BR102012020608A2

BR102012020608A2 - Método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BR102012020608A2
Application number: BRBR102012020608-0A
Authority: BR
Inventors: Irina Borisovna Altman; Tatyana Abranomvna Yampolskaya; Leonid Romanovich Ptitsyn
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2011-08-18
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2013-11-12
Also published as: RU2011134436A; JP2014524233A; EP2559754A2; EP2559754A3; WO2013024904A1; US20140162325A1; EP2559754B1; CN103732736B; CN103732736A; JP6064991B2; US9284584B2

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO A presente invenção fornece um método para produzir L-aminoácido usando uma bactéria pertencente À família Enterobacteriaceaem, particularmente uma bactéria móvel que pertence ao gênero Escherichia, Enterobacter ou Pantoea, mem que a bactéria foi modificada de maneira que a expressão de pelo menos um gene da formação de flagelos e cascata de motilidade seja intensificado.

Description

I “MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO”

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção diz respeito à indústria microbiológica, mais especificamente a uma bactéria da família Enterobacteriaceae na qual a 5 expressão de gene(s) associada com a formação de flagelos e cascata de motilidade é/são desregulada(s), e um método para produzir um L-aminoácido por fermentação das bactérias anteriores, em que a expressão da formação de flagelos e cascata de motilidade gene(s) é intensificada.

Fundamentos da Invenção Convencionalmente, os L-aminoácidos são produzidos em

escala industrial por métodos de fermentação que utilizam cepas de microrganismos obtidos de fontes naturais, ou mutantes destes. De maneira típica, os microrganismos são modificados para melhorar os rendimentos da produção de L-aminoácidos.

Muitas técnicas para melhorar os rendimentos da produção de

L-aminoácido foram relatadas, incluindo transformação de microrganismos

com DNA recombinante (ver, por exemplo, patente U.S. 4.278.765) e alteração de regiões regulatórias tais como promotor, seqüência principal e/ou atenuador, ou outras conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, 20 US20060216796 e W09615246A1). Outras técnicas para melhorar rendimentos da produção incluem aumentar as atividades das enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácido, e/ou dessensibilizar as enzimas alvo para a inibição da resposta pelo L-aminoácido resultante (ver, por exemplo, W09516042A1, EP0685555A1 ou patentes U.S. 4.346.170, 5.661.012 e 25 6.040.160).

As cepas usadas na produção de L-treonina por fermentação são conhecidas, incluindo as cepas com melhores atividades das enzimas envolvidas na biossíntese de L-treonina (EP0219027A2 ou patentes U.S. 5.175.107, 5.661.012, 5.705.371, 5.939.307), as cepas resistentes aos produtos químicos tais como L-treonina e seus análogos (WOOl 14525Al, EP301572A2, patente U.S. 5.376.538), as cepas com enzimas alvo dessensibilizadas para a inibição da resposta pelo L-aminoácido produzido ou seus subprodutos (patentes U.S. 5.175.107 e 5.661.012), e as cepas com 5 enzimas de degradação de treonina inativada (patentes U.S. 5.939.307 e 6.297.031).

Descreve-se na literatura que bactérias móveis, tais como Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Yersinia enterocolitica, e similares, podem exibir diferentes estilos de vida e pode ser 10 em uma célula única móvel (ou estado planctônico), ou como células sedentárias que usam fímbrias adesivas para se agrupar e formar biofilmes na superfície (OToole G.A. et al., Annu. Rev. Mierobiol., 2000: 54, 49-79). As células de Eseheriehia coli (E. coli), por exemplo, são muito móveis durante a fase de crescimento pós-exponencial (Amsler C.D. et al., J. BacterioL, 1993: 15 175, 6238-6244), e se tomam agregadas ou aderidas a uma superfície pela indução de fímbrias curli adesivas quando entram na fase estacionária (Olsén A. et al., Nature, 1989: 338, 652-655).

Sabe-se que em E. coli tanto a formação de flagelos e motilidade, e cascatas de adesão mediadas por curli estão no controle de 20 cascatas de alimentação regulatória, cada qual com um regulador principal na parte superior, que age como um integrador de sinal ambiental massivo (Pesavento C. et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). A cascata de controle de fímbrias curli é um módulo na resposta ao estresse geral, para o qual o

o

fator σ (sigmaS, RpoS) age como o regulador principal (Hengge-Aroms R. 25 2000. The general stress response in E. coli. Em Bacterial stress responses (eds. G. Storz e R. Hengge-Aronis), pp. 161-178. ASM Press, Washington, DC.). A proteína CsgD mostrou ser um ativador essencial para o operon do gene estrutural de curli (csgBAC) (Gerstel U. et al., MoL Microbiol., 2003: 49, 639-654). Para a expressão de flagelos e de cascata de motilidade, o regulador principal é o complexo FlhDC expresso a partir do operon flhDC, definido como o operon de flagelos classe 1. O regulador principal de flagelos FlhDC funciona como um complexo hetero-oligomérico das proteínas FlhD e FlhC (o complexo FH1D4C2), cuja estrutura cristalográfica, originada de E. coli, foi decidido (Wang S. et al., J. Mol. Biol., 2006, 355:798-808). O complexo FlhDC regula a transcrição de vários operons flagelares e não flagelares em bactérias, e, em particular, ativa a expressão de operons de classe 2, que são responsáveis pela parte interna dos flagelos e vários fatores (FliA, FlgM) (Pesavento C. et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). Após o fator FlgM é secretado, FliA é liberado para ativar os operons de classe 3 que codificam as subunidades externas de proteínas de flagelos adicionais, exigidas para a função e quimiotaxia flagelar, bem como inúmeras proteínas de função ainda desconhecida (Aldrigde P.D. et al., Gen. Dev., 2006: 20, 2315-2326).

Um outro regulador chave de motilidade celular e expressão de fímbrias curli é monofosfato de bis-(3’-5’)-cíclico-diguanosina (c-di-GMP) que degrada fosfodiesterase (PDE), por exemplo, YhjH e YciR (o último, além da atividade de c-di-GMP PDE, também funciona na direção oposta 20 como diguanilato ciclase). A superprodução de c-di-GMP PDE demonstrou interferir na motilidade de bactérias entéricas por meio da inativação forte da expressão de fímbrias curli e da celulose no componente da matriz de biofilme (Rõmling U. et al., Mol. Microbiol., 2005: 57, 629-639; Jenal U. e Malone J., Annu. Rev. Genet., 2006: 40, 385-407). No caso particular, YhjH 25 mostrou desempenhar um papel positivo na motilidade (Ko M. e Park C., J. Mol. Biol., 2000: 303, 371-382).

A FliZ, proteína, que é expressa a partir de um gene imediatamente à jusante de fliA, demonstrou ser um inibidor muito potente da formação de fímbrias curli em E. coli, interferindo na atividade do fator σ que controla os genes envolvidos na expressão de curli (Pesavento C. et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). Mais especificamente, FliZ fornece prioridade de motilidade de maneira transiente (e, portanto, uma estratégia de alimentação) com relação à resposta ao estresse geral, contanto que a expressão do gene flagelar continue.

Uma bactéria da família Enterobacteriaceae, que foi modificada para diminuir a expressão dos operons csgBAC ou/e csgDEFG (RU2338782), ou de maneira a não produzir a proteína adesina de fímbria tipo I (EP1838726A1), foi empregada para produzir um L-aminoácido, especificamente, L-treonina.

Além do mais, sabe-se a partir de W02002097089A1, que microrganismos contendo flagelos, nos quais um ou mais genes com relação à constituição de flagelos ou ao movimento de flagelos são inativados ou eliminados, podem ser usados como hospedeiros para produzir substâncias úteis, por exemplo, aminoácidos (W02002097089A1).

Até o momento, não existem relatos que destacam o efeito positivo de melhor expressão de genes bacterianos (flhDC, yhjH e fliZ), envolvidos na formação de flagelos e cascata de motilidade, na produtividade de L-aminoácidos, e mais especificamente L-treonina e L-fenilalanina.

Revelação da Invenção

Os aspectos da presente invenção inclui fornecer uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, especificamente aos gêneros Escherichia, Enterobacter e Pantoea, no qual expressão de gene(s) da formação de flagelos e cascata de motilidade é/são intensificado(s), e um 25 método para produzir L-aminoácidos, especificamente, L-treonina e L- fenilalanina usando a dita bactéria. Este objetivo foi atingido pelo achado de que a melhor expressão de gene(s) da formação de flagelos e cascata de motilidade, por exemplo, os genes do operon flhDC de E. coli que codificam os reguladores duplos transcricionais de ligação de DNA, FlhD e FlhC, os quais são partes do complexo FlhD4C2 do regulador principal de flagelos, resulta em maior produção de L-aminoácido. Os inventores também descobriram que aumentar a produção de L-aminoácido pode ser atingida usando os genes do operon flhDC em combinação com outros genes da formação de flagelos e cascata de motilidade tal como vhill e fliZ tendo expressão intensificada.

r

E um aspecto da presente invenção fornecer um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar uma bactéria em um meio, em que a dita bactéria pertence à família Enterobacteriaceae e é capaz de produzir L-aminoácido, e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de maneira que a expressão de pelo menos um gene da formação de flagelos e cascata de motilidade seja melhor.

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o dito pelo menos um gene é selecionado do grupo que consiste no(s) gene(s) do operon flhDC, no gene yhjH e no gene fliZ, e combinação destes. ______

r

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita expressão do(s) gene(s) do operon flhDC é melhor modificando uma região de controle de expressão para o(s) gene(s).

r

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita expressão do(s) gene(s) do operon flhDC é melhor aumentando o número de cópias do(s) gene(s).

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita bactéria pertence ao gênero Escherichia.

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita bactéria é Escherichia coli.

r

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita bactéria pertence ao gênero Enterobacter.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que a dita bactéria pertence ao gênero Pantoea.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o gene flhD codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em:

(A) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2;

(B) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de regulador duplo transcricional de ligação ao DNA, de acordo com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e ___________

(C) uma combinação destes.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o gene flhC codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em:

(D) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4;

(E) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de regulador duplo transcricional de ligação ao DNA, de acordo com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e

(F) uma combinação destes. É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o gene yhjH codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em:

(G) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6;

(H) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de fosfodiesterase cíclica-di-GMP, de acordo com a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 6; e

(I) uma combinação destes.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o gene fliZ codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em:

(J) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQID NO: 8; ________

(K) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de regulador, de acordo com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e

(L) uma combinação destes.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido é L-aminoácido aromático.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido aromático é L- fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano.

É um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido é L-aminoácido não aromático.

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido não aromático é L- treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L- glutamina, ácido L-glutâmico, L-prolina, L-arginina e glicina.

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido é L-fenilalanina.

E um aspecto adicional da presente invenção fornecer o método descrito anteriormente, em que o L-aminoácido é L-treonina.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um esquema para a construção do fragmento do DNA de kan-Ptac7.

