SK10542002A3 - Baktéria Escherichia, v ktorej je zosilnená aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy a spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents
Baktéria Escherichia, v ktorej je zosilnená aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy a spôsob výroby L-lyzínu Download PDFInfo
- Publication number
- SK10542002A3 SK10542002A3 SK1054-2002A SK10542002A SK10542002A3 SK 10542002 A3 SK10542002 A3 SK 10542002A3 SK 10542002 A SK10542002 A SK 10542002A SK 10542002 A3 SK10542002 A3 SK 10542002A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- lysine
- enhanced
- intracellular activity
- gene
- plasmid
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 144
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims abstract description 43
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 43
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 21
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 70
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 69
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 36
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 110
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 claims description 11
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 10
- UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrodipicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1CC=CC(C(O)=O)=N1 UWOCFOFVIBZJGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 6
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 5
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 5
- CXMBCXQHOXUCEO-BYPYZUCNSA-N (S)-2,3,4,5-tetrahydrodipicolinic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCC(C(O)=O)=N1 CXMBCXQHOXUCEO-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 64
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 58
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 40
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 38
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 38
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 37
- 101150007902 ASPA gene Proteins 0.000 description 35
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 35
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 23
- 101000779368 Bacillus subtilis (strain 168) Aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 18
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 17
- 101150109073 ldhD gene Proteins 0.000 description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 101150073820 pntA gene Proteins 0.000 description 4
- 101150011666 pntB gene Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OSHIQPFXKULOPB-UHFFFAOYSA-N 6-(hydroxyamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound ONC1=CC=NC(=O)N1 OSHIQPFXKULOPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010063172 Aspartate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 2
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMVYERAUBSAVAX-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-1-nitrosoguanidine Chemical class NC(=N)N(N=O)[N+]([O-])=O HMVYERAUBSAVAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150075693 AK gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100427576 Caenorhabditis elegans ung-1 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101100272976 Panax ginseng CYP716A53v2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040207 Poly(A) polymerase beta Human genes 0.000 description 1
- 101710192595 Polyamine aminopropyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 101150116541 nadB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N pyridinium p-toluenesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- -1 transhydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Predložený vynález sa týka mikrobiologického priemyslu. Konkrétnejšie, predložený vynález sa týka spôsobu výroby L-lyzínu fermentáciou a mikroorganizmu používaného pri tomto produkčnom spôsobe.
Doterajší stav techniky
Obvykle sa pri produkcii L-lyzínu fermentáciou používali kmene izolované z prírody alebo ich umelé mutanty, aby sa zlepšila produktivita. Známe sú mnohé umelé mutantné kmene, ktoré produkujú L-lyzín, a mnohé z nich sú S-2-aminoetylcysteín (AEC) rezistentné kmene a patria do rodov Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus alebo Escherichia. Okrem toho boli opísané rôzne techniky na zvýšenie aminokyselinovej produkcie, napríklad použitím transformantu získaného prostredníctvom rekombinantnej DNA.
čo sa. týka Escherichia baktérií, tak napríklad vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške (Kokai) č. 56-18596, US patente č. 4346170 a v Applied Microbiology and Biotechnology, 15, str. 227-331 (1982) boli opísané spôsoby výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená aktivita dihydrodipikolinát syntetázy (DDPS). Okrem toho bol spôsob výroby L-lyzínu použitím Escherichia baktérie, do ktorej sa zaviedla DDPS derivovaná forma Corynebacterium baktérie, opísaný v kórejskom zverejnenom patente č. 92-8382. Okrem toho je v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, ktorý sa transformoval plazmidom obsahujúcim DNA, ktorá kóduje dihydrodipikolinát syntázu odvodenú z Escherichia baktérie majúcej mutáciu znecitlivujúcu inhibičnú spätnú väzbu L-lyzínom, DNA, którá kóduje aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, DNA, ktorá kóduje dihydrodipikolinát reduktázu, a DNA, ktorá kóduje diaminopimelát dehydrogenázu odvodenú od koryneformnej baktérie.
-2Čo sa týka Brevibacterium baktérií, medzinárodná zverejnená prihláška vynálezu č. WO 95/11985 opisuje, že je možné zlepšiť produktivitu L-lyzínu zosilnením aktivity vnútrobunkovej nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy. Okrem toho je vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 60-87788 opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená iba aktivita fosfoenolpyruvát karboxylázy a v japonskej prihláške vynálezu (Kokoku) č. 6-102028 je opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená iba aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy.
Pri priemyselnej výrobe aminokyselín fermentáciou sa výroba uskutočňuje vo veľkom meradle. Preto môže zlepšenie výťažku aj len o niekoľko percent poskytnúť významnú priemyselnú hodnotu, takže je želateľné zlepšenie výťažku bez ohľadu na stupeň zlepšenia.
Cieľom predloženého vynálezu je poskytnutie zlepšeného spôsobu výroby L-lyzínu fermentáciou v porovnaní s obvyklými spôsobmi.
Pôvodcovia predloženého vynálezu vytrvalo skúmali, aby dosiahli vyššie uvedený cieľ. Výsledkom bolo zistenie, že ak sa zosilní aktivita aspartátsemialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy v Escherichia baktérii majúcej špecifikovanú vlastnosť, a ak sa v takejto Escherichia baktérii zosilní aktivita alebo aktivity špecifického enzýmu alebo enzýmov okrem vyššie uvedených enzýmov, je možné zlepšiť produktivitu L-lyzínu baktériou, a na základe týchto zistení zostavili predložený vynález.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je Escherichia baktériu, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntézy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je zosilnená vnútrobunkové aktivita aspartátsemialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy;
Ďalej vynález poskytuje Escherichia baktériu, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntézy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát
-3reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunková aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je zosilnená vnútrobunková aktivita fosfoenolpyruvát karboxylázy a vnútrobunková aktivita nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy; a ďalej vynález poskytuje Escheríchia baktériu, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom sú zosilnené vnútrobunkové aktivity fosfoenolpyruvát karboxylázy a nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy a vnútrobunková aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo aspartázy (nižšie sa baktéria podľa vyššie uvedených troch predmetov kolektívne označuje ako baktéria podľa predloženého vynálezu).
Je výhodné, aby boli v baktérii podľa predloženého vynálezu zosilnené vnútrobunkové aktivity aspartát-semialdehyd dehydrogenázy a aspartázy.
Okrem toho je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu bola aspartokináza, dihydrodipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartátsemialdehyd dehydrogenáza odvodené od Escheríchia baktérie, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrógenáza a aspartáza, ak sú prítomné, tak každá z nich od Escheríchia baktérie, dihydrodipikolinát syntéza od Escheríchia baktérie alebo Brevibacterium baktérie a diaminopimelát dehydrogenáza ód Brevibacteríum baktérie.
Je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu bola vnútrobunková aktivita enzýmu, ktorého vnútrobunková aktivita je zosilnená, zosilnená prostredníctvom jedného z nasledujúcich spôsobov alebo prostredníctvom ich kombinácie.
(1) Začlenením plazmidu obsahujúceho gén enzýmu.
(2) Zvýšením počtu kópií génu enzýmu na chromozóme.
(3) Modifikáciou promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme.
-4Okrem toho je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu boli vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntézy a aspartokinázy zosilnené tým, že obsahujú dihydrodipikolinát syntázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená prostredníctvom zavedenia diaminopimelát dehydrogenázového génu.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby L-lyzínu, ktorý zahŕňa kultivovanie ktorejkoľvek baktérie podľa predloženého vynálezu vo vhodnom médiu, aby sa produkoval a akumuloval L-lyzín v kultúre, a izolovanie L-lyzínu z kultúry (tu nižšie označovaný aj ako produkčný spôsob podľa predloženého vynálezu).
Najlepší spôsob na uskutočňovanie vynálezu <1> Baktérie podľa predloženého vynálezu
Baktériami podľa predloženého vynálezu sú Escherichia baktérie, v ktorých sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntézy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) v ktorých je zosilnená vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, a navyše sú zosilnené vnútrobunkové aktivity nasledujúcich enzýmov:
(1) aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy, (2) fosfoenolpyruvát karboxylázy a nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy (tu nižšie označovaná aj ako transhydrogenáza) alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo (3) fosfoenolpyruvát karboxylázy a transhydrogenázy a aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo aspartázy.
Baktériami podľa predloženého vynálezu sú výhodne Escherichia baktérie, v ktorých sú navyše zosilnené vnútrobunkové aktivity fosfoenolpyruvát karboxylázy, transhydrogenázy, aspartát-semialdehyd dehydrogenázy a aspartázy.
Baktérie podľa predloženého vynálezu patria výhodne k Escherichia coli (E. coli).
-5V tomto opise znamená výraz vnútrobunková aktivita je zosilnená to, že vnútrobunková enzymatická aktivita je zvýšená v porovnaní s clivým kmeňom (napríklad E. coli W3110 kmeňom) alebo v porovnaní s rodičovským kmeňom (kmeň v ktorom nie je zosilnená aktivita žiadneho z enzýmov zahrnutých v kombináciách špecifikovaných v predloženom vynáleze) a znamená aj to, že baktéria má enzymatickú aktivitu, ktorú nemá divý kmeň alebo rodičovský kmeň. Spôsoby merania aktivít vyššie uvedených enzýmov sú známe a priemerný odborník v oblasti môže jednoducho potvrdiť zosilnenie vnútrobunkových aktivít.
