CN106191146B

CN106191146B - 使用具有减弱的gshA基因表达的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的方法

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Publication number: CN106191146B
Application number: CN201610366024.8A
Authority: CN
Inventors: V.V.萨姆索诺夫; N.S.埃雷米娜; N.V.斯托伊诺瓦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: EP3098319A1; BR102016012032B1; BR102016012032A2; JP6834177B2; US11746345B2; US20160348089A1; RU2015120052A; CN106191146A; EP3098319B1; JP2016220680A

Abstract

本发明提供了通过使用以减弱gshA基因表达的方式进行了修饰的肠肝菌科细菌，特别是属于埃希氏菌属的细菌进行发酵生产L‑氨基酸，如支链L‑氨基酸的方法。

Description

使用具有减弱的gshA基因表达的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的方法

技术领域

本发明一般涉及微生物学产业，并且具体来说涉及通过肠肝菌科细菌的发酵生产L-氨基酸的方法，所述肠肝菌科细菌以减弱gshA基因的表达的方式进行了修饰，使得增强L-氨基酸的生产。

背景技术

常规地，在产业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其突变体的发酵方法生产L-氨基酸。典型地，微生物经修饰以提高L-氨基酸的生产产率。

已经报道了许多提高L-氨基酸生产产率的技术，包括使用重组DNA转化微生物(见例如美国专利号4,278,765A)和改变表达调节区，如启动子，前导序列，和/或弱化子(attenuator)，或本领域技术人员已知的其它调节区(见例如US20060216796 A1和WO9615246 A1)。用于提高生产产率的其它技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目标酶对所得L-氨基酸的反馈抑制脱敏(见例如WO9516042 A1，EP068555 A1或美国专利号4,346,170A，5,661,012A和6,040,160A)。

用于提高L-氨基酸生产产率的另一种方法是减弱以下基因的表达：参与目标L-氨基酸降解的一个基因或几个基因，将目标L-氨基酸的前体从该氨基酸生物合成途径中转移的基因，参与碳、氮和磷酸盐通量再分配的基因，以及编码毒素的基因等。

gshA基因编码γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶，其催化从L-谷氨酸生物合成谷胱甘肽的途径中的两个步骤的第一个。该酶由谷胱甘肽反馈抑制(Apontoweil P.and BerendsW.,Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K 12.Properties of theenzymes and regulation,Biochim.Biophys.Acta,1975,399(1):1-9)。具有增加的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)活性和metC、tnaA、gshA和dfp基因缺失的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株用于通过该细菌的发酵的L-半胱氨酸生产的方法(CN101831397A)。

然而，先前尚未报道下述数据，其描述减弱gshA基因的表达对通过发酵肠杆菌科的产L-氨基酸的细菌进行L-氨基酸生产的影响。

发明内容

本发明的一个方面提供了使用属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌生产L-氨基酸的方法，如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸，所述细菌可以属于埃希氏菌属(Escherichia)，并且更具体而言，属于大肠杆菌物种，并且以减弱gshA基因的表达的方式进行了修饰。

通过以下发现完成了这一目的：减弱属于肠杆菌科的产L-氨基酸的细菌的染色体上的gshA基因的表达对该细菌赋予了较高的L-氨基酸，更具体地支链L-氨基酸，且特别但不限于L-缬氨酸的生产率(productivity)，所述产L-氨基酸的细菌可以属于埃希氏菌属，且更具体的是大肠杆菌物种。此外，可以增加通过发酵肠杆菌科的经修饰的细菌的L-氨基酸(如例如支链L-氨基酸，包括L-缬氨酸)的生产产率。可以减弱gshA基因，例如通过失活属于肠杆菌科的细菌的染色体上的gshA基因的表达，所述细菌可以属于埃希氏菌属，且更具体的是大肠杆菌物种。这些发现已经导致了本发明的以下非限制性的方面。

本发明的一个方面提供了用于生产L-氨基酸的方法，包括：

(i)在培养基中培养肠肝菌科的产L-氨基酸的细菌以在所述培养基中，或在细菌细胞中，或所述培养基和所述细菌细胞中产生L-氨基酸；及

(ii)从所述培养基中，或从所述细菌细胞中，或从所述培养基中和所述细菌细胞中收集L-氨基酸，

其中所述细菌以减弱gshA基因的表达的方式进行了修饰。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌是菠萝泛菌(Pantoea ananatis)。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中gshA基因的表达由于gshA基因的失活而减弱。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中gshA基因是缺失的。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中gshA基因选自下组：

(A)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA；

(B)包含由于遗传密码的简并性所致的SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列的DNA；

(C)相对于SEQ ID NO:1的整个核苷酸序列具有不低于60％的同一性的DNA，且其中所述DNA编码具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的蛋白质；

(D)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的DNA；和

(E)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质的DNA，该氨基酸序列包括一个或多个突变，包括一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入，或添加，且其中所述蛋白具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶的活性，

(F)编码蛋白的DNA，所述蛋白相对于SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列具有不低于65％的同一性，且其中所述蛋白具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶的活性。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸选自芳香族L-氨基酸和非芳香族L-氨基酸。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述非芳香族L-氨基酸选自L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸和L-缬氨酸。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是支链L-氨基酸。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述支链L-氨基酸选自L-异亮氨酸，L-亮氨酸和L-缬氨酸。

本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-缬氨酸。

发明详述

本发明在下面详细地描述。

1.细菌

可以使用任意属于肠杆菌科并经修饰以减弱gshA基因表达的产L-氨基酸的细菌。短语“产L-氨基酸的细菌”可以意指当在培养基中培养细菌时具有产生，排泄(excrete)或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培养基和/或细菌细胞中积累的能力的肠杆菌科细菌。

短语“产L-氨基酸的细菌”也可以意指与野生型或亲本菌株，如大肠杆菌K-12相比能够以更大的量产生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培养基中积累的细菌。短语“产L-氨基酸的细菌”也可以意指能够引起例如不少于0.1g/L，不少于0.5g/L，或不少于1.0g/L量的目标L-氨基酸在培养基中积累的细菌。

此外，也可以使用属于肠杆菌科并经修饰以减弱gshA基因的表达的细菌，其具有产生L-氨基酸的能力。细菌可以固有地具有产L-氨基酸的能力，或可以通过使用突变方法或DNA重组技术修饰而具有产L-氨基酸的能力。可以通过在固有地具有产生L-氨基酸的能力的细菌中，或已经赋予了产生L-氨基酸的能力的细菌中减弱gshA基因的表达获得细菌。或者，可以通过将产生L-氨基酸的能力赋予以减弱gshA基因的表达的方式进行了修饰的细菌获得细菌。还有，细菌也可以是通过减弱gshA基因的表达已经获得产生L-氨基酸的能力的细菌。

短语“产L-氨基酸的能力”可以意指当在培养基中培养细菌时细菌以下述水平产生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培养基和/或细菌细胞内积累的能力，所述水平使得可以从培养基和/或细菌细胞中收集L-氨基酸。

细菌可以产生仅一种氨基酸，或两种或更多种氨基酸的混合物。特别地，细菌可以产生仅一种L-氨基酸，或两种或更多种氨基酸的混合物。

短语“氨基酸”可以意指含有至少一个氨基基团(NH₂)和至少一个羧基基团(COOH)的有机化合物。L-氨基酸是氨基酸的非限制性例子。

短语“L-氨基酸”可以意指L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸。

短语“芳香族L-氨基酸”包括例如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-组氨酸具有芳香族部分，具体的是咪唑环，除了上述芳香族L-氨基酸之外，短语“芳香族L-氨基酸”也可以包括L-组氨酸。

短语“非芳香族L-氨基酸”包括例如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸和L-缬氨酸。由于L-组氨酸的生物合成途径与常见的芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸的合成途径不同，除了上述非芳香族L-氨基酸之外，短语“非芳香族L-氨基酸”也可以包括L-组氨酸。

也就是说，L-组氨酸可以被包括在“芳香族L-氨基酸”和“非芳香族L-氨基酸”的任一种或两者中。

L-氨基酸可以属于一个或多个L-氨基酸家族。作为例子，谷氨酸家族包括L-精氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，和L-脯氨酸；丝氨酸家族包括L-半胱氨酸，甘氨酸，和L-丝氨酸；天冬氨酸家族包括L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，和L-苏氨酸；丙酮酸家族包括L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸和L-缬氨酸；并且芳香族家族包括L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-氨基酸可以是另一种L-氨基酸的生物合成途径中的中间体，上述氨基酸家族也可以包括其它L-氨基酸，如例如非生蛋白性(non-proteinogenic)L-氨基酸。例如，L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是来自L-精氨酸生物合成途径的氨基酸。因此，谷氨酸家族可以包括L-瓜氨酸和L-鸟氨酸，以及L-精氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，和L-脯氨酸。

L-氨基酸也可以属于一个或多个氨基酸组。例如，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，和L-缬氨酸可以属于支链L-氨基酸(branched-chain L-amino acid)组。此外，L-高亮氨酸和L-高异亮氨酸也可以属于支链氨基酸组。

L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-高亮氨酸和L-高异亮氨酸是L-氨基酸的具体例子。L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸和L-缬氨酸是L-氨基酸的具体例子。L-异亮氨酸，L-亮氨酸和L-缬氨酸是L-氨基酸的更具体的例子。L-缬氨酸是L-氨基酸的还更具体的例子。

