JP5821946B2

JP5821946B2 - Ｂｓｓｒ遺伝子の発現が増強した腸内細菌科の細菌を使用するｌ−アミノ酸の製造方法

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Publication number: JP5821946B2
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Description

本発明は、微生物工業に関し、特に、bssR遺伝子の発現が増強されるよう改変された腸内細菌科（Enterobacteriaceae family）の細菌を使用するL-アミノ酸の製造方法に関する。この遺伝子は、シグナル分泌を介するバイオフィルムのレギュレーターをコードする。

従来、L-アミノ酸は、自然源（natural sources）から得られた微生物の株、又はその変異体を利用する発酵法によって工業的に製造されている。典型的には、微生物は、L-アミノ酸の生産収量を増強するよう改変されている。

L-アミノ酸の生産収量を増強するための多数の技術が報告されており、これには組換えDNAで微生物を形質転換することが含まれる（特許文献１）。生産収量を増強するための他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は、結果として生じたL-アミノ酸によって引き起こされるフィードバック阻害の標的酵素を脱感作することが含まれる（特許文献２〜４）。

yliH遺伝子及びyceP遺伝子は、Escherichia coliのバイオフィルムの形成の際に誘導される（非特許文献１）。最少グルコース培地を用いた連続フローチャンバー（continuous-flow chamber）において、yceP(b1060)及びyliH(b0836)の欠失により、バイオフィルムの質量、表面被覆率（surface coverage）、及び平均厚さが増大することによってバイオフィルムの形成が増大することが示された。このバイオフィルム形成増大の遺伝的基盤を決定するために、両変異株について、バイオフィルムにおける特異的な（differential）遺伝子発現プロファイルを、グルコースを用いたリッチな培地中で野生型株と対比して調査したところ、372〜882遺伝子が一貫して誘導されること及び76〜337遺伝子が一貫して抑制されることが見出された。両変異株のバイオフィルム形成の増加は、ストレス応答に関連する遺伝子（8〜64遺伝子）の特異的な発現に関連していた。更に重要なことに、42〜130遺伝子はオートインデューサー−２を介した細胞シグナル伝達（autoinducer-2 cell signaling）に関連しており、これらの遺伝子も特異的に（differentially）発現した。これらの遺伝子は、インドールに関連した17〜26遺伝子が特異的に発現したことから、インドールを介したシグナル伝達（indole signaling）にも関連していた。0.2％グルコースを補填したLB（LB glu）中でのyliH変異株及びyceP変異株におけるバイオフィルム形成の増加は、両変異株における細胞外及び細胞内インドール濃度の減少（50倍〜140倍）によって起こり、また、培養中でのインドール添加は、野生型のバイオフィルム形成の表現型を復帰させた；すなわち、インドールはバイオフィルムを抑制するものである。yliH又はycePのいずれかの欠失により、複合培地中で生育させた場合の（最も顕著には定常期の）細胞外オートインデューサー−２の濃度が50倍に増加したことから、両変異株は、クオラムセンシングを介してバイオフィルムの形成を調節している。YliHタンパク質（127アミノ酸）及びYcePタンパク質（84アミノ酸）は、LB中で運動性を2〜7倍抑制したことから、両タンパク質は、運動性の調節に関与している。「シグナル分泌を介したバイオフィルムのレギュレーター（regulator of biofilm through signal secretion）」という表現に基づき、これら２つの遺伝子座には、yliHについてbssR、ycePについてbssS、という新たな名称が提案されている（非特許文献２）。

しかしながら、現在のところ、L-アミノ酸を製造する目的で、bssR遺伝子の発現を増強させる報告はない。

米国特許第4,278,765号米国特許第4,346,170号米国特許第5,661,012号米国特許第6,040,160号

Ren, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 515-524 (2004) Domka J., et.al., Appl. Environ. Microbiol. 72(4): 2449-59 (2006)

本発明の態様には、L-アミノ酸を生産することのできる株の生産性を増強し、これらの株を使用してL-アミノ酸を製造する方法を提供することが含まれる。

前記態様は、bssR遺伝子の発現を増強することにより、L-アミノ酸、例えば、L-スレオニン、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、L-アルギニン、L-シトルリン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファン、の生産を増強することができることを見出したことによって達成された。

本発明は、アミノ酸、例えば、L-スレオニン、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、L-アルギニン、L-シトルリン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファン、を生産する能力が増大した腸内細菌科の細菌を提供する。

本発明の態様は、腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌であって、bssR遺伝子の発現が増強されるよう改変された細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記発現が、bssR遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、Escherichia属に属する前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、Escherichia coliである前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、Pantoea属に属する前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、芳香族L-アミノ酸及び非芳香族L-アミノ酸からなる群より選択される前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記芳香族L-アミノ酸が、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファンからなる群より選択される前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記非芳香族L-アミノ酸が、L-スレオニン、L-リジン、L-シス
テイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-オルニチンからなる群より選択される前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、L-アルギニンである前記細菌を提供することである。

本発明の更なる態様は、L-アミノ酸を生産する方法であって、前記細菌を培養培地中で培養すること、および前記L-アミノ酸を培地から回収することを含む方法を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、芳香族L-アミノ酸及び非芳香族L-アミノ酸からなる群より選択される前記方法を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記芳香族L-アミノ酸が、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファンからなる群より選択される前記方法を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記非芳香族L-アミノ酸が、L-スレオニン、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-オルニチンからなる群より選択される前記方法を提供することである。

本発明の更なる態様は、前記L-アミノ酸が、L-アルギニンである前記方法を提供することである。

１．細菌
ここに開示する主題に基づく細菌は、腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌であって、bssR遺伝子の発現が増強されるよう改変された細菌である。

「L-アミノ酸生産細菌」という記載は、培地で培養した場合にL-アミノ酸を生産して培地中に分泌する能力を有する細菌を意味してよい。

「L-アミノ酸生産細菌」という用語は、腸内細菌科の細菌、例えば、E. coli K-12等のE. coli、の野生株又は親株よりも多い量で、L-アミノ酸を生産して培地中への蓄積を引き起こすことのできる細菌を意味してもよく、微生物が、0.5 g/L以上、他の例では1.0 g/L以上の量で、培地中への標的L-アミノ酸の蓄積を引き起こすことができることを意味してもよい。細菌は、１種類のL-アミノ酸を生産してもよく、２種類以上のL-アミノ酸の混合物を生産してもよい。

「L-アミノ酸」という用語は、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及びL-バリンを含む。

「芳香族L-アミノ酸」という用語は、例えば、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファンを含む。「非芳香族L-アミノ酸」という用語は、例えば、L-スレオニン
、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、及びL-アルギニンを含む。具体例は、L-スレオニン、L-リジン、L-システイン、L-ロイシン、L-ヒスチジン、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-プロリン、及びL-アルギニンである。

腸内細菌科は、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エルビニア（Erwinia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、パントエア（Pantoea）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、セラチア（Serratia）属、シゲラ（Shigella）属、モルガネラ（Morganella）属、エルシニア（Yersinia）属等に属する細菌を包含する。特に、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で使用される分類により腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に分類されるものを使用することができる。具体例は、Escherichia属又はPantoea属に属する細菌である。

「Escherichia属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従って、Escherichia属に分類されることを意味してよい。Escherichia属に属する細菌としては、限定されるものではないが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））が挙げられる。

Escherichia属に属する細菌は特に限定されないが、例えば、Neidhardt, F. C.らによって記載された細菌（Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1）を使用することができる。

「Pantoea属に属する細菌」という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従って、Pantoea属に分類されることを意味してよい。エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）の幾つかの種は、最近では、16S rRNAの塩基配列解析等に基づいて、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチュアールティ（Pantoea stewartii）等に再分類されている（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。

