JP2010200645A

JP2010200645A - Ｌ−アミノ酸の製造法

Info

Publication number: JP2010200645A
Application number: JP2009048179A
Authority: JP
Inventors: Yuri Nagai; 由利長井; Yuri Masumitsu; 裕梨益満; Takuji Ueda; 拓嗣植田
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2010-09-16

Abstract

【課題】改良された、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供する。
【解決手段】腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌であって、腸内細菌に属する細菌で発現させたときに同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかを付与する機能を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細菌を、培地に培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取することによって、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。

Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられている（特許文献１〜９）。

アッケシソウ（Salicomia europeae）は、塩類が集積した乾燥地でも生育が可能な塩生植物として知られており、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のファシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（Fasciclin-like arabinogalactan protein）と部分的に相同性のあるアラビノガラクタンタンパク質が、アッケシソウの塩ストレス耐性に関与することが報告されている（特許文献１０）。

また、アッケシソウ由来のアラビノガラクタンタンパク質を大腸菌内で発現させた場合、その大腸菌は塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、熱ストレス耐性が向上することが報告されている（特許文献１０）。

しかしながら、アラビノガラクタンタンパク質とＬ−アミノ酸生産との関連についての知見は現在までに知られていない。

欧州特許公開EP0643135B 欧州特許公開EP0733712B 欧州特許公開EP1477565A 欧州特許公開EP0796912A 欧州特許公開EP0837134A 国際公開WO01/53459 欧州特許公開EP1170376A 国際公開WO2005/010175 国際公開WO96/17930 国際公開WO2006/013807

本発明は、改良された、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、させることによって、腸内細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成した
すなわち本発明は、以下のとおりである。

（１）腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地に培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌は、腸内細菌に属する細菌で発現させたときに同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかを付与する機能を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細菌である方法。
（２）前記アラビノガラクタンタンパク質が、アッケシソウのアラビノガラクタンタンパク質である、前記方法。
（３）前記アラビノガラクタンタンパク質が、少なくとも配列番号２の１〜３７５位のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、前記方法。
（４）前記アラビノガラクタンタンパク質が、少なくとも配列番号２の１〜４０２位のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、前記方法。
（５）前記アラビノガラクタンタンパク質が、分泌シグナルペプチドが付加された形態で前記細菌で発現される、前記方法。
（６）前記分泌シグナルペプチドが配列番号２の−１〜−２５位のアミノ酸配列からなる、前記方法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、及びＬ−システインからなる群から選択される、前記方法。
（８）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、前記方法。
（９）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、前記方法。
（１０）前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である前記方法。

本発明により、効率よくＬ−アミノ酸を製造することができる。

＜１＞本発明で使用される細菌
本発明で使用される細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌であり、かつ、腸内細菌科に属する細菌で発現させたときに同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかを付与する機能を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細菌である。以下、前記タンパク質をSeFLAタンパク質、同タンパク質をコードする遺伝子を「SeFLA遺伝子」と呼ぶことがある。本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、SeFLA遺伝子で形質転換することによって取得することができる。また、本発明の細菌は、SeFLA遺伝子で形質転換された腸内細菌科に属する細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与するか、SeFLA遺伝子で形質転換された腸内細菌科に属する細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。

以下に、SeFLA遺伝子で形質転換される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。

＜１−１＞腸内細菌科に属する細菌及びＬ−アミノ酸生産能の付与及び増強
本発明の細菌は、腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌である。
腸内細菌科は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
上記細菌の中では、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌が特に好ましい。

本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。エシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E.coli）が挙げられるが、これに限定されない。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655
(ATCC 47076)等が挙げられる。

これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O.
Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。

尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。

パントエア属細菌の代表的な細菌として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。

パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)

これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。

エルビニア・アミロボーラATCC15580株
エルビニア・カロトボーラATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)

本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンを含む。これらの中では、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインが好ましく、特に、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。
また、本発明においてＬ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸及び／またはその塩、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む。

以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌Ｌ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。

Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理
し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。

上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。

以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。

Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。

スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。

このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。

また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。

Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。

Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を
有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（aspC）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。

Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。

酵素活性の低下は、例えば、染色体上の標的酵素遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、コード領域中に他の配列を挿入することによって達成される。これらの手法は、遺伝子破壊とも呼ばれる。また、標的遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することなどによって、標的遺伝子の発現を低下させることによっても、同遺伝子を不活化することができる。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。

さらには、染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、標的遺伝子の不活化は、染色体上の標的遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of t
he National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）

好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。

pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。

Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ
ードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。

hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メ
チルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。

シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。

具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。

パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロ
バクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。

また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。

さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、実施例に記載したように、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。

Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝
子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。

Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ
−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami

Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。

Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 03567
39, 及び米国特許第5,998,178号)。

Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。

本発明に用いる細菌は、グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。

＜１−２＞SeFLA遺伝子による形質転換
SeFLA遺伝子は、腸内細菌科に属する細菌で発現させたときに同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかを付与する機能を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子である。同遺伝子で腸内細菌科に属する細菌を形質転換し、前記タンパク質を発現させることにより、非形質転換株に比べて、前記細菌の塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかが向上する。このような、前記タンパク質の機能を「SeFLA活性」ということがある。本発明において、「SeFLA遺伝子で細菌を形質転換する」とは、同細菌にSeFLA活性を付与することを意味する。
SeFLA活性を付与された細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能が向上する。したがって、本発明においてSeFLA活性とは、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させる活性でもある。

SeFLA遺伝子としては、アッケシソウ（Salicomia europeae）のSeFLA遺伝子が挙げられる。アッケシソウのSeFLA遺伝子は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のファシクリン様アラビノガラクタンタンパク質（Fasciclin-like arabinogalactan protein）と部分的に相同性のあるアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子として同定された。同遺伝子で細菌を形質転換することにより、同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、又は熱ストレス耐性が向上することが知られている（WO2006/013807）。

尚、「塩ストレス耐性（耐塩性）」とは、所定濃度の塩に対する活性をいう。例えば、塩ストレス耐性を付与された細菌は、非改変株に比べて、所定濃度の塩、例えば0.5〜2MのNaCl存在下において統計学上有意に優れた増殖を示すことになるが、これに限定されない。
「水分ストレス耐性（耐乾性）」とは、所定濃度のソルビトールに対する活性をいう。例えば、水分ストレス耐性を付与された細菌は、非改変株に比べて、所定濃度、例えば1〜2Mのソルビトール存在下において統計学上有意に優れた増殖を示すことになるが、これに限定されない。
また、「熱ストレス耐性（耐熱性）」とは、高温、例えば45〜55℃に対する耐性をいう。例えば、熱ストレス耐性を付与された細菌は、非改変株に比べて、高温度下において統計学上有意に優れた増殖を示すが、これに限定されるものではない。

アッケシソウのSeFLA遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。同塩基配列は、427アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレーム（120〜1403位。1401〜1403は終止コドン）を含む。このオープンリーディングフレームがコードし得るアミノ酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列について、SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて解析した結果から、1〜25位のアミノ酸配列は分泌シグナルペプチドと考えられている。また、big-PI plant predictor（http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/plant_server.html）を用いて解析した結果、376〜377位のアミノ酸配列が、疎水性グリ
コシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーシグナル配列と考えられている。配列番号２においてアミノ酸残基に付されている番号は、上記推定に基づくものである。

配列番号２のアミノ酸配列全長（配列番号２の-25〜402位）を有するタンパク質（以下、「全長SeFLA」ともいう）をエシェリヒア・コリで発現させると、塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性のいずれもが、非改変株に比べて向上する。
また、分泌シグナルペプチドと推定される部分を除いたアミノ酸配列（配列番号２の1〜402位）からなるタンパク質（以下、「SeFLAΔN」ともいう）、及び、GPIアンカーシグナル配列と推定される部分を除いたアミノ酸配列（配列番号２の-25〜375位）からなるタンパク質（以下、「SeFLAΔC」ともいう）を、各々エシェリヒア・コリで発現させると、塩ストレス耐性及び水分ストレス耐性は非改変株に比べて向上する。しかし、水分ストレス耐性を向上される効果は、全長SeFLAに比べると低い。また、SeFLAΔN及びSeFLAΔCのいずれも、熱ストレス耐性を向上される機能は低い（以上、「WO2006/013807」参照）。

