JPS6185184A - 形質転換によるｌ−トリプトフアン生産性微生物及びｌ−トリプトフアン製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明はＬ−トリプトファンＩ高生産能を有するバチル
ス属に屈する菌及び該菌を用いるＬ−トリプトファンの
高生産性製造法に関し、更に詳しくは、Ｌ−トリプトフ
ァンの生合成を調整する遺伝情報を有するＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの宿主菌内で自己複製能力がない組換
え体ＤＮＡを用い、バチルス属に１−する菌株を形質転
換せしめ、該組換え体ＤＮＡを宿主菌の染色体ＤＮＡに
安定に挿入（インテグレーション）せしめた形質転換菌
及び該形質転換菌を用いる発酵法によるＬ−トリプトフ
ァンのｔＡ造法に関する。

（従　来　Ｉｋ術　） ｔｍ法によるＬ−トリプトファンの製造はその経済性の
観点から注目を集め、その際特に、その基碇となるＬ−
トリプトファン生産菌の改良は壬、要な、！題となって
いる。

従来、菌の改良には公知の方法、例えば特開昭５９−１
３０１８１号公報に見られるように、上に人工突然変異
法が用いられ、取得した突然変異株によってＬ−トリプ
トファンの５１ｉｉ造が行なわれて来た。

しかし、Ｌ−トリプトファンの収Ｑは商業的に必ずしも
充分なものとは言い難く、その経済的製法の追求が望ま
れている。そこで、最近開発された遺伝子組換え技術を
利用してアミノ酸を高度に生産するように微生物を処理
することが出来るように種々の研究が行われている。

ところで、遺伝子組換え技術による菌の改良は、先ず遺
伝子をその供与細胞から取出し、試験管内でベクターＤ
ＮＡと結合させ、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に
取り込ませる。そして。

１１的とする組換え体ＤＮＡを有する宿主細胞を増殖せ
しめ１次いで導入遺伝子を発現せしめることによって目
的の産物を得る。しかし、これらの方法によって得られ
る組換え体ＤＮＡは宿主細胞内で一般に不安定で」８養
中に消失したり、あるいは１組換え体の一部が欠失を生
ずることがある。それゆえ、宿主細胞内における組換え
体ＤＮＡの安定化手法が確ケされない限り実用性に制約
を受ける。そこで、木発明者等は組換え体ＤＮＡを宿主
細胞の染色体に挿入（インテグレーション）することが
出来れば、安定に組換え体ＤＮＡが宿主細胞に保持され
、上記制約から逃れられることが期待されるｔ考えた。

しかしながら。

Ｌ−トリプトファンなどの製造のためにかかる観点から
の研究実例はない、わずかに、バチルスズブチルス菌に
おいて遺伝子地図作成や遺伝子解析のために、染色体Ｄ
ＮＡ断片を有する組換え体プラスミドを用いてバチルス
　ズブチルス閑の染色体に組換え体プラスミドを挿入せ
しめ、胞子形成に関与する遺伝子座の同定を行ったり、
組換え体プラスミドの染色体への挿入の４＋！構研究な
どの基礎研究があるにとどまっている〔参考。

Ｊ、　Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、　１４２　、９０−１１８
　（＋９８０）　　及びＰ「ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、　　ＬＩＳＡ、７５．３８８４−３８８８（
＋９７８）　）　。

（発明の目的及び構成） そこで、Ｌ−トリプトファンの発酵法による！Ｉｉｌ造
のために、Ｌ−トリプトファンの生合成を調整する遺伝
子を新たに宿主菌の染色体に挿入させるへく鋭意研究を
行った所、Ｌ−トリプトファンの生合成を調整する遺伝
子を有する染色体断片と、ベクターＤＮＡを試験管内で
結合せしめ、宿主菌内で自己複製能を有さない組換え体
ＤＮＡを取得し５次いで該組換え体ＤＮＡをトリプトフ
ァンアナログ耐性を有する宿主菌に導入し形質転換させ
た。これら形質転換菌の中から、親株と比較して、例え
ばトリプトファンシンセターゼ活性が高くなった菌株を
選択することが出来る。