A figura 2 é um esquema para a construção do fragmento do DNA de cat-Pytyft-yhjH. ________

A figura 3 é um esquema para a construção do fragmento do DNA de cat-Ptac7.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção é descrita em detalhes a seguir.

1. Bactéria de acordo com a presente invenção

O termo “uma bactéria produtora de L-aminoácido” pode significar uma bactéria que apresenta uma capacidade de produzir e causar acúmulo de L-aminoácido em um meio de cultura quando a bactéria é cultivada no meio. A capacidade de produzir L-aminoácido pode significar a capacidade da bactéria produzir um L-aminoácido em um meio, ou as células bacterianas causarem o acúmulo do L-aminoácido até uma extensão que o L- aminoácido pode ser coletado do meio ou das células bacterianas, quando a bactéria é cultivada no meio. O termo “L-aminoácido” pode incluir L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L- glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L- valina.

O termo “L-aminoácido aromático” pode incluir L- fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano. O termo “L-aminoácido não aromático” inclui L-treonina, L-lisina, L-cisteína, L-metionina, L-leucina, L- isoleucina, L-valina, L-histidina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido L- aspártico, L-glutamina, ácido L-glutâmico, glicina, L-prolina e L-arginina. L- treonina, L-lisina, L-cisteína, L-leucina, L-histidina, ácido L-glutâmico, L- fenilalanina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina são particularmente exemplos.

O L-aminoácido pode incluir L-aminoácidos na forma livre e sais destes, tais como sulfatos, cloridratos, carbonatos, sais de amônio, sais de sódio e sais de potássio.

O L-aminoácido pode ser produzido pelo método da presente invenção, tanto sozinho quanto como uma mistura de dois ou mais tipos de L- aminoácidos

A bactéria pode inerentemente ter a capacidade de produzir L- aminoácido ou pode ser modificada para apresentar uma capacidade de produzir L-aminoácido usando um método de mutação ou técnicas de recombinação de DNA, da maneira aqui descrita.

As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae podem incluir bactérias dos gêneros Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Morganella, Pantoea, Salmonella, Yersinia, entre outros, e com a capacidade anteriormente mencionada de produzir L-aminoácido. Especificamente, aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae, de acordo com a taxonomia usada na base de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax.cgi?id=543), podem ser usadas. Exemplos de cepas da família Enterobacteriaceae que podem ser modificadas da maneira aqui descrita incluem uma bactéria do gênero Eseherichia, Enterobaeter ou Pantoea.

As cepas da bactéria Eseherichia que podem ser modificadas para obter bactérias do tipo Escheriehia, de acordo com o assunto em questão revelado atualmente, não são particularmente limitadas e, especificamente, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. podem ser usadas (Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. Em F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. eoli e Salmonella: cellular and molecular biology, 2a ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996). A espécie E. coli é um exemplo particular. Os exemplos específicos de E. coli incluem E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MGl655 (ATCC 47076), entre outros, que são derivados da cepa do protótipo tipo selvagem, a cepa Κ- Ι 2. Estas cepas são disponíveis a partir, por exemplo, do American Type Culture Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Isto é, os números de registro são fornecidos para cada uma das cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando estes números de registro (referência a www.atcc.org). Os números de registro das cepas são listados no catálogo do American Type Culture Collection.

Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, entre outros. Exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis, entre outros. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii com base na análise da seqüência de nucleotídeos de RNAr 16S, etc. Uma bactéria que pertence a qualquer dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada, contanto que seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de Pantoea ananatis é cultivada por técnicas de engenharia genética, a cepa Pantoea ananatis AJl3355 (FERM BP-6614), cepa AJl3356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e derivados destas podem ser usados. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis na base de sequenciamento de nucleotídeo de RNAr 16S, entre outros, da maneira descrita anteriormente.

O termo “uma bactéria móvel” pode significar uma bactéria unicelular ou planctônica que exibe mas, sem limitação, movimento autopropulsor em circunstâncias apropriadas, usando flagelos ou um flagelo que está, ou que está entrando, em uma fase de crescimento definida durante o crescimento em um meio de cultura. Especificamente, aquelas descritas em “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology” (2a ed., Springer, Nova Iorque) podem ser usadas. A frase “uma bactéria móvel”, empregada na presente invenção, também pode significar uma bactéria que possui a capacidade e é capaz de se mover para frente (nadando), através de um meio de cultura com velocidade a qual é menor, igual a, ou maior que as bactérias parentais não modificadas ou tipo selvagem. O termo “uma bactéria móvel” também pode significar uma bactéria que possui a capacidade e é capaz de existir no estado unicelular móvel ou planctônico por um período o qual é menor, igual a, ou maior que as bactérias parentais não modificadas ou tipo selvagem.

A presente invenção pode ser atingida por intensificar ou aumentar a expressão de genes associada com a formação de flagelos e cascata de motilidade.

A frase “genes associados à formação de flagelos e cascata de motilidade” pode significar qualquer gene ou genes envolvidos na formação de flagelos e cascata de motilidade, o qual o código da(s) proteína(s), direta ou indiretamente envolvidos na formação funcional de flagelos, ou que reúnem, estimulam ou prolongam a motilidade das bactérias por meio de vários mecanismos. Exemplos de genes associados com a formação de flagelos e cascata de motilidade podem ser, mas não são limitados para, os genes do operon flhDC que codifica o complexo FII1D4C2 regulador principal de flagelos, que afeta positivamente a formação de flagelos bacterianos. Outros exemplos dos genes associados com a formação de flagelos e cascata de motilidade incluem o gene yhjH, que codifica c-di-GMP PDE, que diminui o agrupamento de c-di-GMP em uma bactéria, e o gene fliZ, que interfere com a atividade de σ .

O termo “flagelos funcionais” pode significar flagelos montados corretamente capazes de rotação ou uma outra locomoção, para permitir que uma bactéria seja considerada uma bactéria móvel.

A frase “pelo menos um gene da formação de flagelos e cascata de motilidade” pode significar um ou mais dos genes da formação de flagelos e cascata de motilidade, e podem incluir, não limitando a, genes do operon flhDC, os genes yhjH e fliZ em qualquer combinação”.______

A frase “o operon flhDC, genes yhjH e fliZ em qualquer combinação” pode significar tanto um gene selecionado do operon flhDC, genes yhjH e fliZ, quanto dois ou mais genes diferentes selecionados do operon flhDC, genes yhjH e fliZ, mas não limitada a estas combinações.

A frase “modificado de maneira que a expressão de pelo menos um gene da formação de flagelos e cascata de motilidade seja intensificada” pode significar que o número das moléculas codificadas pelo(s) gene do operon flhDC, e/ou o gene yhjH, e/ou o gene fliZ por célula aumentam, ou a atividade por molécula (pode ser referida como uma atividade específica) da proteína codificada por estes genes melhora, comparado a uma cepa não modificada, tal como uma cepa tipo selvagem ou parental. A bactéria pode ser modificada de maneira tal que a atividade da proteína por célula aumente em 150 % ou mais, 200 % ou mais em um outro exemplo, 300 % ou mais em um outro exemplo, da atividade de uma cepa não modificada. Exemplos de uma cepa não modificada que funciona como uma referência para a comparação anterior, tal como uma cepa tipo selvagem de um microrganismo que pertence à família Enterobacteriaceae, incluem, por 5 exemplo, a cepa E. coli MG1655 (ATCC 47076), cepa W3110 (ATCC 27325), cepa Pantoea ananatis AJ13335 (FERM BP-6614), entre outros.

Os métodos que podem ser usados para intensificar expressão do(s) gene(s) ou genes do operon incluem aumentar o número das cópias do(s) gene(s) ou genes do operon, e/ou introduzir o(s) gene(s) ou genes do 10 operon em um vetor que é capaz de aumentar o número de cópias do(s) gene(s) ou genes do operon em uma bactéria da família Enterobacteriaeeae. Para melhorar a expressão do(s) gene(s), o número de cópias do gene pode ser aumentado em células que utilizam, por exemplo, técnicas de recombinação de gene. O número de cópias do gene pode ser aumentado ligando um 15 fragmento de DNA que contém o gene em um vetor que funciona na bactéria hospedeira, tal como um vetor multicópias, para preparar um DNA recombinante e introduzi-lo na bactéria para transformar a bactéria. Exemplos de vetores replicáveis autonomamente em células de E. coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG e vetores da 20 série pACYC são disponíveis pela Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW219 é disponível pela Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV29 (disponível pela Takara Bio Inc.), entre outros.

Intensificação da expressão do(s) gene(s) ou genes do operon também pode ser atingida introduzindo múltiplas cópias do(s) gene(s) ou 25 genes do operon no DNA cromossômico de uma bactéria, por exemplo, por recombinação homóloga, integração de Mu, ou similares. A recombinação homóloga pode ser realizada usando uma seqüência a qual é presente em múltiplas cópias no DNA cromossômico. As seqüências com múltiplas cópias no DNA cromossômico incluem, mas sem limitação, DNA repetitivo ou repetições invertidas na extremidade de um elemento transponível. Além disso, é possível incorporar o(s) gene(s) ou genes do operon em um transposon, e permitir que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias do(s) gene(s) ou genes do operon no DNA cromossômico. Usando a integração Mu, até 3 cópias do gene podem ser introduzidas no DNA cromossômico durante uma ação simples. A melhoria da expressão do(s) gene(s) ou genes do operon também pode ser atingida colocando os DNAs no controle de um promotor potente. Por exemplo, o promotor lae, o promotor trp, o promotor tre, o promotor tae, os promotores Pr ou o Pl do fago lambda IO são todos conhecidos por serem promotores potentes. Os promotores potentes que fornecem um nível elevado da expressão de gene em uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae podem ser usados. Alternativamente, o efeito de um promotor pode ser melhorado, por exemplo, introduzindo uma mutação na região promotora do(s) gene(s) ou genes do operon no cromossomo bacteriano para obter uma função de promotor mais forte, resultando assim em maior nível de transcrição do(s) gene(s) ou genes do operon localizados à jusante do promotor. Além do mais, sabe-se que a substituição de vários nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon inicial, especialmente as seqüências imediatamente à montante do códon inicial, afetam muito a capacidade de tradução do RNAm. Por exemplo, uma variação de 20 vezes nos níveis de expressão foi observada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos que antecedem o códon inicial (Gold L. et al., Annu. Rev. Mierobiol., 1981: 35, 365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984: 3, 623-629). O uso de um promotor potente pode ser combinado com a multiplicação de cópias de gene.

Os métodos para a preparação de DNA plasmidial, digestão, ligação e transformação de DNA, seleção de um oligonucleotídeo como um oligonucleotídeo iniciador e similares, podem ser métodos comuns bem conhecidos pelos versados na técnica. Estes métodos são descritos, por

20

25 exemplo, em Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Os métodos para clonagem molecular e expressão heteróloga de gene são descritos em Bemard R. Glick, Jack J. Pastemak e Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principies and applications of recombinant DNA”, 4a ed., Washington, D.C: ASM Press (2009); Evans Jr., T.C. e Xu M.-Q., “Heterologous gene expression in E. coli”, Ist ed., Humana Press (2011).