本発明においては、SeFLA遺伝子がコードするアラビノガラクタンタンパク質は、分泌シグナルペプチドもしくはGPIアンカーシグナル配列、又はこれらの両方が付加された形態で発現されることが好ましい。分泌シグナルペプチドは、SeFLAタンパク質のN末端側に付加される。GPIアンカーシグナル配列はSeFLAタンパク質のC末端側に付加される。しかし、分泌シグナルペプチドもしくはGPIアンカーシグナル配列、又はこれらの両方を含まない形態で発現させてもよい。

分泌シグナルペプチド及びGPIアンカーシグナル配列は、SeFLA固有の分泌シグナルペプチド及びGPIアンカーシグナル配列であってもよいが、他のタンパク質の分泌シグナルペプチド又はGPIアンカーシグナル配列であってもよい。このような分泌シグナルペプチドとしては、 Saccharomyces cerevisiae の分泌シグナルペプチドが挙げられる。また、GPIアンカーシグナル配列としては、細胞壁タンパク質のGPIアンカーシグナル配列が挙げられる。

本発明において、単に「SeFLA遺伝子」というときは、特記しない限り、固有の分泌シグナルペプチド及びGPIアンカーシグナル配列を含むSeFLAタンパク質、分泌シグナルペプチド及び／又はGPIアンカーシグナル配列を他のタンパク質由来のものに置換えたSeFLAタンパク質、及び分泌シグナルペプチド及び／又はGPIアンカーシグナル配列を含まないSeFLAタンパク質をコードする遺伝子のいずれをも含む。

細菌を、SeFLA遺伝子で形質転換することによって、細菌にSeFLA活性を付与することができる。細菌をSeFLA遺伝子で形質転換するとは、細菌にSeFLA遺伝子を発現可能な形態で導入し、同遺伝子がコードするタンパク質を発現させることをいう。SeFLA遺伝子で細菌形質転換するには、例えば、ベクターにSeFLA遺伝子を挿入し、得られた組換えベクターを宿主微生物に導入する。

形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29、pTWV228、pTWV229（pHSG、pSTV、pTWVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。また、コリネ型細菌用のプラスミドとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 (特開2000-262288号公報参照）、pVK7(米国特許出願公開明細書2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭58-192900号公報)、pCG1(特開昭57-134500号公報)、pCG2（特開昭58-35197号公報）、pCG4、pCG11（特開昭57-183799号公報）、pHK4（特開平5-7491号公報）などが挙げられる。

形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.
Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。

また、SeFLA遺伝子の細菌への導入は、宿主微生物への染色体上への導入によっても達成できる。微生物の染色体上にSeFLA遺伝子を導入するためには、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する方法（特開平2-109985号公報、US5,882,888 EP805867B1）や、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことも可能である。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することにより、目的遺伝子を染色体上に導入することも可能である。また、P1ファージ等のファージを用いたtransductionや、接合伝達ベクターによる染色体上への目的遺伝子の導入も可能である。また、WO03/040373に記載されているように、目的物質生産に不要な遺伝子を標的にしてSeFLA遺伝子を導入することも可能である。このような方法で標的配列に、SeFLA遺伝子を１コピー又は多コピー導入することができる。

染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、目的遺伝子又はその一部と相補的な配列を持つプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。

コピー数は、１コピー以上導入されていればいずれでもよいが、２コピー以上、より好ましくは３コピー以上、さらに好ましくは５コピー以上増幅されていることが好ましい。
さらにSeFLA遺伝子は、下述するように、プロモーター等の発現調節配列の選択と組み合わせることによって、活性を至適化することが可能である。

