CN103003437A - 使用具有编码肽酶的基因的减弱表达的肠杆菌科的细菌产生l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了使用经修饰减弱选自pepA、pepB和pepD基因的一种或多种基因的表达的肠杆菌科的细菌,特别是属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌产生L-氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工业,并具体涉及产生L-氨基酸,如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的方法。本方法使用经修饰减弱编码肽酶的基因的表达的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌。
背景技术
常规地,L-氨基酸在工业上通过利用来自自然来源的微生物菌株或其突变体的发酵方法产生。通常,所述微生物经修饰而增强L-氨基酸的生产收率。
已报道了许多增强L-氨基酸生产收率的技术,包括通过用重组DNA(参见,例如美国专利号4,278,765)转化微生物。其他增强生产收率的技术包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性,和/或使由产生的L-氨基酸造成的反馈抑制的靶酶脱敏(参见,例如,WO95/16042或美国专利号4,346,170;5,661,012和6,040,160)。
其它增强L-氨基酸生产收率的方式是减弱一种或几种涉及靶L-氨基酸的降解的基因,使靶L-氨基酸的前体从L-氨基酸的生物合成途径转向的基因,涉及碳、氮和磷通量的重新分配的基因,以及编码毒素的基因等的表达。
来自大肠杆菌(Escherichia coli)的pepA基因(同义词carP)编码组合了催化和调节特性的多功能酶氨肽酶A(PepA)。已显示:除了水解蛋白质的N端氨基酸残基之外,还需要氨肽酶A进行位点特异性DNA重组和质粒多聚体的单体化(monomerization)(Stirling等(1989)EMBO J.,8,1623-1627;Charlier等(1995)J.Mol.Biol.,250,392-406)。另一种氨肽酶A功能是转录调节。PepA是DNA结合蛋白,并涉及调控氨甲酰磷酸合酶的合成的carAB操纵子的转录抑制(Roovers等,(1988)J.Mol.Biol.,204,857-865)。氨甲酰磷酸是L-精氨酸和嘧啶生物合成途径的中间体。氨甲酰磷酸和L-鸟氨酸之间的相互作用导致L-瓜氨酸形成,其通过L-精氨琥珀酸转化为L-精氨酸。
来自大肠杆菌的pepB基因(同义词yhfI,b2523,ECK2520)编码氨肽酶B(PepB),其为大肠杆菌中的四种半胱氨酰甘氨酸酶(cysteinylglycinase)之一。氨肽酶B在体外切割Leu-Gly,Leu-Gly-Gly,Cys-Gly和Leu-Gly(Miller等(1994)Journal of Bacteriology,176,610-619,Hermsdorf等(1979)InternationalJournal of Peptide and Protein Research,13,146-151,Suzuki等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.,5,1549-1558)。在体内,氨肽酶B与氨肽酶A和N,以及二肽酶D一起,为四种半胱氨酰甘氨酸酶之一(Suzuki等,(2001)Journal of Bacteriology2001;183(4)1489-1490)。二价阳离子,包括一些并非活性的有效刺激剂的,稳定化氨肽酶免受热失活(Suzuki等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.,5,1549-1558.)。
来自大肠杆菌的pepD基因(同义词pepH,肌肽酶)编码肽酶D,其为能够分解多种具有未封闭的(unblocked)N端的二肽,包括半胱氨酰甘氨酸的二肽酶(Schroeder等,(1994)FEMS Microbiology Letters,123,153-159,Suzuki等,(2001)Journal of Bacteriology,183,1489-1490)。肽酶D作为PepD单体的二聚体起作用(Klein等,(1986)Journal of General Microbiology,132,2337-2343)。在磷酸盐饥饿过程中,pepD的转录增加至五倍(Henrich等,(1992)MolecularGeneral Genetics,232,117-125)。
然而,目前并无减弱编码肽酶的基因的表达用于产生L-氨基酸,如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸的报道。
本发明的公开
本发明的诸方面包括增强能够产生L-氨基酸,如L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-赖氨酸的菌株的生产率,并提供使用这些菌株产生此种L-氨基酸的方法。
上述诸方面通过发现使编码肽酶pepA,pepB,和/或pepD的基因失活可增强L-氨基酸,如L-精氨酸和L-赖氨酸的产生而实现。此外,因为L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径中的中间物,所以亦可增强此L-氨基酸的产生。
本发明提供了具有增加的产生L-氨基酸如L-精氨酸和L-瓜氨酸的能力的肠杆菌科的细菌。
本发明的一个方面是提供具有产生L-氨基酸能力的肠杆菌科的细菌,其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达:pepA,pepB,和pepD基因。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述基因的表达通过使所述基因失活来减弱。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
本发明的另一个方面是提供根据权利要求3的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述L-氨基酸选自下组:L-精氨酸,L-瓜氨酸和L-赖氨酸。
本发明的另一个方面是提供如上所述的细菌,其中所述细菌经修饰减弱pepA,pepB和pepD基因的表达,且所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
本发明的另一个方面是提供产生L-氨基酸的方法,其包括:
在培养基中培养如上所述的细菌;和
从培养基收集所述L-氨基酸。
本发明的另一个方面是提供如上所述的方法,其中所述L-氨基酸选自下组:L-精氨酸,L-瓜氨酸和L-赖氨酸。
附图说明
图1显示了引物对P1和P2在质粒pMW118-attL-Cm-attR上的相对位置。
图2显示包含失活的pepA基因的染色体DNA片段的构建。
实施方式的说明
本发明如下详述。
1.细菌
根据本发明公开的主题的细菌是具有产生L-氨基酸如L-精氨酸,L-瓜氨酸或L-赖氨酸的能力的肠杆菌科的细菌,其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达:编码氨肽酶的pepA,pepB和pepD基因。
术语“具有产生L-氨基酸的能力的细菌”可意指当在培养基中培养细菌时,能够产生L-氨基酸并将其分泌入培养基的细菌。