O nível da expressão de gene pode ser determinado medindo a quantidade de RNAm transcrito do gene usando vários métodos conhecidos, incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativo e similares. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos, incluindo SDS-PAGE seguido por ensaio de imuno blotting (análise Western blotting) e similares.

O gene da formação de flagelos e cascata de motilidade inclui um gene selecionado do operon flhDC, genes yhjH e fliZ.

O operon flhDC inclui os dois genes que são flhD e flhC.

O gene flhD codifica o regulador FlhD duplo transcricional de ligação ao DNA (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, número de entrada bl892). O gene flhD (número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 1.975.871 a 1.976.221, complemento; ID do gene: 945442) é localizado entre os genes flhC e insB no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene flhD e a seqüência de aminoácidos da proteína FlhD codificada pelo gene flhD são mostradas em SEQ ID NO: I e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

O flhC gene codifica o regulador FlhC duplo transcricional de ligação ao DNA (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, número de entrada bl891). O gene flhC (número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 1.975.290 a 1.975.868, complemento; ID do gene: 947280) está localizado entre os genes motA e flhD no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene flhC e a seqüência de aminoácidos da proteína FlhC codificada pelo gene flhC são mostradas em SEQID NO: 3 e SEQID NO: 4, respectivamente.

O gene yhjH codifica fosfodiesterase cíclica-di-GMP YhjH 5 (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, número de entrada b3525). O gene yhjH (número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 3.676.443 a 3.677.210, complemento; ID do gene: 948042) está localizado entre os genes yhjG e kdgK no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene yhjH e a seqüência de 10 aminoácidos do YhjH proteína codificada pelo gene yhjH são mostradas em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.

O gene fliZ codifica o antagonista RpoS e o possível regulador da atividade FliZ de FliA (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, número de entrada bl921). O gene fliZ (número de acesso ao 15 Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 1.998.497 a 1.999.048, complemento; ID do gene: 946833) está localizado entre os genes fliY e fliA no cromossomo de E. coli K-12. A seqüência de nucleotídeos do gene fliZ e a seqüência de aminoácidos da proteína FliZ codificada pelo gene fliZ são mostradas em SEQ ID NO: 7 e SEQID NO: 8, respectivamente.

Uma vez que podem existir algumas diferenças na seqüência

de DNA entre os gêneros ou cepas da família Enterobacteriaceae, cada um dos genes do operon flhDC e dos genes yhjH e fliZ a serem melhorados no cromossomo não é limitado ao gene mostrado em SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7, mas pode incluir um gene homólogo à SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7, que codifica 25 um variante da proteína FlhD, FlhC, YhjH ou FliZ. O termo “proteína variante” pode significar uma proteína que apresenta mudanças na seqüência, quer sejam deleções, inserções, adições substituições, ou inversões de um ou vários resíduos de aminoácido, mas ainda mantém a atividade similar na proteína FlhD, FlhC, YhjH ou FliZ, respectivamente. O número de mudanças na proteína variante depende da posição na estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de resíduos de aminoácido. Pode ser 1 a 30, em um outro exemplo 1 a 15, e em um outro exemplo 1 a 5 em SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8.

As deleções, inserções, adições ou substituições de um ou vários resíduos de aminoácido podem ser mutação(s) conservativa(s), de maneira tal que a atividade da proteína codificada pelo gene do operon flhDC e dos genes yhjH e fliZ seja mantida. Uma mutação conservativa representativa pode ser uma substituição conservativa. A substituição conservativa pode ser uma substituição em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se for um aminoácido com grupo hidroxila. Os exemplos específicos de substituições que são considerados substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gin, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin; substituição de Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile; substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys; substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai. A mutação de tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou similar, de resíduos de aminoácido, da maneira descrita anteriormente, também pode incluir uma mutação de ocorrência natural que baseia-se nas diferenças individuais, diferenças nas espécies de microrganismos com os genes do operon flhDC e os genes yhjH e fliZ (mutante ou variante), entre outros.

Estas mudanças no variante podem ocorrer em regiões da proteína que não são importantes para a função da proteína. Isto é em decorrência de alguns aminoácidos apresentarem muita homologia uns com os outros, de maneira tal que a estrutura tridimensional ou a atividade não seja afetada por uma mudança como esta. Portanto, o variante de proteína codificado por cada um dos genes do operon flhDC, ou o gene yhjH ou fliZ, pode apresentar uma homologia de não menos que 80 %, em um outro exemplo não menos que 90 %, em um outro exemplo não menos que 95 %, em um outro exemplo não menos que 97 %, ou em um outro exemplo não menos que 99 % com relação às seqüências de aminoácido completas mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ou 8, contanto que a funcionalidade das proteínas FlhD ou FlhC, ou do complexo FII1D4C2 montado a partir das proteínas FlhD e FlhC e da proteína YhjH ou FlizH, da maneira descrita anteriormente, seja mantida. A homologia entre duas seqüências de aminoácido pode ser determinada usando os métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa de computador BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), que calcula três parâmetros: classificação, identidade e similaridade.

Além do mais, cada um dos genes do operon flhDC e dos genes yhjH e fliZ pode ser um variante que hibridiza em condições severas nas seqüências de nucleotídeos complementares às seqüências mostradas em SEQ ID NOs: 1, 3, 5 ou 7, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeos em condições severas, contanto que codifique a proteína funcional FlhD ou FlhC, ou o complexo FII1D4C2 montado a partir das proteínas FlhD e FlhC, ou a proteína YhjH ou FlizH antes da inativação. As “condições severas” incluem aquelas nas quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido com homologia de não menos que 80 %, em um outro exemplo não menos que 90 %, em um outro exemplo não menos que 95 %, em um outro exemplo não menos que 97 % e em um outro exemplo não menos que 99 %, é formado e um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido com homologia menor que o anterior não é formado. Por exemplo, as condições severas podem ser exemplificadas lavando uma vez ou mais, ou em um outro exemplo, duas ou três vezes em uma concentração de sal de SSC IX, SDS 0,1 %, ou em um outro exemplo, SSC 0,1X, SDS 0,1 % a 60°C ou, em um outro exemplo, a 65°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para manchar e, como uma regra, pode ser aquela recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada da lavagem para a membrana de náilon carregada positivamente Amersham Hybond™-N+ (GE Healthcare) em condições severas é 15 minutos. A etapa de lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Como a sonda, uma parte da seqüência complementar às seqüências mostradas em SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7 também pode ser usada. Uma sonda como esta pode ser produzida por PCR usando oligonucleotídeos como oligonucleotídeos iniciadores, preparados com base nas seqüências mostradas em SEQ ID NO: 1, 3, 5 ou 7, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos como um molde. Recomenda-se que o tamanho da sonda seja >50 bp; ela pode ser selecionada adequadamente dependendo das condições de hibridização, e tem em geral 100 bp a I kbp. Por exemplo, quando um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem após a hibridização podem ser exemplificadas por SSC 2X, SDS 0,1 % a 5O0C, ou a 60°C ou, em um outro exemplo, a 65°C.

Como os genes que codificam as proteínas FlhD, FlhC, YhjH e FliZ de E. coli já foram elucidados (ver anteriormente), eles e suas proteínas variantes podem ser obtidas por PCR (reação em cadeia da polimerase; referência a White T.J. et al., Trends Genet., 1989: 5, 185-189) que utiliza oligonucleotídeos iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeos do gene flhD, flhC, yhjH e fliZ, respectivamente. Os genes que codificam as FlhD, FlhC, YhjH e FliZ proteínas, ou suas proteínas variantes de outros microrganismos, podem ser obtidos em uma maneira similar.

Os métodos para conferir a capacidade de produzir um L- aminoácido, tais como L-lisina, L-treonina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-metionina, L-alanina, L-isoleucina e/ou L-homoserina, para as bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, e métodos para melhorar uma capacidade de produzir os L-aminoácidos citados anteriormente em bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae são descritos a seguir.

Para conferir a capacidade de produzir um L-aminoácido, os métodos empregados convencionalmente no cultivo de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Eseherichia podem ser usados (ver “ Amino acid fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), pp.77-100, Ia ed., 1986). Tais métodos incluem a aquisição das propriedades de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente ao análogo de L-aminoácido, ou um mutante de regulação metabólica, ou a construção de uma cepa recombinante de maneira tal que expresse uma enzima da biossíntese de L-aminoácido. Aqui, no cultivo de bactéria produtora de L-aminoácidos, uma ou mais das propriedades anteriormente descritas, tais como auxotrofia, resistência ao análogo, e mutação da regulação metabólica, podem ser transmitidas. A expressão de enzima(s) de biossíntese de L-aminoácido pode ser melhorada sozinha ou em combinações de duas ou mais. Além do mais, os métodos de transmitir propriedades tais como um auxotrofia, resistência à análogo, ou mutação da regulação metabólica, podem ser combinados com o reforço das enzimas de biossíntese.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente ao análogo de L-aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica com a capacidade de produzir um L-aminoácido pode ser obtida submetendo uma cepa precursora ou tipo selvagem à mutagênese convencional, tal como a exposição aos raios X ou irradiação de UV, ou tratamento com um agente mutagênico tais como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e etil metanossulfonato (EMS), selecionando cepas que exibem autotrofia, resistência à análogos, ou uma 5 mutação da regulação metabólica e que também apresentam a capacidade de produzir um L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

Bactérias produtoras de L-treonina

Os exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para direcionar as bactérias produtoras de L-treonina incluem, mas sem limitação, 10 cepas que pertencem ao gênero Eseherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (patente U.S. 5.175.107, patente U.S. 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (patente U.S.5.631.157), E. coli NRRL-21593 (patente U.S. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (patente U.S. 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (patente U.S. 5.376.538), E. coli 15 MG442 (Gusyatiner M. et al., Genetika (em Russo), 1978: 14, 947-956), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) e similares. ____

O cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, bem como assimila sacarose, e o gene ilvA apresenta uma mutação fraca. Esta cepa também apresenta uma mutação no gene rhtA, que transmite resistência a altas 20 concentrações de treonina ou homoserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido inserindo um operon thrA*BC que inclui um gene mutante thrA em um vetor derivado de RSF1010. Este gene mutante thrA codifica desidrogenase de aspartoquinase homoserina I, que dessensibilizou substancialmente a inibição da resposta por treonina (patente 25 U.S. 5.175.107). A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987, no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Federação Russa, 117105 Moscou, Nagatinskaya Street 3-A) com o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Federação Russa, 117545 Moscou, Ist Dorozhny proezd, I) em 7 de abril de 1987, com o número de acesso B-3996. E. coli VKPM B-5318 (EP0593792B1) também pode ser usada como uma cepa precursora para fornecer bactérias produtoras de L- treonina. A cepa B-5318 é prototrófica com relação a isoleucina, e um repressor Cl de fago lambda sensível à temperatura e o promotor PR substituem a região regulatória do operon de treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1990 com o número de acesso de VKPM B-5318.