Prostriedky na zosilnenie vnútrobunkových aktivít zahŕňajú nasledujúce prostriedky a ich kombinácie, ale nie sú nimi obmedzené.
Ako prvý je možné uviesť prostriedok na zvýšenie exprimovaného množstva enzýmov.
Konkrétne, ako prostriedky na zvýšenie exprimovaného množstva enzýmov je možné uviesť nasledujúce prostriedky:
(1) Zavedenie plazmidu obsahujúceho gén enzýmu
Ako plazmid sa môže použiť vektor autonómne replikovateľný v Escherichia bakteriálnej bunke. Zaviesť sa môže známym spôsobom. To znamená, že gén, o ktorý je záujem sa môže začleniť do vektora a týmto vektorom sa môže transformovať Escherichia baktéria. Týmto vektorom je výhodne multi-kópiový typ plazmidu.
Gény môžu byť nesené rovnakým plazmidom alebo rozličnými plazmidmi. Niektoré z génov môžu byť nesené rovnakým plazmidom. Ak sa použijú dva alebo viacero druhov plazmidov, je výhodné použiť plazmidy, ktoré majú stabilné rozdeľovacie systémy umožňujúce stabilnú koexistenciu týchto plazmidov v bunke. Poradie zavádzania génov nie je nijako výnimočne obmedzené.
(2) Zvyšovanie počtu kópií génu enzýmu na chromozóme
Počet kópií sa môže zvyšovať amplifikáciou DNA na chromozomálnej DNA použitím Mu fága alebo podobne.
DNA na chromozomálnej DNA môže byť pôvodne vlastnená Escherichia baktériou alebo to môže byť DNA začlenená do chromozómu hostiteľského
-6mikroorganizmu spôsobom použitím transdukcie, transpozónu (Berg, D. E. a Berg C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), Mu fága (zverejnená japonská patentová prihláška č. 2-109985) alebo homologickej rekombinácie (Experiments in Molecular Genetics and Cold Sprin Harbor Lab. (1972)).
(3) Modifikácia promótorovej sekvencie génu enzýmu
Promótorová sekvencia sa môže modifikovať, aby sa zvýšilo transkripčné množstvo génu, a aby sa tým zvýšilo exprimované množstvo. Napríklad sa môže zosilniť promótor zavedením mutácie do promótora, aby sa zvýšilo transkripčné množstvo génu umiestneného po prúde od promótora. Okrem zavedenia mutácie do promótora sa môže novo zaviesť promótor, ktorý funguje v Escheríchia baktériách, ako napríklad lac, trp, tac, trc a PL. Alternatívne sa môže zvýšiť transkripčné množstvo génu novo zavedeným zosilňovačom. Hoci promótorovou sekvenciou môže byť sekvencia génu enzýmu na chromozóme alebo sekvencia génu enzýmu na plazmide, výhodne je to sekvencia génu enzýmu na chromozóme. Zavádzanie génov do chromozomálnej DNA je opísané napríklad vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 1-215280.
Pôvod génov pre vyššie uvedené enzýmy nie je nijako zvlášť obmedzený a použité môžu byť gény získané z rôznych zdrojov, pokiaľ sa môžu exprimovať v Escheríchia baktériách, a pokiaľ v nich môžu fungovať genetické produkty.
Ďalej tu budú uvedené príklady na získanie génov L-lyzínového biosyntetického systému a transhydrogenázového génu z E. coli a dihydrodipikolinát syntázového a diaminopimelát dehydrogenázového génu z Brevibacterium lactofermentum.
Fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc) sa môže získať z plazmidu pS2 (Sabe, H. a ďalší, Gene, 31, 279 (1984)) alebo pT2, ktoré obsahujú tento gén. DNA fragment obsahujúci ppc sa môže získať poštiepením pS2 s Aatll a Aflll. Okrem toho sa DNA fragment obsahujúci ppc môže získať aj poštiepením pT2 so Smal a Seal. E. coli F15 kmeň obsahujúci pT2 (AJ12873) sa uložil v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 15. júla 1993 a obdržal
-7prístupové číslo FERM P-13752. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. júla 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4732.
Aspartokinázový gén (lysC) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie lysC (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., a Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1062 (1986) (napríklad primerov uvedených v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, sekv. č. 5 a 6).
Aspartát-semialdehydový dehydrogenázový gén (asd) sa môže získať z plazmidu pAD20 (Haziza, C. a ďalší, EMBO, 1, 379 (1982)) obsahujúceho tento gén. Ak sa pAD20 poštiepi s Asel a Clal, získa sa DNA fragment obsahujúci asd.
Dihydrodipikolinát syntázový gén (dapA) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 1 a 2 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapA (Richaud, F. a ďalší,
J. Bacteriol, 297 (1986)).
Dihydrodipikolinát reduktázový gén (dapB) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 9 a 10 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapB (Bouvier, J. a ďalší,
J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)).
Tetrahydrodipikolinát sukcinylázový gén (dapD) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 15 a 16 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapD (Richaud, C. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)).
Sukcinyldiaminopimelát deacylázový gén (dapE) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako
-8templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 17 a 18 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapE (Bouvier, J. a ďalší, J. Bacteriol, 174, 5265 (1992)).
Aspartázový gén (aspA) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 5 a 6 uvedenými v Zozname sekvencií predloženého opisu) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie aspA (Woods, S. A. a ďalší, Biochem. J., 237 (2), 547-557 (1986)).
Transhydrogenázový gén (pntAB) sa môže pripraviť na základe známej nukleotidovej sekvencie transhydrogenázového génu (D.M. Čiarke a ďalší, Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)). V E. coli sa transhydrogenáza skladá z dvoch podjednotiek, ktoré sú kódované s pntA, respektíve pntB (D. M. Čiarke a ďalší, vyššie). Preto sa pripravujú oba gény (pozri napríklad medzinárodnú zverejnenú prihlášku vynálezu č. WO 95/11985).
Môže sa získať aj z plazmidu obsahujúceho pntAB. Ako plazmid obsahujúci pntAB, môže byť spomenutý plazmid pMW::THY uvedený v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985. Tento plazmid je rekombinantným plazmidom získaným ligáciou 3,0kb DNA fragmentu E. coli K-12 MC1061 kmeňa, ktorý obsahuje pntA a pntB, a BamHI a Hindlll fragmentu plazmidového vektora pMW118. Escherichia coli JM109 kmeň obsahujúci pMW::THY bol označený ako AJ 12929 kmeň a bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-0046, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 4. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13890. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. septembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4798.
Dihydrodipikolinát syntázový gén (dapA) Brevibacterium lactofermentum sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových
-9primerov (napríklad primerov so sekv. č. 3 a 4 uvedenými v Zozname sekvencií predloženého opisu) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapA (Bonassie, S. a ďalší, N.A.R., 18(21), 6421 (1990)).
Dihydrodipikolinát dehydrogenázový gén (ddh) Brevibacterium lactofermentum sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primerov (napríklad primerov so sekv. č. 11 a 12 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie ddh Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a ďalší, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)).
Ako prostriedok na zosilnenie vnútrobunkových aktivít môže byť uvedený aj prostriedok na zosilnenie špecifických aktivít enzýmov. Tento prostriedok môže byť kombinovaný s prostriedkom na zvýšenie exprimovaných množstiev enzýmov.
Ako prostriedok na zvýšenie špecifických aktivít enzýmov môže byť uvedené aj zavedenie enzýmu s mutáciou zvyšujúcou špecifickú aktivitu, vrátane enzýmu, ktorého spätná inhibičná väzba je znecitlivená, ak takýto enzým dostáva spätnú inhibičnú väzbu, a tak ďalej.
Príklady enzýmov, ktorých spätná inhibičná väzba je znecitlivená, zahŕňajú dihydrodipikolinát syntázu (DDPS), ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu (AK), ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená.
Výraz spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená znamená, že postačuje podstatné znecitlivenie inhibície a nie je potrebné, aby bola inhibícia úplne znecitlivená. Okrem toho sú medzi enzýmy, ktorých spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, zahrnuté aj enzýmy odvodené od iného organizmu ako Escheríchia baktérií bez ohľadu na to či ide o divý typ alebo mutantný typ enzýmu organizmu, ak je stupeň spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom nižší ako stupeň divého typu enzýmu odvodeného od Escheríchia baktérie. Takže je zahrnutý aj enzým, ktorý pôvodne nemá spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ako napríklad DDPS odvodený od Brevibacterium baktérií.
-10Stupeň spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom môže byť hodnotený známymi metódami, ako napríklad metódami opísanými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, v príkladoch 1 a 2.
Ako DDPS, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená (znecitlivená DDPS) a ako AK, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená (znecitlivená AK), je možné uviesť enzýmy opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 a vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 10-113183.
Príklady znecitlivených DDPS zahŕňajú teda DDPS s mutáciou znecitlivujúcou spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ktorá je pri divom type DDPS. Ako divý typ DDPS môžu byť uvedené DDPS odvodené od Escheríchia baktérií, najmä DDPS odvodená od E. coli. Príklady mutácie, ktorá znecitlivuje spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom u DDPS, zahŕňajú:
(1) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci alanínovému zvyšku v polohe 81 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne valínovým zvyškom), (2) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci histidínovému zvyšku v polohe 118 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom), a (3) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci alanínovému zvyšku v polohe 81 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne valínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci histidínovému zvyšku v polohe 118 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom) v DDPS aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. č. 4 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa počítajú od N-konca DDPS. Je dobre známe, že medzi druhmi alebo kmeňmi sa môže vyskytnúť odlišnosť v aminokyselinovej sekvencii, ktorá neovplyvňuje aktivitu, a pre priemerného odborníka v oblasti je jednoduché určiť aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci vyššie uvedeným špecifickým aminokyselinovým zvyškom.