「遺伝子の発現が増強されるように細菌が改変された」という記載は、遺伝子の発現が、非改変株、例えば、野生株、より高いことを意味してよい。このような改変としては、発現する遺伝子の細胞当たりのコピー数の増加、遺伝子の転写レベルの増加、遺伝子から転写されるmRNAの翻訳レベルの増加等が挙げられる。発現した遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体DNAを制限酵素処理した後、遺伝子の配列に基づくプローブを使用するサザンブロッティングや蛍光in situハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization, FISH）等を行うことにより測定する。遺伝子の転写のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等を含む種々の公知の方法により測定することができる。mRNAの翻訳レベル又は遺伝子産物の量は、抗体を使用するウエスタンブロッティングを含む種々の公知の方法により測定することができる。ウエスタンブロッティング分析は、翻訳レベルだけでなく、転写レベルも反映する。更に、対照の役目を果たす野生株には、例えば、E. coli K-21又はPantoea ananatis FERM BP-6614が含まれる。

bssR遺伝子（yliH, b0836と同義）は、バイオフィルム形成のレギュレーターであるBssRをコードする。bssR遺伝子（GenBank accession number NC_000913.2; gi: 49175990におけるヌクレオチド877,471〜877,854）は、E. coli K-12の染色体上のrimO遺伝子（反対方向に配向している）とyliI遺伝子との間に位置している。bssR遺伝子の塩基配列及びbssR遺伝子によってコードされるBssRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及
び配列番号２に示す。

腸内細菌科の属又は株の間でDNA配列に幾分かの差異があり得るため、発現が増強されるように改変されるbssR遺伝子は、配列番号１に示される遺伝子に限定されず、配列番号１に相同な遺伝子を含んでいてよい。したがって、bssR遺伝子によってコードされるタンパク質バリアント（protein variant）は、BssRタンパク質の活性を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列全体に対して、80％以上、他の例では90％以上、他の例では95％以上、他の例では98％以上、他の例では99％以上の相同性を有していてよい。「相同性」という用語は、「同一性」を意味し得る。

「タンパク質バリアント」という記載は、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであるかにかかわらずその配列中に変異を有するタンパク質を意味してよい。バリアントタンパク質における変異の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。バリアントタンパク質における変異の数は、配列番号２において、1〜30、他の例では1〜15、更に他の例では1〜5であってよい。バリアントにおけるこのような変異は、タンパク質の三次元構造に重要ではないタンパク質の領域において生じうる。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有しているため、そのような変異によっては三次元構造は影響を受けないからである。

２つのアミノ酸配列の間の相同性は、周知の方法、例えば、３つのパラメータ（スコア、同一性、及び類似性）を計算するコンピュータプログラムBLAST 2.0を使用して決定することができる。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるよう、保存的変異であるべきである。代表的な保存的変異は、保存的置換である。保存的置換としては、Ser又はThrによるAlaの置換、Gln、His、又はLysによるArgの置換、Glu、Gln、Lys、His、又はAspによるAsnの置換、Asn、Glu、又はGlnによるAspの置換、Ser又はAlaによるCysの置換、Asn、Glu、Lys、His、Asp、又はArgによるGlnの置換、Asn、Gln、Lys、又はAspによるGluの置換、ProによるGlyの置換、Asn、Lys、Gln、Arg、又はTyrによるHisの置換、Leu、Met、Val、又はPheによるIleの置換、Ile、Met、Val、又はPheによるLeuの置換、Asn、Glu、Gln、His、又はArgによるLysの置換、Ile、Leu、Val、又はPheによるMetの置換、Trp、Tyr、Met、Ile、又はLeuによるPheの置換、Thr又はAlaによるSerの置換、Ser又はAlaによるThrの置換、Phe又はTyrによるTrpの置換、His、Phe、又はTrpによるTyrの置換、及びMet、Ile、又はLeuによるValの置換が挙げられる。

更に、bssR遺伝子は、機能的なBssRタンパク質をコードする限り、配列番号１に示す塩基配列又はこの塩基配列から調製することのできるプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントであってよい。「ストリンジェントな条件」は、特異的なハイブリッド、例えば、60％以上、他の例では70％以上、他の例では80％以上、他の例では90％以上、他の例では95％以上、他の例では98％以上、他の例では99％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件としては、1×SSC、0.1％SDS、他の例では0.1×SSC、0.1％SDSの塩濃度で、60℃で、1回またはそれ以上、他の例では2回又は3回、洗浄することが挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用する膜の種類に依存し、原則として、製造業者によって推奨されているものとすべきである。例えば、ストリンジェントな条件下でHybond（商標名）N+ナイロン膜（アマシャム）について推奨される洗浄時間は15分である。洗浄工程は、2〜3回行うことができる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション条件に応じて適宜選択することができ、通常は100 bp〜1 kbpである。

遺伝子の発現を増強する方法には、遺伝子のコピー数を増加させることが含まれる。腸内細菌科の細菌内で機能することのできるベクターに遺伝子を導入することにより、遺伝子のコピー数が増加する。低コピーベクター（low copy vector）を使用することができる。低コピーベクターとしては、限定されるものではないが、pSC101、pMW118、pMW119等が挙げられる。「低コピーベクター」という用語は、コピー数が細胞当たり最大で5コピーまでのベクターについて使用される。しかしながら、pBR系プラスミド等の高コピーベクター（high copy vector）を使用することもできる。

遺伝子発現の増強は、例えば相同組換えやMu組み込み等によって、細菌の染色体中に遺伝子を多コピー導入することによっても達成できる。例えば、1回のMu組み込み作用により、最大3コピーまでの遺伝子を細菌の染色体中に導入することができる。

遺伝子のコピー数の増加は、細菌の染色体DNA中に遺伝子を多コピー導入することによっても達成できる。細菌の染色体中に遺伝子を多コピー導入するためには、染色体DNA中の多コピーな配列を標的として相同組換えを実施する。染色体DNA中に多コピー存在する配列には、限定されるものではないが、反復性DNA（repetitive DNA）、又は転移因子（transposable element）の末端に存在する逆方向反復（inverted repeats）が含まれる。また、遺伝子をトランスポゾンに組み込むことが可能であり、これを転移させ、染色体DNAに遺伝子を多コピー導入することができる。

遺伝子発現の増強は、プロモーター、ターミネーター、及びシャイン-ダルガーノ（SD）配列等の遺伝子の発現調節配列を改変すること、例えば、目的遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置すること、によっても達成できる。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、λファージのP_R又はP_Lプロモーターは、いずれも強力なプロモーターであることが知られている。強力なプロモーターの使用は、遺伝子の多コピー化と組み合わせてよい。あるいは、プロモーターの効果は、例えば、プロモーターに変異を導入し、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させることにより増強することができる。また、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンの直ぐ上流の配列、における数個のヌクレオチドの置換は、mRNAの翻訳性（translatability）に大きく影響し得ることが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性質によっては、発現レベルが20倍に及ぶことが分かっている（Goldら、Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Huiら、EMBO J., 3, 623-629, 1984）。

更に、細菌の染色体上の遺伝子のプロモーター領域にヌクレオチド置換を導入することもでき、この結果、より強いプロモーター機能が得られる。発現調節配列の改変は、例えば、WO00/18935及びJP1-215280Aに開示されているような、温度感受性プラスミドを使用する遺伝子置換と同様のやり方で行うことができる。

プラスミドDNAの調製、DNAの消化及び連結、形質転換、オリゴヌクレオチドのプライマーとしての選択のための方法等は、当業者に周知の通常の方法であってよい。これらの方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。

L-アミノ酸生産細菌
bssR遺伝子の発現が増強されるよう改変された、ここに開示する主題に基づく細菌としては、芳香族又は非芳香族L-アミノ酸のいずれを生産することのできる細菌でも使用することができる。

ここに開示する主題に基づく細菌は、L-アミノ酸を生産する能力をもともと（inherently）有する細菌内において、bssR遺伝子の発現を増強することにより取得することができる。あるいは、ここに開示する主題に基づく細菌は、bssR遺伝子の発現が既に増強されている細菌に、L-アミノ酸を生産する能力を付与することにより取得することができる。