术语“具有产生L-氨基酸的能力的细菌”亦可意指能够产生L-氨基酸如L-精氨酸,L-瓜氨酸或L-赖氨酸,并导致所述L-氨基酸在培养基中以大于大肠杆菌的野生型或亲本株(如大肠杆菌K-12)的量蓄积的细菌,并且可意指所述微生物能够在培养基中造成不少于0.5g/L,在另一个实施例中不小于1.0g/L的L-氨基酸的量的蓄积。术语“L-氨基酸”可包括L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸。
肠杆菌科包括属于埃希氏菌(Escherichia)属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等等。具体而言,可使用根据NCBI(National Center forBiotechnology Information)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中所用的分类法归类为肠杆菌科的那些。具体实例是属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”可意指该细菌根据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类于埃希氏菌属。属于埃希氏菌属的细菌的实例为,但不限于,大肠杆菌(E.coli)。属于埃希氏菌属的细菌并无特别限制,然而例如涵盖由Neidhardt,F.C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1208,表1)所述的细菌。
短语“属于泛菌属的细菌”可意指该细菌根据微生物学领域的技术人员已知的分类法归类为泛菌属。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等,一些成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)的种最近被重新归类入成团泛菌(Pantoeaagglomerans),Pantoea ananatis,斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等。
短语“细菌经修饰而减弱了编码氨肽酶A的pepA基因的表达”可意指细菌以这样的方式被修饰使得经修饰的细菌含有减少量的氨肽酶A,或亦可意指所述细菌不能合成氨肽酶A。
短语“细菌经修饰而减弱了编码氨肽酶B的pepB基因的表达”可意指细菌以这样的方式被修饰使得经修饰的细菌含有减少量的氨肽酶B,或亦可意指所述细菌不能合成氨肽酶B。
短语“细菌经修饰而减弱了编码氨肽酶D的pepD基因的表达”可意指细菌以这样的方式被修饰使得经修饰的细菌含有减少量的氨肽酶D,或亦可意指所述细菌不能合成氨肽酶D。
短语“使基因失活”可意指经修饰的基因编码完全无功能的蛋白质。亦可能经修饰的DNA区由于基因一部分的缺失、基因开读框的移码、错义/无义突变的导入,或者基因邻接区(包括调控基因表达的序列,如启动子、增强子、减弱子、核糖体结合位点等)的修饰而不能天然表达该基因。
基因在细菌染色体上的存在与否可通过公知的方法,包括PCR、Southern印迹等来检测。此外,基因表达的水平可通过使用多种公知方法,包括Northern印迹、定量RT-PCR等来测量从基因转录的mRNA的量来进行估计。由基因编码的蛋白质的量可通过公知方法包括SDS-PAGE继以免疫印迹测定法(Western印迹分析)等来进行测量。
已阐明了编码来自大肠杆菌的氨肽酶A的pepA基因(同义词:carP,b4260,ECK4253)(与GenBank登录号NC_000913.2的序列中核苷酸4482463至4483974互补的核苷酸)。来自大肠杆菌的pepA基因位于染色体上holC和lptF基因之间。pepA基因的核苷酸序列,以及由pepA基因编码的PepA蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
已阐明了编码来自大肠杆菌的氨肽酶B的pepB基因(同义词:yfhI,b2523,ECK2520)(与GenBank登录号EG12310的序列中核苷酸2653097至2654380互补的核苷酸)。来自大肠杆菌的pepB基因位于染色体上iscX和sseB基因之间。pepB基因的核苷酸序列,以及由pepB基因编码的PepB蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
已阐明了编码来自大肠杆菌的氨肽酶D的pepD基因(同义词:pepH,b0237,ECK0238)(与GenBank登录号10695的序列中核苷酸254259至255716互补的核苷酸)。来自大肠杆菌的pepD基因位于染色体上gpt和prfH基因之间。pepD基因的核苷酸序列,以及由pepD基因编码的PepD蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
因为肠杆菌科的属或菌株之间DNA序列可有一些差异,因此在染色体上待失活的基因并不限于SEQ ID NO:1、7或9中所示的基因,但可包括与SEQ IDNO:1、7或9同源并编码变体蛋白质的基因。短语“变体蛋白质”可意指在序列中具有变化,无论是氨基酸的缺失、插入、添加或取代,但仍维持该蛋白质活性的蛋白质。在变体蛋白质中变化的数目取决于在蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可为1至30个,在另一个实例中为1至15个,并且在另一个实例中为1至5个。变体中的这些变化可发生在对于蛋白质功能并不至关重要的蛋白质区。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性,从而使得三维结构或活性并不受此种变化影响。因此,由基因编码的蛋白质变体可与SEQ IDNO.2、8或10中所示的完整氨基酸序列具有不小于80%,在另一个实例中不小于90%,在另一个实例中不小于95%,在另一个实例中不小于98%,并且在另一个实例中不小于99%的同源性,只要在失活之前的蛋白质能够作为氨肽酶或二肽酶起作用即可。在本说明书中,术语“同源性”亦可称作“同一性”。
两个氨基酸序列之间的同源性可使用公知方法例如计算机程序BLAST2.0(其计算三个参数:得分,同一性和类似性)来确定。
而且,所述pepA、B或D基因可为与SEQ ID NO:1、7或9中所示的核苷酸序列,或可从所述核苷酸序列制备的探针,在严格条件下杂交的变体,只要其在失活之前编码功能性蛋白质。“严格条件”包括在该条件下,形成特异性杂合体,例如具有不小于60%,在另一个实例中不小于70%,在另一个实例中不小于80%,在另一个实例中不小于90%,在另一个实例中不小于95%,在另一个实例中不小于98%,并且在另一个实例中不小于99%的同源性的杂合体,而不形成非特异性杂合体,例如具有低于上述的同源性的杂合体。举例而言,严格条件可例示为在对应于1x SSC,0.1%SDS,优选0.1x SSC,0.1%SDS的盐浓度在60℃洗涤一次,在另一个实例中洗涤两或三次。洗涤的持续时间取决于用于印迹的膜的类型,并且,大致而言,应为制造商所推荐的。举例而言,对于HybondTM N+尼龙膜(Amersham),在严格条件下的推荐的洗涤持续时间为15分钟。洗涤可进行2至3次。探针的长度可根据杂交条件适当地选择,并通常为100bp至1kbp。