短语“L-氨基酸”不仅可以指游离形式的氨基酸，而且还可以包括氨基酸的盐或水合物，或由氨基酸和另一种有机或无机化合物形成的加合物。氨基酸的盐的例子包括，例如，硫酸盐，氯化物，碳酸盐，铵盐，钠盐，钾盐，和盐酸盐。氨基酸的盐的具体例子包括但不限于L-赖氨酸的单盐酸盐(monochlorhydrate salt of L-lysine)(L-赖氨酸·HCl)和L-精氨酸的单盐酸盐(monochlorhydrate salt of L-arginine)(L-精氨酸-HCl)。氨基酸的水合物的例子包括，例如，一水合物和二水合物。氨基酸的水合物的具体例子包括一水合L-半胱氨酸(L-cysteine monohydrate)(L-Cys·H₂O)。

属于肠杆菌科的细菌可以来自肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，摩根氏菌属(Morganella)，泛菌属，发光杆菌属(Photorhabdus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，沙门氏菌属(Salmonella)，耶尔森氏菌属(Yersinia)等等，并且可以具有产生L-氨基酸的能力。特别地，可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类系统归入肠杆菌科的细菌。可以修饰的来自肠肝菌科的细菌的例子包括埃希氏菌属，肠杆菌属，或泛菌属。

可以经修饰以获得依照本公开的主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌没有具体限制，并且特别地，可以使用Neidhardt等的工作中描述的那些菌株(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12,p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),E.coli and Salmonella:cellular andmolecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。大肠杆菌物种是一个具体的例子。大肠杆菌的具体例子包括大肠杆菌W3110(ATCC 27325)，大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等等，其来源于原型野生型菌株，K-12菌株。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)获得。也就是说，对于每个菌株给出了登记号，并且可以通过使用这些登记号订购菌株(参见http://www.atcc.org)。菌株的登记号列在美国典型培养物保藏中心的目录中。

肠杆菌属细菌的例子包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌属细菌的例子包括菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等等。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等等，成团肠杆菌的一些菌株最近重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，菠萝泛菌，或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的细菌，只要它是分类为肠杆菌科的细菌。当通过遗传工程技术培育菠萝泛菌时，可以使用菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株当它们被分离时鉴定为成团肠杆菌，并且以成团肠杆菌保藏。然而，如上文所述，基于16S RNA的核苷酸测序等，它们最近重新分类为成团泛菌。

在下文，将具体举例说明产L-氨基酸的细菌。可以独立或以任意适合的组合使用产L-氨基酸的细菌的任意特性和用于赋予或增强产L-氨基酸的能力的修饰，如下文举例说明的那些。

产L-精氨酸的细菌

产L-精氨酸的细菌及可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请No.2002/058315A1)和其包含突变体N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利No.2215783 C2)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926，EP1170358A1)，其是来源于237菌株并具有改进的乙酸同化能力的菌株，大肠杆菌382ilvA+菌株，其是通过将来自大肠杆菌K-12菌株的ilvA基因的野生型等位基因引入382菌株自其获得的菌株，等等。突变体N-乙酰谷氨酸合酶的例子包括例如通过取代对应于野生型酶的位置15至19的氨基酸残基针对L-精氨酸的反馈抑制脱敏的突变体N-乙酰谷氨酸合酶(EP1170361 A1)。

产L-精氨酸的细菌及可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子也包括下述菌株，其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强。除编码N-乙酰谷氨酸合酶(argA)的基因外，此类基因的例子包括编码以下酶的基因：N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶(acetyl-γ-glutamylphosphate reductase,argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(ornithine acetyltransferase,argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase,argB)、N-乙酰鸟氨酸转氨酶(N-acetylornithine aminotransferase,argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(ornithine carbamoyltransferase,argF)、精氨基琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase,argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argininosuccinate lyase,argH)，和氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,carAB)。

产L-精氨酸的细菌及可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子也包括对氨基酸类似物具有抗性的菌株等等。这样的菌株的例子包括对α-甲基甲硫氨酸、对氟代苯丙氨酸(p-fluorophenylalanine)、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸盐(argininehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)或磺胺胍(sulfaguanidine)具有抗性的大肠杆菌突变体菌株(参见日本专利公开(Laid-open)(Kokai)No.56-106598)。

产L-瓜氨酸的细菌

产L-瓜氨酸的细菌及可以用于衍生产L-瓜氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237/pMADS11、237/pMADS12、和237/pMADS13菌株(RU2215783 C2，欧洲专利No.1170361B1，美国专利No.6,790,647B2)(其具有突变体N-乙酰谷氨酸合酶)，大肠杆菌333菌株(VKPM B-8084)和374菌株(VKPM B-8086)(两者都具有突变体反馈抗性氨甲酰磷酸合成酶)(俄罗斯专利No.2264459 C2)，α-酮戊二酸合酶活性增加，并且铁氧还原蛋白NADP⁺还原酶，丙酮酸合酶，和/或α-酮戊二酸脱氢酶活性另外修饰的大肠杆菌菌株(EP2133417 A1)，以及菠萝泛菌NA1sucAsdhA菌株(其中琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性减少)(美国专利申请No.2009286290 A1)等。

由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体，产L-瓜氨酸的细菌及可以用于衍生产L-瓜氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以下酶的基因：N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase,argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamatekinase,argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(N-acetylglutamyl phosphate reductase,argC)、N-乙酰鸟氨酸转氨酶(acetylornithine transaminase,argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(acetylornithine deacetylase,argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(ornithinecarbamoyltransferase,argF/I)、和氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphatesynthetase,carAB)，及其组合。

可以通过失活由argG基因编码的精氨基琥珀酸合酶容易地从任何产L-精氨酸的细菌，如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得产L-鸟氨酸的细菌。

产L-半胱氨酸的细菌

产L-半胱氨酸的细菌及可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218,168 B1，俄罗斯专利No.2279477 C2)，具有编码适合于分泌细胞毒性物质的蛋白质的基因过表达的大肠杆菌W3110(美国专利No.5,972,663A)，具有降低的半胱氨酸脱巯基酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)，具有由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调控物的活性增加的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)等。产L-半胱氨酸的细菌及可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括大肠杆菌JM15菌株(ydeD)，其是大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218,168 B1)的衍生物，并已经用含有ydeD基因的DNA转化(美国专利No.5,972,663)。

产L-谷氨酸的细菌

产L-半胱氨酸的细菌及可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC⁺(EP1172433 A1)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是一种具有thrC和ilvA基因中的突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利No.4,278,765)。通过使用在野生型大肠杆菌K-12菌株(VKPM B-7)细胞上培养的噬菌体P1进行的通用转导方法转移thrC基因的野生型等位基因。因此，得到了L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC⁺(VKPM B-8961)，其能够产生L-谷氨酸。

产L-半胱氨酸的细菌及可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于编码L-谷氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykK)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、二磷酸果糖醛缩酶(fbp)和磷酸葡糖异构酶(pgi)。

经修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的例子包括EP 1078989 A2、EP955368 A2和EP952221 A2中公开的那些菌株。

产L-谷氨酸的细菌及可以用于衍生产L-谷氨酸细菌的亲本菌株的例子还包括具有降低或消除的酶活性的菌株，所述酶催化通过从L-谷氨酸生物合成途径分叉而合成与L-谷氨酸不同的化合物。此类酶的例子包括异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)和琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)。在酶的名称后面的括号中显示的是编码该酶的基因的例子(其应当适用于下文的相同情况)。在α-酮戊二酸脱氢酶活性中缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌和用于获得它们的方法描述于美国专利No.5,378,616和5,573,945。特别地，这些菌株包括以下：

大肠杆菌W3110sucA::Km^R，

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)，

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)，

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)。

大肠杆菌W3110sucA::Km^R是一种通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(此后称为“sucA基因”)获得的菌株。该菌株在α-酮戊二酸脱氢酶中完全缺陷。

产L-谷氨酸的细菌及可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的其它例子包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物(天冬氨酸类似物)具有抗性的菌株。这些菌株也可以在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷，并且其例子包括例如大肠杆菌AJ13199(FERMBP-5807)(美国专利No.5,908,768)，大肠杆菌FFRM P-12379(其另外具有降低的L-谷氨酸分解能力)(美国专利No.5,393,671)，大肠杆菌AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利No.6,110,714)等。

产L-谷氨酸的细菌及可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括泛菌属细菌，如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、菠萝泛菌SC17菌株(FERM BP-11091)和菠萝泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。AJ13355菌株是一种从Iwata-shi(Shizuoka-ken，日本)的土壤中分离的菌株，作为可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增殖的菌株。SC17菌株是作为低粘液生产突变菌株(low phlegm-producing mutantstrain)从AJ13355菌株选择的菌株(美国专利No.6,596,517)。SC17菌株于2009年2月4日保藏在独立的管理机构，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，International Patent Organism Depositary(目前为独立的管理机构，National Institute of Technology and Evaluation，International Patent OrganismDepositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM BP-11091的保藏号。AJ13355菌株于1998年2月19日保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science andTechnology(目前为NITE IPOD，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM P-16644的保藏号。然后，于1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏物转为国际保藏物，并且指定了FERM BP-6614的保藏号。

