JP6834177B2

JP6834177B2 - ｇｓｈＡ遺伝子の発現が弱化された腸内細菌科の細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造方法

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Publication number: JP6834177B2
Application number: JP2016105778A
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Description

本発明は、広くは微生物工業に関し、具体的には、gshA遺伝子の発現が弱化され、Ｌ−アミノ酸の生産が増強されるように改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌の発酵によりＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。

従来、Ｌ−アミノ酸は自然源から得られた微生物株あるいはそれらの変異体を利用した発酵法によって工業的に製造されてきた。典型的には、そのような微生物はＬ−アミノ酸の生産収率が高まるように改変されている。

Ｌ−アミノ酸の生産収率を高めるための多くの技術が報告されており、組換えDNAによ
る微生物の形質転換（例えば、特許文献１を参照）、プロモ−ター、リーダー配列及び／又はアテニュエーター、あるいはその他の当業者に知られた発現制御領域の改変（例えば、特許文献２および３を参照）などがある。生産収率を高めるその他の技術としては、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は生成したＬ−アミノ酸による目的とする酵素のフィードバック阻害を解除すること（例えば、特許文献４〜８を参照）が挙げられる。

Ｌ−アミノ酸の生産収率を高める別の方法としては、１種または数種の、目的とするＬ−アミノ酸の分解に関与する遺伝子、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から該Ｌ−アミノ酸の前駆体を別の経路に逸らせる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸の流れの再分配に関与する遺伝子、および毒素をコードする遺伝子などの発現を減少させることが挙げられる。

gshA遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸からのグルタチオン生合成経路の2つの工程のうち最
初の工程を触媒する、γ−グルタメートシステインリガーゼをコードする。この酵素は、グルタチオンによるフィードバック阻害を受ける（非特許文献１）。セリンアセチルトランスフェラーゼ（SAT）の活性が増強され、metC、tnaA、gshA、及びdfp遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリBL21（DE3）株が、細菌の発酵によるＬ−システインの製造方法に使
用されている（特許文献９）。

しかし、腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌の発酵によるＬ−アミノ酸の生産に対するgshA遺伝子の発現を弱化することの効果を示すデータはこれまで報告されていない。

米国特許第4278765号米国特許出願公開第2006/0216796号国際公開第9615246号パンフレット国際公開第9516042号パンフレット欧州特許出願公開第0685555号米国特許第4346170号米国特許第5661012号米国特許第6040160号中国特許出願公開第101831397号

Apontoweil P. and Berends W., Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K 12. Properties of the enzymes and regulation, Biochim. Biophys. Acta, 1975, 399(1):1-9

本発明は、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変された、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌（エシェリヒア（Escherichia）属に属するものであってもよく、
より具体的にはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））であってもよい）
を使用した、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等のＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。

上記課題は、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産菌（エシェリヒア属に属するものであってもよく、より具体的にはエシェリヒア・コリであってもよい）の染色体上のgshA遺伝子の発現を弱化させることにより、Ｌ−アミノ酸、より具体的には分枝鎖Ｌ−アミノ酸、特に、限定するものではないがＬ−バリン、のより高い生産性が該細菌に付与されるという知見により達成された。さらに、前記のような改変された腸内細菌科の細菌の発酵により、例えば、Ｌ−バリンを含む分枝鎖Ｌ−アミノ酸等のＬ−アミノ酸の生産収率が増大し得る。gshA遺伝子は、例えば、腸内細菌科に属する細菌（エシェリヒア属に属するものであってもよく、より具体的にはエシェリヒア・コリであってもよい）の染色体上のgshA遺伝子の発現を不活性化することにより弱化することができる。これらの知見に基づき、以下のような本発明の非限定的な態様が得られる。

本発明のひとつの態様として、
（i）腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を培養培地で培養して培地もしくは菌体、また
はその両者中にＬ−アミノ酸を生産させ、
（ii）培養培地もしくは菌体、またはその両者からＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸を製造する方法であって、
前記細菌が、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変されている方法が提供される。

本発明の別の態様として、前記細菌がエシェリヒア属に属するものである、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記細菌がパントエア（Pantoea）属に属するもので
ある、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記細菌がパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、gshA遺伝子の発現がgshA遺伝子の不活性化により弱化されている、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、gshA遺伝子が欠失している、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、gshA遺伝子が、下記（A）〜（F）からなる群から選択されるDNAである、前記方法が提供される：
（A）配列番号1の塩基配列を含むDNA、
（B）遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列を含むDNA、
（C）配列番号１の塩基配列全体に対して60%以上の同一性を有し、γ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有するタンパク質をコードするDNA、
（D）配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（E）配列番号2のアミノ酸配列であって、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、及び／又は付加を含む1またはそれ以上の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質
をコードするDNAであって、該タンパク質がγ−グルタメートシステインリガーゼの活性
を有するものであるDNA、
（F）配列番号2のアミノ酸配列全体に対して65%以上の同一性を有するタンパク質をコー
ドするDNAであって、該タンパク質がγ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有す
るものであるDNA。

本発明のさらに別の態様として、前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及び非芳香族Ｌ−アミノ酸からなる群から選択される、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンからなる群から選択される、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記非芳香族Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンからなる群から選択される、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記Ｌ−アミノ酸が分枝鎖Ｌ−アミノ酸である、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記分枝鎖Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−バリンからなる群から選択される、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の態様として、前記Ｌ−アミノ酸がＬ−バリンである、前記方法が提供される。

以下、本発明を詳細に説明する。

１．細菌
腸内細菌科に属し、且つgshA遺伝子の発現が弱化するように改変された任意のＬ−アミノ酸生産菌を使用することができる。「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、当該細菌を培養培地で培養したときに、培地及び／又は菌体中にＬ−アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味し得る。

また、「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、エシェリヒア・コリK-12株等の野生株または親株と比較して、より多い量でＬ−アミノ酸を培養培地中に生成し、排出もしくは分泌し
、且つ／又は蓄積することができる細菌も意味し得る。また、「Ｌ−アミノ酸生産菌」の用語は、例えば、0.1g/l以上、0.5g/l以上、あるいは1.0g/l以上の量で目的のＬ−アミノ酸を培地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。

さらに、腸内細菌科に属し、且つgshA遺伝子の発現が弱化するように改変された、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を使用することもできる。細菌は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有していてもよく、あるいは突然変異法あるいはDNA組換え技術を使用してＬ−ア
ミノ酸生産能を有するように改変されていてもよい。前記細菌は、本来的にＬ−アミノ酸生産能を有する細菌において、あるいはＬ−アミノ酸生産能を付与された細菌において、gshA遺伝子の発現を弱化させることにより得ることができる。あるいは、前記細菌は、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変された細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより得ることができる。前記細菌は、gshA遺伝子の発現を弱化させたことによりＬ−アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。

「Ｌ−アミノ酸生産能」の用語は、当該細菌を培養培地で培養したときに、培地及び／又は菌体から回収できる程度に、培地及び／又は菌体中に該Ｌ−アミノ酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する、細菌の能力を意味し得る。

前記細菌は、1種のアミノ酸を単独で生産してもよく、2種またはそれ以上のアミノ酸の混合物を生産してもよい。具体的には、前記細菌は、1種のＬ−アミノ酸を単独で生産し
てもよく、2種またはそれ以上のＬ−アミノ酸の混合物を生産してもよい。

「アミノ酸」の用語は、少なくとも1つのアミノ基（NH₂）及び少なくとも1つのカルボ
キシル基（COOH）を含む有機化合物を意味し得る。Ｌ−アミノ酸はアミノ酸の非限定的な例である。

「Ｌ−アミノ酸」の用語は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンを意味し得る。

「芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを包含する。Ｌ−ヒスチジンは芳香族部分（具体的にはイミダゾール環）を有するので、「芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、上記芳香族Ｌ−アミノ酸に加えてＬ−ヒスチジンも包含し得る。

「非芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンを包含する。Ｌ−ヒスチジンの生合成経路はＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシン等の通常の芳香族アミノ酸の生合成経路とは異なるので、「非芳香族Ｌ−アミノ酸」の用語は、上記非芳香族Ｌ−アミノ酸に加えてＬ−ヒスチジンも包含し得る。

すなわち、Ｌ−ヒスチジンは、「芳香族Ｌ−アミノ酸」及び「非芳香族Ｌ−アミノ酸」のいずれか一方あるいは両方に包含され得る。

Ｌ−アミノ酸は、1種またはそれ以上のＬ−アミノ酸ファミリーに属し得る。例として
、グルタミン酸ファミリーは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−プロリンを含み、セリンファミリーは、Ｌ−システイン、グリシン、及びＬ−セリンを含み、アスパラギン酸ファミリーは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−スレオニンを含み、ピルビン酸ファミリーは、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−バリンを含み、芳香族ファミリーは、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを含む。或るＬ−アミノ酸は別のＬ−アミノ酸の生合成経路の中間体になり得るので、上記アミノ酸ファミリーは、例えば非タンパク質性Ｌ−アミノ酸等の、その他のＬ−アミノ酸を包含し得る。例えば、Ｌ−シトルリン及びＬ−オルニチンはＬ−アルギニンの生合成経路からのアミノ酸である。したがって、グルタミン酸ファミリーは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−プロリンに加えて、Ｌ−シトルリン及びＬ−オルニチンを包含してもよい。

Ｌ−アミノ酸は、1種またはそれ以上のＬ−アミノ酸グループにも属し得る。例として
、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−バリンは分枝鎖Ｌ−アミノ酸グループに属し得る。さらに、Ｌ−ホモロイシン及びＬ−ホモイソロイシンも分枝鎖Ｌ−アミノ酸グループに属し得る。

