JPH10229879A - 相同組換え体による蛋白質生産方法 - Google Patents
相同組換え体による蛋白質生産方法Info
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- JPH10229879A JPH10229879A JP9032100A JP3210097A JPH10229879A JP H10229879 A JPH10229879 A JP H10229879A JP 9032100 A JP9032100 A JP 9032100A JP 3210097 A JP3210097 A JP 3210097A JP H10229879 A JPH10229879 A JP H10229879A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛋白質生産能力の高い菌株の当該能力をその
まま利用して、異種蛋白質を高い生産率で生産するこ
と。 【解決手段】 好アルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白
質遺伝子のプロモーターの制御下に、当該蛋白質以外の
蛋白質をコードする領域を含むDNA配列を導入して相同
組換え用プラスミドを得、これを用いて元の好アルカリ
性バチルス属細菌を相同組換えせしめることにより形質
転換体を得、次いでこの形質転換体を培養して培養物か
ら蛋白質を採取する蛋白質生産方法。
まま利用して、異種蛋白質を高い生産率で生産するこ
と。 【解決手段】 好アルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白
質遺伝子のプロモーターの制御下に、当該蛋白質以外の
蛋白質をコードする領域を含むDNA配列を導入して相同
組換え用プラスミドを得、これを用いて元の好アルカリ
性バチルス属細菌を相同組換えせしめることにより形質
転換体を得、次いでこの形質転換体を培養して培養物か
ら蛋白質を採取する蛋白質生産方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、好アルカリ性バチ
ルス属細菌の高い蛋白質生産能力を利用し、その相同組
換え体により異種蛋白質を高生産する方法に関する。
ルス属細菌の高い蛋白質生産能力を利用し、その相同組
換え体により異種蛋白質を高生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
蛋白質生産能が高い大腸菌（ＥＫ系）、枯草菌（ＢＭ
系）等を宿主とし、その菌体内に有用蛋白質をコードす
る外来遺伝子を組み込んで、その異種蛋白質を高生産さ
せることが行われている。
蛋白質生産能が高い大腸菌（ＥＫ系）、枯草菌（ＢＭ
系）等を宿主とし、その菌体内に有用蛋白質をコードす
る外来遺伝子を組み込んで、その異種蛋白質を高生産さ
せることが行われている。
【０００３】しかし、大腸菌（ＥＫ系）や枯草菌（ＢＭ
系）などの宿主−ベクター系では、外来遺伝子を組み込
んだプラスミドの宿主内での安定性に乏しく、また安定
化されても、その機構は宿主、ベクター、組み込まれる
外来遺伝子によって様々な工夫が必要であった。特に枯
草菌を宿主とした場合、プラスミドの保持、外来遺伝子
の発現に難点があった。
系）などの宿主−ベクター系では、外来遺伝子を組み込
んだプラスミドの宿主内での安定性に乏しく、また安定
化されても、その機構は宿主、ベクター、組み込まれる
外来遺伝子によって様々な工夫が必要であった。特に枯
草菌を宿主とした場合、プラスミドの保持、外来遺伝子
の発現に難点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは蛋白質生産能力の高い菌株の当該生産能力を
そのまま利用して、異種の蛋白質を高生産させる系を開
発すべく鋭意研究を重ねた結果、好アルカリ性バチルス
属細菌の分泌蛋白質遺伝子のプロモーターが、異種蛋白
質発現のための相同組換え用プラスミドのプロモーター
として有用であり、この相同組換え用プラスミドを用い
て元の好アルカリ性バチルス属細菌を相同組換えして得
られる形質転換体により、異種蛋白質が高い生産率で生
産されることを見出し、本発明を完成した。
発明者らは蛋白質生産能力の高い菌株の当該生産能力を
そのまま利用して、異種の蛋白質を高生産させる系を開
発すべく鋭意研究を重ねた結果、好アルカリ性バチルス
属細菌の分泌蛋白質遺伝子のプロモーターが、異種蛋白
質発現のための相同組換え用プラスミドのプロモーター
として有用であり、この相同組換え用プラスミドを用い
て元の好アルカリ性バチルス属細菌を相同組換えして得
られる形質転換体により、異種蛋白質が高い生産率で生
産されることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】すなわち本発明は、好アルカリ性バチルス
属細菌の分泌蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下に、
当該蛋白質以外の蛋白質をコードする領域を含むDNA配
列を導入して相同組換え用プラスミドを得、これを用い
て元の好アルカリ性バチルス属細菌を相同組換えせしめ
ることにより形質転換体を得、次いでこの形質転換体を
培養して培養物から蛋白質を採取することを特徴とする
蛋白質生産方法を提供するものである。
属細菌の分泌蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下に、
当該蛋白質以外の蛋白質をコードする領域を含むDNA配
列を導入して相同組換え用プラスミドを得、これを用い
て元の好アルカリ性バチルス属細菌を相同組換えせしめ
ることにより形質転換体を得、次いでこの形質転換体を
培養して培養物から蛋白質を採取することを特徴とする
蛋白質生産方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明方法に用いる好アルカリ性
バチルス属細菌としては、蛋白質を分泌し、その生産能
に優れるものであれば特に限定されないが、例えば酵素
を分泌する好アルカリ性バチルス属細菌、特にアルカリ
セルラーゼ生産菌であるバチルス・エスピー(Bacillus
sp.)KSN-635 株（FERM BP-1485）又はその変異株が好適
なものとして挙げられる。
バチルス属細菌としては、蛋白質を分泌し、その生産能
に優れるものであれば特に限定されないが、例えば酵素
を分泌する好アルカリ性バチルス属細菌、特にアルカリ
セルラーゼ生産菌であるバチルス・エスピー(Bacillus
sp.)KSN-635 株（FERM BP-1485）又はその変異株が好適
なものとして挙げられる。
【０００７】かかる好アルカリ性バチルス属細菌の分泌
蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下に導入するDNA配
列において、当該DNA配列が含む領域がコードする、上
記宿主菌の分泌蛋白質以外の蛋白質（以下、「異種蛋白
質」という）としては、特に限定されるものでないが、
例えばセルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
ゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ
等の酵素が挙げられ、特に、有用ではあるが生産性が低
いものが本発明の適用の対象として好適である。例え
ば、バチルス・エスピー KSM-AP1378株（FERM BP-3048)
の生産する液化型アルカリアミラーゼが好適な例として
挙げられる。
蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下に導入するDNA配
列において、当該DNA配列が含む領域がコードする、上
記宿主菌の分泌蛋白質以外の蛋白質（以下、「異種蛋白
質」という）としては、特に限定されるものでないが、
例えばセルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
ゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ
等の酵素が挙げられ、特に、有用ではあるが生産性が低
いものが本発明の適用の対象として好適である。例え
ば、バチルス・エスピー KSM-AP1378株（FERM BP-3048)