产L-谷氨酸的细菌及可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括在α-酮戊二酸脱氢酶活性上有缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的属于泛菌属的突变体菌株，并且可以如上文所述获得。这样的菌株包括菠萝泛菌AJ13356(美国专利No.6,331,419 B1)。菠萝泛菌AJ13356于1998年2月19日以保藏号FERM P-16645保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science andTechnology,Ministry of International Trade and Industry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。然后，于1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定，将它转为国际保藏物，并且接受了保藏号FERM BP-6615。由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏，菠萝泛菌AJ13356在α-酮戊二酸脱氢酶活性上有缺陷。上述菌株当它被分离时鉴定为成团肠杆菌，并且保藏为成团肠杆菌AJ13356。然而，基于16SrRNA核苷酸测序等，它最近重新分类为菠萝泛菌。虽然AJ13356在上述保藏单位作为成团肠杆菌保藏，但是为了本说明书的目的，将它们描述为菠萝泛菌。

产L-谷氨酸的细菌及可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括属于泛菌属的菌株，例如菠萝泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株、菠萝泛菌AJ13601菌株、菠萝泛菌NP106菌株、和菠萝泛菌NA1菌株。通过将含有源自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG以及含有源自乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB导入SC17sucA菌株中获得SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。AJ13601菌株是作为在低pH下对高浓度的L-谷氨酸有抗性的菌株从SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株选择的菌株。通过消除(curing)RSFCPG和pSTYCB质粒，从AJ13601菌株获得NP106菌株。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Tradeand Industry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且指定了保藏号FERM P-17516。然后，于2000年7月6日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏物转为国际保藏物，并且指定了保藏号FERM BP-7207。

产L-组氨酸的细菌

产L-组氨酸的细菌及可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU 2003677 C1)、大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536 C1)、大肠杆菌NRRL B-12116-B-12121(美国专利No.4,388,405)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利No.6,344,347 B1)、大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(EP 1085087 A2)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554 B1)等。

产L-组氨酸的细菌及可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括编码L-组氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。这些基因的例子包括编码以下酶的基因：ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP环水解酶/磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamideribotide isomerase,hisA)、酰胺转移酶(amidotransferase,hisH)、组胺醇磷酸氨基转移酶(histidinol phosphate aminotransferase,hisC)、组胺醇磷酸酶(histidinolphosphatase,hisB)和组胺醇脱氢酶(histidinol dehydrogenase,hisD)等。

已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶受到L-组氨酸的抑制，并且因此也可以通过将对反馈抑制赋予抗性的突变引入ATP磷酸核糖基转移酶中有效增强产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利No.2003677 C1和2119536C1)。

具有产L-组氨酸的能力的菌株的具体例子包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048(其已经使用携带编码L-组氨酸-生物合成酶的DNA的载体转化)(JP56-005099A)，使用rht(一种用于氨基酸输出的基因)转化的大肠杆菌菌株(EP1016710A2)，大肠杆菌80菌株(其已经赋予磺胺胍，DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性)(VKPM B-7270,RU2119536 C1)，大肠杆菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR(RU2119536和Doroshenko V.G.et al.,The directedmodification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154)等。

产L-异亮氨酸的细菌

产L-异亮氨酸的细菌及可以用于衍生产L-异亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于对6-二甲基氨基嘌呤具有抗性的突变体菌株(JP 5-304969A)，对异亮氨酸类似物，如硫代异亮氨酸和异亮氨酸异羟肟酸盐具有抗性的突变体菌株，和另外对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸盐(arginine hydroxamate)具有抗性的突变体菌株(JP 5-130882A)。另外，用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白，如苏氨酸脱氨酶和乙酰醇酸合酶(acetohydroxate synthase)的基因转化的重组菌株也可以用作产L-异亮氨酸的细菌或其亲本菌株(JP 2-458 A,EP0356739 A1,和美国专利No.5,998,178)。

产L-亮氨酸的细菌

产L-亮氨酸的细菌及可以用于衍生产L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，例如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，57菌株(VKPMB-7386,美国专利No.6,124,121))；对亮氨酸类似物有抗性的大肠杆菌菌株(JP 62-34397B和JP 8-70879 A)，包括β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)、3-羟基亮氨酸(3-hydroxyleucine)、4-氮杂亮氨酸(4-azaleucine)和5,5,5-三氟亮氨酸(5,5,5-trifluoroleucine)；通过WO96/06926中所述的基因工程技术获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP 8-70879 A)等。

产L-亮氨酸的细菌及可以用于衍生产L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子也包括参与L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。这些基因的例子包括leuABCD操纵子的基因，其可以以突变体leuA基因代表，所述突变体leuA基因编码解除L-亮氨酸的反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(α-isopropylmalate synthase)(美国专利No.6,403,342 B1)。另外，产L-亮氨酸的细菌及可以用于衍生产L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子也包括编码蛋白质的一种或多种基因的表达得到增强的菌株，所述蛋白质从细菌细胞分泌L-氨基酸。此类基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。

产L-赖氨酸的细菌

产L-赖氨酸的细菌及可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括属于埃希氏菌属并且对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当L-赖氨酸存在于培养基中时，此抑制被完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的例子包括但不限于氧杂赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸异羟肟酸盐(lysinehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可以通过将属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理，获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。可用于生产L-赖氨酸的细菌菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRL B-12185；见美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些菌株中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶(aspartokinase)的反馈抑制是脱敏的。

产L-赖氨酸的细菌及可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括编码L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以下酶的基因：二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase,dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利No.6,040,160)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195A)。另外，产L-赖氨酸细菌或其亲本菌株可以具有参与能量效率的基因(cyo)(EP1170376 A1)，编码烟酰胺核苷酸转氢酶(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)，或其组合的表达水平升高。由于天冬氨酸激酶III受到L-赖氨酸的反馈抑制，编码针对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因(美国专利No.5,932,453)可以用于增强这种酶的活性。此外，由于二氢吡啶二羧酸合酶受到L-赖氨酸的反馈抑制，编码针对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶的突变体dapA基因可以用于增强这种酶的活性。

产L-赖氨酸的细菌或可以用于衍生产L-赖氨酸细菌的亲本菌株可以具有降低的酶活性或无酶活性，所述酶催化引起从L-赖氨酸生物合成途径分叉，并且导致另一种化合物的产生的反应。另外，产L-赖氨酸的细菌或可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株可以具有降低的酶活性或无酶活性，所述酶负面作用于L-氨基酸合成或积累。参与L-氨基酸产生的此类酶的例子包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA,ldcC)、苹果酸酶等，并且其中这些酶的活性被减少或删除的菌株公开于WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等。

为了减少或删除赖氨酸脱羧酶活性，可以减少编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因两者的表达。可以通过例如WO2006/078039中所述的方法减少这两个基因的表达。

产L-赖氨酸的细菌及可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括大肠杆菌WC196菌株(美国专利No.5,827,698),大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc菌株、和大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株(WO2006/078039)。

WC196菌株通过将AEC抗性赋予W3110菌株从W3110菌株(其衍生于大肠杆菌K-12)培育(美国专利No.5,827,698)。WC196菌株是指定的大肠杆菌AJ13069，并且于1994年12月6日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology,Ministry of International Trade andIndustry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且指定了保藏号FERM P-14690。然后，于2000年7月6日依据布达佩斯条约的规定，将该保藏转为国际保藏，并且指定了保藏号FERM P-14690。然后，于1995年9月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，并且分配了保藏号FERM BP-5252(美国专利No.5,827,698)。

WC196ΔcadAΔldc菌株是通过破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因从WC196菌株构建。WC196ΔcadAΔldc菌株指定为AJ110692，并于2008年10月7日以保藏号FERM BP-11027作为国际保藏物保藏在独立的管理机构，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology,International Patent Organism Depositary(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。

通过向WC196ΔcadAΔldc菌株中导入含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2(美国专利No.6,040,160)构建了WC196ΔcadAΔldc/pCABD2菌株。该质粒pCABD2含有源自大肠杆菌并编码具有针对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变(H118Y)的二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的突变体dapA基因、源自大肠杆菌并编码具有针对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变(T352I)的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因、源自大肠杆菌并编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因，和源自乳发酵短杆菌并编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。

产L-赖氨酸的细菌及可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括大肠杆菌AJIK01菌株(NITE BP-01520)。该AJIK01菌株指定为大肠杆菌AJ111046，并且于2013年1月29日保藏于NITE IPOD(#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。然后，它于2014年5月15日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，并且指定保藏号为NITE BP-01520。

产L-甲硫氨酸的细菌

产L-甲硫氨酸的细菌及可以用于衍生产L-甲硫氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ11539菌株(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)(专利GB2075055)；和对正亮氨酸(L-甲硫氨酸类似物)有抗性的大肠杆菌218菌株(VKPM B-8125)(RU2209248C2)和73菌株(VKPM B-8126)(RU2215782)等。大肠杆菌73菌株于2001年5月14日在保藏号VKPM B-8126下保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1stDorozhny proezd,1)。然后，它于2002年2月1日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。此外，甲硫氨酸阻遏物缺陷菌株和使用编码参与L-甲硫氨酸生物合成的蛋白质如高丝氨酸转琥珀酰基酶(homoserine transsuccinylase)和胱硫醚γ-合酶的基因转化的重组菌株(JP2000-139471A)也可以用作产L-甲硫氨酸的细菌或其亲本菌株。

产L-鸟氨酸的细菌

由于L-鸟氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体，产L-鸟氨酸的细菌和可以用于衍生产L-鸟氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括编码L-精氨酸生物合成酶(如上文所述的那些)的一种或多种基因的表达增强的菌株。

可以通过由argF和argI基因两者编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活，从任意产L-精氨酸的细菌，例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)容易地得到产L-鸟氨酸的细菌。用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活的方法描述于本文。

