KR100704517B1 - Ｌ-라이신의 제조 방법 및 당해 방법에 사용된 미생물 - Google Patents
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Abstract
(1) L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유하고, (2) 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (3) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자가 도입되거나 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강되어 있는 에스케리키아속 세균으로서, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 포스포에놀피루브산 카복실라제의 세포내 활성이 증강되어 있음을 특징으로 하는, 에스케리키아속에 속하는 세균을 적절한 배지속에 배양하는 단계, 당해 배양물 속에 L-라이신을 생산 축적시키는 단계 및 당해 배양물로부터 L-라이신을 수거하는 단계에 의해 L-라이신을 생산한다.
L-라이신, 에스케리키아속 세균, 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제, 포스포에놀피루브산 카복실라제
Description
본 발명은 미생물 공업에 관한 것이고, 상세하게는 발효법에 의한 L-라이신의 제조 방법 및 당해 제조 방법에 사용하는 미생물에 관한 것이다.
종래, 발효법에 의해 L-라이신을 제조하는 경우, 생산성을 향상시키기 위해 자연계에서 분리한 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주가 사용되었다. L-라이신을 생산하는 인공 변이주는 다수 공지되어 있고, 이의 대부분은 S-2-아미노에틸시스테인(AEC) 내성 변이주이고, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 바실러스(Bacillus)속 또는 에스케리키아(Escherichia)속에 속한다. 또한, 재조합 DNA를 사용하여 수득된 형질전환체를 사용하는 등의 아미노산의 생산을 증가시키는 각종 기술이 기재되어 있다.
예를 들면, 에스케리키아속 세균에 관해서는 일본 공개특허공보 제(소)56-18596호, 미국 특허 제4,346,170호 및 문헌[참고문헌: Applied Microbiology and Biotechnology, 15, p227-231(1982)]에서 디하이드로디피콜린산 합성효소(DDPS)의 활성을 증강시킨 균주를 사용함에 의한 L-라이신의 제조 방법이 기재되어 있다. 또한, 코리네박테리움속 세균으로부터 유래된 DDPS를 도입한 에스케리키아속 세균을 사용하는 L-라이신의 제조 방법은 대한민국 특허 공보 제92-8382호에 기재되어 있다. 또한, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는 에스케리키아속 세균으로부터 유래된 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 DNA, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA, 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 DNA 및 코리네형 세균으로부터 유래된 디아미노피멜린산 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 균주를 사용하는 L-라이신의 제조 방법이 국제공개 제WO 95/16042호에 기재되어 있다.
브레비박테리움속 세균에 관해서는, 세포내의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제의 활성을 증강시킴에 의해 L-라이신 생산성을 개선시킬 수 있음이 국제공개 제WO 95/11985호에 기재되어 있다. 또한, 포스포에놀피루브산 카복실라제의 활성을 단독으로 증강시킨 균주를 사용하는 L-라이신의 제조 방법 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 활성을 단독으로 증강시킨 균주를 사용하는 L-라이신의 제조 방법이 각각 일본 공개특허공보 제(소)60-87788 및 일본 특허공보 제(평)6-102028호에 기재되어 있다.
발효법에 의한 공업적인 아미노산의 제조에서는 대량생산이 이루어지므로, 단지 몇%의 수율 향상이라고 해도, 공업적 가치가 클 수 있으므로, 수율의 향상이 그 정도의 대소에 관계없이 요망되고 있다.
발명의 개시
본 발명은 종래보다 더욱 개량된 발효법에 의한 L-라이신의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기한 목적을 해결하기 위해 예의 검토를 거듭하였다. 그 결과, 특정한 성질을 갖는 에스케리키아속 세균에서, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 포스포에놀피루브산 카복실라제의 활성을 증강시킬 경우, 및 이러한 효소에 추가하여 특정한 효소 또는 효소 그룹의 활성을 증강시킬 경우에, 이러한 세균에 의한 L-라이신의 생산성이 개선되는 것을 밝혀내고, 이러한 발견에 기초하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은,
제1의 양태로서, (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, 또한 (2) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아속 세균으로서, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 포스포에놀피루브산 카복실라제의 세포내 활성이 증강되어 있음을 특징으로 하는 세균,
제2의 양태로서, (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아속 세균으로서, 포스포에놀피루브산 카복실라제의 세포내 활성 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 또는 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제의 세포내 활성이 증강되어 있음을 특징으로 하는 세균 및
제3의 양태로서, (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2)디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아속 세균으로서, 포스포에놀피루브산 카복실라제 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제의 세포내 활성 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 아스파르타제의 세포내 활성이 증강되어 있음을 특징으로 하는 에스케리키아속 세균을 제공한다(이하, 상기 3개 양태의 세균을 정리하여, 「본 발명의 세균」이라고 한다).
본 발명의 세균에서는, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 및 아스파르타제의 세포내 활성이 증강되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 세균에서는 아스파르토키나제, 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제, 포스포에놀피루브산 카복실라제 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제가 에스케리키아속 세균으로부터 유래하고, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 및 아스파르타제가, 존재하는 경우에는, 에스케리키아속 세균으로부터 유래하고, 디하이드로디피콜린산 합성효소가 에스케리키아속 세균 또는 브레비박테리움속 세균으로부터 유래하고, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제가 브레비박테리움속 세균으로부터 유래하는 것이 바람직하다.
본 발명의 세균에서는 세포내 활성이 증강된 효소의 세포내 활성이 하기의 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해 증강된 것이 바람직하다.
(1)효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하는 것.
(2)염색체 상에서 효소의 유전자의 카피수를 증가시키는 것.
(3)염색체 상에서 효소의 유전자의 프로모터 서열을 변형시키는 것.
또한, 본 발명의 세균에서는 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 아스파르토키나제의 세포내 활성이, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유함으로써 증강되고, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성이 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자를 도입시킴에 의해 증강된 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세균을 적절한 배지에서 배양하는 단계, 당해 배양물 속에 L-라이신을 생산 축적시키는 단계, 및 당해 배양물로부터 L-라이신을 수거하는 단계를 포함하는, L-라이신의 제조 방법(이하, 「본 발명의 제조 방법」이라고 한다)을 제공한다.
도 1은 dapA*24를 갖는 RSF 1010 유래의 플라스미드 RSF24P의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 2는 dapA*24 및 lysC*80을 갖는 플라스미드 RSFD80의 제조공정을 도시하 는 도면이다.
도 3은 dapA*24, lysC*80 및 dapB를 갖는 플라스미드 pCAB1의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 4는 dapA*24, lysC*80, dapB 및 ddh를 갖는 플라스미드 pCABD2의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 5는 dapA*24, lysC*80, dapB, dapD 및 dapE를 갖는 플라스미드 pCABDE1의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 6은 ppc를 갖는 플라스미드 pppc의 구조를 도시하는 도면이다.
도 7은 asd를 갖는 플라스미드 pasd의 구조를 도시하는 도면이다.
도 8은 pntAB(pntA 및 pntB)를 갖는 플라스미드 pMW::THY의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 9는 aspA를 갖는 플라스미드 pMW118::aspA의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 10은 ppc 및 asd를 갖는 플라스미드 ppcd의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 11은 ppc 및 pntAB를 갖는 플라스미드 pPTS의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 12는 ppc 및 aspA를 갖는 플라스미스 pAPW의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 13은 ppc, pntAB 및 asd를 갖는 플라스미드 pPTd의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 14는 ppc, pntAB 및 aspA를 갖는 플라스미드 pAPT의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 15는 ppc, pntAB 및 aspA를 갖는 플라스미드 pAPTK의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 16은 asd를 갖는 플라스미드 pSd의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 17은 ppc, pntAB, aspA 및 asd를 갖는 플라스미드 pKD의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 18은 tetpro 를 갖는 플라스미드 pUTES의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 19는 tetpro 및 이의 하류에 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로부터 유래된 dapA를 갖는 플라스미드 pUEBL3의 제조공정을 도시하는 도면이다.