Ｌ−アミノ酸としては、特に、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ホモロイシン、及びＬ−ホモイソロイシンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸として、具体的には、Ｌ−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−バリンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸として、より具体的には、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びＬ−バリンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸として、さらに具体的には、Ｌ−バリンが挙げられる。

「Ｌ−アミノ酸」の用語は、遊離形態のアミノ酸のみならず、アミノ酸の塩もしくは水和物、またはアミノ酸と別の有機もしくは無機の化合物とによって形成された付加物も包含し得る。アミノ酸の塩としては、例えば、硫酸塩、塩化物塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩が挙げられる。アミノ酸の塩として、具体的には、限定するものではないが、Ｌ−リジン塩酸塩（Ｌ−リジン・HCl）やＬ−アルギニン塩酸
塩（Ｌ−アルギニン・HCl）が挙げられる。アミノ酸の水和物としては、例えば、一水和
物や二水和物が挙げられる。アミノ酸の水和物として、具体的には、Ｌ−システイン一水和物（Ｌ−システイン・H₂O）が挙げられる。

腸内細菌科に属する細菌は、エンテロバクター、エルビニア、エシェリヒア、クレブシエラ、モルガネラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、イェルシニア等の属に属する細菌であり得、且つＬ−アミノ酸生産能を有し得る。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で用いられている分類法
により腸内細菌科に分類されている細菌を使用することができる。改変することができる腸内細菌科の細菌の例としては、エシェリヒア、エンテロバクターあるいはパントエア属の細菌が挙げられる。

改変することにより本発明のエシェリヒア属細菌を得ることができるエシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、具体的には、Neidhardtらの著書（Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, pp. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2^nd ed., ASM Press, Washington, D.C., 1996）に挙げられるものが使用できる。特にエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリの具体例としては、プロトタイプ野生株であるエシェリヒア・コリK-12株由来のエシェリヒア・コリW3110（ATC
C 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）等が挙げられる。これらの株は、
例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。すなわち各菌株には対
応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して発注することができる（www.atcc.orgを参照）。各菌株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられ、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析などによりパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア
・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはパントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌であれば、エンテロバク
ター属またはパントエア属のいずれに属するものであっても使用することができる。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、及びそれらの派生株を用いることができる。これらの株は、分離された当時
はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アナナティスに再分類されている。

以下、Ｌ−アミノ酸生産菌を具体的に例示する。以下に例示するもの等のＬ−アミノ酸生産菌の性質及びＬ−アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれもそれぞれ単独で、あるいは任意の適切な組み合わせで使用することができる。

Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリ237株（VKPM B-7925、米国特許出願公開2002058315 A1）及び変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼを
保持するその誘導株（ロシア特許第2215783 C2号、EP1170361 A1）、237株由来の酢酸資
化能が向上した株であるエシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926、EP1170358 A1）、エシェリヒア・コリK-12からのilvA遺伝子の野生型アレルをエシェリヒア・コリ382株に導入
することにより得た株であるエシェリヒア・コリ382ilvA⁺株等のエシェリヒア属に属する株が挙げられる。変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼの例としては、例えば、野生型酵素の15〜19位に相当するアミノ酸残基が置換されることによりＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼが挙げられる（EP1170361 A1）。

Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺
伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼをコードする遺伝子（argA）に加えて、Ｎ−アセチル-γ-グルタミルホスフェートレダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、Ｎ−アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノスクシネートシンターゼ（argG）、アルギニノスクシネートリアーゼ（argH）、及びカルバモイルホスフェートシンテターゼ（carAB）をコードする遺伝子が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産菌及びＬ−アルギニン生産菌を誘導するために使用することができ
る親株の例としては、アミノ酸アナログなどに対する耐性を有する株も挙げられる。そのような株の例としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、またはスルファグアニジンに対して耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株が挙げられる（特開昭56-106598号参照）。

Ｌ−シトルリン生産菌
Ｌ−シトルリン生産菌及びＬ−シトルリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、変異型Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリ237/pMADS11株、237/pMADS12株、及び237/pMADS13株
（RU2215783 C2、ヨーロッパ特許第1170361 B1号、米国特許第6,790,647 B2号）、フィードバック耐性カルバモイルホスフェートシンセターゼを保持するエシェリヒア・コリ333
株（VKPM B-8084）及び374株（VKPM B-8086）（ロシア特許第2264459 C2号）、α−ケト
グルタレートシンターゼ活性が増大し、フェレドキシンNADP⁺レダクターゼ、ピルベート
シンターゼ、及び／又はα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性がさらに改変されたエシェリヒア・コリ株（EP2133417 A1）などのエシェリヒア属に属する株、スクシネートデヒドロゲナーゼ及びα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア・アナナティスNA1sucAsdhA株（米国特許出願公開2009286290 A1号）などが挙げられる。

Ｌ−シトルリンはＬ−アルギニン生合成経路の中間体であるので、Ｌ−シトルリン生産菌及びＬ−シトルリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強され
た株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェートレダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルホスフェートシンセターゼ（carAB）をコードする遺伝子、並びにそれらの組合せが挙げられる。

また、Ｌ−シトルリン生産菌は、任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926）から、argG遺伝子にコードされるアルギニノスクシネートシンターゼを不活性化することにより容易に得ることができる。

Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌及びＬ−システイン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレルで形質転換されたエシェリヒア・コリJM15（米国特許第6,218,168 B1号、ロシア特許第2279477 C2号）、細胞に対して毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリW3110（米国特許第5,972,663 A号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ株（JP11155571 A2）、cysB遺伝子によりコードされるシステインレ
ギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリW3110（WO0127307 A1
）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。また、Ｌ−システイン生産菌及びＬ−システイン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリJM15(ydeD)も挙げられる。エシェリヒア・コリJM15(ydeD)は、エシェリヒア・コリJM15の派生株であり（米国特許第6,218,168 B1号）、ydeD遺伝子を含むDNAで形質転換
されている（米国特許第5,972,663号）。

Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することが
できる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリVL334thrC⁺（EP
1172433 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。エシェリヒア・コリVL334（VKPM B-1641）は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ
−スレオニン要求性株である（米国特許第4,278,765号）。thrC遺伝子の野生型アレルは
、野生型エシェリヒア・コリK12株（VKPM B-7）の細胞で増殖したバクテリオファージP1
を用いる一般的形質導入法により導入された。その結果、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するＬ−イソロイシン要求性のVL334thrC⁺株（VKPM B-8961）が得られた。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタメートシンテターゼ（gltBD）、イソシトレートデヒドロゲナーゼ（icdA
）、アコニテートヒドラターゼ（acnA、acnB）、シトレートシンターゼ（gltA）、ピルベートカルボシラーゼ（pyc）、ピルベートデヒドロゲナーゼ（aceEF、lpdA）、ピルベートキナーゼ（pykA、pykF）、ホスホエノールピルベートシンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA、pgmI）、ホスホグリセレートキナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースホスフェートイソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（fbp）、及び
グルコースホスフェートイソメラーゼ（pgi）をコードする遺伝子が挙げられる。

シトレートシンテターゼ遺伝子、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989 A2、EP955368 A2、及びEP952221 A2に開示されたものが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。そのような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ（aceA）、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（sucA）、アセトラクテートシンターゼ（ilvI）、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ（pfl）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ldh）、グルタメートデカルボキシラーゼ（gadAB）、及びスクシネートデヒドロゲナーゼ（sdhABCD）が挙げられる。カッコ内には、その酵素をコードする遺伝子の一例を示す（以下の記載においても同様）。α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を欠損した、またはα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属細菌、及びそれらの取得方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。具体的には、そのような株として下記のものが挙げられる。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）

エシェリヒア・コリW3110sucA::Km^R は、エシェリヒア・コリW3110のα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下「sucA遺伝子」という）を破壊することにより得られた株である。この株はα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性を完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株のその他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質
（アスパラギン酸アナログ）に対して耐性を有する株が挙げられる。これらの株は、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、そのような例としては、例えば、エシェリヒア・コリAJ13199（FERM BP-5807、米国特許第5,908,768号）、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したエシェリヒア・コリFFRM P-12379（米国特許第5,393,671
号）、エシェリヒア・コリAJ13138（FERM BP-5565、米国特許第6,110,714号）などが挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、パン
トエア・アナナティスSC17株（FERM BP-11091）、パントエア・アナナティスSC17（0）株（VKPM B-9246）などのパントエア属細菌も挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（
米国特許第6,596,517号）。SC17株は、2009年2月4日に、独立行政法人産業技術総合研究
所特許生物寄託センター（現独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE IPOD）、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。AJ13355株は、1998年2月19日に、通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国
千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM P-16644が付与さ
れている。その後、この寄託は1999年1月11日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、またはα−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下した、上記のようにして得られるパントエア属に属する変異株も挙げられる。そのような株としては、パントエア・アナナティスAJ13356株（米国特許第6,331,419 B1号）が挙げられる。パントエア・アナナティスAJ13356株は、1998年2月19日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。パントエア・アナナティスAJ13356株
は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）が破壊されたことによりα−ケトグルタレー
トデヒドロゲナーゼ活性を欠損している。この株は、単離された際にはエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13356株として寄託
されたが、近年、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。AJ13356株は、上記寄託機関にエンテロバクター・アグロメランスとして
寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスとして記載する。

Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、パントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、パントエア・アナナティスAJ13601株、パントエア・アナナティスNP106株、及びパントエア・アナナティスNA1株などのパントエア属に属する株も挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB
株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のシトレートシンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、及びグルタメートデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のシトレートシンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から、低pH下で高濃度
のＬ−グルタミン酸に対して耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は
、AJ13601株からプラスミドRSFCPG及びpSTVCBを脱落させることにより得た株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE IP
OD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、
受託番号FERM P-17516が付与された。その後、この寄託は、2000年7月6日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。

Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌及びＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリ24株（VKPM B-5945
、RU2003677 C1）、エシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270、RU2119536 C1）、エシェリ
ヒア・コリNRRL B-12116〜B-12121（米国特許第4,388,405号）、エシェリヒア・コリH-9342（FERM BP-6675）及びH-9343（FERM BP-6676）（米国特許第6,344,347 B1号）、エシェリヒア・コリH-9341（FERM BP-6674、EP1085087 A2）、エシェリヒア・コリAI80/pFM201
（米国特許第6,258,554 B1号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌及びＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、ATPホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル-AMPサイクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル-ATPサイクロヒドロラーゼ/ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ（hisIE）、ホスホリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイド
イソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールホスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）などをコードする遺伝子が挙げられる。

hisG及びhisBHAFIによりコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素は、Ｌ−ヒスチジンにより阻害されることが知られている。従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPホスホリ
ボシルトランスフェラーゼにフィードバック阻害に対する耐性を付与する変異を導入することにより、効率的に増強することができる（ロシア特許第2003677 C1号及び第2119536 C1号）。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを搭載するベクターで形質転換されたエシェリヒア・コリFERM-P 5038及び5048（特開昭56-005099号）、アミノ酸排出遺伝子であるrhtで形質転換されたエシェリヒア・コリ株（EP1016710 A2）、スルファグアニジン、ＤＬ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性が付与されたエシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270, RU2119536 C1）、エシェリヒア・コリMG1655+hisGr hisL'_{_}Δ ΔpurR（RU2119536、Doroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154）などが挙げられる。

Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌及びＬ−イソロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対して耐性を有する変異株（特開平5-304969号）、チアイソロイシンやイソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに対して耐性を有する変異株、さらにＤＬ−エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対して耐性を有する変異株（特開平5-130882号）が挙げられる。さらに、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もＬ−イソロイシン生産菌またはその親株として使用できる（特開平2-458号、EP 0356739 A1及び米国特許第5,998,178号）。

Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌またはＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ロイシン耐性のエシェリヒア・コリ株（例えば、57株（VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号））、β-2-チエニルアラニン、3-ヒ
ドロキシロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログに耐性のエシェリヒア・コリ株（特公昭62-34397号及び特開平8-70879号）、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたエシェリヒア・コリ株、エシェリヒア・コリH-9068（特開平8-70879号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

Ｌ−ロイシン生産菌及びＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−ロイシン生合成に関与する１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたα-イソプロピルマレートシンターゼをコードする変異型leuA遺
伝子（米国特許第6,403,342 B1号）に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられ
る。さらに、Ｌ−ロイシン生産菌及びＬ−ロイシン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、細菌細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１種またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）が挙げられる（EP 1239041 A2）。

Ｌ−リジン生産菌
Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア属に属し、Ｌ−リジンアナログに対して耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害はＬ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、限定するものではないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−
クロロカプロラクタムなどが挙げられる。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人為的変異誘発処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産に有用な細菌株の具体例としては、エシェリヒア・コリAJ11442（FERM BP-1543、NRRL B-12185、米国特許第4,346,170号参照）及びエシェリヒア・コリVL611が挙げられる。これらの株では、Ｌ−リジンによるアスパルトキナーゼの
フィードバック阻害が解除されている。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発現が
増強された株も挙げられる。そのような遺伝子の例としては、限定するものではないが、ジヒドロジピコリネートシンターゼ（dapA）、アスパルトキナーゼIII（lysC）、ジヒド
ロジピコリネートレダクターゼ（dapB）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（lysA）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ppc）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（asd）、及びアスパルターゼ（aspA）（EP1253195 A）をコードする遺伝子が挙げられる。また、Ｌ−リジン生産菌またはその親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716 A号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、ま
たはこれらの組合せの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIIIはＬ−
リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するために、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を使用してもよい（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリネートシンターゼはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増
強するために、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリネートシンターゼをコードする変異型dapA遺伝子を使用してもよい。

Ｌ−リジン生産菌またはＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株においては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してそれ以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。また、Ｌ−リジン生産菌またはＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株においては、Ｌ−リジンの合成または蓄積に負に作用する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。そのようなＬ−リジン生産に関与する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA、ldcC）、リンゴ酸酵素などが挙げられ、これらの酵素の活性を低下または欠損させた株はWO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175などに開示されている。

リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることができる。両遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載の方法により低下させることができる。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリWC196株（米国特許第5,827,698号）、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc株、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldc/pCABD2株（WO2006/078039）も挙げられる。

WC196株は、エシェリヒア・コリK-12に由来するW3110株から、W3110株にAEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、エシェリヒア・コリAJ13069と命名され、1994年12月6日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE IPOD
、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受
託番号FERM P-14690が付与された。その後、1995年9月29日にブダペスト条約の規定に基
づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。

WC196ΔcadAΔldc株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊することにより、WC196株から構築された。WC196ΔcadAΔldc株はAJ110692と命名さ
れ、2008年10月7日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-11027で国際寄託として寄託された。

WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株は、WC196ΔcadAΔldcC株に、リジン生合成遺伝子を含む
プラスミドpCABD2を導入することにより構築された（米国特許第6,040,160号）。プラス
ミドpCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異（H118Y）を有する
ジヒドロジピコリネートシンターゼ（DDPS）をコードするエシェリヒア・コリ由来の変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異（T352I）を有す
るアスパルトキナーゼIIIをコードするエシェリヒア・コリ由来の変異型lysC遺伝子と、
エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリネートレダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のジアミノピメレートデヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含む。

Ｌ−リジン生産菌及びＬ−リジン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリAJIK01（NITE BP-01520）も挙げられる。AJIK01株はエ
シェリヒア・コリAJ111046と命名され、2013年1月29日にNITE IPOD（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託されている。その後、2014年5月15日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01520が付
与されている。

Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌及びＬ−メチオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリAJ11539（NRRL B-12399）、AJ11540（NRRL B-12400）、AJ11541（NRRL B-12401）、AJ11542（NRRL B-12402）（英国特許第2075055号）、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシンに対して耐性
を有するエシェリヒア・コリ218株（VKPM B-8125、RU2209248 C2）及び73株（VKPM B-8126、RU2215782 C2）などが挙げられる。エシェリヒア・コリ73株は、2001年5月14日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8126で寄託された。その後、2002年2月1日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管された。さらに、メチオニンリプレッサー欠損株、及びホモセリントランスサクシニラーゼやシスタチオニンγ-シンターゼなどのメチオニン生合成に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子で形質転換された組換え株（特開2000-139471号）もＬ−メチオニン生産菌
またはその親株として使用できる。

Ｌ−オルニチン生産菌
Ｌ−オルニチンはＬ−アルギニン生合成経路の中間体であるので、Ｌ−オルニチン生産菌及びＬ−オルニチン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、上記したようなＬ−アルギニン生合成酵素をコードする1種またはそれ以上の遺伝子の発
現が増強された株が挙げられる。

また、Ｌ−オルニチン生産菌は、任意のＬ−アルギニン生産菌、例えばエシェリヒア・コリ382株（VKPM B-7926）から、argF及びargI両遺伝子によりコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活性化することにより容易に得ることができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活性化する方法は本明細書に記載する。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌及びＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリAJ12739（tyrA::Tn10, tyrR）（VKPM B-8197）、変異型pheA34遺伝子を保持するエシェリヒア・コリHW1089（ATCC 55371、米国特許第5,354,672号）、エシェリヒア・コリMWEC101-b（KR8903681）、エシェリヒア・コリNRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、及びNRRL B-12147（米国特許第4,407,952号）、エシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB]（FERM BP-3566）、エシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD]（FERM BP-12659）、エ
シェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm]（FERM BP-12662）、並びにAJ12604と命名されたエシェリヒア・コリK-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]（FERM BP-3579、EP488424 B1）が挙げられる。さらに、Ｌ−フェニルアラニン生産菌及びＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するために使用することができる親株としては、yedA遺伝子またはyddG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も挙げられる（米国特許第7,259,003号及び第7,666,655号）。

Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ilvA遺伝子を欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるエシェリヒア・コリ702ilvA（VKPM B-8012、EP1172433 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、Ｌ−プロリン生合成に関与する1種またはそれ以
上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。Ｌ−プロリン生産菌において使用するこ
とができるそのような遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子が挙げられる（DE3127361 A1）。さらに、Ｌ−プロリン生産菌及びＬ−プロリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、細菌の細胞からのＬ−アミノ酸の排出を担うタンパク質をコードする遺伝子の1種またはそれ以上遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。このような
遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）（EP1239041 A2）が
挙げられる。

Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404（英国特許第2075056号）、VKPM B-8012（ロシア特許第2207371 C2号）、DE3127361 A1に記載のプラスミド変異株、Bloom F.R. et al "The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34"に記載のプラスミド変異株などのエシェリヒア・コリ株が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌及びＬ−スレオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、エシェリヒア・コリTDH-6/pVIC40（VKPM
B-3996、米国特許第5,175,107号及び第5,705,371号）、エシェリヒア・コリ472T23/pYN7（ATCC 98081、米国特許第5,631,157号）、エシェリヒア・コリNRRL B-21593（米国特許
第5,939,307号）、エシェリヒア・コリFERM BP-3756（米国特許第5,474,918号）、エシェリヒア・コリFERM BP-3519及びFERM BP-3520（米国特許第5,376,538号）、エシェリヒア
・コリMG442（Gusyatiner et al., Genetika (Russian), 1978, 14:947-956）、エシェリヒア・コリVL643及びVL2055（EP1149911 A2）、エシェリヒア・コリVKPM B-5318（EP0593792 A1）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。