产L-苯丙氨酸的细菌

产L-苯丙氨酸的细菌及可以用于衍生产L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8179)，大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(其含有突变体pheA34基因)(美国专利No.5,354,672)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)，大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-arpG4，pACMAB]，命名为AJ12604(FERM BP-3579)(EP488424B1)。此外，产L-苯丙氨酸的细菌及可以用于衍生产L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括属于埃希氏菌属并且具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利No.7,259,003和7,666,655)。

产L-脯氨酸的细菌

产L-脯氨酸的细菌及可以用于衍生产L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)，其在ilvA基因上是缺陷的且能够产生L-脯氨酸(EP1172433 A1)。产L-脯氨酸的细菌及可以用于衍生产L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括参与L-脯氨酸生物合成的一种或多种基因的表达增强的菌株。可以用于产L-脯氨酸的细菌中的这些基因的例子包括编码具有脱敏的L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(DE3127361 A1)。另外，产L-脯氨酸的细菌及可以用于衍生产L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括编码负责从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达增强的菌株。此类基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

具有产生L-脯氨酸的能力的属于埃希氏菌属的细菌的例子包括以下大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB专利No.2075056)、VKPMB-8012(俄罗斯专利No.2207371 C2)、DE312761 A1中描述的质粒突变体、Bloom F.R.等在“The 15^th Miamiwinter symposium”，1983，p.34中描述质粒突变体等。

产L-苏氨酸的细菌

产L-苏氨酸的细菌及可以用于衍生产L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利No.5,175,107和5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美国专利No.5,631,157)、大肠杆菌NRRL B-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(Russian),1978,14:947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(EP 1149911A2)、大肠杆菌VKPM B-5318(EP 0593792 A1)等。

TDH-6菌株是thrC基因缺陷的，并为蔗糖-同化(sucrose-assimilative)的，并且其ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。该菌株在rhtA基因中也具有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。VKPM B-3996菌株(其含有质粒pVIC40)是通过将质粒pVIC40导入TDH-6菌株获得的。质粒pVIC40是通过将thrA*BC操纵子插入RSF1010-衍生的载体中获得，所述操纵子包括突变体thrA基因。该突变体thrA基因编码具有实质性脱敏的苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。该VKPM B-3996菌株于1987年11月19日在保藏号RIA 1867下保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics(RussianFederation,117105Moscow,Nagatinskaya Street 3-A)。该VKPM B-3996菌株还于1987年4月7日在保藏号VKPM B-3996下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNIIGenetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

B-5318菌株就异亮氨酸而言是原养型的；并含有质粒pPRT614，其对应苏氨酸操纵子的调控区被温度敏感型λ-噬菌体C1阻遏物和PR启动子替代的质粒pVIC40。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日在保藏号VKPM B-5318下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)。

产L-苏氨酸的细菌及可以用于衍生产L-苏氨酸的细菌的亲本菌株可以经修饰以增强一种或多种以下基因的表达：

-突变体thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；

-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；

-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；

-rhtA基因，其编码苏氨酸和高丝氨酸流出系统的推定跨膜蛋白；

-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和

-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；

已经阐明了编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b0002；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:337至2,799；Gene ID:945803)。该thrA基因位于大肠杆菌K-12的染色体上的thrL和thrB基因之间。

已经阐明了编码大肠杆菌的高丝氨酸激酶的thrB基因(KEGG,entry No.b0003；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:2,801至3,733；Gene ID:947498)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。

已经阐明编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因(KEGG,entry No.b0004；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:3,734至5,020；Gene ID:945198)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX基因之间。全部三个基因作为单个的苏氨酸操纵子thrABC发挥功能。为了增强该苏氨酸操纵子的表达，期望从该操纵子除去影响转录的弱化子区(WO2005049808 A1,WO2003097839 A1)。

突变体thrA基因(其编码对L-苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I)以及thrB和thrC基因可以作为一个操作子从公知的质粒pVIC4获得，所述质粒存在于产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC4详细描述于美国专利5,705,371中。

已经阐明了rhtA基因(其编码大肠杆菌的苏氨酸和高丝氨酸流出系统的蛋白(内膜转运蛋白))(KEGG,entry No.b0813；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:848,433至849,320,互补物；Gene ID:947045)。rhtA基因位于大肠杆菌K-12的染色体上的dps和ompX基因之间，与glnHPQ操纵子(其编码谷氨酰胺转运系统的组分)接近。rhtA基因与ybiF基因(KEGG,entry No.b0813)相同。

已经阐明了asd基因(其编码大肠杆菌的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶)(KEGG,entryNo.b3433；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:3,571,798至3,572,901,互补物；Gene ID:947939)。asd基因位于在大肠杆菌K-12的染色体上的同一条链上的glgB和gntU基因(相反链上的yhgN基因)之间(The asd gene is located between the glgB andgntU gene on the same strand(yhgN gene on the opposite strand)on thechromosome of E.coli K-12)。

还有，已经阐明了aspC基因(其编码大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶)(KEGG,entry No.b0928；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:983,742至984,932,互补物；Gene ID:945553)。aspC基因位于大肠杆菌K-12的染色体上相反链上的ycbL基因和同一条链上的ompF基因之间。

产L-色氨酸的细菌

产L-色氨酸的细菌及可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其具有突变体trpS基因，编码的部分失活的色氨酰-tRNA合成酶(美国专利No.5,756,345)，大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码解除丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码解除色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因(美国专利No.6,180,373 B1)，酶色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利No.4,371,614)，大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其具有增强的磷酸烯醇式丙酮酸生产能力(WO97/08333，美国专利No.6.319,696 B1)等。产L-色氨酸的细菌及可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括属于埃希氏菌属并具有增强的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利申请No.2003148473 A1和2003157667 A1)。

产L-色氨酸的细菌及可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括选自下组的酶的一种或多种活性增强的菌株：邻氨基苯甲酸合酶，磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此，可以将脱敏该反馈抑制的突变引入这些酶中。具有此类突变的菌株的具体例子包括大肠杆菌SV 164，其含有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶，和通过向所述大肠杆菌SV164导入质粒pGH5获得的转化体菌株(WO94/08031 A1)，所述质粒pGH5含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因。

产L-色氨酸的细菌及可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中已经引入了色氨酸操纵子的菌株，所述色氨酸操纵子含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP 57-71397 A,JP 62-244382 A,美国专利No.4,371,614)。此外，可以通过增强色氨酸操纵子中(trpBA)编码色氨酸合酶的基因的表达，赋予产L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基组成。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达，改进产L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。

产L-缬氨酸的细菌

产L-缬氨酸的细菌及可以用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于已经经修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利5,998,178)。期望除去ilvGMEDA操纵子中为弱化所要求的区域，使得该操纵子的表达不被产生的L-缬氨酸弱化。此外，期望地，该操纵子中的ilvA基因被破坏，使得苏氨酸脱氨酶活性降低。

产L-缬氨酸的细菌及可以用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括氨基酰基t-RNA合成酶中具有突变的突变体菌株(美国专利No.5,658,766)。此类菌株的例子包括大肠杆菌VL1970，其在编码异亮氨酸t-RNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日在保藏号VKPM B-4411下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhnyproezd,1)。

此外，需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H⁺-ATP酶的突变体菌株也可以用作产L-缬氨酸的细菌或其亲本菌株(WO96/06926 A1)。

产L-缬氨酸的细菌及可以用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括大肠杆菌H81菌株(VKPM B-8066；见例如EP1942183 B1)，大肠杆菌NRRL B-12287和NRRL B-12288(美国专利No.4,391,907)，大肠杆菌VKPMB-4411(美国专利No.5,658,766)，大肠杆菌VKPM B-7707(EP1016710A2)等。

属于肠杆菌科的本发明的细菌已经经修饰以减弱gshA基因的表达。

短语“gshA基因”可以表示编码具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的酶的基因。编码具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的酶的基因的具体例子包括编码γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶的gshA基因。也就是说，编码具有γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性的酶的基因可以是gshA基因。对gshA基因的更具体的描述在下文给出。

gshA基因(同物异名：gsh-I)编码γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶GshA(同物异名：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，γGCS)[KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b2688；Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot,accessionNo.P0A6W9]。gshA基因(GenBank,accession No.NC_000913.3；核苷酸位置:2814883至2816439,互补物；Gene ID:944881)位于大肠杆菌K-12菌株的染色体上的相同链上的yqaA基因和相反链上的micA基因之间。大肠杆菌K-12菌株的gshA基因的核苷酸序列(SEQ IDNO:1)和由大肠杆菌K-12菌株的gshA基因编码的γGCS蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)是已知的。也就是说，gshA基因可以具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，且由gshA基因编码的γGCS蛋白可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。短语“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”包含其中基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列的情况，以及其中基因或蛋白由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。

短语“细菌以减弱ghsA基因的表达的方式进行了修饰”可以表示细菌以下述方式进行了修饰，从而在经修饰的细菌中gshA基因的表达被减弱。短语“细菌以减弱ghsA基因的表达的方式进行了修饰”可以特别地表示细菌已经以下述方式修饰，从而与非修饰的细菌相比，在经修饰的细菌中gshA基因的表达被减弱。例示的是，gshA基因的表达可以由于gshA基因的失活而被减弱。

