BR112016007182B1

BR112016007182B1 - Método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BR112016007182B1
Application number: BR112016007182-4A
Authority: BR
Inventors: Tatyana Mikhailovna Kuvaeva; Evgeniya Aleksandrovna Polyakova; Natalia Viktorovna Stoynova
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2022-12-13
Also published as: EP3052637A1; WO2015050276A1; JP6460100B2; RU2013144250A; CL2016000746A1; CA2924629C; JP2016531562A; EP3052637B1; CA2924629A1; US9873898B2; BR112016007182A2; US20160201100A1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO. A presente invenção fornece um método para produzir um L- aminoácido por fermentação usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia, que está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato, como o gene pitA ou pitB.

Description

Fundamentos da Invenção Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se à indústria microbiológica, e especificamente a um método para produzir um L-aminoácido por fermentação de uma bactéria da família Enterobacteriaceae que está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

Técnica Anterior

[002] Convencionalmente, os L-aminoácidos são industrialmente produzidos por métodos de fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidas de fontes naturais, ou seus mutantes. Tipicamente, os micro-organismos são modificados para aumentar os rendimentos de produção de L-aminoácidos.

[003] Têm sido relatadas muitas técnicas para aumentar os rendimentos de produção de L-aminoácido, incluindo a transformação de micro-organismos com DNA recombinante (consulte, por exemplo, Patente U.S. n° 4.278.765 A) e a alteração de regiões regulatórias como promotor, sequência líder, e/ou atenuador, ou outros conhecidos pela pessoa versada na técnica (consulte, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. n° 20060216796 A1 e WO9615246 A1). Outras técnicas para aumentar os rendimentos de produção incluem o aumento das atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácido e/ou a dessensibilização das enzimas-alvo à inibição de retroalimentação pelo L-aminoácido resultante (consulte, por exemplo, WO9516042 A1, EP0685555 A1 ou Patentes U.S. n°s 4.346.170 A, 5.661.012 A, e 6.040.160).

[004] Outro método para aumentar os rendimentos de produção de L-aminoácidos é atenuar a expressão de um gene ou de vários genes que está envolvido (estão envolvidos) na degradação do L-aminoácido-alvo, de genes que desviam os precursores do L-aminoácido-alvo da rota de biossíntese de L-aminoácido, de genes envolvidos na redistribuição dos fluxos de carbono, de nitrogênio, e de fosfato, e de genes que codificam toxinas, etc.

[005] Bactérias, como, por exemplo, Escherichia coli (E. coli), contêm dois genes pit, pitA e pitB, que codificam proteínas que transportam fosfato inorgânico (Pi) através da membrana citoplasmática das bactérias (Harris R.M. et al., “Characterization of PitA and PitB from Escherichia coli”, J. Bacteriol., 2001, 183(17):5008-5014). As proteínas transportadoras de fosfato PitA e PitB são homólogos de proteína tendo, uma em relação à outra, uma identidade de sequência de aminoácidos de 81% (Hoffer S.M. et al., “Activation by gene amplification of pitB, encoding a third phosphate transporter of Escherichia coli K-12”, J. Bacteriol., 2001, 183(15):4659- 4663), e estas proteínas transportadoras pertencem à família de Proteínas Transportadoras de Fosfato Inorgânico (PiT, Inorganic Phosphate Transporter). Um exame dos 34 genomas bacterianos completamente sequenciados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG) revelou que algumas bactérias, como, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonadaceae), contêm mais que um homólogo de PitA.

[006] As proteínas PitA e PitB da E. coli procariótica podem transportar fosfato inorgânico independentemente uma da outra. Tal atividade sobreposta de proteínas transportadoras de fosfato inorgânico também tem sido relatada para espécies eucarióticas como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae (Martinez P.R. et al., “Physiological regulation of the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae”, J. Bacteriol., 1998, 180:2253-2256) e Neurospora crassa (Versaw W.K. e Metzenberg R.L., “Repressible cation-phosphate symporters in Neurospora crassa”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92:3884-3887). Estudos prévios sobre procariontes têm mostrado que o sistema PitA (em prol de brevidade também chamado de o sistema Pit) medeia a absorção de fosfato inorgânico e de íons de cátion divalente. Por exemplo, a absorção de fosfato inorgânico em E. coli (Enterobacteriaceae) e Acinetobacter johnsonii (Moraxellaceae) pela utilização do sistema Pit é dependente do cotransporte de íons de cátions de metais divalentes, como Mg(II), Ca(II), Mn(II), ou Co(II), mediante a formulação de um complexo de metal-fosfato, neutro, solúvel, que é a espécie transportada (van Veen H.W. et al., “Translocation of metal phosphate via the phosphate inorganic transport system of Escherichia coli”, Biochemistry, 1994, 33(7):1766-1770; van Veen H.W. et al., “Mechanism and energetics of the secondary phosphate-transport system of Acinetobacter-johnsonii-210A”. J. Biol. Chem., 1993, 268:19377-19383). Também tem sido relatado que PitA está envolvido em absorção de Zn(II) provavelmente via a formação de um complexo de ZnHPO4. Entretanto, é sugerido que PitA também pode desempenhar uma função em efluxo de Zn(II), quando a concentração intracelular de íons de zinco torna-se tóxica (Beard S.J. et al., “Evidence for the transport of zinc(II) ions via the pit phosphate transport system in Escherichia coli”, FEMS Microbiol. Lett., 2000, 184:231-235).

[007] Entretanto, não foram previamente relatados nenhuns dados que descrevem o efeito de atenuação da expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato sobre a produção de L-aminoácidos por fermentação de uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae.

Sumário da Invenção

[008] Um aspecto da presente invenção é fornecer uma bactéria produtora de L-aminoácido pertencendo a famílias Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie E. coli, que está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato, como o gene pitA ou seu homólogo como, por exemplo, o gene pitB.

[009] Outro aspecto a presente invenção é fornecer um método para produzir L-aminoácidos como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L- aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae conforme descrito mais adiante neste documento.

[0010] Estes objetivos foram alcançados pela descoberta de que a atenuação da expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato, em particular, inativação do gene pitA, no cromossomo de uma bactéria produtora de L-aminoácido pertencendo à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie Escherichia coli, confere à bactéria uma produtividade mais alta de L-aminoácidos, como, por exemplo, L-arginina e L-histidina.

[0011] Um aspecto da presente invenção é fornecer um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura para produzir e acumular um L- aminoácido no meio de cultura ou nas células da bactéria, ou em ambos; e (ii) coletar o L-aminoácido do meio de cultura ou das células da bactéria, ou de ambos, em que a bactéria está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[0012] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

[0013] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria é Escherichia coli.

[0014] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

[0015] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a bactéria é Pantoea ananatis.

[0016] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que a expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada devido à inativação do gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[0017] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o gene que codifica proteína transportadora de fosfato está deletado.

[0018] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o gene que codifica proteína transportadora de fosfato é selecionado do grupo consistindo em: (A) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; (B) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; (C) um DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos variante de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 devido à degeneração do código genético; (D) um DNA tendo uma identidade da sequência de nucleotídeos não menor que 75% em relação à sequência de nucleotídeos inteira de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e que codifica uma proteína tendo atividade de transporte de fosfato inorgânico; (E) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (F) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e (G) um DNA que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de transporte de fosfato inorgânico.

[0019] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado do grupo consistindo em um L-aminoácido aromático e um L-aminoácido não aromático.

[0020] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido aromático é selecionado do grupo consistindo em L-fenilalanina, L-triptofano e L-tirosina.

[0021] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido não aromático é selecionado do grupo consistindo em L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, L-treonina e L-valina.

[0022] Um outro aspecto da presente invenção é fornecer o método conforme descrito acima, em que o L-aminoácido é L-arginina e L-histidina. Descrição Breve dos Desenhos

[0023] A Figura 1 mostra o esquema do plasmídeo pMW118-X attL - KniR-À attR.

Descrição das Modalidades

[0024] A presente invenção é descrita em detalhes abaixo.

1. Bactéria

[0025] A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” pode significar uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tem uma capacidade para produzir, excretar ou secretar e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura ou nas células bacterianas quando a bactéria é cultivada no meio.

[0026] A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” também pode significar uma bactéria que é capaz de produzir, excretar ou secretar e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura em uma quantidade maior que aquela de uma cepa parental ou de tipo selvagem, como E. coli K-12. A frase “uma bactéria produtora de L-aminoácido” também pode significar uma bactéria que é capaz de causar acumulação em um meio de cultura de uma quantidade não menor que 0,5 g/L ou não menor que 1,0 g/L do L-aminoácido-alvo. A bactéria pode produzir quer um tipo de aminoácido somente, quer uma mistura de dois ou mais tipos de aminoácidos.

[0027] A frase “capacidade de produzir L-aminoácido” pode significar a capacidade da bactéria para produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação do L-aminoácido em um meio de cultura ou nas células bacterianas em um tal nível que o L-aminoácido pode ser coletado do meio de cultura ou das células bacterianas, quando a bactéria é cultivada no meio.

[0028] A frase “L-aminoácido” pode significar L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L- glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L- tirosina e L-valina.

[0029] A frase “L-aminoácido aromático” inclui, por exemplo, L- fenilalanina, L-triptofano e L-tirosina. Como L-histidina tem uma porção aromática, especificamente, um anel imidazol, a frase “L-aminoácido aromático” pode também incluir, além dos L-aminoácido aromáticos anteriormente mencionados, L-histidina.

[0030] A frase “L-aminoácido não aromático” inclui, por exemplo, L- alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L- metionina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, L-treonina e L-valina. Como a rota biossintética de L-histidina é diferente das rotas biossintéticas de aminoácidos aromáticos comuns como L-fenilalanina, L-triptofano, e L-tirosina, a frase “L-aminoácido não aromático” pode também incluir, além dos L-aminoácidos não aromáticos anteriormente mencionados, L-histidina.

[0031] Isto é, L-histidina pode ser incluída em qualquer um de, ou em ambos de, “L-aminoácido aromático” e “L-aminoácido não aromático”.

[0032] Um L-aminoácido pode pertencer a uma ou mais famílias de L-aminoácidos. Como um exemplo, a família de glutamato inclui L-arginina, ácido L-glutâmico, L-glutamina e L-prolina; a família de serina inclui L- cisteína, glicina e L-serina; a família de aspartato inclui L-asparagina, ácido L-aspártico, L-isoleucina, L-lisina, L-metionina e L-treonina; a família de piruvato inclui L-alanina, L-isoleucina, L-valina e L-leucina; e a família de aromáticos inclui L-fenilalanina, L-triptofano e L-tirosina. Como um L- aminoácido pode ser um intermediário em uma rota biossintética de outro L- aminoácido, as famílias de aminoácidos anteriormente mencionadas podem também incluir outros L-aminoácidos, como, por exemplo, L-aminoácidos não proteinogênicos. Por exemplo, L-citrulina e L-ornitina são aminoácidos da rota biossintética de L-arginina. Portanto, a família de glutamato pode incluir L-arginina, L-citrulina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-ornitina e L-prolina.