基因的表达可通过将突变导入染色体上的基因,从而使得由该基因编码的蛋白质的胞内活性相对于未经修饰的菌株减少而减弱。导致基因表达的减弱的突变包括替代一个或多个碱基以导致由所述基因编码的蛋白质中的氨基酸取代(错义突变),终止密码子的导入(无义突变),缺失一个或两个碱基导致移码,插入药物抗性基因,或缺失基因一部分或整个基因(Qiu,Z.和Goodman,M.F.,J.Biol.Chem.,272,8611-8617(1997);Kwon,D.H.等,J.Antimicrob.Chemother.,46,793-796(2000))。pepA基因的表达亦可通过修饰表达调节序列如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列等来减弱(WO95/34672,Carrier,T.A.和Keasling,J.D.,Biotechnol Prog15,58-64(1999))。
举例而言,可采用下述方法通过基因重组来导入突变。可制备编码具有减少活性的突变蛋白质的突变基因,并可用含有所述突变基因的DNA片段转化待修饰的细菌。然后,通过同源重组用突变基因替代染色体上的天然基因,并可选择所得菌株。使用同源重组的基因替代可通过采用直链DNA进行,这称作“Red驱动的整合”(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,12,p6640-6645(2000)),或通过采用含有温度敏感性复制起点的质粒进行(美国专利号6,303,383或JP05-007491A)。此外,亦可使用如上所述的同源重组使用无法在宿主中复制的质粒来并入基因取代所致的位点特异性突变。
基因的表达亦可通过将转座子或IS因子插入基因的编码区(美国专利号5,175,107),或通过常规方法,如用UV辐照或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)进行的诱变,定位诱变,使用同源重组的基因破坏,和/或亦称作“Red-驱动的整合”的插入-缺失诱变(Yu,D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:5978-83以及Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)来减弱。
制备质粒DNA,消化和连接DNA,转化,选择寡核苷酸作为引物等的方法可为本领域技术人员公知的普通方法。这些方法例如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,“Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版”,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
L-氨基酸产生细菌
可采用能够产生L-氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-赖氨酸的细菌。
根据本发明公开的主题的细菌可通过使细菌中一种或多种编码具有天然或固有的产生L-氨基酸的能力的肽酶的基因失活来获得。或者,所述细菌可通过将产生L-氨基酸的能力赋予已经具有失活的编码肽酶的基因的细菌来获得。
L-精氨酸产生细菌
L-精氨酸产生细菌或可用于获得L-精氨酸产生细菌的亲本株的实例包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其携带突变的N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄罗斯专利申请号2001112869),大肠杆菌菌株382(VKPM B-7926)(EP1170358A1),一种导入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的精氨酸产生菌株(EP1170361A1),等等。
可用于获得L-精氨酸产生细菌的亲本株的实例亦包括其中一种或多种编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达得到增强的菌株。此类基因的实例包括编码N-乙酰谷氨酸合酶(argA),N-乙酰谷氨酸激酶(argB),N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC),乙酰鸟氨酸转氨酶(argD),乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE),鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF/I),精氨琥珀酸合成酶(argG),精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶(carAB)的基因。酶名称后括号中的缩写代表基因名称。
L-瓜氨酸产生细菌
属于埃希氏菌属的L-瓜氨酸产生细菌或可用于获得L-瓜氨酸产生细菌的亲本株的实例包括但不限于大肠杆菌菌株333(VKPM B-8084)和374(VKPMB-8086),两者均携带突变的反馈抗性氨甲酰磷酸合成酶(俄罗斯专利RU2264459C2),大肠杆菌菌株,其中α-酮戊二酸合酶活性增加,此外还修饰了铁氧还蛋白NADP+还原酶、丙酮酸合酶或α-酮戊二酸脱氢酶活性(EP2133417A1),以及菌株P.ananantis NA1sucAsdhA,其中琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性减少(美国专利申请号2009286290),等等。
因为L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间物,可用于得到L-瓜氨酸产生细菌的亲本酶的实例包括其中一种或多种编码L-精氨酸生物合成酶的基因得到增强的菌株。此类基因的实例包括但不限于编码N-乙酰谷氨酸合酶(argA),N-乙酰谷氨酸激酶(argB),N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC),乙酰鸟氨酸转氨酶(argD),乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE),鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF/I),和氨甲酰基磷酸合成酶(carAB)的基因,或其组合。
可用于获得本发明的L-瓜氨酸产生细菌的亲本株的实例亦可包括L-精氨酸产生菌株,其中催化L-瓜氨酸至L-精氨酸的转化的精氨琥珀酸合成酶(ArgG)的活性相对于亲本株减少。精氨琥珀酸合成酶的活性可通过藉由如上所述的常规方法使相应的基因argG失活来减少。
L-赖氨酸产生细菌
属于埃希氏菌属的L-赖氨酸产生细菌或亲本株的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长,但当L-赖氨酸存在于培养基中时,该抑制完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括但不限于氧代赖氨酸,赖氨酸氧肟酸(盐),S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC),γ-甲基赖氨酸,α-氯己内酰胺,等等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体可通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来获得。可用于产生L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543,NRRL B-12185;参见美国专利号4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中,L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制被脱敏。