このように選抜された形質転換菌は、Ｌ−１リプトフア
ンの生産性が高く、更に、例えば一般に知られている自
己複製能のある組換え体ＤＮＡ、例えば、プラスミドや
ファージを用いた場合のような特別な配慮やその不安定
さに伴う障害を克服するための対策を講することなしに
培養が可能であるなど、工業的にイＩ利にＬ−トリプト
ファンの製造に供することができる。

本発明によれば、Ｌ−）リプトファ／の生合成を調整す
る遺伝子（望ましくは、トリプトファンなどによる阻害
が全く解除されているものがよい、）を有するＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの、宿主菌内で自己複製能のない
組換え体ＤＮＡを用い、バチルス属に属する微生物から
選ばれる宿主菌株（好ましくは、トリプトファンアナロ
グ耐性を有する宿主菌）を形質転換して、宿主菌の染色
体に該Ｍ１検え体ＤＮＡを新たに挿入せしめることによ
って、Ｌ−トリプトファンの生合成を調整する遺伝子が
新たに付加された染色体ＤＮＡを４１するＬ−）リプト
フＴン高生産性菌が提供でき、さらに該形質転換菌を用
いたＬ−トリプトファンの経済的な発酵法による製造法
が提供される。

以下、未発明について更に説明する。

１　組換え体ＤＮＡの作製 従来、宿主菌を形質転換せしめる場合には、もっばら宿
主菌内で自己複製能を有する組換え体ＤＮＡ、例えば、
プラスミドや７γ−ジが用いられて来た。しかし１本発
明では、染色体に安定に組換え体ＤＮＡを挿入せしめる
ために、自己複製能を有さない組換え体ＤＮＡを使用し
た。

本発明に於けるＬ−トリプトファンの生合成をＡ＊する
遺伝情報を有するＤＮＡｌｌｉ片は１通常Ｌ−トリプト
ファン生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡより適当な
制限酵素によって切出されたものが用いられるが、宿主
菌の染色体ＤＮＡとの相同性が高いものであれば原則と
してその由来については特別な制限はなく５例えば、土
壌や他の天然物から分離されるＬ−トリプトファン生産
能をイ（する野生株は勿論のこと、それらを紫外線照射
や化学物質による処理をして得られる人工的突然変異株
或いは遺伝子組換え技術を用いて得られるＬ−トリプト
ファンの生合成を調整する遺伝情報を含む組換えＤＮＡ
等いずれでも良い、尚、この場合、１１亥ＤＮＡＩＩＩ
＋片はＬ−）リプトファ７の生合成を調整する遺伝情報
を有する部分のみからなり、他に余分な部分を含まない
ものであることが望ましいが、用いるルＩＦＭ酵２弱の
種類によってはその＋ｔｉｊ後に若干他の部分を含むこ
とがあり、そのようなものであっても宿主菌との相同性
や目的とするＬ−トリプトファンの生合成に悪影響を及
ぼさない限り用いることができる。ｔた。該ＤＮＡ断片
はＬ−）リプトフＴンの生合成を調整する遺伝情報のす
べてを有する必りはなく、その一部分のみを含んでいる
ＤＮＡでも用いることができる。

このようなＬ−）リプトクアンの生合成をＡ１堕する遺
伝情報を有する染色体ＤＮＡを有する微生物としては、
例えば、バチルス昏アミロリクイファシェンス、へチル
ス拳アミロリティカス、バチルス＃フルカ口フィラス、
バチルス・ファギュランス、バチルス・ライケニホルミ
ス、バチルス・ナラトウ、バチルス会ズブチルス、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス等のバチルス属に属する
微生物や、それらの変異株など、およびそれらを親株と
して遺伝子組み換えによって育種した株等が掲げられる
。

また、これらＤＮＡよりＴｒｐ遣仏子を切出すのに用い
られるＭ１限酵素としては特に制限はないが、トリプト
ファンの生合成を調整する遺伝子中にも切断部位が少な
いほうが望ましく、例えば、ＥｃｏＲｌ、　ＢａｍＨｌ
、　　５ａ１１．　５ａｃ１．　　Ｐｖｕ［Ｉ。