SeFLA遺伝子を発現させるには、同遺伝子を導入する細菌で機能するプロモーター等の発現調節配列をSeFLAをコードする配列の上流に連結する。腸内細菌科に属する細菌で機能するプロモーターとしては、例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H.1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。

さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を適性化することが可能である。また、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。

本発明においてSeFLA活性が付与されたかどうかの確認は、改変株と親株又は非改変株のSeFLA活性を比較することによって行うことができる。具体的には、SeFLA活性は、WO2006/013807に記載された方法によって、改変株の塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、又は熱ストレス耐性を、親株又は非改変株と比較することによって調べることができる。ここで親株としては、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。

SeFLA遺伝子としては、アッケシソウのSeFLA遺伝子以外にも、同SeFLA遺伝子がコードするタンパク質と相同性の高いタンパク質であって、SeFLA活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、すなわちSeFLA遺伝子のホモログであっもよい。
このようなSeFLA遺伝子ホモログは、上記の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、植物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。

SeFLA遺伝子のホモログは、配列番号２のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、SeFLA活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、SeFLA活性を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、例えば上述の方法でSeFLA活性を調べることによって確認することができる。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。

また、本発明に用いるSeFLA遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、それらの遺伝子の保存的バリアント、すなわち、コードされるタンパク質のSeFLA活性が損なわれない限り、野生型SeFLAタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。野生型SeFLAタンパク質としては、全長SeFLA、分泌シグナルペプチドもしくはGPIアンカーシグナル配列、又はこれらの両方を含まないSeFLAタンパク質（以下、「部分長SeFLA」ということがある）のいずれであってもよいが、分泌シグナルペプチド及びGPIアンカーシグナル配列の両方を含む全長SeFLAであることが好ましい。

ここで、「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には1〜20、好ましくは1〜10、より好ましくは1〜5、特に好ましくは1〜3を意味する。上記変異は機能的に変化しない中性変異である保存的変異が好ましく、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のような
アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、SeFLA遺伝子を保持する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

またSeFLA遺伝子は、配列番号１のうちコード領域（120〜1400位）、又は部分長SeFLAに相当する領域（120〜1319位、195〜1403位、又は195〜1319位）の塩基配列の相補配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、SeFLA活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。特に「ストリンジェントな条件」とは、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAがハイブリダイズする条件が好ましい。

また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。

保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。

上記したSeFLA遺伝子のホモログ及びバリアントに関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強における遺伝子等についても同様に適用される。

＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、SeFLA遺伝子で形質転換された腸内細菌科に属する細菌を培地に培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取することによって、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。

使用する培地は、細菌を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロース、グリセロールを炭素源として用いることが好ましい。なお、シュクロース資化能を持たない株については、シュクロース資化遺伝子を導入することにより、シュクロースを炭素源として使用できるようになる（米国特許第5,175,107号）。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。

これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ホモセリン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。

培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。

培養終了後の培地液からのＬ−アミノ酸の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。本発明において採取されるＬ−アミノ酸は、目的とするＬ−アミノ酸以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ−アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878)。
Ｌ−アミノ酸は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法（Nagai,H.et al.:Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の方法を組み合わせることにより採取できる。

また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。

また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸のカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A）。

塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地中で好気培養するに際して、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又はこれらの両方を、塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用することができる。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させる方法としては、培養中の培地のｐＨが６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、さらに、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することが知られている（特開2002-65287、米国特許出願公開第20020025564号、EP1813677A）。

本発明においては、発酵中の発酵槽内の圧力が正となるように制御すること、及び、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することの両方を行ってもよい。いずれの場合も、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが、好ましくは20mM以上、より好ましくは30mM以上、特に好ましくは40mM以上存在する培養期があるようにすることが
好ましい。発酵槽内圧力、炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスの供給量、又は制限された給気量は、例えば培地中の重炭酸イオン又は炭酸イオンを測定することや、pHやアンモニア濃度を測定することによって、決定することができる。