の生産する液化型アルカリアミラーゼが好適な例として
挙げられる。
【０００８】相同組換え用プラスミドの構築は、例えば
好アルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現
制御領域（又は発現制御領域及び分泌制御領域）の下流
領域と、異種蛋白質をコードする遺伝子を置換すること
により行われる。ここで、相同組換え体が異種蛋白質を
分泌するためには、相同組換え用プラスミドがシグナル
配列を有していなければならないが、異種蛋白質の分泌
に利用するシグナル配列としては、宿主の分泌蛋白質自
身のシグナル配列、及び異種蛋白質のシグナル配列のい
ずれでもよい。前者の場合には、シグナル配列を有さな
い異種蛋白質をコードする領域を含むDNA配列を、好ア
ルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現制御
領域及び分泌制御領域の下流に導入することにより、ま
た後者の場合には、シグナル配列を有する異種蛋白質を
コードする領域を含むDNA配列を、好アルカリ性バチル
ス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現制御領域の下流に導
入することにより、相同組換え用プラスミドを構築する
ことができる。
好アルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現
制御領域（又は発現制御領域及び分泌制御領域）の下流
領域と、異種蛋白質をコードする遺伝子を置換すること
により行われる。ここで、相同組換え体が異種蛋白質を
分泌するためには、相同組換え用プラスミドがシグナル
配列を有していなければならないが、異種蛋白質の分泌
に利用するシグナル配列としては、宿主の分泌蛋白質自
身のシグナル配列、及び異種蛋白質のシグナル配列のい
ずれでもよい。前者の場合には、シグナル配列を有さな
い異種蛋白質をコードする領域を含むDNA配列を、好ア
ルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現制御
領域及び分泌制御領域の下流に導入することにより、ま
た後者の場合には、シグナル配列を有する異種蛋白質を
コードする領域を含むDNA配列を、好アルカリ性バチル
ス属細菌の分泌蛋白質遺伝子の発現制御領域の下流に導
入することにより、相同組換え用プラスミドを構築する
ことができる。
【０００９】上記のようにして得られた相同組換え用プ
ラスミドを用いて好アルカリ性バチルス属細菌を形質転
換させる方法としては、コンピテントセル法、プロトプ
ラスト法、エレクトロポレーション法等の従来公知の方
法が用いられるが、特に特開平8-107784号公報に記載さ
れている、改良されたプロトプラスト法が好アルカリ性
バチルス属細菌の形質転換に適しており、好ましい。
ラスミドを用いて好アルカリ性バチルス属細菌を形質転
換させる方法としては、コンピテントセル法、プロトプ
ラスト法、エレクトロポレーション法等の従来公知の方
法が用いられるが、特に特開平8-107784号公報に記載さ
れている、改良されたプロトプラスト法が好アルカリ性
バチルス属細菌の形質転換に適しており、好ましい。
【００１０】相同組換えにより得られた、異種蛋白質の
生産に用いる形質転換体としては、宿主菌の分泌蛋白質
及び異種蛋白質の両方を生産するものであってもよい
が、宿主菌の分泌蛋白質を生産せずかつ異種蛋白質を生
産するものが異種蛋白質の生産能が高く、また異種蛋白
質の単離を考慮すると好ましい。かかる宿主菌の分泌蛋
白質を生産せずかつ異種蛋白質を生産する形質転換体を
得る方法としては、(1)宿主菌を、線状化した相同組換
え用プラスミドを用いて、２カ所の相同領域で染色体内
相同組換えさせる１段階の相同組換えによる方法、(2)
宿主菌を、環状の相同組換え用プラスミドを用いて、１
カ所の相同領域で相同組換えさせて宿主菌の分泌蛋白質
及び異種蛋白質の両方を生産する形質転換体を得た後、
これを培養して、２段階目の相同組換えにより宿主菌の
分泌蛋白質遺伝子を含む部分が欠失して当該蛋白質の生
産能力を失なった菌株を選抜する２段階の相同組換えに
よる方法が挙げられる（図９）。
生産に用いる形質転換体としては、宿主菌の分泌蛋白質
及び異種蛋白質の両方を生産するものであってもよい
が、宿主菌の分泌蛋白質を生産せずかつ異種蛋白質を生
産するものが異種蛋白質の生産能が高く、また異種蛋白
質の単離を考慮すると好ましい。かかる宿主菌の分泌蛋
白質を生産せずかつ異種蛋白質を生産する形質転換体を
得る方法としては、(1)宿主菌を、線状化した相同組換
え用プラスミドを用いて、２カ所の相同領域で染色体内
相同組換えさせる１段階の相同組換えによる方法、(2)
宿主菌を、環状の相同組換え用プラスミドを用いて、１
カ所の相同領域で相同組換えさせて宿主菌の分泌蛋白質
及び異種蛋白質の両方を生産する形質転換体を得た後、
これを培養して、２段階目の相同組換えにより宿主菌の
分泌蛋白質遺伝子を含む部分が欠失して当該蛋白質の生
産能力を失なった菌株を選抜する２段階の相同組換えに
よる方法が挙げられる（図９）。
【００１１】得られた形質転換体を用いて異種蛋白質を
製造するには、常法に従い該形質転換体を培養し、培養
物から異種蛋白質を採取すればよい。ここで、形質転換
体の培養操作は宿主として用いた好アルカリ性バチルス
属細菌が増殖し、異種蛋白質が生産される条件であれば
特に制限されないが、例えば炭素源、窒素源及び塩類を
含む培地中で培養すればよい。また、培養物からの異種
蛋白質の分離精製は、目的とする異種蛋白質の性質に応
じて行えばよい。
製造するには、常法に従い該形質転換体を培養し、培養
物から異種蛋白質を採取すればよい。ここで、形質転換
体の培養操作は宿主として用いた好アルカリ性バチルス
属細菌が増殖し、異種蛋白質が生産される条件であれば
特に制限されないが、例えば炭素源、窒素源及び塩類を
含む培地中で培養すればよい。また、培養物からの異種
蛋白質の分離精製は、目的とする異種蛋白質の性質に応
じて行えばよい。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて更に詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】なお、実施例において採用した下記項目の
材料又は方法について、以下に説明する。 １．使用菌株、使用プラスミド及び使用プライマー ２．使用培地 ３．形質転換 ４．相同組換え体におけるアルカリアミラーゼ遺伝子発
現安定性の検定 ５．アルカリセルラーゼ・液化型アルカリα−アミラー
ゼ生産菌からのアルカリセルラーゼ非生産・液化型アル
カリα−アミラーゼ生産菌の選抜 ６．電気泳動 ７．DNAの調製 ８．サザンハイブリダイゼーション ９．複製連鎖反応（PCR） １０．酵素活性測定
材料又は方法について、以下に説明する。 １．使用菌株、使用プラスミド及び使用プライマー ２．使用培地 ３．形質転換 ４．相同組換え体におけるアルカリアミラーゼ遺伝子発
現安定性の検定 ５．アルカリセルラーゼ・液化型アルカリα−アミラー
ゼ生産菌からのアルカリセルラーゼ非生産・液化型アル
カリα−アミラーゼ生産菌の選抜 ６．電気泳動 ７．DNAの調製 ８．サザンハイブリダイゼーション ９．複製連鎖反応（PCR） １０．酵素活性測定
【００１４】１．使用菌株、使用プラスミド及び使用プ
ライマー 使用した菌株について表１に、使用したプラスミドにつ
いて表２に、使用したプライマーについて表３に示し
た。
ライマー 使用した菌株について表１に、使用したプラスミドにつ
いて表２に、使用したプライマーについて表３に示し
た。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】
【表３】
【００１８】２．使用培地 （１）大腸菌並びにKSM-635株及びその形質転換体の培
養には、特に記述のない限りLB培地を用い、固体培養は
1.5％寒天を含む培地を用いて行った。ただし、KSM-635
株及びその形質転換体の培養には、0.3％になるようにN
a2CO3を添加したアルカリLB培地を用いた。
養には、特に記述のない限りLB培地を用い、固体培養は
1.5％寒天を含む培地を用いて行った。ただし、KSM-635
株及びその形質転換体の培養には、0.3％になるようにN
