SK287800B6 - Spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents

Spôsob výroby L-lyzínu Download PDF

Info

Publication number
SK287800B6
SK287800B6 SK1054-2002A SK10542002A SK287800B6 SK 287800 B6 SK287800 B6 SK 287800B6 SK 10542002 A SK10542002 A SK 10542002A SK 287800 B6 SK287800 B6 SK 287800B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mutation
lysine
enhanced
gene
plasmid
Prior art date
Application number
SK1054-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK10542002A3 (sk
Inventor
Kazuo Nakanishi
Yoshimi Kikuchi
Junichiro Kojima
Tomoko Suzuki
Yasushi Nishimura
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK10542002A3 publication Critical patent/SK10542002A3/sk
Publication of SK287800B6 publication Critical patent/SK287800B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Spôsob výroby L-lyzínu zahŕňajúci kultiváciu Escherichia coli vo vhodnom médiu na produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre a izoláciu L-lyzínu z kultúry.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka mikrobiologického priemyslu. Konkrétnejšie, predložený vynález sa týka spôsobu výroby L-lyzínu fermentáciou a mikroorganizmu používaného pri tomto produkčnom spôsobe.
Doterajší stav techniky
Obvykle sa pri produkcii L-lyzínu fermentáciou používali kmene izolované z prírody alebo ich umelé mutanty, aby sa zlepšila produktivita. Známe sú mnohé umelé mutantné kmene, ktoré produkujú L-lyzín, a mnohé z nich sú 5-2-amino-etylcysteín (AEC) rezistentné kmene a patria do rodov Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus alebo Escherichia. Okrem toho boli opísané rôzne techniky na zvýšenie aminokyselinovej produkcie, napríklad použitím transformantu získaného prostredníctvom rekombinantnej DNA.
Čo sa týka Escherichia baktérií, tak napríklad vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške (Kokai) č. 56-18596, US patente č. 4346170 a v Applied Microbiology and Biotechnology, 15, str. 227-331 (1982) boli opísané spôsoby výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená aktivita dihydrodipikolinát syntetázy (DDPS). Okrem toho bol spôsob výroby L-lyzínu použitím Escherichia baktérie, do ktorej sa zaviedla DDPS derivovaná forma Corynebacterium baktérie, opísaný v kórejskom zverejnenom patente č. 92-8382. Okrem toho je v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, ktorý sa transformoval plazmidom obsahujúcim DNA, ktorá kóduje dihydrodipikolinát syntázu odvodenú z Escherichia baktérie majúcej mutáciu znecitlivujúcu inhibičnú spätnú väzbu L-lyzínom, DNA, ktorá kóduje aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, DNA, ktorá kóduje dihydrodipikolinát reduktázu, a DNA, ktorá kóduje diaminopimelát dehydrogenázu odvodenú od koryneformnej baktérie.
Čo sa týka Brevibacterium baktérií, medzinárodná zverejnená prihláška vynálezu č. WO 95/11985 opisuje, že je možné zlepšiť produktivitu L-lyzínu zosilnením aktivity vnútrobunkovej nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy. Okrem toho je vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 60-87788 opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená iba aktivita fosfoenol-pyruvát karboxylázy a v japonskej prihláške vynálezu (Kokoku) č. 6-102028 je opísaný spôsob výroby L-lyzínu použitím kmeňa, v ktorom je zosilnená iba aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy.
Pri priemyselnej výrobe aminokyselín fermentáciou sa výroba uskutočňuje vo veľkom meradle. Preto môže zlepšenie výťažku aj len o niekoľko percent poskytnúť významnú priemyselnú hodnotu, takže je želateľné zlepšenie výťažku bez ohľadu na stupeň zlepšenia.
Cieľom predloženého vynálezu je poskytnutie zlepšeného spôsobu výroby L-lyzínu fermentáciou v porovnaní s obvyklými spôsobmi.
Pôvodcovia predloženého vynálezu vytrvalo skúmali, aby dosiahli uvedený cieľ. Výsledkom bolo zistenie, že ak sa zosilní aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy v Escherichia baktérii majúcej špecifikovanú vlastnosť, a ak sa v takejto Escherichia baktérii zosilní aktivita alebo aktivity špecifického enzýmu, alebo enzýmov okrem uvedených enzýmov, je možné zlepšiť produktivitu L-lyzínu baktériou, a na základe týchto zistení zostavili predložený vynález.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je Escherichia baktéria, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je zosilnená vnútrobunková aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy.
Ďalej vynález poskytuje Escherichia baktériu, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom je zosilnená vnútrobunková aktivita fosfoenol-pyruvát karboxylázy a vnútrobunková aktivita nikotínamid adenindinukleotid transhydrogenázy alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy; a ďalej vynález poskytuje Escherichia baktériu, v ktorej sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, pričom sú zosilnené vnútrobunkové aktivity fosfoenol-pyruvát karboxylázy a nikotínamid adenindinukleotid transhydrogenázy a vnútrobunková aktivita aspartát-semialdehyd dehydro2 genázy alebo aspartázy (neskôr sa baktéria podľa uvedených troch predmetov kolektívne označuje ako „baktéria podľa predloženého vynálezu“).
Je výhodné, aby boli v baktérii podľa predloženého vynálezu zosilnené vnútrobunkové aktivity aspartátsemialdehyd dehydrogenázy a aspartázy.
Okrem toho je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu bola aspartokináza, dihydrodipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartát-semialdehyd dehydrogenáza odvodené od Escherichia baktérie, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenáza a aspartáza, ak sú prítomné, tak každá z nich od Escherichia baktérie, dihydrodipikolinát syntáza od Escherichia baktérie alebo Brevibacterium baktérie a diaminopimelát dehydrogenáza od Brevibacterium baktérie.
Je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu bola vnútrobunková aktivita enzýmu, ktorého vnútrobunková aktivita je zosilnená prostredníctvom jedného z nasledujúcich spôsobov alebo prostredníctvom ich kombinácie.
(1) Začlenením plazmidu obsahujúceho gén enzýmu.
(2) Zvýšením počtu kópií génu enzýmu na chromozóme.
(3) Modifikáciou promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme.
Okrem toho je výhodné, aby v baktérii podľa predloženého vynálezu boli vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy a aspartokinázy zosilnené tým, že obsahujú dihydrodipikolinát syntázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínomje znecitlivená, a vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená prostredníctvom zavedenia diaminopimelát dehydrogenázového génu.
Predložený vynález poskytuje aj spôsob výroby L-lyzínu, ktorý zahŕňa kultivovanie ktorejkoľvek baktérie podľa predloženého vynálezu vo vhodnom médiu, aby sa produkoval a akumuloval L-lyzín v kultúre, a izolovanie L-lyzínu z kultúry (tu označovaný aj ako „produkčný spôsob podľa predloženého vynálezu“).
Najlepší spôsob na uskutočňovanie vynálezu <1> Baktérie podľa predloženého vynálezu
Baktériami podľa predloženého vynálezu sú Escherichia baktérie, v ktorých sú (1) zosilnené vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy, a (2) v ktorých je zosilnená vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy, a navyše sú zosilnené vnútrobunkové aktivity nasledujúcich enzýmov:
(1) aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy, (2) fosfoenolpyruvát karboxylázy a nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy (tu označovaná aj ako „transhydrogenáza“) alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy, alebo (3) fosfoenolpyruvát karboxylázy a transhydrogenázy a aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo aspartáZy' · ,
Baktériami podľa predloženého vynálezu sú výhodne Escherichia baktérie, v ktorých sú navyše zosilnené vnútrobunkové aktivity fosfoenolpyruvát karboxylázy, transhydrogenázy, aspartát-semialdehyd dehydrogenázy a aspartázy.
Baktérie podľa predloženého vynálezu patria výhodne k Escherichia coli (E. coli).
V tomto opise znamená výraz „vnútrobunková aktivita je zosilnená“ to, že vnútrobunková enzymatická aktivita je zvýšená v porovnaní s divým kmeňom (napríklad E. coli W3110 kmeňom) alebo v porovnaní s rodičovským kmeňom (kmeň, v ktorom nie je zosilnená aktivita žiadneho z enzýmov zahrnutých v kombináciách špecifikovaných v predloženom vynáleze) a znamená aj to, že baktéria má enzymatickú aktivitu, ktorú nemá divý kmeň alebo rodičovský kmeň. Spôsoby merania aktivít uvedených enzýmov sú známe a priemerný odborník v oblasti môže jednoducho potvrdiť zosilnenie vnútrobunkových aktivít.
Prostriedky na zosilnenie vnútrobunkových aktivít zahŕňajú nasledujúce prostriedky a ich kombinácie, ale nie sú nimi obmedzené.
Ako prvý je možné uviesť prostriedok na zvýšenie exprimovaného množstva enzýmov.
Konkrétne, ako prostriedky na zvýšenie exprimovaného množstva enzýmov je možné uviesť nasledujúce prostriedky:
(1) Zavedenie plazmidu obsahujúceho gén enzýmu
Ako plazmid sa môže použiť vektor autonómne replikovateľný v Escherichia bakteriálnej bunke. Zaviesť sa môže známym spôsobom. To znamená, že gén, o ktorý je záujem, sa môže začleniť do vektora a týmto vektorom sa môže transformovať Escherichia baktéria. Týmto vektorom je výhodne multi-kópiový typ plazmidu.
Gény môžu byť nesené rovnakým plazmidom alebo rozličnými plazmidmi. Niektoré z génov môžu byť nesené rovnakým plazmidom. Ak sa použijú dva alebo viacero druhov plazmidov, je výhodné použiť plazmidy, ktoré majú stabilné rozdeľovacie systémy umožňujúce stabilnú koexistenciu týchto plazmidov v bunke. Poradie zavádzania génov nie je nijako výnimočne obmedzené.