L-スレオニン生産細菌
L-スレオニン生産細菌、又はL-スレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)（米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号）、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081)（米国特許第5,631,157号）、E. coli NRRL-21593（米国特許第5,939,307号）、E. coli FERM BP-3756（米国特許第5,474,918号）、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520（米国特許第5,376,538号）、E. coli MG442（Gusyatinerら、Genetika（ロシア語）、14, 947-956 (1978)）、並びにE. coli VL643及びVL2055（EP1149911A）等が挙げられる。

TDH-6株は、thrC遺伝子を欠損し、さらに、スクロース資化性で、ilvA遺伝子にリーキー（leaky）変異を有する。この株は、rhtA遺伝子にも変異を有し、これにより高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性が付与されている。B-3996株は、変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010系ベクターに挿入することによって得られたプラスミドpVIC40を有する。この変異型thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害から実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする。B-3996株は、1987年11月19日に、受託番号RIA 1867の下で、All-Union Scientific Center
of Antibiotics (Russia, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A) に寄託された。この株は、1987年4月7日に、受託番号VKPM B-3996の下で、Russian National Collection
of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation) にも寄託された。

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) は、L-スレオニン生産細菌を誘導するための親株として使用してもよい。B-5318株は、イソロイシン非要求性（prototrophic）であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの調節領域が温度感受性のλファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318株は、1990年3月3日に、受託番号VKPM B-5318の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) に寄託された。

細菌は、以下の遺伝子の１またはそれ以上の発現が増強されるよう、さらに改変されていてよい：
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩ（aspartokinase homoserine dehydrogenase I）をコードする変異型thrA遺伝子；
ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）をコードするthrB遺伝子；
スレオニン合成酵素（threonine synthase）をコードするthrC遺伝子；
推定上の膜貫通タンパク質（putative transmembrane protein）をコードするrhtA遺伝子；
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase）をコードするasd遺伝子；及び
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパルテートトランスアミナーゼ（aspartate transaminase））をコードするaspC遺伝子。

Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置337〜2799、GenBank accession no. N
C_000913.2, gi: 49175990）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置2801〜3733、GenBank accession no. NC_000913.2, gi: 49175990）。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は明らかとなっている（ヌクレオチド位置3734〜5020、GenBank accession no. NC_000913.2, gi: 49175990）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら３つの遺伝子は全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、望ましくは、転写に影響を与えるアテニュエーター領域を同オペロンから除去する（WO2005/049808、WO2003/097839）。

スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子は、thrB遺伝子及びthrC遺伝子と共に、スレオニン生産E. coli株VKPM B-3996中に存在する周知のプラスミドpVIC40から単一のオペロンとして取得することができる。プラスミドpVIC40については、米国特許第5,705,371号に詳細に記載されている。

rhtA遺伝子は、E. coli染色体上の18分に位置し、グルタミン輸送系の構成要素をコードするglnHPQオペロンに近接している。rhtA遺伝子は、ORF1（ybiF遺伝子、ヌクレオチド位置764〜1651、GenBank accession no. AAA218541, gi:440181）と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によってコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht：ホモセリン及びスレオニンに対する耐性（resistance to homoserine and threonine））。また、rhtA23変異が、AGT開始コドンに対する−１位におけるG→A置換であることが明らかにされている（ABSTRACTS of the 17^thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A）。

E. coliのasd遺伝子は既に明らかとなっており（ヌクレオチド位置3572511〜3571408、GenBank accession no. NC_000913.1, gi:16131307）、同遺伝子の塩基配列に基づいて調製したプライマーを利用するPCR（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T. J.ら、Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照のこと）によって取得することができる。他の微生物のasd遺伝子は、同様の手法で取得することができる。

また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかとなっており（ヌクレオチド位置983742〜984932、Genbank accession no. NC_000913.1, gi:16128895）、PCRによって取得することができる。他の微生物のaspC遺伝子は、同様の手法で取得することができる。

L-リジン生産細菌
Escherichia属に属するL-リジン生産細菌としては、L-リジンアナログに対する耐性を有する変異体が挙げられる。L-リジンアナログは、Escherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、培地中にL-リジンが存在する場合、この阻害は完全に又は部分的に脱感作される。L-リジンアナログとしては、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン（AEC）、γ‐メチルリジン、α‐クロロカプロラクタム等が挙げられる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体は、Escherichia属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって得ることができる。L-リジンを製造するのに有用な細菌株としては、特に、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185;米国特許第4,346,170号参照）及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物においては、L-リジンによるアスパルト
キナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。

WC196株は、Escherichia coliのL-リジン生産細菌として使用することができる。この細菌株は、Escherichia coli K-12から誘導されたW3110株にAEC耐性を付与することにより、育種された。この結果得られた株は、Escherichia coli AJ13069株と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 （郵便番号305-8566））に、1994年12月6日に寄託され、FERM P-14690の受託番号が付与された。その後、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-5252の受託番号が付与された（米国特許第5,827,698号）。

L-リジン生産細菌、又はL-リジン生産細菌を誘導するのに使用することができる親株としては、L-リジン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。このような遺伝子としては、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリネート合成酵素（dapA）、アスパルトキナーゼ（lysC）、ジヒドロジピコリネートレダクターゼ（dapB）、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（lysA）、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、及びアスパルターゼ（aspA）（EP1253195A）をコードする遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP1170376A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（pntAB）（米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、又はこれらの組合せについて発現を増大した株であってよい。

L-リジン生産細菌を誘導するのに使用することができる親株としては、L-リジンの生合成経路から分岐してL-リジン以外の化合物を生成するための反応を触媒する酵素の活性が減少したか、この活性がなくなった株が挙げられる。L-リジンの生合成経路から分岐してL-リジン以外の化合物を生成するための反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（米国特許第5,827,698号）、及びリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。

L-システイン生産細菌
L-システイン生産細菌、又はL-システイン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、フィードバック耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする種々のcysEアレルを形質転換したE. coli JM15（米国特許第6,218,168号、ロシア連邦特許出願第2003121601号）、細胞に毒性の物質を分泌するのに適したタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現したE. coli W3110（米国特許第5,972,663号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したE. coli株（JP11155571A2）、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子（positive transcriptional regulator）の活性が増大したE. coli W3110等が挙げられる。

L-ロイシン生産細菌
L-ロイシン生産細菌、又はL-ロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシンに耐性のE. coli株（例えば、57株（VKPM B-7386、米国特許第6,124,121号））又はβ-2-チエニルアラニン、3-ヒドロキシロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンを含むロイシンアナログに耐性のE. coli株（JP62-34397B及びJP8-70879A）、WO96/06926に記載された遺伝子操作方法によって得られたE. coli株、E. coli H-9068（JP8-70879A）等が挙げられる。

細菌は、L-ロイシンの生合成に関与する１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより改良されていてよい。そのような遺伝子としては、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられ、好ましい代表例は、L-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレート合成酵素をコードする変異型leuA遺伝子である（米国特許第6,403,342号）。さらに、細菌は、菌体からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより改良されていてよい。そのような遺伝子としては、b2682及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）が挙げられる（EP 1239041 A2）。

L-ヒスチジン生産細菌
L-ヒスチジン生産細菌、又はL-ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli 24株（VKPM B-5945, RU2003677）、E. coli 80株（VKPM B-7270, RU2119536）、E. coli NRRL B-12116〜B-12121（米国特許第4,388,405号）、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676)（米国特許第6,344,347号）、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201（米国特許第6,258,554号）等が挙げられる。

L-ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-ヒスチジンの生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。そのような遺伝子としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシルAMPシクロヒドラーゼ（hisI）、ホスホリボシル-ATPピロホスホハイドロラーゼ（hisIE）、ホスホリボシルホルムイミノ-5-アミノイミダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールホスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールホスファターゼ（hisB）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等をコードする遺伝子が挙げられる。

hisG及びhisBHAFIによりコードされるL-ヒスチジン生合成酵素は、L-ヒスチジンによって阻害されることが知られており、よって、L-ヒスチジン生産能は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼにフィードバック阻害に対する耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増強することもできる（ロシア連邦特許第2003677号及び2119536号）。