-11 Iné príklady znecitlivenej DDPS zahŕňajú DDPS odvodenú od koryneformných baktérií, napríklad Brevibacterium lactofermentum (Cremer J. a ďalší, J. Gen. Microbiol, 134, 3221-3229 (1988)).
Aby bola znecitlivená DDPS obsahom Escherichia baktérií, môže sa napríklad vniesť DNA kódujúca znecitlivenú DDPS.
Príklady DNA kódujúcej znecitlivenú DDPS zahŕňajú DNA zodpovedajúce DNA kódujúcej divý typ DDPS, ktorá má mutáciu na znecitlivenie spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom kódovanej DDPS.
Ďalej tu bude vysvetlený spôsob na získanie DNA kódujúcej znecitlivenú DDPS (znecitlivený DDPS gén) prostredníctvom príkladu DDPS odvodenej od Escherichia baktérií. Čo sa týka DDPS iných organizmov, DNA sa môže získať podobne. Okrem toho, ak je divým typom DDPS odvodenej od iného organizmu znecitlivená DDPS, môže sa použiť jej kódujúca DNA nezmenená.
DNA kódujúca divý typ DDPS nie je nijako výnimočne obmedzená, pokiaľ kóduje DDPS odvodenú od Escherichia baktérie. Konkrétne môže byť uvedená DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu opísanú v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, ako sekv. č. 4. Konkrétnejšie môže byť uvedená sekvencia reprezentovaná nukleotidovými číslami 272-1147 v rámci nukleotidovej sekvencie označenej ako sekv. č. 3 v rovnakom dokumente. Z týchto sekvencií je jedna, majúca mutáciu nukleotidovej sekvencie spôsobujúcu nahradenie vyššie uvedených aminokyselinových zvyškov, DNA kódujúcou znecitlivenú DDPS. Okrem toho, typ kodónu zodpovedajúceho nahradenému aminokyselinovému zvyšku nie je nijako výnimočne obmedzený, pokiaľ kóduje daný aminokyselinový zvyšok. Navyše sa tiež očakáva mierna odchýlka v aminokyselinovej sekvencii obsiahnutej v DDPS medzi bakteriálnymi druhmi a kmeňmi. Avšak sekvencie, ktoré majú takúto odchýlku spôsobujúcu nahradenie, deléciu alebo inzerciu aminokyselinových zvyškov v polohách, ktoré neovplyvňujú aktivitu enzýmu, spadajú do rozsahu znecitliveného DDPS génu.
Takýto znecitlivený DDPS gén je možné získať napríklad nasledovne. Najprv sa DNA obsahujúca divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén s mutáciou podrobí in vitro mutačnému procesu a DNA, ktorá prešla mutačným procesom sa liguje s vektorovou DNA kompatibilnou s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantné DNA.
-12Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant ktorý začne exprimovať znecitlivenú DDPS sa vyselektuje spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant nesie znecitlivený DDPS gén. Alternatívne sa môžu ligovať DNA obsahujúca divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén majúci mutáciu a vektorová DNA kompatibilná s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantné DNA. Potom sa táto rekombinantné DNA môže podrobiť in vitro mutačnému procesu a zaviesť do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant ktorý začne exprimovať znecitlivenú DDPS sa vyselektuje spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant tiež nesie znecitlivený DDPS gén.
Okrem toho sa môže mikroorganizmus, ktorý produkuje divý typ DDPS, podrobiť mutačnému procesu, čím sa pripraví mutantný kmeň, ktorý produkuje znecitlivenú DDPS, a potom sa z tohto mutantného kmeňa môže získať znecitlivený DDPS gén. Alternatívne, ak sa mutačnému procesu podrobí transformant, do ktorého bola zavedená rekombinantné DNA ligovaná s divým typom génu, aby sa pripravil mutantný kmeň produkujúci znecitlivenú DDPS, a potom sa rekombinantné DNA izoluje z mutantného kmeňa, vytvorí sa znecitlivený DDPS gén z tejto DNA.
Príklady činidiel na in vitro DNA mutačný proces zahŕňajú hydroxylamín a tak ďalej. Hydroxylamín je chemické mutačné činidlo, ktoré spôsobuje nahradenie cytozínu tymínom prostredníctvom zmeny cytozínu na N4-hydroxycytozín. Keď sa mutačnému procesu podrobuje samotný mikroorganizmus, tento proces sa uskutočňuje ultrafialovým žiarením alebo mutagenizačným činidlom zvyčajne používaným na umelé mutácie, ako napríklad A/-metyl-/\/-nitro-A/-nitrozoguanidínom (NTG) alebo kyselinou dusitou.
Ako baktéria poskytujúca DNA obsahujúcu divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén obsahujúci mutáciu, sa môže použiť ktorýkoľvek z mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia. Konkrétne sa môžu použiť mikroorganizmy uvedené v literatúre od Neidhardta a ďalších (Neidhardt, F.C. a ďalší, Escherichia coli a Salmonella typhimurium, American Socienty for Microbiology, Washington D.S., 1208, tabuľka 1). Spomenutý môže byť napríklad E. coli JM109 kmeň a MC1061 kmeň. Keď sa ako donor DNA obsahujúcej DDPS gén použije divý kmeň, je možné získať DNA obsahujúcu divý typ DDPS génu.
- 13Príklady znecitlivenej AK zahŕňajú AK, ktoré majú mutáciu znecitlivujúcu spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ktorá je prítomná pri divom type AK. Ako AK divého typu môžu byť spomenuté AK odvodené od Escherichia baktérií, najmä aspartokináza III (AKIII) odvodená od E. coli. Príklady mutácií, ktoré znecitlivujú spätnú inhibičnú väzbu AKIII L-lyzínom, zahŕňajú:
(a) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (b) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 408 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (c) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci arginínovému zvyšku v polohe 34 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne cysteínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (d) · mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci leucínovému zvyšku v. polohe 325 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne fenylalanínovým zvyškom), (e) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), (f) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci valínovému zvyšku v polohe 349 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne metionínovým zvyškom), (g) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci serínovému zvyšku v polohe 345 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne leucínovým zvyškom),
-14(h) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci valínovému zvyšku v polohe 347 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne metionínovým zvyškom), (i) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci treonínovému zvyšku v polohe 352 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), (j) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci treonínovému zvyšku v polohe 352 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci serínovému zvyšku v polohe 369 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne fenylalanínovým zvyškom), (k) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci zvyšku kyseliny glutámovej v polohe 164 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne lyzínovým zvyškom), a (l) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 417 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci cysteínovému zvyšku v polohe 419 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom), v AKIII aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. č. 8 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa počítajú od N-konca AKIII. Okrem toho môže byť spomenutá mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom) (zverejnená japonská patentová prihláška č. 10-113183). Je dobre známe, že medzi druhmi alebo kmeňmi sa môže vyskytnúť odlišnosť v aminokyselinovej sekvencii, ktorá neovplyvňuje aktivitu, a pre priemerného odborníka v oblasti je jednoduché určiť aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci vyššie uvedeným špecifickým aminokyselinovým zvyškom.
-15Iné príklady znecitlivenej AK zahŕňajú mutantný typ AK odvodený od koryneformných baktérií (zverejnená japonská patentová prihláška č. 6-62866).
Na to, aby Escherichia baktérie obsahovali znecitlivenú AK sa môže do týchto Escherichia baktérií napríklad zaviesť DNA, ktorá kóduje znecitlivenú AK.
Príklady DNA kódujúcej znecitlivenú AK zahŕňajú tie, ktoré zodpovedajú DNA kódujúcej divý typ AK s mutáciou znecitlivujúcou spätnú inhibičnú väzbu kódovanej AK L-lyzínom.
Ďalej tu bude vysvetlený spôsob na získanie DNA kódujúcej znecitlivenú AK prostredníctvom príkladu AKIII odvodenej od Escherichia baktérií. Čo sa týka AK iných organizmov, DNA sa môže získať podobne. Okrem toho, ak je divým typom AK odvodenej od iného organizmu znecitlivená AK, môže sa použiť jej kódujúca DNA nezmenená.
DNA kódujúca divý typ AKIII nie je nijako výnimočne obmedzená. Uvedená môže byť napríklad DNA kódujúca AKIII odvodená od Escherichia baktérie, konkrétne od E. coli. Konkrétne môže byť uvedená DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu opísanú v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, ako sekv. č. 8 a sekvencia reprezentovaná nukleotidovými číslami 5841930 v rámci nukleotidovej sekvencie označenej ako sekv. č. 7 v rovnakom dokumente. AKIII E. coli je kódovaná lysC génom.