TDH-6株は、thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、そのilvA遺伝子がリーキ
ー（leaky）変異を有する。この株は、また、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたは
ホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。VKPM B-3996株は、プラスミドpVIC40
を保持する株であり、TDH-6株にプラスミドpVIC40を導入することにより得られたもので
ある。プラスミドpVIC40は、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010由来ベクターに挿入することにより得たものである。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。VKPM B-3996株は、1987年11月19日にAll-Union Scientific Center of Antibiotics（Russian Federation, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A）に受
託番号RIA 1867で寄託されている。VKPM B-3996株は、1987年4月7日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）にも受託番号B-3996で寄託されている。

B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域を温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換したプラスミドpPRT614を保持する。VKPM B-5318株は、1990年5月3日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）に受託番号VKPM B-5318で寄託されて
いる。

Ｌ−スレオニン生産菌あるいはＬ−スレオニン生産菌を誘導するために使用することができる親株は、下記の遺伝子の1種またはそれ以上の発現が増強されるように改変されて
いてもよい：
- スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子、
- ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、
- スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子;
- スレオニン及びホモセリン排出系の推定膜貫通型タンパク質をコードするrhtA遺伝子、
- アスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子、
- アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子。

エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードす
るthrA遺伝子は明らかにされている（KEGG、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
、エントリーNo. b0002、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置337〜2,799、Gene ID 945803）。thrA遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体においてthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。

エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0003、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置2,801〜3,733、Gene ID 947498）。thrB遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体においてthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。

エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0004、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置3,734〜5,020、Gene ID 945198）。thrC遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体においてthrB遺伝子とyaaX遺伝子との間に位置する。これらの３つの遺伝子全部が、単一のスレオニンオペロンthrABCとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響するアテニュエーター領域をオペロンから除去することが望ましい（WO2005/049808 A1、WO2003/097839 A1）。

スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性のアスパルトキナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子、ならびにthrB遺伝子及びthrC遺伝子
は、エシェリヒア・コリスレオニン生産株VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から単一のオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。

エシェリヒア・コリのスレオニン及びホモセリン排出系（内膜輸送体）のタンパク質をコードするrhtA遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0813、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置848,433〜849,320、相補鎖、Gene ID 947045）。rhtA遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQオペロン近くのdps及びompX遺伝子の間に位置する。rhtA遺伝子はybiF遺
伝子（KEGG、エントリーNo. B0813）と同一である。

エシェリヒア・コリのアスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b3433、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置3,571,798〜3,572,901、相補鎖、Gene ID 947939）。asd遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、同じ鎖上に位置するglgB及びgntU遺伝子の間に位置する（yhgN遺伝子は反対鎖上）。

また、エシェリヒア・コリのアスパルテートアミノトランスフェラーゼをコードするaspC遺伝子は明らかにされている（KEGG、エントリーNo. b0928、GenBank accession No. NC_{_}000913.2、ヌクレオチド位置983,742〜984,932、相補鎖、Gene ID 945553）。aspC遺伝子は、エシェリヒア・コリK-12の染色体上、反対鎖上のycbL遺伝子と同一鎖上のompF遺伝
子との間に位置している。

Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、部分的に不活性化されたトリプトファニル-tRNAシンテターゼをコードする変異型trpS遺伝子を保持するエシェリヒア・
コリJP4735/pMU3028（DSM10122）及びJP6015/pMU91（DSM10123）（米国特許第5,756,345
号）、セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するエシェリヒア・コリSV164(pGH5)（米国特許第6,180,373 B1号）、酵素トリプトファナーゼを欠損するエシェリヒア・コ
リAGX17(pGX44)（NRRL B-12263）及びAGX6(pGX50)aroP（NRRL B-12264）（米国特許第4,371,614号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたエシェリヒア・コリAGX17/pGX50,pACKG4-pps（WO97/08333、米国特許第6,319,696 B1号）などのエシェリヒア属に属する株が挙げられる。Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、yedA遺伝子またはyddG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増強されたエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も挙げられる（米国特許出願公開第20030148473 A1号及び第20030157667 A1号）。

Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、アントラニレートシンターゼ、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、トリプトファンシンターゼから選ばれる１種またはそれ以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。そのような変異を有する株の具体例としては、フィードバック阻害が解除されたアントラニレートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリSV164、及びフィードバック阻害が解除されたホ
スホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO94/08031 A1）をエシェリヒア・コリSV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

Ｌ−トリプトファン生産菌及びＬ−トリプトファン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株（特開昭57-71397号、特開昭62-244382
号、米国特許第4,371,614号）も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン（trpBA）中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増強することによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増強することによりＬ−トリプトファン生
産能を改良してもよい（WO2005/103275）。

Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、限定するものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株（米国特許第5,998,178号）が挙げられる。ilvGMEDAオペロン中のアテニュエーショ
ンに必要な領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが望ましい。さらに、オペロン中のilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少していることが望ましい。

Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の
例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する変異株（米国特許第5,658,766号）も挙げられる。そのような株の例としては、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するエシェリヒア・コリVL1970が挙げられる。エシェリヒア・コリVL1970は、1988年6月24日に、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny Proezd, 1）に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。

さらに、増殖にリポ酸を要求し、且つ／又は、H⁺-ATPアーゼを欠損している変異株（WO96/06926 A1）もＬ−バリン生産菌またはその親株として用いることができる。

Ｌ−バリン生産菌及びＬ−バリン生産菌を誘導するために使用することができる親株の例としては、エシェリヒア・コリH81株（VKPM B-8066、例えばEP1942183 B1参照）、エシェリヒア・コリNRRL B-12287及びNRRL B-12288（米国特許第4,391,907号）、エシェリヒ
ア・コリVKPM B-4411（米国特許5,658,766号）、エシェリヒア・コリVKPM B-7707（EP1016710 A2）なども挙げられる。

本発明の腸内細菌科に属する細菌は、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変されている。

「gshA遺伝子」の用語は、γ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味し得る。γ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子の具体例としては、γ−グルタメートシステインリガーゼをコードするgshA遺伝子が挙げられる。γ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子は、gshA遺伝子であってよい。以下、gshA遺伝子についてより具体的に記載する。

gshA遺伝子（gsh-Iと同義）は、γ−グルタメートシステインリガーゼGshA（γ-グルタミルシステインシンセターゼ；γGCSと同義）をコードする（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, エントリーNo. b2688; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P0A6W9）。gshA遺伝子（GenBank, accession No. NC_{_}000913.3、ヌクレオチド位置2814883〜2816439、相補鎖、Gene ID 944881）は、エシェリヒア・コリK-12株の染色体上、同鎖上のyqaA遺伝子と反対鎖上のmicA遺伝子の間に位置する。エシェリヒア・コリK-12株のgshA遺伝子の塩基配列（配列番号1）、及びエシェリヒア・コリK-12株のgshA遺伝子によりコードされるγGCSタンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）は公
知である。すなわち、gshA遺伝子は配列番号1に示す塩基配列を有していてもよく、gshA
遺伝子にコードされるγGCSタンパク質は配列番号2に示すアミノ酸配列を有していてもよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。

「gshA遺伝子の発現が弱化するように細菌が改変されている」との表現は、改変された該細菌においてgshA遺伝子の発現が弱化されるような方法で該細菌が改変されていることを意味し得る。「gshA遺伝子の発現が弱化するように細菌が改変されている」の用語は、具体的には、非改変細菌と比較して、改変された該細菌においてgshA遺伝子の発現が弱化されるような方法で該細菌が改変されていることを意味し得る。例えば、gshA遺伝子の発現は、gshA遺伝子を不活性化することにより弱化させることができる。

「gshA遺伝子が不活性化される」との表現は、改変された遺伝子が、完全に不活性であるか完全に機能しないタンパク質、すなわち、完全に不活性であるか完全に機能しないγ−グルタメートシステインリガーゼ、をコードしていることを意味し得る。さらに、遺伝
子の一部の削除あるいは遺伝子の全体の削除、該遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸置換（ミスセンス変異）を起こす1つまたはそれ以上の塩基の置換、終止コド
ンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームをシフトさせる1つまたは2つの塩基の削除、薬剤耐性遺伝子及び／又は転写終結シグナルの挿入、あるいはプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等の遺伝子発現を制御する配列を含む該遺伝子の隣接領域の改変により、改変DNA領域が当該遺伝子を通常通りに発
現することができなくてもよい。遺伝子の不活性化は、例えば、UV照射あるいはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）を使用する変異処理、部位特
異的変異、相同組換えを使用した遺伝子破壊、及び／又は「Red/ET-ドリブンインテグレ
ーション」または「λRed/ET-メディエーテッドインテグレーション」に基づいた挿入欠
失変異（Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（11）:5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128）等の従来の方法によっても行うこ
とができる。

「gshA遺伝子の発現が弱化されている」との表現は、改変された細菌が、gshA遺伝子の発現レベルが減少するように改変された、機能可能にgshA遺伝子に結合した領域（プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、転写終結シグナル等の遺伝子発現を制御する配列、リボソーム結合部位、及びその他の発現制御因子を含む）を含むこと、あるいはその他の例（例えばWO95/34672; Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64を参照）を意味してもよい。「機能可能に遺伝子に結合する」との表現は
、制御領域が、核酸分子または遺伝子の塩基配列に、該塩基配列の発現（例えば、増強された、増大した、構成的な、基底レベルの、抗終結化された、弱化された、脱制御化された、減少した、あるいは抑制された発現）、具体的には該塩基配列によりコードされた遺伝子産物の発現、を可能とするように結合していることを意味し得る。