a2CO3を添加したアルカリLB培地を用いた。
【００１９】（２）KSM-635株及びその形質転換体が生
産するアルカリセルラーゼの活性を検出するためには、
表４に示すキシロースハロープレートを用いるか、アル
カリLBプレートで１晩培養後、カルボキシメチルセルロ
ース（CMC）軟寒天（0.5％ CMC, 1.0％ NaCl, 1.0％ 寒
天, 50mM グリシン緩衝液(pH9.0)）を重層し、37℃で１
時間インキュベートしコンゴーレッド染色した（Teathe
r and Wood 1982. Appl.Environ. Microbiol. 43:777-7
80）。
産するアルカリセルラーゼの活性を検出するためには、
表４に示すキシロースハロープレートを用いるか、アル
カリLBプレートで１晩培養後、カルボキシメチルセルロ
ース（CMC）軟寒天（0.5％ CMC, 1.0％ NaCl, 1.0％ 寒
天, 50mM グリシン緩衝液(pH9.0)）を重層し、37℃で１
時間インキュベートしコンゴーレッド染色した（Teathe
r and Wood 1982. Appl.Environ. Microbiol. 43:777-7
80）。
【００２０】
【表４】
【００２１】（３）大腸菌形質転換体及びKSM-635株形
質転換体のアミラーゼ活性を検出するためには、それぞ
れ表５に示すスターチアズレプレート及びこれに0.3％
Na2CO3を添加したアルカリスターチアズレプレートを用
いた。
質転換体のアミラーゼ活性を検出するためには、それぞ
れ表５に示すスターチアズレプレート及びこれに0.3％
Na2CO3を添加したアルカリスターチアズレプレートを用
いた。
【００２２】
【表５】
【００２３】（４）KSM-635株及び形質転換体の培養実
験には表６に示すMYG broth（Ozaki etal. 1990. J. Ge
n. Microbiol. 136:1327-1334）を用いた。
験には表６に示すMYG broth（Ozaki etal. 1990. J. Ge
n. Microbiol. 136:1327-1334）を用いた。
【００２４】
【表６】
【００２５】３．形質転換 大腸菌JM109の形質転換は、コンピテントセル法により
行った。KSM-635株の形質転換は、秦田ら、特開平8-107
784号公報に記載されているプロトプラスト法に従って
行い、50μg/mlのカナマイシンを含む再生培地で再生し
たコロニーを、アルカリスターチアズレプレートで培養
し、形質転換体の確認を行った。
行った。KSM-635株の形質転換は、秦田ら、特開平8-107
784号公報に記載されているプロトプラスト法に従って
行い、50μg/mlのカナマイシンを含む再生培地で再生し
たコロニーを、アルカリスターチアズレプレートで培養
し、形質転換体の確認を行った。
【００２６】４．相同組換え体におけるアルカリアミラ
ーゼ遺伝子発現安定性の検定 150μg/mlカナマイシンを含むアルカリLBプレートで単
離した菌を、様々な濃度のカナマイシンを含むアルカリ
LB培地で１晩振とう培養し、同じ濃度のカナマイシンを
含むアルカリスターチアズレプレートで培養した。全コ
ロニーのうち、ハローを形成するコロニーの割合をアル
カリアミラーゼ遺伝子発現の安定性とした。
ーゼ遺伝子発現安定性の検定 150μg/mlカナマイシンを含むアルカリLBプレートで単
離した菌を、様々な濃度のカナマイシンを含むアルカリ
LB培地で１晩振とう培養し、同じ濃度のカナマイシンを
含むアルカリスターチアズレプレートで培養した。全コ
ロニーのうち、ハローを形成するコロニーの割合をアル
カリアミラーゼ遺伝子発現の安定性とした。
【００２７】５．アルカリセルラーゼ・液化型アルカリ
α−アミラーゼ生産菌からのアルカリセルラーゼ非生産
・液化型アルカリα−アミラーゼ生産菌の選抜 セルラーゼ・アミラーゼ生産株を、キシロースハロープ
レートで37℃、１日間振とう培養し、培養液をアルカリ
スターチアズレプレートへ塗布して30℃、２日間培養し
た。単集落をキシロースハロープレートで30℃、２〜３
日間培養し、ハローを形成しない株を選抜した。
α−アミラーゼ生産菌からのアルカリセルラーゼ非生産
・液化型アルカリα−アミラーゼ生産菌の選抜 セルラーゼ・アミラーゼ生産株を、キシロースハロープ
レートで37℃、１日間振とう培養し、培養液をアルカリ
スターチアズレプレートへ塗布して30℃、２日間培養し
た。単集落をキシロースハロープレートで30℃、２〜３
日間培養し、ハローを形成しない株を選抜した。
【００２８】６．電気泳動 DNAの電気泳動は、Mupidを用いてアガロースゲルにより
50V又は100Vで行い、電気泳動後のゲルはエチジウムブ
ロマイドで染色し、UV照射によりDNAを検出した。
50V又は100Vで行い、電気泳動後のゲルはエチジウムブ
ロマイドで染色し、UV照射によりDNAを検出した。
【００２９】蛋白質のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）は、定法に従って行い、SDS-PAGEではクマーシ
ーブリリアントブルー（CBB）染色し、Native-PAGE で
は活性染色後CBB染色した。
（PAGE）は、定法に従って行い、SDS-PAGEではクマーシ
ーブリリアントブルー（CBB）染色し、Native-PAGE で
は活性染色後CBB染色した。
【００３０】アルカリセルラーゼの活性染色は、電気泳
動後のゲルをCMCプレート（1.0％ NaCl, 0.5％ CMC, 50
mM グリシン緩衝液(pH9.0), 1.0％ 寒天）上に置き、37
℃で保温後、ゲルを除き、0.1％コンゴーレッド溶液を
注いだ（Teather and Wood 1982. Appl. Environ. Micr
obiol. 43:777-780）。30分後、コンゴーレッド溶液を
除き、１M NaClで脱色した。
動後のゲルをCMCプレート（1.0％ NaCl, 0.5％ CMC, 50
mM グリシン緩衝液(pH9.0), 1.0％ 寒天）上に置き、37
℃で保温後、ゲルを除き、0.1％コンゴーレッド溶液を
注いだ（Teather and Wood 1982. Appl. Environ. Micr
obiol. 43:777-780）。30分後、コンゴーレッド溶液を
除き、１M NaClで脱色した。
【００３１】７．DNAの調製 少量のプラスミドの調製は、アルカリ抽出法又はWizard
Minipreps（Promega社製）を用いて行った。大量のプ
ラスミドの調製は、Qiagen Plasmid Kit（QIAGEN社製）
を用いて行った。Bacillusからのプラスミド調製の場合
には、いずれの方法においても、最初の段階で用いるSo
lution Iの代わりにSolution Iリゾチーム（最終濃度２
mg/ml）を加えた溶液を用い、37℃で30分間保温の操作
を加えた。
Minipreps（Promega社製）を用いて行った。大量のプ
ラスミドの調製は、Qiagen Plasmid Kit（QIAGEN社製）
を用いて行った。Bacillusからのプラスミド調製の場合
には、いずれの方法においても、最初の段階で用いるSo
lution Iの代わりにSolution Iリゾチーム（最終濃度２
mg/ml）を加えた溶液を用い、37℃で30分間保温の操作
を加えた。
【００３２】KSM-635株及び形質転換体の染色体の調製
は、基本的に文献（Saito and Miura1963. Biophys. Ac
ta. 72:619-629）に従って行った。まず約30mlの培養液
から遠心分離で集菌した菌体を0.5mlリゾチーム溶液
（0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH8.0, 0.2mg/mlリゾチー
ム）に懸濁し、溶菌後凍結した。4.5mlの１％ SDS, 0.1
M NaCl, 0.1M トリス−塩酸緩衝液（pH9.0）で溶解し、
フェノール：クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させ
た。沈殿をパスツールピペットで巻き取り、70％エタノ
ールでリンスして乾燥させた。滅菌水で溶解後RNase処
理し、再びフェノール：クロロホルム抽出、エタノール
沈殿を行った。
は、基本的に文献（Saito and Miura1963. Biophys. Ac