Z týchto sekvencií je jedna, majúca mutáciu nukleotidovej sekvencie spôsobujúcu nahradenie vyššie uvedených aminokyselinových zvyškov, DNA kódujúcou znecitlivenú AK. Okrem toho, typ kodónu zodpovedajúceho nahradenému aminokyselinovému zvyšku nie je nijako výnimočne obmedzený, pokiaľ kóduje daný aminokyselinový zvyšok. Navyše sa tiež očakáva mierna odchýlka v aminokyselinovej sekvencií obsiahnutej v AKIII medzi bakteriálnymi druhmi a kmeňmi. Avšak sekvencie, ktoré majú takúto odchýlku spôsobujúcu nahradenie, deléciu alebo inzerciu aminokyselinových zvyškov v polohách, ktoré neovplyvňujú aktivitu enzýmu, spadajú do rozsahu mutantného AK génu. Napríklad nukleotidová sekvencia divého typu lysC génu získaná v príklade 2 uvedenom nižšie (medzinárodná zverejnená prihláška vynálezu č. WO 95/16042, sekv. č. 7) má odchýlky v 6 polohách sekvencie v porovnaní s už zverejnenou nukleotidovou sekvenciou lysC E. coli K-12 JC411 kmeňa (Cassan M., Parsot, C., Cohen, G.N. a
- 16Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), spomedzi ktorých dve odchýlky kódujú odlišné aminokyselinové zvyšky (lysC JC411 kmeňa poskytuje nahradenie glycínového zvyšku v polohe 58 cysteínovým zvyškom a nahradenie glycínového zvyšku v polohe 401 alanínovým zvyškom v aminokyselinovej sekvencii kódovanej s lysC, ktorá je označená ako sekv. č. 8 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa odčítavajú z jej N-konca). Očakáva sa, že aj lysC s rovnakou sekvenciou ako lysC E. coli K-12 JC411 kmeňa môže poskytnúť lysC s mutáciou, ktorá znecitlivuje spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ak sa zavedie ktorákoľvek z mutácií uvedených vyššie ako (a) až (I), alebo mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom.
Takúto DNA kódujúcu mutantný typ AKIII, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, je možné získať napríklad nasledovne. Najprv sa DNA obsahujúca divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén s mutáciou podrobí in vitro mutačnému procesu a DNA, ktorá prešla mutačným procesom sa liguje s vektorovou DNA kompatibilnou s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant ktorý začne exprimovať mutantný typ AKIII sa sa môže vyselektovať spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant nesie mutantný typ génu. Alternatívne sa môžu ligovať DNA obsahujúca divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén majúci mutáciu a vektorová DNA kompatibilná s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Potom sa táto rekombinantná DNA môže podrobiť in vitro mutačnému procesu a zaviesť do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant ktorý začne exprimovať mutantný typ AKIII sa môže vyselektovať spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant tiež nesie mutantný typ génu.
Okrem toho sa môže mikroorganizmus, ktorý produkuje divý typ enzýmu, podrobiť mutačnému procesu, čím sa pripraví mutantný kmeň, ktorý produkuje mutantný typ enzýmu, a potom sa z tohto mutantného kmeňa môže získať mutantný typ génu. Príklady činidiel na priame podrobenie DNA mutačnému
- 17procesu zahŕňajú hydroxylamín a tak ďalej. Hydroxylamín je chemické mutačné činidlo, ktoré spôsobuje nahradenie cytozínu tymínom prostredníctvom zmeny cytozínu na N4-hydroxycytozín. Ked sa mutačnému procesu podrobuje samotný mikroorganizmus, tento proces sa uskutočňuje ultrafialovým žiarením alebo mutagenizačným činidlom zvyčajne používaným na umelé mutácie, ako napríklad /V-metyl-/V-nitro-A/-nitrozoguanidínom (NTG).
Ako baktéria poskytujúca DNA obsahujúcu divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén obsahujúci mutáciu, sa môže použiť ktorýkoľvek z mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia. Konkrétne sa môžu použiť mikroorganizmy uvedené v literatúre od Neidhardta a ďalších (Neidhardt, F.C. a ďalší, Escherichia coli a Salmonella typhimurium, American Socienty for Microbiology, Washington D.S., 1208, tabuľka 1). Spomenutý môže byť napríklad E. coli JM109 kmeň a MC1061 kmeň a tak ďalej.
Je výhodné, aby v baktériách podľa predloženého vynálezu bola, aspartokináza, dihydrodipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartátsemialdehyd dehydrogenáza odvodené od Escherichia baktérie, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenáza a aspartáza, ak sú prítomné, tak každá z nich od Escherichia baktérie, dihydrodipikolinát syntáza od Escherichia baktérie alebo Brevibacterium baktérie a diaminopimelátdehydrogenáza od Brevibacterium baktérie.
Príklady Brevibacterium baktérií zahŕňajú okrem Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilum a tak ďalej.
Okrem toho je výhodné, aby v baktériách podľa predloženého vynálezu boli vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy a aspartokinázy zosilnené zavedením dihydrodipikolinát syntázy, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázy, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aby bola vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy zosilnená zavedením diaminopimelát dehydrogenázového génu. Takéto výhodné baktérie podľa predloženého vynálezu je možné získať zavedením plazmidu
-18pCABD2 alebo pCABDEI, ktoré sú uvedené v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, do Escherichia baktérie.
<2> Produkčný spôsob podľa predloženého vynálezu
L-lyzín je možné účinne produkovať kultivovaním baktérií podľa predloženého vynálezu, ktoré sa získali podľa vyššie uvedeného opisu, v médiu vhodnom na produkciu a akumulovanie L-lyzínu v kultúre, a izolovaním L-lyzínu z kultúry.
Médiom používaným na kultiváciu baktérií podľa predloženého vynálezu môže byť zvyčajné médium obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a iné organické stopové výživové látky, ak sú potrebné.
Ako zdroj uhlíka je možné použiť sacharidy, ako napríklad glukózu, laktózu, galaktózu, fruktózu a škrobový hydrolyzát; alkoholy, ako napríklad glycerol a sorbitol; alebo organické kyseliny, ako napríklad kyselinu fumarovú, kyselinu citrónovú a kyselinu jantárovú.
Ako zdroj dusíka je možné použiť anorganické amónne soli, ako napríklad síran amónny, chlorid amónny alebo fosforečnan amónny; organický dusík, ako napríklad sójový hydrolyzát; amoniakový plyn; alebo vodný amoniak.
Ako organické stopové výživové látky je výhodné pridávať potrebné látky, ako napríklad vitamín ΒΊ a L-izoleucín, kvasinkový extrakt a tak ďalej, vo vhodnom množstve. Okrem týchto sa pridáva malé množstvo fosforečnanu draselného, síranu horečnatého, železitých iónov, mangánových iónov a tak ďalej.
Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v aeróbnych podmienkach 16 až 72 hodín. Kultivačná teplota môže byť kontrolovaná tak, aby dosahovala v priebehu kultivácie 20 °C až 45 °C, a pH môže byť kontrolované tak, aby bolo v priebehu kultivácie v rozsahu 5 až 8. Na nastavenie pH je možné použiť anorganické alebo organické, kyslé alebo alkalické látky, ako aj amoniakový plyn a tak ďalej.
Izolácia L-lyzínu z fermentačnej kvapaliny sa zvyčajne uskutočňuje kombináciou iónovej výmennej živicovej metódy, precipitačnej metódy a iných známych techník.
Predložený vynález bude nižšie podrobnejšie vysvetlený s odvolaním sa na nasledujúce príklady.
-19Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje spôsob výroby plazmidu RSF24P odvodeného od RSF1010, ktorý obsahuje dapA*24.
Obrázok 2 znázorňuje spôsob výroby plazmidu RSFD80 obsahujúceho dapA*24 a /ysC*80.
Obrázok 3 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCAB1 obsahujúceho dapA*24, lysC*80 a dapB.
Obrázok 4 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCABD2 obsahujúceho dapA*24, lysC*8Q, dapB a ddh.
Obrázok 5 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCABDEI obsahujúceho dapA*24, lysC*80, dapB, dapD a dapE.
Obrázok 6 znázorňuje štruktúru plazmidu pppc obsahujúceho ppc.
Obrázok 7 znázorňuje štruktúru plazmidu pasd obsahujúceho asd.
Obrázok 8 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pMW::THY obsahujúceho pntAB (pntA a pntB).
Obrázok 9 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pMW118::aspA obsahujúceho aspA.
Obrázok 10 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu ppcd obsahujúceho ppc a asd.
Obrázok 11 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pPTS obsahujúceho ppc a pntAB.
Obrázok 12 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPW obsahujúceho ppc a aspA.
Obrázok 13 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pPTd obsahujúceho ppc, pntAB a asd.
Obrázok 14 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPT obsahujúceho ppc, pntAB a aspA.
Obrázok 15 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPTK obsahujúceho ppc, pntAB a aspA.
Obrázok 16 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pSd obsahujúceho asd.
-20Obrázok 17 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pKD obsahujúceho ppc, pntAB, aspA a asd.
Obrázok 18 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pUTES obsahujúceho tefm
Obrázok 19 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pUEBL3 obsahujúceho tefr° a dapA odvodené od Brevibacterium lactofermentum po prúde od tefro.