ＸｈｏＩ　、　Ｘｂａｌ、　１１ｂｏ　ｒ、旧ｕ１等が
あげられる。

本発明において、宿主菌内で自己複製しないベクターと
しては所謂宿主−ベクター系として成り立つものであれ
ばいずれでもよく、例えば。

Ｃｏ１Ｅｌ　、　ｐｓｃｌｏｌ、　ｐｓＦ２１２４　、
　ｐＪＢ８、ｐＡｃＹｌ：１８４、ＰＣ：Ｒ１，Ｒ８に
、　ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３１？、　Ｐ
ＢＲ３１８゜ｐＢＲ３２０，ｐＢＲ３２１，ｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３３３、ｐＢＲ３４１、ｐＢＲ３４５，ｐＢ
Ｒ３５０，ｐＢＲ３５１，ｐにＬ２．　ｐＭＬ−２１゜
ＧｏｌＥＩＡｐ　、　ＲＳＦｉＯｌＯ、ｐＶＨ５１、ｐ
ＶＨ１５１，ｐＶＨ１５３、ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２
５及びｐＢＲ３２８等の大腸菌由来のプラスミドがあげ
られる。特に１本発明のすぐれた点は、例えばバチルス
属に属さない宿主細胞、例えば大腸菌などでクローニン
グ出来れば、その系で用いた＃Ｉ換え体ＤＮＡそのもの
を＋ｔＬ接本完本発明用出来る点にある。その際、従来
技術であれば、宿り菌以外でクローニングした時、ベク
ターとして宿主菌内でも自己複製ｒＩ丁能なベクター（
例えば宿主菌内で複製可能なシャトルベクターとか法会
主領域ベクターなど）を使用しておくか。

あるいはクローニングしたＤＮＡを宿主菌内で安定に存
在し得るベクターと連結させ直す操作などの配慮を必要
とした。

以下に代表的な例として大１ｌｉ１菌由来のプラスミド
Ｐ８Ｒ３２２及びρＢＲ３２１’を使用した例を示し、
更に具体的に詳述するが、前述の如く他の例についても
同様に行い得ることは１；うまでもない。

プラスミドｐＴρ４の有するりａラムフェニコール耐性
逍伝子を常法によりファージρ１１のＤＮＡにクローニ
ングし、次いで該ファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断して、予めＥｃａＲＩで！／Ｊ断しておいたプラ
スミド　ｐＢＲ３２２ＯＮＡと、それら生じたＤＮＡ断
片の末端の数が同じになるような薯二度で混合し、Ｔ４
ファーノリガーゼを用いて結合反応を起こさせる。この
ＤＮＡを用い、塩化カルシウム処理した大１揚ＪＣ８０
０ｔｒｐ　、　　ｌｅｕ、　ｔｈｒ、　ｒｋ−ｍｋ−株
を常法により形質転換し、クロラムフェニコール、アン
ピシリン、テトラサイクリンのいずれにも耐性を有する
株を取（すした、これら形質転換株からプラスミドを分
離精製し、制限酵素地図をつくった所、第１図のような
、ｖＩ制限素地図を有するプラスミドを含む形質転換菌
大腸菌５Ｄ−１００７（微工研ｌＪｉ寄第７８８０号）
が得られた。

該形質転換菌のプラスミド（ｐＳ０３１８５と称する）
にはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｌの切断点に約２．５メガ
ダルトンのクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され
ていた。

次に　ｐＳＤ３１８５を制限酵素（ＥｃｏＲＩ　）で部
分的に切断し、またクローンしたトリプトファンアナロ
グ耐性枯０菌由来のトリプトファンオペロンを含むファ
ージφｌｏｓ［１ＩＩＡ　Ｃ特開昭５９−１２５８９２
吟参照）も制限酵Ｊ（ＥｃｏＲＩ）で切断し、両者ＤＮ
Ａを混合し、Ｔ４ファージリガーゼを用いて結合させる
。

このＤＮＡを用い、塩化カルシウム処理した人１賜ｆｉ
　Ｃ８００Ｌｒｐ　、　ｔａｕ　、　ｔｈｒ　、　ｒｋ
−、ｍｋ−株を常法により形質転換し、クロラムフェニ
コール耐性、アンビノリ／耐性及びテトラサイクリノ耐
性でかつＴｒｐ非品求性を小す形質転換菌を取得する。