A bactéria pode ser modificada adicionalmente para melhorar a expressão de um ou mais dos seguintes genes (RU2275424):

o gene mutante thrA que codifica desidrogenase de aspartoquinase I e homoserina resistente à inibição da resposta por L-treonina; o gene thrB que codifica homoserina quinase; o gene thrC que codifica treonina sintase;

o gene rhtA que codifica uma proteína do sistema de efluxo de treonina e homoserina (um transportador da membrana interna); o gene asd que codifica aspartate-P-semialdeído desidrogenase; e o gene aspC que codifica aspartate aminotransferase.

O gene thrA que codifica desidrogenase I de aspartoquinase I e homoserina de E. coli foi elucidado (número de entrada de KEGG b0002; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 337 a 2.799; ID do gene: 945803). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12.

O gene thrB que codifica homoserina quinase de E. coli foi elucidado (número de entrada KEGG b0003; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 2.801 a 3.733; ID do gene: 947498). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase de E. coli foi elucidado (número de entrada KEGG b0004; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 3.734 a 5.020; ID do gene: 945198). O gene thrC está localizado entre os genes thrB e yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um operon único de treonina thrABC. Para melhorar a expressão do operon treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é removida desejavelmente do operon (W02005049808A1, W02003097839A1).

O gene mutante thrA que codifica a desidrogenase I de aspartoquinase I e homoserina resistente à inibição da resposta por L-treonina, bem como, os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um operon a partir do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli VKPM B-3996 produtora de treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na patente U.S. 5.705.371.

O gene rhtA que codifica uma proteína do sistema de efluxo de treonina e homoserina (um transportador da membrana interna) de E. coli foi elucidado (número de entrada KEGG b0813; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 848.433 a 849.320, complemento; ID do gene: 947045). O gene rhtA está localizado entre os genes dps e ompX no cromossomo de E. coli K-12, próximo ao operon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao genQybiF (número de entrada KEGG B0813).

O gene asd que codifica aspartate-P-semialdeído desidrogenase de E. coli foi elucidado (número de entrada KEGG b3433; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 3.571.798 a 3.572.901, complemento; ID do gene: 947939). O gene asd está localizado entre os genes glgB e gntU na mesma fita (gene yhgN na fita oposta) no cromossomo de E. coli K-12.

Igualmente, o gene aspC que codifica aspartato aminotransferase de E. coli foi elucidado (número de entrada KEGG b0928; número de acesso ao Banco de Genes NC_000913.2; posições do nucleotídeo: 983.742 a 984.932, complemento; ID do gene: 945553). O gene aspC está localizado entre o gene ycbL na fita oposta e o gene ompF na mesma fita no cromossomo de E. coli K-12.

Além do mais, as bactéria produtoras de L-treonina podem apresentar atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que age negativamente na síntese ou acúmulo de L-treonina. Os exemplos de tais enzimas incluem treonina desidrogenase codificada pelo gene tdh, entre outros (W02009022754A1).

A cepa de E. coli Β-3996Δ(ordL-narW) também pode ser usada como uma cepa precursora para fornecer bactérias produtoras de L- treonina. A cepa B-3996à(ordL-narW) foi denominada AG7843 e depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) 15 (Rússia, 117545 Moscou, I Dorozhny proezd 1) em 21 de maio 2010 com o número de acesso B-10647, e a forma de depósito nacional foi então convertida no depósito internacional nas cláusulas de Tratado de Budapeste em 19 de julho de 2012.

Bactérias Produtoras de L-Lisina As bactérias produtoras de L-Lisina e os métodos para

construí-las são exemplificados a seguir.

Os exemplos de cepas com capacidade de produzir L-Iisina incluem, por exemplo, cepas resistentes ao análogo de L-Iisina e cepas mutantes de regulação metabólica. Os exemplos de análogos de L-Iisina 25 incluem, mas sem limitação, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2- aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metilisina, α-clorocaprolactam, entre outros. As cepas mutantes com resistência àqueles análogos de lisina podem ser obtidas submetendo uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Os exemplos específicos de bactérias produtoras de L-Iisina incluem E. coli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, ver patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-18596 e patente U.S. 4.346.170), capa E. coli VL611 (patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-189180), entre outros. Como uma E. coli produtora de L-lisina, a cepa WC196 também pode ser usada (ver publicação de patente internacional W096/17930).

Além do mais, uma bactéria produtora de L-lisina também pode ser construída aumentando a atividade de uma enzima do sistema de biossíntese de L-lisina. A atividade de uma enzima como esta pode ser maior aumentando o número de cópias do gene que codifica a enzima nas células, ou modificando uma seqüência de controle de expressão destas. O aumento do número de cópias de um gene que codifica uma enzima do sistema de biossíntese de L-lisina, e a modificação de uma seqüência de controle de expressão desta, podem ser mantidos pelos mesmos método para os genes gltP e gltS descritos anteriormente.

______Os exemplos de genes que codificam enzimas biossintéticas de

L-lisina incluem genes que codificam enzimas da via de diaminopimelato, tais como o gene de diidrodipicolinato sintase (dapA), gene de aspartoquinase (IysC), gene de diidrodipicolinato redutase (dapB), gene de diaminopimelato descarboxilase (IysA), gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (W096/40934 para todos os genes anteriores), gene de fosfoenolpirvato carboxilase (ppc) (patente Japonesa Aberta ao Público 60-87788), gene de aspartato aminotransferase (aspC) (publicação de patente Japonesa (Kokoku) No. 6-102028), e gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (WOOO/61723), e genes que codificam enzimas da via do ácido aminoadípico, tal como o gene de homoaconitrato hidratase (patente Japonesa Aberta ao Público 2000-157276). Além disso, a cepa bacteriana pode apresentar um maior nível de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (patente Européia submetida à inspeção pública 1170376), o gene que codifica nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (patente U.S. 5.830.716), o gene ybjE que codifica uma proteína com atividade de excreção de L-lisina (W02005/073390), o gene que codifica glutamato desidrogenase (gdhA) (Gene 23:199-209, 1983), ou qualquer combinação aleatória destes.

As abreviações para os genes são mostradas entre parênteses. Entre os genes anteriormente mencionados, o gene ybjE é um exemplo.

Sabe-se que a diidrodipicolinato sintase tipo selvagem derivada de E. coli é submetida à inibição da resposta por L-lisina, e sabe-se que a aspartoquinase tipo selvagem derivada de E. coli é submetida à supressão e inibição da resposta por L-lisina. Portanto, quando o gene dapA e o gene IysC são usados, os genes que codificam enzimas mutantes dessensibilizadas para a inibição da resposta por L-lisina podem ser usados. Os exemplos de DNA que codificam uma diidrodipicolinato sintetase mutante, dessensibilizados para a inibição da resposta por L-lisina, incluem um DNA que codifica uma proteína como esta com uma seqüência de aminoácidos na qual o resíduo de histidina na posição 118 é substituído por resíduo de tirosina. Os exemplos de DNA que codificam uma aspartoquinase mutante, dessensibilizados para a inibição da resposta por L-lisina, incluem um DNA que codifica uma proteína AKIII com uma seqüência de aminoácidos em que o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323, e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por isoleucina, asparagina e resíduos de isoleucina, respectivamente (para estes mutantes, ver patentes U.S. 5.661.012 e 6.040.160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos por mutagênese sítio específico usando PCR, ou similar.

Sabe-se que os plasmídeos de uma ampla faixa de hospedeiro RSFD80, pCABl e pCABD2 contêm um gene dapA mutante que codifica uma diidrodipicolinato sintase mutante, e um gene IysC mutante que codifica uma aspartoquinase mutante (patente U.S. 6.040.160). A cepa de E. coli JMl09 transformada com este plasmídeo foi denominada AJl2396 (patente U.S. 6.040.160), e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente National Institute of 5 Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) em 28 de outubro de 1993, e determinada com um número de acesso de FERM P-13936, e o depósito foi então convertido em um depósito internacional nas regras de Tratado de Budapeste em 1 de novembro de 1994, e determinado com um número de acesso de FERM BP-4859. O RSFD80 10 pode ser obtido da cepa AJ12396 por um método convencional.

Além do mais, bactérias produtoras de L-aminoácido podem apresentar nenhuma ou atividade reduzida de uma enzima que catalisa uma reação, que causa uma ramificação da via de biossíntese de L-aminoácido e resulta na produção de um outro composto. Igualmente, as bactérias podem 15 apresentar nenhuma ou atividade reduzida de uma enzima que age negativamente na síntese ou acúmulo de L-aminoácido. Os exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homoserina desidrogenase, lisina descarboxilase (cadA, IdcC), enzima málica, entre outros, e as cepas nas quais as atividades destas enzimas são reduzidas ou 20 eliminadas são reveladas em W095/23864, W096/17930, W02005/010175, entre outros.

A expressão de ambos os genes cadA e IdcC, que codificam a lisina descarboxilase, pode ser reduzida a fim de diminuir ou eliminar a atividade de lisina descarboxilase. A expressão de ambos os genes pode ser reduzida, por exemplo, pelo método descrito em W02006/078039.

A fim de reduzir ou eliminar as atividades das enzimas, uma mutação pode ser introduzida nos genes que codificam as enzimas no genoma por um método de mutagênese conhecido, ou técnica de recombinação de gene, de maneira tal que as atividades intracelulares das enzimas sejam reduzidas ou eliminadas. Tal introdução de uma mutação pode ser atingida, por exemplo, usando recombinação genética para eliminar os genes que codificam as enzimas no genoma, ou para modificar uma seqüência de controle de expressão tal como uma seqüência promotora ou a seqüência Shine-Dalgamo (SD). Uma mutação também pode ser introduzida para transmitir uma substituição de aminoácido (mutação pontual), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de deslocamento de quadro que resulta na adição ou deleção de um ou dois nucleotídeos nas regiões que codificam as enzimas no genoma, ou que eliminam parcialmente ou totalmente os genes (J. Biol. Chem., 272:8611-8617, 1997).