(2) Zvyšovanie počtu kópií génu enzýmu na chromozóme
Počet kópií sa môže zvyšovať amplifikáciou DNA na chromozomálnej DNA použitím Mu fága alebo podobne.
DNA na chromozomálnej DNA môže byť pôvodne vlastnená Escherichia baktériou alebo to môže byť DNA začlenená do chromozómu hostiteľského mikroorganizmu spôsobom použitím transdukcie, transpozónu (Berg, D. E. a Berg C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), Mu fága (zverejnená japonská patentová prihláška č. 2-109985) alebo homologickej rekombinácie (Experiments in Molecular Genetics and Cold Sprin Harbor Lab. (1972)).
(3) Modifikácia promótorovej sekvencie génu enzýmu
Promótorová sekvencia sa môže modifikovať, aby sa zvýšilo transkripčné množstvo génu, a aby sa tým zvýšilo exprimované množstvo. Napríklad sa môže zosilniť promótor zavedením mutácie do promótora, aby sa zvýšilo transkripčné množstvo génu umiestneného po prúde od promótora. Okrem zavedenia mutácie do promótora sa môže novo zaviesť promótor, ktorý funguje v Escherichia baktériách, ako napríklad lac, trp, tac, trc a PL. Alternatívne sa môže zvýšiť transkripčné množstvo génu novo zavedeným zosilňovačom. Hoci promótorovou sekvenciou môže byť sekvencia génu enzýmu na chromozóme alebo sekvencia génu enzýmu na plazmide, výhodne je to sekvencia génu enzýmu na chromozóme. Zavádzanie génov do chromozomálnej DNA je opísané napríklad vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 1-215280.
Pôvod génov pre uvedené enzýmy nie je nijako zvlášť obmedzený a použité môžu byť gény získané z rôznych zdrojov, pokiaľ sa môžu exprimovať v Escherichia baktériách, a pokiaľ v nich môžu fungovať genetické produkty.
Ďalej tu budú uvedené príklady na získanie génov L-lyzínového bio-syntetického systému a transhydrogenázového génu z E. coli a dihydrodipikolinát syntázového a diaminopimelát dehydrogenázového génu z Brevibacterium lactofermentum.
Fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc) sa môže získať z plazmidu pS2 (Sabe, H. a ďalší, Gene, 31, 279 (1984)) alebo pT2, ktoré obsahujú tento gén. DNA fragment obsahujúci ppc sa môže získať poštiepením pS2 s AatlI a AflII. Okrem toho sa DNA fragment obsahujúci ppc môže získať aj poštiepením pT2 so Smal a Seal. E. coli F15 kmeň obsahujúci pT2 (AJ12873) sa uložil v National Inštitúte of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 15. júla
1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13752. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. júla 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4732.
Aspartokinázový gén (lysC) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie lysC (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., a Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1062 (1986) (napríklad primérov uvedených v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, sekv. č. 5 a 6).
Aspartát-semialdehydový dehydrogenázový gén (asd) sa môže získať z plazmidu pAD20 (Haziza, C. a ďalší, EMBO, 1, 379 (1982)) obsahujúceho tento gén. Ak sa pAD20 poštiepi s Asel a Clal, získa sa DNA fragment obsahujúci asd.
Dihydrodipikolinát syntázový gén (dapA) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 1 a 2 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapA (Richaud, F. a ďalší, J. Bacteriol, 297 (1986)).
Dihydrodipikolinát reduktázový gén (dapB) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 9 a 10 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapB (Bouvier, J. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)).
Tetrahydrodipikolinát sukcinylázový gén (dapD) sa môže získať amplifikáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 15 a 16 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapD (Richaud, C. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)).
Sukcinyldiaminopimelát deacylázový gén (dapE) sa môže získať amplifíkáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 17 a 18 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapE (Bouvier, J. a ďalší, J. Bacteriol, 174, 5265 (1992)).
Aspartázový gén (aspA) sa môže získať amplifíkáciou prostredníctvom PCR použitím E. coli chromozomálnej DNA ako templátu a dvoch druhov oligo-nukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 5 a 6 uvedenými v Zozname sekvencii predloženého opisu) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie aspA (Woods, S. A. a ďalší, Biochem. J., 237 (2), 547-557 (1986)).
Transhydrogenázový gén (pntAB) sa môže pripraviť na základe známej nukleotidovej sekvencie transhydrogenázového génu (D.M. Čiarke a ďalší, Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)). V E. coli sa transhydrogenáza skladá z dvoch podjednotiek, ktoré sú kódované spntA, respektívepntB (D. M. Čiarke a ďalší). Preto sa pripravujú oba gény (pozri napríklad medzinárodnú zverejnenú prihlášku vynálezu č. WO 95/11985).
Môže sa získať aj z plazmidu obsahujúceho pntAB. Ako plazmid obsahujúci pntAB môže byť spomenutý plazmid pMW::THY uvedený v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985. Tento plazmid je rekombinantným plazmidom získaným ligáciou 3,0kb DNA fragmentu E. coli K-12 MC1061 kmeňa, ktorý obsahuje pntA a pntB, a BamHI a HindlII fragmentu plazmidového vektora pMWl 18. Escherichia coli JM109 kmeň obsahujúci pMW::THY bol označený ako AJ 12929 kmeň a bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-0046, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 4. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13890. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. septembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4798.
Dihydrodipikolinát syntázový gén (dapA j Brevibacterium lactofermentum sa môže získať amplifíkáciou prostredníctvom PCR použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 3 a 4 uvedenými v Zozname sekvencii predloženého opisu) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie dapA (Bonassie, S. a ďalší, N.A.R., 18(21), 6421 (1990)).
Dihydrodipikolinát dehydrogenázový gén (ddh) Brevibacterium lacto-fermentum sa môže získať ampliflkáciou prostredníctvom PCR použitím chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ako templátu a dvoch druhov oligonukleotidových primérov (napríklad primérov so sekv. č. 11 a 12 uvedenými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042) pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie ddh Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a ďalší, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)).
Ako prostriedok na zosilnenie vnútrobunkových aktivít môže byť uvedený aj prostriedok na zosilnenie špecifických aktivít enzýmov. Tento prostriedok môže byť kombinovaný s prostriedkom na zvýšenie exprimovaných množstiev enzýmov.
Ako prostriedok na zvýšenie špecifických aktivít enzýmov môže byť uvedené aj zavedenie enzýmu s mutáciou zvyšujúcou špecifickú aktivitu, vrátane enzýmu, ktorého spätná inhibičná väzba je znecitlivená, ak takýto enzým dostáva spätnú inhibičnú väzbu, a tak ďalej.
Príklady enzýmov, ktorých spätná inhibičná väzba je znecitlivená, zahŕňajú dihydrodipikolinát syntázu (DDPS), ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu (AK), ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená.
Výraz „spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená“ znamená, že postačuje podstatné znecitlivenie inhibície a nie je potrebné, aby bola inhibícia úplne znecitlivená. Okrem toho sú medzi enzýmy, ktorých spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, zahrnuté aj enzýmy odvodené od iného organizmu ako Escherichia baktérií bez ohľadu na to, či ide o divý typ alebo mutantný typ enzýmu organizmu, ak je stupeň spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom nižší ako stupeň divého typu enzýmu odvodeného od Escherichia baktérie. Takže je zahrnutý aj enzým, ktorý pôvodne nemá spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ako napríklad DDPS odvodený od Brevibacterium baktérií.
Stupeň spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom môže byť hodnotený známymi metódami, ako napríklad metódami opísanými v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, v príkladoch 1 a 2.
Ako DDPS, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená (znecitlivená DDPS) a ako AK, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená (znecitlivená AK), je možné uviesť enzýmy opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 a vo zverejnenej japonskej patentovej prihláške č. 10-113183.
Príklady znecitlivených DDPS zahŕňajú teda DDPS s mutáciou znecitlivujúcou spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ktorá je pri divom type DDPS. Ako divý typ DDPS môžu byť uvedené DDPS odvodené od Escherichia baktérií, najmä DDPS odvodená od E. coli. Príklady mutácie, ktorá znecitlivuje spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom pri DDPS, zahŕňajú:
(1) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci alanínovému zvyšku v polohe 81 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne valínovým zvyškom), (2) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci histidínovému zvyšku v polohe 118 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom), a (3) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci alanínovému zvyšku v polohe 81 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne valínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci histidínovému zvyšku v polohe 118 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom) v DDPS aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. č. 4 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa počítajú od N-konca DDPS. Je dobre známe, že medzi druhmi alebo kmeňmi sa môže vyskytnúť odlišnosť v aminokyselinovej sekvencii, ktorá neovplyvňuje aktivitu, a pre priemerného odborníka v oblasti je jednoduché určiť aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci uvedeným špecifickým aminokyselinovým zvyškom.
Iné príklady znecitlivenej DDPS zahŕňajú DDPS odvodenú od koryneformných baktérií, napríklad Brevibacterium lactofermentum (Cremer J. a ďalší, J. Gen. Microbiol., 134, 3221-3229 (1988)).
Aby bola znecitlivená DDPS obsahom Escherichia baktérií, môže sa napríklad vniesť DNA kódujúca znecitlivenú DDPS.
Príklady DNA kódujúcej znecitlivenú DDPS zahŕňajú DNA zodpovedajúce DNA kódujúcej divý typ DDPS, ktorá má mutáciu na znecitlivenie spätnej inhibičnej väzby L-lyzínom kódovanej DDPS.