短语“gshA基因是失活的”可以表示该经修饰的基因编码完全无活性或非功能性的蛋白，即，完全无活性或非功能性的γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶。也可接受的是经修饰的DNA区域不能天然表达该基因，由于基因的部分的缺失或整个基因的缺失，一个或多个碱基的替换而导致由基因编码的蛋白中的氨基酸取代(错义突变)，终止密码子的引入(无义突变)，一个或两个碱基的缺失而导致基因的读码框移位，插入药物抗性基因和/或转录终止信号，或对基因的相邻区域的修饰，包括控制基因表达的序列，如启动子，增强子，弱化子，核糖体结合位点等。也可以通过例如常规方法，如使用UV照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍)的诱变处理，定点诱变，使用同源重组的基因破坏，和/或插入-缺失诱变进行基因的失活(Yu D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(11):5978-5983；DatsenkoK.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645；Zhang Y.etal.,Nature Genet.,1998,20:123-128)based on“Red/ET-driven integration”or“λRed/ET-mediated integration”)。

短语“gshA基因的表达被减弱”也可以表示该经修饰的细菌含有可操作地连接到所述gshA基因的区域，包括控制基因表达的序列，如启动子，增强子，弱化子和转录终止信号，核糖体结合位点，以及其它表达控制元件，其经修饰导致gshA基因的表达水平的降低；以及其它的例子(见，例如，WO95/34672；Carrier T.A.and Keasling J.D.,Biotechnol.Prog.,1999,15:58-64)。短语“可操作地连接到基因”可以表示调控区以允许核苷酸序列表达(例如，增强，增加，组成性，基础，抗终止，减弱，失调(deregulated)，减少，或抑制的表达)，特别地由核苷酸序列编码的基因产物的表达的此类方式连接到核酸分子或基因的核苷酸序列。

短语“gshA基因的表达被减弱”也可以表示经修饰的细菌中gshA基因的表达产物的量，如基因的mRNA的量或由基因编码的γGCS蛋白的量，其中gshA基因的表达减弱，降低到例如未修饰的细菌中的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。

短语“细菌以减弱gshA基因的表达的方式进行了修饰”也可以意指细菌以下述的方式进行了修饰，从而与非修饰的细菌相比，在经修饰的细菌中，gshA基因产物，如γGCS蛋白的总酶促活性是降低的。可以修饰细菌，使得每个细胞的GCS蛋白活性降低到例如非修饰细菌中的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。

充当参考用于以上比较的未修饰的细菌的例子可以包括属于埃希氏菌属的细菌的野生型菌株，如大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)和大肠杆菌W3110菌株(ATCC 27325)，或属于泛菌属的细菌，如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)等。充当参考用于以上比较的未修饰的细菌的例子也可以包括尚未修饰以减弱gshA基因的表达的亲本菌株或gshA基因的表达没有被减弱的细菌。

短语“γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性”可以表示催化以下反应的酶促活性(EC编号：6.3.2.2)：

其中ATP可以表示三磷酸腺苷而ADP可以表示二磷酸腺苷。

可以通过使用丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶-偶联的测定评价二磷酸腺苷(ADP)形成(Seelig G.F.and Meister A.,Glutathione biosynthesis；gamma-glutamylcysteinesynthetase from rat kidney,Methods Enzymol.,1985；113:379-390)或使用L-α-[¹⁴C]氨基丁酸评价二肽形成(Griffith O.W.and Meister A.,Selective inhibition of gamma-glutamyl-cycle enzymes by substrate analogs,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74(8):3330-3334)确定γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶的酶促活性。也可以使用通过高效液相色谱法和电化学检测对γ-谷氨酰半胱氨酸的直接测量(Gegg M.E.et al.,Determinationof glutamate-cysteine ligase(gamma-glutamylcysteine synthetase)activity byhigh-performance liquid chromatography and electrochemical detection,Anal.Biochem.,2002,304(1):26-32)。可以通过使用牛血清白蛋白作为标注品的Bradford蛋白测定法测定蛋白浓度(Bradford M.M.,Anal.Biochem.,1976,72:248-254)。

可以通过替换基因的表达控制序列，减弱ghsA基因的表达，如使用较弱的启动子替换染色体DNA上的启动子。通过RNA合成的起始作用的频率确定启动子的强度。用于评价启动子和强启动子的强度的方法的例子描述于Goldstein M.A.et al.(GoldsteinM.A.and Doi R.H.,Prokaryotic promoters in biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1:105-128)等。此外，也可能向基因的启动子区中引入一个或多个核苷酸取代，从而修饰待弱化的启动子，如WO0018935 A1所公开的。此外，已知取代Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或SD序列和起始密码子之间的间隔区，和/或核糖体结合位点(RBS)中的起始密码子直接上游或下游的序列中的几个碱基极大地影响mRNA的翻译效率。对这样的区域的该修饰可以与降低gshA基因的转录组合。

也可以通过将转座子或插入序列(IS)插入基因的编码区(美国专利No.5,175,107)或控制基因表达的区域，或通过常规方法，如使用紫外线(UV)照射或亚硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍，NTG)诱变来减弱gshA基因的表达。此外，可以通过基于例如λRed/ET介导的重组的已知染色体编辑方法进行位点特异性突变的掺入(Datsenko K.A.andWanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)。

可以测量gshA基因的拷贝数、存在或不存在，例如通过限制化处理染色体DNA，接着使用基于基因序列的探针的Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等进行。可以使用多种公知的方法，包括Northern印迹，定量RT-PCR等，通过测量从基因转录的mRNA的量确定基因表达的水平。可以通过已知的方法，包括SDS-PAGE，接着进行免疫印迹测定(Western印迹分析)，或蛋白样品的质谱分析等，测量由基因编码的蛋白的量。

用于操作重组DNA分子和分子克隆的方法，如制备质粒DNA，消化，连接和转化DNA，选择寡核苷酸作为引物，掺入突变等可以是对于本领域的技术人员公知的普通方法。这些方法描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或GreenM.R.and Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4th ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press (2012)；Bernard R.Glick,Jack J.Pasternak andCheryl L.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications ofrecombinant DNA”,4th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)。

在肠肝菌科的属，种或菌株之间DNA序列可能存在一些差异。因此，ghsA基因不限于SEQ ID NO:1中所示的基因，而可以包括作为SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列并且编码γGCS蛋白的基因。也就是说，短语“ghsA基因”不限于SEQ ID NO:1中所示的ghsA基因，而可以正确地指代SEQ ID NO:1中所示的ghsA基因及其变体核苷酸序列。

相似地，短语“γGCS”或“γGCS蛋白”不限于SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白，而可以正确地指代SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白及其变体蛋白。

短语“变体蛋白”可以表示与SEQ ID NO:2相比序列中具有一个或多个突变的蛋白，不论它们是取代，缺失，插入和/或添加一个或几个氨基酸残基，但其仍然维持了与γGCS蛋白相似的活性或功能，如如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性，或相对于野生型蛋白，其三维结构没有显著变化。变体蛋白中的变化数目取决于蛋白的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型。其可以是但不严格限于，SEQ ID NO:2中的1至100个，在另一个例子中1至50个，在另一个例子中1至30个，在另一个例子中1至15个，在另一个例子中1至10个，和在另一个例子中1至5个。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性，使得这些氨基酸之间的改变不影响蛋白的活性或功能，或通过这些氨基酸之间的变化，蛋白的三维结构相对于野生型蛋白没有显著改变。因此，相对于SEQ ID NO:2中所示的完整氨基酸序列，由gshA基因编码的变体蛋白可以具有不少于65％，不少于70％，不少于75％，不少于80％，不少于85％，不少于90％，不少于95％，不少于98％，或不少于99％的同源性，其在使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”，只要维持了γGCS蛋白的活性或功能，或γGCS蛋白的三维结构相对于野生型γGCS蛋白没有显著改变。

示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一个或几个氨基酸残基可以是保守突变。代表性的保守突变为保守取代。保守取代可以是但不限于取代，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，那么取代在Phe、Trp、Tyr之间相互发生；如果取代位点是疏水氨基酸，那么在Ala、Leu、Ile、Val之间相互发生；如果取代位点是亲水性氨基酸，在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之间相互发生；如果取代位点是极性氨基酸，在Gln和Asn之间相互发生；如果取代位点是碱性氨基酸，在Lys、Arg和His相互发生；如果取代位点是酸性氨基酸，在Asp和Glu之间相互发生；如果取代位点是具有羟基的氨基酸，在Ser和Thr之间相互发生。保守取代的例子包括Ser或Thr取代Ala；Gln,His或Lys取代Arg；Glu,Gln,Lys,His或Asp取代Asn；Asn,Glu或Gln取代Asp；Ser或Ala取代Cys；Asn,Glu,Lys,His,Asp或Arg取代Gln；Asn,Gln,Lys或Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn,Lys,Gln,Arg或Tyr取代His；Leu,Met,Val或Phe取代Ile；Ile,Met,Val或Phe取代Leu；Asn,Glu,Gln,His或Arg取代Lys；Ile,Leu,Val或Phe取代Met；Trp,Tyr,Met,Ile或Leu取代Phe；Thr或Ala取代Ser；Ser或Ala取代Thr；Phe或Tyr取代Trp；His,Phe或Trp取代Tyr；和Met,Ile或Leu取代Val。

示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一个或几个氨基酸残基也可以是非保守突变，只要该突变被氨基酸序列中的不同位置的一个或多个二次突变(secondary mutation)补偿，使得活性或功能与γGCS蛋白的活性或功能相似，诸如维持了如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶的活性，或γGCS蛋白的三维结构相对于野生型γGCS蛋白没有显著变化。

