JP2708168B2 - 微生物の改良 - Google Patents
微生物の改良Info
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- JP2708168B2 JP2708168B2 JP63038482A JP3848288A JP2708168B2 JP 2708168 B2 JP2708168 B2 JP 2708168B2 JP 63038482 A JP63038482 A JP 63038482A JP 3848288 A JP3848288 A JP 3848288A JP 2708168 B2 JP2708168 B2 JP 2708168B2
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- Japan
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- gene
- microorganism
- promoter
- bacillus
- expression control
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は有用微生物の新規な改良方法及び該改良方法
により製造された微生物、並びに該微生物を用いる有用
物質の製造方法に関する。本発明の微生物の改良方法
は、既存の遺伝子を含有する染色体に、該遺伝子の発現
を制御することができる発現制御配列を外部から導入す
ることを特徴とする。
により製造された微生物、並びに該微生物を用いる有用
物質の製造方法に関する。本発明の微生物の改良方法
は、既存の遺伝子を含有する染色体に、該遺伝子の発現
を制御することができる発現制御配列を外部から導入す
ることを特徴とする。
組換えDNA技術の発展、進歩によってホルモン、ワク
チン、インターフェロン等の蛋白質や酵素、アミノ酸、
さらにビタミンや抗生物質などの二次代謝産物に至るま
で、微生物中で大量生産が可能となった。これは、物質
生産に係わる特定の遺伝子を適当な多コピー数のプラス
ミドベクター上にクローン化し、該プラスミドを適当な
微生物中に形質転換法で導入し、物質生産に係わる導入
した遺伝子を発現させることにより達成される。この
際、活性の高いプロモーター遺伝子を有するプラスミド
ベクターを用いて、プロモーター遺伝子と目的遺伝子を
機能的に連結することにより、遺伝子の発現はより効率
的に行われる。しかしながら、プラスミドの脱落が起こ
ったり、プラスミドに変異や欠失が生じる等の為、プラ
スミドベクターを用いた物質生産は一般的に不安定であ
り安定的な物質生産には不適当なことがある。
チン、インターフェロン等の蛋白質や酵素、アミノ酸、
さらにビタミンや抗生物質などの二次代謝産物に至るま
で、微生物中で大量生産が可能となった。これは、物質
生産に係わる特定の遺伝子を適当な多コピー数のプラス
ミドベクター上にクローン化し、該プラスミドを適当な
微生物中に形質転換法で導入し、物質生産に係わる導入
した遺伝子を発現させることにより達成される。この
際、活性の高いプロモーター遺伝子を有するプラスミド
ベクターを用いて、プロモーター遺伝子と目的遺伝子を
機能的に連結することにより、遺伝子の発現はより効率
的に行われる。しかしながら、プラスミドの脱落が起こ
ったり、プラスミドに変異や欠失が生じる等の為、プラ
スミドベクターを用いた物質生産は一般的に不安定であ
り安定的な物質生産には不適当なことがある。
これに代る方法として、宿主微生物の染色体に目的遺
伝子をインテグレーションせしめる方法があり、この方
法によれば外部から導入された遺伝子を多世代にわたっ
て安定に維持することができるが、該遺伝子の増幅度を
上げることが困難であり、このため目的とする生成物の
生産性に限界があるという欠点が存在する。
伝子をインテグレーションせしめる方法があり、この方
法によれば外部から導入された遺伝子を多世代にわたっ
て安定に維持することができるが、該遺伝子の増幅度を
上げることが困難であり、このため目的とする生成物の
生産性に限界があるという欠点が存在する。
従って、目的の物質に係る遺伝子が染色体に安定に維
持されており、しかも該遺伝子が強力に発現され、目的
物質を効率よく生産することができる微生物及びその創
成方法が強く求められている。
持されており、しかも該遺伝子が強力に発現され、目的
物質を効率よく生産することができる微生物及びその創
成方法が強く求められている。
本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々検討し
た結果、特定の目的物質の生産に係わる遺伝子をすでに
含有する微生物染色体に、該遺伝子の発現を増強するこ
とができる強力なプロモーターを導入することにより、
目的物質を効率よく生産することができる微生物が得ら
れることを見出し、この発明を完成した。
た結果、特定の目的物質の生産に係わる遺伝子をすでに
含有する微生物染色体に、該遺伝子の発現を増強するこ
とができる強力なプロモーターを導入することにより、
目的物質を効率よく生産することができる微生物が得ら
れることを見出し、この発明を完成した。
従って、本発明は、目的物質の生産に係わる遺伝子
（目的遺伝子）を含有する染色体を有する微生物の該染
色体に、該目的遺伝子のための発現制御配列が、該目的
遺伝子の発現を制御することができる位置及び方向で導
入されている改良された微生物であって、前記発現制御
配列が、該発現制御配列の一端又は両端に付加された前
記目的遺伝子のDNA配列の部分と相補助的な配列による
相同的交叉により導入されたものであることを特徴とす
る微生物；目的物質の生産に係わる遺伝子（目的遺伝
子）を含有する染色体を有する微生物の該染色体に、該
目的遺伝子のための発現制御領域を、該目的遺伝子の発
現を増強することができる位置及び方向で導入すること
を特徴とする改良された微生物の製造方法において、前
記発現制御配列を、該発現制御配列の一端又は両端に付
加された前記目的遺伝子のDNA配列の部分と相補的な配
列による相同的交叉により導入することを特徴とする方
法；並びに、該微生物を培養して該遺伝子に係る生成物
を生産せしめ、そして該生成物を採取することを特徴と
する有用物質の製造方法、を提供しようとするものであ
る。
（目的遺伝子）を含有する染色体を有する微生物の該染
色体に、該目的遺伝子のための発現制御配列が、該目的
遺伝子の発現を制御することができる位置及び方向で導
入されている改良された微生物であって、前記発現制御
配列が、該発現制御配列の一端又は両端に付加された前
記目的遺伝子のDNA配列の部分と相補助的な配列による
相同的交叉により導入されたものであることを特徴とす
る微生物；目的物質の生産に係わる遺伝子（目的遺伝
子）を含有する染色体を有する微生物の該染色体に、該
目的遺伝子のための発現制御領域を、該目的遺伝子の発
現を増強することができる位置及び方向で導入すること
を特徴とする改良された微生物の製造方法において、前
記発現制御配列を、該発現制御配列の一端又は両端に付
加された前記目的遺伝子のDNA配列の部分と相補的な配
列による相同的交叉により導入することを特徴とする方
法；並びに、該微生物を培養して該遺伝子に係る生成物
を生産せしめ、そして該生成物を採取することを特徴と
する有用物質の製造方法、を提供しようとするものであ
る。