該形質転換菌から組換えプラスミドを常法により分離精
製し、制限酵、４７．地図を作製した所　第２図のよう
に制限酵素地図を持つプラスミドを有する形質転換画人
ｌ１ＢＳ菌５Ｏ−１００８（微工研菌寄第７８６１号）
か得られた。この形質転換菌のプラスミド（ｐ　５ＤＴ
ＩＩ１１　と称する）にはＰＳＤ３１８５のＥｃｏＲ１
切断点の１つに約５メガダルトンのＤＮＡが挿入されて
いた。この挿入ＤＮＡは、各種トリプト７ｒ７Ｄ求株（
ｔｒｐ　Ａ、　Ｌｒｐ　Ｂ、　ｔｒｐ　Ｃ，ｔｒｐ　Ｄ
またはｔｒｐ　Ｅ等の突然変異株）を受容菌としてＰＳ
Ｄ丁１１１１を供与体ＤＮＡとした時、全てに　Ｔｒｐ
非費求性の形質転換菌が高頻度に出現せしめることから
　トリプトファンの生合成を調整する遺伝情？ｌＪを看
すると考えられる。

次いでｐＢＲ３２５を用いた例を示す。

プラスミドＰＢＲ３２５を制限酵素（例えば、ＥｃｏＲ
Ｉ　）でジノ断し、また例えば、特開昭５９−１２５８
９２号で示された方法でクローンした。＜チルス・アミ
ロリクイファシェンス■へ旧５２１（東京大学応用微生
物研究所より入手）の５−フルオロトリプトファン耐性
株のトリプトファンの生合成を調整する遺伝情報を含む
ファージφ１０５ＤＮＡも１−ｃｏＲＩにて切断し、両
者のＤＮＡを適当な濃度で混合し、両ＤＮＡ断片をＴ４
ファージリガーゼで結合させる。

次に、このＤＮＡを用い、大１揚！ＩＣ６００ｔｒｐ、
ｌｅｕ、ｔｈｒ、ｒｋ−、ｍｋ−株を上述の方法で形質
転換せしめた。

そして、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性かつ
クロラムフェニコール耐性でなおかつＴｒｐ非要求性の
形質転換菌大腸ｍ５Ｄ−１００９（微工研菌寄第７８６
２号）を選択した。該菌よりプラスミドを常法により分
離精製した所、第３図に示すようなプラスミド（ｐｓ０
２９８１）が得られた。

尚、該プラスミドを用いて、バチルス―ズブチルス　ｈ
ｉｓＢ株を形質転換した所、Ｈａｓ非要求性株が得られ
ることから、ｌ；亥Ｍ１換え体ＤＮＡはトリプトファン
オペロン以外にｈｉｓＢ通伝子も含むことが判る。

２、宿−し菌 宿主菌としては前述したような組換え体ＤＮＡをその染
色体内に１ｔｊｉ人し得るものならばいずれでもよい、
ここでは、代表的な例としてバチルスφズブチルスｌＮ
Ａｌ０２８株（東京大学ε用微生物研究所より入手）な
らびにバチルス−アミロリクィファシエンス　１ＭＡｌ
５２１ａとそのトリプトファンアナログ耐性株、バチル
ス５Ｏ−３０（特開昭５９−１３０１８１号）を宿１１
２（とじて例示する。