L-ヒスチジン生産能を有する株として、具体的には、L-ヒスチジン生合成酵素をコードするDNAを担持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048（JP 56-005099 A）、アミノ酸排出のための遺伝子であるrhtを導入したE. coli株（EP1016710A）、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン、及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株（VKPM B-7270、ロシア連邦特許第2119536号）等が挙げられる。

L-グルタミン酸生産細菌
L-グルタミン酸生産細菌、又はL-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli VL334thrC⁺ (EP 1172433) が挙げられる。E. coli VL334 (VKPM B-1641) は、thrC及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性の株である（米国特許第4,278,765号）。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12 (VKPM B-7) 細胞で生育させたバクテリオファージP1を使用する一般的なトランスダクション法によって導入した。この結果、L-グルタミン酸を生産することのできるL-イソロイシン要求性株VL334thrC⁺ (VKPM B-8961) が得られた。

L-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損した株、又はL-グルタミン酸生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子が増強された株が挙げられる
。L-グルタミン酸生合成に関与する遺伝子としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミン合成酵素（glnA）、グルタミン酸合成酵素（gltAB）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）、クエン酸合成酵素（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルビン酸キナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルビン酸合成酵素（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセレートキナーゼ（pgk）、グルセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（fbp）、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、及びグルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）をコードする遺伝子が挙げられる。

クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強されるよう改変された株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示された株が挙げられる。

クエン酸合成酵素遺伝子及び／又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現が低下し、且つ／又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性を欠損するよう改変された株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示された株が挙げられる。

L-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-グルタミン酸生合成経路から分岐してL-グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または消失した株が挙げられる。そのような酵素としては、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA）、ホスホトランスアセチラーゼ（pta）、アセテートキナーゼ（ack）、アセトヒドロキシ酸合成酵素（ilvG）、アセト乳酸合成酵素（ilvI）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldh）、及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ（gadAB）が挙げられる。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が欠損または低下したEscherichia属に属する細菌、及びこれらを取得する方法は、米国特許第5,378,616号及び5,573,945号に記載されている。特に、これらの株には以下のものが含まれる：
E. coli W3110sucA::Km^R
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W3110sucA::Km^Rは、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。

L-グルタミン酸生産細菌として、他には、Escherichia属に属し、アスパラギン酸の代謝拮抗物質に対する耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損していてもよく、そのような株としては、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807)（米国特許第5,908,768号）、さらにL-グルタミン酸分解能が低下したFERM P-12379（米国特許第5,393,671号）、AJ13138 (FERM BP-5565)（米国特許第6,110,714号）等が挙げられる。

L-グルタミン酸生産細菌としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損または低下したPantoeaに属する変異株が挙げられ、上記のようにして取得することができる。そのような株には、Pantoea ananatis AJ13356（米国特許第6,331,419号）が含まれる。Pantoea ananatis AJ13356は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立
行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 （郵便番号305-8566））に、1998年2月19日、FERM P-16645の受託番号の下で寄託された。その後、同株は1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6615の受託番号が付与された。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損している。同株は、分離された当時はEnterobacter agglomeransとして同定され、Enterobacter agglomaerans AJ13356として寄託された。しかしながら、同株は、最近、16S rRNAの塩基配列解析等に基づきPantoea ananatisとして再分類された。AJ13356は、Enterobacter agglomeransとして上記寄託機関に寄託されたが、この明細書の目的のためには、Pantoea ananatisとして記載する。

L-フェニルアラニン生産細菌
L-フェニルアラニン生産細菌、又はL-フェニルアラニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10,tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保有するE. coli HW1089 (ATCC 55371)（米国特許第5,354,672号）、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146、及びNRRL B-12147（米国特許第4,407,952号）が挙げられる。また、親株としては、E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110(tryA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)、及びE. coli K-12 [W3110(tyrA)/pBP-aroG4, pACMAB]（AJ12604 (FERM BP-3579)と命名）を使用することができる（EP 488424 B1）。更に、yedA遺伝子又はyddG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が増強されたEscherichia属に属するL-フェニルアラニン生産細菌を使用してもよい（米国特許出願第2003/0148473A1号及び2003/0157667A1号）。

L-トリプトファン生産細菌
L-トリプトファン生産細菌、又はL-トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、変異型trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニルtRNA合成酵素を欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123)（米国特許第5,756,345号）、セリンによるフィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害が解除されたアントラニレート合成酵素をコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164(pGH5)（米国特許第6,180,373号）、トリプトファナーゼ酵素を欠損したE. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264)（米国特許第4,371,614号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたE. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps（WO9708333、米国特許第6,319,696号）等が挙げられる。yedA遺伝子又はyddG遺伝子によりコードされる同定済みのタンパク質の活性が増強されたEscherichia属に属するL-トリプトファン生産細菌を使用してもよい（米国特許出願第2003/0148473A1号及び2003/0157667A1号）。

L-トリプトファン生産細菌を誘導するための親株としては、アントラニレート合成酵素、ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ、及びトリプトファン合成酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。アントラニレート合成酵素及びホスホグリセレートデヒドロゲナーゼは、いずれもL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けることから、フィードバック阻害を脱感作する変異をこれらの酵素に導入してもよい。そのような変異を有する株として、具体的には、脱感作されたアントラニレート合成酵素を保有するE. coli SV164、及びフィードバックから脱感作されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。

L-トリプトファン生産細菌を誘導するための親株としては、脱感作されたアントラニレート合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株も挙げられる（JP 57-71397A、JP62-244382A、米国特許第4,371,614号）。更に、L-トリプトファン生産能は、トリプトファンオペロンの内、トリプトファン合成酵素をコードする遺伝子（trpBA）の発現を増強することによって付与することができる。トリプトファン合成酵素は、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によってコードされるα及びβサブユニットからなる。加えて、L-トリプトファン生産能は、イソクエン酸リアーゼ−リンゴ酸合成酵素オペロンの発現を増強することによって改良することができる（WO2005/103275）。

L-プロリン生産細菌
L-プロリン生産細菌、又はL-プロリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ilvA遺伝子を欠損し、L-プロリンを生産することのできるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012)（EP 1172433）が挙げられる。細菌は、L-プロリン生合成に関与する１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。L-プロリン生産細菌に好ましい遺伝子としては、L-プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子が挙げられる（DE特許3127361）。さらに、細菌は、菌体からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現を増強することにより改良されていてよい。そのような遺伝子としては、b2682及びb2683遺伝子（ygaZH遺伝子）が挙げられる（EP 1239041 A2）。

L-プロリン生産活性を有するEscherichia属に属する細菌としては、以下のE. coli株が挙げられる：NRRL B-12403及びNRRL B-12404（イギリス特許2075056）、VKPM B-8012（ロシア連邦特許出願第2000124295号）、ドイツ特許3127361に記載されたプラスミド変異体、Bloom F. R.ら（第15回Miami winter symposium, 1983, p. 34）に記載されたプラスミド変異体等。

L-アルギニン生産細菌
L-アルギニン生産細菌、又はL-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli 237株 (VKPM B-7925)（米国特許出願第2002/058315A1号）及び変異型N-アセチルグルタミン酸合成酵素を保有するその誘導体株（ロシア連邦特許出願第2001112869号）、E. coli 382株 (VKPM B-7926)（EP1170358A1）、ならびにN-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株（EP1170361A1）等が挙げられる。

L-アルギニン生産細菌を誘導するための親株としては、L-アルギニンの生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。このような遺伝子としては、N-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギノコハク酸合成酵素（argG）、アルギノコハク酸リアーゼ（argH）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子が挙げられる。