Ďalej tu bude vysvetlený spôsob na získanie DNA kódujúcej znecitlivenú DDPS (znecitlivený DDPS gén) prostredníctvom príkladu DDPS odvodenej od Escherichia baktérií. Čo sa týka DDPS iných organizmov, DNA sa môže získať podobne. Okrem toho, ak je divým typom DDPS odvodenej od iného organizmu znecitlivená DDPS, môže sa použiť jej kódujúca DNA nezmenená.
DNA kódujúca divý typ DDPS nie je nijako výnimočne obmedzená, pokiaľ kóduje DDPS odvodenú od Escherichia baktérie. Konkrétne môže byť uvedená DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu opísanú v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, ako sekv. č. 4. Konkrétnejšie môže byť uvedená sekvencia reprezentovaná nukleotidovými číslami 272-1147 v rámci nukleotidovej sekvencie označenej ako sekv. č. 3 v rovnakom dokumente. Z týchto sekvencii je jedna, majúca mutáciu nukleotidovej sekvencie spôsobujúcu nahradenie uvedených aminokyselinových zvyškov, DNA kódujúcou znecitlivenú DDPS. Okrem toho, typ kodónu zodpovedajúceho nahradenému aminokyselinovému zvyšku nie je nijako výnimočne obmedzený, pokiaľ kóduje daný aminokyselinový zvyšok. Navyše sa tiež očakáva mierna odchýlka v aminokyselinovej sekvencii obsiahnutej v DDPS medzi bakteriálnymi druhmi a kmeňmi. Ale sekvencie, ktoré majú takúto odchýlku spôsobujúcu nahradenie, deléciu alebo inzerciu aminokyselinových zvyškov v polohách, ktoré neovplyvňujú aktivitu enzýmu, spadajú do rozsahu znecitliveného DDPS génu.
Takýto znecitlivený DDPS gén je možné získať napríklad nasledovne. Najprv sa DNA obsahujúca divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén s mutáciou podrobí in vitro mutačnému procesu a DNA, ktorá prešla mutačným procesom, sa liguje s vektorovou DNA kompatibilnou s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant, ktorý začne exprimovať znecitlivenú DDPS, sa vyselektuje spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant nesie znecitlivený DDPS gén. Alternatívne sa môžu ligovať DNA obsahujúca divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén majúci mutáciu a vektorová DNA kompatibilná s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Potom sa táto rekombinantná DNA môže podrobiť in vitro mutačnému procesu a zaviesť do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant, ktorý začne exprimovať znecitlivenú DDPS, sa vyselektuje spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant tiež nesie znecitlivený DDPS gén.
Okrem toho sa môže mikroorganizmus, ktorý produkuje divý typ DDPS, podrobiť mutačnému procesu, čím sa pripraví mutantný kmeň, ktorý produkuje znecitlivenú DDPS, a potom sa z tohto mutantného kmeňa môže získať znecitlivený DDPS gén. Alternatívne, ak sa mutačnému procesu podrobí transformant, do ktorého bola zavedená rekombinantná DNA ligovaná s divým typom génu, aby sa pripravil mutantný kmeň produkujúci znecitlivenú DDPS, a potom sa rekombinantná DNA izoluje z mutantného kmeňa, vytvorí sa znecitlivený DDPS gén z tejto DNA.
Príklady činidiel na in vitro DNA mutačný proces zahŕňajú hydroxylamín a tak ďalej. Hydroxylamín je chemické mutačné činidlo, ktoré spôsobuje nahradenie cytozínu tymínom prostredníctvom zmeny cytozínu na N4-hydroxycytozín. Keď sa mutačnému procesu podrobuje samotný mikroorganizmus, tento proces sa uskutočňuje ultrafialovým žiarením alebo mutagenizačným činidlom zvyčajne používaným na umelé mutácie, ako napríklad N-metyl-Y'-nitro-N-nitrozoguanidínom (NTG) alebo kyselinou dusitou.
Ako baktéria, poskytujúca DNA obsahujúcu divý typ DDPS génu alebo iný DDPS gén obsahujúci mutáciu, sa môže použiť ktorýkoľvek z mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia. Konkrétne sa môžu použiť mikroorganizmy uvedené v literatúre od Neidhardta a ďalších (Neidhardt, F.C. a ďalší, Escherichia coli a Salmonella typhimurium, American Socienty for Microbiology, Washington D.S., 1208, tabuľka 1). Spo6 menutý môže byť napríklad E. coli JM109 kmeň a MC 1061 kmeň. Keď sa ako donor DNA obsahujúcej DDPS gén použije divý kmeň, je možné získať DNA obsahujúcu divý typ DDPS génu.
Príklady znecitlivenej AK zahŕňajú AK, ktoré majú mutáciu znecitlivujúcu spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ktorá je prítomná pri divom type AK. Ako AK divého typu môžu byť spomenuté AK odvodené od Escherichia baktérií, najmä aspartokináza III (AKIII) odvodená od E. coli. Príklady mutácií, ktoré znecitlivujú spätnú inhibičnú väzbu AKIII L-lyzínom, zahŕňajú:
(a) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (b) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 408 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (c) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci arginínovému zvyšku v polohe 34 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne cysteínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), (d) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci leucínovému zvyšku v polohe 325 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne fenylalanínovým zvyškom), (e) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), (f) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci valínovému zvyšku v polohe 349 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne metionínovým zvyškom), (g) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci serínovému zvyšku v polohe 345 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne leucínovým zvyškom), (h) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci valínovému zvyšku v polohe 347 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne metionínovým zvyškom), (i) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci treonínovému zvyšku v polohe 352 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), (j) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci treonínovému zvyšku v polohe 352 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci serínovému zvyšku v polohe 369 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne fenylalanínovým zvyškom), (k) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci zvyšku kyseliny glutámovej v polohe 164 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne lyzínovým zvyškom), a (l) mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 417 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom), a mutáciu, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci cysteínovému zvyšku v polohe 419 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne tyrozínovým zvyškom), v AKIII aminokyselinovej sekvencii uvedenej ako sekv. č. 8 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa počítajú od N-konca AKIII. Okrem toho môže byť spomenutá mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne izoleucínovým zvyškom) (zverejnená japonská patentová prihláška č. 10-113183). Je dobre známe, že medzi druhmi alebo kmeňmi sa môže vyskytnúť odlišnosť v aminokyselinovej sekvencii, ktorá neovplyvňuje aktivitu, a pre priemerného odborníka v oblasti je jednoduché určiť aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci uvedeným špecifickým amino-kyselinovým zvyškom.
Iné príklady znecitlivenej AK zahŕňajú mutantný typ AK odvodený od koryneformných baktérií (zverejnená japonská patentová prihláška č. 6-62866).
Na to, aby Escherichia baktérie obsahovali znecitlivenú AK, sa môže do týchto Escherichia baktérií napríklad zaviesť DNA, ktorá kóduje znecitlivenú AK.
Príklady DNA kódujúcej znecitlivenú AK zahŕňajú tie, ktoré zodpovedajú DNA kódujúcej divý typ AK s mutáciou znecitlivujúcou spätnú inhibičnú väzbu kódovanej AK L-lyzínom.
Ďalej tu bude vysvetlený spôsob na získanie DNA kódujúcej znecitlivenú AK prostredníctvom príkladu AKIII odvodenej od Escherichia baktérií. Čo sa týka AK iných organizmov, DNA sa môže získať podobne. Okrem toho, ak je divým typom AK odvodenej od iného organizmu znecitlivená AK, môže sa použiť jej kódujúca DNA nezmenená.
DNA kódujúca divý typ AKIII nie je nijako výnimočne obmedzená. Uvedená môže byť napríklad DNA kódujúca AKIII odvodená od Escherichia baktérie, konkrétne od E. coli. Konkrétne môže byť uvedená DNA kódujúca aminokyselinovú sekvenciu opísanú v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, ako sekv. č. 8 a sekvencia reprezentovaná nukleotidovými číslami 584-1930 v rámci nukleotidovej sekvencie označenej ako sekv. č. 7 v rovnakom dokumente. AKIII E. coli je kódovaná lysC génom.
Z týchto sekvencii je jedna, majúca mutáciu nukleotidovej sekvencie spôsobujúcu nahradenie uvedených aminokyselinových zvyškov, DNA kódujúcou znecitlivenú AK. Okrem toho, typ kodónu zodpovedajúceho nahradenému aminokyselinovému zvyšku nie je nijako výnimočne obmedzený, pokiaľ kóduje daný aminokyselinový zvyšok. Navyše sa tiež očakáva mierna odchýlka v aminokyselinovej sekvencii obsiahnutej v AKIII medzi bakteriálnymi druhmi a kmeňmi. Ale sekvencie, ktoré majú takúto odchýlku spôsobujúcu nahradenie, deléciu alebo inzerciu aminokyselinových zvyškov v polohách, ktoré neovplyvňujú aktivitu enzýmu, spadajú do rozsahu mutantného AK génu. Napríklad nukleotidová sekvencia divého typu lysC génu získaná v uvedenom príklade 2 (medzinárodná zverejnená prihláška vynálezu č. WO 95/16042, sekv. č. 7) má odchýlky v 6 polohách sekvencie v porovnaní s už zverejnenou nukleotidovou sekvenciou lysC E. coli K-12 JC411 kmeňa (Cassan M., Parsot, C., Cohen, G.N. a Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), spomedzi ktorých dve odchýlky kódujú odlišné aminokyselinové zvyšky (lysC JC411 kmeňa poskytuje nahradenie glycínového zvyšku v polohe 58 cysteínovým zvyškom a nahradenie glycínového zvyšku v polohe 401 alanínovým zvyškom v aminokyselinovej sekvencii kódovanej s lysC, ktorá je označená ako sekv. č. 8 v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, pričom polohy sa odčítavajú z jej N-konca). Očakáva sa, že aj lysC s rovnakou sekvenciou ako lysC E. coli K-12 JC411 kmeňa môže poskytnúť lysC s mutáciou, ktorá znecitlivuje spätnú inhibičnú väzbu L-lyzínom, ak sa zavedie ktorákoľvek z uvedených mutácií ako (a) až (1), alebo mutácia, ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci glycínovému zvyšku v polohe 323 iným aminokyselinovým zvyškom (výhodne zvyškom kyseliny asparágovej), a ktorou sa nahrádza aminokyselinový zvyšok zodpovedajúci metionínovému zvyšku v polohe 318 iným aminokyselinovým zvyškom.