菌株WC196可用作大肠杆菌的L-赖氨酸产生细菌。该细菌菌株是从W3110菌株培育的,后者来源于大肠杆菌K-12,即用编码突变的、对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变的lyC基因(其中位置352处的苏氨酸已用异亮氨酸替代)替代W3110菌株染色体上的野生型lyC基因,并对所得菌株赋予AEC抗性(美国专利号5,661,012)。所得菌株命名为大肠杆菌AJ13069,并于1994年12月6日保藏于通商产业省工业技术院人体工学工程技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency ofIndustrial Science and Technology)(目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology,International Patent Organism Depositary),Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本),并获得保藏号FERM P-14690。然后,于1995年9月29日,根据布达佩斯条约的规定,将其转为国际保藏,并得到登录号FERM BP-5252(美国专利号5,827,698)。
可用于获得能够产生L-赖氨酸的细菌的亲本株的实例亦包括其中一种或多种编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达得到增强的菌株。此类基因的实例包括但不限于编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA),天冬氨酸激酶(lysC),二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB),二氨基庚二酸脱羧酶(lysA),二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利号6,040,160),磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc),天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195A)的基因。此外,亲本株还可具有涉及能量效率的基因(cyo)(EP 1170376A),编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利号5,830,716),ybjE基因(WO2005/073390),或其组合的增加表达。
已知来源于大肠杆菌的野生型二氢吡啶二羧酸合成酶受L-赖氨酸的反馈抑制,而来源于大肠杆菌的野生型天冬氨酸激酶受L-赖氨酸的阻抑和反馈抑制。因此,当使用dapA和lysC基因时,这些基因可为编码不受L-赖氨酸的反馈抑制的酶的突变基因。
编码对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA的实例包括编码具有其中位置118处的组氨酸由酪氨酸替代的酶的氨基酸序列的蛋白质的DNA。编码对L-赖氨酸所致的反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶的DNA的实例包括编码具有其中位置352处的苏氨酸、位置323处的甘氨酸和位置318处的甲硫氨酸分别由异亮氨酸、天冬酰胺和异亮氨酸替代的氨基酸序列的AKIII的DNA(对于这些突变体,参见美国专利号5,661,012和美国专利号6,040,160)。此类突变体DNA可通过使用PCR等的位点特异性诱变来获得。
已知广宿主范围质粒RSFD80,pCAB1和pCABD2为含有编码突变的二氢吡啶二羧酸合成酶的突变的dapA基因和编码突变的天冬氨酸激酶的突变的lysC基因的质粒(美国专利号6,040,160)。用RSFD80转化的大肠杆菌JM109菌株命名为AJ12396(美国专利号6,040,160),该菌株于1993年10月28日保藏于通商产业省工业技术院人体工学工程技术研究所(目前为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)并分配保藏号FERM P-13936,然后该保藏于1994年11月1日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏,并分配保藏号FERM BP-4859。RSFD80可通过已知方法从AJ12396菌株获得。
可用于获得能够产生L-赖氨酸的细菌的亲本株的实例亦包括具有减少的或不具有催化从L-赖氨酸的生物合成途径分支而生成除L-赖氨酸之外的化合物的反应的酶的活性的菌株。此类酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶,赖氨酸脱羧酶(美国专利号5,827,698)和苹果酸酶(WO2005/010175)。为了减少或消除赖氨酸脱羧酶活性,可减少编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因和cadA基因二者的表达(国际专利公开WO2006/038695)。
cadA-和ldcC-基因破坏菌株的实例包括大肠杆菌WC196LC(WC196ΔcadAΔldc)菌株。WC196LC菌株,其命名为AJ110692,于2008年10月7日作为国际保藏保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Central 6,1-1,Higashi1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,305-8566,日本),并分配保藏号FERM BP-11027。
2.本发明的方法
例示性的方法包括通过将本文中所述的细菌在培养基中培养以产生L-氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸和/或L-赖氨酸,并将其分泌入培养基,并从培养基收集L-氨基酸,来产生L-氨基酸。
培养,从培养基收集和纯化L-氨基酸可通过常规发酵方法进行,其中使用细菌产生氨基酸。
用于培养的培养基可为合成或天然的培养基,只要所述培养基包含碳源和氮源以及矿物质,以及如果需要,所选的细菌生长所需的适量的营养物。所述碳源可括多种糖类如葡萄糖和蔗糖,以及多种有机酸。取决于所选的微生物的同化模式,可使用醇,包括乙醇和甘油。作为氮源,可使用多种铵盐如氨和硫酸铵,其它含氮化合物如胺类,天然氮源如蛋白胨,大豆水解物,以及消化的发酵微生物。作为矿物质,可使用一磷酸钾(potassium monophosphate),硫酸镁,氯化钠,硫酸亚铁,硫酸锰,氯化钙等。作为维生素,可使用硫胺素,酵母提取物等。
培养可优选在有氧条件下,如通过振荡培养,或通过通气的搅拌培养,在20至40℃,优选30至38℃的温度进行。培养的pH通常为5-9,优选为6.5-7.2。培养的pH可用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲液来调整。通常,1至5日培养导致L-氨基酸在液体培养基中蓄积。
在培养之后,固形物如细胞可通过离心或膜过滤从液体培养基移出,然后L-氨基酸可通过离子交换、浓缩和/或结晶方法来收集和纯化。
实施例
本发明可参考下述非限定性实例在下文中更具体地说明。
实施例1:构建具有失活的pepA基因的菌株。
1.pepA基因的缺失