As atividades enzimáticas também podem ser reduzidas ou eliminadas construindo um gene que codifica uma enzima mutante, em que a região codificante é totalmente ou parcialmente eliminada, e substituindo-o por um gene normal no genoma por recombinação homóloga ou similar, ou introduzindo um transposon ou o fator IS no gene. Por exemplo, a fim de introduzir uma mutação que diminui ou elimina as atividades das enzimas anteriormente mencionadas por recombinação genética, os métodos a seguir podem ser usados. Um gene mutante é preparado modificando parte da seqüência de um gene objetivo, de maneira tal que não codifique uma enzima que pode funcionar normalmente, e a seguir uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para causar recombinação de um gene correspondente no genoma, com o gene mutante para substituir o gene mutante pelo gene objetivo no genoma. Os exemplos de tal substituição de gene que usa recombinação homóloga incluem métodos de usar um DNA linear, tal como o método denominado integração direcionada Red (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 2000, 97:6640-6645), e o método que utiliza a integração direcionada Red em combinação com um sistema incisivo derivado do fago λ (Cho E.H. et al., J. BacterioL, 2002, 184:5200-5203) (referência a W02005/010175), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (patente U.S. 6.303.383, patente Japonesa Aberta ao Público 05-007491), entre outros. Além do mais, tal mutagênese sítio específico, que baseia-se na substituição de gene usando recombinação homóloga da maneira descrita anteriormente, também pode ser realizada usando um plasmídeo que é incapaz de se replicar em um hospedeiro.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-lisina incluem a cepa de E. coli WC196AcadAAldcC/pCABD2 (W02006/078039). A cepa foi construída introduzindo o plasmídeo pCABD2 que contém os genes de biossíntese de lisina (patente U.S. 6.040.160) na cepa WC196, com os genes cadA e IdcC interrompidos, que codificam a lisina descarboxilase. A cepa WC196 foi cultivada a partir da cepa W3110, que foi derivada de E. coli Κ- Ι 2, substituindo o gene IysC tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 por um gene IysC mutante, que codifica uma aspartoquinase III mutante, em que a treonina na posição 352 foi substituída por isoleucina, resultando na dessensibilização da inibição da resposta desta por L-lisina (patente U.S. 5.661.012), e conferindo resistência à AEC para a cepa resultante (patente U.S. 5.827.698). A cepa WC196 foi determinada E. coli AJ13069, depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994, e determinada com um número de acesso de FERM P- 14690. A seguir, foi convertida em um depósito internacional nas regras do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e determinada com um número de acesso de FERM BP-5252 (patente U.S. 5.827.698). A própria cepa WC196AcadAAldcC também é uma bactéria produtora de L-lisina exemplar. A WC196AcadAAldcC foi determinada AJl 10692, e depositada no National Institute of Bioscience and Human-Teehnology, Ageney of Industrial Science and Technology (atualmente a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-

1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional, e determinada com um número de acesso de FERM BP-11027.

O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de E. coli que codifica uma diidrodipicolinato sintase (DDPS), com uma mutação para a dessensibilização da inibição da resposta por L-lisina, um gene IysC mutante derivado de E. coli que codifica aspartoquinase III com uma mutação para a dessensibilização da inibição da resposta por L-lisina, o gene dapB derivado de E. coli que codifica diidrodipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum que codifica diaminopimelato desidrogenase._______________

Bactérias produtoras de L-cisteína

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-cisteína incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Eseherichia, tal como E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos cysE, que codificam serina acetiltransferases resistentes à realimentação (patente U.S. 6.218.168, pedido de patente Russa 2003121601); E. coli W3110 com gene expresso que codifica proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para as células (patente U.S. 5.972.663); cepas de E. coli com menor atividade de cisteína dessulfoidrase (JPl 1155571A2); E. coli W3110 com melhor atividade de um regulador transcricional positivo para a regulação de cisteína codificada pelo gene cysB (W00127307A1) e similares.

Bactérias Produtoras de L-Ieucina Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-Ieucina incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Eseherichia, tais como cepas de E. coli resistentes à leucina (por exemplo, o cepa 57 (VKPM B-7386, patente U.S. 6.124.121)) ou análogos de 5 leucina, incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5- trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); as cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em W096/06926; E. coli H- 9068 (JP 8-70879 A) e similares.

A bactéria pode ser melhorada pela intensificação da 10 expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Os exemplos incluem genes do operon leuABCD, que podem ser representados por um gene IeuA mutante que codifica isopropilmalato sintase livre da inibição da resposta por L-leucina (patente U.S. 6.403.342). Além disso, a bactéria pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais 15 genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido a partir da célula bacteriana. Os exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes

ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias Produtoras de L-histidina

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias 20 produtoras de L-histidina incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como a cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677); cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116 - B12121 (patente U.S. 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP- 6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (patente U.S. 6.344.347); E. coli H-9341 25 (FERM BP-6674) (EP1085087); E. coli AI80/pFM201 (patente U.S. 6.258.554) e similares.

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-histidina incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-histidina são melhores. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil AMP cicloidrolase (hisl), fosforribosil-ATP pirofosfoidrolase (hisIE), fosforribosilformimino-5- aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (,hisH), histidinol fosfato aminotransferase (his C), histidinol fosfatase (hisB), histidinol desidrogenase (hisD), entre outros.

Sabe-se que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina e, portanto, uma capacidade de produzir L-histidina também pode ser melhorada introduzindo uma mutação que confere resistência à inibição da resposta em ATP fosforribosiltransferase (patentes Russas 2003677 e 2119536).

Os exemplos específicos de cepas com uma capacidade de produzir L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048, que foram introduzidas com um vetor que carrega um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), as cepas de E. coli introduzidas com rht, um gene para uma exportação de aminoácido (EP1016710A), a cepa de E. coli 80 transmitida com resistência à sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3- alanina e estreptomicina (VKPM B-7270, patente Russa 2119536), entre outros.

r

Bactérias Produtoras de Acido L-glutâmico

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tal como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica com relação a L-isoleucina e L-treonina, com mutações nos genes thrC e ilvA (patente U.S. 4.278.765). Um alelo tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago Pl crescido nas células da cepa de E. coli Kl2 (VKPM B-7) tipo selvagem. Em função disso, uma cepa VL334thrC+ auxotrófica com relação à L-isoleucina (VKPM B- 8961), que é capaz de produzir ácido L-glutâmico, foi obtida.

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas sem limitação, cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de 5 ácido L-glutâmico é melhor. Os exemplos de tais genes incluem genes que codificam glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase ([glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), 10 piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmí), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (<tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfltA, pfkB), e glucose fosfato isomerase (pgi).

Os exemplos de cepas modificadas de maneira que a expressão

do gene de citrato sintetase, o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase, jg/ou^ o gene de glutamato desidrogenase gene são melhores incluem aqueles revelados em EP1078989B1, EP955368B1 e EP952221B1.

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer as bactérias 20 produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas com atividade reduzida ou eliminada de uma enzima que catalisa a síntese de um composto sem ser ácido L-glutâmico, ramificando a partir de uma via de biossíntese de ácido L-glutâmico. Os exemplos de tais enzimas incluem isocitrato liase (aceÂ), α-cetoglutarato desidrogenase (sueA), fosfotransacetilase (pta), 25 acetato quinase (ack), aceto-hidróxi ácido sintase (UvG), acetolactato sintase (ilvl), formato acetiltransferase (pf7), lactate desidrogenase (Jdh), e glutamato descarboxilase (gadAB). As bactérias que pertencem ao gênero Escherichia deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, ou com uma atividade de a-cetoglutarato desidrogenase reduzida, e métodos para obtê-las são descritos nas patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, estas cepas incluem as seguintes:

E. coli W311 OsucA: :KmR E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E. coli W311 OsucA: :KmR é uma cepa obtida interrompendo o gene α-cetoglutarato desidrogenase (daqui por diante referido como “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em a- cetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactéria produtora de ácido L-glutâmico incluem aquelas que pertencem ao gênero Escherichia e apresentam resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Estas cepas também podem ser deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJl3199 (FERM BP-5807) (patente U.S. 5.908.768). FFRM P-12379. que apresenta adicionalmente pouca capacidade de decompor ácido L-glutâmico (patente U.S. 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (patente U.S. 6.110.714) e similares.

Os exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem cepas mutantes que pertencem ao gênero Pantoea, que são deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou apresentam uma menor atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, e podem ser obtidas da maneira descrita anteriormente. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356. (patente U.S. 6.331.419). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998, com um número de acesso de FERM P-16645. A seguir, foi convertida em um depósito internacional nas regras de Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJl3356 é deficiente na atividade de a- 5 cetoglutarato desidrogenase como um resultado da interrupção do gene da subunidade aKGDH-El (sucÁ). A cepa anterior foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis, com base no sequenciamento de 10 nucleotídeo de RNAr 16S, entre outros. Embora o depósito anteriormente mencionado de AJ133 56 tenha sido realizado como Enterobaeter agglomerans, para os propósitos desta especificação, eles são descritos como Pantoea ananatis.

Bactérias Produtoras de L-fenilalanina Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias

produtoras de L-fenilalanina incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Eseherichia, tais como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) que carrega gene pheA34 mutante (patente U.S. 5.354.672); E. coli MWEClOl-b 20 (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (patente U.S. 4.407.952). Igualmente, como uma cepa precursora, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K- 12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR- 25 aroG4, pACMAB], denominada AJ 12604 (FERM BP-3579), pode ser usada (EP 488424 BI). Além do mais, as bactérias produtoras de L-fenilalanina, que pertencem ao gênero Eseherichia com uma melhor atividade da proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG, também podem ser usadas (pedidos de patente U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al). Bactérias Produtoras de L-triptofano

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer as bactérias produtoras de L-triptofano incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Eseherichia podem ser usadas, tais como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientes na triptofanoil- RNAt sintetase codificada pelo gene trpS mutante (patente U.S. 5.756.345); E. coli SVl64 (pGH5) com um alelo de serA que codifica fosfoglicerato desidrogenase livre da inibição da resposta por serina, e um alelo de trpE que codifica antranilato sintase livre da inibição da resposta por triptofano (patente U.S. 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanoase (patente U.S. 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, em que uma capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é melhor (W09708333, patente U.S. 6.319.696), e similares. As bactérias produtoras de L-triptofano, que pertencem ao gênero Escherichia com uma melhor atividade da proteína

_ identificada codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG, também podem ser

usadas (pedidos de patente U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem cepas em que uma ou mais 20 atividades da enzimas selecionadas a partir de antranilato sintase, fosfoglicerato desidrogenase e triptofano sintase são melhores. A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são ambas submetidas à inibição da resposta por L-triptofano e L-serina, de maneira tal que uma mutação que dessensibiliza a inibição da resposta possa ser introduzida nestas enzimas. Os 25 exemplos específicos de cepas com uma mutação como esta incluem uma E. coli SVl64 que carrega antranilato sintase dessensibilizada, e uma cepa transformante obtida introduzindo na E. coli SVl64 o plasmídeo pGH5 (WO 94/08031), que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para realimentação. Os exemplos de cepas precursoras para fornecer as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem cepas nas quais o operon de triptofano, que contém um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizada foi introduzido (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, patente U.S. 4.371.614). Além do mais, a capacidade de produção do L-triptofano pode ser conferida intensificando a expressão de um gene que codifica triptofano sintase, entre os operons de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consistem em subunidades α e β, que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser melhor pela melhora da expressão do operon de isocitrato liase-malato sintase (W02005/103275).