上記態様においては、培養中の培地のｐＨが６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御する。上記態様によれば、従来の方法に比べて、カウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるためにアンモニアが供給され、塩基性アミノ酸のＮ源となり得る。培地に含まれる塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ等が挙げられる。これらは、好ましくは総カチオンの５０％以下であることが好ましい。

また、発酵中の発酵槽内圧力が正となるようにするには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解し、重炭酸イオン又は炭酸イオンを生じ、これらは塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、さらに好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、培養液に炭酸ガス、又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給することによって、培養液に炭酸ガスを溶解させてもよい。さらには、培養液に炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給しつつ、発酵槽内圧力が正となるように調節してもよい。

発酵槽内圧力を正に調節するには、例えば、給気圧を排気圧よりも高くするように設定すればよい。また、培養液に炭酸ガスを供給する場合は、例えば、純炭酸ガス、又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを吹き込めばよい。

尚、培地に重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させる上記の方法は、単独でもよいし、複数を組み合わせてもよい。

従来法では、通常、生成する塩基牲アミノ酸のカウンタアニオンとすべく、十分量の硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムが、又、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物もしくは塩酸分解物が培地に添加され、これらから与えられる硫酸イオン、塩化物イオンが培地に含まれる。従って、弱酸性である炭酸イオン濃度は培養中極めて低く、ppm単位である。上記態様では、これら硫酸イオン、塩化物イオンを減じ、微生物が発酵中に放出する炭酸ガスを上記発酵環境にて培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとすることに特徴がある。したがって、上記態様においては、硫酸イオンや塩化物イオンを生育に必要な量以上培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。アンモニアは、単独で、又は他の気体とともに培地に供給することができる。

培地に含まれる重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外の他のアニオンの濃度は、微生物の生育に必要な量であれば、低いことが好ましい。このようなアニオンには、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、及び水酸化物イオン等が挙げられる。これらの他のイオンのモル濃度の合計は、好ましくは通常は９００ｍＭ以下、より好ましくは７００ｍＭ以下、特により好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３００ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。

上記態様においては、硫酸イオン、及び／又は、塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであり、培地に含まれる硫酸イオンもしくは塩化物イオン、又はこれらの合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。

通常は、塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として培地に硫酸アンモニウムを添加すると、硫酸イオンによって培養液中の炭酸ガスが放出してしまう。それに対して、上記態様においては、過剰量の硫酸アンモニウムを培地に添加する必要がないので、炭酸ガスを発酵液中に容易に溶解させることができる。

また、上記態様においては、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」程度に培地中の総アンモニア濃度を制御することが好ましい。そのような条件としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の収率及び／又は生産性が得られる条件が含まれる。具体的には、培地中の総アンモニア濃度としては、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２５０ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、前記「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度の上限値範囲としてもよい。

一方、微生物の生育及び塩基性物質の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度としては、培養中にアンモニアが継続して枯渇しない窒素源が不足することにより微生物による目的物質の生産性を低下させない限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときの濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。

本発明で用いられる培地は、栄養源として炭素源、窒素源とを含んでいればいずれでもよい。また、本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができる。

上記流加培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また、連続培養とは、培養中の容器に培地を連続的又は間欠的に流加するとともに、容器から培地（通常、流加する培地と当量）を抜き取る方法をいう。また、本明細書において「初発培地」とは、流加培養又は連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地のことを意味し、「流加培地」とは、流加培養又は連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地のことを意味する。流加培地は、微生物の生育に必要な成分の全てを含んでいてもよいが、一部のみを含むものであってもよい。また、本明細書において「発酵培地」とは、発酵槽中の培地を意味し、この発酵培地から目的物質が回収される。また、本明細書において、「発酵槽」とは、塩基性アミノ酸生産を行う器を意味し、その形状は問わず、発酵タンクを用いてもジャーファーメンターを用いてもよい。また、その容量は目的物質を生成・回収できる容量であればいずれでもよい。