为了评估蛋白或DNA同源性的程度，可以使用几种计算方法，如BLAST搜索，FASTA搜索和ClustalW方法。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索是由blastp,blastn,blastx,megablast,tblastn,和tblastx程序采用的启发式搜索算法(heuristic search algorithm)；这些程序使用Karlin S.和Altschul S.F.的统计学方法(Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoring schemes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:2264-2268；Applications and statistics formultiple high-scoring segments in molecular sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)，将显著性归于它们的发现。计算机程序BLAST计算三个参数：得分，同一性和相似性。FASTA搜索方法由Pearson W.R.描述(Rapid and sensitive sequencecomparison with FASTP and FASTA,Methods Enzymol.,1990,183:63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.等人描述(CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gappenalties and weightmatrix choice,Nucleic Acids Res.,1994,22:4673-4680)。

SEQ ID NO:2所示的γGCS蛋白的变体蛋白的例子包括来自肠肝菌科的不同细菌的γGCS的蛋白同源物(γGCS同源物)。也就是说，来自肠杆菌科的不同细菌的γGCS同源物是已知的，其具有如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸连接酶活性。来自属于肠杆菌科的细菌的这些γGCS同源物的例子描述于下文(表1)，其中指出了同源性值(作为“同一性”，其为氨基酸的同一性)，分类数据，和NCBI数据库中的氨基酸序列的登记号和序列记录号(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)。

表1

*-在NCBI数据库(National Center for Biotechnology Information,www.ncbi.nlm.nih.gov/)中

gshA基因可以是编码γGCS蛋白的任意基因。例如，gshA基因可以是变体核苷酸序列。短语“变体核苷酸序列”可以表示下述核苷酸序列，其编码如上文所述的“变体蛋白”，或编码任意野生型γGCS蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白，使用根据标准遗传密码表的任意同义氨基酸密码子(见例如Lewin B.,“Genes VIII”,2004,PearsonEducation,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)。因此，gshA基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列，例如由于遗传密码的简并性所致的SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列。

短语“变体核苷酸序列”也可以表示但不限于在严格条件下与SEQ ID NO:1中所示的序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或可以在严格条件下从核苷酸序列制备的探针，只要其编码功能性蛋白质。“严格条件”包括在如下那些条件，在该条件下形成特异性杂交体，例如具有不低于60％，不低于65％，不低于70％，不低于75％，不低于80％，不低于85％，不低于90％，不低于95％，不低于96％，不低于97％，不低于98％，或不低于99％的同源性(当使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”)的杂交体，而不形成非特异性杂交体，例如具有低于上文的同源性的杂交体。例如，严格条件可以通过以盐浓度为1xSSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠)，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)，或在另一个例子中，0.1xSSC，0.1％SDS在60℃或65℃洗涤一次或多次，或在另一个例子中，两次或三次例示。洗涤的持续时间依赖于用于印迹的膜类型，且一般来说，可以是制造商所推荐的。例如，对于AmershamHybond^TM-N+带正电荷的尼龙膜(GE Healthcare)，在严格条件下推荐的洗涤持续时间是15分钟。该洗涤步骤可以进行2至3次。作为探针，也可以使用与SEQ ID NO:1中所示序列互补的序列的一部分。可以使用寡核苷酸作为基于SEQ ID NO:1中所示的序列制备的引物和含有核苷酸序列的DNA片段作为模版通过PCR产生此类探针。探针的长度推荐为>50bp，其可以基于杂交条件适当地选择，并通常为100bp至1kbp。例如，当具有约300bp长度的DNA片段作为探针使用时，杂交后的洗涤条件可以以2xSSC，0.1％SDS在50℃，60℃或65℃例示。

由于已经阐明了编码大肠杆菌物种的γGCS蛋白的基因(见上文)，可以如下获得编码γGCS蛋白的变体核苷酸序列，即利用基于gshA基因的核苷酸序列制备的引物进行PCR(聚合酶链式反应；参考White T.J.et al.,The polymerase chain reaction,TrendsGenet.,1989,5:185-189)；或者通过体外处理含有野生型gshA基因的DNA进行的定点诱变法(例如使用羟胺)，或用于处理微生物(例如含有野生型gshA基因的属于肠杆菌科的细菌)的方法，例如用紫外线(UV)照射或诱变剂进行，如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于此类处理的亚硝酸；或以全长基因结构化学合成。也就是说，可以由此获得编码肠杆菌科的其它细菌的γGCS蛋白的基因。

短语“野生型蛋白”可以表示由肠杆菌科的野生型或亲本细菌菌株，例如由野生型大肠杆菌MG1655菌株天然产生的天然蛋白。野生型蛋白可以由“野生型基因”编码，其可以存在于野生型细菌的基因组中。

以上关于基因和蛋白质的变体的描述也可以在作必要的变更后应用于任意的蛋白质，如L-氨基酸生物合成酶和编码它们的基因。

除了已经提到的特性外，在不偏离本发明的范围的情况下，细菌可以具有其它特定的特性，如各种营养需求，耐药性，药物敏感性和药物依赖性。

2.方法

本发明的方法包括用于产生L-氨基酸的方法，如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸，或其混合物。特别地，本发明的方法包括用于产生支链L-氨基酸的方法，如L-异亮氨酸，L-亮氨酸，和L-缬氨酸，或其混合物。更特别地，本发明的方法包括用于产生L-缬氨酸的方法。

用于产生L-氨基酸的方法可以包括下述步骤：在培养基中培养如本文所述的细菌以允许L-氨基酸产生，分泌，和/或在培养基中或在细菌细胞中，或两者中积累，以及从培养基和/或细菌细胞中收集L-氨基酸。收集的氨基酸可以进一步纯化。该目标L-氨基酸可以以游离形式，盐形式，或其水合形式，或其与另一个有机或无机化合物的加合物形式，或其组合产生。也就是说，短语“L-氨基酸”可以指代以游离形式的L-氨基酸，其盐形式，其水合物形式，其加合物形式，或其混合物。另外，短语“L-氨基酸”可以特别指代游离形式的氨基酸，其盐形式，或其混合物。例如，可以通过该方法产生L-氨基酸的铵，钠，钾等盐或内盐，如两性离子。这是可能的，因为氨基酸可以在发酵条件下在典型的酸-碱中和反应中相互反应或与中和剂，如无机或有机酸性或碱性物质反应以形成盐，这是氨基酸的化学特征，其对于本领域技术人员是明显的。特别地，可以通过该方法产生L-氨基酸的单盐酸盐(monochlorhydrate salt)，如L-赖氨酸的单盐酸盐(L-赖氨酸-HCl)或L-精氨酸的单盐酸盐(L-精氨酸-HCl)；或通过该方法可以产生L-氨基酸的单水合单盐酸盐(monochlorhydrate salt monohydrate)，如L-组氨酸的单水合单盐酸盐(L-组氨酸-HCl·H₂O)。

细菌的培养和L-氨基酸的收集和纯化可以以与常规发酵方法相似的方式进行，其中使用微生物产生L-氨基酸。用于产生L-氨基酸的培养基可以是合成的或天然的培养基，如含有碳源，氮源，硫源，磷源，无机离子，和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。作为碳源，可以使用糖类，如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，麦芽糖，木糖，海藻糖，核糖，蔗糖和淀粉水解物；醇，如乙醇，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇；有机酸，如葡糖酸，富马酸，柠檬酸、苹果酸和琥珀酸；脂肪酸等。作为氮源，可以使用无机铵盐，如硫酸铵，氯化铵和磷酸铵；有机氮，如大豆水解产物(soy bean hydrolyzates)；氨气；氨水等。此外，也可以利用蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆等等。硫源可以包括硫酸铵，硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸锰等。除了碳源，氮源，和硫源外，培养基可以含有磷源。作为磷源，可以利用磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸聚合物(phosphate polymer)，如焦磷酸等。维生素，如维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸(nicotinic acid)，烟酰胺(nicotinamide)和维生素B12；需要的物质，例如，有机营养物，如核酸，如腺嘌呤和RNA，氨基酸，蛋白胨，酪蛋白水解物或酵母提取物等可以以适当量(即便是痕量)存在。除了这些，如果必要的话，可以添加少量的磷酸钙，铁离子，锰离子等。

可以在需氧条件下进行培养，持续16至72小时，或16至65小时；培养期间的培养温度可以控制在30至45℃，或30至37℃内；且pH可以调节在5和8之间，或6.0和7.5之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质，以及氨气调节pH。

在培养后，可以从培养基中收集目标L-氨基酸。还有，在培养后，可以用例如超声波等破坏细胞，可以通过例如离心或膜过滤除去固体，如细胞和经细胞破环的悬液(cell-disrupted suspension)(也称为细胞碎片)获得上清液，然后，可以从上清液收集目标L-氨基酸。可以通过常规技术(如浓缩，离子交换层析，和结晶)的任意组合进行从培养基或上清液等收集L-氨基酸。

除了目标L-氨基酸外，收集的目标L-氨基酸组合物可以含有微生物细胞，培养基组分，水分(moisture)，以及微生物的副产物代谢物。收集的目标L-氨基酸的纯度可以是50％或更高，优选85％或更高，特别优选95％或更高(美国专利No.5,431,933,日本专利No.1214636,美国专利Nos.4,956,471,4,777,051,4,946,654,5,840,358,6,238,714,美国专利公布申请No.2005/0025878)。