[0033] L-Arginina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L- histidina, L-isoleucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L- treonina, L-triptofano, e L-valina são exemplos particulares. L-Arginina, L- glutamina, L-histidina, e L-prolina são exemplos específicos. L-arginina e L- histidina são exemplos mais específicos.

[0034] A frase “L-aminoácido” pode incluir não apenas um L- aminoácido sob uma forma livre, mas também pode incluir um sal do mesmo ou um seu hidrato, ou uma sua forma de aduto com outro composto orgânico ou inorgânico conforme descrito em seguida.

[0035] As bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae podem ser dos gêneros Escherichia e/ou Pantoea, etc., e podem ter a capacidade para produzir um L-aminoácido. Especificamente, podem ser utilizadas aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados do NCBI (“National Center for Biotechnology Information”) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543). Exemplos de cepas da família Enterobacteriaceae que podem ser modificadas incluem uma bactéria do gênero Escherichia, Enterobacter ou Pantoea.

[0036] As cepas de bactérias Escherichia que podem ser modificadas para se obterem bactérias Escherichia de acordo com o assunto presentemente revelado não são particularmente limitadas, e especificamente, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. podem ser usadas (Bachmann, B.J., “Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12”, p. 2460-2488. Em F.C. Neidhardt et al. (ed.), “E. coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology”, 2nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996). A espécie E. coli é um exemplo particular. Exemplos específicos de E. coli incluem E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076), etc., que são derivadas da cepa protótipo de tipo selvagem, cepa E. coli K-12. Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, junto à “American Type Culture Collection” (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são concedidos a cada uma das cepas, e as cepas podem ser requisitadas pelo uso destes números de registro (referir- se a www.atcc.org). Os números de registro das cepas estão listados no catálogo da “American Type Culture Collection”.

[0037] Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etc. Exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis, etc. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, ou Pantoea stewartii com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. Uma bactéria pertencendo a qualquer dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada desde que ela seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de Pantoea ananatis é gerada por técnicas de engenharia genética, a cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP- 6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207), e seus derivados podem ser usadas (usados). Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, elas foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA etc. conforme descrito acima.

Bactérias produtoras de L-aminoácido

[0038] A bactéria da presente invenção pertencendo à família Enterobacteriaceae e modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato, como pitA ou seu homólogo pitB, que é capaz de produzir um L-aminoácido, pode ser usada.

[0039] A bactéria pode inerentemente ter a capacidade de produzir L- aminoácido ou pode ser modificada para ter uma capacidade para produzir L- aminoácido pelo uso de um método de mutação ou técnicas de recombinação de DNA. A bactéria pode ser obtida pela atenuação da expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato em uma bactéria inerentemente tendo a capacidade para produzir um L-aminoácido. Alternativamente, a bactéria pode ser obtida pela concessão da capacidade para produzir um L-aminoácido à uma bactéria já tendo um gene que codifica proteína transportadora de fosfato atenuado. Também, a bactéria pode ser uma bactéria que tem adquirido a capacidade para produzir um L-aminoácido por atenuação da expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[0040] A bactéria pode produzir um L-aminoácido quer sozinho e/ou como uma mistura de dois ou mais tipos de L-aminoácidos. Também é aceitável que a bactéria possa produzir um L-aminoácido quer sozinho quer como uma mistura do L-aminoácido e um sal do mesmo, conforme explicado mais adiante neste documento.

[0041] Daqui por diante, as bactérias produtoras de L-aminoácido serão especificamente exemplificadas. Qualquer uma das propriedades das bactérias produtoras de L-aminoácido-e modificações para conceder ou aumentar a capacidade para produzir L-aminoácido, com aquelas exemplificadas abaixo, podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada.

Bactérias produtoras de L-arginina

[0042] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- arginina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S. n° 2002058315 A1) e suas cepas derivadas hospedando genes argA mutantes que codificam N-acetilglutamato-sintase mutante (Patente Russa n° 2215783 C2, EP1170361 A1), cepa E. coli 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1), cepa E. coli 382 ilvA+, que é obtida da cepa 382 pela introdução na mesma do alelo de tipo selvagem de gene ilvA da cepa E. coli K-12, e semelhantes. Exemplos de N-acetilglutamato-sintase mutante incluem, por exemplo, uma N-acetilglutamato-sintase mutante dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-arginina pela substituição dos resíduos de aminoácido correspondendo às posições 15 a 19 da enzima de tipo selvagem (EP1170361 A1).

[0043] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina está intensificada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam N-acetil-Y- glutamilfosfato-redutase (argC), ornitina-acetiltransferase (argJ), N- acetilglutamato-quinase (argB), N-acetilornitina-aminotransferase (argD), ornitina-carbamoiltransferase (argF), argininossuccinato-sintase (argG), argininossuccinato-liase (argH), e carbamoil-fosfato-sintetase (carAB), além do gene que codifica N-acetilglutamato-sintase (argA). O gene argA pode também ser um gene argA mutante que codifica N-acetilglutamato-sintase mutante como aqueles exemplificados acima.

[0044] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina também incluem cepas tendo resistência aos análogos de aminoácido, et.. Exemplos de tais cepas incluem cepas mutantes de Escherichia coli tendo resistência à α-metilmetionina, à p-fluorofenilalanina, à D-arginina, ao hidroxamato de arginina, à S-(2-aminoetil)-cisteína, à α-metilserina, e—à 2- tienilalanina, ou à sulfaguanidina (consultar o Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (Kokai) n° 56-106598).

Bactérias produtoras de L-citrulina

[0045] Exemplos de bactérias produtoras de L-citrulina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- citrulina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas E. coli 237/pMADS11, 237/pMADS12, e 237/pMADS13 com N-acetilglutamato-sintase mutante (RU2215783 C2, Patente Europeia n° 1170361 B1, Patente U.S. n° 6.790.647 B2), cepas E. coli 333 (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086), ambas hospedando carbamoil- fosfato-sintetase mutante resistente às retroalimentação (Patente Russa n° 2264459 C2), cepas E. coli nas quais a atividade de α-cetoglutarato-sintase está aumentada, e atividades de ferredoxina-NADP+-redutase, piruvato- sintase, e/ou α-cetoglutarato desidrogenase estão adicionalmente modificadas (EP2133417 A1), e cepa P. ananantis NA1sucAsdhA, na qual as atividades de succinato-desidrogenase e de α-cetoglutarato-desidrogenase estão decrescidas (Pedido de Patente U.S. n° 2009286290 A1), e semelhantes.

[0046] Como a L-citrulina é um intermediário da rota biossintética de L-arginina, exemplos de bactérias produtoras de L-citrulina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- citrulina, incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam aos, genes que codificam N- acetilglutamato-sintase (argA), N-acetilglutamato-quinase (argB), N- acetilglutamil-fosfato-redutase (argC), acetilornitina-transaminase (argD), acetilornitina-desacetilase (argE), ornitina-carbamoiltransferase (argF/I), e carbamoil-fosfato-sintetase (carAB), e suas combinações.

[0047] Uma bactéria produtora de L-citrulina pode ser também facilmente obtida de qualquer bactéria produtora de L-arginina, por exemplo cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), por inativação de argininossuccinato- sintase codificada pelo gene argG.

Bactérias produtoras de L-cisteína

[0048] Exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- cisteína incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli JM15 transformadas com alelos cysE diferentes que codificam serina-acetiltransferases resistentes à retroalimentação (Patente U.S. n° 6.218.168 B1, Patente Russa n° 2279477 C2), E. coli W3110 tendo genes superexpressados que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para células (Patente U.S. n° 5.972.663 A), cepas E. coli tendo uma atividade de cisteína-dessulfo-hidrase diminuída (JP11155571 A2), E. coli W3110 tendo uma atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para régulon cisteína codificado pelo gene cysB (WO0127307 A1), e semelhantes.

Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico

[0049] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433 A1). A E. coli VL334 (VKPM B-1641) é cepa auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina tendo mutações nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. n° 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago P1 crescido nas células da cepa de tipo selvagem E. coli K-12 (VKPM B-7). Como um resultado, foi obtida uma cepa VL334thrC+ (VKPM B-8961) auxotrófica para L-isoleucina, que é capaz de produzir ácido L-glutâmico.

[0050] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas não se limitam às cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam glutamato-desidrogenase (gdhA), glutamina-sintetase (glnA), glutamato-sintetase (gltBD), isocitrato-desidrogenase (icdA), aconitato- hidratase (acnA, acnB), citrato-sintase (gltA), fosfoenolpiruvato-carboxilase (ppc), piruvato-carboxilase (pyc), piruvato-desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato-quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato-sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato-quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (gapA), triose-fosfato-isomerase (tpiA), frutose-bisfosfato-aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), e glicose- fosfato-isomerase (pgi).

[0051] Exemplos de cepas modificadas de modo que a expressão do gene codificador de citrato-sintetase, do gene codificador de fosfoenolpiruvato-carboxilase, e/ou do gene codificador de glutamato- desidrogenase está/estão aumentada(s) incluem aquelas reveladas em EP1078989 A2, EP955368 A2, e EP952221 A2.

[0052] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas tendo uma atividade decrescida ou eliminada de uma enzima que catalisa a síntese de um composto diferente de ácido L-glutâmico pela ramificação de uma rota de biossíntese de ácido L- glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem isocitrato-liase (aceA), α- cetoglutarato-desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato-quinase (ack), aceto-hidroxi-ácido-sintase (ilvG), acetolactato-sintase (ilvI), formiato- acetiltransferase (pfl), lactato-desidrogenase (ldh), glutamato-descarboxilase (gadAB), succinato-desidrogenase (sdhABCD), e 1-pirolina-5-carboxilato- desidrogenase (putA). Bactérias pertencendo ao gênero Escherichia deficientes na atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase ou tendo uma atividade reduzida de α-cetoglutarato-desidrogenase e métodos para obtê-las estão descritas (descritos) em Patentes U.S. n°s 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::KmR E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::KmR é uma cepa obtida pela disrupção do gene codificador de α-cetoglutarato-desidrogenase (daqui em diante chamado de “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em α-cetoglutarato-desidrogenase.

[0053] Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem as cepas que pertencem ao gênero Escherichia e têm resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Estas cepas podem também ser deficientes na atividade de α-cetoglutarato- desidrogenase e seus exemplos incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente U.S. n° 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que adicionalmente tem uma capacidade abaixada para decompor ácido L- glutâmico (Patente U.S. n° 5.393.671), E. coli AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente U.S. n° 6.110.714), e semelhantes.

[0054] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem bactérias Pantoea, como a cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), a cepa Pantoea ananatis SC17 (FERM BP-11091), e a cepa Pantoea ananatis SC17(0) (VKPM B-9246). A cepa AJ13355 é isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão, como uma cepa que pode se proliferar em um meio de pH baixo contendo ácido L- glutâmico como uma fonte de carbono. A cepa SC17 é selecionada como uma cepa mutante baixa produtora de muco proveniente da cepa AJ13355 (Patente U.S. n° 6.596.517). A cepa SC17 foi depositada na agência administrativa independente, “National Institute of Advanced Industrial Science and Technology”, “International Patent Organism Depository” (atualmente agência administrativa independente, “National Institute of Technology and Evaluation”, “International Patent Organism Depositary”, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 4 de fevereiro de 2009, e designada com um número de acesso de FERM BP-11091. A cepa AJ13355 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente, agência administrativa independente, “National Institute of Technology and Evaluation”, “International Patent Organism Depositary” (NITE IPOD), n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e designada com um número de acesso de FERM P16644. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e designado com um número de acesso de FERM BP-6614.