도 20은 브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유래된 dapA(브레비박테리움 dapA), lysC, dapB 및 ddh를 갖는 플라스미드 pCABD(B)의 제조공정을 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
<1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은, (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2)디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아속 세균으로서, 또한 하기의 효소의 세포내 활성이 증강되어 있는 세균이다.
(1)아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 포스포에놀피루브산 카복실라제,
(2)포스포에놀피루브산 카복실라제 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제(이하, 「트랜스하이드로게나제」라고 한다) 또는 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제, 또는
(3)포스포에놀피루브산 카복실라제 및 트랜스하이드로게나제 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 아스파르타제.
본 발명의 세균은, 바람직하게는 포스포에놀피루브산 카복실라제, 트랜스하이드로게나제, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 및 아스파르타제의 세포내 활성이 보다 증강된 에스케리키아속 세균이다.
본 발명의 세균은 에스케리키아 콜라이(E. coli)인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 「세포내 활성이 증강된다」라는 것은 야생형 균주(예: 이. 콜라이(E. coli W3110 균주) 또는 모 균주(본 발명에서 특정된 조합 효소의 모든 세포내 활성이 증강되어 있지 않은 균주)와 비교해서, 세포내의 효소 활성이 상승되는 것을 의미하고, 야생형 균주 또는 모 균주가 갖고 있지 않은 효소 활성을 갖는 것도 포함한다. 또한, 상기한 각각의 효소 활성의 측정법은 공지되어 있고, 세포내 활성의 증강은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
세포내 활성을 증강시키는 수단으로서는 하기의 수단 및 이들의 조합을 들 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
우선, 효소의 발현량을 상승시키는 수단을 들 수 있다.
효소의 발현량을 증가시키는 수단으로서는 구체적으로는 하기의 수단을 들 수 있다.
(1)효소의 유전자를 갖는 플라스미드의 도입
플라스미드로서는 에스케리키아속 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 도입 방법은 공지된 것일 수 있다. 즉, 이러한 벡터에 당해 유전자를 삽입한 후, 이러한 벡터로 에스케리키아속 세균을 형질전환시킨다. 이러한 벡터는 다수-카피형의 플라스미드인 것이 바람직하다.
각 유전자는 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드에 의해 보유될 수 있다. 또한, 유전자의 일부가 동일한 플라스미드에 의해 보유될 수 있다. 복수 종류의 플라스미드를 사용하는 경우에는, 이들 플라스미드가 함께 안정되고, 세포내에 안정적 공존을 가능하게 하는 안정 분배기구를 갖는 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 각 유전자의 도입 순서는 제한되지 않는다.
(2)염색체 상에서 효소의 유전자 카피수의 증가
Mu 파지 등을 사용해서 염색체 DNA 상의 DNA를 증폭시킴으로써 카피수를 증가시킬 수 있다.
염색체 DNA 상의 DNA는 에스케리키아속 세균이 본래 가지고 있는 것이거나, 형질도입, 트랜스포존[참고문헌: Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417(1983)], Mu 파지[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호] 또는 상동성 재조합[참고문헌: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]을 사용하는 방법으로 숙주 미생물의 염색체로 도입한 것일 수 있다.
(3)효소 유전자의 프로모터 서열의 변형
프로모터 서열을 변형시켜, 유전자의 전사량을 증가시킴으로써, 발현량을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터에 변이를 도입함으로써 프로모터를 강화시키고, 프로모터로부터 하류에 있는 유전자의 전사량을 증가시킬 수 있다. 프로모터에 변이를 도입하는 것 이외에도, lac, trp, tac, trc 및 PL과 같은 에스케리키아속 세균에서 기능하는 기타 프로모터를 새롭게 도입할 수 있다. 또는 인핸서를 새롭게 도입함으로써 유전자의 전사량을 증가시킬 수 있다. 프로모터 서열로는 염색체 상의 효소의 유전자 및 플라스미드 상의 효소 유전자의 어느 것도 양호하지만, 염색체 상의 효소의 유전자인 것이 바람직하다. 염색체 DNA내로 프로모터와 같은 유전자를 도입하는 것에 관해서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)1-215280호에 기재되어 있다.
상기한 효소의 유전자의 유래는 특별히 한정되지 않으며, 에스케리키아속 세균에서 유전자를 발현할 수 있고 유전자 산물이 기능할 수 있는 한, 여러 유래의 것을 사용할 수 있다.
하기에 이. 콜라이의 L-라이신 생합성계 유전자 및 트랜스하이드로게나제 유전자 및 브레비박테리움 락토페르멘툼의 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자의 수득법을 예시한다.
포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc)는 이러한 유전자를 갖는 플라스미드 pS2[참고문헌: Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)] 또는 pT2로부터 수득할 수 있다. pS2를 AatⅡ와 AflⅡ로 절단함으로써 ppc를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 또한, pT2를 SmaⅠ과 ScaⅠ로 절단함에 의해서도 ppc를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다. pT2를 보유하는 이. 콜라이 F15균주 (AJ 12873)은 1993년 7월 15일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 FERM P-13752의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1994년 7월 11일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, FERM BP-4732의 수탁번호가 부여되어 있다.
아스파르토키나제 유전자(lysC)는 기존의 lysC의 염기서열[참고문헌: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., and Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 5 및 6)을 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd)는 이러한 유전자를 갖는 플라스미드 pAD20[참고문헌: Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379(1982)]로부터 수득할 수 있다. pAD20을 AseⅠ과 ClaⅠ로 절단하면, asd를 갖는 DNA 단편을 수득할 수 있다.
디하이드로디피콜린산 합성효소 유전자(dapA)는 기존의 dapA의 염기서열[참고문헌: Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297(1986)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 1 및 2)를 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB)는 기존의 dapB의 염기서열[참고문헌: Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829(1984)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 9 및 10)를 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 유전자(dapD)는 기존의 dapD의 염기서열[참고문헌: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824(1984)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 15 및 16)를 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
석시닐디아미노피멜린산 데아실라제 유전자(dapE)는 기존의 dapE의 염기서열[참고문헌: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265(1992)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 17 및 18)를 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
아스파르타제 유전자(aspA)는 기존의 aspA의 염기서열[참고문헌: Woods, S.A. et al., Biochem. J., 237(2), 547-557(1986)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 본 명세서 서열목록중 서열번호 5 및 6)를 사용하는 PCR법에 의해 이. 콜라이 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB)는 기존의 트랜스하이드로게나제 유전자의 염기서열[참고문헌: D. M. Clarke et al., Eur. J. Biochem., 158, 647-653(1986)]에 기초하여 제조할 수 있다. 이. 콜라이에서는 트랜스하이드로게나제가 2개의 아단위으로 구성되고, 각각 pntA, pntB에 의해 암호화되므로[참고문헌: 상기에 기재, D. M. Clarke et al.], 이 유전자 둘다가 제조된다(예: 국제공개 제WO 95/11985호 참조).
또한, pntAB를 함유하는 플라스미드로부터 수득할 수 있다. pntAB를 함유하는 플라스미드로서는 국제공개 제WO 95/11985호에 기재된 플라스미드 pMW::THY를 들 수 있다. 상기 플라스미드는 이. 콜라이 K-12 MC1061 균주의 pntA 및 pntB를 함유하는 3.0k의 DNA 단편과 플라스미드 벡터 pMW118의 BamHⅠ 및 HindⅢ 단편을 연결함으로써 수득된 재조합 플라스미드이다. pMW::THY를 보유하는 에스케리키아 콜라이 JM109 균주는 AJ12929 균주로 명명되며, 1993년 10월 4일에 통산성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-0046 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 수탁번호 FERM P-13890으로 기탁되어 있으며, 1994년 9월 14일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제 기탁으로 이관되고 FERM BP-4798의 수탁번호가 부여되어 있다.