本発明は、目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその
染色体中に有し該目的物質を生産することができる微生
物、及び目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその染色
体中に有するが該目的物質を実質上生産することができ
ず新たに外部から発現制御遺伝子を導入することにより
該目的物質を生産することができる様になる微生物、の
いずれにも適用することができる。この様な微生物とし
て、例えばバチルス（Bacillus）属、エシェリシア（Es
cherichia）属、セラチア（Seratia）属、シュードモナ
ス（Psudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacte
rium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属
等に属する微生物を挙げることができる。バチルス属に
属する微生物の例として、例えばバチルス・ズブチリ
ス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・
リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス等
を挙げることができる。
染色体中に有し該目的物質を生産することができる微生
物、及び目的物質の生産に係る遺伝子をすでにその染色
体中に有するが該目的物質を実質上生産することができ
ず新たに外部から発現制御遺伝子を導入することにより
該目的物質を生産することができる様になる微生物、の
いずれにも適用することができる。この様な微生物とし
て、例えばバチルス（Bacillus）属、エシェリシア（Es
cherichia）属、セラチア（Seratia）属、シュードモナ
ス（Psudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacte
rium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属
等に属する微生物を挙げることができる。バチルス属に
属する微生物の例として、例えばバチルス・ズブチリ
ス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・
リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス等
を挙げることができる。
本発明の方法により製造される目的物質は、遺伝子の
直接的な発現生成物である蛋白質又はポリペプチド、例
えば各種の酵素類、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、
グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、トリプトファン
シンセターゼ；各種のペプチド性ホルモン類、例えばイ
ンシュリン、成長ホルモン、エンケファリン、ソマトス
タチン；各種の抗原類、例えば肝炎ワクチン、ポリオワ
クチン、ヘルペスワクチン；各種のリンホカイン類、例
えばインターフェロン、インターロイキン等であること
ができる。
直接的な発現生成物である蛋白質又はポリペプチド、例
えば各種の酵素類、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、
グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、トリプトファン
シンセターゼ；各種のペプチド性ホルモン類、例えばイ
ンシュリン、成長ホルモン、エンケファリン、ソマトス
タチン；各種の抗原類、例えば肝炎ワクチン、ポリオワ
クチン、ヘルペスワクチン；各種のリンホカイン類、例
えばインターフェロン、インターロイキン等であること
ができる。
本発明の方法により製造される目的物質はまた、遺伝
子の直接的発現生成物である１又は複数の酵素の触媒作
用により生産される物質であることができる。この様な
物質の例として複数のトリプトファン合成関連酵素によ
り合成されるＬ−トリプトファン、複数のスレオニン合
成関連酵素により合成されるＬ−スレオニン、複数のプ
リンヌクレオチド合成酵素により合成されるイノシンや
グアニン等を挙げることができる。この様な目的物質の
生産に係わる遺伝子としては、宿主微生物の染色体中に
本来存在する遺伝子であってもよく、又あらかじめ宿主
微生物の染色体中に人為的に挿入しておいた遺伝子であ
ってもよい。前者の遺伝子はその遺伝子に天然に付随す
る発現制御配列を有しており、これに加えて本発明の方
法により追加の発現制御配列を挿入することにより、宿
主による目的物質の生産を増強することができ、あるい
はもともと目的物質を実質的に生産しなかった宿主に目
的物質を生産する能力を付与することができる。後者の
場合も、多く場合その構造遺伝子に付随する発現制御領
域を有しており、本発明の方法による強力な発現制御配
列を導入することにより、前記のごとき効果を得ること
ができる。あらかじめ挿入された遺伝子がその発現制御
配列を伴っていない場合には、そのまま宿主微生物は目
的物質を生産することができないが、本発明の方法によ
り発現制御配列を人為的に挿入することにより該宿主微
生物に目的物質を生産する能力を付与することができ
る。この様は遺伝子を含有する微生物の具合例として、
枯草菌類のトリプトファン合成に係わる遺伝式とクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子を試験管内でライゲーション
せしめ、トリプトファン生産菌である若草菌類の染色体
中に両遺伝子をインテグレーションさせることにより創
製された、安定的に両遺伝子産物及びトリプトファン生
産する微生物が挙げられる（特開昭61−85184、及び特
開昭61−88873）。
子の直接的発現生成物である１又は複数の酵素の触媒作
用により生産される物質であることができる。この様な
物質の例として複数のトリプトファン合成関連酵素によ
り合成されるＬ−トリプトファン、複数のスレオニン合
成関連酵素により合成されるＬ−スレオニン、複数のプ
リンヌクレオチド合成酵素により合成されるイノシンや
グアニン等を挙げることができる。この様な目的物質の
生産に係わる遺伝子としては、宿主微生物の染色体中に
本来存在する遺伝子であってもよく、又あらかじめ宿主
微生物の染色体中に人為的に挿入しておいた遺伝子であ
ってもよい。前者の遺伝子はその遺伝子に天然に付随す
る発現制御配列を有しており、これに加えて本発明の方
法により追加の発現制御配列を挿入することにより、宿
主による目的物質の生産を増強することができ、あるい
はもともと目的物質を実質的に生産しなかった宿主に目
的物質を生産する能力を付与することができる。後者の
場合も、多く場合その構造遺伝子に付随する発現制御領
域を有しており、本発明の方法による強力な発現制御配
列を導入することにより、前記のごとき効果を得ること
ができる。あらかじめ挿入された遺伝子がその発現制御
配列を伴っていない場合には、そのまま宿主微生物は目
的物質を生産することができないが、本発明の方法によ
り発現制御配列を人為的に挿入することにより該宿主微
生物に目的物質を生産する能力を付与することができ
る。この様は遺伝子を含有する微生物の具合例として、
