgttcatca ggttgtaaat aggggacagt 180

agacattaat tacacctaaa aagaaaaggg cccccatgag gcgcatcgtt gagaggcgtt 240

gggggtgctg ttggcttcta cgatatatct aattttgcct gatgtgtcag tagctcgaac 300

gtcactttca cttgtcgtct gaagtttcga tgtttctgca ccataaacgg tgtttatgaa 360

ttatcccccc ctctaccccc cgggggtgag gttttcgctg agaaggctgg cttcaaacgg 420

gggctggaca cgtacgcgga gatggcgacg cgttctgtca cgaatcgtgc gttgcgtgct 480

ggccattccg ccacccaagc cagatccagg tcatgagggc taccaggcca cacagaagca 540

gcgctaccta gaacgccaga tcagggcgtc gaaacggatg gaagctgcag ccatcgaccc 600

tagagacatt gacaccgcaa aacagcgcat acgggcatac caggcaaaac tacgcgacca 660

catcaaacag cacgacctgc caaggcgcag acaccgagaa cagattaaaa tgcgctaaag 720

aagttaacat catgctgcca ccgcccaagc gggaaacatt gcgattgggg ttgggtcttt 780

gaatcttaca tttca 795

<210> 7

<211> 887

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acattgcgat tggggttggg tctttgaatc ttacatttca tagagtgaga cgcttgcagg 60

ttggggttta aacgttgtgg atatcgattc cctgcagggg agctgtataa agtgtgaggt 120

aaatctaaaa cgcaggacgt gacatttttg gcgcgtttta ggttatactg tctcagacaa 180

cgaaactctt gtcccacatt gtgagatttg cttgctagaa tgtgggctag aaattcctga 240

aaatttttac gcactgtaag gacggtgagt tccatggaaa aatttaccac ccacaccggc 300

gttggcgttc cactgcagcg atccaacgtg gacaccgacc agatcatccc cgccgtctac 360

ctcaagcgcg tcacccgcac aggcttcgaa gacggactgt tttccaactg gcgccaaaac 420

gaccccaact ttgtcctcaa caccgacacc tacaagaacg gctccgttct cgtagcaggc 480

cctgactttg gcaccggctc ctcccgcgag cacgccgtct gggcactcat ggactacggc 540

ttccgcgctg tcttctcctc acgattcgcc gacatcttcc gcggcaactc cggaaaagct 600

ggcatgctcg ccggcatcat ggaacagtcc gacatcgaac ttctgtggaa gctcatggaa 660

caaaccccgg gcctcgaact gaccgtgaac ctggaaaagc agatcgtcac tgcaggcgac 720

gtagtgatca gcttcgaagt tgacccttac attcgctggc gtttgatgga aggcctcgac 780

gacgctggcc tgaccctgcg caagctcgat gaaattgaag actacgaggc taagcgccct 840

gcgtttaagc cacgcactaa cgcttaatca aaaaccccaa cccgcac 887

<210> 8

<211> 887

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acattgcgat tggggttggg tctttgaatc ttacatttca tagagtgaga cgcttgcagg 60