브레비박테리움 락토페르멘툼의 디하이드로디피콜린산 합성효소 유전자(dapA)는 기존의 dapA의 염기서열[참고문헌: Bonassie, S. et al., N. A. R., 18(21), 6421(1990)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 본 명세서 서열목록중 서열번호 3 및 4)를 사용하는 PCR법에 의해 브레비박테리움 락토페르멘툼 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
브레비박테리움 락토페르멘툼의 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자(ddh)는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 ddh의 기존의 염기서열[참고문헌: Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)]에 기초하여 작성한 2종류의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(예: 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 11 및 12)를 사용하는 PCR법에 의해 브레비박테리움 락토페르멘툼의 염색체 DNA를 주형으로 하여 증폭시킴으로써 수득할 수 있다.
또한, 세포내 활성을 증강시키는 수단으로서 효소의 특이적 활성을 상승시키는 수단을 들 수 있다. 이러한 수단은 효소의 발현량을 상승시키는 수단과 조합할 수 있다.
효소의 특이적 활성을 상승시키는 수단으로서는, 특이적 활성이 상승된 변이를 도입한 효소를 보유시키는 것과, 효소가 피드백 억제를 받는 경우, 피드백 억제를 해제한 효소를 보유시키는 것 등을 들 수 있다.
피드백 억제가 해제된 효소로서는, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소(DDPS) 및 L-라이신 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제(AK)를 들 수 있다.
「L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된다」라는 표현은 실질적으로 억제가 해제되면 양호하다는 것을 의미하며, 완전히 해제될 필요는 없다. 또한, 에스케리키아속 세균 이외의 생물로부터 유래된 효소도, 이것이 당해 생물의 야생형인지 변이형인지에 관계없이 L-라이신에 의한 피드백 억제의 정도가 에스케리키아속 세균으로부터 유래된 야생형 효소보다도 낮으면 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 효소에 포함된다. 따라서 브레비박테리움속 세균으로부터 유래된 DDPS와 같이 본래 L-라이신에 의한 피드백 억제를 받지 않는 효소도 포함된다.
L-라이신에 의한 피드백 억제의 정도는 국제공개 제WO 95/16042호의 실시예 1 및 2에 기재된 방법 등의 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 DDPS(비감수성 DDPS) 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 AK(비감수성 AK)로서는 국제공개 제WO 95/16042호 및 일본 공개특허공보 제(평)10-113183호에 기재된 것을 들 수 있다.
즉, 비감수성 DDPS의 예로서는 야생형 DDPS의 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는 것을 들 수 있다. 야생형 DDPS로서는 에스케리키아속 세균 유래, 특히 이. 콜라이로부터 유래된 DDPS를 들 수 있다. DDPS의 L-라이신에 의한 피드백 억제를 해제하는 변이의 예로서는 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 4에 나타낸 DDPS의 아미노산 서열 중에 DDPS의 N-말단으로부터,
① 81번째의 알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 발린 잔기)로 치환시킨 변이,
② 118번째의 히스티딘 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔 기(바람직하게는 티로신 잔기)로 치환시킨 변이,
③ 81번째의 알라닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 발린 잔기)로 치환시키며, 또한 118번째의 히스티딘 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 티로신 잔기)로 치환시킨 변이를 들 수 있다. 세균종이나 균주 사이에서 활성에 영향을 주지 않는 차이가 아미노산 서열에 있을 수 있다는 것은 잘 알려져 있으며, 상기한 특정 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기는 당해 분야의 숙련가에 의해서 용이하게 인식될 수 있다.
비감수성 DDPS의 다른 예로서는 코리네형 세균(예: 브레비박테리움 락토페르멘툼)으로부터 유래된 DDPS[Cremer J. et al. J. Gen. Microbiol., 134, 3221-3229(1988)]을 들 수 있다.
비감수성 DDPS를 보유시키는 방법으로서는 비감수성 DDPS를 암호화하는 DNA를 에스케리키아속 세균에 도입하는 것을 들 수 있다.
비감수성 DDPS를 암호화하는 DNA의 예로서는 암호화된 DDPS의 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는, 야생형 DDPS를 암호화하는 DNA를 들 수 있다.
하기, 에스케리키아속 세균으로부터 유래된 DDPS를 예로 들어 비감수성 DDPS를 암호화하는 DNA(비감수성 DDPS 유전자)의 수득방법에 관해 설명하며, 다른 생물로부터 유래된 DDPS에 관해서도 동일하다. 또한 다른 생물로부터 유래된 야생형 DDPS가 비감수성 DDPS이면 이것을 암호화하는 DNA를 그대로 사용할 수 있다.
야생형 DDPS를 암호화하는 DNA로서는 에스케리키아속 세균으로부터 유래된 DDPS를 암호화하는 것이면 특별히 제한하지 않지만, 구체적으로는 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 DNA를 들 수 있으며, 또한 구체적으로는 서열번호 3에 나타낸 염기서열 중에서 염기번호 272 내지 1147로 나타낸 서열을 들 수 있다. 이들 서열에서 상기 아미노산 잔기의 치환을 일으키도록 하는 염기서열의 변이를 갖는 것이 비감수성 DDPS를 암호화하는 DNA이다. 또한, 치환된 아미노산 잔기에 대응하는 코돈은 이러한 아미노산 잔기를 암호화하는 것이면 종류는 특별히 문제되지 않는다. 또한, 세균종이나 균주의 차이에 따라 보유되는 DDPS의 아미노산 서열이 조금 상이할 것이 예상되지만, 이러한 효소의 활성에 관여하지 않는 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것도 비감수성 DDPS 유전자에 포함된다.
이러한 비감수성 DDPS 유전자를 수득하는 방법의 예는 하기와 같다. 우선, 야생형 DDPS 유전자 또는 다른 변이를 갖는 DDPS유전자를 함유하는 DNA를 시험관내 변이처리하며, 변이 처리후의 DNA와 숙주에 적합한 벡터 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다. 재조합 DNA를 숙주 미생물로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체 중에서 비감수성 DDPS를 발현하게 된 것을 선택하는데, 이러한 형질전환체는 비감수성 DDPS 유전자를 보유한다. 또한 야생형 DDPS 유전자 또는 다른 변이를 갖는 DDPS 유전자를 함유하는 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결하여 재조합 DNA를 수득한 다음, 재조합 DNA를 시험관내 변이처리하며, 변이처리 후의 재조합 DNA를 숙주 미생물로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 형질전환체 중에서 비감수성 DDPS를 발현하게 된 것을 선택할 수 있고, 또한 이러한 형질전환체는 비감수성 DDPS 유전자를 보유한다.
야생형 DDPS를 생산하는 미생물을 변이처리하고, 비감수성 DDPS를 생산하는 변이주를 만든 다음, 당해 변이주로부터 비감수성 DDPS 유전자를 수득할 수 있다. 또는, 야생형 유전자가 연결된 재조합 DNA가 도입된 형질전환체를 변이처리하고, 비감수성 DDPS를 생산하는 변이주를 만든 다음, 당해 변이주로부터 재조합 DNA를 회수하면, 상기 DNA 상에 비감수성 DDPS 유전자가 만들어진다.
DNA를 시험관내 변이처리하기 위한 약제로서는, 하이드록실아민 등을 들 수 있다. 하이드록실아민은 시토신을 N4-하이드록시시토신으로 변경함으로써, 시토신으로부터 티민으로의 변이를 야기하는 화학 변이처리제이다. 또한, 미생물 자체를 변이처리하는 경우에는, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 또는 아질산 등의 통상적인 인공 돌연변이에 사용되는 변이제에 의한 처리를 실시한다.
상기 야생형 DDPS 유전자 또는 다른 변이를 갖는 DDPS 유전자를 함유하는 DNA의 공여균으로서는 어떤 에스케리키아속에 속하는 미생물도 사용될 수 있다. 특히, 문헌[참고문헌: Neidhardt, F. C. et. al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1]에 기재된 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, 이. 콜라이 JM109 균주나 MC1061 균주 등을 들 수 있다. DDPS 유전자를 함유하는 DNA의 공여균으로서 야생균주를 사용하는 경우, 야생형의 DDPS 유전자를 함유하는 DNA를 수득할 수 있 다.