「gshA遺伝子の発現が弱化されている」との表現は、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変された細菌におけるgshA遺伝子の発現産物の量、例えば該遺伝子のmRNAの量あるいは該遺伝子によりコードされるγGCSタンパク質の量が、改変されていない細菌における
量の、例えば50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、あるいは0%に低下していることも意
味し得る。

「gshA遺伝子の発現が弱化するように細菌が改変されている」との表現は、改変された細菌におけるγGCSタンパク質等のgshA遺伝子産物の総酵素活性が、改変されていない細
菌と比較して減少するように細菌が改変されていることも意味し得る。細菌は、細胞当たりのγGCSタンパク質の活性が、非改変細菌における活性の、例えば50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、あるいは0%に低下するように改変されていてよい。

上記の比較のための対照となる非改変細菌の例としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCC 47076）やW3110株（ATCC 27325）等のエシェリヒア属に属する細菌の野性株や、
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）等のパントエア属に属する細菌の
野生株などが挙げられる。上記の比較のための対照となる非改変細菌の例としては、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変されていない親株や、gshA遺伝子の発現が弱化されていない細菌も挙げられる。

「γ−グルタメートシステインリガーゼの活性」の用語は、下記の反応を触媒する酵素活性を意味し得る（EC 6.3.2.2）：
Ｌ−システイン + Ｌ−グルタミン酸 + ATP ⇔ γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイン + ADP + リン酸 + H⁺ （ATPはアデノシントリホスフェートを意味し、ADPはアデノシンジホスフェートを意味する）

γ−グルタメートシステインリガーゼの酵素活性は、ピルベートキナーゼとラクテートデヒドロゲナーゼのカップリングアッセイを使用してアデノシンジホスフェート（ADP）
の形成を測定することにより（Seelig G.F. and Meister A., Glutathione biosynthesis; gamma-glutamylcysteine synthetase from rat kidney, Methods Enzymol., 1985; 113:379-390）、あるいはＬ−α−[¹⁴C]アミノブチレートを使用してジペプチドの形成を測
定することにより（Griffith O.W. and Meister A., Selective inhibition of gamma-glutamyl-cycle enzymes by substrate analogs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74
（8）:3330-3334）、決定することができる。高速液体クロマトグラフィー及び電気化学
的検出によるγ-グルタミルシステインの直接の測定も使用できる（Gegg M.E. et al., Determination of glutamate-cysteine ligase (gamma-glutamylcysteine synthetase) activity by high-performance liquid chromatography and electrochemical detection, Anal. Biochem., 2002, 304(1):26-32）。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用するブラッドフォードタンパク質分析によって決定することができる（Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254）。

gshA遺伝子の発現は、染色体DNA上のプロモーター等の遺伝子の発現制御配列をより弱
いものに置換することにより弱化させることができる。プロモーターの強度はRNA合成の
開始の頻度として定義される。プロモーターの強度を評価する方法及び強力なプロモーターの例はGoldstein M.A.らなどにより記載されている（Goldstein M.A. and Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）。さらに、WO0018935 A1に開示されるように、遺伝子のプロモーター領域に1つまたはそ
れ以上のヌクレオチド置換を導入し、それによりプロモーターを改変して弱化させることも可能である。さらに、シャイン・ダルガルノ（SD）配列、及び／又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び／又はリボソーム結合部位（RBS）中の開始コドンの直ぐ上流
及び／又は下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。これらの領域の改変は、gshA遺伝子の転写を低下させることと組合せてもよい。

gshA遺伝子の発現は、トランスポゾンあるいは挿入配列（IS）を該遺伝子のコード領域（米国特許第5,175,107号）あるいは遺伝子発現を制御する領域に挿入することにより、
あるいは紫外線（UV）の照射もしくはニトロソグアニジン（Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン、NGT）による変異処理などのような慣用の方法により、弱化すること
もできる。さらに、例えば、λRed/ET-メディエーテッドリコンビネーション（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）に基づいた、公知の染色体改変方法により部位特異的な変異の導入を行うことができる。

gshA遺伝子のコピー数、遺伝子の存在あるいは不在は、例えば、染色体DNAを制限処理
した後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in
situハイブリダイゼーション（FISH）等を行うことにより、測定することができる。遺
伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。

プラスミドDNAの調製、DNAの切断、DNAの結合、DNAの形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等の、DNAの組換え分子の操作及び分子クローニン
グのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual", 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、あるいはGreen M.R.
and Sambrook J.R., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （2012）、Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, "Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA", 4^th ed., Washington, DC, ASM Press （2009）に記載されている。

腸内細菌科の属、種、あるいは株間でDNA配列にいくらかの相違があり得る。従って、gshA遺伝子は、配列番号1で示される遺伝子に限定されず、配列番号1の変異体塩基配列で
あって、γGCSタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。すなわち、「gshA遺伝子
」という用語は、配列番号1に示すgshA遺伝子に限られず、配列番号1に示すgshA遺伝子とその変異体塩基配列を総称してよい。

同様に、「γGCS」または「γGCSタンパク質」という用語は、配列番号2に示すγGCSタンパク質に限られず、配列番号2に示すγGCSタンパク質とその変異体タンパク質を総称してよい。

「変異体タンパク質」の用語は、配列番号2と比較して、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるにせよ、1つまたはそれ以上の変異を
配列中に有するタンパク質であって、γGCSタンパク質のものに類似する活性または機能
（例えば上記したようなγ−グルタメートシステインリガーゼの活性）を維持しているか、その三次元構造が野生型γGCSタンパク質に対して有意には変更されていないタンパク
質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中の位置あるいはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、配列番号2において1〜100、別の例では1〜50、別の例では1〜30、別の
例では1〜15、別の例では1〜10、あるいは別の例では1〜5であってよい。これは、アミノ酸には互いに高い相同性を有し、それらアミノ酸間の変異によっても、タンパク質の活性あるいは機能が影響されないか、タンパク質の三次元構造が野生型タンパク質と比較して有意に変化しないものがあるからである。従って、gshA遺伝子によってコードされる変異体タンパク質は、γGCSタンパク質の活性あるいは機能が維持されるか、γGCSタンパク質の三次元構造が野生型γGCSタンパク質と比較して有意に変更されない限り、配列番号2のアミノ酸配列全体に対して65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムBLASTを使用する際のパラメーター「同一性」として定義される、相同性を有するものであってよい。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、保存的変異が挙げられる。保存的変異の代表的なものは保存的置換である。保存的置換は、限定するものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間
で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ala、Leu、Ile、Val間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が極性
アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys
、Arg、His間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGln
への置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、ArgまたはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、Ser
からThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置
換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、非保存的変異も挙げられ、ただし、その変異は、アミノ酸配列の異なる位置の1つまたはそ
れ以上の第2の変異により、γGCSタンパク質のものに類似する活性または機能（例えば上記したようなγ−グルタメートシステインリガーゼの活性）が維持されるか、あるいは野生型γGCSタンパク質と比較してγGCSタンパク質の三次元構造が有意に変更されないように、補償されるものである。

タンパク質またはDNAの相同性の程度を評価するためには、いくつかの計算方法、例え
ばBLAST検索、FASTA検索、及びClustalW法を使用することができる。BLAST（Basic Local
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）検索は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、及びtblastxにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin S.及びAltschul S.F.の統計学的方法（"Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）を使用して、有意性を
発見物に帰着させるものである。コンピュータプログラムBLASTは3つのパラメーター、すなわち、スコア、同一性、及び類似性、を計算する。FASTA検索法は、Pearson W.R.によ
り記載されている（"Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA", Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）。ClustalW法は、Thompson J.D. et al.によっ
て記載されている（"CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）。

配列番号2に示すγGCSタンパク質の変異体タンパク質としては、腸内細菌科の種々の細菌からのγGCSタンパク質ホモログが挙げられる。すなわち、腸内細菌科の種々の細菌か
らのγGCSタンパク質ホモログが知られており、それらは上記のようなγ−グルタメート
システインリガーゼの活性を有する。腸内細菌科の細菌のそのようなγGCSタンパク質ホ
モログの例を、相同性の値（「同一性」、すなわちアミノ酸の同一性、として）、分類学データならびにNCBIデータベース（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）におけるアミノ酸配列の受託（Accession）番号及び配列記録（Sequence record）番号とともに以下に記載する（表１）。

gshA遺伝子は、γGCSタンパク質をコードするいかなる遺伝子であってもよい。例えば
、gshA遺伝子は変異体塩基配列であってもよい。「変異体塩基配列」の用語は、上記のような変異体タンパク質をコードする塩基配列、あるいは標準遺伝子暗号表（例えばLewin B., "Genes VIII", 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458を
参照）による任意の同義のアミノ酸コドンを使用して配列番号2に示すγGCSタンパク質等の野生型γGCSタンパク質をコードする塩基配列を意味し得る。従って、gshA遺伝子は、
遺伝暗号の縮重による変異体塩基配列、例えば遺伝子コードの縮重による配列番号1の変
異体塩基配列、であってもよい。

また、「変異体塩基配列」の用語は、限定するものではないが、機能的なタンパク質をコードするものである限り、配列番号1に示す配列に相補的な塩基配列と、または該塩基
配列から調製し得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」としては、特異的なハイブリッド、例えば
コンピュータプログラムBLASTを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義され
る相同性が60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、あるいは99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC（標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム）、0.1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、別の例においては0.1×SSC、0.1% SDSの塩濃度で60℃または65℃において１回以上、別の例において２または３回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存し、一般的には製造者により推奨されるものとすべきである。例えば、Amersham Hybond^TM-N+正荷電ナイロンメンブレン（GE Healthcare）のストリンジェントな条件
下での推奨洗浄時間は15分である。洗浄工程は２または３回行うことができる。プローブとしては、配列番号1に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプ
ローブは、配列番号1に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマー
として使用し、該塩基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCRによって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨されるが、ハイブリゼーション
条件により適切に選択することができ、通常100 bp 〜1 kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄
条件としては、50℃、60℃、あるいは65℃における2×SSC、0.1%SDSの条件が挙げられる
。