[0055] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientes na atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase ou têm uma atividade decrescida de α-cetoglutarato-desidrogenase, e podem ser obtidas conforme descrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356. (Patente U.S. n° 6.331.419 B1). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology”, “Ministry of International Trade and Industry” (atualmente NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 sob o número de acesso FERM P-16645. Foi então convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente em atividade de α-cetoglutarato-desidrogenase como um resultado da disrupção do gene codificador da subunidade αKGDH-E1 (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como a Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA etc. Embora AJ13356 esteja depositada no depósito anteriormente mencionado como Enterobacter agglomerans, para as finalidades deste relatório descritivo, é descrita como Pantoea ananatis.

[0056] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem as cepas pertencendo ao gênero Pantoea como a cepa Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, a cepa Pantoea ananatis AJ13601, a cepa Pantoea ananatis NP106, e a cepa Pantoea ananatis NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida pela introdução do plasmídeo RSFCPG contendo o gene codificador de citrato- sintase (gltA), o gene codificador de fosfoenolpiruvato-carboxilase (ppc), e o gene codificador de glutamato-desidrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli, e do plasmídeo pSTVCB contendo o gene codificador de citrato-sintase (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum, para dentro da cepa SC17sucA. A cepa AJ13601 é selecionada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma cepa resistente a uma concentração alta de ácido L-glutâmico em um pH baixo. A cepa NP106 foi obtida da cepa AJ13601 pela cura dos plasmídeos RSFCPG e pSTVCB. A cepa AJ13601 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente, NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 18 de agosto de 1999, e designada com um número de acesso de FERM P-17516. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e designado com um número de acesso de FERM BP-7207.

[0057] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas tendo resistência a um análogo de ácido aspártico. Tais cepas podem também ser deficientes na atividade de α- cetoglutarato-desidrogenase. Exemplos específicos de cepas tendo resistência a um análogo de ácido aspártico e deficientes na atividade de α-cetoglutarato- desidrogenase incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807, Patente U.S. n° 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que adicionalmente tem uma capacidade diminuída para decomposição de ácido L-glutâmico (Patente U.S. n° 5.393.671), e E. coli AJ13138 (FERM BP-5565, Patente U.S. n° 6.110.714).

Bactérias produtoras de L-histidina

[0058] Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como a cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677 C1), a cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536 C1), E. coli NRRL B-12116 - B- 12121 (Patente U.S. n° 4.388.,405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H- 9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. n° 6.344.347 B1), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087 A2), E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. n° 6.258.554 B1), e semelhantes.

[0059] Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-histidina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam ATP fosforribosiltransferase (hisG), fosforribosil-AMP-ciclo-hidrolase (hisI), fosforribosil-AMP-ciclo-hidrolase/fosforribosil-ATP-pirofosfatase (hisIE), fosforribosilformimino-5-aminoimidazol-carboxamida-ribotídeo-isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol-fosfato-aminotransferase (hisC), histidinol-fosfatase (hisB), histidinol-desidrogenase (hisD), etc.

[0060] É sabido que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e por hisBHAFI são inibidas pela L-histidina, e, portanto, uma capacidade para produzir L-histidina pode também ser eficientemente aumentada pela introdução de uma mutação na ATP- fosforribosiltransferase que confere resistência à inibição de retroalimentação (Patentes Russas n°s 2003677 C1 e 2119536 C1).

[0061] Exemplos específicos de cepas tendo uma capacidade para produzir L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048, que estão transformadas com um vetor transportando um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E. coli transformadas com rht, um gene para uma proteína exportadora de aminoácido (EP1016710 A2), cepa E. coli 80, que possui resistência à sulfaguanidina, à DL-1,2,4-triazol-3-alanina, e à estreptomicina (VKPM B- 7270, RU2119536 C1), E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR (RU2119536 e Doroshenko V.G. et al., “The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants”, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (em russo), 2013, 49(2):149-154.), etc.

Bactérias produtoras de L-isoleucina

[0062] Exemplos de bactérias produtoras de L-isoleucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- isoleucina incluem, mas não se limitam às, cepas mutantes tendo resistência à 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), cepas mutantes tendo resistência a um análogo de isoleucina como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, e cepas mutantes adicionalmente tendo resistência à DL-etionina e/ou ao hidroxamato de arginina (JP 5-130882 A). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, como treonina-desaminase e aceto-hidroxato-sintase, podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-isoleucina ou cepas parentais (JP 2458 A, EP0356739 A1, e Patente U.S. n° 5.998.178).

Bactérias produtoras de L-leucina

[0063] Exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas de E. coli resistentes à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. n° 6.124.121)); cepas de E. coli resistentes aos análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5- trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 8-70879 A); cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WO96/06926; E. coli H- 9068 (JP 8-70879 A), e semelhantes.

[0064] Exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem genes do operon leuABCD, que pode ser representado por um gene leuA mutante que codifica α-isopropilmalato-sintase isenta de inibição de retroalimentação por L-leucina (Patente U.S. n° 6,403,342 B1). Além disso, exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana está aumentada. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (ygaZH) (EP1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-lisina

[0065] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Escherichia e tendo resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, mas esta inibição é parcial ou completamente dessensibilizada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos do análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-AminoEtil)-L-Cisteína (AEC), Y-metil-lisina, α-clorocaprolactama, etc. Cepas mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo as bactérias pertencendo ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; consulte a Patente U.S. n° 4.346.170) e E. coli VL611. Nestas cepas, a inibição de retroalimentação de aspartoquinase por L-lisina está dessensibilizada.

[0066] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-lisina está aumentada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam aos, genes que codificam di- hidrodipicolinato-sintase (dapA), aspartoquinase III (lysC), di- hidrodipicolinato-redutase (dapB), diaminopimelato-descarboxilase (lysA), diaminopimelato-desidrogenase (ddh) (Patente U.S. n° 6.040.160), fosfoenolpiruvato-carboxilase (ppc), aspartato-semialdeído-desidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (EP1253195 A1). Além disso, as cepas parentais podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP1170376 A1), o gene que codifica nicotinamida- nucleotídeo- trans-hidrogenase (pntAB) (Patente U.S. n° 5.830.716 A), o gene ybjE (WO2005/073390), ou suas combinações. Visto que aspartoquinase III é propensa à inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase III dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-lisina (Patente U.S. n° 5.932.453) pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima. Adicionalmente, visto que a di- hidrodipicolinato-sintase é propensa à inibição de retroalimentação por L- lisina, um gene dapA mutante que codifica uma di-hidrodipicolinato-sintase dessensibilizada para inibição de retroalimentação por L-lisina pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima.

[0067] As bactérias produtoras de L-lisina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-lisina podem ter uma atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que catalisa uma reação que causa uma ramificação da rota de biossíntese de L- aminoácido e resulta na produção de outro composto. Também, bactérias produtoras de L-lisina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina podem ter uma atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que negativamente atua sobre a síntese ou a acumulação de L-lisina. Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homosserina-desidrogenase, lisina-descarboxilase (cadA, ldcC), enzima málica, etc., e cepas nas quais as atividades destas enzimas estão decrescidas ou deletadas são reveladas em WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175, etc.

[0068] A expressão de ambos os genes cadA e ldcC que codificam lisina-descarboxilase pode ser decrescida com a finalidade de decrescer ou deletar a atividade de lisina-descarboxilase. A expressão de ambos os genes pode ser decrescida, por exemplo, pelo método descrito em WO2006/078039.

[0069] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem a cepa E. coli WC196 (Patente U.S. n° 5.827.698), a cepa E. coli WC196ΔcadAΔldc, e a cepa E. coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO2006/078039).

[0070] A cepa WC196 foi gerada a partir da cepa W3110, que foi derivada da E. coli K-12, pela concessão à cepa W3110 de resistência à AEC (S-(2-AminoEtil)-L-Cisteína) (Patente U.S. n° 5.827.698). A cepa WC196 foi chamada de E. coli AJ13069, depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba- ken, 292-0818, Japão) em 6 de dezembro de 1994 D, e designada com um número de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e designada com um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. n° 5.827.698).

[0071] A cepa WC196ΔcadAΔldc foi construída a partir da cepa WC196 por disrupção dos genes cadA e ldcC que codificam lisina- descarboxilase. A cepa WC196ΔcadAΔldcC foi designada AJ110692 e depositada no “National Institute of Bioscience and Human-Technology”, “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional sob o número de acesso FERM BP-11027.

[0072] A cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 foi construída pela introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes para a biossíntese de lisina na cepa WC196ΔcadAΔldcC (Patente U.S. n° 6.040.160). O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e que codifica uma di-hidrodipicolinato-sintase (DDPS) tendo uma mutação para dessensibilização de inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene mutante lysC derivado de Escherichia coli e que codifica aspartoquinase III tendo uma mutação para dessensibilização à inibição de retroalimentação por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica di- hidrodipicolinato-redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica diaminopimelato-desidrogenase.

[0073] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). A cepa AJIK01 foi designada E. coli AJ111046, e depositada em NITE IPOD (n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 29 de janeiro de 2013. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as cláusulas do Tratado de Budapeste em 15 de maio de 2014, e designada com um número de acesso de NITE BP-01520.

Bactérias produtoras de L-metionina

[0074] Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- metionina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como cepas de E. coli AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) (Patent GB2075055); e cepas de E. coli 218 (VKPM B-8125) (RU2209248 C2) e 73 (VKPM B-8126) (RU2215782 C2) resistentes à norleucina, ao análogo de L-metionina, ou semelhantes. A cepa E. coli 73 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny Proezd, 1) em 14 de maio de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8126, e foi convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de 2002. Adicionalmente, uma cepa deficiente em repressor metionina e cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-metionina como homosserina-transsuccinilase e cistationina-Y-sintase (JP 2000-139471 A) podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-metionina ou cepas parentais.

Bactérias produtoras de L-ornitina

[0075] Como L-ornitina é um intermediário da rota biossintética de L- arginina, exemplos de bactérias produtoras de L-ornitina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-ornitina, incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina, como aquelas descritas acima, está aumentada.