비감수성 AK의 예로는, 야생형 AK에서 발견되는 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는 것을 들 수 있다. 야생형 AK로서는 에스케리키아속 세균 유래, 특히 이. 콜라이로부터 유래된 아스파르토키나제 Ⅲ(AKⅢ)를 들 수 있다. AKⅢ의 L-라이신에 의한 피드백 억제를 해제하는 변이로서는, 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 8에 나타낸 AKⅢ의 아미노산 서열 중에서 AKⅢ의 N-말단으로부터,
(a) 323번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시키는 변이,
(b) 323번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시키고, 또한 408번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시키는 변이,
(c) 34번째의 아르기닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 시스테인 잔기)로 치환시키고, 또한 323번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시킨 변이,
(d) 325번째의 류신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 페닐알라닌 잔기)로 치환시키는 변이,
(e) 318번째의 메티오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키는 변이,
(f) 318번째의 메티오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키고, 또한 349번째의 발린 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 메티오닌 잔기)로 치환시키는 변이,
(g) 345번째의 세린 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 류신 잔기)로 치환시키는 변이,
(h) 347번째의 발린 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 메티오닌 잔기)로 치환시키는 변이,
(i) 352번째의 트레오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키는 변이,
(j) 352번째의 트레오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키고, 또한 369번째의 세린 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 페닐알라닌 잔기)로 치환시키는 변이,
(k) 164번째의 글루탐산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 라이신 잔기)로 치환시키는 변이,
(l) 417번째의 메티오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키고, 또한 419번째의 시스테인 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 티로신 잔기)로 치환시키는 변이를 들 수 있다. 또한 323번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시키고, 또한 318번째의 메티오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 이소류신 잔기)로 치환시키는 변이[일본 공개특허공보 제(평)10-113183호]을 들 수 있다. 세균종이나 균주 사이에서 활성에 영향을 미치지 않는 차이가 아미노산 서열에 있을 수 있는 것은 공지되어 있으며, 상기한 특정 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기는 당해 숙련가에 의해 용이하게 인식될 수 있다.
비감수성 AK의 다른 예로서는 코리네형 세균 유래 변이형 AK[일본 공개특허공보 제(평)6-62866호]를 들 수 있다.
비감수성 AK를 보유시키는 방법으로서는, 비감수성 AK를 암호화하는 DNA를 에스케리키아속 세균에 도입하는 것을 들 수 있다.
비감수성 AK를 암호화하는 DNA의 예로서는, 암호화된 AK의 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는, 야생형 AK를 암호화하는 DNA를 들 수 있다.
하기에서, 에스케리키아속 세균으로부터 유래된 AKⅢ를 예로 들어서, 비감수성 AK를 암호화하는 DNA를 수득하는 방법이 설명될 것이다. 다른 생물로부터 유래된 AK에 관해서도 DNA는 동일하게 수득될 수 있다. 또한 다른 생물로부터 유래된 야생형 AK가 비감수성 AK인 경우, 이것을 암호화하는 DNA를 그대로 사용할 수 있다.
야생형 AKⅢ를 암호화하는 DNA로서는 특별히 제한되지는 않지만, 에스케리키아속 세균, 예를 들어 이. 콜라이로부터 유래된 AKⅢ를 암호화하는 DNA를 들 수 있으며, 특히 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 암호화하는 DNA, 또한 서열번호 7에 나타낸 염기서열 중에서 염기번호 584 내지 1930으로 표시된 서열을 들 수 있다. 또한, 이. 콜라이의 AKⅢ는 lysC 유전자로 암호화된다.
이들 서열에서, 상기 아미노산 잔기의 치환을 야기하는 염기서열의 변이를 갖는 것이, 변이형 AKⅢ를 암호화하는 DNA이다. 또한, 치환된 아미노산 잔기에 대응하는 코돈의 종류는, 당해 아미노산 잔기를 암호화하는 한, 특별히 제한되지는 않는다. 또한 세균종이나 균주의 차이에 따라 보유하는 야생형 AKⅢ의 아미노산 서열이 조금 상이한 것이 있다. 그러나, 이러한 효소의 활성에 관여하지 않는 위치에서 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것도 변이형 AKⅢ 유전자에 포함된다. 예를 들면, 하기 실시예 2에서 수득된 야생형 lysC 유전자의 염기서열(국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 7)은 이미 발표된 이. 콜라이 K-12 JC 411 균주의 lysC의 염기서열[참고문헌: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., and Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)]과 6군데에서 차이가 있고, 이중에 2군데에서 암호화된 아미노산 잔기가 상이하다(JC411 균주의 lysC는 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 서열번호 8에 나타낸 lysC의 아미노산 서열 중에서 N-말단으로부터 58번째의 글리신 잔기가 시스테인 잔기로 치환되고, 401번째의 글리신 잔기가 알라닌 잔기로 치환된다). 이러한 이. 콜라이 K-12 JC411 균주의 lysC와 동일한 서열을 갖는 lysC에서도 상기 (a) 내지 (l) 및 323번째의 글리신 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기(바람직하게는 아스파라긴산 잔기)로 치환시키고, 또한 318번째의 메티오닌 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기의 어느 하나의 변이를 도입하면 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이를 갖는 lysC가 수득되는 것이 예상된다.
L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 변이형 AKⅢ를 암호화하는 DNA를 수득하는 방법의 예는 하기와 같다. 우선, 야생형 AKⅢ 유전자 또는 다른 변이를 갖는 AKⅢ 유전자를 함유하는 DNA를 시험관내 변이처리하고, 변이 처리후의 DNA와 숙주에 적합한 벡터 DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다. 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 형질전환체 중에서 변이형 AKⅢ를 발현하게 된 것을 선택하면, 이러한 형질전환체는 변이형 유전자를 보유한다. 또한, 야생형 AKⅢ 유전자 또는 다른 변이를 갖는 AKⅢ 유전자를 함유하는 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결하여 재조합 DNA를 수득한 다음, 재조합 DNA를 시험관내 변이처리하고, 변이 처리후의 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환체를 수득하며, 형질전환체 중에서 변이형 AKⅢ를 발현하게 된 것을 선택해도 형질전환체는 변이형 유전자를 보유한다.
또는 야생형 효소를 생산하는 미생물을 변이처리하고, 변이형 효소를 생산하는 변이주를 만든 다음, 당해 변이주로부터 변이형 유전자를 수득할 수 있다. DNA를 직접 변이처리하기 위한 약제로서는 하이드록실아민 등을 들 수 있다. 하이드록실아민은 시토신을 N4-하이드록시시토신으로 변경함으로써 시토신으로부터 티민으로의 변이를 일으키는 화학 변이처리제이다. 또한, 미생물 자체를 변이처리하는 경우에는 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아닌(NTG) 등의 통상적인 인공 돌연변이에 사용되는 변이제에 의한 처리를 실시한다.
상기한 야생형 AKⅢ 유전자 또는 다른 변이를 갖는 AKⅢ 유전자를 함유하는 DNA의 공여균으로서는, 어떤 에스케리키아속에 속하는 미생물도 사용될 수 있다. 특히, 문헌[참고문헌: Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1]에서 열거한 것을 이용할 수 있다. 예를 들어 이. 콜라이 JM109 균주나 MC1061 균주 등을 들 수 있다.
본 발명의 세균에서는, 아스파르토키나제, 디하드로디피콜린산 리덕타제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제, 포스포에놀피루브산 카복실라제 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제가 에스케리키아속 세균으로부터 유래하고, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 및 아스파르타제가, 존재하는 경우, 에스케리키아속 세균으로부터 유래하며, 디하이드로디피콜린산 합성효소가 에스케리키아속 세균 또는 브레비박테리움속 세균으로부터 유래하며 디아미노피멜린산 데하이드로게나제가 브레비박테리움속 세균으로부터 유래하는 것이 바람직하다.