L-シトルリン生産細菌
L-シトルリン生産細菌、又はL-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coliの変異型N-アセチルグルタミン酸合成酵素株である237/pMADS11, 237/pMADS12、及び237/pMADS13 (RU2215783, EP1170361B1, US6790647B2)、E. coli 333株 (VKPM B-8084）及び374株 (VKPM B-8086)（両者は、フィードバック耐性の変異型カルバモイルリン酸合成
酵素を保有する）（ロシア連邦特許第RU2264459 C2号）、α‐ケトグルタル酸合成酵素の活性が増加し、さらにフェレドキシンNADP⁺レダクターゼ、ピルビン酸合成酵素、又はα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が改変されたE. coli株（EP 2133417 A1号）、ならびに、コハク酸デヒドロゲナーゼ及びα‐ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が減少したP. ananatis NA1sucAsdhA株（米国特許出願第2009286290号）等が挙げられる。

L-シトルリンは、L-アルギニンの生合成経路の中間体であるため、L-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、L-アルギニン生合成酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。このような遺伝子としては、限定されるものではないが、N-アセチルグルタミン酸合成酵素（argA）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子又はこれらの組合せが挙げられる。

また、L-シトルリン生産細菌は、いずれかのL-アルギニン生産細菌、例えばE. coli 382株 (VKPM B-7926)から、argG遺伝子によってコードされるアルギノコハク酸合成酵素を不活化させることにより容易に得られる。

「アルギノコハク酸合成酵素の不活化」という記載は、細菌が不活性なアルギノコハク酸合成酵素を含有するように改変されたことを意味してもよく、細菌がアルギノコハク酸合成酵素を合成することができないことを意味してもよい。アルギノコハク酸合成酵素の不活化は、argG遺伝子の不活化によって行うことができる。

「argG遺伝子の不活化」という記載は、改変された遺伝子が、完全に非機能的なタンパク質をコードすることを意味する。遺伝子の一部または全体の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス／ナンセンス変異の導入、又は遺伝子の隣接領域（プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等の遺伝子の発現を制御する配列を含む）の改変により、改変されたDNA領域が遺伝子を本来の形で発現できないことも可能である。

細菌の染色体上のargG遺伝子の有無は、PCRやサザンブロッティング等を含む周知の方法によって検出することができる。また、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することによって見積もることができる。argG遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEとそれに続けてイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）を行うこと等を含む周知の方法によって測定することができる。

argG遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内の活性が非改変株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することにより、弱化させることができる。遺伝子の発現の弱化をもたらす変異には、遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸の置換を引き起こす１以上の塩基の置換（ミスセンス変異）、終止コドンの導入（ナンセンス変異）、フレームシフトを引き起こす１又は２塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは遺伝子の全体の欠失が含まれる（Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)）。argG遺伝子の発現は、プロモーターやシャイン-ダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することによっても弱化させることができる（WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)）。

例えば、遺伝子組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。活性の低下した変異型タンパク質をコードする変異型遺伝子を調製し、その変異型遺伝子を含むDNA断片を用いて、改変すべき細菌を形質転換する。その後、相同組換えによって、染色体上の本来の（native）遺伝子を変異型遺伝子によって置換し、この結果得られる株を選択する。相同組換えを使用する遺伝子置換または遺伝子破壊は、直鎖DNAを用いて行うことができ、これは「Redドライブンインテグレーション(Red-driven integration)」として知られている（Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 97, 12, p 6640-6645 (2000)）。または、相同組換えを使用する遺伝子置換は、温度感受性複製開始点を有するプラスミドを用いて行うことができる（米国特許第6,303,383号又はJP 05-007491A）。更に、宿主中で複製できないプラスミドを使用する上記のような相同組換えを使用して、遺伝子置換による部位特異的変異を組み込むこともできる。

遺伝子の発現は、遺伝子のコード領域にトランスポゾン又はIS因子（IS factor）を挿入することによっても弱化させることができ（米国特許第5,175,107号）、又は、従来の方法、例えば、UV照射又はニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を用いる変異誘発によっても弱化させることができる。

L-オルニチン生産細菌
L-オルニチン生産細菌は、いずれかのアルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株（VKPM B-7296）から、argF及びargIの両遺伝子によりコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活化させることにより容易に取得することができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを不活化させる方法は、上記の通りである。

L-バリン生産細菌
L-バリン生産細菌、又はL-バリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、Escherichia属に属する細菌、例えば、H-81 (VKPM B-8066)、NRRL B-12287及びNRRL B-12288（米国特許第4,391,907号）、VKPM B-4411（米国特許第5,658,766号）、VKPM
B-7707（欧州特許出願第EP1016710A2号）等が挙げられる。

L-バリン生産細菌を誘導するための親株としては、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロン（米国特許第5,998,178号）を過剰発現するよう改変された株が挙げられる。生産されるL-バリンによってオペロンの発現がアテニュエーション（減衰）を受けないよう、ilvGMEDAオペロン中のアテニュエーションに必要な領域を除去するのが望ましい。更に、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するよう、望ましくはオペロン中のilvA遺伝子を破壊する。

L-バリン生産細菌を誘導するための親株としては、アミノアシルt-RNA合成酵素の変異を有する変異体（米国特許第5,658,766号）も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNA合成酵素をコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970を使用することができる。E. coli VL1970は、1988年1月24日、受託番号VKPM B-4411の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation) に寄託された。

また、生育にリポ酸を要求し、且つ／又はH⁺-ATPアーゼを欠く変異体を、親株として使用することもできる（WO96/06926）。

L-イソロイシン生産細菌
L-イソロイシン生産細菌、又はL-イソロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、限定されるものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体（JP 5-304969A）、チアイソロイシンやイソロイシンヒドロキサメート等
のイソロイシンアナログに対する耐性を有する変異体、及びDL-エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性をさらに有する変異体（JP 5-130882A）が挙げられる。さらに、L-イソロイシン生合成に関与するタンパク質、例えば、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキセート合成酵素、をコードする遺伝子により形質転換された組換え株を親株として使用することもできる（JP 2-458A、FR 0356739、及び米国特許第5,998,178号）。

L-メチオニン生産細菌
L-メチオニン生産細菌、及びL-メチオニン生産細菌を誘導するための親株としては、限定されるものではないが、L-スレオニン要求性変異株やノルロイシン耐性変異株（JP2000-139471A）が挙げられる。また、メチオニンリプレッサー欠損株や、L-メチオニン生合成に関与するタンパク質、例えばホモセリントランススクシニラーゼやシスタチオニンγ−合成酵素、をコードする遺伝子により形質転換された組換え株（JP2000-139471A）を親株として使用することもできる。

２．方法
ここに開示した主題に基づく例示的な方法には、ここに開示した主題に基づく細菌を培地中で培養して培地中にL-アミノ酸を生産および分泌させ、培地からL-アミノ酸を回収することにより、L-アミノ酸を製造することが含まれる。

培養、ならびに培地からのL-アミノ酸の回収及び精製等は、細菌を使用してアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様のやり方で行うことができる。

培養のために選択される培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて、選択された細菌が生育のために要求する適量の栄養素を含む限り、合成培地であってもよく、天然培地であってもよい。炭素源には、グルコースおよびスクロース等の種々の炭水化物および種々の有機酸が含まれ得る。用いる微生物の同化の様式によっては、エタノール及びグリセリンを含むアルコールを使用してよい。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウム等の種々のアンモニウム塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵微生物等の天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。

培養は、20〜40℃の温度で、他の例では30〜38℃の温度で、振盪および／または通気攪拌によるような好気的な条件下で、行うことができる。培養のpHは、通常は5〜9、他の例では6.5〜7.2である。培養のpHは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液を用いて調整することができる。通常は、1〜5日間の培養により、液体培地中に標的のL-アミノ酸が蓄積する。

培養後、細胞等の固形分は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、L-アミノ酸は、イオン交換、濃縮、及び／又は結晶化の方法によって回収および精製することができる。