エシェリヒア・コリのγGCSタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されている（上
記参照）ので、γGCSタンパク質をコードする変異体塩基配列は、gshA遺伝子の塩基配列
に基づいて調製されたプライマーを利用するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、White T.J. et
al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189参照）により
得ることができ、あるいは野生型gshA遺伝子を含むDNAをin vitroで例えばヒドロキシル
アミンで処理することによる部位特異的変異法、あるいは野生型のgshA遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する細菌を紫外線（UV）照射もしくはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）及び亜硝酸等の突然変異誘発に通常使用される変異剤で処理する方法により得ることができ、あるいは完全長の遺伝子構造物として化学合成することができる。すなわち、このようにして、腸内細菌科の他の細菌のγGCSタンパク質をコ
ードする遺伝子を得ることができる。

「野生型タンパク質」の用語は、腸内細菌科の野生株または親株、例えば野生型エシェリヒア・コリMG1655株によって自然に生産される天然タンパク質を意味し得る。野生型タンパク質は、野生型細菌のゲノムに天然に存在し得る「野生型遺伝子」によってコードされ得る。

なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。

細菌は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記のような性質に加えて、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、薬物依存性等の特定の性質を有することができる。

２. 方法
本発明の方法は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリン等のＬ−アミノ酸、又はそれらの混合物を製造する方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロ
イシン、及びＬ−バリン等の分枝鎖Ｌ−アミノ酸、又はそれらの混合物を製造する方法を包含する。より具体的には、本発明の方法は、Ｌ−バリンを製造する方法を包含する。

Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、本明細書に記載した細菌を培養培地で培養してＬ−アミノ酸を培養培地もしくは菌体、またはその両者に生成、排出、及び／又は蓄積させる工程と、培養培地及び／又は菌体からＬ−アミノ酸を回収する工程を含み得る。回収されたアミノ酸はさらに精製してもよい。目的のＬ−アミノ酸は遊離の形態、その塩もしくは水和物の形態、またはそれらと他の有機もしくは無機の化合物との付加物の形態、あるいはそれらの組合せとして生成されてもよい。すなわち、「Ｌ−アミノ酸」の用語は、遊離の形態のＬ−アミノ酸、もしくはその塩、もしくはその水和物、もしくはその付加物、またはそれらの混合物を意味してよい。「Ｌ−アミノ酸」の用語は、具体的には、遊離の形態のＬ−アミノ酸もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。例えば、Ｌ−アミノ酸のアンモニウム、ナトリウム、カリウム等の塩、あるいはＬ−アミノ酸の両性イオン等の内部塩を、前記方法により製造することができる。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成することができることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。具体的には、Ｌ−リジン塩酸塩（Ｌ−リジン・HCl）やＬ−アルギニン塩酸塩（Ｌ−アルギニン・HCl）等のＬ−アミノ酸の一塩酸塩を該方法により製造でき、また、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物（Ｌ−ヒスチジンHCl
・H₂O）等のＬ−アミノ酸の一塩酸塩一水和物を前記方法により製造することができる。

細菌の培養、及び培地等からのＬ−アミノ酸の回収及び精製は、微生物を使用してＬ−アミノ酸製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。Ｌ−アミノ酸の製造のための培養培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、無機イオン、並びにその他の有機及び無機成分を必要に応じて含む典型的な培地等の、合成培地あるいは天然培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、シュクロース、澱粉加水分解物などの糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸などの有機酸、および脂肪酸などを使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、およびアンモニア水などを使用することができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、およびコーンスティープリカーなども使用することができる。培地は、これらの窒素源の1種またはそれ以上を含むことができる。硫黄源としては、硫
酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンなどが挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸などのリン酸ポリマーなどを使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12などのビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNAなどの核酸、アミノ酸、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキスなどの有機栄養素などを、適当量（痕跡量であってもよい）存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオンなどを加えてもよい。

培養は、好気的条件下で16〜72時間、あるいは16〜65時間行うことができる。培養中の培養温度は、30〜45℃、あるいは30〜37℃の範囲内に制御することができる。pHは5〜8、あるいは6.0〜7.5の間に調節することができる。pHは、無機もしくは有機の酸またはアルカリ性物質、およびアンモニアガスを使用することにより調節することができる。

培養後、培養培地から目的のＬ−アミノ酸を回収することができる。また、培養後、細胞を例えば超音波などで破砕し、例えば遠心分離や膜ろ過によって細胞及び細胞破砕懸濁
物（細胞デブリともいう）などの固体を除去して上清を取得し、上清から目的のＬ−アミノ酸を回収することができる。培養培地や上清等からのＬ−アミノ酸の回収は、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び晶析などの慣用の技術の任意の組合せにより実施することができる。

尚、回収される目的のＬ−アミノ酸組成物は、該Ｌ−アミノ酸以外に、例えば、菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物等を含んでいてもよい。Ｌ−アミノ酸は、所望の程度に精製されていてもよい。回収される目的のＬ−アミノ酸の純度は、例えば50％（w/w）以上、好ましくは85％（w/w）以上、特に好ましくは95%（w/w）以上であってよい（U.S. Patent No. 5,431,933, Japanese Patent No. 1214636, U.S. Patent Nos. 4,956,471, 4,777,051, 4,946,654, 5,840,358, 6,238,714, U.S. Patent Published Application No. 2005/0025878）。

以下、下記の非限定的な実施例により本発明をより具体的に説明する。

実施例１：不活性化されたgshA遺伝子を有するエシェリヒア・コリ株の構築
１．１エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA株の構築
「λRed/ETメディエーテッドインテグレーション」と呼ばれる、Datsenko K.A.及びWanner B.L.によって最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）により、不活性化されたgshA遺伝子を有す
るエシェリヒア・コリ株を構築した。この方法に従い、それぞれ、一方の末端がgshA遺伝子に隣接する領域に相同であり、且つ、もう一方の末端が鋳型プラスミド中のクロラムフェニコール耐性（Cm^R）を付与するcat遺伝子に隣接する領域に相同である、PCRプライマ
ーP1（配列番号3）及びP2（配列番号4）を構築した。プラスミドpMIV-5JS（特開2008-99668号、EP1942183 A1）を鋳型として使用した。PCR条件は、95℃で3分の変性、95℃で1分
、34℃で30秒、及び72℃で1分のプロファイルを最初に2サイクル、95℃で30秒、50℃で30秒、及び72℃で1分のプロファイルをその後30サイクル、最後に72℃で5分の伸長とした。

得られたPCR産物1（配列番号5、1,378 bp）をアガロースゲルにおける電気泳動により
精製し、温度感受性複製開始点を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリMG1655株のエレクトロポレーションに使用した。プラスミドpKD46（Datsenko K.A. and Wanner
B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）は、ラムダファージの2,154ヌクレオチドのDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241、GenBank accession No. J02459）を含み、以て、アラビノース誘導性P_araBプロモーターの制御下にあるλRed相同
組換えシステムの遺伝子（γ、β、及びexo遺伝子）を含む。プラスミドpKD46は、前記PCR産物をエシェリヒア・コリMG1655株（ATCC 47076）の染色体に組込むために必要である
。pKD46プラスミドを含むエシェリヒア・コリMG1655株は、E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA（Accession No. CGSC7669）から入手することができる。

エレクトロコンピテント細胞は以下のようにして調製した。エシェリヒア・コリMG1655/pKD46を、アンピシリン（100mg/L）を含むLB培地（Luria-Bertani培地、溶原性ブロスともいう、Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）において、30℃で一晩増殖さ
せ、培養物をアンピシリン（100mg/L）及びＬ−アラビノース（1 mM）を含む5 mL のSOB
培地（Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）で100倍に希釈した。希釈した培養物を、通気（250rpm）しながら30℃でOD600が約0.6になるまで増殖させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水で3回洗浄することによりエレクトロコンピテン
ト化した。エレクトロポレーションは、70μLの細胞及び約100ngのPCR産物1を使用して行った。エレクトロポレーションを行った細胞を1 mL のSOC培地（Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）において37℃で2.5時間培養し、溶原性ブロス（Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）、アガー（1.5%）、及びクロラムフェニ
コール（10mg/L）を含むプレート上に植菌し、37℃で増殖させてCm^R組換体を選択した。pKD46プラスミドを脱落させるため、クロラムフェニコール（10 mg/L）を含むＬ−アガー
で42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を試験した。このようにし
てCm^Rマーカーを有するエシェリヒア・コリMG1655ΔgshA株（エシェリヒア・コリMG1655
ΔgshA::Cm^R株ともいう）を得た。

１．２． gshA遺伝子の欠失の確認
変異体エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA株における、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）で標識されたgshA遺伝子の欠失をPCRにより確認した。遺伝子座特異的プライマーP3（配列番号6）及びP4（配列番号7）を確認に使用した。PCR条件は、94℃で3分の変性、94℃で30秒、58℃で30秒、及び72℃で2分のプロファイルを30サイクル、最後に72℃で6分の伸長とした。天然gshAを有する親株であるエシェリヒア・コリMG1655の染色体DNAを鋳
型とする反応で得たPCR産物2は2,155bpの鎖長を有していた（配列番号8）。変異株であるエシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^Rの染色体DNAを鋳型とする反応で得たPCR産物3は、1,858bpの鎖長を有していた（配列番号9）。