브레비박테리움속 세균으로서는 브레비박테리움 락토페르멘툼 이외에 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flaum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 세균에서는 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 아스파르토키나제의 세포내 활성이 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유함으로써 증강되고, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 세포내 활성이 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자의 도입에 의해 증강되는 것이 바람직하다. 이와 같이 바람직한 본 발명의 세균은 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 플라스미드 pCABD2 또는 pCABDE1을 에스케리키아속 세균으로 도입함으로써 수득할 수 있다.
<2> 본 발명의 제조 방법
상기와 같이 수득된 본 발명의 세균을 적절한 배지중에서 배양하고, 당해 배양물 속에 L-라이신을 생산 축적시키며, 당해 배양물로부터 L-라이신을 수거함으로써 L-라이신을 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 에스케리키아속 세균의 배양에 사용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라, 기타 유기성분을 함유하는 통상적인 배지이다.
탄소원으로서는 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스 또는 전분의 가수분해물 등의 당류, 글리세롤 또는 소르비톨 등의 알콜류 또는 푸마르산, 시트르산 또는 석신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다.
질소원으로서는 황산암모늄, 염화암모늄 또는 인산암모늄 등의 무기 암모늄염, 대두 가수분해물 등의 유기 질소, 암모니아 가스 또는 암모니아수 등을 사용할 수 있다.
유기 미량 영양원으로서는 비타민 B1, L-이소류신 등의 요구 물질 또는 효모 추출물 등을 적당량 함유시킨 것이 바람직하다. 이들 외에 필요에 따라 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 소량 첨가된다.
배양은 호기적 조건하에서 16 내지 72시간 동안 실시하는 것이 바람직하고, 배양 온도는 25℃ 내지 45℃, 배양중 pH는 5 내지 8로 제어한다. 또한 pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
발효액으로부터 L-라이신의 수거는 통상적인 이온교환 수지법, 침전법, 기타 공지된 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다.
하기에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
실시예 1
<1> 다양한 성질을 갖는 에스케리키아속 세균의 제조
하기에 기재된 플라스미드를 이. 콜라이 W3110(tyrA)으로 도입했다.
플라스미드명 보유한 유전자
RSF24P dapA*
RSFD80 dapA*, lysC*
pCAB1 dapA*, lysC*, dapB
pCABD2 dapA*, lysC*, dapB, ddh
pCABD(B) 브레비박테리움 dapA, lysC*, dapB, ddh
pCABDE1 dapA*, lysC*, dapB, dapD, dapE
유전자의 약호의 의미는 하기와 같다.
ppc: 포스포에놀피루브산 카복실라제
lysC: 아스파르토키나제 Ⅲ
lysC*: 억제 해제형 아스파르토키나제 Ⅲ
asd: 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제
dapA: 디하이드로디피콜린산 합성효소
dapA*: 억제 해제형 디하이드로디피콜린산 합성효소
브레비박테리움 dapA: 억제 해제형 디하이드로디피콜린산 합성효소(브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유래)
삭제
dapB: 디하이드로디피콜린산 리덕타제
dapD: 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제
dapE: 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제
ddh: 디아미노피멜린산 데하이드로게나제(브레비박테리움 락토페르멘툼 유래)
플라스미드 RSF24P, RSFD80, pCAB1, pCABD2 및 pCABDE1은 국제공개 제WO 95/16042호에 기재되어 있다. 이의 작제에 대한 상세한 것은 국제공개 제WO 95/16042호에 기재되어 있으며 이의 개략은 하기와 같다.
(1)RSF24P
이. 콜라이의 기존의 dapA의 염기서열[참고문헌: J. Bacteriol., 166, 297(1986)]에 기초하여 PCR법에 의해 dapA의 SD 서열 및 개방 판독 프레임(open reading frame; ORF)를 포함하는 단편을 증폭시켰다. 증폭 단편을 클로닝 벡터 pCR1000에 연결하고 pCR1000 중의 lacZ 프로모터에 의한 전사 방향에 대해 dapA의 전사방향이 역방향으로 되도록 연결한 플라스미드 pdapA2를 수득했다. pdapA2를 하이드록실아민에 의해 변이 처리하고, 변이 처리된 pdapA2를 이. 콜라이 W3110으로 도입하고, 형질전환체로부터 AEC 내성이 있는 것을 선택했다. 또한, 선택된 내성주가 갖는 플라스미드로 암호화된 DDPS의 L-라이신에 의한 억제 정도를 측정하고, L-라이신에 의한 억제가 해제된 것을 선택했다. 서열 결정에 의해 597번째의 C가 T로 변화하는 것이 확인된 pdapA24를 pVIC40의 테트라사이클린 내성 유전자 프로모터의 하류에 연결하고, RSF24P를 수득했다(도 1).
RSF24P를 이. 콜라이 JM109 균주에 도입한 것은 AJ12395라고 명명하고, 1993년 10월28일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 FREM P-13935의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1994년 11월1일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고 FERM BP-4858의 수탁번호가 부여되어 있다.
(2)RSFD80
이. 콜라이의 기존의 lysC의 염기서열[참고문헌: J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)]에 기초하여 PCR법에 의해 lysC의 SD 서열 및 ORF를 포함하는 단편을 증폭시켰다. 증폭 단편을 다중 카피 벡터 pUC18에 연결하고, pUC18 중의 lacZ 프로모터에 의한 전사 방향에 대해 lysC의 전사 방향이 역방향으로 되도록 연결한 플라스미드 pLYSC1을 수득했다. pLYSC1을 하이드록실아민에 의해 변이처리하고, 변이처리된 pLYSC1을 이. 콜라이 GT3으로 도입하고, 형질전환체로부터 AEC 및 L-라이신에 내성이 있는 것을 선택했다. 또한, pLYSC1을 이. 콜라이 MC1061로 도입하고, 균체를 하이드록실아민에 의해 변이처리하고, AEC 및 L-라이신에 내성이 있는 것을 선택했다. 또한 선택된 내성주가 갖는 플라스미드에 암호화된 AK의 L-라이신에 의한 억제 정도 및 열안정성을 측정하고, L-라이신에 의한 억제가 해제되는 동시에 안정성이 우수한 것을 선택했다. 서열 결정에 의해 352번째의 C가 T로 변화된 것이 확인된 pLYSC1*80을 pHSG399의 lacZ 프로모터의 하류에 연결하고, pLLC*80을 수득했다. pLLC*80과 RSF24P로부터 도 2에 도시된 바와 같이 하여 RSFD80을 작제했다.
RSFD80을 이. 콜라이 JM109 균주로 도입한 것은 AJ12396이라고 명명하고, 1993년 10월 28일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 FERM P-13936의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1994년 11월 1일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고 FERM BP-4859의 수탁번호가 부여되어 있다.
(3)pCAB1
기존의 dapB의 염기서열[참고문헌: Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259, 14829(1984)]에 기초하여 PCR법에 의해 이. 콜라이 W3110 균주 염색체 DNA로부터 dapB를 증폭시키고, 수득된 증폭 DNA 단편을 AseⅠ와 DraⅠ로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW119의 SmaⅠ부위에 삽입하고, 플라스미드 pdapB를 수득했다. 이어서 도 3에 도시된 바와 같이 하여 dapB를 RSFD80에 조합하여 pCAB1을 수득했다.
(4)pCABD2
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 ddh의 기존의 염기서열[참고문헌: Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917(1987)]에 기초하여 PCR법에 의해 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC13869의 염색체 DNA로부터 ddh를 증폭시키고, 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoT22Ⅰ과 AvaⅠ으로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW119의 SmaⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pddh를 수득했다. 이어서 도 4에 도시된 바와 같이 하여 ddh를 pCAB1에 조합하여 플라스미드 pCABD2를 수득했다.