枯草菌類のトリプトファン合成に係わる遺伝式とクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子を試験管内でライゲーション
せしめ、トリプトファン生産菌である若草菌類の染色体
中に両遺伝子をインテグレーションさせることにより創
製された、安定的に両遺伝子産物及びトリプトファン生
産する微生物が挙げられる（特開昭61−85184、及び特
開昭61−88873）。
発現制御配列としては例えばプロモーター、ターミネ
ーター、SD配列、オペレーターが挙げられ、これらは特
定の発現制御配列に依存して通常は染色体にあらかじめ
存在する、目的物質の生産に係わる構造遺伝子の上流又
は下流に、該構造遺伝子の転写方向に合わせて挿入され
る。前記制御配列の典型的な例はプロモーターであり、
これは一般に前記構造遺伝子の上流に該構造遺伝子の転
写方向に合わせて挿入される。例えば、ある特定の宿主
微生物については、該微生物中に天然に存在するプロモ
ーターをクローン化したもの、又は該微生物のファージ
中に天然に存在するプロモーターをクローン化したも
の、あるいはこれらのプロモーターに由来するハイブリ
ドプロモーター等を使用することができる。プロモータ
ーはまた、化学合成されたものであってもよい。
ーター、SD配列、オペレーターが挙げられ、これらは特
定の発現制御配列に依存して通常は染色体にあらかじめ
存在する、目的物質の生産に係わる構造遺伝子の上流又
は下流に、該構造遺伝子の転写方向に合わせて挿入され
る。前記制御配列の典型的な例はプロモーターであり、
これは一般に前記構造遺伝子の上流に該構造遺伝子の転
写方向に合わせて挿入される。例えば、ある特定の宿主
微生物については、該微生物中に天然に存在するプロモ
ーターをクローン化したもの、又は該微生物のファージ
中に天然に存在するプロモーターをクローン化したも
の、あるいはこれらのプロモーターに由来するハイブリ
ドプロモーター等を使用することができる。プロモータ
ーはまた、化学合成されたものであってもよい。
挿入すべき発現制御領域は通常、宿主微生物中で増幅
することができるプラスミドにより、あるいは宿主微生
物中で増幅することができない環状又は線状のDNAとし
て導入される。目的とするDNAを宿主微生物に導入する
ための方法として、DNAを細胞に挿入するために通常用
いられる方法のいずれか、例えばカルシウムセル法（文
献J.Bacteriol.,119,1072（1974））、コンピテントセ
ル法（文献Gene,１,153（1977））、プロトプラスト形
質転換法〔Molec.Gen.Genet.168,111（197）〕等を用い
ることができる。
することができるプラスミドにより、あるいは宿主微生
物中で増幅することができない環状又は線状のDNAとし
て導入される。目的とするDNAを宿主微生物に導入する
ための方法として、DNAを細胞に挿入するために通常用
いられる方法のいずれか、例えばカルシウムセル法（文
献J.Bacteriol.,119,1072（1974））、コンピテントセ
ル法（文献Gene,１,153（1977））、プロトプラスト形
質転換法〔Molec.Gen.Genet.168,111（197）〕等を用い
ることができる。
プロモーター等の発現制御配列を宿主微生物の染色体
にインテグレーションする方法としては一般に、いわゆ
る相同的交叉が用いられる。このため、挿入されるべき
制御配列はその一端又は両端に、染色体にすでに存在し
ている目的生成物の生産に係わる遺伝子のDNA配列と相
同なDNA配列を有することが好ましい。
にインテグレーションする方法としては一般に、いわゆ
る相同的交叉が用いられる。このため、挿入されるべき
制御配列はその一端又は両端に、染色体にすでに存在し
ている目的生成物の生産に係わる遺伝子のDNA配列と相
同なDNA配列を有することが好ましい。
本明細書においては、具体例として、宿主微生物とし
てバチルス・アミロリクエファシエンスを用い、目的物
質の生産に係わる遺伝子としてトリプトファンオペロン
を構成する遺伝子を用い、発現制御配列としてバチルス
・アミロリクエファシエンス由来のプロモーター又はバ
チルス・ズブチリスに感染するSP02ファージ由来のプロ
モーターを用いる。以下に、この具体例を実施例として
記載する。
てバチルス・アミロリクエファシエンスを用い、目的物
質の生産に係わる遺伝子としてトリプトファンオペロン
を構成する遺伝子を用い、発現制御配列としてバチルス
・アミロリクエファシエンス由来のプロモーター又はバ
チルス・ズブチリスに感染するSP02ファージ由来のプロ
モーターを用いる。以下に、この具体例を実施例として
記載する。
なお、実施例において酵素反応条件はおよそ次の通り
とした。
とした。
Hind III消化 反応媒体:100mM Tris−Hcl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 Hind III部分消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して0.1ユニット〜１ユニッ
ト 反応条件:37℃にて60分間 Sma I 消化 反応媒体:10mM Tris−HCl（pH8.0）,20mM KCl,7mM
MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して10ユニット 反応条件:37℃にて60分間 Xba I 消化 反応条件:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 EcoR I消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 BamH I消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して10ユニット 反応条件:37℃にて60分間 DNAポリメラーゼＩ Klenowフラグメント （pol I）処理 100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,
5mM MgCl2の緩衝液中で消化された１μｇのDNA（20μ
）に対して、NNAポリメラーゼＩ・Klenowフラグメン
トを３ユニット（１μ）、各dXTP2n mole（2mM溶液を
１μ）加え、室温で30分間インキュベーションする。
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 Hind III部分消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して0.1ユニット〜１ユニッ
ト 反応条件:37℃にて60分間 Sma I 消化 反応媒体:10mM Tris−HCl（pH8.0）,20mM KCl,7mM
MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して10ユニット 反応条件:37℃にて60分間 Xba I 消化 反応条件:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 EcoR I消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して５ユニット 反応条件:37℃にて60分間 BamH I消化 反応媒体:100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5m