ttggggttta aacgttgtgg atatcgattc cctgcagggg agctgtataa agtgtgaggt 120

aaatctaaaa cgcaggacgt gacatttttg gcgcgtttta ggttatactg tctcagacaa 180

cgaaactctt gtcccacatt gtgagatttg cttgctagaa tgtgggctag aaattcctga 240

aaatttttac gcactgtaag gacggtgagt tccatggaaa aatttaccac ccacaccggc 300

gttggcgttc cactgcagcg atccaacgtg gacaccgacc agatcatccc cgccgtctac 360

ctcaagcgcg tcacccgcac aggcttcgaa gacggactgt tttccaactg gcgccaaaac 420

gaccccaact ttgtcctcaa caccgacacc tacaagaacg gctccgttct cgtagcaggc 480

cctgactttg gcaccggctc ctcccgcgag cacgccgtct gggtactcat ggactacggc 540

ttccgcgctg tcttctcctc acgattcgcc gacatcttcc gcggcaactc cggaaaagct 600

ggcatgctcg ccggcatcat ggaacagtcc gacatcgaac ttctgtggaa gctcatggaa 660

caaaccccgg gcctcgaact gaccgtgaac ctggaaaagc agatcgtcac tgcaggcgac 720

gtagtgatca gcttcgaagt tgacccttac attcgctggc gtttgatgga aggcctcgac 780

gacgctggcc tgaccctgcg caagctcgat gaaattgaag actacgaggc taagcgccct 840

gcgtttaagc cacgcactaa cgcttaatca aaaaccccaa cccgcac 887

<210> 9

<211> 769

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agccacgcac taacgcttaa tcaaaaaccc caacccgcac atttttagat ttctattttg 60

tgtacatagg gttcggaaca aagcttaaac catccccaat tgaaatgtcg ttacacaccc 120

acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc gccccccacg 180

ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc gaaatagtga 240

ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc acccacttgt 300

cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc tcgaaccggg 360

caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg atgcttaatg 420

tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480

ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540

gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt gtggacgtat 600

tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660

ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc ctgcagctcc 720

gctaaaccaa cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctg 769

<210> 10

<211> 1445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggttagatt ttttggcccc tcccaatggg actcattaat gagatttcgg tagtgccgtg 60

cgtaccccat tagaaagtga aaattcactg attctagcca gtcacgctgg gaatcattac 120

atgggccttc ttcgatcatt ccatgatcga caagaaaagc ctcacgttca tcaggttgta 180

aataggggac agtagacatt aattacacct aaaaagaaaa gggcccccat gaggcgcatc 240

gttgagaggc gttgggggtg ctgttggctt ctacgatata tctaattttg cctgatgtgt 300

cagtagctcg aacgtcactt tcacttgtcg tctgaagttt cgatgtttct gcaccataaa 360

cggtgtttat gaattatccc cccctctacc ccccgggggt gaggttttcg ctgagaaggc 420

tggcttcaaa cgggggctgg acacgtacgc ggagatggcg acgcgttctg tcacgaatcg 480

tgcgttgcgt gctggccatt ccgccaccca agccagatcc aggtcatgag ggctaccagg 540

ccacacagaa gcagcgctac ctagaacgcc agatcagggc gtcgaaacgg atggaagctg 600

cagccatcga ccctagagac attgacaccg caaaacagcg catacgggca taccaggcaa 660

aactacgcga ccacatcaaa cagcacgacc tgccaaggcg cagacaccga gaacagatta 720

aaatgcgcta aagaagttaa catcatgctg ccaccgccca agcgggaaac attgcgattg 780

gggttgggtc tttgaatctt acatttcata gagtgagacg cttgcaggtt ggggtttaaa 840

cgttgtggat atcgattccc tgcaggggag ctgtataaag tgtgaggtaa atctaaaacg 900

caggacgtga catttttggc gcgttttagg ttatactgtc tcagacaacg aaactcttgt 960

cccacattgt gagatttgct tgctagaatg tgggctagaa attcctgaaa atttttacgc 1020

actgtaagga cggtgagttc catggaaaaa tttaccaccc acaccggcgt tggcgttcca 1080

ctgcagcgat ccaacgtgga caccgaccag atcatccccg ccgtctacct caagcgcgtc 1140

acccgcacag gcttcgaaga cggactgttt tccaactggc gccaaaacga ccccaacttt 1200

gtcctcaaca ccgacaccta caagaacggc tccgttctcg tagcaggccc tgactttggc 1260

accggctcct cccgcgagca cgccgtctgg gtactcatgg actacggctt ccgcgctgtc 1320

ttctcctcac gattcgccga catcttccgc ggcaactccg gaaaagctgg catgctcgcc 1380

ggcatcatgg aacagtccga catcgaactt ctgtggaagc tcatggaaca aaccccgggc 1440

ctcga 1445

<210> 11

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcgttggcg ttccactgca gcgatccaac gtggacaccg accagatcat ccccgccgtc 60