(5)pCABDE1
기존의 dapD의 염기서열[참고문헌: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824(1984)]에 기초하여 PCR법에 의해 이. 콜라이 W3110 균주 염색체 DNA로부터 dapD를 증폭시키고, 수득된 증폭 DNA 단편을 EcoO109Ⅰ과 SacⅠ로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW118의 SmaⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pdapD를 수득했다. 또한, 기존의 dapE의 염기서열[참고문헌: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265(1992)]에 기초하여 PCR법에 의해 이. 콜라이 W3110균주 염색체 DNA로부터 dapE를 증폭시키고, 수득된 증폭 DNA 단편을 MunⅠ과 BglⅡ로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW118의 SmaⅠ 부위에 삽입하여 플라스미드 pdapE를 수득했다. pdapE로부터 dapE를 절단하고, pdapD에 삽입하여 dapE 및 dapD를 함께 갖는 플라스미드 pMWdapDE1을 작제했다. 또한 도 5에 도시된 바와 같이 하여 pMWdapDE1로부터 dapE 및 dapD를 함유하는 단편을 절단하고, 이것을 pCAB1에 삽입하여 pCABDE1을 수득했다.
플라스미드 pCABD(B)는 하기와 같이 작제했다.
우선, 하기 서열의 프라이머를 사용하여 pBR322로부터 Tet 내성 유전자의 프로모터 부위를 함유하는 DNA 단편을 증폭시켰다.
5'-TCAAGAATTCTCATGTTTGA-3'(서열번호 1)
5'-GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC-3'(서열번호 2)
증폭된 DNA 단편을 KpnⅠ및 EcoRⅠ로 절단하고, pUC18의 KpnⅠ및 EcoRⅠ 절단 부위에 삽입하여 pUTES를 수득했다(도 18).
다음에 하기 서열의 프라이머를 사용하여 브레비박테리움 락토페르멘툼 Ysr균주 염색체 DNA를 주형으로 하여 브레비박테리움 dapA유전자를 증폭시켰다.
5'-GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG-3'(서열번호 3)
5'-TGGAACCTCTGTTGCTGCAG-3'(서열번호 4)
증폭된 브레비박테리움 dapA유전자를 KpnⅠ및 BamHⅠ로 절단하고, pUTES의 KpnⅠ 및 BamHⅠ절단 부위에 삽입하여 pUEBL3을 수득했다(도 19).
다음에 pUEBL3를 EcoRⅠ및 XbaⅠ으로 절단하고, 양쪽 말단을 평활 말단화하며 브레비박테리움 dapA를 포함하는 단편을 수득했다. 다음에 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pCABD2를 NheⅠ및 SpeⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, lysC, dapB 및 ddh를 포함하는 단편을 회수한 후, 여기에 먼저 수득한 브레비박테리움 dapA를 포함하는 단편을 삽입함으로써 pCABD(B)를 수득했다(도 20).
이. 콜라이 W3110(tyrA)에 관해서는 유럽 공개특허공보 제488424호에 상세하게 기재되어 있지만 이의 제조방법에 관해 간단하게 살펴보면 하기와 같다. 국립 유전학 연구소(시즈오카켄 미시마시)로부터 이. 콜라이 W3110 균주를 입수했다. 상기 균주를 스트렙토마이신이 함유된 LB 플레이트에 접종시키고, 콜로니를 형성하는 균주를 선택하여 스트렙토마이신 내성주를 수득했다. 선택된 스트렙토마이신 내성주와 이. 콜라이 K-12 ME8424 균주를 혼합하여 완전 배지(L-브로쓰: 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl)에서 37℃의 조건하에 15분 동안 정치 배양하여 접합을 유도했다. 이. 콜라이 K-12 ME8424 균주는(HfrP045, thi, relA1, tyrA::Tn10, ung1 및 nadB)의 유전형질을 갖고, 국립 유전학 연구소로부터 입수할 수 있다.
이후에 배양물을 스트렙토마이신, 테트라사이클린 및 L-티로신을 함유하는 완전 배지(L-브로쓰: 1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 1.5% 한천)에 접종시키고, 콜로니를 형성하는 균주를 선택했다. 이러한 균주를 이. 콜라이 W3110(tyrA)균주라고 명명하였다.
또한, 유럽 공개특허공보 제488424호에는 W3110(tyrA) 균주에 플라스미드를 도입하여 형성된 균주가 다수 기재되어 있다. 예를 들면, 플라스미드 pHATerm을 도입하여 수득된 균주는 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm 균주(이. 콜라이 AJ 12662 균주)로 명명되고, 1991년 11월 16일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 국제기탁되어 있으며, 수탁번호 FERM BP-3653이 부여되어 있다. 이러한 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm 균주로부터 플라스미드 pHATerm을 탈락시킴으로써 W3110(tyrA) 균주를 수득할 수 있다. 플라스미드의 탈락은 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다.
<2> 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc) 또는 아스파르타제 유전자(aspA)의 도입 및 L-라이신 생산성의 평가
asd를 포함하는 플라스미드 및 ppc를 갖는 플라스미드로서는 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pasd 및 pppc를 사용했다. 이들 플라스미드의 작제에 관해서는 국제공개 제WO 95/16042호에 상세하게 기재되어 있다. 이의 개략은 하기와 같다.
(1)pasd
asd는 이러한 유전자를 갖는 플라스미드 pAD20[참고문헌: Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379(1982)]로부터 수득했다. pAD20을 AseⅠ과 ClaⅠ로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW118의 SmaⅠ부위에 삽입하여 플라스미드 pasd를 수득했다(도 8).
(2)pppc
ppc는 이러한 유전자를 갖는 플라스미드 pT2로부터 수득했다. pT2를 SmaⅠ과 ScaⅠ로 절단하고, 말단을 평활화한 다음, pMW118의 SmaⅠ 부위에 삽입하여 플라스미드 pppc를 수득했다(도 9). pT2를 보유하는 이. 콜라이 F15 균주(AJ12873)는 1993년 7월 15일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 (우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 FERM P-13752의 수탁번호에 근거하여 기탁되어 있으며, 1994년 7월 11일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고 수탁번호 FERM BP-4732가 부여되어 있다.
aspA를 갖는 플라스미드는 하기와 같이 작제했다.
하기 서열의 프라이머를 사용하여 이. 콜라이의 aspA 유전자를 증폭시켰다.
5'-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3'(서열번호 5)
5'-CAGCAAACTATGATGAGAA-3'(서열번호 6)
다음에, 수득된 증폭 단편을 pMW118(닛본진사)의 SmaⅠ 절단 부위에 삽입하여 pMW118::aspA를 수득했다(도 9).
이. 콜라이 W3110(tyrA) 및 상기 <1>에서 수득한 각각의 형질전환체에 pMW118(대조 플라스미드), pasd, pppc 및 pMW118::aspA(비교예 플라스미드)를 각각 도입했다. 수득된 형질전환체는 이. 콜라이 W3110(tyrA)에 pMW118, pasd, pppc 또는 pMW118::aspA를 도입한 것을 제외하여, pMW118, pasd, pppc 및 pMW118::aspA의 어느 하나와 RSF24P, RSFD80, pCAB1, pCABD2, pCABD(B) 및 pCABDE1의 어느 하나와의 2종류의 플라스미드가 공존하고 있다. 이들 형질전환체에 관해 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 방법에 따라 L-라이신 생산성을 조사했다. 구체적으로는 하기와 같이 실시했다.
배양은 500㎖ 경사구 플라스크에 하기 조성의 배지를 20㎖ 투입하고, 배양온도 37℃, 교반 114 내지 116rpm의 조건하에 30시간 동안 실시했다.