M MgCl2 酵素量 :DNA1μｇに対して10ユニット 反応条件:37℃にて60分間 DNAポリメラーゼＩ Klenowフラグメント （pol I）処理 100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,
5mM MgCl2の緩衝液中で消化された１μｇのDNA（20μ
）に対して、NNAポリメラーゼＩ・Klenowフラグメン
トを３ユニット（１μ）、各dXTP2n mole（2mM溶液を
１μ）加え、室温で30分間インキュベーションする。
細菌アルカリ性ホス ファーターゼ（BAP） 処理 制限酵素で消化された１μg DNA溶液に対して
0.3ユニットのBAPを加え、55℃、30分間インキュベーシ
ョンする。
0.3ユニットのBAPを加え、55℃、30分間インキュベーシ
ョンする。
T4 NDAガーゼ による連結 100mM Tris−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,5
mM MgCl2中で消化された各DNA溶液を混合後、100μＭに
なる様にATPを加え、さらにT4 DNAリガーゼを30ユニッ
ト添加し、15℃で１夜インキュベーションする。
mM MgCl2中で消化された各DNA溶液を混合後、100μＭに
なる様にATPを加え、さらにT4 DNAリガーゼを30ユニッ
ト添加し、15℃で１夜インキュベーションする。
実施例1.バチルス・アミロリクエファシエンスからのプ
ロモーターのクローニング及びマーカーの付与（第１
図） まず、プロモーター検索ベクターpGR71〔Nature,293,
309（1981）Goldfarb,D.S.et al.〕（このベクターは当
業界において広く使用されており、容易に入手すること
ができる。）を制限酵素Hind IIIで消化し、これと同じ
く制限酵素Hind IIIで消化したバチルス・アミロリクエ
ファシエンスIAM 1521の染色体DNAとを試験管内で混合
し、T4 DNAリガーゼを用いて連結反応を行った後、バチ
ルス・ズブチリスUOT 0531（東京大学応用微生物研究
所）にプロトプラスト形質転換法〔S.Chang ＆ S.N.Coh
en,Molec.gen.Genet.168,111（1979）〕で導入し、25pp
mのクロラムフェニコールを含むＬ寒天プレートに生え
る形質転換体を多数取得した。次にこの形質転換体のク
ロラムフェニコール耐性度およびクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼの活性を測定し、活性が一
番高い形質転換体バチルス・ズブチリスTFK756を高活性
プロモーターがクローン化されている株として選んだ。
TFK756からプラスミドを分離・精製し、クローン化され
ていた0.3MDの大きさのHind III断片DNAをプロモーター
活性を有する配列P756と命名、P756がクローン化された
pGR 71をpSDK 756と命名した。
ロモーターのクローニング及びマーカーの付与（第１
図） まず、プロモーター検索ベクターpGR71〔Nature,293,
309（1981）Goldfarb,D.S.et al.〕（このベクターは当
業界において広く使用されており、容易に入手すること
ができる。）を制限酵素Hind IIIで消化し、これと同じ
く制限酵素Hind IIIで消化したバチルス・アミロリクエ
ファシエンスIAM 1521の染色体DNAとを試験管内で混合
し、T4 DNAリガーゼを用いて連結反応を行った後、バチ
ルス・ズブチリスUOT 0531（東京大学応用微生物研究
所）にプロトプラスト形質転換法〔S.Chang ＆ S.N.Coh
en,Molec.gen.Genet.168,111（1979）〕で導入し、25pp
mのクロラムフェニコールを含むＬ寒天プレートに生え
る形質転換体を多数取得した。次にこの形質転換体のク
ロラムフェニコール耐性度およびクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼの活性を測定し、活性が一
番高い形質転換体バチルス・ズブチリスTFK756を高活性
プロモーターがクローン化されている株として選んだ。
TFK756からプラスミドを分離・精製し、クローン化され
ていた0.3MDの大きさのHind III断片DNAをプロモーター
活性を有する配列P756と命名、P756がクローン化された
pGR 71をpSDK 756と命名した。
次にpSDK 756のP756プロモーターの上流にマーカーと
してのテトラサイクリン耐性遺伝子を組込む為に枯草菌
プラスミドpTP5を制限酵素HindIIIで消化し、これと同
じく制限酵素Hind IIIで部分消化したpSDK 756とを混合
し、T4 DNAリガーゼを用いて結合反応を行った後、大腸
菌C600に形質転換を行い、テトラサイクリン耐性で、か
つクロラムフェニコール耐性となる形質転換体を得た。
これによりpSDK 756のP756上流に1.5MDのテトラサイク
リン耐性遺伝子を組込んだプラスミッドpSDK27364を作
製した。
してのテトラサイクリン耐性遺伝子を組込む為に枯草菌
プラスミドpTP5を制限酵素HindIIIで消化し、これと同
じく制限酵素Hind IIIで部分消化したpSDK 756とを混合
し、T4 DNAリガーゼを用いて結合反応を行った後、大腸
菌C600に形質転換を行い、テトラサイクリン耐性で、か
つクロラムフェニコール耐性となる形質転換体を得た。
これによりpSDK 756のP756上流に1.5MDのテトラサイク
リン耐性遺伝子を組込んだプラスミッドpSDK27364を作
製した。
さらに図１に示したようにまずpSDK 27364を制限酵素
Hind IIIで部分消化し、Klenow Fragmentと４種のXTPを
用いて、平滑末端を作った。次に、Sma Iで消化しBAPで
脱リン酸化したpUC 18と混合し、T4 DNAリガーゼを用い
て結合反応を行い、大腸菌JM 109に形質転換を行い、プ
ラスミドpSDK27365を含む、アンピシリン、テトラサイ
クリン耐性を示す形質転換体をスクリーニングした。こ
れにより、テトラサイクリン耐性のマーカーが付与され
たP756を有するDNA断片の調製ができるプラスミドが取
得された。
Hind IIIで部分消化し、Klenow Fragmentと４種のXTPを
用いて、平滑末端を作った。次に、Sma Iで消化しBAPで
脱リン酸化したpUC 18と混合し、T4 DNAリガーゼを用い
て結合反応を行い、大腸菌JM 109に形質転換を行い、プ
ラスミドpSDK27365を含む、アンピシリン、テトラサイ
クリン耐性を示す形質転換体をスクリーニングした。こ
れにより、テトラサイクリン耐性のマーカーが付与され
たP756を有するDNA断片の調製ができるプラスミドが取
得された。
実施例2.プロモーターP756導入用DNAの調製及び宿主株
への導入（第２図） 前記プラスミドpSDK 27365をEcoR I及びXba Iで消
化、アガロース電気泳動により分離し、フェノール抽出
及びエタノール沈澱により精製することにより、テトラ
サイクリン耐性遺伝子及びプロモーターP756を含有する