培地に含まれる炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロー
ス、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、特にグルコース、スクロースが好ましい。その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、メタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。また、炭素源となる原料としては、ケインモラセス、ビートモラセス、ハイテストモラセス、シトラスモラセス、転化糖を用いてもよいし、セルロース、デンプン、コーン、シリアル、タピオカ等の天然原料の加水分解物を用いてもよい。また培養液中に溶存した二酸化炭素も炭素源として使用出来る。これらの炭素源が初発培地にも流加培地にも用いることができる。培地中にこれらの炭素源を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。また、初発培地、流加培地とも、同じ炭素源を用いてもよいし、流加培地の炭素源を初発培地と変更してもよい。例えば、初発培地の炭素源をグルコースとし、流加培地の炭素源をスクロースとする場合である。

培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含んでいてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。

培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源を含んでいることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。

また培地には、炭素源、窒素源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）を含んでいてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。特に芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸の場合、生合成系が共通しているので、微生物が後述のように、目的アミノ酸以外の生合成が弱化されている場合がある。このような場合、生合成系が弱化されたアミノ酸を培地中に添加することが好ましい。例えば目的アミノ酸がＬ−リジンの場合、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンである。

微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12、ピリドキシン、パントテン酸等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。

また培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−アミノ酸生産菌は、後述のようにＬ−アミノ酸生合成経路が強化されており、Ｌ−アミノ酸分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−リジン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。核酸生産菌についても同様に、必要な物質を培地に添加することが好ましい。

初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地の両方が種晶を含む場合は、種晶の濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。

培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３０〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。

本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、回分培養又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。また、種培養及び本培養に先立って、１回、２回又はそれ以上の前培養を行い、順次スケールアップしてもよい。

これらの培養法の場合、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を添加して繰り返し培養を行ってもよい。新たに添加する培地とは、炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましい。添加する培地の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトース、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。

本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的に糖や栄養源の供給が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培地を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。流加培地の炭素源は、前記と同様である。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。

また、流加培養を行う際に、糖の量が、流加培養液あるいは発酵培地全体の炭素源量として、30g/Lを超えない程度で流加させることが好ましく、20g/L以下、10g/L以下で制御することが好ましい。特に、微生物の対数増終了時以降に、糖濃度が前記濃度範囲となるように制御することが好ましい。炭素源の流加速度は、米国特許5,912,113号明細書記載の方法を用いて制御することが出来る。また、糖とリン酸が菌体生育の制限因子となる濃度で糖とリン酸を流加することが好ましく、流加培養液に含まれるリン酸の量としては、P/C ratioで２以下、好ましくは1.5以下、さらに好ましくは1以下である（米国特許5,763,230号明細書参照）。

本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ−アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。

ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ−アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ−アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行う。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように培養することが好まし
い。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。

培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させ
たあとに開始することが望ましく、例えば開始時間としては最大で流加を始めた5時間後、望ましくは3時間後、さらに望ましくは最大で1時間後である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。

菌体を再利用する連続培養法とは、予定したＬ−アミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ−アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物若しくは遠心上澄み液を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。

本発明により得られる塩基性アミノ酸を含む発酵液は、好ましくは、炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンを、下記式で表される規定度比率が５〜１００％となるように含有している。

培地中の炭酸イオン及び重炭酸イオンは、熱を加えることによって炭酸ガスとして放出される。したがって、この発酵液中の固形成分に占める塩基性アミノ酸の含量が高められる。また、発酵液に炭酸より強い酸を加えれば、容易に炭酸と置換できるため、多様な塩形態が選択できる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