ta. 72:619-629）に従って行った。まず約30mlの培養液
から遠心分離で集菌した菌体を0.5mlリゾチーム溶液
（0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH8.0, 0.2mg/mlリゾチー
ム）に懸濁し、溶菌後凍結した。4.5mlの１％ SDS, 0.1
M NaCl, 0.1M トリス−塩酸緩衝液（pH9.0）で溶解し、
フェノール：クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させ
た。沈殿をパスツールピペットで巻き取り、70％エタノ
ールでリンスして乾燥させた。滅菌水で溶解後RNase処
理し、再びフェノール：クロロホルム抽出、エタノール
沈殿を行った。
【００３３】アガロースゲルから目的のDNA断片を精製
するためには、電気泳動後のアガロースゲルから目的の
長さのバンドを切り出し、GENECLEAN II Kit（BIO101）
を用いてDNA断片を回収した。
するためには、電気泳動後のアガロースゲルから目的の
長さのバンドを切り出し、GENECLEAN II Kit（BIO101）
を用いてDNA断片を回収した。
【００３４】８．サザンハイブリダイゼーション それぞれの染色体をHindIIIで切断し、0.7％アガロース
ゲルで電気泳動した。プローブとしては、相同組換えベ
クターpBLHA2 の3'側相同領域2.5kb（KSM-635株のアル
カリセルラーゼ遺伝子の2.5kb DraI 断片を含む）、及
びpBLHA2のアミラーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子
を含む2.6kb PCR 産物を用いた。Hybond-N+にエレクト
ロブロッティング後、UV処理し、DIG DNA LABELLING AN
D DETEC TION KIT（BOEHRINGER MANNHEIM社製）を用い
て製品のプロトコールに従ってハイブリダイゼーション
及び検出を行った。
ゲルで電気泳動した。プローブとしては、相同組換えベ
クターpBLHA2 の3'側相同領域2.5kb（KSM-635株のアル
カリセルラーゼ遺伝子の2.5kb DraI 断片を含む）、及
びpBLHA2のアミラーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子
を含む2.6kb PCR 産物を用いた。Hybond-N+にエレクト
ロブロッティング後、UV処理し、DIG DNA LABELLING AN
D DETEC TION KIT（BOEHRINGER MANNHEIM社製）を用い
て製品のプロトコールに従ってハイブリダイゼーション
及び検出を行った。
【００３５】９．複製連鎖反応（PCR） 必要なプライマーは、GENE Assembler Plus（Amersham
社製）を用いてマニュアルに従い合成し、NAP-10カラム
（Pharmacia Biotech社製）を用いて精製した。PCRはVe
nt DNA Polymerase（Bio Labs社製）による反応を、PRO
GRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700（ASTEC社製）又はGe
neAmp PCR System 2400（PERKIN ELMER社製）を用いて
行った。94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分を基本
にして必要に応じて変更を加え、PCRを35サイクル行っ
た。
社製）を用いてマニュアルに従い合成し、NAP-10カラム
（Pharmacia Biotech社製）を用いて精製した。PCRはVe
nt DNA Polymerase（Bio Labs社製）による反応を、PRO
GRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700（ASTEC社製）又はGe
neAmp PCR System 2400（PERKIN ELMER社製）を用いて
行った。94℃で１分、55℃で１分及び72℃で２分を基本
にして必要に応じて変更を加え、PCRを35サイクル行っ
た。
【００３６】PCR産物をサブクローニングするためには
以下の処理を行った。50μg/mlとなる様にPCR産物にプ
ロテイナーゼＫを加えて37℃で１時間保温し、フェノー
ル：クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、沈殿を滅菌
水に溶解しフィルター付遠心チューブSUPREC-02（宝酒
造株式会社製）を用いてDNAを回収した。
以下の処理を行った。50μg/mlとなる様にPCR産物にプ
ロテイナーゼＫを加えて37℃で１時間保温し、フェノー
ル：クロロホルム抽出、エタノール沈殿し、沈殿を滅菌
水に溶解しフィルター付遠心チューブSUPREC-02（宝酒
造株式会社製）を用いてDNAを回収した。
【００３７】10．酵素活性測定 500ml坂口フラスコを用い、40ml MYG brothで125rpm、3
0℃の条件で各菌株を振とう培養した。培養液から遠心
分離により細胞を除き、上清を活性測定に用いた。
0℃の条件で各菌株を振とう培養した。培養液から遠心
分離により細胞を除き、上清を活性測定に用いた。
【００３８】セルラーゼ及びアミラーゼの活性測定は、
ジニトロサリチル酸法（DNS法）（Miller et al. 1960.
Anal. Biochem. 2:127-132）に従って行った。
ジニトロサリチル酸法（DNS法）（Miller et al. 1960.
Anal. Biochem. 2:127-132）に従って行った。
【００３９】セルラーゼ活性測定における基質溶液とし
ては、2.5％ CMC、緩衝液（1.0M グリシン/NaOH, pH9.
0）及びイオン交換水の4:1:4混合液を用いた。
ては、2.5％ CMC、緩衝液（1.0M グリシン/NaOH, pH9.
0）及びイオン交換水の4:1:4混合液を用いた。
【００４０】アミラーゼ活性測定における基質溶液とし
ては、１％可溶性デンプン及び緩衝液（0.1M グリシン/
0.1M NaCl/NaOH, pH8.5）の5:4混合液を用いた。
ては、１％可溶性デンプン及び緩衝液（0.1M グリシン/
0.1M NaCl/NaOH, pH8.5）の5:4混合液を用いた。
【００４１】実施例１ １．液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子導入のための
相同組換え用プラスミドの構築Bacillus sp. KSM-635株染色体上のアルカリセルラーゼ
遺伝子の発現制御領域（及び分泌制御領域）の下流領域
と、Bacillus sp. KSM-AP1378株（FERM BP-3048）の液
化型アルカリα−アミラーゼ（荒ら、WO94/26881）をコ
ードする遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子とを置換す
るための相同組換え用プラスミドを構築した。
相同組換え用プラスミドの構築Bacillus sp. KSM-635株染色体上のアルカリセルラーゼ
遺伝子の発現制御領域（及び分泌制御領域）の下流領域
と、Bacillus sp. KSM-AP1378株（FERM BP-3048）の液
化型アルカリα−アミラーゼ（荒ら、WO94/26881）をコ
ードする遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子とを置換す
るための相同組換え用プラスミドを構築した。
【００４２】１−１．Bacillus sp. KSM-635株のアルカ
リセルラーゼ遺伝子由来の断片のサブクローニング 本アルカリセルラーゼ遺伝子の発現制御領域を有する5'
側相同領域をサブクローニングするため、アルカリセル
ラーゼ遺伝子を有するpBC100（表２）を鋳型とし、CMCD
EL1とCMCDEL3（表３）をプライマーとしてPCRを行っ
た。PCR産物からDNAを回収し、BalIとHindIIIにより切
断した。1.6kbの断片を精製し、pBLUESCRIPTII SK+（表
２）のHincII、HindIII間に挿入してプラスミドを構築
し、これをpBLΔ3'とした（図１）。