Obrázok 20 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pCABD(B) obsahujúceho dapA odvodené od Brevibacterium lactofermentum (Brev. dapA), lysC, dapB a ddh.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 <1> Príprava Escherichia baktérií s rôznymi vlastnosťami
Nižšie uvedené plazmidy boli zavedené do E. co//'W3110 (tyrA).
| Názov plazmidu | obsiahnutý gén |
| RSF24P | dapA* |
| RSFD80 | dapA*, lysC* |
| pCAB1 | dapA*, lysC*, dapB |
| pCABD2 | dapA*, lysC*, dapB, ddh |
| pCABD (B) | Brev. dapA*, lysC*, dapB, ddh |
| pCABDEI | dapA*, lysC*, dapB, dapD, dapE |
Skratky použité pre gény majú nasledujúce významy: ppc: fosfoenolpyruvát karboxyláza lysC: aspartokináza III lysC*: aspartokináza III necitlivá voči inhibícii asd: aspartát-semialdehyd dehydrogenáza dapA: dihydrodipikolinát syntéza dapA*: dihydrodipikolinát syntéza necitlivá voči inhibícii
-21 Brev. dapA: dihydrodipikolinát syntáza necitlivá voči inhibícii (odvodená od
Brevibacterium lactofermentum) dapB: dihydrodipikolinát reduktáza dapD; tetrahydrodipikolinát sukcinyláza dapE: sukcinyldiaminopimelát deacyláza ddh: diaminopimelát dehydrogenáza (odvodená od Brevibacterium lactofermentum)
Plazmidy RSF24P, RSFD80, pCAB1, pCABD2 a pCABDEI sú opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042. V medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 sú opísané aj ich konštrukcie, ktoré sú stručne vysvetlené nižšie.
(1)RSF24P
Na základe známej dapA nukleotidovej sekvencie E. coli (J. Bacteriol., 166, 297 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval fragment obsahujúci SD sekvenciu a otvorený čítací rámec (ORF) dapA. Amplifikovaný fragment sa ligoval do klonovacieho vektora pCRIOOO, čím sa získal plazmid pdapA2, v ktorom bol dapA ligovaný tak, že smer transkripcie dapA bol opačný ako smer transkripcie lacZ promótorom v pCRIOOO. Plazmid pdapA2 sa podrobil procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu a pdapA2 podrobený procesu mutagenézy sa zaviedol do E. coli W3110. Z transformantov sa vybrali tie, ktoré vykazovali AEC rezistenciu. Okrem toho sa meral stupeň L-lyzínovej inhibície DDPS kódovanej plazmidom neseným vybranými rezistentnými kmeňmi, a vyselektoval sa kmeň, ktorý nebol citlivý na inhibíciu L-lyzínom. Plazmid pdapA24, pri ktorom sa sekvenovaním potvrdilo, že obsahuje zmenu 587th C na T, sa ligoval do pVIC40 v polohe po prúde od promótora génu tetracyklínovej rezistencie, čim sa získal RSF24P (obrázok 1).
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol RSF24P sa označil ako AJ 12395 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonsko) 28. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13935. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 1. novembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4858.
-22(2) RSFD80
Na základe známej lysC nukleotidovej sekvencie E. coli (J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval fragment obsahujúci SD sekvenciu a ORF lysC. Amplifikovaný fragment sa ligoval do multikópiového vektora pUC18, čím sa získal plazmid pLYSCI, v ktorom bol lysC ligovaný tak, aby bol smer transkripcie lysC opačný ako smer transkripcie lacZ promótorom v pUC18. Plazmid pLYSCI sa podrobil procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu a pLYSCI, ktorý sa podrobil procesu mutagenézy, sa zaviedol do E. coli GT3. Z transformantov sa vyselektovali tie, ktoré vykazovali AEC rezistenciu a L-lyzínovú rezistenciu. Ďalej sa pLYSCI zaviedol do E. coli MC1061, potom sa bunky podrobili procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu, a tie, ktoré vykazovali AEC rezistenciu a L-lyzínovú rezistencie, sa vyselektovali. Ďalej sa meral stupeň inhibície L-lyzínom a tepelná stabilita AK kódovanej plazmidmi nachádzajúcimi sa vo vybraných rezistentných kmeňoch a vyselektoval sa kmeň, ktorý bol necitlivý voči inhibícii L-lyzínom a vykazoval vynikajúcu stabilitu. Plazmid pLYSCI*80, v ktorom sa sekvenovaním potvrdila zmena 352. C na T, sa ligoval do pHSG399 v polohe po prúde od lacZ promótora, čím sa získal pLLC*80. Z pLLC*80 a RSF24P sa RSFD80 skonštruoval tak, ako je znázornené na obrázku 2.
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol RSFD80 sa označil ako AJ12396 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 28. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13936. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 1. novembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4859.
(3) pCAB1
Na základe známej dapB nukleotidovej sekvencie (Bouvier, J. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)), sa prostredníctvom PCR amplifikoval dapB z chromozomálnej DNA kmeňa E. co//W3110. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Asel a Dral a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do
-23Smal miesta pMW119, čím sa získal plazmid pdapB. Následne sa dapB zaviedol do RSFD80, ako je znázornené na obrázku 3, čím sa získal pCAB1.
(4) pCABD2
Na základe známej ddh nukleotidovej sekvencie Corynebačteríum glutamicum (Ishino, S. a ďalší, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval ddh z chromozomálnej DNA kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC13869. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s EcoT22l a Aval a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMW119, čím sa získal plazmid pddh. Následne sa ddh zaviedol do pCAB1, ako je znázornené na obrázku 4, čím sa získal pCABD2.
(5) pCABDEI
Na základe známej dapD nukleotidovej sekvencie (Richaud, C. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)), sa prostredníctvom PCR amplifikoval dapD z chromozomálnej DNA kmeňa E. coli\N2>11Q. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Eco0109l a Sad a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMW118, čím sa získal plazmid pdapD. Ďalej sa na základe známej dapE nukleotidovej sekvencie (Bouvier, J. a ďalší, J. Biol. Chem., 174, 5265 (1992)) prostredníctvom PCR amplifikoval dapE z chromozomálnej DNA kmeňa E. coli W3110. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Munl a Bglll a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMW118, čím sa získal plazmid pdapE. Ďalej sa dapE vystrihol z pdapE a začlenil sa do pdapD, čím sa získal plazmid pMWdapDEI obsahujúci tak dapE, ako aj dapD. Ako je znázornené na obrázku 5, fragment obsahujúci dapE a dapD sa vystrihol z pMWdapDEI a začlenil sa do pCAB1, čím sa získal pCABDEI.
Plazmid pCABD(B) sa skonštruoval nasledovne.
Najprv sa DNA fragment obsahujúci promótorové miesto génu Tet rezistencie amplifikoval z pBR322 použitím primerov s nasledujúcimi sekvenciami:
5' - TCAAGAATTCTCATGTTTGA - 3’ (sekv. č. 1)
5' - GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC - 3' (sekv. č. 2)
-24Amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Kpnl a EcoRI a začlenil sa medzi Kpnl a EcoRI štiepne miesta pUC18, čím sa získal pUTES (obrázok 18).
Potom sa amplifikoval Brev. dapA gén použitím primerov s nižšie uvedenými sekvenciami a chromozomálnej DNA kmeňa Brevibacterium lactofermentum Ysr ako templátu.
5’ - GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG - 3' (sekv. č. 3)
5' - TGGAACCTCTGTTGCTGCAG - 3' (sekv. č. 4)
Amplifikovaný Brev. dapA gén sa poštiepil s Kpnl a BamHI a začlenil sa medzi Kpnl a BamHI štiepne miesta pUTES, čím sa získal pUEBL3 (obrázok 19).
Potom sa pUEBL3 poštiepil s EcoRI a Xbal a oba jeho konce sa zatupili, čím sa získal fragment obsahujúci Brev. dapA. Potom sa pCABD2 uvedený v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Nhel a Spel a oba jeho konce sa zatupili. Izoloval sa fragment obsahujúci lysC, dapB a ddh a do neho sa potom začlenil predtým získaný fragment obsahujúci Brev. dapA, čím sa získal pCABD(B) (obrázok 20).
Hoci E. coli W3110 (tyrA) je podrobne opísaný v európskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 488424, nižšie bude stručne vysvetlený spôsob jeho prípravy. E. coli W3110 kmeň sa získal z National Inštitúte of Genetics (Shizuoka-ken, Mishima-shi). Tento kmeň sa inokuloval na LB platne obsahujúce streptomycín a vyselektoval sa kmeň, ktorý tvoril kolónie, čím sa získal streptomycín rezistentný kmeň. Vyselektovaný streptomycín rezistentný kmeň a kmeň E. coli K-12 ME8424 sa zmiešali a kultivovali sa v kompletnom médiu (L-médium: 1% Bacto tryptón, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl) ako stacionárna kultúra pri 37 °C 15 minút, aby sa indukovala konjugácia. E. coli K-12 ME8524 má genetické vlastnosti HfrPO45, thi, relA1, tyrA::Tn10, ung-1 a nadB a je možné ho získať od National Inštitúte of Genetics.
Potom sa kultúrou inokulovalo kompletné médium (L-médium: 1% Bacto tryptón, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 1,5% agar) obsahujúce streptomycín, tetracyklín a L-tyrozín a vyselektoval sa kmeň tvoriaci kolónie. Tento kmeň sa označil ako E. coli W3110 (tyrA) kmeň.
V európskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 488424 sú opísané mnohé kmene vytvorené zavedením plazmidu do W3110 (tyrA) kmeňa. Napríklad kmeň
-25získaný zavedením plazmidu pHATerm bol označený ako E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm kmeň (E. coli AJ12662 kmeň) a bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 16. novembra 1991 ako medzinárodný depozit a obdržal prístupové číslo FERM BP-3653. W3110 (tyrA) kmeň je možné získať aj elimináciou plazmidu pHATerm z tohto E. coli W311% (tyrA)/pHATerm kmeňa. Eliminácia plazmidu sa môže uskutočniť obvyklým spôsobom.