tacctcaagc gcgtcacccg cacaggcttc gaagacggac tgttttccaa ctggcgccaa 120

aacgacccca actttgtcct caacaccgac acctacaaga acggctccgt tctcgtagca 180

ggccctgact ttggcaccgg ctcctcccgc gagcacgccg tctgggtact catggactac 240

ggcttccgcg ctgtcttctc ctcacgattc gccgacatct tccgcggcaa ctccggaaaa 300

gctggcatgc tcgccggcat catggaacag tccgacatcg aacttctgtg gaagctcatg 360

gaacaaaccc cgggcctcga actgaccgtg aacctggaaa agcagatcgt cactgcaggc 420

gacgtagtga tcagcttcga agttgaccct tacattcgct ggcgtttgat ggaaggcctc 480

gacgacgctg gcctgaccct gcgcaagctc gatgaaattg aagactacga ggctaagcgc 540

cctgcgttta agccacgcac taacgcttaa tcaaaaaccc caacccgcac atttttagat 600

ttctattttg tgtacatagg gttcggaaca aagcttaaac catccccaat tgaaatgtcg 660

ttacacaccc acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc 720

gccccccacg ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc 780

gaaatagtga ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc 840

acccacttgt cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc 900

tcgaaccggg caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg 960

atgcttaatg tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa 1020

ccccactggc ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca 1080

ccacacttgc gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt 1140

gtggacgtat tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc 1200

gtcaatgttc ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc 1260

ctgcagctcc gctaaaccaa caggtagatc ataaaaatgg cgatactcaa caccgctgta 1320

attgagtttt ttcgcggact ccggaaccag cgcaacaccc agtccaga 1368

<210> 12

<211> 917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctctt tgaatcttac atttcataga 60

gtgagacgct tgcaggttgg ggtttaaacg ttgtggatat cgattccctg caggggagct 120

gtataaagtg tgaggtaaat ctaaaacgca ggacgtgaca tttttggcgc gttttaggtt 180

atactgtctc agacaacgaa actcttgtcc cacattgtga gatttgcttg ctagaatgtg 240

ggctagaaat tcctgaaaat ttttacgcac tgtaaggacg gtgagttcca tggaaaaatt 300

taccacccac accggcgttg gcgttccact gcagcgatcc aacgtggaca ccgaccagat 360

catccccgcc gtctacctca agcgcgtcac ccgcacaggc ttcgaagacg gactgttttc 420

caactggcgc caaaacgacc ccaactttgt cctcaacacc gacacctaca agaacggctc 480

cgttctcgta gcaggccctg actttggcac cggctcctcc cgcgagcacg ccgtctgggc 540

actcatggac tacggcttcc gcgctgtctt ctcctcacga ttcgccgaca tcttccgcgg 600

caactccgga aaagctggca tgctcgccgg catcatggaa cagtccgaca tcgaacttct 660

gtggaagctc atggaacaaa ccccgggcct cgaactgacc gtgaacctgg aaaagcagat 720

cgtcactgca ggcgacgtag tgatcagctt cgaagttgac ccttacattc gctggcgttt 780

gatggaaggc ctcgacgacg ctggcctgac cctgcgcaag ctcgatgaaa ttgaagacta 840

cgaggctaag cgccctgcgt ttaagccacg cactaacgct taagttttgg cggatgagag 900

aagattttca gcctgat 917

<210> 13

<211> 917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctctt tgaatcttac atttcataga 60