Bactérias Produtoras de L-prolina

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao gênero Eseherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). A bactéria pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Os exemplos de tais genes para bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB que codifica glutamato quinase, cuja inibição da resposta por L-prolina é dessensibilizada (patente DE 3127361). Além disso, a bactéria pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L- aminoácido a partir da célula bacteriana. Tais genes são exemplificados pelos genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

Os exemplos de bactérias que pertencem ao gênero Eseherichia, que apresentam uma atividade de produzir L-prolina, incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (patente GB 2075056), VKPM B-8012 (pedido de patente Russa 2000124295), plasmídeos mutantes descritos na patente DE 3127361, plasmídeos mutantes descritos por Bloom F.R. et al (O 15° Miami winter symposium, 1983, p.34) e similares.

Bactérias Produtoras de L-arginina

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-arginina incluem, mas sem limitação, cepas que pertencem ao 5 gênero Eseherichia, tais como a cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (pedido de patente U.S. 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas que carregam N- acetilglutamato sintase mutante (pedido de patente Russa 2001112869), a cepa E. coli 382 (VKPM B-7926) (EP1170358A1), uma cepa produtora de arginina na qual o gene argA que codifica N-acetilglutamato sintetase é aqui é 10 introduzido (EP11703 61A1), e similares.

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-arginina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina são melhores. Os exemplos de tais genes incluem genes que codificam N- 15 acetilglutamil fosfato redutase (argC), omitina acetil transferase (argJ), N- acetilglutamato quinase (argB), acetilomitina transaminase (argD\ omitina carbamoil transferase (argF), ácido arginino-succínico sintetase (argG), ácido arginino-succínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB).

Bactérias Produtoras de L-valina Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias

produtoras de L-valina incluem, mas sem limitação, cepas que foram

r

modificadas para expressar o operon ilvGMEDA (patente U.S. 5.998.178). E desejável remover a região do operon ilvGMEDA, que é exigida para a atenuação, de maneira que a expressão do operon não seja atenuada pela L- 25 valina que é produzida. Além do mais, o gene ílvA no operon é desejavelmente interrompido, de maneira tal que a atividade de treonina desaminase seja menor.

Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias produtoras de L-valina incluem também mutantes com uma mutação de amino-acil RNA-t sintetase (patente U.S. 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que apresenta uma mutação no gene UeS que codifica isoleucina RNAt sintetase, pode ser usada. A E. coli VL1970 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Federação Russa, 5 117545 Moscou, Ist Dorozhny Proezd, 1) em 24 de junho de 1988, com o número de acesso VKPM B-4411. Além do mais, os mutantes que exigem ácido lipoico para o crescimento, e/ou que não apresentam H+-ATPase também podem ser usados como cepas precursoras (W096/06926).

Bactérias Produtoras de L-isoleucina Os exemplos de cepas precursoras para fornecer bactérias

produtoras de L-isoleucina incluem, mas sem limitação, mutantes com resistência a 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes com resistência a um análogo de isoleucina, tal como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, e mutantes adicionalmente com resistência a DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, as cepas

_ recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas

na biossíntese de L-isoleucina, tais como treonina desaminase e aceto- hidroxato sintase, também podem ser usadas como cepas precursoras (JP 2- 458 A, FR 0356739, e patente U.S. 5.998.178).

2. Método de acordo com a presente invenção

O método da presente invenção é um método para produzir L- aminoácido por cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura para produzir e excretar o L-aminoácido no meio, e coletar o L- aminoácido do meio.

O cultivo, coleta e purificação de L-aminoácido do meio, e

similares, podem ser realizados de uma maneira similar aos métodos convencionais de fermentação em que um aminoácido é produzido usando uma bactéria.

Um meio usado para cultura pode ser tanto um meio sintético quanto natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria exige para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos, tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microrganismo escolhido, o álcool, incluindo etanol e glicerol, pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio tais como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio tais como aminas, uma fonte natural de nitrogênio tal como peptona, hidrolisado de soja e microrganismo fermentadores de produtos digeridos podem ser usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio e similares podem ser usados. As vitaminas, tiamina, extrato de levedura e similares podem ser usados.

O cultivo pode ser realizado em condições aeróbicas, tal como uma cultura em agitação e uma cultura em agitação com aeração, em uma temperatura de 20 a 40°C, ou 30 a 38°C. O pH da cultura é em geral entre 5 e 9, ou entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases e tampões. Em geral, 1 a 5 dias de cultivo levam ao acúmulo do L-aminoácido alvo no meio líquido.

Após o cultivo, os sólidos tais como células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração por membrana, e a seguir o L-aminoácido pode ser coletado e purificado por métodos de concentração, e/ou cristalização, e/ou vários métodos cromatográficos.

A composição do L-aminoácido coletado pode conter células bacterianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos do subproduto do microrganismo, além do L-aminoácido. A pureza do L-aminoácido coletado é, por exemplo, 50 % ou maior, 85 % ou maior, ou ainda 95 % ou maior (patente U.S. 5.431.933, publicação de patente Japonesa No. 1-214636, patentes U.S. 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, pedido de patente publicada U.S. 2005/0025878).

Além do mais, quando o L-aminoácido precipita no meio, este pode ser coletado por centrifiigação, filtração ou similares. O L-aminoácido precipitado no meio e o L-aminoácido dissolvido no meio podem ser isolados juntos após o L-aminoácido dissolvido no meio ser cristalizado.

Exemplos

A presente invenção será mais precisamente explicada a seguir, com referência aos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1: Construção de E. coli MG 1655: :Atdh,rhtA*, cepa

Ptac7AhDC.

A cepa E. coli MG1655::Atdh,rhtA*,cepa PtacTflhDC, foi obtida por substituição da região promotora natural do operon flhDC na cepa MG1655::Atdh,rhtA* pelo promotor Ptac7 (Fig.l), que é derivado do promotor Ptac- O promotor Ptac7 carrega a eliminação do C-nucleotídeo (a 23a posição à montante do códon ATG) na região do sítio de ligação LacI, para eliminar a __repressão dependente de LacI. _________________

Para substituir a região promotora natural do operon flhDC, um fragmento de DNA que carrega o promotor Ptac7 e o marcador de resistência à canamicina (KmR), codificado pelo gene kan, foram integrados 20 no local da região promotora natural no cromossomo da cepa de E. coli MG1655::Atdh,rhtA*, pelo método descrito por Datsenko K.A. e Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:6640-6645), que também é denominado como uma “integração mediada por Red” e/ou “integração direcionada para Red”. A cepa MG1655::Atdh,rhtA* foi construída da 25 maneira descrita em detalhes na Patente Russa 2364628C2 e W02009022754A1. O plasmídeo recombinante pKD46 (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl Acad. Sei. EUA, 2000, 97:6640-6645), com o replicon sensível à temperatura, foi usado como o doador dos genes derivados do fago λ responsáveis pelo sistema de recombinação mediado por Red. A cepa de E. coli BW25113 contendo o plasmídeo recombinante pKD46 pode ser obtida do E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, EUA, o número de acesso é CGSC7630. Após a integração do plasmídeo pKD46 na cepa E. coli MG 165 5:: Atdh,rht A *, a cepa 5 MG1655: :Atdh,rhtA*/pKD46 foi obtida.

O fragmento do promotor Ptac7 foi obtido por PCR usando o plasmídeo pKK223-3 (“Pharmacia”) disponível comercialmente como um molde, e os oligonucleotídeos iniciadores Pl (SEQ ID NO: 9) e P2 (SEQ ID NO: 10). O oligonucleotídeo iniciador Pl contém 21 nucleotídeos homólogos 10 à região 5’ do gene kan, exigidos para união adicional com o promotor Ptac7. O oligonucleotídeo iniciador P2 contém 40 nucleotídeos homólogos à região 5’ do gene flhD, exigidos para integração adicional no cromossomo bacteriano. Além disso, o oligonucleotídeo iniciador P2 apresenta uma eliminação de C-nucleotídeo (na 23a posição à montante do códon ATG) na 15 região do sítio de ligação LacI.

O fragmento de DNA que contém o marcador KmR, codificado pelo gene kan, foi obtido por PCR usando o plasmídeo pACYC177 disponível comercialmente (número de acesso ao Banco de Genes X06402, “Tools”, Lituânia) como o molde, e os oligonucleotídeos iniciadores P3 (SEQ ID NO: 20 11) e P4 (SEQ ID NO: 12). O oligonucleotídeo iniciador P3 contém 41 nucleotídeos homólogos à região localizada 188 bp à montante do códon inicial do gene flhD, exigidos para integração adicional no cromossomo bacteriano. O oligonucleotídeo iniciador P4 contém 21 nucleotídeos homólogos à região 5’ do promotor Ptac7, exigidos para união adicional com o 25 gene kan.

A PCR foi fornecida usando o termociclador “GeneAmp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura da reação com volume total de 50 μΕ consistiu em 5 μΕ de tampão de PCR IOx com MgCl2 25 mM (“Tools”, Lituânia), 200 μΜ de cada dNTP, 25 pmol de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores usados e IU de Taq-polimerase (“Tools”, Lituânia). Aproximadamente 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como um DNA molde para a amplificação por PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação inicial do DNA por 5 minutos a 95°C, seguido por 25 ciclos de: desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a 54°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 20 segundos para o promotor Ptac7, ou 50 segundos para o gene kan:, e o alongamento final por 5 minutos a 72°C. A seguir, o fragmento de DNA amplificado foi purificado em eletroforese em gel de agarose, extraído usando “colunas GenElute Spin” (“Sigma”, USA) e precipitado por etanol.

O fragmento de DNA kan-PtacZ foi obtido por PCR de sobreposição que usa os dois fragmentos de DNA descritos anteriormente, e os oligonucleotídeos iniciadores Pl (SEQ ID NO: 9) e P4 (SEQ ID NO: 12) para obter os fragmentos de DNA que se sobrepõem e a amplificação. O fragmento de DNA amplificado kan-Ptac7 foi purificado em eletroforese em gel de agarose, extraído usando “colunas GenElute Spin” (“Sigma”, USA) e precipitado por etanol. O fragmento de DNA obtido foi usado para eletroporação e integração mediada por Red no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655::Atdh,rhtA*/pKD46.

As células de MG1655::Atdh,rhtA*/pKD46 foram crescidas por toda a noite a 3 0°C no meio LB líquido com adição de ampicilina (100 μg/nlL), a seguir foram diluídas em 1:100 no meio SOB (extrato de levedura, g/L; NaCl, 0,5 g/L; triptona, 20 g/L; KCl, 2,5 mM; MgCl2, 10 mM) com adição de ampicilina (100 μg/mL) e L-arabinose (10 mM) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97:6640-6645) e crescimento a 30°C para atingir a densidade ótica da cultura bacteriana OD600 de 0,4 - 0,7. As células crescidas a partir de 10 mL do meio de cultura bacterianos foram lavadas 3 vezes em água deionizada gelada, seguido por suspensão em 100 μι de água. 10 μι de fragmento de DNA (100 ng) dissolvidos em água deionizada foram adicionados à suspensão celular. A eletroporação foi realizada pelo eletroporador “Bio-Rad” (EUA) (No. 165-2098, versão 2-89), de acordo com as instruções do fabricante.