1.8MDのEcoR I−Xba I断片を調製した。
への導入（第２図） 前記プラスミドpSDK 27365をEcoR I及びXba Iで消
化、アガロース電気泳動により分離し、フェノール抽出
及びエタノール沈澱により精製することにより、テトラ
サイクリン耐性遺伝子及びプロモーターP756を含有する
1.8MDのEcoR I−Xba I断片を調製した。
一方、バチルス・アミロリクエファシエンスのトリプ
トファン合成系遺伝子が大腸菌プラスミドpBR322にクロ
ーニングされているプラスミドpSDT1111を制限酵素EcoR
I及びXba Iで消化し、アガロースゲル電気泳動により
分離し、そしてフェノール抽出及びエタノール沈澱によ
り精製することにより、トリプトファン合成系遺伝子の
上流部分を含有する2.5MDの大きさのEcoR I−Xba Iフラ
グメントを得た。なお、前記プラスミドpSDT1111を含有
する大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第7861号（FERMP−7861）として寄託されてい
る。
トファン合成系遺伝子が大腸菌プラスミドpBR322にクロ
ーニングされているプラスミドpSDT1111を制限酵素EcoR
I及びXba Iで消化し、アガロースゲル電気泳動により
分離し、そしてフェノール抽出及びエタノール沈澱によ
り精製することにより、トリプトファン合成系遺伝子の
上流部分を含有する2.5MDの大きさのEcoR I−Xba Iフラ
グメントを得た。なお、前記プラスミドpSDT1111を含有
する大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第7861号（FERMP−7861）として寄託されてい
る。
次に、両フラグメント約１μｇずつを混合し、T4 DNA
リガーゼを用いて連結反応を行い、これを用いてバチル
ス・アミロリクエファシエンスのトリプトファン生産株
バチルスSD30のコンピテントセルを次の様にして形質転
換した。
リガーゼを用いて連結反応を行い、これを用いてバチル
ス・アミロリクエファシエンスのトリプトファン生産株
バチルスSD30のコンピテントセルを次の様にして形質転
換した。
まず、TBAB寒天培地（Difco社、Bacto Tryptose10g、
Bacto Beef Extract 3g、NaCl 5g、Bacto Agar 15g;H2O
1）で画線培養したバチルスSD30をCI培地（K2HPO4 1
4g、KH2PO4 6g、（NH4）2SO4 2g、クエン酸ナトリウム
・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 5mM、グリコース5g、カザミノ
酸0.2g、Ｌ−トリプトファン50ppm、H2O 1）にOD660
が0.05になる様に接種、37℃で振とう培養し、OD660が
約0.5になった時点で遠心分離（4000rpm、10分間）し、
沈澱をC II培地（K2HPO4 14g、KH2PO4 6g、（NH4）2SO4
2g、クエン酸ナトリウム・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 5m
M、グルコース5g、カザミノ酸0.1g、Ｌ−トリプトファ
ン5ppm）で、２倍に希釈されるように懸濁した。さらに
37℃で振とう培養を続け、30分後に、連結反応を行なっ
たDNA溶液を加え、37℃で振とうを１時間行ない、テト
ラサイクリンを5ppm含むTBAB寒天培地に塗布した。
Bacto Beef Extract 3g、NaCl 5g、Bacto Agar 15g;H2O
1）で画線培養したバチルスSD30をCI培地（K2HPO4 1
4g、KH2PO4 6g、（NH4）2SO4 2g、クエン酸ナトリウム
・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 5mM、グリコース5g、カザミノ
酸0.2g、Ｌ−トリプトファン50ppm、H2O 1）にOD660
が0.05になる様に接種、37℃で振とう培養し、OD660が
約0.5になった時点で遠心分離（4000rpm、10分間）し、
沈澱をC II培地（K2HPO4 14g、KH2PO4 6g、（NH4）2SO4
2g、クエン酸ナトリウム・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 5m
M、グルコース5g、カザミノ酸0.1g、Ｌ−トリプトファ
ン5ppm）で、２倍に希釈されるように懸濁した。さらに
37℃で振とう培養を続け、30分後に、連結反応を行なっ
たDNA溶液を加え、37℃で振とうを１時間行ない、テト
ラサイクリンを5ppm含むTBAB寒天培地に塗布した。
37℃で１夜培養後に、テトラサイクリン耐性の形質転換
体が取得された。
体が取得された。
この様にして、相同的交叉によりプロモーターP756が
染色体上のトリプトファン合成系遺伝子のすぐ上流にイ
テングレーションされ、目的とするトリプトファン生産
株が得られた。この相同的交叉の結果を第２図に模式的
に示す。
染色体上のトリプトファン合成系遺伝子のすぐ上流にイ
テングレーションされ、目的とするトリプトファン生産
株が得られた。この相同的交叉の結果を第２図に模式的
に示す。
例3.（参考例） ファージSPO2由来のプロモーターとト
リプトファン合成系遺伝子を含有するプラスミドの調製
及びその宿主への導入（第３図） 第３図に示す出発プラスミドpSDB 136は、枯草菌ファ
ージSP02由来のプロモーター（P201）を含有する0.17MD
のEcoR Iフラグメントを含有し、その下流に制限酵素切
断点BamH I、Sal I及びPst Iを含み、さらにその下流に
バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）由来のクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子の構造遺伝子を含有する5MD
の大きさのプラスミドである。該プラスミドはpHL708
（Gene,16,199（1981））（Bacillus Genetic Stoch Ce
nter,オハイオ・ステート・ユニバーシティーから商業
的に入手することができる。）をEcoR IとBgl IIで消化
し、EcoR IとBamH Iで消化したpBR322と混合、T4 DNAリ
ガーゼで結合反応後、大腸菌c600に形質転換を行ない、
得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換体から調
製される。
リプトファン合成系遺伝子を含有するプラスミドの調製
及びその宿主への導入（第３図） 第３図に示す出発プラスミドpSDB 136は、枯草菌ファ
ージSP02由来のプロモーター（P201）を含有する0.17MD
のEcoR Iフラグメントを含有し、その下流に制限酵素切
断点BamH I、Sal I及びPst Iを含み、さらにその下流に
バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）由来のクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子の構造遺伝子を含有する5MD
の大きさのプラスミドである。該プラスミドはpHL708