Takúto DNA kódujúcu mutantný typ AKIII, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, je možné získať napríklad nasledovne. Najprv sa DNA obsahujúca divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén s mutáciou podrobí in vitro mutačnému procesu a DNA, ktorá prešla mutačným procesom, sa liguje s vektorovou DNA kompatibilnou s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Rekombinantná DNA sa zavedie do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant, ktorý začne exprimovať mutantný typ AKIII, sa môže vyselektovať spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant nesie mutantný typ génu. Alternatívne sa môžu ligovať DNA obsahujúca divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén majúci mutáciu a vektorová DNA kompatibilná s hostiteľom, čím sa pripraví rekombinantná DNA. Potom sa táto rekombinantná DNA môže podrobiť in vitro mutačnému procesu a zaviesť do hostiteľských mikroorganizmov, čím sa získajú transformanty, a transformant ktorý začne exprimovať mutantný typ AKIII, sa môže vyselektovať spomedzi ostatných transformantov. Takýto transformant tiež nesie mutantný typ génu.
Okrem toho sa môže mikroorganizmus, ktorý produkuje divý typ enzýmu, podrobiť mutačnému procesu, čím sa pripraví mutantný kmeň, ktorý produkuje mutantný typ enzýmu, a potom sa z tohto mutantného kmeňa môže získať mutantný typ génu. Príklady činidiel na priame podrobenie DNA mutačnému procesu zahŕňajú hydroxylamín a tak ďalej. Hydroxylamín je chemické mutačné činidlo, ktoré spôsobuje nahradenie cytozínu tymínom prostredníctvom zmeny cytozínu na N4-hydroxycytozín. Keď sa mutačnému procesu podrobuje samotný mikroorganizmus, tento proces sa uskutočňuje ultrafialovým žiarením alebo mutagenizačným činidlom zvyčajne používaným na umelé mutácie, ako napríklad A-metyl-A'-nitro-A-nitrozoguanidínom (NTG).
Ako baktéria poskytujúca DNA obsahujúcu divý typ AKIII génu alebo iný AKIII gén obsahujúci mutáciu sa môže použiť ktorýkoľvek z mikroorganizmov patriacich do rodu Escherichia. Konkrétne sa môžu použiť mikroorganizmy uvedené v literatúre od Neidhardta a ďalších (Neidhardt, F.C. a ďalší, Escherichia coli a Salmonella typhimurium, American Socienty for Microbiology, Washington D.S., 1208, tabuľka 1). Spomenutý môže byť napríklad E. coli JM109 kmeň a MC 1061 kmeň a tak ďalej.
Je výhodné, aby v baktériách podľa predloženého vynálezu bola aspartokináza, dihydrodipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartát-semialdehyd dehydrogenáza odvodené od Escherichia baktérie, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenáza a aspartáza, ak sú prítomné, tak každá z nich od Escherichia baktérie, dihydrodipikolinát syntáza od Escherichia baktérie alebo Brevibacterium baktérie a diaminopimelátdehydrogenáza od Brevibacterium baktérie.
Príklady Brevibacterium baktérií zahŕňajú okrem Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Coryne-bacterium glutamicum, Corynebacterium lilum a tak ďalej.
Okrem toho je výhodné, aby v baktériách podľa predloženého vynálezu boli vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy a aspartokinázy zosilnené zavedením dihydrodipikolinát syntázy, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázy, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aby bola vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy zosilnená zavedením diaminopi8 melát dehydrogenázového génu. Takéto výhodné baktérie podľa predloženého vynálezu je možné získať zavedením plazmidu pCABD2 alebo pCABDEl, ktoré sú uvedené v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042, do Escherichia baktérie.
<2> Produkčný spôsob podľa predloženého vynálezu
L-lyzín je možné účinne produkovať kultivovaním baktérií podľa predloženého vynálezu, ktoré sa získali podľa uvedeného opisu, v médiu vhodnom na produkciu a akumulovanie L-lyzínu v kultúre, a izolovaním Llyzínu z kultúry.
Médiom používaným na kultiváciu baktérií podľa predloženého vynálezu môže byť zvyčajné médium obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a iné organické stopové výživové látky, ak sú potrebné.
Ako zdroj uhlíka je možné použiť sacharidy, ako napríklad glukózu, laktózu, galaktózu, fruktózu a škrobový hydrolyzát; alkoholy, ako napríklad glycerol a sorbitol; alebo organické kyseliny, ako napríklad kyselinu fumarovú, kyselinu citrónovú a kyselinu jantárovú.
Ako zdroj dusíka je možné použiť anorganické amónne soli, ako napríklad síran amónny, chlorid amónny alebo fosforečnan amónny; organický dusík, ako napríklad sójový hydrolyzát; amoniakový plyn; alebo vodný amoniak.
Ako organické stopové výživové látky je výhodné pridávať potrebné látky, ako napríklad vitamín B] a L-izoleucín, kvasinkový extrakt a tak ďalej, vo vhodnom množstve. Okrem týchto sa pridáva malé množstvo fosforečnanu draselného, síranu horečnatého, železitých iónov, mangánových iónov a tak ďalej.
Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v aeróbnych podmienkach 16 až 72 hodín. Kultivačná teplota môže byť kontrolovaná tak, aby dosahovala v priebehu kultivácie 20 °C až 45 °C, a pH môže byť kontrolované tak, aby bolo v priebehu kultivácie v rozsahu 5 až 8. Na nastavenie pH je možné použiť anorganické alebo organické, kyslé alebo alkalické látky, ako aj amoniakový plyn a tak ďalej.
Izolácia L-lyzínu z fermentačnej kvapaliny sa zvyčajne uskutočňuje kombináciou iónovej výmennej živicovej metódy, precipitačnej metódy a iných známych techník.
Predložený vynález bude podrobnejšie vysvetlený s odvolaním sa na nasledujúce príklady.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 znázorňuje spôsob výroby plazmidu RSF24P odvodeného od RSF1010, ktorý obsahuje dapA*24.
Obrázok 2 znázorňuje spôsob výroby plazmidu RSFD80 obsahujúceho dapA*24 a lys C* 80.
Obrázok 3 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCABl obsahujúceho dapA*24, iysC*SQ a dapB.
Obrázok 4 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCABD2 obsahujúceho dapA*24, lysC*80, dapB a ddh. Obrázok 5 znázorňuje spôsob výroby plazmidu pCABDEl obsahujúceho dapA*24, lysC*80, dapB, dapD a dapE.
Obrázok 6 znázorňuje štruktúru plazmidu pppc obsahujúceho ppc.
Obrázok 7 znázorňuje štruktúru plazmidu pasd obsahujúceho asd.
Obrázok 8 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pMW::THY obsahujúceho pntAB (pntA apntB).
Obrázok 9 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pMWl 18::aspA obsahujúceho aspA.
Obrázok 10 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu ppcd obsahujúceho ppc a asd.
Obrázok 11 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pPTS obsahujúceho ppc a pntAB.
Obrázok 12 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPW obsahujúceho ppc a aspA.
Obrázok 13 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pPTd obsahujúceho ppc, pntAB a asd.
Obrázok 14 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPT obsahujúceho ppc, pntAB a aspA.
Obrázok 15 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pAPTK obsahujúceho ppc, pntAB a aspA.
Obrázok 16 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pSd obsahujúceho asd.
Obrázok 17 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pKD obsahujúceho ppc, pntAB, aspA a asd.
Obrázok 18 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pUTES obsahujúceho tefm.
Obrázok 19 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pUEBL3 obsahujúceho /e/pro a dapA odvodené od Brevibacterium lactofermentum po prúde od teEm.
Obrázok 20 znázorňuje spôsob prípravy plazmidu pCABD(B) obsahujúceho dapA odvodené od Brevibacterium lactofermentum (Brev dapA), lysC, dapB a ddh.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1 <1> Príprava Escherichia baktérií s rôznymi vlastnosťami Uvedené plazmidy boli zavedené do E. coli W3110 (tyrA).
Názov plazmidu obsiahnutý gén
RSF24P dapA*
RSFD80 dapA *, lysC* pCABl dapA*, lys C*, dapB pCABD2 dapA * lysC*, dapB, ddh pCABD (B) Brev. dapA *, lysC*, dapB, ddh pCABDEl dapA*, lysC*, dapB, dapD, dapE
Skratky použité pre gény majú nasledujúce významy:
ppc: fosfoenolpyruvát karboxyláza lysC: aspartokináza III lysC*: aspartokináza III necitlivá proti inhibícii asd: aspartát-semialdehyd dehydrogenáza dapA: dihydrodipikolinát syntáza dapA *: dihydrodipikolinát syntáza necitlivá proti inhibícii
Brev. dapA: dihydrodipikolinát syntáza necitlivá proti inhibícii (odvodená od Brevibacterium lactofermentum) dapB: dihydrodipikolinát reduktáza dapD: tetrahydrodipikolinát sukcinyláza dapE: sukcinyldiaminopimelát deacyláza ddh: diaminopimelát dehydrogenáza (odvodená od Brevibacterium lactofermentum)
Plazmidy RSF24P, RSFD80, pCABl, pCABD2 a pCABDEl sú opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042. V medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 sú opísané aj ich konštrukcie, ktoré sú stručne vysvetlené neskôr.