但し、バチルス５Ｏ−３０以外はトリプトファン・アナ
ログである５−フルオロトリプトファン（以下、５−Ｆ
Ｔと略す）感受性であったので、例えば。

Ｎ−メチル−Ｎ゛−二トローＮ−ニトロソグアニジン等
を用いて常Ｖ、により人Ｉ突△変異処理をして、　５−
ＦＴ耐性菌を取１′１シて、以下の実験に供した。

また、ＩにＡ１５２１株に関しては　同様の突然変異旭
理で５−ＦＴ耐性を有すヒスチジン要求株を取得し、実
験に供した。

３、形質転換菌の取得 ｐｓｏ丁１１１１０．１−１ルｇを上記宿主菌に公知の
方ノ去（例えば　Ｊ、　　Ｂａｃｔｓｔｉｏｌ、、　８
１．７４１（１９８１）又は　Ｍｏ１ｅｃ、　　ｇｅｎ
、　　Ｇｅｎｔ、、　１８１１．　１１Ｉ（１９７９）
など）によって取り込ませ、形質転換を行ったところ、
クロラムフェニコール（ｊｕｔｓ／ｍｌ　）を含む寒天
培地で成育する。いわゆるクロラムフェニコール耐性を
有する形質転換菌バチルスＳＯ−１００２（機工Ｍ菌寄
第７８５５号）が取得できた。この菌の１学的性質は原
株／ヘチルス・７ミロリクイフアシエンスＩＮＡ　Ｉ５
２１株とアントラニル酸によるＬ−トリプトファンの合
成阻害、５−ＦＴ耐性及びトリプトファン合成系酵素の
活性の点で相違する以外は原株と実質的に同じである。

しかしながら、トリプトファン合成を調整する遺伝子を
含まないｐｓＤ３１１１１５を用いた時には、クロラム
フよニコール耐性菌の出現は認められなかったので１元
来これら組換え体プラスミドは宿主菌内で自己複製能力
はないと考えられた。さらＪこ、Ｆ記形賀転換菌からは
１５′１環状ＤＮＡ　（プラスミド）の存在は認められ
なかった。

次に、バチルス５Ｏ−３０株を宿主菌に用いて選抜した
該形質転換菌のＬ−トリプトファンシンセターゼノ活性
ノ９４定（文献？Ｉｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ７ｓｏ
ｌｏｇｙ、５、　７９４（１８８２））結果を示す。

＋ＮＪＪａ　　　　Ｌ−トリプトファンシンセタ−ゼ活
性 バチルス５Ｄ−３０１００ バチルス５Ｏ−１００２２０３ また、該形質転換株のアントラニル酸（８０ｐｐ腸）存
在下におけるスピザイゼン最少培地 （（ＮＨ４ン２　５０４　　　０．２Ｚ　　　、　　Ｋ
２　　ＨＰＯ４＋、４１ＫＨ２Ｆ０．　０．８Ｌ　り！
７１！ｌｌＪ’ｙムー２　Ｈ２００，１！、　Ｍｇ　３
０４　１１７Ｍ２０　０．０２ｇ　。

グルコース０．５り　）　テ３７℃、　１．５　時１１
Ｊｌ培１ｎた時のＬ−トリプトファンの′ａ積結果を示
す。

菌株　　　　　　Ｌ−トリプトファン蓄積（誇ｇ／脂１
　） バチルス５Ｏ−３０３４ バチルス５Ｄ−１００２７２ 以上の実験から、ρ５ＤＴＩＩＩＩが宿主菌染色体に挿
入されたと考えられる（参照Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、ヒ、３８８４（１１１７８））　
。

さらに、宿主菌としてＩＭＡ１０２８株の５−ＦＴ耐性
株を用いた場合も、同様にしてｐｓＤＴＩＪＩＩ　　Ｄ
　Ｎ　Ａによって、クロラムフェニコール耐性を有し、
Ｌ−トリプトファンシンセターゼ活性ならびにその蓄積
が約２倍亢進した形質転換株が取得できた。

また、！Ａ旧５２１の５−ＦＴ耐性を有するヒスチジン
要求株を宿主菌として、ｐｓＤ２９６１を供与体ＤＮＡ
として上述の方法により形質転換し、ヒスチジン非要求
性菌を選択する。

この場合には宿主菌のヒスチジン遺伝子とｐｓＤ２９Ｂ
＋が有するヒスチジン遺伝子とが組換えを起こしてヒス
チジン非要求性となった形質転換菌又は丘述したように
ｐｓＤ２１１８１が染色体に挿入された結果ヒスチジン
非要求性となった形質転換菌あるいは両反応が同時に起
ったヒスチジン非要求性形質転換菌の存在が考えられる
。