实施例

本发明将参考以下非限制性实施例来更具体解释。

实施例1：具有失活的gshA基因的大肠杆菌菌株的构建

1.1大肠杆菌MG1655ΔgshA菌株的构建

通过最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的，称为“λRed/ET介导的整合”的方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)构建了具有失活的gshA基因的大肠杆菌菌株。根据该方法，构建了PCR引物P1(SEQ IDNO:3)和P2(SEQ ID NO:4)，其每一个在任一端与邻接gshA基因的区域同源，并在另一端与模板质粒中邻接赋予氯霉素抗性(Cm^R)的cat基因的区域同源。质粒pMIV-5JS(JP2008-99668,EP1942183 A1)用作模板。PCR的条件如下：95℃变性3分钟；最初2个循环的概况(profile)：95℃1分钟，34℃30秒，72℃1分钟；最后30个循环的概况：95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟；最后的延伸：72℃5分钟。

通过琼脂糖中的电泳纯化获得的PCR产物1(SEQ ID NO:5；1,378bp),并用于电穿孔含有具有温度敏感性复制起点的pKD46质粒的大肠杆菌M1655菌株。该pKD46质粒(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)包括噬菌体λ的2,154个核苷酸的DNA片段(核苷酸位置从31088至33241；GenBank,accessionNo.J02459)，并从而含有在阿拉伯糖诱导型P_araB启动子控制下的λRed同源重组系统的基因(γ、β、和exo基因)。pKD46质粒对于PCR产物整合到大肠杆菌M1655菌株(ATCC 47076)的染色体中是必要的。含有pKD46质粒的大肠杆菌M1655菌株可以从大肠杆菌Genetic StockCenter,Yale University,New Haven,USA获得(Accession No.CGSC7669)。

电感受态细胞如下制备：大肠杆菌MG1655/pKD46在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基(Luria-Bertani肉汤(broth)，也称为溶源性肉汤(lysogenic broth)；SambrookJ.and Russell D.W.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3^rd ed.),Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)中在30℃培养过夜；接着，使用5mL含有氨苄青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基(Sambrook J.,Fritsch E.F.and ManiatisT.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2^nd ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)将培养物稀释100倍。稀释的培养物在30℃通气(250rpm)培养至OD₆₀₀为约0.6，接着，通过浓缩100倍并使用冰冷的去离子H₂O洗涤三次变为电感受态。使用70μL细胞和约100ng的PCR产物1进行电穿孔。使用1mL的SOC培养基(Sambrook J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2^nd ed.),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)在30℃孵育电穿孔的细胞2.5小时，放置到含有溶源性肉汤(Sambrook J.andRussell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,2001)，琼脂(1.5％)和氯霉素(10mg/L)的平板上，并在37℃培养以选择Cm^R-重组体。为了消除pKD46质粒，在42℃在补充有氯霉素(10mg/L)的L-琼脂上进行了两次传代，且对获得的菌落测试对氨苄青霉素的敏感性。由此，获得了具有Cm^R-标志物的大肠杆菌MG1655ΔgshA菌株，其也称为大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株。

1.2.gsh基因缺失的确认

通过PCR确认了突变体大肠杆菌MG1655ΔgshA菌株中用氯霉素抗性基因(cat)标记的gshA基因缺失。基因座特异性引物P3(SEQ ID NO:6)和P4(SEQ ID NO:7)用于确认。PCR的条件如下：94℃变性3分钟；30个循环的概括(profile)：94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟；最终延伸：72℃6分钟。使用来自具有天然gshA基因的亲本菌株大肠杆菌MG1655的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物2的长度为2,155bp(SEQ ID NO:8)。使用来自突变体菌株大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R的染色体DNA作为模板的反应中获得的PCR产物3长度为1,858bp(SEQ ID NO:9)。

实施例2：具有失活的gshA基因的产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株的构建

为了测试gshA基因的失活对L-缬氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株(实施例1.1)的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产缬氨酸的大肠杆菌H81菌株(Miller J.H.,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLab.Press,Plainview,NY,1972)以获得大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R菌株。H81菌株(EP1239041A2)在2001年1月30日以保藏号VKPM B-8066保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(RussianFederation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2002年2月1日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。在含有溶源性肉汤，琼脂(1.5％)和氯霉素(10mg/L)的平板上选择具有失活的gshA基因的大肠杆菌H81菌株。如此，获得了大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R菌株。如实施例1.2中所述通过PCR确认了使用氯霉素抗性基因标记的gshA基因的缺失。

实施例3：通过大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R菌株的L-缬氨酸的生产

将经修饰的大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R和对照大肠杆菌H81菌株分别在2mL LB培养基中在34℃培养18小时。然后，将0.2mL获得的培养物每个接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器上(250rpm)在34℃培养72小时直到葡萄糖消耗。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

发酵培养基在116℃灭菌30分钟。葡萄糖和CaCO₃如下单独灭菌：葡萄糖在110℃灭菌30分钟而CaCO₃在116℃灭菌30分钟。在灭菌前通过添加6M KOH将pH调节到7.0。

培养后，通过薄层色谱法(TLC)确定培养基中积累的L-缬氨酸的量。使用没有荧光指示剂的Merck硅胶60包被的10×20-cm TLC平板(Merck,Darmstadt,Germany)。使用CamagLinomat 5样品敷料器(applicator)将样品应用到平板。Merck平板使用流动相显色，所述流动相由丙-2-醇:乙酸乙酯:25％氨水:水＝16:16:5:10(v/v)组成。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可视化试剂(visualizing reagent)。显色后，将平板干燥并使用Camag TLCScanner 3以吸光度模式扫描，其中使用winCATS软件(版本1.4.2)在520nm检测。

四次独立的试管发酵的结果(作为平均值)示于表2。如可以从表2中看到，与亲本大肠杆菌H81菌株相比，经修饰的大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R菌株能够产生更高量(g/L)的L-缬氨酸(Val)。表2还示出了与亲本大肠杆菌H81菌株相比，经修饰的大肠杆菌H81ΔgshA::Cm^R菌株能够以更高的产率(％，相对于消耗的葡萄糖)产生L-缬氨酸。

表2

实施例4：通过大肠杆菌382ΔgshA菌株的L-精氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-精氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产精氨酸的大肠杆菌382菌株以获得大肠杆菌382ΔgshA。382菌株在2000年4月10日以保藏号VKPM B-7926保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2001年5月18日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。

将大肠杆菌382和382ΔgshA菌株分别在3mL营养肉汤中在37℃振荡(220rpm)培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物每个接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器(220rpm)上在32℃培养48小时。

培养后，通过纸色谱法使用由正丁醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-精氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可视化试剂。将含有L-精氨酸的点切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-精氨酸，且L-精氨酸的量在540nm用分光光度法测定。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。

实施例5：通过大肠杆菌382ΔargGΔgshA的L-瓜氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-瓜氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产瓜氨酸的大肠杆菌382ΔargG菌株以获得大肠杆菌382ΔargGΔgshA。382ΔargG菌株是通过在产精氨酸的大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926,EP1170358 A1)的染色体上删除argG基因获得的，通过最初由DatsenkoK.A.和Wanner B.L.开发的称为“λRed/ET介导的整合”的方法(Datsenko K.A.and WannerB.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)得到。根据这一方法，构建了PCR引物，其每一个与argG基因临近的区域且与模板质粒中赋予抗生素抗性的基因临近的区域两者同源。质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR中用作模板。

将大肠杆菌382ΔargG和382ΔargGΔgshA菌株分别在3mL营养肉汤中在37℃振荡培养18小时。然后将0.3mL获得的培养物每个接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器上在32℃培养48小时。

培养后，通过纸色谱法使用由正丁醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-瓜氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可视化试剂。将含有L-瓜氨酸的点切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-瓜氨酸，且L-瓜氨酸的量在540nm用分光光度法测定。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

实施例6.通过大肠杆菌JM15(ydeD)ΔgshA的L-半胱氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-半胱氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产半胱氨酸的大肠杆菌JM15(ydeD)菌株以获得大肠杆菌JM15(ydeD)ΔgshA菌株。JM15(ydeD)菌株是大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218,168 B1)的衍生物，其已经使用含有ydeD基因的DNA转化(美国专利No.5,972,663)。ydeD基因编码一种膜蛋白，且其不参与任意L-氨基酸的生物合成途径。

用于评价L-半胱氨酸生产的发酵条件和方案详细描述于美国专利No.6,218,168B1的实施例6中。

实施例7：通过大肠杆菌VL334thrC⁺ΔgshA的L-谷氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-谷氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产谷氨酸的大肠杆菌VL334thrC⁺菌株(EP1172433 A1)以获得大肠杆菌VL334thrC⁺ΔgshA菌株。VL334thrC⁺菌株在2004年12月6日以保藏号VKPMB-8961保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNIIGenetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^stDorozhny proezd,1))，然后其于2004年12月8日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。

将大肠杆菌VL334thrC⁺和VL334thrC⁺ΔgshA菌株分别在L-琼脂平板上在37℃培养18-24个小时。然后，将一环细胞转移到含有2mL发酵培养基的20×200-mm试管中。在30℃进行振荡培养3天。

培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-谷氨酸的量，接着通过茚三酮(丙酮中的1％溶液)染色，在具有0.5％CdCl₂的50％乙醇中洗脱L-谷氨酸，并在540nm进一步评估L-谷氨酸的量。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。将pH调节到7.2。

实施例8：通过大肠杆菌MG1655+hisG^rhisL'_ΔΔpurRΔgshA的L-组氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-组氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段使用P1转导转移到产组氨酸的大肠杆菌MG1655+hisG^rhisL'_ΔΔpurR菌株以获得大肠杆菌MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurRΔgshA菌株。MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurR菌株描述于RU2119536 C1和Doroshenko V.G.et al.,Thedirected modification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producingmutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154。