细菌菌株中的pepA基因通过最初由Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12),6640-6645)开发的、称为“Red-驱动的整合”的方法来缺失。根据该步骤,构建了PCR引物P1(SEQ ID NO:3)和P2(SEQID NO:4),其与邻接pepA基因的区,和在模板质粒中赋予抗生素抗性的基因二者同源。将质粒pMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)用作PCR反应中的模板。PCR的条件如下所述:在94℃起始DNA变性30秒,然后25个循环,每循环在94℃变性30秒,在55℃退火30秒,在72℃延伸1分30秒;和在72℃进行最终延伸2分钟。
将1.7kb PCR产物(图1)从琼脂糖凝胶纯化,并用于含有质粒pKD46的大肠杆菌菌株MG1655(ATCC 700926)的电穿孔。pKD46质粒(Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:12:6640-45)含有温度敏感性复制起点,并包括噬菌体λ的2154核苷酸DNA片段(GenBank登录号J02459,核苷酸位置31088至33241),以及λRed同源重组系统的基因(γ,β,exo基因),其处于阿拉伯糖诱导性ParaB启动子的调控下。pKD46质粒对于PCR产物整合入MG1655菌株的染色体是必需的。菌株MG1655可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(P.O.Box 1549Manassas,VA20108,美国)获得。
电感受态细胞如下所述制备:将大肠杆菌MG1655/pKD46细胞在30℃在含有氨苄青霉素(100mg/l)的LB培养基中生长过夜,并将培养物用5ml含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培养基(Sambrook等,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)稀释100倍。将细胞在30℃通气生长至OD600≈0.6,然后通过浓缩100倍并用冰冷的去离子H2O洗涤三次使其成为电感受态。使用70μl的细胞和≈100ng的PCR产物进行电穿孔。电穿孔之后的细胞用1ml的SOC培养基(Sambrook等,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版”,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)在37℃温育2.5小时,然后铺板于含有氯霉素(30μg/ml)的L-琼脂上,并在37℃生长以选择CmR重组体。然后,为了消除pKD46质粒,在42℃在含Cm的L-琼脂上进行两次传代,并测试菌落对氨苄青霉素的敏感性。
2.通过PCR验证pepA基因缺失
其中pepA基因缺失的突变体标记有Cm抗性基因,并使用位点特异性引物P3(SEQ ID NO:5)和P4(SEQ ID NO:6)通过PCR验证。为此目的,将新鲜分离的菌落悬于20μl水中,然后将1μl的悬液用于PCR。PCR条件如下:在94℃进行起始DNA变性30秒,然后30个循环,每循环在94℃变性30秒,在55℃退火30秒,并在72℃延伸2分钟;在72℃最终延伸2分钟。在使用亲本pepA+菌株MG1655的细胞作为模板的PCR反应中获得的PCR产物长度为1.65kb。在使用突变的MG1655ΔpepA::cat菌株的细胞作为模板的PCR反应中获得的PCR产物长度为1.71kb核苷酸(图2)。
3.从大肠杆菌菌株MG1655ΔpepA::cat的染色体消除Cm抗性基因(cat基因)
使用int-xis系统从大肠杆菌pepA::cat菌株的染色体消除Cm抗性基因。为此目的,用pMWts-Int/Xis质粒(WO05/010175)转化大肠杆菌菌株MG1655pepA::cat。在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上选择转化体克隆。将平板在30℃温育过夜。通过将分离的菌落在37℃(在此温度阻抑物Cits部分失活,而int/xis基因的转录去阻抑)涂布,接着选择CmSApR变体而从cat基因和pMWts-Int/Xis对转化体克隆进行质粒消除(cure)。cat基因从菌株染色体的消除以位点特异性引物P3(SEQ ID NO:5)和P4(SEQ ID NO:6)通过PCR进行验证。PCR条件如下:在94℃起始DNA变性30秒;然后30个循环,每循环在94℃变性30秒,在55℃退火30秒,和在72℃延伸2分钟;在72℃最终延伸2分钟。在用MG1655ΔpepA::cat菌株的细胞作为模板的反应中获得的PCR产物长度为1.71kb。在用不含cat基因的细胞作为模板的反应中获得的PCR产物长度为160bp。由此,获得了具有失活的pepA基因和缺失的cat基因的菌株。
实施例2.通过大肠杆菌菌株382ΔpepA产生L-精氨酸
为了测试pepA基因的失活对L-精氨酸产生的作用,将来自上述大肠杆菌菌株MG1655ΔpepA的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller,J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)转移至产生L-精氨酸的大肠杆菌菌株382以获得大肠杆菌382ΔpepA菌株。菌株382于2000年4月10日以登录号VKPM B-7926保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(俄罗斯,117545Moscow,1Dorozhny proezd,1),然后于2001年5月18日根据布达佩斯条约转为保藏物。
将大肠杆菌菌株382和382pepA分别在37℃在3ml的营养液中振荡培养18小时,并将0.3ml的培养物接种入20x200-mm试管中的2ml的发酵培养基,并在32℃在旋转振荡器上培养48小时。
在培养之后,在培养基中蓄积的L-精氨酸的量通过使用下述流动相的纸层析确定:丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)。使用丙酮中的水合茚三酮溶液(2%)作为显影剂。切出含有L-精氨酸的印迹,用CdCl2的0.5%水溶液洗脱L-精氨酸,并在540nm用分光光度法估计L-精氨酸的量。
发酵培养基的组成(g/l)如下:
将葡萄糖和硫酸镁单独灭菌,将CaCO3在180℃干热灭菌2小时。将pH调整至7.0。
试管发酵的结果示于表1。如表1可见,具有失活的pepA基因的菌株与亲本L-精氨酸产生大肠杆菌菌株382相比能够产生更高量的L-精氨酸。
表1
实施例3.通过大肠杆菌菌株382ΔpepA产生瓜氨酸
为了测试pepA基因的失活对L-精氨酸产生的作用,将来自上述大肠杆菌菌株MG1655ΔpepA的染色体的DNA片段通过P1转导(Miller,J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)转移至大肠杆菌瓜氨酸产生菌株382ΔargG以获得大肠杆菌382ΔargGΔpepA菌株。菌株382ΔargG可通过藉由起初由Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12),6640-6645)开发的、称作“Red-驱动的整合”的方法缺失382菌株(VKPM B-7926)染色体上的argG基因来获得。根据该方法,可构建与邻接argG基因的区和在模板质粒中赋予抗生素抗性的基因二者同源的PCR引物。在PCR反应中,可使用质粒pMW118-attL-Cm-attR(WO05/010175)作为模板。