(1)RSF24P
Na základe známej dapA nukleotidovej sekvencie E. coli (J. Bacteriol., 166, 297 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval fragment obsahujúci SD sekvenciu a otvorený čítací rámec (ORF) dapA. Amplifikovaný fragment sa ligoval do klonovacieho vektora pCRIOOO, čím sa získal plazmid pdapA2, v ktorom bol dapA ligovaný tak, že smer transkripcie dapA bol opačný ako smer transkripcie lacZ promótorom v pCRIOOO. Plazmid pdapA2 sa podrobil procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu a pdapA2 podrobený procesu mutagenézy sa zaviedol do E. coli W3110. Z transformantov sa vybrali tie, ktoré mali AEC rezistenciu. Okrem toho sa meral stupeň L-lyzínovej inhibície DDPS kódovanej plazmidom neseným vybranými rezistentnými kmeňmi, a vyselektoval sa kmeň, ktorý nebol citlivý na inhibíciu L-lyzínom. Plazmid pdapA24, pri ktorom sa sekvenovaním potvrdilo, že obsahuje zmenu 587th C na T, sa ligoval do pVIC40 v polohe po prúde od promótora génu tetracyklínovej rezistencie, čím sa získal RSF24P (obrázok 1).
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol RSF24P, sa označil ako AI12395 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japonsko) 28. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13935. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 1. novembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4858.
(2) RSFD80
Na základe známej lysC nukleotidovej sekvencie E. coli (J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval fragment obsahujúci SD sekvenciu a ORF lysC. Amplifíkovaný fragment sa ligoval do multikópiového vektora pUC18, čím sa získal plazmid pLYSCl, v ktorom bol lysC ligovaný tak, aby bol smer transkripcie lysC opačný ako smer transkripcie lacZ promótorom v pUC18. Plazmid pLYSCl sa podrobil procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu a pLYSCl, ktorý sa podrobil procesu mutagenézy, sa zaviedol do E. coli GT3. Z transformantov sa vyselektovali tie, ktoré mali AEC rezistenciu a L-lyzínovú rezistenciu. Ďalej sa pLYSCl zaviedol do E. coli MC1061, potom sa bunky podrobili procesu mutagenézy použitím hydroxylamínu, a tie, ktoré mali AEC rezistenciu a L-lyzínovú rezistencie, sa vyselektovali. Ďalej sa meral stupeň inhibície L-lyzínom a tepelná stabilita AK kódovanej plazmidmi nachádzajúcimi sa vo vybraných rezistentných kmeňoch a vyselektoval sa kmeň, ktorý bol necitlivý proti inhibícii L-lyzínom a mal vy10 nikajúcu stabilitu. Plazmid pLYSCl*80, v ktorom sa sekvenovaním potvrdila zmena 352. C na T, sa ligoval do pHSG399 v polohe po prúde od lacZ promótora, čím sa získal pLLC*80. Z pLLC*80 a RSF24P sa RSFD80 skonštruoval tak, ako je znázornené na obrázku 2.
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol RSFD80, sa označil ako AJ12396 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 28. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13936. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 1. novembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4859.
(3) pCABl
Na základe známej dapB nukleotidovej sekvencie (Bouvier, J. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14829 (1984)), sa prostredníctvom PCR amplifikoval dapB z chromozomálnej DNA kmeňa E. coli Wi 110. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Asel a Dral a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMWl 19, čím sa získal plazmid pdapB. Následne sa dapB zaviedol do RSFD80, ako je znázornené na obrázku 3, čím sa získal pCABl.
(4) pCABD2
Na základe známej ddh nukleotidovej sekvencie Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. a ďalší, Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval ddh z chromozomálnej DNA kmeňa Brevi-bacterium lactofermentum ATCC13869. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s EcoT22I a A val a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMW119, čím sa získal plazmid pddh. Následne sa ddh zaviedol do pCABl, ako je znázornené na obrázku 4, čím sa získal pCABD2.
(5) pCABDEl
Na základe známej dapD nukleotidovej sekvencie (Richaud, C. a ďalší, J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) sa prostredníctvom PCR amplifikoval dapD z chromozomálnej DNA kmeňa E. coli W3110. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s Eco0109I a Sací a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMW118, čím sa získal plazmid pdapD. Ďalej sa na základe známej dapE nukleotidovej sekvencie (Bouvier, J. a ďalší, J. Biol. Chem., 174, 5265 (1992)) prostredníctvom PCR amplifikoval dapE z chromozomálnej DNA kmeňa E. coli W3110. Získaný amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s MunI a BgUI a získanému fragmentu sa zatupili konce a zaviedol sa do Smal miesta pMWl 18, čím sa získal plazmid pdapE. Ďalej sa dapE vystrihol z pdapE a začlenil sa do pdapD, čím sa získal plazmid pMWdapDEl obsahujúci tak dapE, ako aj dapD. Ako je znázornené na obrázku 5, fragment obsahujúci dapE a dapD sa vystrihol z pMWdapDEl a začlenil sa do pCABl, čím sa získal pCABDEl.
Plazmid pCABD(B) sa skonštruoval nasledovne.
Najprv sa DNA fragment obsahujúci promótorové miesto génu Tet rezistencie amplifikoval z pBR322 použitím primérov s nasledujúcimi sekvenciami:
5' - TCAAGAATTCTCATGTTTGA - 3' (sekv. č. 1)
5' - GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC - 3' (sekv. č. 2)
Amplifikovaný DNA fragment sa poštiepil s KpnI a EcoRI a začlenil sa medzi KpnI a EcoRI štiepne miesta pUC18, čím sa získal pUTES (obrázok 18).
Potom sa amplifikoval Brev. dapA gén použitím primérov s nižšie uvedenými sekvenciami a chromozomálnej DNA kmeňa Brevibacterium lactofermentum Ysr ako templátu.
5' - GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG - 3' (sekv. č. 3)
5' - TGGAACCTCTGTTGCTGCAG - 3’ (sekv. č. 4)
Amplifikovaný Brev. dapA gén sa poštiepil s KpnI a BamHI a začlenil sa medzi KpnI a BamHI štiepne miesta pUTES, čím sa získal pUEBL3 (obrázok 19).
Potom sa pUEBL3 poštiepil s EcoRI a Xbal a oba jeho konce sa zatupili, čím sa získal fragment obsahujúci Brev. dapA. Potom sa pCABD2 uvedený v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s NheI a Spel a oba jeho konce sa zatupili. Izoloval sa fragment obsahujúci lysC, dapB a ddh a doň sa potom začlenil predtým získaný fragment obsahujúci Brev. dapA, čím sa získal pCABD(B) (obrázok 20).
Hoci E. coli W3110 (tyrA) je podrobne opísaný v európskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 488424, neskôr bude stručne vysvetlený spôsob jeho prípravy. E. coli W3110 kmeň sa získal z National Inštitúte of Genetics (Shizuoka-ken, Mishima-shi). Tento kmeň sa inokuloval na LB platne obsahujúce streptomycín a vyselektoval sa kmeň, ktorý tvoril kolónie, čím sa získal streptomycín rezistentný kmeň. Vyselektovaný streptomycín rezistentný kmeň a kmeň E. coli K-12 ME8424 sa zmiešali a kultivovali sa v kompletnom médiu (L-médium: 1 % Bacto tryptón, 0,5 % kvasinkový extrakt, 0,5 % NaCl) ako stacionárna kultúra pri 37 °C minút, aby sa indukovala konjugácia. E. coli K-12 ME8524 má genetické vlastnosti HfrPO45, thi, relAl, tyrA::TnlO, ung-1 a nadB a je možné ho získať od National Inštitúte of Genetics.
Potom sa kultúrou inokulovalo kompletné médium (L-médium: 1 % Bacto tryptón, 0,5 % kvasinkový extrakt, 0,5 % NaCl, 1,5 % agar) obsahujúce streptomycín, tetracyklín a L-tyrozín a vyselektoval sa kmeň tvoriaci kolónie. Tento kmeň sa označil ako E. coli W3110 (tyrA) kmeň.
V európskej zverejnenej prihláške vynálezu č. 488424 sú opísané mnohé kmene vytvorené zavedením plazmidu do W3110 (tyrA) kmeňa. Napríklad kmeň získaný zavedením plazmidu pHATerm bol označený ako E. coli W3110 (ŕyrď)/pHATerm kmeň (E. coli AJ 12662 kmeň) a bol uložený v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 16. novembra 1991 ako medzinárodný depozit a obdržal prístupové číslo FERM BP-3653. W3110 (tyrA) kmeň je možné získať aj elimináciou plazmidu pHATerm z tohto E. coli W311% (ŕyrď)/pHATerm kmeňa. Eliminácia plazmidu sa môže uskutočniť obvyklým spôsobom.
<2> Zavedenie aspartát-semialdehyd dehydrogenázového génu (asd), fosfoenol-pyruvát karboxylázového génu (ppc) alebo aspartázového génu (aspA) a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Ako plazmid obsahujúci asd a ako plazmid obsahujúci ppc sa použili plazmidy pasd a pppc opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Konštrukcie týchto plazmidov sú podrobne opísané v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Ich hlavné črty sú uvedené neskôr.