gtgagacgct tgcaggttgg ggtttaaacg ttgtggatat cgattccctg caggggagct 120

gtataaagtg tgaggtaaat ctaaaacgca ggacgtgaca tttttggcgc gttttaggtt 180

atactgtctc agacaacgaa actcttgtcc cacattgtga gatttgcttg ctagaatgtg 240

ggctagaaat tcctgaaaat ttttacgcac tgtaaggacg gtgagttcca tggaaaaatt 300

taccacccac accggcgttg gcgttccact gcagcgatcc aacgtggaca ccgaccagat 360

catccccgcc gtctacctca agcgcgtcac ccgcacaggc ttcgaagacg gactgttttc 420

caactggcgc caaaacgacc ccaactttgt cctcaacacc gacacctaca agaacggctc 480

cgttctcgta gcaggccctg actttggcac cggctcctcc cgcgagcacg ccgtctgggt 540

actcatggac tacggcttcc gcgctgtctt ctcctcacga ttcgccgaca tcttccgcgg 600

caactccgga aaagctggca tgctcgccgg catcatggaa cagtccgaca tcgaacttct 660

gtggaagctc atggaacaaa ccccgggcct cgaactgacc gtgaacctgg aaaagcagat 720

cgtcactgca ggcgacgtag tgatcagctt cgaagttgac ccttacattc gctggcgttt 780

gatggaaggc ctcgacgacg ctggcctgac cctgcgcaag ctcgatgaaa ttgaagacta 840

cgaggctaag cgccctgcgt ttaagccacg cactaacgct taagttttgg cggatgagag 900

aagattttca gcctgat 917

<210> 14

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaccc tgccaaccga cgaaggcgca 60

acctttgaca aggtcgtaga aatcgatggc tccgcactga ccccattcat cacctggggc 120

accaacccag gccaaggtct gccactgagc gaaaccgtgc caaacccaga agacttcacc 180

aacgacaacg acaaggcagc agccgaaaag gcactgcagt acatggacct ggtaccagga 240

accccactgc gcgacatcaa gatcgacacc gtcttcctgg gatcctgcac caacgcccgc 300

atcgaagacc tgcagatcgc cgctgacatc ctcaagggcc acaaaatcgc cgacggcatg 360

cgcatgatgg tcgtgccttc ctccacctgg atcaagcaag aggccgaagc actcggactg 420

gacaaaatct tcaccgacgc tggcgctgaa tggcgtaccg caggctgctc catgtgcctg 480

ggcatgaacc cagaccaact gaagccaggc gagcgctctg catccacctc caaccgaaac 540

ttcgaaggac gccaaggacc aggaggccgc acccacctgg tatccccagc agtcgcagcc 600

gccaccgcaa tccgcggcac cctgtcctca cctgcagata tctaaggaag gctagaaaaa 660

gagtttcagt ctgatagcga aagcaccccg caaccttcat tgtcgcgggg tgcatttgtg 720

cgtcttggtg ggcgagtgga gtgggcatgt ctggaataga ccaagaggcc ctggattccc 780

ttaaggtctt ggtctttttc gtacgttttg aggcctggga agtgcatatc cagaccaagg 840

gaccccggca agccaagacc cttggtttaa tatgacgttc cgccccgagc aagccgaaac 900

cattacctag aacgcatgaa aagtgcccct ctaggatggg ttctaagccc ctaacaggct 960

caaacccaag cccatgcccg ctcgccaaac cggaggcctt aaacgcgctc ctatttaacc 1020

ggcagggaac tcgccaggta atcagcgccg gtgaacacac cgtcgtgaaa gctcaacacc 1080

cacacgctgc cctttttcgc cttgatcttc tcatcgatag ggagggtgcc gttctcggag 1140

aaccatttga tcatttccgg aatgatgtcg ccctgcccaa cgatcatcgg cacgccacct 1200

tgtgcaacca cgtcggtgaa gcgcttcttg caggcctcgg gatcggtttc ccaggcgtcg 1260

tcgccgaaca gtcggttgac gggggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg 1320

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtcaa gatcgacacc gtcttc 56

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agccgtagtc catgagtacc cagacggcgt gctc 34

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagcacgccg tctgggtact catggactac ggct 34

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca tgcgttctag gtaatggt 58

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctggcgccaa aacgacccca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cacagaagtt cgatgtcgga 20

<210> 21

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt acccca 56

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgaaatgtaa gattcaaaga cccaacccca atcgcaatgt 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acattgcgat tggggttggg tctttgaatc ttacatttca 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgggtggtaa atttttccat ggaactcacc gtccttacag 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctgtaaggac ggtgagttcc atggaaaaat ttaccaccca 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtgcgggttg gggtttttga ttaagcgtta gtgcgtggct 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agccacgcac taacgcttaa tcaaaaaccc caacccgcac 40