実施例２：不活性化したgshA遺伝子を有するエシェリヒア・コリＬ−バリン生産株の構築
gshA遺伝子の不活性化のＬ−バリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株（実施例１．１）の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのバリン生産株H81にP1トランスダクションにより導入し（Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, 1972）
、エシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^R株を得た。H81株（EP1239041 A2）は、2001年1月30日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8066で寄託され、その後2002年2月1日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管されている。不活性化したgshA遺伝子を有するエシェリヒア・コリH81株は、溶原性
ブロス、アガー（1.5%）、及びクロラムフェニコール（10mg/L）を含むプレート上で選択した。このようにしてエシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^R株を得た。クロラムフェニコール耐性遺伝子で標識されたgshAの欠失は実施例１．２に記載したようにPCRにより確認し
た。

実施例３：エシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^R株によるＬ−バリンの生産
改変株であるエシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^R及び対照株であるエシェリヒア・コリH81を、それぞれ、34℃で18時間、2 mLのLB培地中で培養した。その後、得られた培養物0.2 mLをそれぞれ20×200mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、グルコースが消費されるまで、回転式振盪機（250rpm）上、34℃で72時間培養した。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとした。
グルコース 76.0
(NH₄)₂SO₄ 18.0
KH₂PO₄ 1.8
MgSO₄・7H₂O 1.2
チアミン-HCl 0.1
CaCO₃ 24.0
LB培地 10%(v/v)
発酵培地は、116℃で30分間殺菌した。ただしグルコースは110℃で30分間、CaCO₃は116℃で30分間、別々に殺菌した。pHは殺菌前に6M KOHにより7.0に調整した。

培養後、培地に蓄積したＬ−バリンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）で測定した
。蛍光指示薬を含まないMerck Silica Gel 60（Merck, Darmstadt, Germany）で被覆した10×20cm TLCプレートを使用した。試料をCamag Linomat 5サンプルアプリケーターを使
用してプレート上にアプライした。Merckプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（16:16:5:10、v/v）からなる移動相で展開した。ニンヒドリン溶液（2%、w/v；アセトン中）を可視化試薬として使用した。展開後、プレートを乾燥し、Camag TLCスキャナ3を用いて、winCATSソフトウェア（バージョン1.4.2）により520nmで検出す
る吸光度モードで走査した。

4連の独立した試験管発酵の結果（平均値）を表２に示す。表２から判るとおり、親株
であるエシェリヒア・コリH81と比較して、改変株であるエシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^Rは、より多い量（g/l）のＬ−バリン（Val）を生産することができた。さらに表２は
、改変株であるエシェリヒア・コリH81ΔgshA::Cm^Rが、親株であるエシェリヒア・コリH81と比較して、より高い収率（消費したグルコースに対する%）でＬ−バリンを生産することができたことも示している。

実施例４：エシェリヒア・コリ382ΔgshA株によるＬ−アルギニンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−アルギニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのアルギニン生産株382にP1トランスダクションにより導入し、エシェリヒア・コリ382ΔgshA株を得る。382株は、2000年4月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-7926で寄託され、その後2001年5月18日にブダペス
ト条約の規定に基づく国際寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリ382株及び382ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18時間、3 mLの栄養培地中で振盪培養する（220rpm）。その後、得られた培養物0.3 mLをそれぞれ20×200mm試
験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機（220rpm）上、32℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−アルギニンの量を、n-ブタノール:酢酸:水=4:1:1（v/v）
からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。Ｌ−アルギニンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でＬ−アルギニンを溶出させ、Ｌ−アルギニンの量を540nmで分光
測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する
。pHは7.0に調整する。

実施例５：エシェリヒア・コリ382ΔargGΔgshAによるＬ−シトルリンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−シトルリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのシトルリン生産株382ΔargGにP1トランスダクションにより導入し、エシェリヒア・コリ382ΔargGΔgshA株を得る。382ΔargG株は、「λRed/ET-メディエーテッドインテグレーション」と呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L.により最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）によりエ
シェリヒア・コリのアルギニン生産株382（VKPM B-7926、EP1170358 A1）の染色体上のargG遺伝子を削除することにより得られる。この方法に従い、argG遺伝子に隣接する領域と、鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子に隣接する領域の両領域に相同なPCR
プライマーを構築する。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR（WO05/010175）をPCRの鋳型として使用する。

エシェリヒア・コリ382ΔargG株及び382ΔargGΔgshA株を、それぞれ、37℃で18時間、3 mLの栄養培地中で振盪培養する。その後、得られた培養物0.3 mLをそれぞれ20×200mm
試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機上、32℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−シトルリンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。Ｌ−シトルリンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でＬ−シトルリンを溶出させ、Ｌ−シトルリンの量を540nmで分
光測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
Ｌ−アルギニン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する
。pHは7.0に調整する。

実施例６：エシェリヒア・コリJM15(ydeD)ΔgshAによるＬ−システインの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−システイン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションによりエシェリヒア・コリのシステイン生産株JM15(ydeD)に導入してエシェリヒア・コリJM15
(ydeD)ΔgshA株を得る。JM15(ydeD)株は、エシェリヒア・コリJM15（米国特許6,218,168 B1号）の派生株であり、ydeD遺伝子を含むDNAで形質転換されている（米国特許5,972,663号）。ydeD遺伝子は膜タンパク質をコードし、いずれのＬ−アミノ酸の生合成経路にも関与しない。

Ｌ−システイン生産の評価のための発酵条件及び方法は、米国特許6,218,168 B1号の実施例６に詳細に記述されている。

実施例７：エシェリヒア・コリVL334thrC⁺ΔgshAによるＬ−グルタミン酸の生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−グルタミン酸生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのグルタミン酸生産株VL334thrC⁺（EP1172433 A1）に導入してエシェリヒア・コリVL334thrC⁺ΔgshA株を得る。VL334thrC⁺株は、2004年12月6日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika,
Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8961で寄託され、その後2004年12月8日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリVL334thrC⁺株及びVL334thrC⁺ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。その後、1白金耳分の細胞を20×200mmの試験管中の2 mLの発酵培地へ移し、30℃で3日間振盪培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−グルタミン酸の量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定し、ニンヒドリン（アセトン中の1%溶液）で染色し、0.5% CdCl₂を含む50%エタノールでＬ−グルタミン酸を溶
出させ、Ｌ−グルタミン酸の量を540nmで測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.1
Ｌ−イソロイシン 0.07
CaCO₃ 25.0
グルコースとCaCO₃は別々に殺菌する。pHは7.2に調整する。

実施例８：エシェリヒア・コリMG1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurR ΔgshAによるＬ−ヒスチ
ジンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−ヒスチジン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのＬ−ヒスチジン生産株MG1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurRに導入してエシェリヒア・コリ1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurR ΔgshA株を得る。MG1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurR株は、RU2119536 C1及びDoroshenko V.G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149-154に記載されている。

エシェリヒア・コリMG1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurR株及びMG1655+hisG^r hisL'_{_}Δ ΔpurR ΔgshA株を、それぞれ、30℃で3時間、2 mLのＬ−ブロス（Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.), Cold Spring Harbor Labor
atory Press, 2001）中で培養する。その後、得られた培養物0.1 mLを20×200mmの試験管中の2 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、回転式振盪機（250rpm）上、30℃で65時間培養する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 50.0
豆濃* 0.2（窒素量として）
Ｌ−アスパラギン酸 1.0
(NH₄)₂SO₄ 18.0
KCl 1.0
KH₂PO₄ 0.5
MgSO₄・7H₂O 0.4
FeSO₄・7H₂O 0.02
MnSO₄・5H₂O 0.02
ZnSO₄・7H₂O 0.02
アデノシン 0.2
チアミン-HCl 0.001
ベタイン 2.0
CaCO₃ 60.0
*豆濃は大豆粕加水分解物（味の素）である。
グルコース、硫酸マグネシウム、ベタイン、及びCaCO₃は別々に殺菌する。pHは殺菌前
に6M KOH溶液により6.0に調整する。

培養後、培地に蓄積するＬ−ヒスチジンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）により
測定する。非蛍光性指示薬（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）を含むSorbfilシリカゲルの0.11mmの層で被覆した10×15cm TLCプレートを使用する
。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:アセトン:25%アンモニア水:水（6:6:1.5:1、v/v）からなる移動相で展開する。ニンヒドリン溶液（2%、w/v；アセトン中）を可視化試
薬として使用する。展開後、プレートを乾燥し、Camag TLCスキャナ3を用いて、winCATS
ソフトウェア（バージョン1.4.2）により520nmで検出する吸光度モードで走査する。

実施例９：エシェリヒア・コリ57ΔgshAによるＬ−ロイシンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−ロイシン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのロイシン生産株57（VKPM B-7386、米国特許6,124,121号）に導入してエシェリヒア・コリ57ΔgshA株を得る。57株は、1997年5月19日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-7386で寄託され
ている。

エシェリヒア・コリ57株及び57ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。20×200mmの試験管中の4%シュクロースを含む2 mLのＬ−ブロス（Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中、回転式振盪機（250rpm）上、32℃で18時間、各株を増殖させ、種培養物を得る。その後、発酵培地に0.2 mL（10%）の種培養物
を接種する。発酵は、20×200mmの試験管中の2 mLの最小発酵培地で行う。菌体は32℃で48〜72時間、250rpmで振盪して増殖させる。

培養後、培地に蓄積するＬ−ロイシンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
K₂HPO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン-HCl 0.01
CaCO₃ 25.0
グルコースは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.2に調整する。