两个大肠杆菌菌株,382ΔargG和382ΔargGΔpepA,可分别在37℃在3ml营养液中振荡培养18小时,并将0.3ml获得的培养物接种于20x200-mm试管中的2ml的发酵培养基,并在32℃在旋转振荡器上培养48小时。
在培养之后,在培养基中蓄积的瓜氨酸的量可通过使用下述流动相的纸层析确定:丁醇:乙酸:水=4:1:1(v/v)。使用丙酮中的水合茚三酮溶液(2%)作为显影剂。可切出含有瓜氨酸的印迹,可用CdCl2的0.5%水溶液洗脱瓜氨酸,然后在540nm用分光光度法估计瓜氨酸的量。
发酵培养基的组成(g/l)如下所述:
将葡萄糖和硫酸镁单独灭菌,将CaCO3在180℃干热灭菌2小时。将pH调整至7.0。
实施例4:构建具有减少的氨肽酶活性的L-赖氨酸产生细菌
从WC196ΔcadAΔldcC菌株构建不表达氨肽酶A或B或C的菌株(WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km,WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km和WC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km菌株)。
WC196ΔcadAΔldcC菌株能够产生L-赖氨酸,并用于获得目标pep基因缺陷菌株。WC196ΔcadAΔldcC中的每个pep基因通过称作“Red-驱动的整合”的方法以与实施例1中所示类似的方式缺失。
pepA,pepB或pepD基因通过分别使用对于pepA,SEQ ID NO:11和12的引物,对于pepB,SEQ ID NO:13和14的引物,对于pepD,SEQ ID NO:15和16的引物来缺失。由此获得了其中缺失了每个氨肽酶基因的WC196ΔcadAΔldcCΔpepA::Km,WC196ΔcadAΔldcCΔpepB::Km和WC196ΔcadAΔldcCΔpepD::Km菌株。WC196196ΔcadAΔldcC菌株中的cadA基因和ldcC基因亦可以类似的方式缺失。
此外,将每个菌株在37℃在L培养基中培养直至培养物的最终OD600变为约0.6。然后,将相同体积的40%甘油溶液添加至培养物,搅拌混合物,然后分为合适的体积并储藏于-80℃。这些称为甘油储备物。
实施例5:减少氨肽酶活性的菌株的L-赖氨酸产生能力的评价
将菌株的每个甘油储备物解冻,并将各100μL平均地施于L-平板,并在37℃培养24小时。将上述甘油储备物解冻,并均匀地施于L-平板,并在37℃进行培养24小时。将获得的细胞的悬液稀释101倍,测量稀释的悬液的OD620值(n),并将对应于50/n的体积的细胞悬液接种入500mL Sakaguchi烧瓶中的20mL的发酵培养基,并在往复振荡的培养机器(115rpm)上在37℃进行培养48小时。在培养之后,在培养基中蓄积的L-赖氨酸的量以已知方式测量(Biotec Analyzer AS210,SAKURA SEIKI)。
发酵培养基的组成(g/l)如下:
L-赖氨酸发酵培养基的组成:
将培养基用KOH调整至pH7.0,并在115℃高压灭菌10分钟。将葡萄糖和MgSO4·7H2O在180℃分别干热灭菌2小时。
结果示于表2。得率(yield)(%)代表基于葡萄糖的L-赖氨酸的得率。如从表2可见,WC196ΔcadAΔldcCΔpepA,WC196ΔcadAΔldcCΔpepB和WC196ΔcadAΔldcCΔpepD菌株与亲本L-赖氨酸产生大肠杆菌菌株WC196ΔcadAΔldcC相比,能够产生更高量的L-赖氨酸。
表2
尽管已参照其优选实施方案详细描述了本发明,但是对于本领域技术人员显而易见的是可进行多种变化并可采用等同物,而不偏离本发明的范围。所有本文中引用的参考文献通过提述并入作为本申请一部分。
工业实用性
根据本发明,可改善L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-赖氨酸通过肠杆菌科的细菌的产生。
PCT/RO/134表
Claims (9)
1.一种具有产生L-氨基酸能力的肠杆菌科细菌,其中所述细菌经修饰而减弱了选自下组的一种或多种基因的表达:pepA,pepB,和pepD基因。
2.根据权利要求1的细菌,其中所述基因的表达通过使所述基因失活来减弱。
3.根据权利要求1或2的细菌,其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
4.根据权利要求3的细菌,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。
5.根据权利要求1或2的细菌,其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。
6.根据权利要求1至5中任一项的细菌,其中所述L-氨基酸选自下组:L-精氨酸,L-瓜氨酸和L-赖氨酸。
7.根据权利要求1至6中任一项的细菌,其中所述细菌经修饰而减弱了pepA,pepB和pepD基因的表达,且所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
8.一种产生L-氨基酸的方法,其包括:
在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项所述的细菌;和
从所述培养基收集所述L-氨基酸。
9.根据权利要求8的方法,其中所述L-氨基酸选自下组:L-精氨酸,L-瓜氨酸和L-赖氨酸。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106191146A (zh) * | 2015-05-28 | 2016-12-07 | 味之素株式会社 | 使用具有减弱的gshA基因表达的肠肝菌科细菌生产L‑氨基酸的方法 |
CN112266908A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-01-26 | 华东理工大学 | 一种重组肌肽水解酶突变体及其应用 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | L−アミノ酸の製造法 |
RU2013147882A (ru) | 2013-10-28 | 2015-05-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕН ПУТЬ ДЕГРАДАЦИИ ПУТРЕСЦИНА |
US10428359B2 (en) | 2016-10-03 | 2019-10-01 | Ajinomoto Co, Inc. | Method for producing L-amino acid |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007018310A1 (en) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE ybiV GENE |
JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
EP1870457A1 (en) * | 2005-03-29 | 2007-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Dipeptide crystals and process for production thereof |
CN101115832A (zh) * | 2004-11-26 | 2008-01-30 | 协和发酵工业株式会社 | 工业上有用的微生物 |