将大肠杆菌MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurR和MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurRΔgshA菌株分别在2mL L-肉汤(L-broth)中在30℃培养3个小时(Sambrook J.and RussellD.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,2001)。然后，将0.1mL获得的培养物每个接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器上(250rpm)在30℃培养65小时。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

Mameno*是大豆粉水解物(soybean meal hydrolysate)(Ajinomoto Co,Inc.)。

葡萄糖，硫酸镁，甜菜碱和CaCO₃单独灭菌。灭菌前通过6M KOH溶液将pH调节到6.0。

培养后，通过薄层色谱法(TLC)确定在培养基中积累的L-组氨酸的量。使用含非荧光指示剂的Sorbfil硅胶(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm层包被的10×15-cm TLC平板。该Sorbfil平板使用流动相显色，所述流动相由丙-2-醇:丙酮:25％氨水:水＝6:6:1.5:1(v/v)组成。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可视化试剂。显色后，将平板干燥并使用Camag TLC Scanner 3以吸光度模式扫描，其中使用winCATS软件(版本1.4.2)在520nm检测。

实施例9：通过大肠杆菌57ΔgshA的L-亮氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-亮氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产亮氨酸的大肠杆菌57菌株(VKPMB-7386,美国专利No.6,124,121)以获得大肠杆菌57ΔgshA菌株。该57菌株在1997年5月19日以保藏号VKPM B-7386保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNIIGenetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^stDorozhny proezd,1))。

将大肠杆菌57和57ΔgshA菌株分别在L-琼脂平板上在37℃培养18-24小时。为了获得种子培养物，将菌株各自在旋转振荡器(250rpm)上在含有2mL补充有蔗糖(4％)的L-肉汤(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)的20×200-mm试管中在32℃培养18小时。接着，使用0.2mL种子培养物(10％)接种发酵培养基。在20×200-mm试管中在2mL的基本发酵培养基中进行发酵。在32℃在以250rpm振荡的情况下培养细胞48-72小时。

培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇(butan-1-ol):乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-亮氨酸的量。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖单独灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时。将pH调节到7.2。实施例10：通过大肠杆菌AJ11442ΔgshA的L-赖氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-赖氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产赖氨酸的大肠杆菌AJ11442菌株以获得大肠杆菌AJ11442ΔgshA菌株。该AJ11442菌株在1981年5月1日以保藏号FERM P-5084保藏于生物科学和人类技术研究所，工业和科学技术机构(National Institute ofBioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science andTechnology)(目前,NITE IPOD,日本，292-0818，千叶县(#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan))，然后其于1987年10月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，指定保藏号FERM BP-1543。

将大肠杆菌AJ11442和AJ11442ΔgshA菌株分别在含有链霉素(20mg/L)的L-培养基中在37℃培养。接着，将0.3mL获得的培养物各自接种到500-mL烧瓶中20mL含有所需药物的发酵培养基中。通过使用往复振荡器(reciprocal shaker)以115rpm的搅拌速度在37℃进行培养16小时。

培养后，通过已知的方法(Biotech-analyzer AS210,Sakura Seiki Co.)确定培养基中积累的L-赖氨酸和残留的葡萄糖的量。接着，对于每个菌株，相对于消耗的葡萄糖计算L-赖氨酸的产率。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

通过KOH将pH调节至7.0，且该培养基在115℃高压蒸汽处理10分钟。葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时并添加到培养基至终浓度为30g/L。

实施例11.通过大肠杆菌382ΔargFΔargI,ΔgshA的L-鸟氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-鸟氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产鸟氨酸的大肠杆菌382ΔargFΔargI菌株以获得大肠杆菌382ΔargFΔargI,ΔgshA菌株。382ΔargFΔargI菌株是通过产精氨酸的大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926,EP1170358 A1)染色体上的argF和argI基因的连续缺失得到的，通过最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的称为“λRed/ET介导的整合”的方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)得到。根据这一方法，构建了与argF或argI基因临近的两个区域同源的两对PCR产物，以及模板质粒中赋予抗生素抗性的基因。质粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR中用作模板。

将大肠杆菌382ΔargFΔargI和382ΔargFΔargI,ΔgshA菌株分别在3mL营养肉汤中在37℃振荡培养18小时。接着，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器上在32℃培养48小时。

培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-鸟氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可视化试剂。将含有L-鸟氨酸的点切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-鸟氨酸，且L-鸟氨酸的量在540nm用分光光度法评估。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

实施例12：通过大肠杆菌AJ12739ΔgshA的L-苯丙氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-苯丙氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产苯丙氨酸的大肠杆菌AJ12739菌株以获得AJ12739ΔgshA菌株。AJ12739菌株在2001年11月6日以保藏号VKPM B-8197保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后，其于2002年8月23日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。

将大肠杆菌AJ12739和AJ12739ΔgshA菌株分别在营养肉汤中在37℃培养18小时。接着，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的3mL发酵培养基中并在37℃在旋转振荡器上振荡培养48小时。

培养后，通过薄层色谱法(TLC)确定在培养基中积累的L-苯丙氨酸的量。使用含非荧光指示剂的Sorbfil硅胶(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,RussianFederation)的0.11-mm层包被的10×15-cm TLC平板。该Sorbfil平板使用流动相显色，所述流动相由丙-2-醇:乙酸乙酯:25％氨水:水＝40:40:7:16(v/v)组成。丙酮中的茚三酮溶液(2％)用作可视化试剂。

发酵培养基的组分(g/L)如下：

实施例13：通过大肠杆菌702ilvAΔgshA的L-脯氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-脯氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产脯氨酸的大肠杆菌702ilvA菌株以获得大肠杆菌702ilvAΔgshA菌株。702ilvA菌株在2000年7月18日以保藏号VKPM B-8012保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2001年5月18日依据布达佩斯条约的规定，转为国际保藏物。

将大肠杆菌702ilvA和702ilvAΔgshA菌株分别在L-琼脂平板上在37℃培养18-24小时。接着，这些菌株各自在与实施例7(L-谷氨酸的生产)相同的条件下培养。

实施例14：通过大肠杆菌B-3996ΔgshA的L-苏氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-苏氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产苏氨酸的大肠杆菌VKPM B-3996菌株以获得大肠杆菌B-3996ΔgshA菌株。VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以保藏号RIA1867保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics(Russian Federation,117105Moscow,Nagatinskaya Street,3-A)。该菌株也于2002年12月19日以保藏号VKPM B-3996保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄罗斯，邮政编码117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))。

将大肠杆菌VKPM B-3996和B-3996ΔgshA菌株分别在L-琼脂平板上在37℃培养18-24小时。为了获得种子培养物，菌株各自在旋转振荡器上(250rpm)在含有2mL补充有蔗糖(4％)的L-肉汤(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)的20×200-mm试管中在32℃培养18小时。接着，使用0.2mL(10％)种子培养物接种发酵培养基。在20×200-mm试管中的2mL的基本发酵培养基中进行发酵。细胞在32℃使用250rpm振荡培养65小时。

培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-苏氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％)用作可视化试剂。将含有L-苏氨酸的点切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脱L-苏氨酸，且L-苏氨酸的量在540nm用分光光度法评估。

发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaCO₃在180℃干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。灭菌后将抗生素引入培养基中。

实施例15：通过大肠杆菌SV164(pGH5)ΔgshA的L-色氨酸的生产

为了测试gshA基因的失活对L-色氨酸生产的影响，将来自上述大肠杆菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色体的DNA片段通过P1转导转移到产色氨酸的大肠杆菌SV164(pGH5)菌株以获得大肠杆菌SV164(pGH5)ΔgshA菌株。SV164(pGH5)菌株是通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164菌株获得的菌株。SV164菌株(JP 3032013B)具有trpE等位基因，其编码免于色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)。SV164菌株是通过向大肠杆菌YMC9菌株(ATCC 33927)的trpE基因中引入突变获得的菌株。YMC9菌株可以从美国典型培养物保藏中心获得(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)。质粒pGH5含有突变体serA基因，编码免于丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶。SV164菌株(pGH5)详细描述于美国专利No.6,180,373 B1或EP0662143 B1。

将大肠杆菌SV164(pGH5)和SV164(pGH5)ΔgshA菌株分别在3mL补充有四环素(20mg/L，pGH5质粒的标志物)的营养肉汤中在37℃振荡培养18小时。然后，将0.3mL获得的培养物各自接种到20×200-mm试管中的3mL发酵培养基中并在旋转振荡器上以250rpm在37℃培养48小时。

培养后，通过如实施例12(L-苯丙氨酸的生产)中所述的TLC确定培养基中积累的L-色氨酸的量。发酵培养基组分列于表3中，但应当以分开的组(A，B，C，D，E，F，G，和H)灭菌，如所显示的，以避免灭菌期间的不利相互作用。

表3

溶液A的pH使用NH₄OH调节至7.1。

*Mameno是大豆粉水解物(Ajinomoto Co,Inc.)

虽然本发明已经参考其优选的实施方案详细描述，但是对于本领域技术人员明显的是，可以在不偏离本发明范围的前提下进行各种变化以及采用同等方案。本文中所有引用的参考文献通过提述作为本申请的一部分收入。

工业应用性

根据本发明，可以改进通过肠肝菌科细菌的L-氨基酸，如支链L-氨基酸的生产。