以下の非限定的な実施例を参照し、以下、本発明を更に具体的に説明する。

実施例１．E. coli MG1655::P_L-tacbssR株の構築
E. coli MG1655::P_L-tacbssR株を、MG1655株のbssR遺伝子の本来の（native）プロモーター領域をP_L-tacプロモーターで置換することにより取得した。

bssR遺伝子の本来のプロモーター領域を置換するために、P_L-tacプロモーター及びcat遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（Cm^R）を有するDNA断片を、Datsenko, K. A.とWanner, B. L., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) によって記載された「Redを介したインテグレーション（Red-mediated integration）」及び／又は「Redドライブンインテグレーション(Red-driven integration)」とも呼ばれる方法により、本来のプロモーター領域に代えて、E. coli MG1655の染色体中に組み込んだ。

cat遺伝子に接続したP_L-tacプロモーターの断片は、E. coli MG1655P_L-tacxylE株（WO2006/043730）の染色体DNAをテンプレートとして使用するPCRにより取得した。P_L-tacプロモーターの塩基配列を配列表に示す（配列番号３）。プライマーP1（配列番号４）及びP2（配列番号５）をPCR増幅に使用した。プライマーP1は、後の細菌の染色体中への組み込みのためにプライマーに導入された、bssR遺伝子の開始コドンから166 bp上流に位置する領域に相補的な36ヌクレオチドを含み、プライマーP2は、bssR遺伝子の5'-配列と同一の36ヌクレオチドを含む。

PCRは、"Gene Amp PCR System 2700"増幅装置（amplificatory）（アプライドバイオシステムズ）を使用して行った。反応混合物（合計容量50μl）は、15 mM MgCl₂を含む５μlの10×PCR緩衝液（“Fermentas”、リトアニア）、200μlの各dNTP、25 pmolの各設計したプライマー、及び1 UのTaq-ポリメラーゼ（“Fermentas”、リトアニア）よりなるものとした。約20 ngのE. coli MG1655P_L-tacxylEゲノムDNAを、PCRのためのテンプレートとして反応混合物に添加した。

温度プロファイルは以下の通りとした：95℃で5分の最初のDNA変性を行った後、95℃で30秒の変性、54℃で30秒のアニーリング、72℃で1.5分の伸長を35サイクル行い、72℃で5分の最後の伸長を行った。次いで、増幅したDNA断片は、アガロースゲル電気泳動により精製し、"GenElute Spin Columns"（「シグマ」、米国）を使用して抽出し、エタノールで沈殿させた。得られたDNA断片は、E. coli MG1655/pKD46の細菌染色体中へのエレクトロポーレーション及びRedを介したインテグレーション（Red-mediated integration）に使用した。pKD46プラスミド（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45）は、温度感受性の複製開始点、λファージの2,154塩基のDNA断片（ヌクレオチド位置31088〜33241, GenBank accession no. J02459）、並びにアラビノース誘導性P_araBプロモーターの制御下にあるλRed相同組換え系の遺伝子（γ、β、およびエキソ（exo）遺伝子）を含む。pKD46プラスミドは、MG1655株の染色体へのPCR産物の組み込みに必要である。MG1655株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108, U.S.A.）から入手することができる。

MG1655/pKD46細胞を、アンピシリン（100μg/ml）を添加した液体LB培地中で30℃で一夜生育させた後、アンピシリン（100μg/ml）及びL-アラビノース（10mM）（アラビノースは、Red系の遺伝子をコードするプラスミドを誘導するのに用いられる）を添加したSOB培地（酵母エキス, 5 g/l; NaCl, 0.5 g/l; トリプトン, 20 g/l; KCl, 2.5 mM; MgCl₂, 10 mM）を用いて1：100に希釈し、細菌培養物の光学密度がOD₆₀₀＝0.4〜0.7に達するまで30℃で生育させた。細菌培養液10 ml分の生育細胞を、氷冷した脱イオン水を用いて3回洗浄した後、100μlの水に懸濁した。脱イオン水に溶解した10μlのDNA断片（100ng）を細胞懸濁液に添加した。エレクトロポーレーションは、"Bio-Rad"エレクトロポーレーション装置（electroporator）（USA）（No. 165-2098、バージョン2-89）を用いて、製造元のマニュアルに従って行った。通電した細胞を、1 mlのSOC培地（Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に添加し、37℃で2時間インキュベートした後、25μg/mlのクロラムフ
ェニコールを含有するL-寒天上に塗布した。24時間以内に生育したコロニーについて、プライマーP3（配列番号６）及びP4（配列番号７）を使用するPCRにより、bssR遺伝子の本来のプロモーター領域に代わるCm^Rマーカーの存在を試験した。この目的のために、新たに単離したコロニーを20μlの水に懸濁し、次いで、1μlの得られた懸濁物をPCRに使用した。以下の温度プロファイルを使用した：95℃で10分の最初のDNA変性を行った後、95℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、及び72℃で1分の伸長を30サイクル行い、72℃で7分の最後の伸長を行った。試験したCm^Rコロニーのいくつかが、所望の約2000 bpのDNA断片を有しており、bssR遺伝子の255 bpの本来のプロモーター領域に代えて、P_l-tacプロモーター及びCm^RマーカーDNAの存在が確認された。これらの株の１つについて、37℃で培養することにより熱感受性プラスミドpKD46を除去し、この結果得られた株をE. coli MG1655 P_L-tacbssRと命名した。

実施例２．E. coli 382 P_l-tacbssRによるL-アルギニンの生産
L-アルギニン生産におけるP_L-tacプロモーター制御下でのbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_L-tacbssRの染色体由来のDNA断片を、E. coliのアルギニン生産株382にP1トランスダクション（Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によって導入した。382株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation) に2000年4月10日に受託番号VKPM B-7926の下で寄託された。

両株、382及び382 P_L-tacbssRを、それぞれ3 mlのニュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養し、0.3 mlの得られた培養液をロータリーシェーカー上の20×200
mmの試験管中の2 mlの発酵培地で37℃で48時間植菌した。

培養後、培地中に蓄積したL-アルギニンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝4：1：1（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより測定した。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液（a solution of ninhydrin (2%) in acetone）を、発色試薬として使用した。L-アルギニンを含むスポットを切り出し、CdCl₂の0.5％水溶液を用いてL-アルギニンを溶出させ、L-アルギニンの量を540 nmで分光学的に見積もった。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
L-イソロイシン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

試験管発酵の結果を表１に示す。表１から分かるように、bssR遺伝子の発現を増強した382 P_l-tacbssR株は、親のE. coli L-アルギニン生産株382と比較して、より高い蓄積量のL-アルギニンを生産することができた。

実施例３．E. coli B-3996 P_l-tacbssR株によるL-スレオニンの生産
スレオニン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssRの染色体由来のDNA断片を、E. coliのスレオニン生産株VKPM B-3996にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、B-3996 P_l-tacbssR株を得ることができる。B-3996株は、1987年11月19日に受託番号RIA 1867の下で、All-Union Scientific Center of Antibiotics (Russia, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A) に寄託された。同株は、受託番号VKPM B-3996の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)にも寄託された。

両E. coli株、B-3996及びB-3996 P_l-tacbssRは、それぞれ、L-寒天プレート上で37℃で18〜24時間生育させることができる。種培養を得るために、4％のグルコースを補填した2
mlのL-ブロス（L-broth）が入った20×200 mmの試験管中で32℃で18時間、ロータリーシェーカー（250rpm）上でこれらの株を生育させることができる。その後、0.21 ml（10％）の種原料（seed material）を発酵培地に植菌することができる。発酵は、20×200 mmの試験管中の2 mlの発酵用最少培地中で行うことができる。細胞は、250 rpmで振盪しながら32℃で65時間生育させることができる。

培養後、培地中に蓄積したL-スレオニンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝4：1：1（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより測定できる。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。L-スレオニンを含むスポットを切り出し、CdCl₂の0.5％水溶液を用いてL-スレオニンを溶出させ、L-スレオニンの量を540 nmで分光学的に見積もることができる。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース 80.0
(NH₄)₂SO₄ 22.0
NaCl 0.8
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 0.8
FeSO₄・7H₂O 0.02
MnSO₄・5H₂O 0.02
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
CaCO₃ 30.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。抗生物質は、滅菌後に培地に導入する。