<2> Zavedenie aspartát-semialdehyd dehydrogenázového génu (asd), fosfoenolpyruvát karboxylázového génu (ppc) alebo aspartázového génu (aspA) a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Ako plazmid obsahujúci asd a ako plazmid obsahujúci ppc sa použili plazmidy pasd a pppc opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Konštrukcie týchto plazmidov sú podrobne opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Ich hlavné črty sú uvedené nižšie.
(1) pasd
Plazmid pasd sa získal z plazmidu pAD20 (Haziza, C. a ďalší, EMBO, 1, 379 (1982), ktorý obsahuje tento gén. Plazmid pAD20 sa poštiepil s Asel a Clal, jeho konce sa zatupili a začlenil sa do Smal miesta pMW118, čím sa získal plazmid pasd (obrázok 8).
(2) pppc
Plazmid pppc sa získal z plazmidu pT2, ktorý obsahuje daný gén. Plazmid pT2 sa poštiepil so Smal a Seal, konce sa zatupili a začlenil sa do Smal miesta pMW118, čím sa získal plazmid pppc (obrázok 9). E. coli F15 kmeň (AJ12873) obsahujúci pT2 sa uložil v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 15. júla 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13752.
-26Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. júla 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4732.
Plazmid obsahujúci aspA sa skonštruoval nasledovne.
AspA gén E. coli sa amplifikoval použitím primerov s nasledujúcimi sekvenciami:
5' - TGATCAGCGAAACACTTTTA - 3' (sekv. č. 5)
5' - CAGCAAACTATGATGAGAA - 3’ (sekv. č. 6)
Potom sa získaný amplifikovaný fragment začlenil do Smal štiepneho miesta pMW118 (Nippon Gene), čím sa získal pMW118::aspA (obrázok 9).
Každý z plazmidov pMW118 (kontrolný plazmid), pasd, pppc a pMW118::aspA (komparatívny plazmid) sa zaviedol do E. coli W3110 (tyrA) a transformanty sa získali ako je opísané v bode <1>. Získané transformanty, s výnimkou tých, ktoré boli získané zavedením pMW118, pasd, pppc alebo pMW118::aspA do E. coli W3110 (tyrA), obsahovali dva druhy plazmidov, tzn. jeden z pMW118, pasd, pppc alebo pMW118::aspA a jeden z RSF24P, RSFD80, pCAB1, pCABD2, pCABD(B) a pCABDEI. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska produktivity L-lyzínu spôsobom opísaným v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Konkrétny postup bol nasledovný.
Bunky sa kultivovali v 20 ml média s nižšie uvedeným zložením, ktoré sa
| nachádzalo v 500ml Sakaguchi fľaši, pri 37 °C 30 hodín, s miešaním 114 až 116 ot./min. | |
| Zloženie média | |
| glukóza | 40 g/l |
| MgSO4.7H2O | 1 g/l |
| (NH4)2SO4 | 16 g/l |
| kh2po4 | 1 g/l |
| FeSO4.7H2O | 0,01 g/l |
| MnSO4.5H2O | 0,01 g/l |
| kvasinkový extrakt (Difco) | 2 g/l |
| L-tyrozín | 0,1 g/l |
-27Nastavené na pH 7,0 s KOH a autoklávované pri 115 °C 10 minút (glukóza a MgSO4.7H2O sa sterilizovali zvlášť).
CaCO3 25 g/l (podľa japonskej Pharmakopoei sterilizovaný suchým teplom pri 180 °C 2 hodiny)
Antibiotiká (20 mg/l streptomycínu, 50 mg/l ampicilínu alebo 25 mg/l kanamycínu v závislosti na druhu plazmidu, ktorý sa má zaviesť).
L-lyzín sa v kultivačnom médiu (médiu po kultivácii) kvantifikoval použitím Biotech Analyzer-a AS210 vyrábaného firmou Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. V tabuľke je množstvo L-lyzínu uvádzané v mg na dl média.
Tabuľka 1
| Lys akumulácia (mg/dl) | ||||
| pMW118 | pasd | pppc | pMW118::aspA | |
| - | 40 | 50 | 60 | 60 |
| RSF24P | 350 | 340 | 360 | 350 |
| RSFD80 | 960 | 790 | 990 | 960 |
| pCAB1 | 1120 | 1140 | 1150 | 1130 |
| pCABD2 | 1230 | 1320 | 1380 | 1240 |
| pCABD(B) | 1230 | 1320 | 1370 | n.d. |
| pCABDEI | 1210 | 1310 | 1350 | n.d. |
n.d.: nestanovené
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 1, keď sa každý samostatne zosilnili asd alebo ppc, alebo keď sa zosilnili spolu s dapA (RSF24P), dapA + lysC (RSFD80) alebo spolu s dapA + lysC + dapB (pCAB1) v E. coli, produkované množstvo L-lyzínu (akumulované množstvo) sa nezmenilo, alebo sa zmenilo len mierne, a v prípade asd mohlo byť znížené v porovnaní s prípadom, keď asd alebo ppc neboli zosilnené (-180 až 20 mg/dl pre asd, 10 až 30 mg/dl pre ppc). Naopak, ak boli zosilnené spolu s dapA + lysC + dapB + ddh (pCABD2) alebo spolu s dapA ; lysC + dapB + dapD + dapE (pCABDEI), pozorovalo sa značné zvýšenie produko-28vaného množstva L-lyzínu v porovnaní s prípadom, kedy nebol zosilnený asd alebo ppc (70 mg/dl pre asd, 90 mg/dl pre ppc). Avšak, keď bol aspA zosilnený spolu s dapA + lysC + dapB + ddh (pCABD2) nebolo pozorované žiadne významné zvýšenie produkovaného množstva L-lyzínu. Okrem toho, ak aj bol použitý dapA odvodený od Brevibacterium lactofermentum namiesto dapA odvodeného od Escherichia coli (pCABD(B)), pozoroval sa rovnaký účinok ako v prípade, keď bol použitý dapA odvodený od Escherichia coli (pCABD2). Takže za dôležitý nie je považovaný pôvod génov, ale ich kombinácia.
Príklad 2 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc) a aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd), transhydrogenázový gén (pntAB) alebo aspartázový gén (aspA)
Plazmid obsahujúci ppc a asd, plazmid obsahujúci ppc a pntAB a plazmid obsahujúci ppc a aspA sa skonštruovali nasledovne.
(1) Plazmid obsahujúci ppc a asd (ppcd)
Plazmid pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 sa poštiepil s Kpnl a Sphl a oba konce DNA fragmentu obsahujúceho asd sa zatupili. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Xbal a zatupili sa oba jeho konce a začlenil sa do neho predtým získaný asd fragment, čím sa získal ppcd (obrázok 10).
(2) Plazmid obsahujúci ppc a pntAB (pPTS)
Plazmid pMW::THY opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985 sa poštiepil so Smal a Hindlll a izoloval sa DNA fragment obsahujúci pntAB. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Xbal, oba jeho konce sa zatupili, ďalej sa štiepil s Hindlll a do štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný pntAB fragment, čím sa získal pPTS (obrázok 11).
-29Konštrukcia plazmidu pMW::THY je podrobne opísaná v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985. Načrtnutá bude nižšie.
Na základe známych pntA a pntB nukleotidových sekvencií E. coli (D.M. Čiarke a ďalší, Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval fragment obsahujúci oba gény vrátane oblastí s promótorovou aktivitou. Amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s BamHI a Hindlll a získaný DNA fragment sa ligoval do plazmidového vektora pMW118 (Nippon Gene) poštiepeného s BamHI a Hindlll, čím sa získal pMW::THY (obrázok 8).
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol pMW118::THY sa označil ako AJ 12929 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 4. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13890. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 14. septembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP4798.
(3) Plazmid obsahujúci ppc a aspA (pAPW)
Plazmid pMW118::aspA, opísaný vo vyššie uvedenom príklade 1, sa poštiepil so Sad, zatupili sa oba jeho konce a ďalej sa štiepil s Hindlll, čím sa získal DNA fragment obsahujúci aspA. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Xbal, oba jeho konce sa zatupili a ďalej sa štiepil s Hindlll a do Hindlll štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný aspA fragment, čím sa získal pAPW (obrázok 12).
<2> Začlenenie dvoch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu obsahujúceho pCABD2, ktorý sa získal vo vyššie uvedenom príklade 1, sa zaviedol každý z pppc (referenčný plazmid), ppcd, pPTS a pAPW (komparatívny plazmid). Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, tzn. jeden z pppc, ppcd, pPTS a pAPW, a pCABD2. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
-30Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
| Lys akumulácia (mg/dl) | |
| pCABD2 + pppc | 1380 |
| pCABD2 + ppcd | 1460 |
| pCABD2 + pPTS | 1450 |
| pCABD2 + pAPW | 1390 |
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 2, keď sa zosilnil asd alebo pntAB spolu s dapA + lysC + dapB + ddh + ppc (ppcd alebo pPTS), pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu (80 mg/dl pre asd, 70 mg/dl pre pntAB). Avšak čo sa týka aspA, nepozorovalo sa žiadne významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu, aj keď bol aspA zosilnený, spolu s dapA + lysC + dapB + ddh + ppc (pAPW).
Príklad 3 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc), transhydrogenázový gén (pntAB) a aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd) alebo aspartázový gén (aspA)
Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a asd gény a plazmid obsahujúci ppc, pntAB a aspA sa skonštruovali nasledovne.