[0076] Uma bactéria produtora de L-ornitina pode ser facilmente obtida a partir de qualquer bactéria produtora de L-arginina, por exemplo cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), pela inativação de ornitina-carbamoiltransferase codificada por ambos os genes argF e argI. Métodos para inativação de ornitina-carbamoiltransferase são descritos neste documento. Bactérias produtoras de L-fenilalanina

[0077] Exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- fenilalanina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) hospedando o gene pheA34 mutante (Patente U.S. n° 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B- 12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (Patente U.S. n° 4.407.952), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR- aroG4, pACMAB] nomeada como AJ12604 (FERM BP-3579) (EP488424 B1). Adicionalmente, bactérias produtoras de L-fenilalanina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenilalanina também incluem as cepas pertencendo ao gênero Escherichia e tendo uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (Pedidos de Patentes U.S. n°s 20030148473 A1 e 20030157667 A1). Bactérias produtoras de L-prolina

[0078] Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012), que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP1172433 A1). Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina está aumentada. Exemplos de tais genes que podem ser usados em bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB que codifica glutamato-quinase com inibição de retroalimentação dessensibilizada por L-prolina (DE3127361 A1). Além disso, exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina também incluem as cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas responsáveis pela excreção de L-aminoácido da célula bacteriana está aumentada. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

[0079] Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia que têm uma capacidade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB n° 2075056), VKPM B- 8012 (Pedido de Patente Russo n° 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em DE3127361 A1, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F.R. et al. em “The 15th Miami Winter Symposium”, 1983, p.34, e semelhantes.

Bactérias produtoras de L-treonina

[0080] Exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- treonina incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patentes U.S. nos 5.175.107 e 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U.S. n° 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U.S. n° 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. n° 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. n° 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner M. et al., Genetika (em russo), 1978, 14:947-956), E. coli VL643 e VL2055 (EP1149911 A2), E. coli VKPM B-5318 (EP0593792 A1), e semelhantes.

[0081] A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, sendo também assimilativa de sacarose, e o seu gene ilvA tem uma mutação hipomórfica. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, cuja mutação concede resistência às concentrações altas de treonina ou de homosserina. A cepa VKPM B-3996, que contém o plasmídeo pVIC40, foi obtida pela introdução do plasmídeo pVIC40 na cepa TDH-6. O plasmídeo pVIC40 foi obtido pela inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA mutante codifica aspartoquinase- homosserina-desidrogenase I que está substancialmente dessensibilizada para inibição de retroalimentação por treonina. A cepa VKPM B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no “All-Union Scientific Center of Antibiotics” (“Russian Federation”, 117105 Moscou, Rua Nagatinskaya 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa VKPM B-3996 foi também depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso VKPM B-3996.

[0082] A cepa B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina; e um repressor C1 de fago-lambda sensível à temperatura e o promotor PR substituem a região regulatória do operon treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) em 3 de maio de 1990 sob o número de acesso VKPM B-5318.

[0083] As bactérias produtoras de L-treonina ou cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-treonina podem ser adicionalmente modificadas para aumentar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartoquinase- homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homosserina-quinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína de transmembrana putativa do sistema de efluxo de treonina e de homosserina; - o gene asd que codifica aspartato-e-semialdeído- desidrogenase; e - o gene aspC que codifica aspartato-aminotransferase (aspartato-transaminase);

[0084] O gene thrA que codifica aspartoquinase I e homosserina- desidrogenase I de E. coli foi elucidado (“KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”, entrada n° b0002; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 337 a 2.799; Gene ID: 945803). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12.

[0085] O gene thrB que codifica homosserina-quinase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0003; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 2.801 a 3.733; Gene ID: 947498). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12.

[0086] O gene thrC que codifica treonina-sintase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0004; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 3.734 a 5.020; Gene ID: 945198). O gene thrC está localizado entre os genes thrB e yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon treonina thrABC. Para aumentar a expressão do operon treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (WO2005049808 A1, WO2003097839 A1).

[0087] O gene thrA mutante que codifica aspartoquinase I e homosserina-desidrogenase I resistentes à inibição de retroalimentação por L- treonina, e também, os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon a partir de plasmídeo pVIC40 bem conhecido que está presente na cepa de E. coli VKPM B-3996 produtora de L-treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente U.S. n° 5.705.371.

[0088] O gene rhtA que codifica uma proteína do sistema de efluxo de treonina e de homosserina (uma proteína transportadora da membrana interna) de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0813; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 848.433 a 849.320, complemento; Gene ID: 947045). O gene rhtA está localizado entre os genes dps e ompX no cromossomo de E. coli K-12 próximos ao operon glnHPQ, que codificam componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao gene ybiF (KEGG, entrada n° b0813).

[0089] O gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido- desidrogenase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b3433; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 3.571.798 a 3.572.901, complemento; Gene ID: 947939). O gene asd está localizado entre os genes glgB e gntU na mesma fita (o gene yhgN na fita oposta) no cromossomo de E. coli K-12.

[0090] Também, o gene aspC que codifica aspartato-aminotransferase de E. coli foi elucidado (KEGG, entrada n° b0928; número de acesso ao GenBank de NC_000913.2; posições de nucleotídeos: 983.742 a 984.932, complemento; Gene ID: 945553). O gene aspC está localizado entre o gene ycbL na fita oposta e o gene ompF na mesma fita no cromossomo de E. coli K-12.

Bactérias produtoras de L-triptofano

[0091] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar the bactérias produtoras de L- triptofano incluem, mas não se limitam às, cepas pertencendo ao gênero Escherichia como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficientes na triptofanoil-tRNA-sintetase codificada pelo gene trpS mutante (Patente U.S. n° 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) tendo um alelo serA que codifica fosfoglicerato-desidrogenase isenta de inibição de retroalimentação por serina e um alelo trpE que codifica antranilato-sintase isenta de inibição de retroalimentação por triptofano (Patente U.S. n° 6.180.373 B1), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanoase (Patente U.S. n° 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps tendo uma capacidade aumentada para produzir fosfoenolpiruvato (WO97/08333, Patente U.S. n° 6,319,696 B1), e semelhantes. Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-triptofano também incluem as cepas pertencendo ao gênero Escherichia e tendo uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (Pedidos de Patentes U.S. n°s 2003148473 A1 e 2003157667 A1).

[0092] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- triptofano também incluem as cepas nas quais uma ou mais atividades das enzimas selecionadas dentre antranilato-sintase, fosfoglicerato-desidrogenase, e triptofano sintase estão aumentadas. As antranilato-sintase e fosfoglicerato- desidrogenase são ambas propensas à inibição de retroalimentação por L- triptofano e L-serina, e consequentemente, uma mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo uma tal mutação incluem E. coli SV164, que hospeda antranilato-sintase dessensibilizada, e uma cepa transformante obtida pela introdução na E. coli SV164 (WO94/08031 A1) do plasmídeo pGH5, que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato-desidrogenase dessensibilizada para retroalimentação.

[0093] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L- triptofano também incluem cepas nas quais está introduzido o operon triptofano que contém um gene que codifica antranilato-sintase dessensibilizada (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, Patente U.S. n° 4.371.614). Além disso, a capacidade para produzir L-triptofano pode ser concedida pelo aumento da expressão de um gene que codifica triptofano- sintase, dentre os operons triptofano (trpBA). A triptofano-sintase consiste em subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade para produzir L-triptofano pode ser aprimorada pelo aumento da expressão do operon isocitrato-liase-malato- sintase (WO2005/103275).

Bactérias produtoras de L-valina

[0094] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina incluem, mas não se limitam às, cepas que estão modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. n° 5.998.178). É desejável remover a região do operon ilvGMEDA que é necessária para atenuação de modo que a expressão do operon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Adicionalmente, o gene ilvA no operon é desejavelmente disrupcionado de maneira que a atividade de treonina-desaminase seja decrescida.

[0095] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem cepas mutantes tendo uma mutação em aminoacil-tRNA-sintetase (Patente U.S. n° 5.658.766). Exemplos de tais cepas incluem E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina-tRNA-sintetase. E. coli VL1970 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny Proezd, 1) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411.

[0096] Adicionalmente, cepas mutantes que necessitam de ácido lipoico para crescerem e/ou estão isentas de H+-ATPase podem também ser usadas como bactérias produtoras de L-valina ou cepas parentais (WO96/06926 A1).

[0097] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e de cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem as cepas E. coli H81 (VKPM B-8066; consulte, por exemplo, EP1942183 B1), E. coli NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente U.S. n° 4.391.907), E. coli VKPM B-4411 (Patente U.S. n° 5,658,766), E. coli VKPM B-7707 (EP1016710 A2), ou semelhantes.

[0098] A bactéria da presente invenção pertencendo à família Enterobacteriaceae está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[0099] A frase “uma bactéria está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato” pode significar que a bactéria está modificada em uma tal maneira que na bactéria modificada a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada. Por exemplo, a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato pode ser atenuada devido à inativação do gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[00100] A frase “um gene que codifica proteína transportadora de fosfato está inativado” pode significar que o gene modificado codifica uma proteína não funcional ou completamente inativa em comparação com uma bactéria que contém um gene que codifica proteína transportadora de fosfato de tipo selvagem ou não modificado. Também é aceitável que a região de DNA modificada seja incapaz de naturalmente expressar o gene devido à deleção de uma parte do gene ou à deleção do gene inteiro, à substituição de uma ou mais bases para causar uma substituição de aminoácido na proteína codificada pelo gene (mutação de sentido trocado ou incorreto), introdução de um códon de terminação (mutação sem sentido), deleção de uma ou duas bases para causar um deslocamento da matriz de leitura do gene, inserção de um gene para resistência a droga e/ou de sinal de terminação de transcrição, ou modificação de uma região adjacente do gene, incluindo sequencias que controlam a expressão de gene expressão como promotor(es), intensificador(es), atenuador(es), sítio(s) de ligação ao ribossomo, etc. Inativação do gene pode também ser realizada, por exemplo, por métodos convencionais como tratamento de mutagênese usando irradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese sítio- direcionada, disrupção de gene usando recombinação homóloga, e/ou mutagênese por inserção-deleção (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128) com base em “integração conduzida por Red/ET (“Red/ET- driven integration”) ou integração mediada por XRed/ET (“XRed/ET-mediated integration”).

[00101] A frase “expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada” pode significar que a quantidade de uma proteína transportadora de fosfato na bactéria modificada, na qual a expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada, está reduzida em comparação com uma bactéria não modificada, por exemplo, uma cepa parental ou de tipo selvagem como E. coli K-12.

[00102] A frase “expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada” também pode significar que a bactéria modificada contém uma região funcionalmente ligada ao gene, incluindo sequências que controlam a expressão de gene como promotores, intensificadores, atenuadores e sinais de terminação de transcrição, sítios de ligação ao ribossomo, e outros elementos de controle de expressão, que está modificada resultando no decréscimo do nível de expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato; e outros exemplos (consulte, por exemplo, WO95/34672; Carrier T.A. e Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64). A frase “funcionalmente ligada ao gene” pode significar que a região regulatória (as regiões regulatórias) está/estão ligada(s) à sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico ou do gene em uma tal maneira que permite a expressão (por exemplo, expressão intensificada, aumentada, constitutiva, basal, antiterminada, atenuada, desregulada, decrescida, ou reprimida) da sequência de nucleotídeos, especificamente, a expressão de um produto de gene codificado pela sequência de nucleotídeos.

[00103] A frase “expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato está atenuada” pode também especificamente significar que quantidade de expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato, tal como a quantidade de mRNA do gene ou a quantidade da proteína transportadora de fosfato codificada pelo gene, está reduzida para, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela de uma bactéria não modificada.