実施例４．E. coli AJ11442 P_l-tacbssRによるL-リジンの生産
リジン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのリジン生産株AJ11442にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、AJ11442 P_l-tacbssR株を得ることができる。AJ11442株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6 （郵便番号305-8566））に、1981年5月1日に寄託され、FERM P-5084の受託番号が付与された。その後、1987年10月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1543の受託番号が付与された。

両E. coli株、AJ11442及びAJ11442 P_l-tacbssRは、L-培地中で37℃で培養することができ、0.3 mlの得られた培養物を、500 mlフラスコ中の必要な薬剤を含む20 mlの発酵培地中に植菌することができる。培養は、115 rpmの攪拌速度で往復振盪装置を使用して37℃で16時間実施することができる。培養の後、培地中のL-リジン量及び残存グルコース量を、公知の方法（サクラ精機製のBiotech-analyzer AS210）により測定することができる。その後、それぞれの株について、消費されたグルコースに対するL-リジンの収率を算出することができる。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース 40
(NH₄)₂SO₄ 24
K₂HPO₄ 1.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
酵母エキス 2.0
pHをKOHにより7.0に調整し、115℃で10分間培地をオートクレーブする。グルコース及びMgSO₄・7H₂Oは別々に滅菌する。CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌し、30 g/lの終濃度で培地に添加する。

実施例５．E. coli JM15(ydeD) P_l-tacbssR株によるL-システインの生産
L-システイン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssRの染色体由来のDNA断片を、E. coliのL-システイン生産株JM15(ydeD)にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、JM15(ydeD) P_l-tacbssR株を得ることができる。

E. coli JM15(ydeD) 株は、E. coli JM15株（米国特許第6,218,168号）の派生株であり、JM15株は、膜タンパク質をコードし、いずれのL-アミノ酸の生合成経路にも関与していないydeD遺伝子を含むDNAにより形質転換することができる（米国特許第5,972,663号）。JM15株(CGSC#5042)は、イェール大学ＭＣＤ生物学部門 E. coli Genetic Resource CenterのColi Genetic Stock Collection (http://cgsc.biology.yale.edu/)から取得することができる。

L-システイン生産の評価のための発酵条件は、米国特許第6,218,168号の実施例６に詳細に記載されている。

実施例６．E. coli 57 P_l-tacbssRによるL-ロイシンの生産
L-ロイシン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのL-ロイシン生産株57（VKPM B-
7386、米国特許第6,124,121号）にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、57 P_l-tacbssR株を得ることができる。57株は、1997年5月19日に受託番号VKPM
B-7386の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation) に寄託された。

両E. coli株、57及び57 P_l-tacbssRは、L-寒天プレート上で37℃で18〜24時間培養することができる。種培養を得るために、4％のスクロースを補填した2 mlのL-ブロス（L-broth）が入った20×200 mmの試験管中で32℃で18時間、ロータリーシェーカー（250 rpm）上でこれらの株を生育させることができる。その後、0.21 ml（10％）の種原料を、発酵培地に植菌することができる。発酵は、20×200 mmの試験管中の2 mlの最少発酵培地中で行うことができる。細胞は、250 rpmで振盪しながら32℃で48〜72時間生育させることができる。L-ロイシンの量は、ペーパークロマトグラフィー（液相の組成：ブタノール：酢酸：水＝4：1：1）により測定することができる。

発酵培地（pH 7.2）の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
K₂HPO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミン 0.01
CaCO₃ 25.0
グルコース及びCaCO₃は別々に滅菌する。

実施例７．E. coli 80 P_l-tacbssR株によるL-ヒスチジンの生産
L-ヒスチジン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssRの染色体由来のDNA断片を、E. coliのヒスチジン生産株80にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、80 P_l-tacbssR株を得ることができる。80株は、ロシア連邦特許第2119536号に記載されており、1999年10月15日に受託番号VKPM B-7270の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された後、2004年7月12日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。

両E. coli株、80及び80 P_l-tacbssRは、それぞれL-ブロス（L-broth）中で29℃で6時間培養することができる。その後、0.1 mlの得られた培養物を、20×200 mmの試験管中の2 mlの発酵培地に植菌し、ロータリーシェーカー（350 rpm）上で振盪しながら29℃で65時間培養することができる。培養の後、培地中に蓄積するヒスチジンの量を、ペーパークロマトグラフィーにより決定することができる。ペーパーは、ブタノール：酢酸：水＝4：1：1（v/v）からなる移動相を用いて展開することができる。ニンヒドリン（0.5％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである（pH6.0）。
グルコース 100.0
豆濃（大豆加水分解物） 0.2（全窒素として）
L-プロリン 1.0
(NH₄)₂SO₄ 25.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄ 0.01
チアミン 0.001
ベタイン 2.0
CaCO₃ 60.0
グルコース、プロリン、ベタイン、及びCaCO₃は別々に滅菌する。pHは滅菌前に6.0に調整する。

実施例８．E. coli VL334thrC⁺P_l-tacbssR株によるL-グルタミン酸の生産
L-グルタミン酸生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのL-グルタミン酸生産株VL334thrC⁺ (EP1172433)にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、VL334thrC⁺P_l-tacbssR株を得ることができる。VL334thrC⁺株は、2004年12月6日に受託番号VKPM B-8961の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された後、2004年12月8日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

両株、VL334thrC⁺及びVL334thrC⁺ P_l-tacbssRは、L-寒天プレート上で37℃で18〜24時間生育させることができる。その後、１ループ分の細胞を、2 mlの発酵培地が入った試験管に移すことができる。発酵培地は、グルコース（60 g/l）、硫酸アンモニウム（25 g/l）、KH₂PO₄（2 g/l）、MgSO₄（1 g/l）、チアミン（0.1 mg/ml）、L-イソロイシン（70μg/ml）、及びCaCO₃（25 g/l）を含有する。pHは7.2に調整する。グルコース及びCaCO₃は別々に滅菌する。培養は、振盪しながら30℃で3日間実施することができる。培養の後、生産されるL-グルタミン酸の量は、ペーパークロマトグラフィー（液相の組成はブタノール：酢酸：水＝4：1：1）に続けてニンヒドリン（アセトン中の1％溶液）による染色を行い、更に0.5％CdCl₂を含有する50％エタノール中で化合物の溶出を行うことにより決定することができる。

実施例９．E. coli AJ12739 P_l-tacbssR株によるL-フェニルアラニンの生産
L-フェニルアラニン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssRの染色体由来のDNA断片を、E. coliのフェニルアラニン生産株AJ12739にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、AJ12739 P_l-tacbssR株を得ることができる。AJ12739株は、2001年11月6日に受託番号VKPM B-8197の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された後、2002年8月23日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。

両株、AJ12739及びAJ12739 P_l-tacbssRは、ニュートリエントブロス中で37℃で18時間培養することができ、0.3 mlの得られた培養物を、それぞれ20×200 mmの試験管中の3 mlの発酵培地に植菌し、ロータリーシェーカー（350rpm）上で振盪しながら37℃で48時間培養することができる。培養の後、培地中に蓄積するフェニルアラニンの量をTLCにより決定することができる。蛍光インジケータを含まないSorbfilシリカゲルの0.11 mmの層でコーティングした10×15 cmのTLCプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を使用することができる。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール：酢酸エチル：25％アンモニア水：水＝40：40：7：16 (v/v)からなる移動相を用いて展開することができる。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りである。
グルコース 40.0
(NH₄)₂SO₄ 16.0
K₂HPO₄ 0.1
MgSO₄・7H₂O 1.0
FeSO₄・7H₂O 0.01
MnSO₄・5H₂O 0.01
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 2.0
チロシン 0.125
CaCO₃ 20.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