(1) Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a asd (pPTd)
Plazmid pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č.
WO 95/16042 sa poštiepil s Kpnl a Sphl a oba konce DNA fragmentu obsahujúceho asd sa zatupili. Potom sa pPTS, opísaný vyššie v príklade 2, poštiepil s Hindlll, jeho konce sa zatupili, a do Hindlll štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný asd fragment, čím sa získal pPTd (obrázok 13).
-31 (2) Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a aspA (pAPT)
Plazmid pMW::THY opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu
č. WO 95/11985 sa poštiepil so Smal a Hindlll, čim sa získal DNA fragment obsahujúci pntAB. Potom sa pAPW opísaný v príklade 2 poštiepil s Xbal, oba jeho konce sa zatupili a ďalej sa štiepil s Hindlll. Predtým získaný fragment obsahujúci pntAB sa zaviedol do Hindlll štiepneho miesta, čím sa získal pAPT (obrázok 14).
<2> Začlenenie troch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu obsahujúceho pCABD2, ktorý sa získal vo vyššie uvedenom príklade 1, sa zaviedol pPTS (referenčný plazmid), pPTd alebo pAPT. Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, tzn. jeden z pPTS, pPTd a pAPT, a pCABD2. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
| Lys akumulácia (mg/dl) | |
| pCABD2 + pPTS | 1450 |
| pCABD2 + pPTd | 1510 |
| pCABD2 + pAPT | 1500 |
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 3, keď sa zosilnil asd alebo aspA spolu s dapA + lysC + dapB + ddh + ppc + pntAB (pPTd alebo pAPT), pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu (60 mg/dl pre asd, 50 mg/dl pre aspA).
Príklad 4 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc), transhydrogenázový gén (pntAB), aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd) a aspartázový gén (aspA)
-32Plazmid obsahujúci ppc, pntAB, asd a aspA sa skonštruoval nasledovne.
Plazmid pAPT opísaný vyššie, v príklade 3, sa poštiepil s Hindlll, oba jeho konce sa zatupili, a d’alej sa štiepil so Smal, čím sa získal DNA fragment obsahujúci ppc, aspA a pntAB. Potom sa pMW218 (Nippon Gene) poštiepil s EcoRI a oba jeho konce sa zatupili a do EcoRI štiepneho miesta so zatupenými koncami sa začlenil predtým získaný DNA fragment obsahujúci ppc, aspA a pntAB, čím sa získal pAPTK (obrázok 15).
Potom sa pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Kpnl, oba jeho konce sa zatupili, a ďalej sa štiepil s BamHI, čím sa získal DNA fragment obsahujúci asd. Potom sa pSTV29 poštiepil s Pstl, oba jeho konce sa zatupili a do BamHI štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný asd fragment, čím vznikol pSd (obrázok 16).
<2> Začlenenie štyroch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu, do ktorého bol zavedený pCABD2, pCABD(B) alebo pCABDEI, ktorý sa získal vo vyššie uvedenom príklade 1, sa zaviedol pAPT (referenčný plazmid 1), pAPTK (referenčný plazmid 2) alebo pAKD. Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, tzn. jeden z pAPT, pAPTK a pKD, a jeden z pCABD2, pCABD(B) a pCABDEI. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
| Lys akumulácia (mg/dl) | |
| pCABD2 + pAPT | 1500 |
| pCABD2 + pAPTK | 1500 |
| pCABD2 + pKD | 1600 |
| pCABD(B) + pKD | 1590 |
| pCABDEI + pKD | 1580 |
-33Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 4, keď sa zosilnil asd spolu s dapA + lysC + dapB + ddh + ppc + pntAB + aspA, pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu. Podobný výsledok sa získal, keď sa namiesto pCABD2 použil pCABD(B) alebo pCABDEI.
Plazmid pAPTK uvedený v tabuľke 4 zodpovedá plazmidu pAPT, ktorého gén liečivovej rezistencie voči ampicilínu bol nahradený génom rezistencie voči kanamycínu (pretože vektor sa zmenil z pMW118 na pMW218). Keďže pKD bol pripravený začlenením asd do pAPTK, pAPTK sa považoval za vhodnejšiu kontrolu pre pKD ako pAPT. Preto sú uvedené aj údaje pre pAPTK. Potvrdilo sa, že na množstvo produkovaného L-lyzínu nemá vplyv ani to, keď sa zmení gén liečivovej rezistencie.
Priemyselná využiteľnosť
Predložený vynález poskytuje Escherichia baktérie s vysokou produktivitou L-lyzínu a použitím týchto baktérií je možné získať L-lyzín s vysokým výťažkom.
Claims (10)
1. Baktéria Escherichia, v ktorej (1) sú zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a v ktorej (2) je zosilnená vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je v nej zosilnená vnútrobunkové aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy.
2. Baktéria Escherichia, v ktorej (1) sú zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a v ktorej (2) je zosilnená vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je v nej zosilnená vnútrobunkové aktivita fosfoenolpyruvát karboxylázy a vnútrobunkové aktivita nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy.
3. Baktéria Escherichia, v ktorej (1) sú zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a v ktorej (2) je zosilnená vnútrobunkové aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom sú v nej zosilnené vnútrobunkové aktivity fosfoenolpyruvát karboxylázy a nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy a vnútrobunkové aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo aspartázy.
4. Baktéria podľa nároku 3, v ktorej sú zosilnené vnútrobunkové aktivity aspartát-semialdehyd dehydrogenázy a aspartázy.
5. Baktéria podľa nároku 3 alebo 4, v ktorej je aspartokináza, dihydrodipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartát-semialdehyd dehydrogenáza odvodené od Escherichia baktérie, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenáza
-38a aspartáza, ak sú prítomné, tak každá z nich je odvodená od Escherichia baktérie, dihydrodipikolinát syntáza je odvodená od Escherichia baktérie alebo Brevibacterium baktérie a diaminopimelát dehydrogenáza je odvodená od Brevibacterium baktérie.
6. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorej je zosilnená vnútrobunková aktivita enzýmu, ktorého vnútrobunková aktivita je zosilnená, prostredníctvom zavedenia plazmidu obsahujúceho gén enzýmu.
7. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorej je zosilnená vnútrobunková aktivita enzýmu, ktorého vnútrobunková aktivita je zosilnená, prostredníctvom zvýšenia počtu kópií génu enzýmu na chromozóme.
8. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorej je zosilnená vnútrobunková aktivita enzýmu, ktorého vnútrobunková aktivita je zosilnená, prostredníctvom modifikácie promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme.
9. Baktéria podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, ktorej vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy a aspartokinázy sú zosilnené tým, že nesie dihydrodipikolinát syntézu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená zavedením diaminopimelát dehydrogenázového génu.
10. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu baktérie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 v médiu vhodnom na produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre a izoláciu L-lyzínu z kultúry.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2000/000298 WO2001053459A1 (fr) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Procede de production de l-lysine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10542002A3 true SK10542002A3 (sk) | 2002-11-06 |
| SK287800B6 SK287800B6 (sk) | 2011-10-04 |
Family
ID=11735597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1054-2002A SK287800B6 (sk) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | Spôsob výroby L-lyzínu |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7723081B1 (sk) |
| EP (1) | EP1253195B1 (sk) |
| JP (1) | JP4207426B2 (sk) |
| KR (1) | KR100704517B1 (sk) |
| CN (1) | CN100577794C (sk) |
| AT (1) | ATE411378T1 (sk) |
| AU (1) | AU2000230762A1 (sk) |
| BR (1) | BRPI0016995B1 (sk) |
| DE (1) | DE60040559D1 (sk) |
| DK (1) | DK1253195T3 (sk) |
| ES (1) | ES2313878T3 (sk) |
| HU (1) | HU229834B1 (sk) |
| MX (1) | MXPA02007154A (sk) |
| SK (1) | SK287800B6 (sk) |
| WO (1) | WO2001053459A1 (sk) |
Families Citing this family (80)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2331956T3 (es) * | 2004-01-30 | 2010-01-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos. |
| CN103088080B (zh) | 2004-10-07 | 2016-02-17 | 味之素株式会社 | 生产碱性物质的方法 |
| KR100768748B1 (ko) | 2004-12-30 | 2007-10-19 | 씨제이 주식회사 | 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법 |
| JP2007185184A (ja) | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007086618A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
| JP2009095237A (ja) | 2006-02-02 | 2009-05-07 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009089603A (ja) | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2004803A2 (en) | 2006-03-23 | 2008-12-24 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna |
| JP2009060791A (ja) * | 2006-03-30 | 2009-03-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2021458A1 (en) | 2006-05-23 | 2009-02-11 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family |
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| KR100837842B1 (ko) * | 2006-08-10 | 2008-06-13 | 씨제이제일제당 (주) | 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이증가된 ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌 생산 방법 |
| US9109242B2 (en) * | 2006-09-15 | 2015-08-18 | Cj Cheiljedang Corporation | Corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same |
| JP2010017081A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2008072761A2 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an l-amino acid |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| RU2006145712A (ru) | 2006-12-22 | 2008-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина |
| EP2116595B1 (en) | 2007-01-22 | 2017-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2395579C2 (ru) | 2007-12-21 | 2010-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| EP2192170B1 (en) | 2007-09-04 | 2017-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid |
| JP2010263790A (ja) | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| CN102348806A (zh) | 2008-01-23 | 2012-02-08 | 味之素株式会社 | L-氨基酸的生产方法 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| EP2302066A4 (en) * | 2008-07-09 | 2012-02-08 | Ajinomoto Kk | METHOD FOR PRODUCING AMINOHYDROXYBENZOIC ACID |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2382320B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration |
| US8623619B2 (en) | 2009-02-09 | 2014-01-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acid |
| JP5521347B2 (ja) | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2460883A4 (en) | 2009-07-29 | 2013-01-16 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| JP2012196144A (ja) | 2009-08-03 | 2012-10-18 | Ajinomoto Co Inc | ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| US8283152B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-10-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| RU2010101135A (ru) | 2010-01-15 | 2011-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2471870C2 (ru) | 2010-06-03 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA |
| RU2010122646A (ru) | 2010-06-03 | 2011-12-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| CN102234667B (zh) * | 2011-06-08 | 2012-08-15 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 赖氨酸的三级发酵制备 |
| DE102011118019A1 (de) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Evonik Degussa Gmbh | Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens |
| WO2013062029A1 (ja) | 2011-10-25 | 2013-05-02 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| JP2015013812A (ja) | 2011-11-01 | 2015-01-22 | 味の素株式会社 | 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法 |
| EP2748340B1 (en) | 2011-11-02 | 2016-06-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for secretory production of proteins |
| WO2013065772A1 (ja) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | タンパク質の分泌生産法 |
| CN108486082A (zh) | 2012-10-18 | 2018-09-04 | 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 | 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用 |
| CN103215286B (zh) * | 2012-11-12 | 2015-11-25 | 江南大学 | 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用 |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| EP2868745B1 (en) | 2013-05-13 | 2017-06-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for manufacturing an L-amino acid |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| WO2015060314A1 (ja) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| EP3420096A1 (en) | 2016-02-25 | 2019-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| KR102011994B1 (ko) | 2017-06-30 | 2019-08-20 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법 |
| KR102308042B1 (ko) * | 2017-07-28 | 2021-09-30 | 엘지디스플레이 주식회사 | 표시장치 |
| CN110964682B (zh) * | 2018-09-30 | 2021-09-03 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| WO2020138178A1 (en) | 2018-12-27 | 2020-07-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing basic l-amino acids or salts thereof by fermentation of an enterobacteriaceae bacterium |
| BR112021014194A2 (pt) | 2019-02-22 | 2021-12-28 | Ajinomoto Kk | Método para a produção de um l-aminoácido |
| JP2022526181A (ja) | 2019-04-05 | 2022-05-23 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造方法 |
| CN110079566B (zh) * | 2019-05-16 | 2020-08-04 | 黑龙江伊品生物科技有限公司 | 用改变ppc启动子的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法 |
| CN110195087B (zh) * | 2019-05-16 | 2020-12-01 | 黑龙江伊品生物科技有限公司 | 用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法 |
| JP2022550084A (ja) | 2019-09-25 | 2022-11-30 | 味の素株式会社 | 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法 |
| KR102126951B1 (ko) * | 2019-09-26 | 2020-06-26 | 씨제이제일제당 주식회사 | 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법 |
| WO2023222510A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
| WO2023222505A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
| WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5618596A (en) | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
| DE3737729A1 (de) | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Degussa | Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen |
| DE3823451C2 (de) | 1988-07-11 | 1997-02-20 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen |
| CZ289051B6 (cs) | 1993-08-24 | 2001-10-17 | Ajinomoto Co. Inc. | Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny |
| US5830716A (en) | 1993-10-28 | 1998-11-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Increased amounts of substances by modifying a microorganism to increase production of NADPH from NADH |
| JPH07155184A (ja) | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| SK283478B6 (sk) | 1994-12-09 | 2003-08-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Gén, ktorý kóduje lyzínovú dekarboxylázu, mikroorganizmus a spôsob výroby L-lyzínu |
| JP4088982B2 (ja) | 1996-10-15 | 2008-05-21 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE19931317A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
| RU2175351C2 (ru) | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
| US20030049804A1 (en) * | 1999-06-25 | 2003-03-13 | Markus Pompejus | Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins |
| US6927046B1 (en) * | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| JP4380029B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 微生物を利用した物質の製造法 |
| JP4265093B2 (ja) * | 2000-08-11 | 2009-05-20 | 味の素株式会社 | スレオニン及びイソロイシンの製造法 |
| DE60234247D1 (de) | 2001-03-30 | 2009-12-17 | Ajinomoto Kk | Verfahren zur sekretion und produktion von protein |
| JP2002330763A (ja) | 2001-05-02 | 2002-11-19 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| AU2003205041A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by fermentation |
| BR0304860A (pt) * | 2002-11-11 | 2004-08-31 | Ajinomoto Kk | Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia |
| DK1602722T3 (da) * | 2003-03-07 | 2011-05-16 | Ajinomoto Kk | Fremgangsmåde til fremstilling af mikrobiel transglutaminase |
| WO2005010175A1 (en) | 2003-07-29 | 2005-02-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-lysine or l-threonine using escherichia bacteria having attnuated malic enzyme activity |
| WO2005103278A1 (ja) | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Ajinomoto Co., Inc. | タンパク質の製造法 |
| JP4595506B2 (ja) | 2004-11-25 | 2010-12-08 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法 |
-
2000
- 2000-01-21 MX MXPA02007154A patent/MXPA02007154A/es active IP Right Grant
- 2000-01-21 KR KR1020027009333A patent/KR100704517B1/ko active IP Right Grant
- 2000-01-21 AT AT00900872T patent/ATE411378T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-01-21 EP EP00900872A patent/EP1253195B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 CN CN00818456A patent/CN100577794C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 JP JP2001553920A patent/JP4207426B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 BR BRPI0016995A patent/BRPI0016995B1/pt active IP Right Grant
- 2000-01-21 AU AU2000230762A patent/AU2000230762A1/en not_active Abandoned
- 2000-01-21 US US10/149,450 patent/US7723081B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-21 WO PCT/JP2000/000298 patent/WO2001053459A1/ja active IP Right Grant
- 2000-01-21 DK DK00900872T patent/DK1253195T3/da active
- 2000-01-21 ES ES00900872T patent/ES2313878T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-21 SK SK1054-2002A patent/SK287800B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-21 HU HU0204295A patent/HU229834B1/hu unknown
- 2000-01-21 DE DE60040559T patent/DE60040559D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-03-11 US US12/721,813 patent/US8062869B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0204295A2 (hu) | 2003-03-28 |
| US20100173368A1 (en) | 2010-07-08 |
| HU229834B1 (en) | 2014-09-29 |
| DK1253195T3 (da) | 2009-01-12 |
| HUP0204295A3 (en) | 2005-09-28 |
| BR0016995A (pt) | 2002-10-29 |
| KR20020065932A (ko) | 2002-08-14 |
| ES2313878T3 (es) | 2009-03-16 |
| EP1253195B1 (en) | 2008-10-15 |
| MXPA02007154A (es) | 2004-09-06 |
| ATE411378T1 (de) | 2008-10-15 |
| US8062869B2 (en) | 2011-11-22 |
| BRPI0016995B1 (pt) | 2016-03-08 |
| SK287800B6 (sk) | 2011-10-04 |
| KR100704517B1 (ko) | 2007-04-10 |
| DE60040559D1 (de) | 2008-11-27 |
| AU2000230762A1 (en) | 2001-07-31 |
| JP4207426B2 (ja) | 2009-01-14 |
| EP1253195A4 (en) | 2004-08-04 |
| CN1423691A (zh) | 2003-06-11 |
| CN100577794C (zh) | 2010-01-06 |
| EP1253195A1 (en) | 2002-10-30 |
| US7723081B1 (en) | 2010-05-25 |
| WO2001053459A1 (fr) | 2001-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7723081B1 (en) | Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same | |
| EP1477565B1 (en) | Method of producing L-lysine by fermentation | |
| US7186531B2 (en) | L-threonine producing bacterium belonging to the genus Escherichia and method for producing L-threonine | |
| RU2197528C2 (ru) | Способ получения l-лизина (варианты) и рекомбинантная днк, используемая для его осуществления (варианты) | |
| CA2214498C (en) | Process for producing l-amino acid through fermentation | |
| KR101208480B1 (ko) | 말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는ｌ-라이신 또는 ｌ-트레오닌의 생산방법 | |
| US7439038B2 (en) | Method for producing L-amino acid using methylotroph | |
| US9051591B2 (en) | Bacterium of enterobacteriaceae family producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites and a method for producing L-aspartic acid or L-aspartic acid-derived metabolites | |
| PL186081B1 (pl) | Metoda wytwarzania L-lizyny | |
| SK287403B6 (sk) | Baktéria patriaca do rodu Escherichia a spôsob výroby L-treonínu alebo L-izoleucínu | |
| EP2089528B1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the genus escherichia with attenuated expression of any of the cynt, cyns, cynx or cynr genes or a combination thereof | |
| EP0834559B1 (en) | Process for producing l-lysine by fermentation | |
| US8017363B2 (en) | Method for production of L-lysine using methanol-utilizing bacterium | |
| EP1486570A1 (en) | Method for producing L-amino acid | |
| CA2549298C (en) | L-threonine producing bacterium belonging to the genus escherichia and method for producing l-threonine | |
| CN101824392B (zh) | 生产l-赖氨酸的方法 | |
| ZA200204973B (en) | Process for producing L-Lysine. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20130121 |