US20090137011A1 (en) * | 2006-06-01 | 2009-05-28 | Dmitriy Vladimirovich Filippov | METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE rcsA GENE |
CN101597588A (zh) * | 2001-02-13 | 2009-12-09 | 味之素株式会社 | 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法 |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
JPS5618596A (en) | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
JPH03501682A (ja) | 1988-10-25 | 1991-04-18 | 味の素株式会社 | L‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリbkiim b‐3996菌株 |
JPH07108228B2 (ja) | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
EP0643135B1 (en) | 1992-11-10 | 2001-08-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Dna encoding aspartokinase iii mutants and their use for the production of l-threonine by fermentation |
HU221120B1 (en) | 1993-10-28 | 2002-08-28 | Ajinomoto Kk | Process for producing different substances with use of microorganism |
JPH07155184A (ja) | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
WO1995034672A1 (fr) | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Ajinomoto Co., Inc. | GENE A DESHYDROGENASE α-CETOGLUTARIQUE |
HU223706B1 (hu) | 1994-12-09 | 2004-12-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Új lizin dekarboxiláz gén és eljárás L-lizin termelésére |
JP2000262288A (ja) | 1999-03-16 | 2000-09-26 | Ajinomoto Co Inc | コリネ型細菌の温度感受性プラスミド |
ATE411378T1 (de) | 2000-01-21 | 2008-10-15 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur herstellung von l-lysin |
JP4682454B2 (ja) | 2000-06-28 | 2011-05-11 | 味の素株式会社 | 新規変異型n−アセチルグルタミン酸合成酵素及びl−アルギニンの製造法 |
RU2215783C2 (ru) * | 2001-05-15 | 2003-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото - Генетика" | МУТАНТНАЯ N-АЦЕТИЛГЛУТАМАТ СИНТАЗА (ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, ШТАММ БАКТЕРИИ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ АРГИНИНА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА |
JP4380029B2 (ja) | 2000-07-05 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 微生物を利用した物質の製造法 |
RU2207371C2 (ru) | 2000-09-26 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот семейства l-глутаминовой кислоты, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
RU2208640C2 (ru) | 2000-07-06 | 2003-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА |
US7476531B2 (en) | 2001-02-13 | 2009-01-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia |
RU2264459C2 (ru) | 2001-08-03 | 2005-11-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата |
RU2229513C2 (ru) | 2001-11-23 | 2004-05-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
JP4894134B2 (ja) | 2003-07-29 | 2012-03-14 | 味の素株式会社 | 物質生産に影響する代謝フラックスの決定方法 |
PL1664318T3 (pl) | 2004-01-30 | 2010-03-31 | Ajinomoto Kk | Mikroorganizm wytwarzający L-aminokwas i sposób wytwarzania L-aminokwasu |
US8003367B2 (en) | 2004-03-16 | 2011-08-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes |
BRPI0516261A (pt) | 2004-10-07 | 2008-08-26 | Ajinomoto Kk | método para produzir uma substãncia básica por fermentação, e, caldo de fermentação ou produto de fermentação contendo uma substáncia básica |
US7915018B2 (en) | 2004-10-22 | 2011-03-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family |
WO2006088235A1 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