〔実施例１〕SeFLA活性を付与したＬ−リジン生産菌の構築
＜１−1＞SeFLA遺伝子発現用プラスミドの構築
配列番号１に示す配列を有し、ZAP-kit（Stratagene社）を用いてλZAPIIファージベクターにクローニングされたSeFLA cDNAを、pBluescript SKベクターに載せかえることにより得られたSeFLA遺伝子発現用プラスミドを用いた。同プラスミドは、WO2006/013807に詳述されている。以下、このプラスミドをpBS-SeFLAと呼ぶ。

pBS-SeFLA又はそれと等価のプラスミドは、アッケシソウのcDNAライブラリーから、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列又は該配列から調製され得るプローブを用いたハイブリダイゼーションによりSeFLA cDNAを取得し、そのcDNA断片の末端をT4 DNAポリメラーゼ及びklenowフラグメントを用いて平滑化し、pBluescript SKのEcoRV部位に挿入することによって、取得することができる。SeFLA cDNAは、WO2006/013807に記載のF2プライマー及びT7プライマー（それぞれ配列番号３、４に示す）を用いたPCRによっても、cDNAライブラリーから取得することができる。pBS-SeFLAで形質転換されたエシェリヒア・コリMG1655は、2008年月日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-21699として寄託されている。

＜１−２＞ SeFLA活性を増強したＬ−リジン生産菌の構築
WC196ΔcadAΔldcC株（国際公開第WO2006/038695号パンフレット参照）株をdapA、dapB
及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株を得た。さらに、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株をpBluescriptIISK(+)および、SeFLA発現用プラスミドpBS-SeFLAで常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2, pBluescriptIISK(+)株、および、WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2, pBS-SeFLA株を得た。

これらの株を、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含むＬ培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。

〔実施例２〕SeFLA活性を強化した菌株のＬ−リジン生産能の評価
上記グリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られた菌体の懸濁液を101倍希釈し、希釈液のOD₆₀₀の値（n）を測定し、50/nに相当する液量の希釈液を、500mL坂口フラスコ中の、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間、攪拌下（115rpm）で培養した。培養24時間後、及び48時間後に、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を公知の方法（サクラ精機バイオテックアナライザーAS210）により測定した。

発酵培地の組成を以下に示す（単位g/L）。
グルコース 40
(NH₄)₂SO₄ 24
K₂HPO₄ 1.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
イーストエキストラクト 2.0
局方CaCO₃ 30
KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブした。但し、グルコース、CaCO₃、及びMgSO₄・7H₂Oは別殺菌した。局方CaCO₃は、180℃で２時間乾熱滅菌した。
抗生物質として、20mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを添加した。

結果を表１に示す。表中、「OD600」は吸光度600nmで測定した菌体量を、「残糖」は培地に残留するグルコース濃度を、「Lys(g/L)」は培地に蓄積したＬ−リジン蓄積量を、「収率(%)」は基質からのＬ−リジン収率を、それぞれ示す。また、「WC196LC」は、WC196ΔcadAΔldcCを示す。
SeFLA活性を付与したＬ−リジン生産菌は、非改変株に比べ多量のＬ−リジンを蓄積した。

Claims

腸内細菌科に属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地に培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌は、腸内細菌に属する細菌で発現させたときに同細菌に塩ストレス耐性、水分ストレス耐性、及び熱ストレス耐性の少なくともいずれかを付与する機能を有するアラビノガラクタンタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細菌である方法。
前記アラビノガラクタンタンパク質が、アッケシソウのアラビノガラクタンタンパク質である、請求項１に記載の方法。
前記アラビノガラクタンタンパク質が、少なくとも配列番号２の１〜３７５位のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、請求項１又は２に記載の方法。
前記アラビノガラクタンタンパク質が、少なくとも配列番号２の１〜４０２位のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその保存的バリアントである、請求項３に記載の方法。
前記アラビノガラクタンタンパク質が、分泌シグナルペプチドが付加された形態で前記細菌で発現される、請求項３又は４に記載の方法。
前記分泌シグナルペプチドが配列番号２の−１〜−２５位のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の方法。
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン、及びＬ−システインからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項７に記載の方法。
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−スレオニンであり、前記細菌がアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼＩ、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、請求項７に記載の方法。
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌またはパントエア属細菌である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。