リセルラーゼ遺伝子由来の断片のサブクローニング 本アルカリセルラーゼ遺伝子の発現制御領域を有する5'
側相同領域をサブクローニングするため、アルカリセル
ラーゼ遺伝子を有するpBC100（表２）を鋳型とし、CMCD
EL1とCMCDEL3（表３）をプライマーとしてPCRを行っ
た。PCR産物からDNAを回収し、BalIとHindIIIにより切
断した。1.6kbの断片を精製し、pBLUESCRIPTII SK+（表
２）のHincII、HindIII間に挿入してプラスミドを構築
し、これをpBLΔ3'とした（図１）。
【００４３】本アルカリセルラーゼ遺伝子の発現制御領
域及び分泌制御領域を有する5'側相同領域をサブクロー
ニングするため、表２に示すpBC100を鋳型とし、CMCDEL
1とCMCDEL4（表３）をプライマーとしてPCRを行った。P
CR産物からDNAを回収し、BalIとNheIにより切断した。
1.7kbの断片を精製し、pBR322のBalI、NheI間に挿入し
てプラスミドを構築し、これをpBRSΔ3'とした（図
１）。
域及び分泌制御領域を有する5'側相同領域をサブクロー
ニングするため、表２に示すpBC100を鋳型とし、CMCDEL
1とCMCDEL4（表３）をプライマーとしてPCRを行った。P
CR産物からDNAを回収し、BalIとNheIにより切断した。
1.7kbの断片を精製し、pBR322のBalI、NheI間に挿入し
てプラスミドを構築し、これをpBRSΔ3'とした（図
１）。
【００４４】本アルカリセルラーゼ遺伝子のオープンリ
ーディングフレーム（ORF）の3'側の部分を有する3'側
相同領域をサブクローニングするため、pBC100（表２）
をDraIで切断し、2.5kbの断片を精製し、pUC18のHincII
部位に挿入してプラスミドを構築し、これをpUCΔ5'と
した（図１）。
ーディングフレーム（ORF）の3'側の部分を有する3'側
相同領域をサブクローニングするため、pBC100（表２）
をDraIで切断し、2.5kbの断片を精製し、pUC18のHincII
部位に挿入してプラスミドを構築し、これをpUCΔ5'と
した（図１）。
【００４５】１−２．Bacillus sp. KSM-AP1378株の液
化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子由来の断片のサブク
ローニング 本液化型アルカリα−アミラーゼをコードする領域をサ
ブクローニングするため、本酵素の遺伝子を有するプラ
スミドpUCAMYL2（表２）を鋳型とし、AMYK1とAMYK2（表
３）をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物からDNA
を回収し、HindIIIとEcoRIにより切断した。1.6kbの断
片を精製し、pBLUESCRIPT II SK+（表２）のHindIII、E
coRI間に挿入してプラスミドを構築し、これをpBLAMYと
した（図２）。
化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子由来の断片のサブク
ローニング 本液化型アルカリα−アミラーゼをコードする領域をサ
ブクローニングするため、本酵素の遺伝子を有するプラ
スミドpUCAMYL2（表２）を鋳型とし、AMYK1とAMYK2（表
３）をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物からDNA
を回収し、HindIIIとEcoRIにより切断した。1.6kbの断
片を精製し、pBLUESCRIPT II SK+（表２）のHindIII、E
coRI間に挿入してプラスミドを構築し、これをpBLAMYと
した（図２）。
【００４６】本液化型アルカリα−アミラーゼのシグナ
ル配列よりＣ末端側をコードする領域をサブクローニン
グするため、pUCAMYL2（表２）を鋳型とし、AMYK2とAMY
K3（表３）をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物か
らDNAを回収し、NheIとEcoRIにより切断した。1.5kbの
断片を精製し、pBR322のNheI、EcoRI間に挿入してプラ
スミドを構築し、これをpBRAMYΔS とした（図２）。
ル配列よりＣ末端側をコードする領域をサブクローニン
グするため、pUCAMYL2（表２）を鋳型とし、AMYK2とAMY
K3（表３）をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物か
らDNAを回収し、NheIとEcoRIにより切断した。1.5kbの
断片を精製し、pBR322のNheI、EcoRI間に挿入してプラ
スミドを構築し、これをpBRAMYΔS とした（図２）。
【００４７】１−３．pUB110のカナマイシン耐性遺伝子
のサブクローニング 本カナマイシン耐性遺伝子をサブクローニングするた
め、pUB110（表２）を鋳型とし、KANR3とKANR4（表３）
をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物からDNAを回
収し、EcoRIとPstIにより切断した。0.9kbの断片を精製
し、pBLUESCRIPT II SK+（表２）のEcoRI、PstI間に挿
入してプラスミドを構築し、これをpBLKANとした（図
３）。
のサブクローニング 本カナマイシン耐性遺伝子をサブクローニングするた
め、pUB110（表２）を鋳型とし、KANR3とKANR4（表３）
をプライマーとしてPCRを行った。PCR産物からDNAを回
収し、EcoRIとPstIにより切断した。0.9kbの断片を精製
し、pBLUESCRIPT II SK+（表２）のEcoRI、PstI間に挿
入してプラスミドを構築し、これをpBLKANとした（図
３）。
【００４８】１−４．相同組換え用プラスミドの構築 １−１〜１−３でサブクローニングして得られた各断片
を以下に示すように連結し、液化型アルカリα−アミラ
ーゼの分泌に利用するシグナル配列として、液化型アル
カリα−アミラーゼ自身のシグナル配列を利用する相同
組換え用プラスミド（pBLHA1）、及び、KSM-635株のア
ルカリセルラーゼ由来シグナル配列を利用する相同組換
え用プラスミド（pBLHA2）を構築した（図４）。
を以下に示すように連結し、液化型アルカリα−アミラ
ーゼの分泌に利用するシグナル配列として、液化型アル
カリα−アミラーゼ自身のシグナル配列を利用する相同
組換え用プラスミド（pBLHA1）、及び、KSM-635株のア
ルカリセルラーゼ由来シグナル配列を利用する相同組換
え用プラスミド（pBLHA2）を構築した（図４）。
【００４９】１−２で得たpBLAMYのHindIII、EcoRI断片
を１−１で得たpBLΔ3'のHindIII、EcoRI間に挿入し、p
BLΔ3'Aを構築した。このpBLΔ3'Aを用いてコンピテン
トセル法により大腸菌を形質転換し、形質転換体をスタ
ーチアズレプレートにおいて１晩培養したところ、ハロ
ーを確認できた。
を１−１で得たpBLΔ3'のHindIII、EcoRI間に挿入し、p
BLΔ3'Aを構築した。このpBLΔ3'Aを用いてコンピテン
トセル法により大腸菌を形質転換し、形質転換体をスタ
ーチアズレプレートにおいて１晩培養したところ、ハロ
ーを確認できた。
【００５０】１−２で得たpBRAMYΔS のNheI、EcoRI断
片を１−１で得たpBRSΔ3'のNheI、EcoRI間に挿入し、p
BRSΔ3'Aを構築した。このpBRSΔ3'Aを用いてコンピテ
ントセル法により大腸菌を形質転換し、形質転換体をス
ターチアズレプレートにおいて１晩培養したところ、ハ
ローを確認できた。
片を１−１で得たpBRSΔ3'のNheI、EcoRI間に挿入し、p
BRSΔ3'Aを構築した。このpBRSΔ3'Aを用いてコンピテ
ントセル法により大腸菌を形質転換し、形質転換体をス
ターチアズレプレートにおいて１晩培養したところ、ハ
ローを確認できた。
【００５１】１−１で得たpUCΔ5'のPstI、SmaI断片を
１−３で得たpBLKANのPstI、SmaI間に挿入し、pBLKΔ5'
を構築した。
１−３で得たpBLKANのPstI、SmaI間に挿入し、pBLKΔ5'
を構築した。
【００５２】pBLKΔ5'のEcoRI、SmaI断片をpBLΔ3'AのE
coRI、SmaI間に挿入し、pBLHA1を構築した。