(배지조성)
글루코스 40g/ℓ
MgSO4·7H2O 1g/ℓ
(NH4)2SO4 16g/ℓ
KH2PO4 1g/ℓ
FeSO4·7H20 0.01g/ℓ
MnSO4·5H2O 0.01g/ℓ
효모 추출물(Difco) 2g/ℓ
L-티로신 0.1g/ℓ
KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분 동안 오토클레이브(글루코스, MgSO4·7H2O는 별도)
CaCO3 25g/ℓ(일본 약전에 따라, 180℃에서 2일 동안 건열 멸균)
항생물질(도입하는 플라스미드의 종류에 따라, 스트렙토마이신 20mg/ℓ, 암피실린 50mg/ℓ 또는 가나마이신 25mg/ℓ)
배양액(배양후의 배지) 중의 L-라이신의 정량을 아사히카세이(주)제 바이오테크 분석기-AS210를 사용해서 실시했다.
결과를 표 1에 나타낸다. 표에서 L-라이신의 양은 배지 ㎗당 mg으로 나타낸다.
| Lys 축적(㎎/㎗) | ||||
| pMW118 | pasd | pppc | pMW118::aspA | |
| - | 40 | 50 | 60 | 60 |
| RSF24P | 350 | 340 | 360 | 350 |
| RSFD80 | 960 | 790 | 990 | 960 |
| pCAB1 | 1120 | 1140 | 1150 | 1130 |
| pCABD2 | 1230 | 1320 | 1380 | 1240 |
| pCABD(B) | 1230 | 1320 | 1370 | n.d. |
| pCABDE1 | 1210 | 1310 | 1350 | n.d. |
n.d. 측정안됨.
표 1에서 명백한 바와 같이 asd 또는 ppc를 이. 콜라이 중에서, 단독으로 또는 dapA(RSF24P) 또는 dapA+lysC(RSFD80) 또는 dapA+lysC+dapB(pCAB1)과 함께 증강시킨 경우의 L-라이신의 생산량(축적량)은, asd 또는 ppc를 증강하지 않은 경우와 비교하여 변화가 없지만, 있어도 미약하며 특히 asd에서는 감소하는 경우도 있다(asd에서는 -180 내지 20mg/㎗, ppc에서는 10 내지 30mg/㎗). 이에 비해, dapA+lysC+dapB+ddh(pCABD2) 또는 dapA+lysC+dapB+dapD+dapE(pCABDE1)과 함께 증강시킨 경우에는, asd 또는 ppc를 증강하지 않은 경우에 비해 현저한 L-라이신의 생산량 상승이 확인되었다(asd에서는 70mg/㎗, ppc에서는 90mg/㎗). 그러나 aspA는 dapA+lysC+dapB+ddh(pCABD2)와 함께 증강시킨 경우에도, 현저한 L-라이신의 생산량 상승은 확인되지 않았다. 또한, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 dapA 대신 브레비박테리움 락토페르멘툼으로부터 유래된 dapA를 사용하는 경우[pCABD(B)]에도, 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 dapA를 사용하는 경우(pCABD2)와 동일한 효과를 얻을 수 있으므로 유전자의 유래는 중요하지 않고, 이러한 조합이 중요하다고 생각된다.
실시예 2
<1> 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc)와 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB) 또는 아스파르타제(aspA)를 갖는 플라스미드의 작제
ppc 및 asd를 갖는 플라스미드, ppc 및 pntAB를 갖는 플라스미드, 및 ppc 및 aspA를 갖는 플라스미드를 하기와 같이 하여 작제했다.
(1)ppc 및 asd를 갖는 플라스미드(ppcd)
국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pasd를 KpnⅠ및 SphⅠ으로 절단한 다음, asd를 함유하는 DNA 단편의 양쪽 말단을 평활 말단화하였다. 다음에 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pppc를 XbaⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 여기에 상기 asd 단편을 삽입함으로써 ppcd를 수득했다(도 10).
(2)ppc 및 pntAB를 갖는 플라스미드(pPTS)
국제공개 제WO 95/11985호에 기재된 pMW::THY를 SmaⅠ및 HindⅢ으로 절단하고, pntAB를 포함하는 DNA 단편을 회수했다. 다음에 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pppc를 XbaⅠ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 HindⅢ으로 절단하여, 여기에 상기 pntAB 단편을 삽입함으로써 pPTS를 수득했다(도 11).
플라스미드 pMW::THY의 작제에 관해서는 국제공개 제WO 95/11985호에 상세하게 기재되어 있다. 이의 개략은 하기와 같다.
이. 콜라이의 기존의 pntA 및 pntB의 염기서열[참고문헌: D.M. Clarke et al., Eur. J. Biochem., 158, 647-653(1986)]에 기초하고, PCR법에 의해 프로모터 활성이 있는 영역을 포함하여 이들 유전자 둘다를 포함하는 단편을 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 BamHⅠ 및 HindⅢ으로 분해하여 수득된 DNA 단편을 BamHⅠ 및 HindⅢ으로 절단한 플라스미드 벡터 pMW118(닛본진사)에 연결하여 pMW::THY를 수득했다(도 8).
pMW118::THY를 이. 콜라이 JM109 균주에 도입한 것은 AJ12929라고 명명되고, 1993년 10월 4일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 FERM P-13890의 수탁번호로 기탁되어 있으며, 1994년 9월 14일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되고, FERM BP-4798의 수탁번호가 부여되어 있다.
(3)ppc 및 aspA를 갖는 플라스미드(pAPW)
실시예 1에 기재된 pMW118::aspA를 SacⅠ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 또한 HindⅢ으로 절단함으로써 aspA를 포함하는 DNA 단편을 수득했다. 다음에 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pppc를 XbaⅠ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 또한 HindⅢ으로 절단하여, 여기에 상기 aspA 단편을 삽입함으로써 pAPW를 수득했다(도 12).
<2> 2개의 유전자의 도입 및 L-라이신 생산성의 평가
실시예 <1>에서 수득한 pCABD2를 도입한 형질전환체에 pppc(참조 플라스미드), ppcd, pPTS 및 pAPW(비교예 플라스미드)를 도입했다. 수득된 형질전환체는 pppc, ppcd, pPTS 및 pAPW의 어느 하나와 pCABD2의 2종류의 플라스미드가 공존하고 있다. 이들 형질전환체에 관해 실시예 1<2>와 동일하게 L-라이신 생산성을 조사했다.
결과를 표 2에 나타낸다.
| Lys 축적(㎎/㎗) | |
| pCABD2 + pppc | 1380 |
| pCABD2 + ppcd | 1460 |
| pCABD2 + pPTS | 1450 |
| pCABD2 + pAPW | 1390 |
표 2에서 명백한 바와 같이, asd 또는 pntAB를 dapA+lysC+dapB+ddh+ppc와 함께 증강시킨 경우(ppcd 또는 pPTS)에는, 현저한 L-라이신의 생산량 상승이 확인되었다(asd에서는 80mg/㎗, pntAB에서는 70mg/㎗). 그러나 aspA는 dapA+lysC+dapB+ddh+ppc와 함께 증강시킨 경우(pAPW)에도, 현저한 L-라이신의 생산량 상승은 확인되지 않았다.
실시예 3
<1> 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc)와 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB)와 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd) 또는 아스파르타제(aspA)유전자를 갖는 플라스미드의 작제
ppc, pntAB 및 asd 유전자를 갖는 플라스미드, 및 ppc, pntAB 및 aspA를 갖는 플라스미드를 하기와 같이 실시하여 작제했다.
(1)ppc, pntAB 및 asd를 갖는 플라스미드(pPTd)
국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pasd를 KpnⅠ및 SphⅠ로 절단한 다음, asd를 포함하는 DNA 단편의 양쪽 말단을 평활 말단화했다. 다음에 실시예 2에 기재된 pPTS를 HindⅢ으로 절단하고, 평활 말단화한 다음, 여기에 상기 asd 단편을 삽입함으로써 pPTd를 수득했다(도 13).