実施例１０：エシェリヒア・コリAJ11442ΔgshAによるＬ−リジンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−リジン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのリジン生産株AJ11442にP1トランスダクションにより導入し、エシェリヒア・コリAJ11442ΔgshA株を得る。AJ11442株は、1981年5月1日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現NITE IPOD、郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-5084で寄託され、その後1987年10月29日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1543の受託番号を付与されている。

エシェリヒア・コリAJ11442株及びAJ11442ΔgshA株を、それぞれ、37℃で、ストレプトマイシン（20mg/L）を含むＬ−培地で培養する。その後、得られた培養物0.3 mLをそれぞれ500-mLフラスコ中の必要な薬剤を含む20mLの発酵培地に接種し、攪拌速度115rpmの往復振盪機を使用して、37℃で16時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−リジンの量及び残存グルコースの量を公知の方法（Biotech-analyzer AS210、サクラ精器）で測定する。その後、各株の消費グルコースに対するＬ−リジンの収率を計算する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 40.0
(NH₄)₂SO₄ 24.0
K₂HPO₄ 1.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
酵母エキス 2.0
pHはKOHにより7.0に調製する。培地は115℃で10分間オートクレーブする。グルコース
と硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃を180℃で2時間乾熱滅菌し、終濃度30g/lで培地に添加する。

実施例１１：エシェリヒア・コリ382ΔargFΔargI,ΔgshAによるＬ−オルニチンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−オルニチン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、エシェリヒア・コリのオルニチン生産株382ΔargFΔargIにP1トランスダクションにより導入し、エシェリヒア・コ
リ382ΔargFΔargI,ΔgshA株を得る。382ΔargFΔargI株は、「λRed/ ETメディエーテッドインテグレーション」と呼ばれる、Datsenko K.A.及びWanner B.L.によって最初に開発された方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）により、エシェリヒア・コリのアルギニン生産株382（VKPM B-7926、EP1170358 A1）の染色体上のargF及びargI遺伝子を順次削除することにより得られる。この
方法に従い、argFまたはargI遺伝子に隣接する領域と、鋳型プラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子に隣接する領域の両領域に相同な2対のPCRプライマーが構築される。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR（WO05/010175）をPCRの鋳型として使用する。

エシェリヒア・コリ382ΔargFΔargI株及び382ΔargFΔargI,ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18時間、3 mLの栄養培地中で振盪培養する。その後、得られた培養物0.3 mLをそれ
ぞれ20×200mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、回転式振盪機上で、32℃で48時間培
養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−オルニチンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。オルニチンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でオルニチンを溶出させ、オルニチンの量を540nmで分光測定する。

実施例１２：エシェリヒア・コリAJ12739ΔgshAによるＬ−フェニルアラニンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−フェニルアラニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのＬ−フェニルアラニン生産株AJ12739に導入してエシェ
リヒア・コリAJ12739ΔgshA株を得る。AJ12739株は、2001年11月6日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8197で寄託され
、その後2002年8月23日にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管された。

エシェリヒア・コリAJ12739株及びAJ12739ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18時間栄養培地中で培養する。その後、得られた培養物0.3mLを20×200mmの試験管中の3 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、回転式振盪機上、37℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−フェニルアラニンの量を薄層クロマトグラフィー（TLC）
により測定する。非蛍光性指示薬（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russian Federation）を含むSorbfilシリカゲルの0.11mmの層で被覆した10×15cm TLCプレートを使
用する。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水（40:40:7:16、v/v）からなる移動相で展開する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視
化試薬として使用する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 40.0
(NH₄)₂SO₄ 16.0
K₂HPO₄ 0.1
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 2.0
Ｌ−チロシン 0.125
CaCO₃ 20.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌す
る。pHは7.0に調整する。

実施例１３：エシェリヒア・コリ702ilvAΔgshAによるＬ−プロリンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−プロリン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのプロリン生産株702ilvAに導入してエシェリヒア・コリ702ilvAΔgshA株を得る。702ilvA株は、2000年7月18日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）に受託番号VKPM B-8012で寄託され、その後2001年5月18日
にブダペスト条約の規定に基づく国際寄託に移管されている。

エシェリヒア・コリ702ilvA株及び702ilvAΔgshA株を、それぞれ、37℃で18〜24時間、Ｌ−アガープレートで培養する。その後、これらの株を実施例７（Ｌ−グルタミン酸の生産）と同様の条件下でそれぞれ培養する。

実施例１４：エシェリヒア・コリB3996ΔgshAによるＬ−スレオニンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−スレオニン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのスレオニン生産株VKPM B-3996に導入してエシェリヒア・コリB-3996ΔgshA株を得る。VKPM B-3996株は、1987年11月19日にAll-Union Scientific Center of Antibiotics（Russian Federation, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street, 3-A）
に受託番号RIA 1867で寄託されている。該株は、2002年12月19日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM、FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1^st Dorozhny proezd, 1）にも受託番号VKPM B-3996で寄託されている。

エシェリヒア・コリVKPM B-3996株及びB-3996ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18〜24時
間、Ｌ−アガープレートで培養する。20×200mmの試験管中のグルコース（4%）を含む2 mLのＬ−ブロス（Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中、回転式振盪機（250rpm）上、32℃で18時間、各株を増殖させ、種培養物を得る。その後、発酵培地に0.2 mL（10%）の種培養物を接種する。発酵は、20×200mmの試験管中の2 mLの最小培地で行う。菌体は32℃で65時間、250rpmで振盪して増殖させる。

培養後、培地に蓄積するＬ−スレオニンの量を、ブタン-1-オール:酢酸:水=4:1:1（v/v）からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーで測定する。ニンヒドリン溶液（2%；アセトン中）を可視化試薬として使用する。Ｌ−スレオニンを含むスポットを切り出し、0.5% CdCl₂水溶液でＬ−スレオニンを溶出させ、Ｌ−スレオニンの量を540nmで分
光測定する。

発酵培地の組成（g/L）は以下のとおりとする。
グルコース 80.0
(NH₄)₂SO₄ 22.0
NaCl 0.8
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 0.8
FeSO₄・7H₂O 0.02
MnSO₄・5H₂O 0.02
チアミン-HCl 0.0002
酵母エキス 1.0
CaCO₃ 30.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO₃は180℃で2時間乾熱滅菌す
る。pHは7.0に調整する。抗生物質は殺菌後培地に添加する。

実施例１５：エシェリヒア・コリSV164(pGH5)ΔgshAによるＬ−トリプトファンの生産
gshA遺伝子の不活性化のＬ−トリプトファン生産に対する効果を試験するため、上記エシェリヒア・コリMG1655ΔgshA::Cm^R株の染色体からのDNA断片を、P1トランスダクションにより、エシェリヒア・コリのトリプトファン生産株SV164(pGH5)に導入してエシェリヒ
ア・コリSV164(pGH5)ΔgshA株を得る。SV164(pGH5)株は、エシェリヒア・コリSV164株に
プラスミドpGH5を導入することにより得られた株である。SV164株（JP 3032013 B）は、
トリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有する。SV164株は、エシェリヒア・コリYMC9株（ATCC 33927）のtrpE遺伝子に変異を導入することにより得られた株である。YMC9株は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）から入手可能である。プラスミドpGH5は、セリンによるフィードバック阻害を
受けないホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を含む。SV164(pGH5)株については、米国特許第6,180,373 B1号あるいはEP0662143 B1に詳細に記載
されている。

エシェリヒア・コリSV164(pGH5) 株及びSV164(pGH5)ΔgshA株を、それぞれ、37℃で18
時間、テトラサイクリン（20mg/L、pGH5プラスミドのマーカー）を含む3 mLの栄養培地中で振盪培養する。その後、得られた培養物0.3mLを20×200mmの試験管中のテトラサイクリン（20mg/L）を含む3 mLの発酵培地にそれぞれ接種し、250rpmの回転式振盪機上、37℃で48時間培養する。

培養後、培地に蓄積するＬ−トリプトファンの量を実施例１２（Ｌ−フェニルアラニンの生産）に記載したようにTLCにより測定する。発酵培地成分を表３に示す。発酵培地成
分は表に示すそれぞれの群（A、B、C、D、E、F、G及びH）で別々に殺菌し、殺菌中の好ましくない相互作用を回避する。

本発明をその好ましい態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更や等価物の採用が可能であることは当業者に明らかであろう。本明細書中に引用した文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。

本発明によれば、腸内細菌科の細菌による分枝鎖Ｌ−アミノ酸等のＬ−アミノ酸の生産を改善することができる。

Claims

（i）腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産菌を培養培地で培養して培地もしくは菌体、またはその両者中にＬ−アミノ酸を生産させ、
（ii）培養培地もしくは菌体、またはその両者からＬ−アミノ酸を回収することを含む、Ｌ−アミノ酸を製造する方法であって、
前記細菌が、gshA遺伝子の発現が弱化するように改変されており、
前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属するものであり、
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−バリンである、方法。
前記細菌がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１に記載の方法。
gshA遺伝子の発現がgshA遺伝子の不活性化により弱化されている、請求項１または２に記載の方法。
gshA遺伝子が欠失している、請求項３に記載の方法。
gshA遺伝子が、下記（A）〜（F）からなる群から選択されるDNAである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
（A）配列番号1の塩基配列を含むDNA、
（B）遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列を含むDNA、
（C）配列番号１の塩基配列全体に対して90%以上の同一性を有し、γ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有するタンパク質をコードするDNA、
（D）配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（E）配列番号2のアミノ酸配列であって、1〜50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がγ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有するものであるDNA、
（F）配列番号2のアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がγ−グルタメートシステインリガーゼの活性を有するものであるDNA。