coRI、SmaI間に挿入し、pBLHA1を構築した。
【００５３】pBRSΔ3'AのBalI、EcoRI断片をpBLKΔ5'の
EcoRV、EcoRI間に挿入し、pBLHA2を構築した。
EcoRV、EcoRI間に挿入し、pBLHA2を構築した。
【００５４】なお、アルカリセルラーゼ遺伝子の発現制
御領域と液化型アルカリα−アミラーゼをコードする領
域の連結、並びにアルカリセルラーゼ遺伝子の発現制御
領域及び分泌制御領域と液化型アルカリα−アミラーゼ
のシグナル配列よりＣ末端側をコードする領域の連結
は、翻訳領域のアミノ酸置換及び非翻訳領域の塩基置換
が起こらないように、図５に示したスキームに従って行
った。上記連結のうち前者を図５のａに、後者を図５の
ｂに示す。なお、図５において、下線はａではHindIII
部位を、ｂではNheI部位を示し、矢印は推定されるシグ
ナルペプチダーゼによる切断部位を示し、上部の文字は
PCRの鋳型の塩基配列及びコードするアミノ酸配列と異
なる部分についての鋳型の塩基配列及びコードするアミ
ノ酸配列を示す。
御領域と液化型アルカリα−アミラーゼをコードする領
域の連結、並びにアルカリセルラーゼ遺伝子の発現制御
領域及び分泌制御領域と液化型アルカリα−アミラーゼ
のシグナル配列よりＣ末端側をコードする領域の連結
は、翻訳領域のアミノ酸置換及び非翻訳領域の塩基置換
が起こらないように、図５に示したスキームに従って行
った。上記連結のうち前者を図５のａに、後者を図５の
ｂに示す。なお、図５において、下線はａではHindIII
部位を、ｂではNheI部位を示し、矢印は推定されるシグ
ナルペプチダーゼによる切断部位を示し、上部の文字は
PCRの鋳型の塩基配列及びコードするアミノ酸配列と異
なる部分についての鋳型の塩基配列及びコードするアミ
ノ酸配列を示す。
【００５５】２．pBLHA2による相同組換え体の作出 ２−１．KSM-635株染色体へのpBLHA2の挿入 相同組換え用プラスミドpBLHA2を用いてKSM-635株をプ
ロトプラスト法により形質転換することにより（秦田
ら、特開平8-107784号公報）、ハロープレートでセルラ
ーゼ活性とアミラーゼ活性の両方を示す形質転換体K2-9
23株を得た。pBLHA2はBacillusで機能する複製開始点を
持たず、また、形質転換体K2-923株からはアルカリ抽出
法によりプラスミドが抽出されないことから、染色体へ
挿入した相同組換え用プラスミドの液化型アルカリα−
アミラーゼ遺伝子によりアミラーゼが生産されていると
考えることができる。
ロトプラスト法により形質転換することにより（秦田
ら、特開平8-107784号公報）、ハロープレートでセルラ
ーゼ活性とアミラーゼ活性の両方を示す形質転換体K2-9
23株を得た。pBLHA2はBacillusで機能する複製開始点を
持たず、また、形質転換体K2-923株からはアルカリ抽出
法によりプラスミドが抽出されないことから、染色体へ
挿入した相同組換え用プラスミドの液化型アルカリα−
アミラーゼ遺伝子によりアミラーゼが生産されていると
考えることができる。
【００５６】形質転換体K2-923株の染色体DNAを鋳型と
してPCRを行うことにより、pBLHA2の3'側相同領域とKSM
-635株染色体の相同配列間におけるキャンベル型の相同
組換えによるKSM-635株染色体へのpBLHA2配列の挿入を
確認することができる（図６）。この相同組換えは図７
のパターンで進行する。図７中、＞及び＜はプライマー
であり、ａはアルカリセルラーゼ遺伝子の開始コドン0.
5kb上流の配列を有するプライマー：5' CTT CTG AAT TC
G CCT TCA TGA GTC GTG ATG 3' を示し、ｂはKSM-635株
アルカリセルラーゼ遺伝子の下流の配列に相補的なプラ
イマー：5' CTC AAG CTT GAA TTC TGG AAG ACG AAT AGT
AAG CAA G 3'を示し、ｃはKANR4,ｄはAMYK2（表３）を
示す。
してPCRを行うことにより、pBLHA2の3'側相同領域とKSM
-635株染色体の相同配列間におけるキャンベル型の相同
組換えによるKSM-635株染色体へのpBLHA2配列の挿入を
確認することができる（図６）。この相同組換えは図７
のパターンで進行する。図７中、＞及び＜はプライマー
であり、ａはアルカリセルラーゼ遺伝子の開始コドン0.
5kb上流の配列を有するプライマー：5' CTT CTG AAT TC
G CCT TCA TGA GTC GTG ATG 3' を示し、ｂはKSM-635株
アルカリセルラーゼ遺伝子の下流の配列に相補的なプラ
イマー：5' CTC AAG CTT GAA TTC TGG AAG ACG AAT AGT
AAG CAA G 3'を示し、ｃはKANR4,ｄはAMYK2（表３）を
示す。
【００５７】相同組換え体K2-923株について、前述した
方法によりアミラーゼ生産の安定性を検討すると、低カ
ナマイシン濃度下においてアミラーゼ生産能を喪失した
菌が認められる（表７）。これらは、相同組換え用プラ
スミドの挿入の起こったのと同じ相同領域において相同
組換えが起こり、相同組換え用プラスミド配列が染色体
から欠失したために生じたものと推測される。
方法によりアミラーゼ生産の安定性を検討すると、低カ
ナマイシン濃度下においてアミラーゼ生産能を喪失した
菌が認められる（表７）。これらは、相同組換え用プラ
スミドの挿入の起こったのと同じ相同領域において相同
組換えが起こり、相同組換え用プラスミド配列が染色体
から欠失したために生じたものと推測される。
【００５８】
【表７】
【００５９】２−２．染色体内相同組換えによるセルラ
ーゼ非生産・アミラーゼ生産株の作出 セルラーゼ・アミラーゼ生産菌K2-923株をアルカリLB培
地で１日間振とう培養後、アルカリスターチアズレプレ
ートにおいて単集落分離し、ハローを形成する単集落を
得た。この菌株403株をキシロースハロープレートにお
いて培養し、セルラーゼ活性を喪失した菌４株を選抜す
ることにより、セルラーゼ非生産・アミラーゼ生産菌が
得られ、これらのうち１株を代表としてK2-923N1とした
（表８）。これらは、相同組換え用プラスミドの挿入と
は異なる相同領域において相同組換えが起こるため生じ
るものと推測される。
ーゼ非生産・アミラーゼ生産株の作出 セルラーゼ・アミラーゼ生産菌K2-923株をアルカリLB培
地で１日間振とう培養後、アルカリスターチアズレプレ
ートにおいて単集落分離し、ハローを形成する単集落を
得た。この菌株403株をキシロースハロープレートにお
いて培養し、セルラーゼ活性を喪失した菌４株を選抜す
ることにより、セルラーゼ非生産・アミラーゼ生産菌が
得られ、これらのうち１株を代表としてK2-923N1とした
（表８）。これらは、相同組換え用プラスミドの挿入と
は異なる相同領域において相同組換えが起こるため生じ
るものと推測される。
【００６０】
【表８】
【００６１】宿主菌KSM-635株及び相同組換え体につい
て、前述の方法に従ってサザンハイブリダイゼーション
による染色体の解析を行った（図８）。図８において、
Ａは相同組換え用プラスミドpBLHA2、並びにサザンハイ
ブリダイゼーションに用いたプローブａ及びｂを示し、
Ｂは各菌株の推定される染色体構造を示す。Ｃ及びＤは
それぞれプローブａ及びｂを用いたサザンハイブリダイ
ゼーションを示し、レーン１、２及び３はそれぞれKSM-
635株、K2-923株及びK2-923N1株の染色体DNAのHindIII
分解物を示す。また数字はDNAの長さ(kb)を示す。
て、前述の方法に従ってサザンハイブリダイゼーション
による染色体の解析を行った（図８）。図８において、
Ａは相同組換え用プラスミドpBLHA2、並びにサザンハイ
ブリダイゼーションに用いたプローブａ及びｂを示し、
Ｂは各菌株の推定される染色体構造を示す。Ｃ及びＤは
それぞれプローブａ及びｂを用いたサザンハイブリダイ
ゼーションを示し、レーン１、２及び３はそれぞれKSM-
635株、K2-923株及びK2-923N1株の染色体DNAのHindIII
分解物を示す。また数字はDNAの長さ(kb)を示す。
【００６２】この結果から、PCRによる解析から示唆さ
れていたのと同様に、セルラーゼ・アミラーゼ生産株K2
-923株は環状の相同組換え用プラスミドpBLHA2の3'側相
同領域とKSM-635株染色体のアルカリセルラーゼ遺伝子