(1) pasd
Plazmid pasd sa získal z plazmidu pAD20 (Haziza, C. a ďalší, EMBO, 1, 379 (1982), ktorý obsahuje tento gén. Plazmid pAD20 sa poštiepil s Asel a Clal, jeho konce sa zatupili a začlenil sa do Smal miesta pMWl 18, čím sa získal plazmid pasd (obrázok 8).
(2) pppc
Plazmid pppc sa získal z plazmidu pT2, ktorý obsahuje daný gén. Plazmid pT2 sa poštiepil so Smal a Seal, konce sa zatupili a začlenil sa do Smal miesta pMWl 18, čím sa získal plazmid pppc (obrázok 9). E. coli F15 kmeň (AJ12873) obsahujúci pT2 sa uložil v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko) 15. júla 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13752. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 11. júla 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4732.
Plazmid obsahujúci aspA sa skonštruoval nasledovne.
AspA gén E. coli sa amplifikoval použitím primérov s nasledujúcimi sekvenciami:
5' - TGATCAGCGAAACACTTTTA - 3' (sekv. č. 5)
5' - CAGCAAACTATGATGAGAA - 3' (sekv. č. 6)
Potom sa získaný amplifikovaný fragment začlenil do Smal štiepneho miesta pMW 118 (Nippon Gene), čím sa získal pMWl 18::aspA (obrázok 9).
Každý z plazmidov pMWl 18 (kontrolný plazmid), pasd, pppc a pMW118::aspA (komparatívny plazmid) sa zaviedol do E. coli W3110 (tyrA) a transformanty sa získali, ako je opísané v bode <1>. Získané transformanty, s výnimkou tých, ktoré boli získané zavedením pMWl 18, pasd, pppc alebo pMWl 18::aspA do E. coli W3110 (tyrA), obsahovali dva druhy plazmidov, t. j. jeden z pMW118, pasd, pppc alebo pMW118::aspA a jeden z RSF24P, RSFD80, pCABl, pCABD2, pCABD(B) a pCABDEl. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska produktivity L-lyzínu spôsobom opísaným v medzinárodnej zverejnenej prihláške č. WO 95/16042. Konkrétny postup bol nasledovný.
Bunky sa kultivovali v 20 ml média s uvedeným zložením, ktoré sa nachádzalo v 500 ml Sakaguchi fľaši, pri 37 °C 30 hodín, s miešaním 114 až 116 ot./min.
Zloženie média glukóza 40 g/1
MgSO4.7H2O 1 g/1 (NH4)2SO4 16 g/1
KH2PO4 1 g/1
FeSO4.7H2O 0,01 g/1
MnSO4.5H2O 0,01 g/1 kvasinkový extrakt (Difco) 2 g/1 L-tyrozín 0,1 g/1
Nastavené na pH 7,0 s KOH a autoklávované pri 115 °C 10 minút (glukóza a MgSO4.7H2O sa sterilizovali zvlášť).
CaCO3 25 g/1 (podľa japonskej Pharmakopoei sterilizovaný suchým teplom pri 180 °C 2 hodiny)
Antibiotiká (20 mg/1 streptomycínu, 50 mg/1 ampicilínu alebo 25 mg/1 kanamycínu v závislosti od druhu plazmidu, ktorý sa má zaviesť).
L-lyzín sa v kultivačnom médiu (médiu po kultivácii) kvantifikoval použitím Biotech Analyzer-a AS210 vyrábaného firmou Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 1. V tabuľke je množstvo L-lyzínu uvádzané v mg na dl média.
Tabuľka 1
Lys akumulácia (mg/dl)
pMW118 pasd PPPC pMW118::aspA
- 40 50 60 60
RSF24P 350 340 360 350
RSFD80 960 790 990 960
pCABl 1120 1140 1150 1130
pCABD2 1230 1320 1380 1240
pCABD(B) 1230 1320 1370 n.d.
pCABDEl 1210 1310 1350 n.d.
n.d.: nestanovené
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 1, keď sa každý samostatne zosilnili asd alebo ppc, alebo keď sa zosilnili spolu s dapA (RSF24P), dapA + lysC (RSFD80) alebo spolu s dapA + lysC + dapB (pCABl) v E. coli, produkované množstvo L-lyzínu (akumulované množstvo) sa nezmenilo, alebo sa zmenilo len mierne, a v prípade asd mohlo byť znížené v porovnaní s prípadom, keď asd alebo ppc neboli zosilnené (-180 až 20 mg/dl pre asd, 10 až 30 mg/dl pre ppc). Naopak, ak boli zosilnené spolu s dapA + lysC + dapB + + ddh (pCABD2) alebo spolu s dapA ; lysC + dapB + dapD + dapE (pCABDEl), pozorovalo sa značné zvýšenie produkovaného množstva L-lyzínu v porovnaní s prípadom, kedy nebol zosilnený asd alebo ppc (70 mg/dl pre asd, 90 mg/dl pre ppc). Ale keď bol aspA zosilnený spolu s dapA + lysC + dapB + ddh (pCABD2), nebolo pozorované žiadne významné zvýšenie produkovaného množstva L-lyzínu. Okrem toho, ak aj bol použitý dapA odvodený od Brevibacterium lactofermentum namiesto dapA odvodeného od Escherichia coli (pCABD(B)), pozoroval sa rovnaký účinok ako v prípade, keď bol použitý dapA odvodený od Escherichia coli (pCABD2). Takže za dôležitý nie je považovaný pôvod génov, ale ich kombinácia.
Príklad 2 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc) a aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd), transhydrogenázový gén (pntAB) alebo aspartázový gén (aspA)
Plazmid obsahujúci ppc a asd, plazmid obsahujúci ppc a pntAB a plazmid obsahujúci ppc a aspA sa skonštruovali nasledovne.
(1) Plazmid obsahujúci ppc a asd (ppcd)
Plazmid pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 sa poštiepil s KpnI a Sphl a oba konce DNA fragmentu obsahujúceho asd sa zatupili. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Xbal a zatupili sa oba jeho konce a začlenil sa doň predtým získaný asd fragment, čím sa získal ppcd (obrázok 10).
(2) Plazmid obsahujúci ppc a pntAB (pPTS)
Plazmid pMW::THY opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985 sa poštiepil so Smal a HindlII a izoloval sa DNA fragment obsahujúci pntAB. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s Xbal, oba jeho konce sa zatupili, ďalej sa štiepil s HindlII a do štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný pntAB fragment, čím sa získal pPTS (obrázok 11).
Konštrukcia plazmidu pMW::THY je podrobne opísaná v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985. Načrtnutá bude neskôr.
Na základe známych pntA a pntB nukleotidových sekvencií E. coli (D.M. Čiarke a ďalší, Eur. J. Biochem., 158, 647-653 (1986)) sa prostredníctvom PCR amplifíkoval fragment obsahujúci oba gény vrátane oblastí s promótorovou aktivitou. Amplifíkovaný DNA fragment sa poštiepil s BamHI a HindlII a získaný DNA fragment sa ligoval do plazmidového vektora pMWl 18 (Nippon Gene) poštiepeného s BamHI a Hindlll, čím sa získal pMW::THY (obrázok 8).
E. coli JM109 kmeň, do ktorého sa zaviedol pMWl 18::THY, sa označil ako AJ12929 a uložil sa v National Inštitúte of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (poštové smerovacie číslo 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japonsko) 4. októbra 1993 a obdržal prístupové číslo FERM P-13890. Potom sa preniesol do medzinárodného depozitu v súlade s ustanoveniami Budapeštianskej dohody 14. septembra 1994 a obdržal poradové číslo FERM BP-4798.
(3) Plazmid obsahujúci ppc a aspA (pAPW)
Plazmid pMWl 18: :aspA, opísaný v uvedenom príklade 1, sa poštiepil so Sací, zatupili sa oba jeho konce a ďalej sa štiepil s HindlII, čím sa získal DNA fragment obsahujúci aspA. Potom sa pppc opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil sXbal, oba jeho konce sa zatupili a ďalej sa štiepil s HindlII a do HindlII štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný aspA fragment, čím sa získal pAPW (obrázok 12).
<2> Začlenenie dvoch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu obsahujúceho pCABD2, ktorý sa získal v uvedenom príklade 1, sa zaviedol každý z pppc (referenčný plazmid), ppcd, pPTS a pAPW (komparatívny plazmid). Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, t. j. jeden z pppc, ppcd, pPTS a pAPW, a pCABD2. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Lys akumulácia (mg/dl)
pCABD2 + pppc 1380
pCABD2 + ppcd 1460
pCABD2 + pPTS 1450
pCABD2 + pAPW 1390
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 2, keď sa zosilnil asd alebo pntAB spolu s dapA + lysC + + dapB + ddh + ppc (ppcd alebo pPTS), pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu (80 mg/dl pre asd, 70 mg/dl pre pntAB). Ale čo sa týka aspA, nepozorovalo sa žiadne významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu, aj keď bol aspA zosilnený, spolu s dapA + lysC + dapB + ddh + + ppc (pAPW).
Príklad 3 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc), transhydrogenázový gén (pntAB) a aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd) alebo aspartázový gén (aspA)
Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a asd gény a plazmid obsahujúci ppc, pntAB a aspA sa skonštruovali nasledovne.
(1) Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a asd (pPTd)
Plazmid pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 sa poštiepil s KpnI a Sphl a oba konce DNA fragmentu obsahujúceho asd sa zatupili. Potom sa pPTS, opísaný v príklade 2, poštiepil s HindlII, jeho konce sa zatupili, a do HindlII štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný asd fragment, čím sa získal pPTd (obrázok 13).