<210> 28

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgt tggtttagcg gagctgca 58

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cggttagatt ttttggcccc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tcgaggcccg gggtttgttc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggcgttggcg ttccactgca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tctggactgg gtgttgcgct 20

<210> 33

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctctt tgaatcttac atttca 56

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacttaagc gttagtgcgt ggct 54

<210> 35

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaccc tgccaaccga cgaagg 56

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tttcgctatc agactgaaac tctttttcta gccttcctta 40

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

taaggaaggc tagaaaaaga gtttcagtct gatagcgaaa 40

<210> 38

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccc gtcaaccgac tgttcggc 58

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

accctgccaa ccgacgaagg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ccgtcaaccg actgttcggc 20

Claims

1. leuD蛋白突变体，其特征在于：所述leuD蛋白突变体为下述任一种：

b1）氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为下述任一种：

1）编码权利要求1所述leuD蛋白突变体的核酸分子；

2）编码序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

3.权利要求1所述leuD蛋白突变体的相关生物材料，其特征在于：所述相关生物材料为下述任一种：

c1）含有权利要求3所述任一核酸分子的表达盒；

c2）含有权利要求3所述任一核酸分子的重组载体、或含有c1）所述表达盒的重组载体；

c3）含有权利要求3所述任一核酸分子的重组微生物、或含有c1）所述表达盒的重组微生物、或含有c2）所述重组载体的重组微生物。

4.权利要求1所述的leuD蛋白突变体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的相关生物材料、蛋白质leuD或所述蛋白质leuD的相关生物材料在如下任一中的应用：

（1）制备L-缬氨酸；

（2）提高微生物L-缬氨酸的产量；

（3）构建产L-缬氨酸工程菌；

所述蛋白质leuD为下述任一种：

a1）氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；

a4）在a1）-a3）中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白；

所述蛋白质leuD的相关生物材料为下述任一种：

d1）编码所述蛋白质leuD的核酸分子；

d2）含有d1）所述核酸分子的表达盒；

d4）含有d1）所述核酸分子的重组微生物、或含有d2）所述表达盒的重组微生物、或含有d3）所述重组载体的重组微生物；

d1）所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：

1）编码序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2）核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

5.一种提高微生物L-缬氨酸的产量的方法，其特征在于，所述方法包括任一种：

M1）在微生物中过表达leuD蛋白突变体基因或提高微生物中leuD蛋白突变体的丰度或提高leuD蛋白突变体的活性；所述leuD蛋白突变体为权利要求1或2所述leuD蛋白突变体，所述leuD蛋白突变体基因为编码权利要求1或2所述leuD蛋白突变体的基因，实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高；

M2）在微生物中过表达蛋白质leuD基因或提高微生物中蛋白质leuD的丰度或提高微生物中蛋白质leuD的活性；所述蛋白质leuD为权利要求4中所述的蛋白质leuD，所述蛋白质leuD基因为编码权利要求4中所述的蛋白质leuD的基因，实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高；

M3）将微生物基因组中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，实现所述微生物L-缬氨酸的产量提高。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第84位的丙氨酸残基突变为另一种氨基酸残基。

7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第84位的丙氨酸残基突变为缬氨酸残基。

8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述突变为通过定点突变方法将SEQ IDNo.1所示DNA分子中第251位的核苷酸C突变为T。

9.一种构建产L-缬氨酸工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

F3）将微生物基因组蛋白质leuD基因替换为leuD蛋白突变体基因，得到所述L-产缬氨酸工程菌；

所述蛋白质leuD基因为编码权利要求4中所述的蛋白质leuD的基因，所述leuD蛋白突变体基因为编码权利要求1或2所述leuD蛋白突变体的基因。

10.一种制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求9所述方法构建的产L-缬氨酸工程菌生产L-缬氨酸。