座との相同組換えにより生じると考えられる。また、セ
ルラーゼ非生産・アミラーゼ生産株K2-923N1株はK2-923
株の染色体上のpBLHA2由来の5'側相同領域とKSM-635株
由来のアルカリセルラーゼ遺伝子上流領域間における相
同組換えにより、アルカリセルラーゼ遺伝子とpBLHA2の
pBLUESCRIPT II SK+DNAを含む部分が欠失して生じると
考えられる（図９）。
れていたのと同様に、セルラーゼ・アミラーゼ生産株K2
-923株は環状の相同組換え用プラスミドpBLHA2の3'側相
同領域とKSM-635株染色体のアルカリセルラーゼ遺伝子
座との相同組換えにより生じると考えられる。また、セ
ルラーゼ非生産・アミラーゼ生産株K2-923N1株はK2-923
株の染色体上のpBLHA2由来の5'側相同領域とKSM-635株
由来のアルカリセルラーゼ遺伝子上流領域間における相
同組換えにより、アルカリセルラーゼ遺伝子とpBLHA2の
pBLUESCRIPT II SK+DNAを含む部分が欠失して生じると
考えられる（図９）。
【００６３】３．相同組換え体による酵素生産 アルカリセルラーゼ生産宿主菌KSM-635株、pBLHA2を用
いて作出したセルラーゼ・アミラーゼ生産株K2-923株及
びセルラーゼ非生産・アミラーゼ生産株K2-923N1株、並
びにpBLHA1を用いて同様の方法により作出したセルラー
ゼ・アミラーゼ生産株K2-11株及びセルラーゼ非生産・
アミラーゼ生産株K2-11N1株の計５株について、その酵
素生産を検討した。
いて作出したセルラーゼ・アミラーゼ生産株K2-923株及
びセルラーゼ非生産・アミラーゼ生産株K2-923N1株、並
びにpBLHA1を用いて同様の方法により作出したセルラー
ゼ・アミラーゼ生産株K2-11株及びセルラーゼ非生産・
アミラーゼ生産株K2-11N1株の計５株について、その酵
素生産を検討した。
【００６４】３−１．相同組換え体のハロー形成 宿主菌及び相同組換え体について、セルラーゼ及びアミ
ラーゼのそれぞれによるハロー形成の有無を確認した
（図１０）。セルラーゼによるハロー形成は、宿主菌KS
M-635株と、K2-923株及びK2-11株において認められる
が、K2-923N1株及びK2-11N1株では認められない。アミ
ラーゼによるハロー形成は、宿主菌KSM-635株では認め
られず、K2-923株、K2-923N1株、K2-11株及びK2-11N1株
において認められる。
ラーゼのそれぞれによるハロー形成の有無を確認した
（図１０）。セルラーゼによるハロー形成は、宿主菌KS
M-635株と、K2-923株及びK2-11株において認められる
が、K2-923N1株及びK2-11N1株では認められない。アミ
ラーゼによるハロー形成は、宿主菌KSM-635株では認め
られず、K2-923株、K2-923N1株、K2-11株及びK2-11N1株
において認められる。
【００６５】３−２．相同組換え体の培養上清の電気泳
動 宿主菌及び相同組換え体について、培養上清を電気泳動
することにより酵素生産を確認した。Native PAGE の結
果を図11及び12に、SDS-PAGEの結果を図13に示す。
動 宿主菌及び相同組換え体について、培養上清を電気泳動
することにより酵素生産を確認した。Native PAGE の結
果を図11及び12に、SDS-PAGEの結果を図13に示す。
【００６６】Native PAGEのセルラーゼ活性染色の結
果、K2-923N1株及びK2-11N1株の培養上清ではバンドが
全く認められない（図11A, 図12A）。Native PAGE のC
BB染色でも、KSM-635株、K2-923株及びK2-11株で認めら
れるセルラーゼ活性を有するバンドは、K2-923N1株及び
K2-11N1株では認められない（図11B, 図12B）。
果、K2-923N1株及びK2-11N1株の培養上清ではバンドが
全く認められない（図11A, 図12A）。Native PAGE のC
BB染色でも、KSM-635株、K2-923株及びK2-11株で認めら
れるセルラーゼ活性を有するバンドは、K2-923N1株及び
K2-11N1株では認められない（図11B, 図12B）。
【００６７】SDS-PAGEにおいても、KSM-635株、K2-923
株及びK2-11株で認められる１本のメジャーバンドがK2-
923N1株及びK2-11N1株では認められない（図13）。ま
た、K2-923株、K2-923N1株、K2-11株及びK2-11N1株で液
化型アルカリα−アミラーゼの分子量に相当するバンド
が認められる（同図）。
株及びK2-11株で認められる１本のメジャーバンドがK2-
923N1株及びK2-11N1株では認められない（図13）。ま
た、K2-923株、K2-923N1株、K2-11株及びK2-11N1株で液
化型アルカリα−アミラーゼの分子量に相当するバンド
が認められる（同図）。
【００６８】これらの結果から、K2-923N1株とK2-11N1
株がキシロースハロープレートで活性を示さないのは、
不活性なセルラーゼが生産されるようになるためではな
く、アルカリセルラーゼ遺伝子による蛋白質の生産が行
われなくなるためであると考えられる。
株がキシロースハロープレートで活性を示さないのは、
不活性なセルラーゼが生産されるようになるためではな
く、アルカリセルラーゼ遺伝子による蛋白質の生産が行
われなくなるためであると考えられる。
【００６９】３−３．相同組換え体の培養実験 宿主菌及び相同組換え体について培養実験を行い、培養
上清のセルラーゼ活性及びアミラーゼ活性を測定した。
この結果を表９に示す。
上清のセルラーゼ活性及びアミラーゼ活性を測定した。
この結果を表９に示す。
【００７０】
【表９】
【００７１】その結果、K2-923N1株及びK2-11N1株の培
養上清のセルラーゼ活性は極めて低く、遺伝子破壊によ
るセルラーゼ非生産化は達成されたと考えられる。これ
らの株のアミラーゼ生産性は、セルラーゼ・アミラーゼ
生産株の２倍以上となり、セルラーゼ遺伝子破壊により
アミラーゼ生産性が向上することが確認された。
養上清のセルラーゼ活性は極めて低く、遺伝子破壊によ
るセルラーゼ非生産化は達成されたと考えられる。これ
らの株のアミラーゼ生産性は、セルラーゼ・アミラーゼ
生産株の２倍以上となり、セルラーゼ遺伝子破壊により
アミラーゼ生産性が向上することが確認された。
【００７２】
【発明の効果】以上のように、本発明の方法によれば、
好アルカリ性バチルス属細菌の有する高い蛋白質生産能
力を利用して、その分泌蛋白質の代わりに種々の有用な
異種蛋白質を高効率で生産することができる。
好アルカリ性バチルス属細菌の有する高い蛋白質生産能
力を利用して、その分泌蛋白質の代わりに種々の有用な
異種蛋白質を高効率で生産することができる。
【図１】バチルス・エスピーKSM-635株のアルカリセル
ラーゼ遺伝子由来DNA断片のサブクローニングの手順を
示す図である。
ラーゼ遺伝子由来DNA断片のサブクローニングの手順を
示す図である。
【図２】バチルス・エスピーKSM-AP1378株の液化型アル
カリα−アミラーゼ遺伝子由来DNA断片のサブクローニ
ングの手順を示す図である。
カリα−アミラーゼ遺伝子由来DNA断片のサブクローニ
ングの手順を示す図である。
【図３】カナマイシン耐性のプラスミドpUB110由来DNA
断片のサブクローニングの手順を示す図である。
断片のサブクローニングの手順を示す図である。
【図４】好アルカリ性バチルス属細菌の相同組換えに用
いるプラスミドの構築手順を示す図である。
いるプラスミドの構築手順を示す図である。
【図５】バチルス・エスピーKSM-635株のアルカリセル
ラーゼ遺伝子とバチルス・エスピーKSM-AP1378株の液化
型アルカリアミラーゼ遺伝子の連結部の配列を示す図で
ある。
ラーゼ遺伝子とバチルス・エスピーKSM-AP1378株の液化
型アルカリアミラーゼ遺伝子の連結部の配列を示す図で
ある。
【図６】相同組換え用プラスミドpBLHA2の3'側相同領域
とバチルス・エスピーKSM-635株染色体の相同配列との
間においてキャンベル型の相同組換えによりKSM-635株
染色体にpBLHA2の配列が挿入される様子を示す図であ
る。
とバチルス・エスピーKSM-635株染色体の相同配列との
間においてキャンベル型の相同組換えによりKSM-635株