(2)ppc, pntAB 및 aspA를 갖는 플라스미드(pAPT)
국제공개 제WO 95/11985호에 기재된 pMW::THY를 SmaⅠ및 HindⅢ으로 절단함으로써 pntAB를 포함하는 DNA 단편을 수득했다. 다음에 실시예 2에 기재된 pAPW를 XbaⅠ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 또한 HindⅢ으로 절단하여, 여기에 상기 pntAB를 포함하는 단편을 삽입함으로써 pAPT를 수득했다(도 14).
<2> 3개의 유전자의 도입 및 L-라이신 생산성의 평가
실시예 <1>에서 수득된 pCABD2를 도입한 형질전환체에 pPTS(참조 플라스미드), pPTd 및 pAPT를 도입했다. 수득된 형질전환체는 pPTS, pPTd 및 pAPT의 어느 하나와 pCABD2의 2종류의 플라스미드가 공존하고 있다. 이들 형질전환체에 관해 실시예 1<2>와 동일하게 L-라이신 생산성을 조사했다.
결과를 표 3에 나타낸다.
| Lys 축적(㎎/㎗) | |
| pCABD2 + pPTS | 1450 |
| pCABD2 + pPTd | 1510 |
| pCABD2 + pAPT | 1500 |
표 3에서 명백한 바와 같이, asd 또는 aspA를 dapA+lysC+dapB+ddh+ppc+pntAB와 함께 증강시킨 경우(pPTd 또는 pAPT)에는, 현저한 L-라이신의 생산량 상승이 확인되었다(asd에서는 60mg/㎗, aspA에서는 50mg/㎗).
실시예 4
<1> 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppc)와 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB)와 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd)와 아스파르타제(aspA)유전자를 갖는 플라스미드의 작제
ppc, pntAB, asd 및 aspA를 갖는 플라스미드를 하기와 같이 하여 작제했다.
실시예 3에 기재된 pAPT를 HindⅢ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 SmaⅠ로 절단함으로써 ppc, aspA 및 pntAB를 포함하는 DNA 단편을 수득했다. 다음에 pMW218(닛본진사)를 EcoRⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 여기에 앞서 수득한 ppc, aspA 및 pntAB를 포함하는 DNA 단편을 삽입함으로써 pAPTK를 수득했다(도 15).
다음에 국제공개 제WO 95/16042호에 기재된 pasd를 KpnⅠ으로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 BamHⅠ로 절단함으로써 asd를 포함하는 DNA 단편을 수득했다. 그리고 pSTV29를 PstⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 BamHⅠ로 절단한 부위에 앞서 수득한 asd 단편을 삽입함으로써 pSd를 수득했다(도 16).
다음에 pSd를 SphⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 XbaⅠ로 절단함으로써 재차 asd를 포함하는 DNA 단편을 수득했다. 그리고 pAPTK를 SacⅠ로 절단한 다음, 양쪽 말단을 평활 말단화하고, 다시 XbaⅠ로 절단한 부위에 상기 asd 단편을 삽입함으로써 pKD를 수득했다(도 17).
<2> 4개의 유전자의 도입 및 L-라이신 생산성의 평가
실시예 <1>에서 수득한 pCABD2, pCABD(B) 또는 pCABDE1을 도입한 형질전환체에 pAPT(참조 플라스미드1), pAPTK(참조 플라스미드2) 및 pKD를 각각 도입했다. 수득된 형질전환체는 pAPT, pAPTK 및 pKD의 어느 하나와 pCABD2, pCABD(B) 및 pCABDE1의 어느 하나의 2종류의 플라스미드가 공존하고 있다. 이들 형질전환체에 관하여 실시예 1<2>와 동일하게 L-라이신 생산성을 조사했다.
결과를 표 4에 나타낸다.
| Lys 축적(㎎/㎗) | |
| pCABD2 + pAPT | 1500 |
| pCABD2 + pAPTK | 1500 |
| pCABD2 + pKD | 1600 |
| pCABD(B) + pKD | 1590 |
| pCABDE1 + pKD | 1580 |
표 4에서 명백한 바와 같이, asd를 dapA+lysC+dapB+ddh+ppc+pntAB+aspA와 함께 증강시킨 경우에는 현저한 L-라이신의 생산량 상승이 확인되었다. 이 결과는 pCABD2대신에 pCABD(B) 또는 pCABDE1을 사용하는 경우에도 동일했다.
표 4에서 pAPTK는 pAPT의 약제내성 유전자를 암피실린으로부터 가나마이신으로 변경한 것이다(벡터를 pMW118로부터 pMW218로 변경했기 때문). pKD는 pAPTK에 asd를 삽입해서 작성했기 때문에, pKD의 대조로서는 pAPT보다 pAPTK가 적절하다고 간주되므로, pAPTK의 데이타도 나타냈다. 약제 내성 유전자의 변경에 의해 L-라이신의 생산량은 영향을 받지 않는 것도 확인되었다.
본 발명에 따라, L-라이신의 생산성이 높은 에스케리키아속 세균이 제공되고, 이러한 세균을 사용함으로써 L-라이신을 고수율로 수득할 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Process for Producing L-Lysine
<130> B-603MSOP956
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of a promoter portion of tet
<400> 1
tcaagaattc tcatgtttga 20
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of a promoter portion of tet
<400> 2
gttagatttg gtacccggtg cctgactgcg ttagc 35
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of dapA
<400> 3
ggttgtggta cccccaaatg agggaagaag 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of dapA
<400> 4
tggaacctct gttgctgcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of aspA
<400> 5
tgatcagcga aacactttta 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for amplification of aspA
<400> 6
cagcaaacta tgatgagaa 19
Claims (10)
- (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐 디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아(Escherichia) 세균으로서, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 포스포에놀피루브산 카복실라제의 세포내 활성이 증강되어 있으며,당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 카피수를 증가시키거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 변형시켜서 효소 각각의 세포내 활성이 증강되어짐을 특징으로 하는 에스케리키아 세균.
- (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아 세균으로서, 포스포에놀피루브산 카복실라제의 세포내 활성 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 또는 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제의 세포내 활성이 증강되어 있으며,당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 카피수를 증가시키거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 변형시켜서 효소 각각의 세포내 활성이 증강되어짐을 특징으로 하는 에스케리키아 세균.
- (1) 디하이드로디피콜린산 합성효소, 아스파르토키나제 및 디하이드로디피콜린산 리덕타제의 세포내 활성이 증강되고, (2) 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성 또는 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제 및 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제의 세포내 활성이 증강된 에스케리키아 세균으로서, 포스포에놀피루브산 카복실라제 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제의 세포내 활성 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 또는 아스파르타제의 세포내 활성이 증강되어 있으며,당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 카피수를 증가시키거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 변형시켜서 효소 각각의 세포내 활성이 증강되어짐을 특징으로 하는 에스케리키아 세균.
- 제3항에 있어서, 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 및 아스파르타제의 세포내 활성이 당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 카피수를 증가시키거나 염색체 상에서 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 변형시킴으로써 증강되어짐을 특징으로 하는 에스케리키아 세균.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 아스파르토키나제, 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 석시닐디아미노피멜린산 데아실라제, 포스포에놀피루브산 카복실라제 및 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제가 각각 에스케리키아 세균으로부터 유래되고, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제 및 아스파르타제가, 존재하는 경우에는, 각각 에스케리키아 세균으로부터 유래되며, 디하이드로디피콜린산 합성효소가 에스케리키아 세균 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 세균으로부터 유래되고, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제가 브레비박테리움 세균으로부터 유래된 에스케리키아 세균.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 아스파르토키나제의 세포내 활성이, L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 디하이드로디피콜린산 합성효소 및 L-라이신에 의한 피드백 억제가 해제된 아스파르토키나제를 보유함으로써 증강되고, 디아미노피멜린산 데하이드로게나제의 세포내 활성이 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자의 도입에 의해 증강된 에스케리키아 세균.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 에스케리키아 세균을 적절한 배지에서 배양하는 단계, 당해 배양물 중에 L-라이신을 생산 축적시키는 단계 및 당해 배양물로부터 L-라이신을 수거하는 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법.
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