[00104] A expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato pode ser atenuada pela substituição de uma sequência de controle de expressão do gene, tal como um promotor no DNA cromossômico, por uma mais fraca. A força de um promotor é definida pela frequência de atuações de iniciação de síntese de RNA. Exemplos de métodos para avaliar a força de promotores e de promotores fortes estão descritos em Goldstein M.A. et al. (Goldstein M.A. e Doi R.H., “Prokaryotic promoters in biotechnology”, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128), etc. Adicionalmente, também é possível introduzir uma ou mais substituições de nucleotídeos em uma região de promotor do gene e assim modificar o promotor para um enfraquecido conforme revelado em WO0018935 A1. Adicionalmente, é sabido que a substituição de vários nucleotídeos na sequência de Shine-Dalgarno (SD), e/ou na sequência espaçadora entre a sequência de SD e o códon de iniciação, e/ou uma sequência imediatamente a montante e/ou a jusante do códon de iniciação no sítio de ligação ao ribossomo (RBS, “ribosome-binding site”) afeta enormemente a eficiência de tradução de mRNA. Esta modificação do RBS pode ser combinada com decréscimo da transcrição de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[00105] A expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato pode também ser atenuada pela inserção de um transpóson ou de uma sequência de inserção (IS, “insertion sequence”) na região codificadora do gene (Patente U.S. n° 5.175.107) ou na região controladora de expressão de gene, ou por métodos convencionais como mutagênese com irradiação ultravioleta (UV) ou nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, NTG). Adicionalmente, a incorporação de uma mutação sítio-específica pode ser conduzida por métodos de edição cromossômica como base, por exemplo, em recombinação mediada por ÀRed/ET (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645).

[00106] O número de cópias, a presença ou ausência do gene que codifica proteína transportadora de fosfato podem ser medidos, por exemplo, por restrição do DNA cromossômico seguida por transferência de Southern (“Southern blotting”) usando uma sonda com base na sequência de gene, hibridização fluorescente in situ (FISH, “fluorescence in situ hybridization”), e semelhantes. O nível de expressão de gene pode ser determinado pela medição da quantidade de mRNA transcrito a partir do gene usando vários métodos bem conhecidos, incluindo transferência de Northern (“Northern blotting”), RT-PCR quantitativa, e semelhantes. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguida por ensaio de imunotransferência (“immunoblotting assay”) (análise por transferência de Western, “Western blotting analysis”), ou análise por espectrometria de massa das amostras de proteínas, e semelhantes.

[00107] Métodos para manipulação com moléculas recombinantes de DNA e clonagem molecular como a preparação de DNA plasmídeo, as digestão, ligação e transformação de DNA, a seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador, a incorporação de mutações, e semelhantes podem ser métodos comuns bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook J., Fritsch E.F. e Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ou Green M.R. e Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak e Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009).

[00108] A atividade de transporte de fosfato inorgânico da proteína transportadora PitA ou de sua proteína homóloga ou proteína variante como PitB pode ser determinada pela avaliação da absorção de fosfato inorgânico marcado com fósforo radioativo 33 (33P) (Harris R.M. et al., “Characterization of PitA and PitB from Escherichia coli”, J. Bacteriol., 2001, 183(17):5008-5014). A concentração de proteína pode ser determinada pelo ensaio de proteína de Bradford (Bradford M.M., “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Anal. Biochem., 1976, 72:248-254) usando albumina de soro bovino como um padrão.

[00109] A frase “um gene que codifica proteína transportadora de fosfato” pode significar um gene que codifica uma proteína transportadora de fosfato. O gene que codifica proteína transportadora de fosfato pode ser o gene pitA e seu(s) homólogo(s) ou sua(s) sequência(s) de nucleotídeos variante(s), como, por exemplo, o gene pitB. A descrição mais específica de pitA, pitB, e de seus homólogos e de suas sequências de nucleotídeos variantes é fornecida adiante neste documento.

[00110] O gene pitA (sinônimo: pit) codifica uma proteína transportadora de fosfato inorgânico de afinidade baixa 1 PitA (KEGG, “Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”, entrada n° b3493; “Protein Knowledgebase”, UniProtKB/Swiss-Prot, número de acesso P0AFJ7). O gene pitA (número de acesso ao GenBank de NC_000913.3; posições de nucleotídeos: 3637642 a 3639141; Gene ID: 948009) está localizado entre os genes yhiN e uspB na fita oposta no cromossomo de cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene pitA da cepa de E. coli K-12 e a sequência de aminoácidos da proteína PitA codificada pelo gene pitA da cepa de E. coli K-12 são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

[00111] O gene pitB codifica uma proteína transportadora de fosfato inorgânico de afinidade baixa 2 PitB (KEGG, “Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”, entrada n° b2987; “Protein Knowledgebase”, UniProtKB/Swiss-Prot, número de acesso P43676). O gene pitB (número de acesso ao GenBank de NC_000913.3; posições de nucleotídeos: 3134872 a 3136371, complemento; Gene ID: 947475) está localizado entre o gene yghT na fita oposta e o gene gss na mesma fita no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene pitB da cepa de E. coli K-12 e a sequência de aminoácidos da proteína PitB codificada pelo gene pitB da cepa de E. coli K-12 são mostradas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

[00112] Visto que pode haver algumas diferenças em sequências de DNA entre os gêneros, as espécies, ou as cepas da família Enterobacteriaceae, os genes pitA e pitB não são limitados aos genes mostrados em SEQ ID NOs: 1 e 3, mas podem incluir genes que são sequências de nucleotídeos variantes de ou homólogas à SEQ ID NO: 1 ou 3, e que codificam proteínas PitA e PitB variantes.

[00113] A frase “uma proteína variante” pode significar uma proteína que tem uma ou várias alterações na sequência em comparação com a SEQ ID NO: 2 ou 4, quer elas são substituições, deleções, inserções, e/ou adições de um ou vários resíduos de aminoácido, mas ainda mantém uma atividade ou função similar àquela da proteína PitA ou PitB, quer a estrutura tridimensional da proteína PitA ou PitB não está significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem ou não modificada. O número de alterações na proteína variante depende da posição de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou do tipo de resíduos de aminoácido. Ele pode ser também, mas não estritamente limitado a, 1 a 30, em outro exemplo 1 a 15, em outro exemplo 1 a 10, e em outro exemplo 1 a 5, na SEQ ID NO: 2 ou 4. Isto é porque alguns aminoácidos têm homologia alta uns com os outros de modo que a atividade ou função não é afetada por uma tal alteração, ou a estrutura tridimensional de PitA ou PitB não é significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem ou não modificada. Portanto, as variantes de proteína codificadas pelos genes pitA e pitB podem ter uma homologia, definida como o parâmetro “identidade” quando se usa o programa de computador BLAST, de não menor que 80%, não menor que 85%, não menor que 90%, não menor que 95%, não menor que 98%, ou não menor que 99% em relação à sequência de aminoácidos inteira mostrada em SEQ ID NO: 2 ou 4, desde que a atividade ou função da proteína PitA ou PitB seja mantida, ou a estrutura tridimensional de PitA ou PitB não seja significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem ou não modificada.

[00114] As substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificadoras de um ou vários resíduos de aminoácido pode ser uma mutação conservativa (mutações conservativas). A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. A substituição conservativa pode ser, mas não se limita a, uma substituição, em que a substituição ocorre mutuamente dentre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; dentre Ala, Leu, Ile e Val, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, His e Thr, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofílico; entre Gln e Asn, se o sítio de substituição for um aminoácido polar; dentre Lys, Arg e His, se o sítio de substituição for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o sítio de substituição for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se o sítio de substituição for um aminoácido tendo grupo hidroxila. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ala por Ser ou Thr, substituição de Arg por Gln, His ou Lys, substituição de Asn por Glu, Gln, Lys, His ou Asp, substituição de Asp por Asn, Glu ou Gln, substituição de Cys por Ser ou Ala, substituição de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg, substituição de Glu por Asn, Gln, Lys ou Asp, substituição de Gly por Pro, substituição de His por Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr, substituição de Ile por Leu, Met, Val ou Phe, substituição de Leu por Ile, Met, Val ou Phe, substituição de Lys por Asn, Glu, Gln, His ou Arg, substituição de Met por Ile, Leu, Val ou Phe, substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu, substituição de Ser por Thr ou Ala, substituição de Thr por Ser ou Ala, substituição de Trp por Phe ou Tyr, substituição de Tyr por His, Phe ou Trp, e substituição de Val por Met, Ile ou Leu.

[00115] As substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificadoras de um ou vários resíduos de aminoácido pode também ser uma substituição não conservativa (substituições não conservativas) desde que a(s) mutação (mutações) seja(m) compensada(s) por uma ou mais mutações secundárias na posição diferente (nas posições diferentes) de sequência de aminoácidos de maneira que a atividade ou função da proteína variante seja mantida ou similar àquela da proteína PitA ou PitB, ou a estrutura tridimensional de PitA ou PitB não seja significativamente alterada em relação à proteína de tipo selvagem ou não modificada.

[00116] Para avaliar o grau de homologia de proteína ou de DNA, vários métodos de cálculo podem ser usados, como pesquisa em BLAST, pesquisa em FASTA e método ClustalW. A pesquisa em BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) é o algoritmo de pesquisa heurístico utilizado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx; estes programas atribuem significância às suas descobertas usando o método estatístico de Karlin S. et al. (Karlin S. e Altschul S.F., “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; Karlin S. e Altschul S.F., “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877). O programa de computador BLAST calcula três parâmetros: escore, identidade e similaridade. O método de pesquisa em FASTA é descrito em Pearson W.R. (“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98). O método ClustalW é também descrito em Thompson J.D. et al. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680).

[00117] Além disso, os genes pitA e pitB podem ser sequências de nucleotídeos variantes. A frase “uma sequência de nucleotídeos variante” pode significar uma sequência de nucleotídeos que codifica “uma proteína variante” usando quaisquer códons de aminoácido sinônimos de acordo com a tabela de código genético padrão (consulte, por exemplo, Lewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458). Portanto, os genes pitA e pitB podem ser sequências de nucleotídeos variantes devido à degeneração do código genético.

[00118] A frase “uma sequência de nucleotídeos variante” também pode significar, mas não se limita a, uma sequência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes com a sequência de nucleotídeos complementar à sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes desde que ela codifique proteína funcional. “Condições estringentes” incluem aquelas sob as quais é formado um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia, definida como o parâmetro “identidade” quando se usa o programa de computador BLAST, de não menor que 75%, não menor que 80%, não menor que 85%, não menor que 90%, não menor que 95%, não menor que 96%, não menor que 97%, não menor que 98%, ou não menor que 99%, e não é formado um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia menor que a acima. Por exemplo, as condições estringentes podem ser exemplificadas por lavagem uma ou mais vezes, ou em outro exemplo, duas ou três vezes, em uma concentração salina de SSCxl (citrato de sódio padrão ou cloreto de sódio padrão), SDS (“ sodium dodecyl sulphate”, dodecilsulfato de sódio) 0,1%, ou em outro exemplo, SSCx0,1, SDS 0,1% a 60°C ou 65°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada para transferência (“blotting”) e, por via de regra, pode ser aquela que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de náilon positivamente carregada Amersham HybondTM-N+ (GE Healthcare) sob condições estringentes é 15 minutes. A etapa de lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Como a sonda, uma parte da sequência complementar às sequências mostradas em SEQ ID NO: 1 ou 3 pode também ser usada. Uma tal sonda pode ser produzida por PCR usando oligonucleotídeos como iniciadores preparados com base na sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 ou 3 e um fragmento de DNA contendo a sequência de nucleotídeos como um molde. É recomendado que o comprimento da sonda seja >50 pb; ele pode ser adequadamente selecionado dependendo das condições de hibridização, e é habitualmente 100 pb a 1 kpb. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem após a hibridização podem ser exemplificadas por SSCx2, SDS 0,1% a 50°C, 60°C ou 65°C.