As células que passaram pelo choque foram adicionadas a 1 mL do meio SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C, e a seguir espalhadas em ágar L contendo 20 μg/mL de canamicina.

As colônias crescidas em 24 horas foram testadas com relação à presença do marcador KmR, em vez da região promotora natural de operon flhDC por PCR que usa oligonucleotídeos iniciadores P5 (SEQ ID NO: 13) e P6 (SEQ ID NO: 14). Com este propósito, uma colônia recentemente isolada foi suspensa em 20 mL de água, e a seguir 1 μί de suspensão obtida foi usada para a PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação inicial do DNA por 10 minutos a 95°C, seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 1,5 minuto; e o alongamento final por 5 minutos a 72°C. Poucas colônias de KmR testadas continham o fragmento de DNA de 1.460 bp desejado, o que confirma a presença do marcador de DNA KmR, em vez da região promotora natural de 840 bp de operon flhDC (Fig. I). Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo pKD46 termossensível, curando a 37°C, e a cepa resultante foi denominada E. coli MGl 655::Atdh,rhtA*,PtacTflhDC.

Exemplo 2: Produção de L-treonina pela cepa E. coli MGl 655: :Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC.

A cepa precursora MG 1655:: Atdh,rht A * e MG 165 5 ::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC foram cada qual transformadas pelo plasmídeo pVIC40 (W09004636A1, patente U.S. 5.705.371). As cepas obtidas foram cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente, A seguir

0,1 mL de cada uma das culturas obtidas foi inoculado em 2 mL de meio de fermentação em um tubo de teste de 20 x 200 mm, e cultivado a 37°C por 24 e 48 horas em um agitador rotatório.

O meio de fermentação continha (g/L): Glicose 40 NaCl 0,8 (NH4)2SO4 22 K2HPO4 2,0 MgSO4-7H20 0,8 MnSO4SH2O 0,02 FeS04-7H20 0,02 Cloridrato de tiamina 0,002 Extrato de levedura 1,0 CaCO3 30 A glicose e o sulfato de magnésio foram esterilizados separadamente. O CaCO3 foi esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas.

_ O pH foi ajustado para 7,0. O antibiótico foi introduzido no meio após a

esterilização.

Após o cultivo, a quantidade de L-treonina que se acumulou no meio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase 20 móvel: butanol/ácido acético/água = 4/1/1 (v/v). Uma solução (2 %) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Um ponto contendo L-treonina foi cortado, a L-treonina foi eluída em 0,5 % de solução aquosa de CdCl2, e a quantidade de L-treonina foi estimada por espectrofotometria a 540 nm.

Os resultados de 20 fermentações em tubos de teste

independentes (como valores médios) são mostrados na tabela 1. Como pode ser observado a partir da tabela 1, a cepa modificada de E. coli MGl655::Atdh,rhtA*,PtaC7flhDC (pVIC40) causou a maior quantidade de acúmulo de L-treonina comparada à cepa de E. coli MG1655Atdh::rhtA (pVIC40) parental. Tabela 1

Cepa 24 h 48 h O Thr, g/L ThrZODgooj OD60O Thr, g/L Thr/OD600, S r/l g/L Q O MG 1655: :Atdh,rhtA* 13,0±0,2 5,0±0,6 0,38 19,4±1,0 4,7±0,8 0,24 (pVIC40) MG 1655: :Atdh,rhtA*, Ptac7AhDC 9,7±0,3 7,7±0,9 0,97 12,2±0,3 7,7±0,4 0,64 (pVIC40) Exemplo 3: Construção da cepa E. coli MG1655: :Atdh,rhtA* ,AintB: :yhj H,cat.

A cepa de E. coli MG1655::Atdh,rhtA*,AintB::yhjH,cat é

obtida por substituição do gene intB natural, que codifica a integrase B na cepa MG1655::Atdh,rhtA* com uma cópia adicional do gene yhjH no controle de seus próprios promotores (Fig. 2).

O fragmento de DNA que carrega o gene yhjH no controle de seu próprio promotor foi integrado no lugar do gene intB natural no cromossomo da cepa de E. coli MG1655::Atdh,rhtA*, pelo método descrito por Datsenko K.A. e Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000: 97, 6640-6645), que também é denominado como uma “integração mediada por — Red” e/ou “integração direcionada por Red”. O plasmídeo pKD46 recombinante (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000: 97, 6640-6645), com o replicon termossensível, foi usado como o doador dos genes derivados do fago λ, responsáveis pelo sistema de recombinação mediada por Red. A cepa de E. coli BW25113 que continha o plasmídeo pKD46 recombinante pode ser obtida do E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA, o número de acesso é CGSC7630.

O gene yhjH foi obtido por PCR usando DNA cromossômico de E. coli MG1655 e oligonucleotídeos iniciadores P7 (SEQ ID NO: 15) e P8 (SEQ ID NO: 16). O oligonucleotídeo iniciador P7 contém 21 nucleotídeos homólogos à região 5’ do gene cat, exigidos para união adicional com o gene yhjH. O oligonucleotídeo iniciador P8 contém 40 nucleotídeos homólogos à região localizadas À jusante do códon TAA do gene intB, exigidos para integração adicional no cromossomo bacteriano.

O fragmento de DNA contendo marcador de resistência ao clorafenicol (CmR), codificado pelo gene cat, foi obtido por PCR usando o 5 plasmídeo disponível comercialmente pACYC184 (Banco de Genes/EMBL número de acesso X06403, “Tools”, Lituânia) como o molde, e os oligonucleotídeos iniciadores P9 (SEQ ID NO: 17) e PlO (SEQ ID NO: 18). O oligonucleotídeo iniciador P9 contém 41 nucleotídeos homólogos à região localizada à montante do códon ATG do gene intB, exigidos para integração 10 adicional no cromossomo bacteriano. O oligonucleotídeo iniciador PlO contém 21 nucleotídeos homólogos à região 5’ do promotor PyhjH5 exigidos para união adicional com o gene yhjH.

A PCR foi realizada usando o termociclador “GeneAmp PCR System 2700” (Applied Biosystems). A mistura de reação com volume total de 50 μΕ consistiu em 5 μΕ de tampão de PCR IOx, com MgCl2 25 mM

___(“Tools”, Lituânia), 200 μΜ de cada dNTP, 25 pmol de cada um dos

oligonucleotídeos iniciadores usados e I U de Taq-polimerase (“Tools”, Lituânia). Aproximadamente 5 ng do DNA plasmidial foram adicionados na mistura de reação como um DNA molde para a amplificação por PCR. O 20 perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação inicial do DNA por 5 minutos a 95°C, seguido por 25 ciclos de: desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a 54°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 45 segundos para o gene yhjH, ou 50 segundos para o gene cat\ e o alongamento final por 5 minutos a 72°C. A seguir, o fragmento de DNA amplificado foi 25 purificado em eletroforese em gel de agarose, extraído usando “colunas GenElute Spin” (“Sigma”, USA) e precipitado por etanol.

O fragmento de DNA cat-?y^H-yhjH foi obtido por PCR de sobreposição, que usa os dois fragmentos de DNA descritos anteriormente e os oligonucleotídeos iniciadores P8 (SEQ ID NO: 16) e P9 (SEQ ID NO: 17). O fragmento de DNA cat-Py^-yhjH amplificado foi purificado em eletroforese em gel de agarose da maneira descrita. O fragmento de DNA obtido foi usado para eletroporação e integração mediada por Red no cromossomo bacteriano de E. coli MG1655::Atdh,rhtA*/pKD46 (ver exemplo 1).

As células de MG1655::Atdh,rhtA*/pKD46 foram crescidas, diluídas e adicionalmente crescidas, bem como a eletroporação foi realizada da maneira descrita no exemplo 1.

As células que sofreram choque foram adicionadas a 1 mL do meio SOC (Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), incubadas por 2 horas a 37°C, e a seguir foram espalhadas no ágar L contendo 20 μg/mL de cloranfenicol.

As colônias crescidas em 24 horas foram testadas com relação à presença do fragmento de DNA cat-Vy^-yhjH, em vez do gene intB natural por PCR que usa os oligonucleotídeos iniciadores Pl 1 (SEQ ID NO: 19) e P12 (SEQ ID NO: 20). Com este propósito, uma colônia recentemente isolada foi suspensa em 20 mL de água, e a seguir 1 μΕ de suspensão obtida foi usada para PCR. O perfil de temperatura foi o seguinte: desnaturação inicial do DNA por 10 minutos a 95°C, seguido por 30 ciclos de: desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos e alongamento a 72°C por 2 minutos; e o alongamento final por 5 minutos a 72°C. Poucas colônias de CmR testadas continham o fragmento de DNA de 2.215 bp desejado, confirmando a presença do fragmento de DNA cat-Pyhjn-yhjH, em vez do gene intB natural de 1.620 bp (Fig.2). Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo pKD46 termossensível cultivando a 37°C, e a cepa resultante foi denominada E. coli MG 1655: :Atdh,rhtA* ,AintB: :yhjH,cat.

Exemplo 4: Construção da cepa E. coli MG 1655: :Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC5AintB: :yhjH,cat.

A cepa de E. coli

MG 1655 ::Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC,AintB::yhjH,cat foi obtida pelo método de transdução geral da mutação de AintB ::yhjH, a partir da cepa MG1655::Atdh,rhtA*,AintB::yhjH,cat na cepa

MG1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, Nova Iorque). Com este propósito, a cepa MG 1655 ::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC foi infectada com um fago bacteriano Plvir5 crescido na cepa doadora MGl 655 ::Atdh, rhtA*, AintB ::yhjH,cat. Assim, a cepa

MG 1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC,AintB::yhjH,cat foi obtida.

Exemplo 5: Produção de L-treonina pela cepa E. coli MG1655: :Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC5AintB: :yhjH,cat.

A cepa precursora MG1655::Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC e MG1655 ::Atdh,rhtA*,Ptac7 AhDC,AintB ::yhjH,cat foram cada qual

_ transformadas pelo plasmídeo pVIC40 (ver exemplo 2). As cepas obtidas

foram cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente, a seguir 0,1 mL de cada uma das culturas obtidas foi inoculada em 2 mL de meio de fermentação em um tubo de teste de 20 x 200 mm, e cultivadas a 37°C por 24 20 horas em um agitador rotatório. A composição e preparação do meio de fermentação, e o método de estimativa de L-treonina são descritos no exemplo 2.

Os resultados de 20 fermentações em tubo de teste independentes (como valores médios) são mostrados na tabela 2. Como pode 25 ser observado a partir da tabela 2, a cepa de E. coli MGl655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC,AintB::yhjH,cat modificada causou a maior quantidade de acúmulo de L-treonina comparada à cepa precursora de E. coli MG1655: :Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC.