(2) Plazmid obsahujúci ppc, pntAB a aspA (pAPT)
Plazmid pMW::THY opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/11985 sa poštiepil so Smal a HindlII, čím sa získal DNA fragment obsahujúci pntAB. Potom sa pAPW opísaný v príklade 2 poštiepil s Xbal, oba jeho konce sa zatupili a ďalej sa štiepil s HindlII. Predtým získaný fragment obsahujúci pntAB sa zaviedol do HindlII štiepneho miesta, čím sa získal pAPT (obrázok 14).
<2> Začlenenie troch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu obsahujúceho pCABD2, ktorý sa získal v uvedenom príklade 1, sa zaviedol pPTS (referenčný plazmid), pPTd alebo pAPT. Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, t. j. jeden z pPTS, pPTd a pAPT, a pCABD2. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Lys akumulácia (mg/dl)
pCABD2 + pPTS 1450
pCABD2 + pPTd 1510
pCABD2 + pAPT 1500
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 3, keď sa zosilnil asd alebo aspA spolu s dapA + lysC + + dapB + ddh + ppc + pntAB (pPTd alebo pAPT), pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu (60 mg/dl pre asd, 50 mg/dl pre aspA).
Príklad 4 <1> Konštrukcia plazmidov obsahujúcich fosfoenolpyruvát karboxylázový gén (ppc), transhydrogenázový gén (pntAB), aspartát-semialdehyd dehydrogenázový gén (asd) a aspartázový gén (aspA)
Plazmid obsahujúci ppc, pntAB, asd a aspA sa skonštruoval nasledovne.
Plazmid pAPT opísaný, v príklade 3, sa poštiepil s HindlII, oba jeho konce sa zatupili, a ďalej sa štiepil so Smal, čím sa získal DNA fragment obsahujúci ppc, aspA a pntAB. Potom sa pMW218 (Nippon Gene) poštiepil s EcoRI a oba jeho konce sa zatupili a do EcoRI štiepneho miesta so zatupenými koncami sa začlenil predtým získaný DNA fragment obsahujúci ppc, aspA a pntAB, čím sa získal pAPTK (obrázok 15).
Potom sa pasd opísaný v medzinárodnej zverejnenej prihláške vynálezu č. WO 95/16042 poštiepil s KpnI, oba jeho konce sa zatupili, a ďalej sa štiepil s BamHI, čím sa získal DNA fragment obsahujúci asd. Potom sa pSTV29 poštiepil s PstI, oba jeho konce sa zatupili a do BamHI štiepneho miesta sa začlenil predtým získaný asd fragment, čím vznikol pSd (obrázok 16).
<2> Začlenenie štyroch druhov génov a zhodnotenie L-lyzínovej produktivity
Do transformantu, do ktorého bol zavedený pCABD2, pCABD(B) alebo pCABDEl, ktorý sa získal v uvedenom príklade 1, sa zaviedol pAPT (referenčný plazmid 1), pAPTK (referenčný plazmid 2) alebo pAKD. Získané transformanty obsahovali dva druhy plazmidov, t. j. jeden z pAPT, pAPTK a pKD, a jeden z pCABD2, pCABD(B) a pCABDEl. Tieto transformanty sa skúmali z hľadiska L-lyzínovej produktivity rovnakým spôsobom ako v príklade 1 <2>.
Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Lys akumulácia (mg/dl)
pCABD2 + pAPT 1500
pCABD2 + pAPTK 1500
pCABD2 + pKD 1600
pCABD(B) + pKD 1590
pCABDEl +pKD 1580
Ako je zrejmé z výsledkov uvedených v tabuľke 4, keď sa zosilnil asd spolu s dapA + lysC + dapB + + ddh + ppc + pntAB + aspA, pozorovalo sa významné zvýšenie množstva produkovaného L-lyzínu. Podobný výsledok sa získal, keď sa namiesto pCABD2 použil pCABD(B) alebo pCABDEl.
Plazmid pAPTK uvedený v tabuľke 4 zodpovedá plazmidu pAPT, ktorého gén liečivovej rezistencie proti ampicilínu bol nahradený génom rezistencie proti kanamycínu (pretože vektor sa zmenil z pMW118 na pMW218). Keďže pKD bol pripravený začlenením asd do pAPTK, pAPTK sa považoval za vhodnejšiu kontrolu pre pKD ako pAPT. Preto sú uvedené aj údaje pre pAPTK. Potvrdilo sa, že na množstvo produkovaného L-lyzínu nemá vplyv ani to, keď sa zmení gén liečivovej rezistencie.
Priemyselná využiteľnosť
Predložený vynález poskytuje Escherichia baktérie s vysokou produktivitou L-lyzínu a použitím týchto baktérií je možné získať L-lyzín s vysokým výťažkom.
Zoznam sekvencií <110> Ajinomoto Co., Ltd.
<120> Spôsob výroby L-lyzínu <130> B-603MS0P956 <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifíkáciu promótorovej časti tet <400> 1 tcaagaattc tcatgtttga <210>2 <211> 35 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifíkáciu promótorovej časti tet <400> 2 gttagatttg gtacccggtg cctgactgcg ttagc <210>3 <211> 30 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifíkáciu dapA <400> 3 ggttgtggta cccccaaatg agggaagaag <210>4 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifíkáciu dapA <400> 4 tggaacctct gttgctgcag <210> 5 <211>20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifíkáciu aspA <400> 5 tgatcagcga aacactttta <210>6 <211> 19 <212>DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> primér na amplifikáciu aspA <400> 6 cagcaaacta tgatgagaa 19

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu Escherichia coli vo vhodnom médiu na produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre a izoláciu L-lyzínu z kultúry, pričom uvedená Escherichia coli má nasledujúce vlastnosti:
    (1) vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy sú zosilnené, (2) vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená, alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy sú zosilnené, a (3) vnútrobunková aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo fosfoenolpyruvát karboxylázy je zosilnená, a v ktorom každá z vnútrobunkových aktivít je zosilnená prostredníctvom zavedenia plazmidu obsahujúceho gén enzýmu, prostredníctvom zvýšenia počtu kópií génu enzýmu na chromozóme, prostredníctvom modifikácie promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme alebo prostredníctvom ich kombinácie.
  2. 2. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu Escherichia coli vo vhodnom médiu na produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre a izoláciu L-lyzínu z kultúry, pričom uvedená Escherichia coli má nasledujúce vlastnosti:
    (1) vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy sú zosilnené, (2) vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy sú zosilnené, a (3) vnútrobunková aktivita fosfoenolpyruvát karboxylázy je zosilnená, a vnútrobunková aktivita nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy alebo aspartát-semialdehyd dehydrogenázy je zosilnená, a v ktorom každá z vnútrobunkových aktivít je zosilnená prostredníctvom zavedenia plazmidu obsahujúceho gén enzýmu, prostredníctvom zvýšenia počtu kópií génu enzýmu na chromozóme, prostredníctvom modifikácie promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme alebo prostredníctvom ich kombinácie.
  3. 3. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu Escherichia coli vo vhodnom médiu na produkciu a akumuláciu L-lyzínu v kultúre a izoláciu L-lyzínu z kultúry, pričom uvedená Escherichia coli má nasledujúce vlastnosti:
    (1) vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy, aspartokinázy a dihydrodipikolinát reduktázy sú zosilnené, (2) vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená alebo vnútrobunkové aktivity tetrahydrodipikolinát sukcinylázy a sukcinyldiaminopimelát deacylázy sú zosilené, a >
    (3) vnútrobunkové aktivity fosfoenolpyruvát karboxylázy a nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenázy sú zosilnené a vnútrobunková aktivita aspartát-semialdehyd dehydrogenázy alebo aspartázy je zosilnená, a v ktorom každá z vnútrobunkových aktivít je zosilnená prostredníctvom zavedenia plazmidu obsahujúceho gén enzýmu, prostredníctvom zvýšenia počtu kópií génu enzýmu na chromozóme, prostredníctvom modifikácie promótorovej sekvencie génu enzýmu na chromozóme alebo prostredníctvom ich kombinácie.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 3, v ktorom uvedená Escherichia coli má ďalej nasledujúcu vlastnosť: vnútrobunkové aktivity aspartát-semialdehyd dehydrogenázy a aspartázy sú zosilnené.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 3 alebo 4, v ktorom aspartokináza, dihydro-dipikolinát reduktáza, tetrahydrodipikolinát sukcinyláza, sukcinyldiaminopimelát deacyláza, fosfoenolpyruvát karboxyláza a aspartát-semialdehyd dehydrogenáza je každá z nich odvodená od Escherichia coli, nikotínamid adeníndinukleotid transhydrogenáza a aspartáza, každá z nich je odvodená od Escherichia coli, dihydrodipikolinát syntáza je odvodená od Escherichia coli alebo Brevibacterium lactofermentum alebo Corynebacterium glutamicum, a diaminopimelát dehydrogenáza je odvodená od Brevibacterium lactofermentum alebo Corynebacterium glutamicum.