[00119] Visto que os genes que codificam as proteínas PitA e PitB das espécies de E. coli já foram elucidados (consulte acima), as sequências de nucleotídeos variantes que codificam proteínas variantes das proteínas PitA e PitB podem ser obtidas por PCR (“polymerase chain reaction”, reação em cadeia da polimerase; consulte White T.J. et al., “The polymerase chain reaction”, Trends Genet., 1989, 5:185-189) utilizando iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene pitA ou pitB; ou o método de mutagênese sítio-direcionada pelo tratamento de um DNA contendo o gene pitA ou pitB de tipo selvagem in vitro, por exemplo, com hidroxilamina, ou um método para tratamento de um micro-organismo, por exemplo, uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae hospedando os genes pitA e pitB de tipo selvagem com irradiação ultravioleta (UV) ou com um agente mutagênico como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso habitualmente utilizada (utilizado) para o tal tratamento; ou quimicamente sintetizada como estrutura de gene de comprimento total. Os genes que codificam as proteínas PitA e PitB ou suas proteínas variantes de outros micro-organismos podem ser obtidos em uma maneira similar.

[00120] A frase “uma proteína de tipo selvagem” pode significar uma proteína nativa produzida na natureza por uma cepa bacteriana de tipo selvagem ou não modificada da família Enterobacteriaceae, por exemplo, pela cepa de tipo selvagem E. coli MG1655. Uma proteína de tipo selvagem pode ser codificada pelo gene de tipo selvagem, ou não modificado, que ocorre na natureza no genoma de uma bactéria de tipo selvagem.

[00121] A bactéria conforme descrita neste documento pode ser obtida pela modificação de uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade para produzir um L-aminoácido para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato. Alternativamente, a bactéria conforme descrita neste documento pode ser obtida pela concessão da capacidade para produzir um L-aminoácido a uma bactéria já modificada para atenuar a expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

[00122] As descrições acima em relação às variantes dos genes e das proteínas pode também ser aplicada mutatis mutandis às proteínas arbitrárias como enzimas da biossíntese de L-aminoácido e genes que as codificam.

[00123] A bactéria pode ter, além das propriedades já mencionadas, outras propriedades como requisitos de vários nutrientes, resistência a droga, sensibilidade a droga, dependência de droga, sem se desviar do escopo da presente invenção.

2. Método

[00124] Um método da presente invenção inclui o método para produzir um L-aminoácido como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-citrulina, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina, ou um sal do mesmo, ou uma sua mistura. Especificamente, um método da presente invenção inclui o método para produzir L-arginina, L- glutamina, L-histidina, e L-prolina, ou uma sua mistura. Mais especificamente, um método da presente invenção inclui o método para produzir L-arginina e L-histidina.

[00125] O método para produzir um L-aminoácido pode incluir as etapas de cultivar a bactéria conforme descrita neste documento em um meio de cultura para permitir que o L-aminoácido seja produzido, excretado, e/ou acumulado no meio de cultura ou nas células bacterianas, e coletar o L- aminoácido do meio de cultura e/ou das células bacterianas. O aminoácido coletado pode ser adicionalmente purificado. O L-aminoácido pode ser produzido sob uma sua forma livre, uma sua forma de sal ou uma sua forma de hidrato, ou uma sua forma de aduto com outro composto orgânico ou inorgânico, ou como uma combinação das mesmas. Por exemplo, sais de sódio, de potássio, de amônio, e semelhantes do L-aminoácido podem ser produzidos pelo método. Especificamente, um sal de monocloridrato de um L-aminoácido pode ser produzido pelo método tal como o sal monocloridrato de L-lisina (L-lisina-HCl) ou o sal monocloridrato de L-arginina (L-arginina- HCl); ou o sal monocloridrato mono-hidrato de um L-aminoácido pode ser produzido pelo método tal como monocloridrato mono-hidrato de L-histidina (L-histidina-HCbHO).

[00126] O cultivo da bactéria, e a coleta e a purificação do L- aminoácido podem ser realizados em uma maneira similar àquela dos métodos de fermentação convencionais nos quais o L-aminoácido é produzido usando um micro-organismo. O meio de cultura para a produção do L- aminoácido pode ser um meio quer sintético quer natural como um meio típico que contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos e inorgânicos conforme a necessidade. Como a fonte de carbono, sacarídeos como glicose, lactose, galactose, frutose, arabinose, maltose, xilose, trealose, ribose, sacarose, e hidrolisados de amidos; álcoois como etanol, glicerol, manitol e sorbitol; ácidos orgânicos como ácido glicônico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido málico, e ácido succínico; ácidos graxos; e semelhantes podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, sais inorgânicos de amônio como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio; nitrogênio orgânico como hidrolisados de soja; gás amônia; amônia aquosa; e semelhantes podem ser utilizados. A fonte de enxofre pode incluir sulfato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, e semelhantes. O meio pode conter uma fonte de fósforo além de uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e uma fonte de enxofre. Como a fonte de fósforo, di- hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, polímeros de fosfato como ácido polifosfórico etc. podem ser usados. Vitaminas como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; substâncias necessárias, por exemplo, nutrientes orgânicos como ácidos nucleicos como adenina e RNA, ou extrato de levedo; e semelhantes podem estar presentes em quantidades apropriadas, mesmo se em quantidades-traço. Além destas, quantidades pequenas de fosfato de cálcio, de íons de ferro, de íons de manganês, e semelhantes podem ser adicionadas, se necessárias.

[00127] A cultivação pode ser realizada sob condições aeróbicas durante 16 h a 72 h, ou durante 16 h a 65 h; a temperatura da cultura durante a cultivação pode ser controlada dentro da faixa de 30°C a 37°C; e o pH pode ser ajustado entre 5 e 8, ou entre 6,0 e 7,5. O pH pode ser ajustado pelo uso de uma substância ácida ou alcalina inorgânica ou orgânica, e também de gás amônia.

[00128] Após a cultivação, sólidos como células e restos celulares podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração por membrana, e então o L-aminoácido-alvo pode ser recuperado do líquido de fermentação por qualquer combinação de técnicas convencionais como concentração, cromatografia de troca de íons, e cristalização.

[00129] A composição de L-aminoácido-alvo coletada pode conter células microbianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos subprodutos do micro-organismo além do L-aminoácido-alvo. A pureza da substância-alvo coletada é 50% ou maior, preferencialmente 85% ou maior, particularmente preferencialmente 95% ou maior (Patente U.S. n° 5.431.933, Patente Japonesa n° 1214636, Patentes U.S. n°s 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, Pedido Publicado de Patente U.S. n° 2005/0025878).

EXEMPLOS

[00130] A presente invenção será mais especificamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitadores.

Exemplo 1. Construção da cepa de E. coli produtora de L-histidina tendo um gene pitA inativado 1.1. Construção da cepa de E. coli MG1655ΔpitA

[00131] Uma cepa de E. coli tendo um gene pitA inativado foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado “integração mediada por ÀRed/ET” (“ARed/ET- mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). Um fragmento de DNA contendo o gene marcador de resistência à canamicina (KmR) foi obtido por PCR usando os iniciadores P1 (SEQ ID NO: 5) e P2 (SEQ ID NO: 6), e o plasmídeo pMW118-XattL-KmR-ÂattR (WO2011043485 A1) como o molde (FIG. 1). O plasmídeo pMW118-XattL-KniR-ÀattR foi construído a partir do plasmídeo pMW118-attL-TcR-attR (WO2005/010175) pela substituição do seu gene marcador de resistência à tetraciclina pelo gene marcador de resistência à canamicina (kan) do plasmídeo pUC4K (Vieira J. e Messing J., Gene, 1982, 19(3):259-268). Os iniciadores P1 e P2 são homólogos a ambas as regiões adjacentes ao gene pitA e ao gene kan que confere resistência à canamicina no plasmídeo molde. As condições para a PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 95°C; perfil para os 2 ciclos iniciais: 1 min a 95°C, 30 s a 34°C, 40 s a 72°C; perfil para os 30 ciclos finais: 30 s a 95°C, 30 s a 50°C, 40 s a 72°C; alongamento final: 5 min a 72°C.

[00132] O produto-1 de PCR obtido (SEQ ID NO: 7; 1.613 pb) foi purificado por eletroforese em gel de agarose e usado para eletroporação da cepa E. coli MG1655 contendo o plasmídeo pKD46 tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) inclui um fragmento de DNA de 2.154 nucleotídeos de fago À (posições de nucleotídeos de 31088 a 33241, número de acesso ao GenBank de: J02459), e contém os genes do sistema de recombinação homóloga ÀRed (genes y, β, e exo) sob o controle do promotor ParaB induzível por arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para a integração do produto de PCR no cromossomo da cepa E. coli MG1655 (ATCC 47076). A cepa E. coli MG1655 contendo o plasmídeo pKD46 pode ser obtida junto ao “E. coli Genetic Stock Center”, Yale University, New Haven, EUA (Número de Acesso CGSC7669).

[00133] Células eletrocompetentes foram preparadas como segue: E. coli MG1655/pKD46 foi crescida de um dia para outro a 30°C em meio-LB (caldo de Luria-Bertani, também chamado de caldo lisogênico; Sambrook J. e Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) contendo ampicilina (100 mg/L); então a cultura foi diluída 100 vezes com 5 mL de meio-SOB (Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) contendo ampicilina (100 mg/L) e L-arabinose (1 mM); a cultura obtida foi crescida com aeração (250 rpm) a 30°C para OD600 de cerca de 0,6 e então tornada eletrocompetente por concentração de 100 vezes e lavagem três vezes com H2O deionizada gelada. Eletroporação foi realizada usando 70 μL de células e cerca de 100 ng do produto de PCR. As células eletroporadas foram incubadas com 1 mL de meio-SOC (Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) a 37°C durante 2,5 h, postas sobre placas contendo o caldo lisogênico (Sambrook J. w Russell D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3rd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001), ágar (1,5%) e canamicina (50 mg/L), e crescidas a 37°C para selecionar KmR-recombinantes. Para eliminar o plasmídeo pKD46, foram realizadas duas passagens em L-ágar suplementado com canamicina (50 mg/L) a 42°C, e as colônias obtidas foram testadas para a sensibilidade à ampicilina. Dessa forma foi construída a cepa E. coli MG1655ΔpitA tendo o gene marcador KmR.