染色体にpBLHA2の配列が挿入される様子を示す図であ
る。
【図７】形質転換体K2-923株の染色体DNAを鋳型としたP
CR産物及びその制限酵素切断物の電気泳動像を示す図で
ある。
CR産物及びその制限酵素切断物の電気泳動像を示す図で
ある。
【図８】宿主菌KSM-635株及び各相同組換え体について
のサザンハイブリダイゼーション解析を示す図である。
のサザンハイブリダイゼーション解析を示す図である。
【図９】宿主菌であるセルラーゼ生産菌から、相同組換
えによりセルラーゼ・アミラーゼ生産菌及びセルラーゼ
非生産・アミラーゼ生産菌を作出する遺伝子置換法を示
す図である。
えによりセルラーゼ・アミラーゼ生産菌及びセルラーゼ
非生産・アミラーゼ生産菌を作出する遺伝子置換法を示
す図である。
【図１０】宿主菌KSM-635株及びその相同組換え体のセ
ルラーゼ活性(A)及びアミラーゼ活性(B)によるハロー形
成を示す図である。
ルラーゼ活性(A)及びアミラーゼ活性(B)によるハロー形
成を示す図である。
【図１１】宿主菌KSM-635株並びにその相同組換え体K2-
923株及びK2-923N1株の培養上清のNative PAGEの結果を
示す図である。
923株及びK2-923N1株の培養上清のNative PAGEの結果を
示す図である。
【図１２】宿主菌KSM-635株並びにその相同組換え体K2-
11株及びK2-11N1株の培養上清のNative PAGEの結果を示
す図である。
11株及びK2-11N1株の培養上清のNative PAGEの結果を示
す図である。
【図１３】宿主菌KSM-635株及びその相同組換え体の培
養上清のSDS-PAGEの結果を示す図である。
養上清のSDS-PAGEの結果を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内
Claims (7)
- 【請求項１】 好アルカリ性バチルス属細菌の分泌蛋白
質遺伝子のプロモーターの制御下に、当該蛋白質以外の
蛋白質をコードする領域を含むDNA配列を導入して相同
組換え用プラスミドを得、これを用いて元の好アルカリ
性バチルス属細菌を相同組換えせしめることにより形質
転換体を得、次いでこの形質転換体を培養して培養物か
ら蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質生産方法。 - 【請求項２】 宿主とする好アルカリ性バチルス属細菌
の分泌蛋白質以外の蛋白質であってシグナル配列を有す
るものをコードする領域を含むDNA 配列を導入するもの
である請求項１記載の蛋白質生産方法。 - 【請求項３】 宿主とする好アルカリ性バチルス属細菌
の分泌蛋白質以外の蛋白質であってシグナル配列を有さ
ないものをコードする領域を含むDNA配列を、好アルカ
リ性バチルス属細菌の分泌蛋白質のシグナル配列をコー
ドする配列の下流に導入するものである請求項１記載の
蛋白質生産方法。 - 【請求項４】 導入するDNA配列が、好アルカリ性バチ
ルス属細菌の分泌蛋白質をコードする領域を含むもので
ある請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質生産方法。 - 【請求項５】 相同組換えによる形質転換体から、宿主
菌株の分泌蛋白質を生産せずかつこれ以外の蛋白質を生
産する菌株を選抜し、この菌株を培養して培養物から蛋
白質を採取するものである請求項１〜４のいずれかに記
載の蛋白質生産方法。 - 【請求項６】 好アルカリ性バチルス属細菌が、バチル
ス・エスピー KSM-635株（FERM BP-1485）又はその変異
株であり、その分泌アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモ
ーターの制御下にDNA配列の導入を行うものである請求
項１〜５のいずれかに記載の蛋白質生産方法。 - 【請求項７】 導入するDNA配列が、アミラーゼをコー
ドするものである請求項１〜６のいずれかに記載の蛋白
質生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9032100A JPH10229879A (ja) | 1997-02-17 | 1997-02-17 | 相同組換え体による蛋白質生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9032100A JPH10229879A (ja) | 1997-02-17 | 1997-02-17 | 相同組換え体による蛋白質生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10229879A true JPH10229879A (ja) | 1998-09-02 |
Family
ID=12349483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9032100A Pending JPH10229879A (ja) | 1997-02-17 | 1997-02-17 | 相同組換え体による蛋白質生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10229879A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002218977A (ja) * | 2001-01-23 | 2002-08-06 | Kao Corp | 組換え遺伝子形成方法 |
| JP2011217665A (ja) * | 2010-04-08 | 2011-11-04 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6185184A (ja) * | 1984-10-04 | 1986-04-30 | Showa Denko Kk | 形質転換によるｌ−トリプトフアン生産性微生物及びｌ−トリプトフアン製造法 |
| JPS6188873A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-07 | Showa Denko Kk | 形質転換菌及びｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPH01215280A (ja) * | 1988-02-23 | 1989-08-29 | Showa Denko Kk | 微生物の改良 |
| JPH04252193A (ja) * | 1991-01-25 | 1992-09-08 | Mitsubishi Kasei Corp | 蛋白質の産生方法 |
| JPH08107784A (ja) * | 1994-10-13 | 1996-04-30 | Kao Corp | 好アルカリ性バチルス属細菌の形質転換法 |
-
1997
- 1997-02-17 JP JP9032100A patent/JPH10229879A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
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| AGRIC. BIOL. CHEM., vol. Vol.53(5), JPNX006025442, 1989, pages 1275 - 1281, ISSN: 0000745863 * |
| BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. Vol.59(11), JPNX006025443, 1995, pages 2172 - 2175, ISSN: 0000745864 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP4589540B2 (ja) * | 2001-01-23 | 2010-12-01 | 花王株式会社 | 組換え遺伝子形成方法 |
| JP2011217665A (ja) * | 2010-04-08 | 2011-11-04 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換した微生物 |
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