EP1856269B1 (en) | 2005-02-18 | 2008-12-10 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING A NON-AROMATIC L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY HAVING EXPRESSION OF THE csrA GENE ATTENUATED |
WO2006123764A1 (en) | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the kefb gene |
WO2007013639A1 (en) | 2005-07-25 | 2007-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE cpxR GENE |
EP2186881B1 (en) | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
EP2007873B1 (en) | 2006-04-18 | 2015-11-18 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE |
RU2337961C2 (ru) | 2006-07-04 | 2008-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB |
RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
JP2010130899A (ja) | 2007-03-14 | 2010-06-17 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミン酸系アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
JP2010226957A (ja) | 2007-10-17 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸の製造法 |
RU2008148283A (ru) | 2008-12-09 | 2010-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА artI |
EP2382320B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration |
RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
-
2010
- 2010-06-03 RU RU2010122647/10A patent/RU2471870C2/ru active
-
2011
- 2011-06-03 JP JP2012554143A patent/JP5846128B2/ja active Active
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- 2011-06-03 CN CN201180027419.0A patent/CN103003437B/zh active Active
- 2011-06-03 EP EP11727556.0A patent/EP2576802B1/en active Active
- 2011-06-03 BR BR112012030583-2A patent/BR112012030583B1/pt active IP Right Grant
-
2012
- 2012-11-28 US US13/687,541 patent/US8722370B2/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101597588A (zh) * | 2001-02-13 | 2009-12-09 | 味之素株式会社 | 通过埃希氏菌属细菌生产l-氨基酸的方法 |
CN101115832A (zh) * | 2004-11-26 | 2008-01-30 | 协和发酵工业株式会社 | 工业上有用的微生物 |
EP1870457A1 (en) * | 2005-03-29 | 2007-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Dipeptide crystals and process for production thereof |
WO2007018310A1 (en) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE ybiV GENE |
JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 |
US20090137011A1 (en) * | 2006-06-01 | 2009-05-28 | Dmitriy Vladimirovich Filippov | METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE rcsA GENE |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KAZUHIKO TABATA ET.AL.,: "Fermentative Production of L-Alanyl-L-Glutamine by a Metabolically Engineered Escherichia coli Strain Expressing L-Amino Acid α-Ligase", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106191146A (zh) * | 2015-05-28 | 2016-12-07 | 味之素株式会社 | 使用具有减弱的gshA基因表达的肠肝菌科细菌生产L‑氨基酸的方法 |
CN106191146B (zh) * | 2015-05-28 | 2021-08-17 | 味之素株式会社 | 使用具有减弱的gshA基因表达的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的方法 |
US11746345B2 (en) | 2015-05-28 | 2023-09-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an L-amino acid using a bacterium of the family Enterobacteriaceae having an attenuated expression of a gshA gene |
CN112266908A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-01-26 | 华东理工大学 | 一种重组肌肽水解酶突变体及其应用 |
CN112266908B (zh) * | 2020-10-29 | 2022-11-08 | 华东理工大学 | 一种重组肌肽水解酶突变体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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RU2471870C2 (ru) | 2013-01-10 |
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