1.2. Verificação da deleção do gene pitA

[00134] A deleção do gene pitA marcado com gene para resistência à canamicina na cepa mutante E. coli MG1655ΔpitA foi verificada por PCR. Iniciadores P3 (SEQ ID NO: 8) e P4 (SEQ ID NO: 9) lócus-específicos foram usados para a verificação. As condições para a PCR foram as seguintes: desnaturação durante 3 min a 94°C; perfil para os 30 ciclos: 30 s a 94°C, 30 s a 55°C, 2 min a 72°C; alongamento final: 6 min a 72°C. O produto-2 de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico como o molde a partir da cepa parental E. coli MG1655 tendo gene pitA nativo, foi de comprimento de 1.599 pb (SEQ ID NO: 10). O produto-3 de PCR, obtido na reação com o DNA cromossômico como um molde da cepa mutante E. coli MG1655ΔpitA tendo o gene marcador KmR, foi de comprimento de 1.670 pb (SEQ ID NO: 11).

Exemplo 2. Produção de L-histidina pela cepa E. COLI MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔpitA

[00135] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-histidina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima (Exemplo 1) foram transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de histidina E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR (Miller, J.H. (1972) «Experiments in Molecular Genetics», Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para obter a cepa MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔpitA tendo o gene marcador KmR. A cepa E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR é descrita por Doroshenko V.G. et al., “The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine- producing mutants”, Prikl. Biokhim. Mikrobiol. (em russo), 2013, 49(2):149- 154. A deleção de pitA marcado com gene para resistência à canamicina foi verificada por PCR conforme descrito no Exemplo 1.2.

[00136] As cepas de E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR e MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔpitA foram separadamente cultivadas em 2 mL de meio-LB durante 3 h a 30°C. Então, 0,1 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados para dentro de 2 mL de meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm e cultivados durante 65 h a 30°C com agitação em um agitador rotativo (250 rpm) até o consumo de glicose. A composição do meio de fermentação (g/L) foi a seguinte: Glicose Mameno* L-Aspartato (NH4)2SO4 KCl KH2PO4 MgSO4^7H2O FeSO4^7H2O MnSO4^5H2O ZnSO4^7H2O Adenosina Tiamina-HCl Betaína CaCO3 25,0 0,1 (como a quantidade de nitrogênio) 0,5 9,0 0,5 0,25 0,2 0,01 0,01 0,01 0,1 0,0005 1,0 30,0 *Mameno é o hidrolisado de farinha de soja (Ajinomoto Co., Inc.).

[00137] Glicose, sulfato de magnésio, betaína, e CaCO3 foram esterilizados separadamente. O pH foi ajustado para 6,0 por KOH 6 M antes da esterilização.

[00138] Após a cultivação, a quantidade de L-histidina, que acumulou no meio, foi determinada por cromatografia em camada fina (TLC, “thin layer chromatography ”). Foram usadas placas de TLC de 10 cm x 20 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, “Russian Federation”). As amostras foram aplicadas sobre as placas usando o aplicador de amostras Camag Linomat 5. As placas de Sorbfil foram eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetona : amônia aquosa 25% : água = 6 : 6 : 1,5 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (1%, p/v) em acetona foi usada como um reagente de visualização. Após a eluição, as placas foram secadas e escaneadas com o Camag TLC Scanner 3 no modo de absorbância a 520 nm usando programa de computador winCATS (versão 1.4.2).

[00139] Os resultados de sete fermentações em tubos de ensaio independentes (como valores médios) são mostrados na Tabela 1. Como pode ser visto a partir da Tabela 1, a cepa modificada E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR ΔpitA foi capaz de produzir uma quantidade mais alta de L- histidina (His) em comparação com a cepa parental E. coli MG1655+hisGr hisL'_Δ ΔpurR.

Exemplo 3. Produção de L-arginina pela cepa E. coli 382 ilvA+ ΔpitA

[00140] A cepa E. coli 382 ilvA+ foi obtida da cepa produtora de L- arginina E. coli 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pela introdução, por transdução-P1, do alelo de tipo selvagem de gene ilvA da cepa E. coli K-12 (Miller, J.H. (1972) «Experiments in Molecular Genetics», Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). A cepa E. coli 382 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 10 de abril de 2000 sob o número de acesso VKPM B-7926 e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

[00141] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-arginina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima foram transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de arginina E. coli 382 ilvA+ para obter a cepa 382 ilvA+ ΔpitA tendo o gene marcador KmR.

[00142] As cepas de E. coli 382 ilvA+ e 382 ilvA+ ΔpitA foram separadamente cultivadas com agitação (220 rpm) a 32°C durante 5 h em 2 mL do meio-LB. Então, 0,3 mL de cada uma das culturas obtidas foram inoculados para dentro de 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200-mm e cultivados a 32°C durante 72 h em um agitador rotativo (220 rpm).

[00143] Após a cultivação, a quantidade de L-arginina, que acumulou no meio, foi determinada por cromatografia em camada fina (TLC). Foram usadas placas de TLC de 10 cm x 20 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, “Russian Federation”). As amostras foram aplicadas sobre as placas usando o aplicador de amostras Camag Linomat 5. As placas de Sorbfil foram eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 4 : 2 : 1,25 : 2,5 (v/v). Uma solução de ninhidrina (1%) em acetona foi usada como um agente de visualização. Após a eluição, as placas foram secadas e escaneadas com o Camag TLC Scanner 3 no modo de absorbância a 520 nm usando programa de computador winCATS (versão 1.4.2). A composição do meio de fermentação (g/L) foi a seguinte: Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSO4^7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedo 1,0 CaCO3 5,0

[00144] Glicose e sulfato de magnésio foram esterilizados separadamente. CaCO3 foi esterilizado por calor seco a 180°C durante 2 h. O pH foi ajustado para 7,0.

[00145] Os resultados de seis fermentações em tubos de ensaio independentes (como valores médios) são mostrados na Tabela 2. Como pode ser visto a partir da Tabela 2, a cepa modificada E. coli 382 ilvA+ ΔpitA foi capaz de produzir uma quantidade mais alta de L-arginina (Arg) em comparação com a cepa parental E. coli 382 ilvA+.

Exemplo 4. Produção de L-citrulina por E. COLI 382ΔargG ΔpitA

[00146] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-citrulina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de citrulina E. coli 382ΔargG para obter a cepa 382ΔargG ΔpitA. A cepa 382ΔargG é obtida pela deleção de gene argG no cromossomo da cepa produtora de arginina 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado “integração mediada por XRed/ET” (“ARed/ET-mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com este procedimento, são construídos os iniciadores de PCR homólogos a ambas as regiões adjacentes ao gene argG e ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo molde. O plasmídeo pMW118-X attL - cat -X attR (WO05/010175) é usado como o molde na reação PCR.

[00147] As cepas de E. coli 382ΔargG e 382ΔargG ΔpitA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 h em 3 mL de caldo nutriente, e 0,3 mL de cada uma das culturas são inoculados para dentro de 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm e cultivados a 32°C durante 48 h em um agitador rotativo.

[00148] Após a cultivação, a quantidade de L-citrulina, que acumula no meio, é determinada por cromatografia em papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo citrulina é cortada, L-citrulina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-citrulina é avaliada espectrofotometricamente a 540 nm. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSQ^7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedo 1,0 L-Isoleucina 0,1 L-Arginina 0,1 CaCO3 5,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.

Exemplo 5. Produção de L-cisteína por E. coli JM15(ydeD)ΔpitA

[00149] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-cisteína, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de cisteína E. coli JM15(ydeD) para obter a cepa JM15(ydeD)ΔpitA. E. coli JM15(ydeD) é uma cepa derivada de E. coli JM15 (CGSC#5042) (Patente U.S. n° 6.218.168 B1), que está transformada com DNA contendo o gene ydeD (Patente U.S. n° 5.972.663). O gene ydeD codifica uma proteína de membrana, e não está envolvido na rota biossintética de nenhum L-aminoácido.

[00150] As condições de fermentação e o procedimento para avaliação de produção de L-cisteína foram descritos em detalhe no Exemplo 6 de Patente U.S. n° 6.218.168 B1. Exemplo 6. Produção de ácido L-glutâmico por E. COLI VL334thrC+ΔpitA

[00151] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de ácido L-glutâmico, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução- P1, para a cepa produtora de glutamato E. coli VL334thrC+ (EP1172433 A1) para obter a cepa VL334thrC+ΔpitA. A cepa VL334thrC+ foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961, e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 8 de dezembro de 2004.

[00152] As cepas de E. coli VL334thrC+ e VL334thrC+ΔpitA são separadamente cultivadas durante 18-24 h a 37°C em placas de L-ágar. Então, uma alça das células é transferida para dentro de tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm contendo 2 mL de meio de fermentação. A cultivação é realizada a 30°C durante 3 dias com agitação.

[00153] Após a cultivação, a quantidade de ácido L-glutâmico que acumula no meio é determinada por cromatografia em papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v) com coloração subsequente por ninhidrina (solução 1% em acetona), eluição de ácido L-glutâmico em etanol 50% com 0,5% de CdCl2 e também avaliação da quantidade de ácido L-glutâmico a 540 nm. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose e CaCO3 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado para 7,2.

Exemplo 7. Produção de L-leucina por E. COLI 57ΔpitA

[00154] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-leucina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de leucina E. coli 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. n° 6.124.121) para obter a cepa 57ΔpitA. A cepa 57 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 19 de maio de 1997 sob o número de acesso VKPM B-7386.

[00155] As cepas de E. coli 57 e 57ΔpitA são separadamente cultivadas durante 18-24 h a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma cultura-semente, as cepas são crescidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32°C durante 18 h em tubos de ensaio de 20 mm x 200 contendo 2 mL de caldo-L (Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press) suplementado com sacarose (4%). Então, o meio de fermentação é inoculado com 0,2 mL de material-semente (10%). A fermentação é realizada em 2 mL de um meio de fermentação mínimo em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm. As células são crescidas durante 48-72 h a 32°C com agitação a 250 rpm.

[00156] Após a cultivação, a quantidade de L-leucina que acumula no meio é determinada por cromatografia em papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 60,0 (NH4)2SO4 25,0 K2HPO4 2,0 MgSO4^7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,01 CaCO3 25,0

[00157] Glicose é esterilizada separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,2.

Exemplo 8. Produção de L-lisina por E. COLI AJ11442ΔpitA

[00158] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-lisina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de lisina E. coli AJ11442 para obter a cepa AJ11442ΔpitA. A cepa AJ11442 foi depositada no “National Institute of Bioscience and Human Technology” da “Agency of Industrial Science and Technology” (atualmente NITE IPOD, n°120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 2920818, Japão) em 1 de maio de1981 sob o número de depósito de FERM P5084, e recebeu um número de acesso de FERM BP-1543. O plasmídeo pCABD2 inclui o gene dapA que codifica di-hidrodipicolinato-sintase tendo uma mutação que dessensibiliza inibição de retroalimentação por L-lisina, o gene lysC que codifica aspartoquinase III tendo uma mutação que dessensibiliza inibição de retroalimentação por L-lisina, the dapB gene que codifica di-hidrodipicolinato-redutase, e o gene ddh que codifica diaminopimelato-desidrogenase (Patente U.S. n° 6.040.160).