しかし、もし染色体にｐｓＯ２９６１が挿入された場合
にはトリプトファンの合成を！？！する遺伝子は染色体
上に少くとも２個存在することになり、例えばトリプト
ファンシンセターゼ活性が宿主菌より高い事が期待され
る。

実１ｒＡ、Ｍ度は少いがＬ−１リプトフＴンシンセアミ
ロリクイフアシエンス　ＩＡＭ１５２１株とアントラニ
ル酸によるＬ−トリプトファンの合成阻害、５−ＦＴｍ
性及びトリプトファン合成系酵素の活性の点で相違する
以外は原株と実質的に同じである。）が以下に示すよう
に選抜できた。

バチルス５Ｄ−１００５１７８ 以上例示したように、抗生物質耐性遺伝子を有した組換
え体ＤＮＡを用いたり、栄養要求性変異株を宿主菌とし
て用いたが、これらは染色体に挿入した組換え体ＤＮＡ
を含む形質転換菌の取得を容易にさせるもので、単に例
示に過ぎない。

抗生物質耐性遺伝子であれば、上記理由から宿主細胞内
で発現しうるものならいずれでもよく。

又、宿主菌の突然変異も挿入されるＤＮＡと相同性を持
つ選択可能な遺伝子変異ならいずれでもよいことは明白
である。

本発明方法に従えば、バチルス５Ｏ−１００２又はバチ
ルスＳＤ−１００５を７ントラニル酸又はその塩を含む
培地で培養することによりＬ−トリプトファンを生成せ
しめることができる。栄養培地中のアントラニル酸又は
その塩の濃度には特に限定はないが目的Ｌ−トリプトフ
ァンの収量、培養条件及び経済的観点から一般には０．
１〜３０００　ｍｇ／文、好ましくは　１００〜１００
０　ｍｇ／文の濃度とする。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物がＪ８養により増殖し得るものであれば任
意のものでよく１例えば、炭素源としては、ブドウ糖、
糖蜜、１電糖、澱粉、澱粉糖化液、セルロース分解物等
の糖類、酢酸、エチルアルコール、グリセリンなど、（
、゛素源としては、アンモニア、硫安、鳩安、硝安、燐
安なとのアンモニウム塩や尿未、硝酸＋１Ｊ等が適宜使
用される。

％機塩としては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガ
ン等の１ｕ類、例えば燐酸アンモニウム。

燐酸カリウム、燐酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸第一鉄、硫酸マンガン、苛性カリ等の工業的薬品で良
く、他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、硼素、銅、
コバルト、モリブデン等の塩類を添加してもよく、また
微量イ■機栄養大としてビタミン、アミノ酸、核酸Ｉ！
！連物質等は菌の生育上特に必要ではないが、これらを
添加したり。

肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー。

ペプトン等の４１ａ物を添加してもよい、７ノトラニル
酸はナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム１１！等
の水溶液やＭ＃酸のエタノール又はメタノール溶液とし
て添加すれば良い。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
撹拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが。

一般的に言えば、温度３０〜４５℃、　ｐＨ８，０〜８
．０及び１５〜８０時間程度の条件で実施する。

倍溶液又は培養物からの目的のＬ−トリプトファンの採
取方法は慣用方法に従って行うことができる０例えば、
倍溶液を遠心分離し、その上清からイオン交換樹脂処理
法、活性炭処理法などの操作を適宜組み合せてＬ−トリ
プトファンを単離することができる。

以下に本発明の形質転換菌を用いたＬ−）リプトフγン
の製造法についての代表的な実施例を説明するが１本発
明の範囲をこれらの実施例に限定するものでないことは
いうまでもない。

実施例１ グ／ｌ／　：ｌ−ス５％、硫安　０．２＄、　Ｋ　２　
ＨＰ　Ｏ４１，４Ｋ　、ＫＨ２ｐｏ、　　０．６Ｌ　　
りｘ７ｍ−ｊ−ト＋）ラム・２８２０　１ｇ、ＭｇＳＯ
４ψ７Ｈ２００，０２＄　　、　　Ｆｅ５Ｏ１・　７Ｈ
２０１ＰＰＩ１．ＭｎＳＯ４ｌｐｐｍを含む液体培地（
ｐＨ７，０）　２文に７ノトラニル％　　８００　ｐｐ
ｍを添加し、これに形質転換菌バチルス５Ｄ−１００２
を植菌し、３５℃で５文のジャーファメンターで通気撹
拌培養した。