実施例１０．E. coli SV164(pGH5) P_l-tacbssR株によるL-トリプトファンの生産
L-トリプトファン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E.
coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのトリプトファン生産株SV164(pGH5)にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、SV164(pGH5) P_l-tacbssR株を得ることができる。SV164株は、トリプトファンによるフィードバック阻害が解除されたアントラニレート合成酵素をコードするtrpEアレルを、trpE欠損株であるE. coli KB862 (DSM7196)（WO94/08031、特開平7-507693号）に導入することにより取得した。プラスミドpGH5は、セリンによるフィードバック阻害が解除されたホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を保有する。SV164(pGH5) 株は、米国特許第6,180,373号又は欧州特許第0662143号に詳細に記載された。KB862株はAJ13828と命名され、2000年12月21日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6
（郵便番号305-8566））に、FERM BP-7405の受託番号でブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託された。

両株、SV164(pGH5)及びSV164(pGH5) P_l-tacbssRは、テトラサイクリン（10 mg/ml、pGH5プラスミドのマーカー）を補填した3 mlのニュートリエントブロス中で振盪しながら32℃で18時間培養することができる。得られた培養物（それぞれ0.3 ml）は、20×200 mmの試験管中のテトラサイクリン（10 mg/ml）を含有する3 mlの発酵培地中に植菌し、ロータリーシェーカーを用いて250 rpmで32℃で72時間培養することができる。培養の後、培地中に蓄積するトリプトファンの量は、実施例９に記載したようにしてTLCにより決定することができる。発酵培地の成分を表２に列記するが、滅菌中の好ましくない相互作用を回避するために、示したように別々のグループ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）で滅菌すべきである。

実施例１１．E. coli 702ilvA P_l-tacbssR株によるL-プロリンの生産
L-プロリン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのプロリン生産株702ilvAにP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、702ilvA P_l-tacbssR株を得ることができる。702ilvA株は、2000年7月18日に受託番号VKPM B-8012の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された後、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

両E. coli株、702ilvA及び702ilvA P_l-tacbssRは、L-寒天プレート上で37℃で18〜24時間生育させることができる。その後、これらの株は、実施例８と同様の条件下で培養することができる。

実施例１２．E. coli 382ΔargG P_l-tacbssR株によるL-シトルリンの生産
L-シトルリン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのL-シトルリン生産株382Δar
gGにP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、382ΔargG P_l-tacbssR株を得ることができる。382ΔargG株は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L.によって最初に開発された「Redドライブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645）により、382株（VKPM B-7926）の染色体上のagrG遺伝子を欠損させることにより取得することができる。この手順に従い、argG遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライマーを構築することができる。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）を、PCR反応のテンプレートとして使用することができる。

両E. coli株、382ΔargG及び382ΔargG P_l-tacbssRは、それぞれ3 mlのニュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養することができる。0.3 mlの得られた培養物は、20×200 mmの試験管中の2 mlの発酵培地に植菌し、ロータリーシェーカー上で32℃で48時間培養した。

培養後、培地中に蓄積するシトルリンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝4：1：1（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより測定できる。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。シトルリンを含むスポットを切り出し、CdCl₂の0.5％水溶液を用いてシトルリンを溶出させ、シトルリンの量を540 nmで分光学的に見積もることができる。

発酵培地の組成（g/l）は以下の通りとすることができる。
グルコース 48.0
(NH₄)₂SO₄ 35.0
KH₂PO₄ 2.0
MgSO₄・7H₂O 1.0
チアミンHCl 0.0002
酵母エキス 1.0
L-イソロイシン 0.1
L-アルギニン 0.1
CaCO₃ 5.0
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に滅菌する。CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

実施例１３．E. coli 382ΔargFΔargI P_l-tacbssR株によるL-オルニチンの生産
L-オルニチン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliのL-オルニチン生産株382ΔargFΔargIにP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、382ΔargFΔargI P_l-tacbssR株を得ることができる。382ΔargFΔargI株は、Datsenko, K. A.とWanner, B. L.によって最初に開発された「Redドライブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645）により、382株（VKPM B-7926）の染色体上のargF及びargI遺伝子を順次欠損させることにより取得することができる。この手順に従い、argF又はargI遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を付与する遺伝子の両方に相同な２対のPCRプライマーを構築することができる。プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）を、PCR反応におけるテンプレートとして使用することができる。

両E. coli株、382ΔargFΔargI及び382ΔargFΔargI P_l-tacbssRは、それぞれ3 mlのニ
ュートリエントブロス中で37℃で18時間振盪しながら培養することができる。0.3 mlの得られた培養物は、20×200 mmの試験管中の2 mlの発酵培地に植菌し、ロータリーシェーカー上で32℃で48時間培養した。

培養後、培地中に蓄積するオルニチンの量を、以下の移動相：ブタノール：酢酸：水＝4：1：1（v/v）を用いたペーパークロマトグラフィーにより測定できる。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。オルニチンを含むスポットを切り出し、CdCl₂の0.5％水溶液を用いてオルニチンを溶出させ、オルニチンの量を540 nmで分光学的に見積もることができる。

実施例１４．E. coli H81 P_l-tacbssR株によるL-バリンの生産
L-バリン生産におけるbssR遺伝子の発現増強の効果を試験するために、上記E. coli MG1655 P_l-tacbssR株の染色体由来のDNA断片を、E. coliバリン生産株H-81にP1トランスダクション（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY）によって導入し、H-81 P_l-tacbssR株を得ることができる。H-81株は、2001年1月30日に受託番号VKPM B-8066の下で、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (GNII genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation)に寄託された後、2002年2月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。

H-81株及びH-81 P_l-tacbssR株は、ニュートリエントブロス中で37℃で18時間培養することができ、0.1mlの得られた培養物を、それぞれ20×200 mmの試験管中の2 mlの発酵培地に植菌し、ロータリーシェーカーを用いて32℃で72時間培養することができる。48時間及び72時間の培養の後、L-バリンの蓄積量をTLCにより測定することができる。蛍光インジケータを含まないSorbfilシリカゲルの0.11 mmの層でコーティングした10×15 cmのTLCプレート（Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia）を使用することができる。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール：酢酸エチル：25％アンモニア水：水＝40：40：7：16 (v/v)からなる移動相を用いて展開することができる。ニンヒドリン（2％）のアセトン溶液を、発色試薬として使用できる。

発酵培地の組成（g/l）：
グルコース 60.0
(NH₄)₂SO₄ 18.0
KH₂PO₄ 1.8
MgSO₄・7H₂O 1.2
CaCO₃ 20.0
チアミンHCl 0.001
CaCO₃は、180℃で2時間乾熱滅菌する。pHは7.0に調整する。

本発明をその好適な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、また、等価物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。ここに引用した参考文献は全て、参照によりこの出願の一部として組み込まれる。

本発明によれば、腸内細菌科の細菌によるL-アミノ酸の製造を改善することができる。

Claims

L-アミノ酸を生産する方法であって、
L-アミノ酸生産細菌を培地中で培養すること、および
前記L-アミノ酸を培地から回収すること、
を含み、
前記L-アミノ酸生産細菌が、bssR遺伝子の発現が野生株と比較して増強されるように改変された、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）であり、
前記発現が、bssR遺伝子のコピー数を増加させること、またはbssR遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、方法。
前記L-アミノ酸が、芳香族L-アミノ酸及び非芳香族L-アミノ酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記芳香族L-アミノ酸が、L-フェニルアラニン、L-チロシン、及びL-トリプトファンからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記非芳香族L-アミノ酸が、L-スレオニン、L-リジン、L-システイン、L-メチオニン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ヒスチジン、グリシン、L-セリン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-プロリン、L-アルギニン、L-シトルリン、及びL-オルニチンからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
前記L-アミノ酸が、L-アルギニンである、請求項１に記載の方法。
前記bssR遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、L-アミノ酸生産細菌で発現増強させることによりL-アミノ酸生産能を増加させる作用を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。