（Gene,16,199（1981））（Bacillus Genetic Stoch Ce
nter,オハイオ・ステート・ユニバーシティーから商業
的に入手することができる。）をEcoR IとBgl IIで消化
し、EcoR IとBamH Iで消化したpBR322と混合、T4 DNAリ
ガーゼで結合反応後、大腸菌c600に形質転換を行ない、
得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換体から調
製される。
プラスミドpSDB 136を制限酵素BamH Iで消化し、次に
大腸菌DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントで処理し
た。他方、プラスミドpSDT 111を制限酵素EcoR Iで消化
し、次に大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメン
トで処理した。両DNA断片を混合した後、T4 DNAリガー
ゼにより連結し、この生成物を用いてトリプトファン要
求性大腸菌JA 221を形質転換した。得られたトリプトフ
ァン非要求性、アンピシリン耐性でかつクロラムフェニ
コール耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出、分析し
てSP02ファージ由来プロモーターとトリプトファン合成
系遺伝子を含むフラグメントが機能的に連結している大
きさ10MDの組替えプラスミドpSEY1213が得られた。
大腸菌DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントで処理し
た。他方、プラスミドpSDT 111を制限酵素EcoR Iで消化
し、次に大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメン
トで処理した。両DNA断片を混合した後、T4 DNAリガー
ゼにより連結し、この生成物を用いてトリプトファン要
求性大腸菌JA 221を形質転換した。得られたトリプトフ
ァン非要求性、アンピシリン耐性でかつクロラムフェニ
コール耐性の形質転換体よりプラスミドを抽出、分析し
てSP02ファージ由来プロモーターとトリプトファン合成
系遺伝子を含むフラグメントが機能的に連結している大
きさ10MDの組替えプラスミドpSEY1213が得られた。
このプラスミドpSEY1213を用い、実施例１に記載した
のと同様にしてバチルス・アミロリクエファシエンスの
トリプトファン生産株バチルスSD−30のコンピテントセ
ルを形質転換した。こうして、相同的交叉によりプロモ
ーターP201が染色体上のトリプトファン合成形遺伝子の
すぐ上流にインテグレーションされ、目的とするトリプ
トファン生産株が得られた。この相同的交叉の結果を第
３図に模式的に示す。
のと同様にしてバチルス・アミロリクエファシエンスの
トリプトファン生産株バチルスSD−30のコンピテントセ
ルを形質転換した。こうして、相同的交叉によりプロモ
ーターP201が染色体上のトリプトファン合成形遺伝子の
すぐ上流にインテグレーションされ、目的とするトリプ
トファン生産株が得られた。この相同的交叉の結果を第
３図に模式的に示す。
実施例4. トリフトファン合成系酵素類の発現 細菌染色体上のトリプトファン遺伝子近傍に、プロモ
ーター配列を挿入した菌株バチルスSD1034、及びバチル
スSD1035の生産する酵素トリプトファンシンセターゼお
よびアントラニール酸シンセターゼの量を両酵素の活性
測定により測った。
ーター配列を挿入した菌株バチルスSD1034、及びバチル
スSD1035の生産する酵素トリプトファンシンセターゼお
よびアントラニール酸シンセターゼの量を両酵素の活性
測定により測った。
プロモーターの導入されていない親株バチルスSD30、
並びにプロモーターが導入されている株バチルスSD103
4、及びバチルスSD1035をTBAB寒天培地（Difco社）で前
培養し、Spizizen最少培地100mlにOD（660nm）が約0.03
になるように接種し、37℃でOD（660nm）が約0.5になる
まで振とう培養した。5000rpm、15分間冷却遠心を行
い、沈澱をバッファーＩ（0.025M KH2PO4、0.075M K2HP
O4、pH7.3、0.01M L−グルタミン、10％グリセリン）で
洗浄遠心後、2mlのバッファーII（0.025M KH2PO4、0.07
5M K2HPO4、PH7.3、0.01ML−グルタミン、4mM MgCl2、4
0％グリセリン）に懸濁した。リゾチーム0.5mg、DNase5
μｇ添加し、37℃で30分間インキュベーションした。3
0,000rpmで、30分間遠心し上清を粗酵素液とした。
並びにプロモーターが導入されている株バチルスSD103
4、及びバチルスSD1035をTBAB寒天培地（Difco社）で前
培養し、Spizizen最少培地100mlにOD（660nm）が約0.03
になるように接種し、37℃でOD（660nm）が約0.5になる
まで振とう培養した。5000rpm、15分間冷却遠心を行
い、沈澱をバッファーＩ（0.025M KH2PO4、0.075M K2HP
O4、pH7.3、0.01M L−グルタミン、10％グリセリン）で
洗浄遠心後、2mlのバッファーII（0.025M KH2PO4、0.07
5M K2HPO4、PH7.3、0.01ML−グルタミン、4mM MgCl2、4
0％グリセリン）に懸濁した。リゾチーム0.5mg、DNase5
μｇ添加し、37℃で30分間インキュベーションした。3
0,000rpmで、30分間遠心し上清を粗酵素液とした。
Method in Engymolgy,５,794（1962）に従って行った
トリプトファンシンセターゼ活性測定の結果、およびGe
netics,52,1303（1965）に従って行ったアントラニール
酸シンセターゼ活性測定の結果を示す。
トリプトファンシンセターゼ活性測定の結果、およびGe
netics,52,1303（1965）に従って行ったアントラニール
酸シンセターゼ活性測定の結果を示す。
バチルスSD1034においては、P756プロモーター及びア
ントラニール酸シンセターゼ遺伝子を含有するトリプト
ファン合成系遺伝子の上流部分が宿主細菌の染色体上の
トリプトファン合成系遺伝子の近傍に導入されており、
この結果として染色体上に元から存在したトリプトファ
ン合成系の遺伝子の発現が強化されていると共に、追加
のアントラニール酸シンセターゼ遺伝子が導入されてい
る。このため、トリプトファンシンセターゼ活性が約2.
5倍に増強され、アントラニール酸シンセターゼ活性は
約3.0倍に増強された。他方、バチルスSD1035において
は、トリプトファン合成系遺伝子の２倍体が形成されて
おり、さらにその片方のトリプトファン合成系遺伝子近
傍にP201プロモーター配列DNAが導入されていることに
より、アントラニル酸シンセターゼ活性、及びトリプト
ファンシンセターゼ活性が３〜3.2倍増強された。
ントラニール酸シンセターゼ遺伝子を含有するトリプト
ファン合成系遺伝子の上流部分が宿主細菌の染色体上の
トリプトファン合成系遺伝子の近傍に導入されており、
この結果として染色体上に元から存在したトリプトファ
ン合成系の遺伝子の発現が強化されていると共に、追加
のアントラニール酸シンセターゼ遺伝子が導入されてい
る。このため、トリプトファンシンセターゼ活性が約2.