ｊ８養中、アントラニル酸濃度が５０９ｐ■以丁まで減
少した時点で、アントラニル酸濃度が約１１０００ｐｐ
になるように適宜追加添加し、また培養途中グルコース
をｔｏｏ　ｇ追加し、更にアンモニア水の添加により培
地のｐＨを７．０±０．４に保ちながら１５時間培養し
た。Ｌ−トリプトファンの７１ｉＪＡは８．３　ｇ／４
°で平行運転した宿主菌５Ｄ−３０の１．７８倍の蓄積
をＪｊ。

えた。

実施例２ グルｌ−ス５＄、硫安　０．２Ｌ　Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４
１，４％　、ＫＨ２ＰＯ４０，ＢＺ、　　り１７！ｍ−
）−トＩＪウム−２Ｈ２０１ｇ、Ｍｇ５Ｏ，壷７Ｈ２０
０，０２％　、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ｌｐｐｍ、　Ｍ
ｎ５ＯｎＩｐｐ−を含む培地（ｐ）Ｉ　７．０　）　２
９．に、アントラニル酸酪　８００　ｐｐｍを添加し、
これに形質転換菌バチルスＳＤ−１００５を接種し、３
５℃で５１のジャーファメノターで通気撹拌項五した。

ｌ中、アントラニル酸濃度が５０ｐＰ鵬以下まで減少し
た時点で、アントラニル酎濃度が約１１０００ｐｐにな
るように適宜追加添加し、また培養途中グルコースを１
００　ｇ追加し、更にアンモニア水の添加により培地の
ｐＨを７．θ±０．４に保ちながら１５時間培養した。

Ｌ−トリプトファンの蓄積は６．７　ｚ／１で１Ｌ行運
転した宿主菌（ヒスチジン要求株ゆえ。

培地中にヒスチジンを５０４ｇ／■文になるように添加
した。）の約１．４倍の蓄積を与えた。

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸ＩａＳＤ−１００７の制限酵素地図。 第２図は大Ｉｌｌ菌５Ｄ−１００８の制限酵素地図、第
３図は大Ｉｌ！！菌５Ｄ−１００１１の制限酵素地図。 をそれぞれ示す。 ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５は大！１ｇ菌由来プラスミ
ド、Ｃ＋＋はクロラムフェニコール耐性形質を示す領域
。 Ｔｒｐはトリプトファンの生成号を調整する領域、Ｓａ
ｌ　　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉ７ｎｄ　ｍ、　）
ｌｉｎｅｌｌ、９ａｍＨＩ、Ｐｓｔ　ｒ、　Ｐｖｕ　Ｉ
ｌ、　Ｘｂａ　１．　ＢｇＲＩｌ、　Ｘｈｏ　Ｉ　、は
制限酵素者であり、各酵素による切断部位を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−トリプトファンの生合成を調整する遺伝情報を
   有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの宿主菌内で自己
   複製能力がない組換え体ＤＮＡを用い、バチルス属に属
   する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して、宿主
   菌の染色体に該組換え体ＤＮＡを挿入せしめた形質 転換菌。 ２、宿主菌がトリプトファンアナログ耐性を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の形質転換菌
   。 ３、Ｌ−トリプトファンの生合成を調整する遺伝情報を
   有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの宿主菌内で自己
   複製能力がない組換え体ＤＮＡがｐＳＤＴ１１１１又は
   ｐＳＤ２９６１である特許請求の範囲第３項記載の形質
   転換菌。 ４、形質転換菌がバチルスＳＤ−１００２、バチルスＳ
   Ｄ−１００５である特許請求の範囲第１項の形質転換菌
   。 ５、該形質転換菌をアントラニル酸又はその塩の存在又
   は不存在下にて培地に培養せしめ、生成したＬ−トリプ
   トファンを培地から採取することを特徴とするＬ−トリ
   プトファンの製造法。