Tabela 2 Cepa 24 h O Thr, g/L Thr/OD600, g/L S Q O MGl 655: :Atdh,rhtA*,Ptac7flhDC(p VIC40) 12,0±0,3 7,0±0,5 0,58 MGl 655: :Atdh,rhtA*,Ptac7flhDC,AintB::yhjH,cat(pVIC40) 11,9±0,2 8,1±0,5 0,68 Exemplo 6: Construção da cepa de E. coli

MGl 655: :Atdh,rhtA* ,Ptac7fliZ,cat.

A cepa de E. coli MGl655::Atdh,rhtA*,Ptac7fliZ,cat foi construída da mesma maneira descrita para a cepa 5 MGl655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC no exemplo 1 (Fig.3).

O fragmento do promotor Ptac7 foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pKK223-3 (“Pharmacia”) como um molde, e os oligonucleotídeos iniciadores P13 (SEQ ID NO: 21) e P14 (SEQ ID NO: 22). O oligonucleotídeo iniciador P13 contém 40 nucleotídeos 10 homólogos à região 5’ do gene fliZ, exigidos para a integração adicional no cromossomo bacteriano. Além disso, o oligonucleotídeo iniciador P13 apresenta uma eliminação de nucleotídeo C (na 23a posição à montante do códon ATG) na região do sítio de ligação LacI. O oligonucleotídeo iniciador P14 contém 21 nucleotídeos homólogos à região 5’ do gene cat, exigidos para 15 união adicional com o promotor Ptac7.

O fragmento de DNA que continha o marcador de resistência ao cloranfenicol (CmR), codificado pelo gene cat, foi obtido por PCR usando o plasmídeo disponível comercialmente pACYC184 (número de acesso Banco de Genes/EMBL X06403, “Tools”, Lituânia) como o molde, e os 20 oligonucleotídeos iniciadores P15 (SEQ ID NO: 23) e P16 (SEQ ID NO: 24). O oligonucleotídeo iniciador Pl5 contém 41 nucleotídeos homólogos à região localizada 9 bp à montante do códon inicial do gene fliZ, exigidos para integração adicional no cromossomo bacteriano. O oligonucleotídeo iniciador Pl6 contém 21 nucleotídeos homólogos à região 5’ do promotor Ptac7, 25 exigidos para união adicional com o gene cat.

O fragmento de DNA cat-fliZ foi obtido por PCR de sobreposição que usa os dois fragmentos de DNA descritos anteriormente, e os oligonucleotídeos iniciadores P15 (SEQ ID NO: 23) e P13 (SEQ ID NO: 21), e foi usado para eletroporação e integração no cromossomo bacteriano da E. coli MG1655::Atdh,rhtA*/pKD46.

As colônias crescidas em 24 horas foram testadas com relação à presença do marcador CmR, em vez da região promotora natural do gene fliZ por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores Pl7 (SEQ ID NO: 25) e Pl8 (SEQ ID NO: 26), da maneira descrita no exemplo 3. Poucas colônias CmR testadas continham o fragmento de DNA de 1540 bp desejado, confirmando a presença do marcador de DNA CmR, em vez de da região promotora natural de 295 bp do gene fliZ (Fig.3). Uma das cepas obtidas foi curada a partir do plasmídeo termossensível pKD46 cultivando a 37°C, e a cepa resultante foi denominada E. coli MGl655 ::Atdh,rhtA*,Ptac7fliZ,cat.

Exemplo 7: Construção da cepa E. coli MG 1655: :Atdh,rhtA*, Ptac7AhDC, Ptac7AiZ, cat.

A cepa E. coli MG 1655 ::Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC,Ptac7AiZ,cat foi obtida pelo método de transdução geral da mutação Ptac7AiZ, a partir da cepa MGl655::Atdh,rhtA*,Ptac7AiZ,cat na cepa MG 1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Com este propósito, a cepa MG 1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC foi infectada com um fago bacteriano Plvir crescido na cepa MGl 655 ::Atdh,rhtA*,Ptac7AiZ5Cat doadora. Assim, a cepa MG 165 5 ::Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC,Ptac7AiZ,cat foi obtida.

Exemplo 8: Produção de L-treonina pela cepa E. coli MG 1655: :Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC, Ptac7AiZ,cat.

A cepa precursora MG1655::Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC e MG1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC,Ptac7AiZ,cat foram cada qual transformadas pelo plasmídeo pVIC40 (ver exemplo 2). As cepas obtidas foram cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente. A seguir, 0,1 mL de cada uma das culturas obtidas foi inoculado em 2 mL de meio de fermentação em um tubo de teste de 20 x 200 mm, e cultivado a 37°C por 24 horas em um agitador rotatório. A composição e preparação do meio de fermentação, e o método de estimativa de L-treonina são descritos no exemplo 2.

Os resultados de 20 fermentações em tubo de teste 5 independentes (como valores médios) são mostrados na tabela 3. Como pode ser observado a partir da tabela 3, a cepa de E. coli MGl655::Atdh,rhtA*,PtacVflhDC5PtacvfliZ,cat modificada causou a maior quantidade de acúmulo de L-treonina comparada com a cepa precursora de E. coli MG1655: :Atdh,rhtA* ,Ptac7AhDC.

Tabela 3

Cepa 24 h O Thr, g/L Thr/OD600, g/L σ CN O O MG 1655: :Atdh, rhtA*, Ptac7AhDC (pVIC40) 12,0±0,3 7,0±0,5 0,58 MG 1655: :Atdh, rhtA*, Ptac7AhDC, Ptac7AiZ, cat(pVIC40) 11,5±0,3 9,3±0,6 0,81 Exemplo 9: Construção da cepa de E. coli AJ12739::Ptac7flhDC,KmR.

A cepa de E. coli AJ12739::Ptac7flhDC,KmR foi obtida pela transdução da mutação de Ptac7AhDC, a partir da cepa 15 MG 165 5 ::Atdh,rhtA*,Ptac7 AhDC na cepa AJ12739 produtora de L- fenilalanina (tyrA::Tn, tyrR) (VKPM B-8197) (patente U.S. 7.666.655). Com este propósito, a cepa AJ12739 foi infectada com um fago bacteriano PlVjr crescido na cepa MG 1655::Atdh,rhtA*,Ptac7AhDC,KmR doadora. Assim, a cepa AJ12739::Ptac7flhDC,KmR foi obtida. A cepa AJ12739 foi depositada em 20 06 de novembro de 2001 no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Federação Russa, 113545 Moscou, I Dorozhny proezd 1) com o número de acesso B-8197.

Exemplo 10: Produção de L-fenilalanina pela cepa E. coli AJ12739::Ptac7flhDC,KmR.

A cepa precursora AJl 2739 e a cepa

AJl2739::Ptac7AhDC,KmR produtora de fenilalanina foram cada qual cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo nutriente com 100 mg/L de ampicilina. A seguir, 0,3 mL da cultura obtida foi inoculado em 3 mL de um meio de fermentação contendo 100 mg/L de ampicilina em um tubo de teste de 20 x 200 mm, e cultivado a 37°C por 48 horas em um agitador rotatório.

O meio de fermentação contendo (g/L): Glicose 40 (NH4)2SO4 16 K2HPO4 0,1 MgS04-7H20 1,0 MnSO4-5H20 0,01 FeSO4-7H20 0,01 Cloridrato de tiamina 0,0002 Extrato de levedura 2,0 Tirosina 0,125 CaCO3 30 A glicose e o sulfato de magnésio foram esterilizados

separadamente. CaCO3 foi esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. O pH foi ajustado para 7,0. O antibiótico foi introduzido no meio após a esterilização.

Após o cultivo, a quantidade de fenilalanina acumulada no 20 meio foi determinada por TLC (cromatografia de camada fina), usando placas de TLC de 10 x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de sílica gel Sorbfil sem indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rússia). Amostras foram aplicadas aos pratos com aplicador de amostra Camag Linomat 5. As placas de Sorbfil foram desenvolvidas com a seguinte 25 fase móvel: propan-2-ol/etilacetato/25 % de amônia aquosa/água = 40/40/7/16 (v/v). Uma solução (2 %) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Após o desenvolvimento, pratos foram secados e examinados com o Camag TLC Scanner 3 no modo absorbância com detecção em 520 nm usando software winCATS (versão 1.4.2). Os resultados de 20 fermentações em tubo de teste independentes (como valores médios) são mostrados na tabela 4. Como pode ser observado a partir da tabela 4, a cepa de E. coli AJ12739::Ptec7flliDC,KmR modificada causou a maior quantidade de acúmulo de L-fenilalanina comparada com a cepa de E. coli AJ12739 parental.

Tabela 4

Cepa 48 h OD600 Phe, g/L Phe/OD600, g/L AJ12739 8,3±0,2 1,62±0,15 0,19 AJ12739::Ptac7flhDC,KmR 7,1±0,3 2,20±0,30 0,31 Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com

referência às modalidades preferidas desta, será evidente para os versados na técnica que várias mudanças podem ser realizadas, e equivalentes podem ser empregados, sem fugir do escopo da invenção. Todas as referências aqui citadas são incorporadas como uma parte deste pedido pela referência.

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, um L-aminoácido é produzido eficientemente por uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma bactéria em um meio, em que a dita bactéria pertence à família Enterobacteriaceae e é capaz de produzir L- aminoácido, e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de tal modo que a expressão de pelo menos um gene da formação de flagelos e cascata de motilidade seja intensificada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um gene é selecionado do grupo que consiste no(s) gene(s) do operon flhDC, no gene yhjH e no gene fliZ, e combinação destes.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a expressão do(s) dito(s) gene(s) é intensificada pela modificação de uma região de controle de expressão do(s) gene(s).

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a expressão do(s) dito(s) gene(s) é intensificada pelo aumento do número de cópias do(s) gene(s).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria pertence ao gênero Eseherichia.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria é Eseherichia coli.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria pertence ao gênero Enterobacter.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria pertence ao gênero Pantoea.

9. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene flhD codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em: (A) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQID NO: 2; (B) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de regulador duplo transcricional de ligação de DNA como definido na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (C) uma combinação destes.

10. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o genQ flhC codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em: (D) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQID NO: 4; (E) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de regulador duplo transcricional de ligação de DNA como definido na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e (F) uma combinação destes.

11. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene yhjH codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em: (G) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6; e (H) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade de fosfodiesterase cíclica-di- GMP como definido na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e (I) uma combinação destes.

12. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene fliZ codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em: (J) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8; e (K) uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 8, mas em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, apagados, inseridos, adicionados ou invertidos, e a dita proteína apresenta atividade reguladora como definido na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e (L) uma combinação destes.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-aminoácido aromático.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido aromático é L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-aminoácido não aromático.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido não aromático é L-treonina, L-lisina, L- cisteína, L-metionina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-histidina, L-serina, L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutâmico, L-prolina, L-arginina, e glicina.

17. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-fenilalanina.

18. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 15, caracterizado pelo fato de que o dito L-aminoácido é L-treonina.