5倍に増強され、アントラニール酸シンセターゼ活性は
約3.0倍に増強された。他方、バチルスSD1035において
は、トリプトファン合成系遺伝子の２倍体が形成されて
おり、さらにその片方のトリプトファン合成系遺伝子近
傍にP201プロモーター配列DNAが導入されていることに
より、アントラニル酸シンセターゼ活性、及びトリプト
ファンシンセターゼ活性が３〜3.2倍増強された。
実施例5. Ｌ−トリプトファンの製造 グルコース５％、硫安0.2％、K2HPO4 1.4％、KH2PO4
0.6％、クエン酸ナトリウム・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 0.
02％、FeSO4・7H2O 1ppm、MnSO41ppmを含む培地（pH7.
0）2Lにアントラニル酸800ppmを添加し、これにプロモ
ーターの導入されていない親株バチルスSD30、並びにプ
ロモーターが導入された株バチルスSD1034、及びバチル
スSD1035を植菌し、35℃で5Lのジャーファメンターで通
気撹はん培養した。培養中、アントラニル酸濃度が50pp
m以下まで減少した時点でアントラニル酸濃度が約1000p
pmになるように適宜追加添加し、また培養途中グルコー
スを100g追加し、更にアンモニア水の添加により培地の
pHを7.0±0.4に保ちながら15時間培養した。培養液中に
蓄積されたＬ−トリプトファンの量を高速液体クロマト
グラフィーにより測定した結果を下に示す。
0.6％、クエン酸ナトリウム・2H2O 1g、MgSO4・7H2O 0.
02％、FeSO4・7H2O 1ppm、MnSO41ppmを含む培地（pH7.
0）2Lにアントラニル酸800ppmを添加し、これにプロモ
ーターの導入されていない親株バチルスSD30、並びにプ
ロモーターが導入された株バチルスSD1034、及びバチル
スSD1035を植菌し、35℃で5Lのジャーファメンターで通
気撹はん培養した。培養中、アントラニル酸濃度が50pp
m以下まで減少した時点でアントラニル酸濃度が約1000p
pmになるように適宜追加添加し、また培養途中グルコー
スを100g追加し、更にアンモニア水の添加により培地の
pHを7.0±0.4に保ちながら15時間培養した。培養液中に
蓄積されたＬ−トリプトファンの量を高速液体クロマト
グラフィーにより測定した結果を下に示す。
上の表から明らかな様に、本発明のプロモーターの導
入によって染色体上のトリプトファン合成系遺伝子の発
現が増強されたバチルスSD1034は親株SD30に比べて約２
倍のトリプトファンを蓄積した。他方、プロモーターの
ほかに追加のトリプトファン合成系遺伝子が導入された
バチルスSD1035は親株SD30に比べて約３倍のトリプトフ
ァンを蓄積した。
入によって染色体上のトリプトファン合成系遺伝子の発
現が増強されたバチルスSD1034は親株SD30に比べて約２
倍のトリプトファンを蓄積した。他方、プロモーターの
ほかに追加のトリプトファン合成系遺伝子が導入された
バチルスSD1035は親株SD30に比べて約３倍のトリプトフ
ァンを蓄積した。
実施例6. バチルスSD1034、及びバチルスSD1035に於いてプロモ
ーター配列DNAがトリプトファン遺伝子の近傍に導入さ
れていることは次の様なサザンハイブリダイゼイション
法により確認した。
ーター配列DNAがトリプトファン遺伝子の近傍に導入さ
れていることは次の様なサザンハイブリダイゼイション
法により確認した。
バチルスSD1034、及びバチルスSD1035をＬ培地300ml
で35℃、１夜振とう培養して、通常のDNA抽出法（Bioch
em.Biophys.Acta72,619,（1963））により染色体DNAを
抽出・精製し約1mgを得た。各DNA1μｇずつを制限酵素B
amH I、EcoR I、Xba Iで夫々完全に消化し、アガロース
電気泳動を行った。常法に従ってアルカル変性、中和
後、ニトロセルロースフィルターにDNAをトランスファ
ーした。フィルターを洗浄後、80℃で２時間熱処理し
た。
で35℃、１夜振とう培養して、通常のDNA抽出法（Bioch
em.Biophys.Acta72,619,（1963））により染色体DNAを
抽出・精製し約1mgを得た。各DNA1μｇずつを制限酵素B
amH I、EcoR I、Xba Iで夫々完全に消化し、アガロース
電気泳動を行った。常法に従ってアルカル変性、中和
後、ニトロセルロースフィルターにDNAをトランスファ
ーした。フィルターを洗浄後、80℃で２時間熱処理し
た。
プローブDNAとして別に精製したトリプトファン遺伝
子を含む5MDのEcoR IフラグメントとP756プロモーター
を含む0.3MDのHind IIIフラグメントとP201プロモータ
ーを含む0.18MDのEcoR Iフラグメントをニックタロンス
レーション法により〔γ−32P〕dCTPでラベルして比活
性40μCi/100ngのプローブDNAを作製した。
子を含む5MDのEcoR IフラグメントとP756プロモーター
を含む0.3MDのHind IIIフラグメントとP201プロモータ
ーを含む0.18MDのEcoR Iフラグメントをニックタロンス
レーション法により〔γ−32P〕dCTPでラベルして比活
性40μCi/100ngのプローブDNAを作製した。
前述のフィルターをプレイハイブリダイゼーション溶
液（６×SSC、５×デンハルト溶液中で42℃２時間イン
キュベーションの後40μCiのプローブDNAと50％ホルム
アミドを含むハイブリダイゼーション溶液（６×SSC、
２×デンハルト溶液中で42℃１夜インキュベーションし
た。次にフィルターを２回、37℃で15分間緩衝液（２×
SSC）中でインキュベーションし低塩濃度の緩衝液（0.1
×SSC）に移し、２回、37℃で５分間洗浄した。フィル
ターの水分を拭きとりコダックXAR5フィルムを用いて−
80℃で３時間オートラジオグラフィーを行った。
液（６×SSC、５×デンハルト溶液中で42℃２時間イン
キュベーションの後40μCiのプローブDNAと50％ホルム
アミドを含むハイブリダイゼーション溶液（６×SSC、
２×デンハルト溶液中で42℃１夜インキュベーションし
た。次にフィルターを２回、37℃で15分間緩衝液（２×
SSC）中でインキュベーションし低塩濃度の緩衝液（0.1
×SSC）に移し、２回、37℃で５分間洗浄した。フィル
ターの水分を拭きとりコダックXAR5フィルムを用いて−
80℃で３時間オートラジオグラフィーを行った。
その結果、バチルスSD1034の場合、BamH Iで消化した
7MDの大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグ
メントプローブでも、P756を含むフラグメントプローブ
でもシグナルが生じた。又、EcoR Iで消化した4.3MDの
大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグメント
プローブでもP756を含むフラグメントプローブでもシグ
ナルが生じ、更にXba Iで消化した。4.3MDの大きさ付近
にもトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプローブ
でもP756を含むフラグメントプローブでもシグナルが生
じた。従ってバチルスSD1034のトリプトファン遺伝子付
近の構造は第２図のようであり、プロモーター配列がト
リプトファン遺伝子の近傍に導入されていることが確認
された。
7MDの大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグ
メントプローブでも、P756を含むフラグメントプローブ
でもシグナルが生じた。又、EcoR Iで消化した4.3MDの
大きさ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグメント
プローブでもP756を含むフラグメントプローブでもシグ
ナルが生じ、更にXba Iで消化した。4.3MDの大きさ付近
にもトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプローブ
でもP756を含むフラグメントプローブでもシグナルが生
じた。従ってバチルスSD1034のトリプトファン遺伝子付
近の構造は第２図のようであり、プロモーター配列がト
リプトファン遺伝子の近傍に導入されていることが確認
された。
バチルスSD1035の場合、Xba Iで消化した10MDの大き
さ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプロ
ーブでもP201を含むフラグメントプローブでもシグナル
が生じ、相同的交叉の結果、第３図に示すように、プロ
モーター配列がトリプトファン遺伝子の近傍に導入され
ていることが確認された。
さ付近にトリプトファン遺伝子を含むフラグメントプロ
ーブでもP201を含むフラグメントプローブでもシグナル
が生じ、相同的交叉の結果、第３図に示すように、プロ
モーター配列がトリプトファン遺伝子の近傍に導入され
ていることが確認された。
本発明に従えば、プラスミドを用いた遺伝子増幅と異
なり、安定的に微生物の生産する特定の物質を多量に工
業的に生産することが可能となる。さらに遺伝子増幅に
於いては、目的の遺伝子が完全無傷でないとその目的を
達成することができないが、本発明では目的遺伝子の上
流部分と任意のプロモーターDNAさえあれば、簡単にそ
の目的が達成される。
なり、安定的に微生物の生産する特定の物質を多量に工
業的に生産することが可能となる。さらに遺伝子増幅に
於いては、目的の遺伝子が完全無傷でないとその目的を
達成することができないが、本発明では目的遺伝子の上
流部分と任意のプロモーターDNAさえあれば、簡単にそ
の目的が達成される。
第１図は、プロモーター配列DNAのクローニング方法を
示す。 第２図は、プロモーター配列DNAとトリプトファン遺伝
子上流部分の細菌への導入方法を示す。 第３図は、プロモーター配列下流へトリプトファン遺伝
子が組み込まれたDNAの調製法、及び細菌への導入方法
を示す。
示す。 第２図は、プロモーター配列DNAとトリプトファン遺伝
子上流部分の細菌への導入方法を示す。 第３図は、プロモーター配列下流へトリプトファン遺伝
子が組み込まれたDNAの調製法、及び細菌への導入方法
を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (8)
- 【請求項１】目的物質の生産に係わる遺伝子（目的遺伝
子）を含有する染色体を有する微生物の該染色体に、該
目的遺伝子のための発現制御配列が、該目的遺伝子の発
現を制御することができる位置及び方向で導入されてい
る改良された微生物であって、前記発現制御配列が、該
発現制御配列の一端又は両端に付加された前記目的遺伝
子のDNA配列の部分と相補的な配列による相同的交叉に
より導入されたものであることを特徴とする微生物。 - 【請求項２】前記微生物がバチルス（Bacillus）属微生
物である請求項１に記載の微生物。 - 【請求項３】前記微生物がバチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis）又はバチルス・アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amyloliquefaciens）である請求項２に
記載の微生物。 - 【請求項４】前記発現制御配列がプロモーターであり、
該プロモーターが前記遺伝子の上流に挿入されている、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。 - 【請求項５】該プロモーターがバチルス属微生物のプロ
モーター又は、バチルス属微生物のファージのプロモー
ターであり、該プロモーターが前記遺伝子の上流に挿入
されている、請求項４に記載の微生物。 - 【請求項６】前記遺伝子がトリプトファンの合成に係る
遺伝子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生
物。 - 【請求項７】目的物質の生産に係わる遺伝子（目的遺伝
子）を含有する染色体を有する微生物の該染色体に、該
目的遺伝子のための発現制御領域を、該目的遺伝子の発
現を増強することができる位置及び方向で導入すること
を特徴とする改良された微生物の製造方法において、前
記発現制御配列を、該発現制御配列の一端又は両端に付
加された前記目的遺伝子のDNA配列の部分と相補的な配
列による相同的交叉により導入することを特徴とする方
法。 - 【請求項８】特許請求の範囲第１項に記載の微生物を培
養して該遺伝子に係わる生成物を生産せしめ、そして該
生成物を採取することを特徴とする有用物質の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63038482A JP2708168B2 (ja) | 1988-02-23 | 1988-02-23 | 微生物の改良 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63038482A JP2708168B2 (ja) | 1988-02-23 | 1988-02-23 | 微生物の改良 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPS61268183A (ja) * | 1985-05-24 | 1986-11-27 | Wakamoto Pharmaceut Co Ltd | Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物 |
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-
1988
- 1988-02-23 JP JP63038482A patent/JP2708168B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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|---|---|
| JPH01215280A (ja) | 1989-08-29 |
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