[00159] As cepas de E. coli AJ11442 e AJ11442ΔpitA são separadamente cultivadas em meio-L contendo estreptomicina (20 mg/L) a 37°C, e 0,3 mL de cada uma das culturas são inoculados para dentro de 20 mL do meio de fermentação contendo as drogas necessárias em um frasco de 500 mL. A cultivação é realizada a 37°C durante 16 h usando um agitador recíproco na velocidade de agitação de 115 rpm.

[00160] Após a cultivação, as quantidades de L-lisina e de glicose residual no meio são determinadas por um método conhecido (Biotechanalyzer AS210, Sakura Seiki Co.). Então, o rendimento de L-lisina é calculado em relação à glicose consumida para cada uma das cepas. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 40,0 (NH4)2SO4 24,0 K2HPO4 1,0 MgSO^HO 1,0 FeSQ^7H2O 0,01 MnSO^HO 0,01 Extrato de levedo 2,0

[00161] O pH é ajustado para 7,0 por KOH e o meio é autoclavado a 115°C durante 10 min. Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h e adicionado ao meio para uma concentração final de 30 g/L. Exemplo 9. Produção de L-ornitina por E. COLI 382ΔargFΔargI,ΔpitA

[00162] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-ornitina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de ornitina E. coli 382ΔargFΔargI para obter a cepa 382ΔargFΔargI,ΔpitA. A cepa 382ΔargFΔargI é obtida por deleção consecutiva de genes argF e argI no cromossomo da cepa produtora de L- arginina 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado “integração mediada por ÀRed/ET” (“ARed/ET-mediated integration”) (Datsenko K.A. e Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com este procedimento, são construídos dois pares de iniciadores de PCR homólogos a ambas as regiões adjacentes ao gene argF ou argI e ao gene que confere resistência a antibiótico no plasmídeo molde. O plasmídeo pMW118-k attL - cat -k attR (WO05/010175) é usado como o molde na reação PCR.

[00163] Cepas de E. coli 382ΔargFΔargI e 382ΔargFΔargI,ΔpitA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 h em 3 mL de caldo nutriente, e 0,3 mL de cada uma das culturas são inoculados para dentro de 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm e cultivados a 32°C durante 48 h em um agitador rotativo.

[00164] Após a cultivação, a quantidade de L-ornitina que acumula no meio é determinada por cromatografia em papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo ornitina é cortada, ornitina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de ornitina é avaliada espectrofotometricamente a 540 nm. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: KH2PO4 2,0 MgSO4^7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedo 1,0 L-Isoleucina 0,1 L-Arginina 0,1 CaCO3 5,0

[00165] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.

Exemplo 10. Produção de L-fenilalanina por E. COLI AJ12739ΔpitA

[00166] Para restar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-fenilalanina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de fenilalanina- E. coli AJ12739 para obter a cepa AJ12739ΔpitA. A cepa AJ12739 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 6 de novembro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8197 e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 23 de agosto de 2002.

[00167] Cepas de E. coli AJ12739 e AJ12739ΔpitA são separadamente cultivadas a 37°C durante 18 h em um caldo nutriente, e 0,3 mL de cada uma das culturas são inoculados para dentro de 3 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm e cultivados a 37°C durante 48 h com agitação em um agitador rotativo.

[00168] Após a cultivação, a quantidade de L-fenilalanina que acumula no meio é determinada por cromatografia em camada fina (TLC). São usadas placas de TLC de 10 cm x 15 cm TLC revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, “Russian Federation”). As placas de Sorbfil são eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 40,0 (NH4)2SO4 16,0 K2HPO4 0,1 MgSO^7H2O 1,0 FeSO^7H2O 0,01 MnSO^5H2O 0,01 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedo 2,0 L-Tirosina 0,125 CaCO3 20,0

[00169] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.

Exemplo 11. Produção de L-prolina por E. COLI 702ilvAΔpitA

[00170] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-prolina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de prolina E. coli 702ilvA para obter a cepa 702ilvAΔpitA. A cepa 702ilvA foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 18 de julho de 2000 sob o número de acesso VKPM B-8012 e então convertida em um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

[00171] Cepas de E. coli 702ilvA e 702ilvAΔpitA são separadamente cultivadas durante 18-24 h a 37°C em placas de L-ágar. Então, estas cepas são cultivadas sob condições iguais às do Exemplo 6 (Produção de ácido L- glutâmico).

Exemplo 12. Produção de L-treonina por E. COLI B-3996ΔpitA

[00172] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-treonina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de treonina E. coli VKPM B-3996 para obter a cepa B- 3996ΔpitA. A cepa VKPM B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no “All-Union Scientific Center of Antibiotics” (“Russian Federation”, 117105 Moscou, Rua Nagatinskaya, 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa foi também depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny proezd, 1) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso VKPM B- 3996.

[00173] Cepas de E. coli VKPM B-3996 e B-3996ΔpitA são separadamente cultivadas durante 18-24 h a 37°C em placas de L-ágar. Para obter uma cultura-semente, as cepas são crescidas em um agitador rotativo (250 rpm) a 32°C durante 18 h em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm contendo 2 mL de caldo-L (Sambrook, J. e Russell, D.W. (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press) suplementado com glicose (4%). Então, o meio de fermentação é inoculado com 0,2 mL (10%) de material-semente. A fermentação é realizada em 2 mL de meio mínimo em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm. As células são crescidas durante 65 h a 32°C com agitação a 250 rpm.

[00174] Após a cultivação, a quantidade de L-treonina que acumula no meio é determinada por cromatografia em papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol : ácido acético : água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-treonina é cortada, L-treonina é eluída com solução aquosa 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-treonina é avaliada espectrofotometricamente a 540 nm. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose 80,0 (NH4)2SO4 22,0 NaCl 0,8 KH2PO4 2,0 MgSO^HO 0,8 FeSO^HO 0,02 MnSO^HO 0,02 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedo 1,0 CaCO3 30,0

[00175] Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCO3 é esterilizado em calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0. O antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.

Exemplo 13. Produção de L-triptofano por E. COLI SV164(pGH5)ΔpitA

[00176] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-triptofano, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de triptofano E. coli SV164(pGH5) para obter a cepa SV164(pGH5)ΔpitA. A cepa SV164(pGH5) é obtida pela introdução do plasmídeo pGH5 na cepa E. coli SV164. A cepa SV164 foi obtida a partir da cepa E. coli KB862 (DSM7196) e tem o alelo trpE que codifica antranilato- sintase isenta de inibição de retroalimentação por triptofano. O plasmídeo pGH5 hospeda um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato- desidrogenase isenta de inibição de retroalimentação por serina. A cepa SV164(pGH5) foi descrita em detalhe na Patente U.S. n° 6.180.373 B1 ou EP0662143 B1.

[00177] Cepas de E. coli SV164(pGH5) e SV164(pGH5)ΔpitA são separadamente cultivadas com agitação a 37°C durante 18 h em 3 mL de caldo nutriente suplementado com tetraciclina (20 mg/L, marcador do plasmídeo pGH5). Então, 0,3 mL de cada uma das culturas são inoculados para dentro de 3 mL de um meio de fermentação contendo tetraciclina (20 mg/L) em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm, e cultivados a 37°C durante 48 h com um agitador rotativo a 250 rpm.

[00178] Após a cultivação, a quantidade de L-triptofano que acumula no meio é determinada por TLC. São usadas placas de TLC de 10 cm x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, “Russian Federation”). As placas de Sorbfil são eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol : acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Os componentes do meio de fermentação são listados na Tabela 3, mas devem ser esterilizados em grupos separados (A, B, C, D, E, F, G, e H), conforme mostrados, para se evitarem interações adversas durante a esterilização.

O pH da solução A é ajustado para 7,1 com NH4OH. *Mameno é o hidrolisado de farinha de soja (Ajinomoto Co., Inc.).

Exemplo 14. Produção de L-valina por E. COLI H81ΔpitA cepa

[00179] Para testar o efeito da inativação do gene pitA sobre a produção de L-valina, os fragmentos de DNA do cromossomo da cepa E. coli MG1655ΔpitA descrita acima são transferidos, por transdução-P1, para a cepa produtora de valina E. coli H81 para obter a cepa H81ΔpitA. A cepa H81 foi depositada na “Russian National Collection of Industrial Microorganisms” (VKPM) (“Russian Federation”, 117545 Moscou, 1° Dorozhny Proezd, 1) em 30 de janeiro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8066, e então convertida para um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de 2002.

[00180] Cepas de E. coli H81 e H81ΔpitA são separadamente cultivadas a 37°C durante 18 h em um caldo nutriente. As culturas obtidas (0,1 mL de cada) são, cada uma, inoculadas para dentro de 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 mm x 200 mm, e cultivadas a 32°C durante 72 h com um agitador rotativo a 250 rpm.

[00181] Após a cultivação, a quantidade de L-valina que acumula no meio é medida por TLC. São usadas placas de TLC de 10 cm x 15 cm TLC revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil contendo indicador não fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, “Russian Federation”). As placas de Sorbfil são eluídas com uma fase móvel consistindo em propan-2-ol: acetato de etila : amônia aquosa 25% : água = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Uma solução de ninhidrina (2%) em acetona é usada como um reagente de visualização. Composição do meio de fermentação (g/L): Glicose 60,0 (NH4)2SO4 15,0 KH2PO4 1,5 MgSO4^7H2O 1,0 Mameno (TN) 0,4 CaCO3 25,0

[00182] CaCO3 é esterilizado com calor seco a 180°C durante 2 h. O pH é ajustado para 7,0.

[00183] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às suas modalidades preferidas, será evidente para uma pessoa versada na técnica que várias alterações podem ser feitas, e equivalentes utilizados, sem se desviarem do escopo da invenção. Todas as referências citadas neste documento são incorporadas como referências como uma parte deste relatório descritivo.

Aplicabilidade Industrial

[00184] De acordo com a presente invenção, pode ser aprimorada a produção de L-aminoácidos como L-arginina e L-histidina por uma bactéria da família Enterobacteriaceae.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura para produzir e acumular um L- aminoácido no meio de cultura ou nas células da bactéria, ou em ambos; e (ii) coletar o L-aminoácido do meio de cultura ou das células da bactéria, ou de ambos, em que a dita bactéria está modificada para atenuar a expressão de um gene que codifica proteína transportadora de fosfato modificando uma sequência de controle de expressão operacionalmente ligada ao gene que codifica a proteína transportadora de fosfato ou por inativação do gene que codifica a proteína transportadora de fosfato, em que a dita bactéria é Escherichia coli, em que o dito L-aminoácido é L-arginina e L-histidina, e em que o referido gene que codifica proteína transportadora de fosfato é o gene pitA ou o gene pitB.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita expressão do gene que codifica proteína transportadora de fosfato é atenuada devido à inativação do gene que codifica proteína transportadora de fosfato.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito gene que codifica proteína transportadora de fosfato está deletado.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito gene que codifica proteína transportadora de fosfato é selecionado do grupo consistindo em: (A) um DNA que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou suas sequências degeneradas que gerem a proteína como definida na SEQ ID NO: 2; e (B) um DNA que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou suas sequências degeneradas que gerem a proteína como definida na SEQ ID NO: 4.