  6. 6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, v ktorom vnútrobunkové aktivity dihydrodipikolinát syntázy a aspartokinázy sú zosilnené tým, že nesú dihydrodipikolinát syntázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a aspartokinázu, ktorej spätná inhibičná väzba L-lyzínom je znecitlivená, a vnútrobunková aktivita diaminopimelát dehydrogenázy je zosilnená zavedením diamino-pimelát dehydrogenázového génu.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 6, v ktorom uvedená dihydrodipikolinát syntáza zahŕňa mutáciu, ktorou sa nahrádza alanín v polohe 81 valínom a histidín v polohe 118 tyrozínom.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 6, v ktorom uvedená aspartokináza zahŕňa mutáciu/mutácie vybranú zo skupiny zahrnujúcej:
    (a) mutáciu, ktorou sa nahrádza glycín v polohe 323 kyselinou asparágovou, (b) mutáciu, ktorou sa nahrádza glycín v polohe 323 kyselinou asparágovou, a mutáciu, ktorou sa nahrádza glycín v polohe 408 kyselinou asparágovou, (c) mutáciu, ktorou sa nahrádza arginín v polohe 34 cysteínom, a mutáciu, ktorou sa nahrádza glycín v polohe 323 kyselinou asparágovou, (d) mutáciu, ktorou sa nahrádza leucínov v polohe 325 fenylalanínom, (e) mutáciu, ktorou sa nahrádza metionín v polohe 318 izoleucínom, (í) mutáciu, ktorou sa nahrádza metionín v polohe 318 izoleucínom, a mutáciu, ktorou sa nahrádza valín v polohe 349 metionínom, (g) mutáciu, ktorou sa nahrádza serín v polohe 345 leucínom, (h) mutáciu, ktorou sa nahrádza valín v polohe 347 metionínom, (i) mutáciu, ktorou sa nahrádza treonín v polohe 352 izoleucínom, (j) mutáciu, ktorou sa nahrádza treonín v polohe 352 izoleucínom, a mutáciu, ktorou sa nahrádza serín v polohe 369 fenylalanínom, (k) mutáciu, ktorou sa nahrádza kyselina glutámová v polohe 164 lyzínom, (l) mutáciu, ktorou sa nahrádza metionín v polohe 417 izoleucínom, a mutáciu, ktorou sa nahrádza cysteín v polohe 419 tyrozínom, (m) mutáciu, ktorou sa nahrádza glycín v polohe 323 kyselinou asparágovou, a mutáciu, ktorou sa nahrádza metionín v polohe 318 izoleucínom.
SK1054-2002A 2000-01-21 2000-01-21 Spôsob výroby L-lyzínu SK287800B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2000/000298 WO2001053459A1 (fr) 2000-01-21 2000-01-21 Procede de production de l-lysine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK10542002A3 SK10542002A3 (sk) 2002-11-06
SK287800B6 true SK287800B6 (sk) 2011-10-04

Family

ID=11735597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1054-2002A SK287800B6 (sk) 2000-01-21 2000-01-21 Spôsob výroby L-lyzínu

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7723081B1 (sk)
EP (1) EP1253195B1 (sk)
JP (1) JP4207426B2 (sk)
KR (1) KR100704517B1 (sk)
CN (1) CN100577794C (sk)
AT (1) ATE411378T1 (sk)
AU (1) AU2000230762A1 (sk)
BR (1) BRPI0016995B1 (sk)
DE (1) DE60040559D1 (sk)
DK (1) DK1253195T3 (sk)
ES (1) ES2313878T3 (sk)
HU (1) HU229834B1 (sk)
MX (1) MXPA02007154A (sk)
SK (1) SK287800B6 (sk)
WO (1) WO2001053459A1 (sk)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1664318T3 (da) 2004-01-30 2010-01-25 Ajinomoto Kk L-aminosyre-producerende mikroorganisme og fremgangsmåde til fremstilling af L-aminosyre
ES2941685T3 (es) 2004-10-07 2023-05-24 Ajinomoto Kk Método para producción de una substancia básica
KR100768748B1 (ko) 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
JP2007185184A (ja) 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009089603A (ja) 2006-02-02 2009-04-30 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2009095237A (ja) 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2055771A3 (en) 2006-03-23 2009-07-08 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
JP2009060791A (ja) * 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2021458A1 (en) 2006-05-23 2009-02-11 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
KR100905381B1 (ko) 2006-07-28 2009-06-30 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
KR100837842B1 (ko) * 2006-08-10 2008-06-13 씨제이제일제당 (주) 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이증가된 ｌ-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌 생산 방법
JP5756259B2 (ja) * 2006-09-15 2015-07-29 シージェイ チェイルジェダン コーポレイション Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法
JP2010017081A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2094858B1 (en) 2006-12-11 2015-02-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2006145712A (ru) 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
BRPI0806790B1 (pt) 2007-01-22 2017-02-14 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
RU2395579C2 (ru) 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
JP2010263790A (ja) 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
WO2010005099A1 (ja) * 2008-07-09 2010-01-14 味の素株式会社 アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法
CN102177246B (zh) 2008-09-08 2015-02-11 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2010084995A2 (en) 2009-01-23 2010-07-29 Ajinomoto Co.,Inc. A method for producing an l-amino acid
EP2395096B1 (en) 2009-02-09 2014-04-09 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing L-amino acids
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
US8283152B2 (en) 2009-08-28 2012-10-09 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN102234667B (zh) * 2011-06-08 2012-08-15 宁夏伊品生物科技股份有限公司 赖氨酸的三级发酵制备
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
CN103917656B (zh) 2011-10-25 2016-09-28 味之素株式会社 蛋白质的分泌产生方法
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
WO2013065869A1 (en) 2011-11-02 2013-05-10 Ajinomoto Co.,Inc. Method for secretory production of protein
IN2014CN04002A (sk) 2011-11-02 2015-10-23 Ajinomoto Kk
CN108486082A (zh) * 2012-10-18 2018-09-04 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
CN103215286B (zh) * 2012-11-12 2015-11-25 江南大学 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
EP2868745B1 (en) 2013-05-13 2017-06-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for manufacturing an L-amino acid
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
BR112015005215B1 (pt) 2013-10-21 2022-12-13 Ajinomoto Co., Inc Métodos para a produção de um l-aminoácido e para a produção de l-lisina
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
KR102308042B1 (ko) * 2017-07-28 2021-09-30 엘지디스플레이 주식회사 표시장치
CN110964682B (zh) * 2018-09-30 2021-09-03 上海凯赛生物技术股份有限公司 L-赖氨酸耐受菌、生产菌及其用途
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
JP7491312B2 (ja) 2018-12-27 2024-05-28 味の素株式会社 腸内細菌科の細菌の発酵による塩基性ｌ－アミノ酸またはその塩の製造方法
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
WO2020204179A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing l-amino acids
CN110079566B (zh) * 2019-05-16 2020-08-04 黑龙江伊品生物科技有限公司 用改变ppc启动子的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
CN110195087B (zh) * 2019-05-16 2020-12-01 黑龙江伊品生物科技有限公司 用改变ppc基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
KR102126951B1 (ko) * 2019-09-26 2020-06-26 씨제이제일제당 주식회사 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
DE3737729A1 (de) * 1987-11-06 1989-05-18 Degussa Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen
DE3823451C2 (de) 1988-07-11 1997-02-20 Forschungszentrum Juelich Gmbh Rekombinante DNA, damit transformierte Mikrooganismen und Verwendung dieser Mikroorganismen zur Herstellung von L-Lysin mit Hilfe dieser Mikroorganismen
CN1179043C (zh) 1993-08-24 2004-12-08 味之素株式会社 突变型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,其基因,和氨基酸的生产方法
CA2175042C (en) * 1993-10-28 2002-05-28 Hiroyuki Kojima Method for production of substances using microorganisms with an increased productivity for nadph
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
HU223706B1 (hu) 1994-12-09 2004-12-28 Ajinomoto Co., Inc. Új lizin dekarboxiláz gén és eljárás L-lizin termelésére
JP4088982B2 (ja) 1996-10-15 2008-05-21 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
US20030049804A1 (en) * 1999-06-25 2003-03-13 Markus Pompejus Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
US6927046B1 (en) * 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
JP4380029B2 (ja) * 2000-07-05 2009-12-09 味の素株式会社 微生物を利用した物質の製造法
JP4265093B2 (ja) * 2000-08-11 2009-05-20 味の素株式会社 スレオニン及びイソロイシンの製造法
DK1375664T3 (da) 2001-03-30 2010-02-08 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til udskillelsen og fremstilling af protein
JP2002330763A (ja) 2001-05-02 2002-11-19 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
AU2003205041A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
BRPI0407911A (pt) * 2003-03-07 2006-02-14 Ajinomoto Kk método para produzir uma transglutaminase ativa microbiana a partir de uma pró-transglutaminase microbiana, metaloprotease neutra de actionomicetos, molécula de ácido nucleico, e, método para produzir uma metaloprotease neutra de actinomicetos
BRPI0413007B1 (pt) 2003-07-29 2019-09-03 Ajinomoto Kk método de produzir l-lisina ou l-treonina
WO2005103278A1 (ja) 2004-04-20 2005-11-03 Ajinomoto Co., Inc. タンパク質の製造法
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE411378T1 (de) 2008-10-15
CN100577794C (zh) 2010-01-06
WO2001053459A1 (fr) 2001-07-26
US20100173368A1 (en) 2010-07-08
KR20020065932A (ko) 2002-08-14
EP1253195B1 (en) 2008-10-15
US7723081B1 (en) 2010-05-25
HUP0204295A3 (en) 2005-09-28
KR100704517B1 (ko) 2007-04-10
US8062869B2 (en) 2011-11-22
DK1253195T3 (da) 2009-01-12
MXPA02007154A (es) 2004-09-06
EP1253195A4 (en) 2004-08-04
JP4207426B2 (ja) 2009-01-14
BRPI0016995B1 (pt) 2016-03-08
AU2000230762A1 (en) 2001-07-31
SK10542002A3 (sk) 2002-11-06
HU229834B1 (en) 2014-09-29
DE60040559D1 (de) 2008-11-27
ES2313878T3 (es) 2009-03-16
HUP0204295A2 (hu) 2003-03-28
EP1253195A1 (en) 2002-10-30
CN1423691A (zh) 2003-06-11
BR0016995A (pt) 2002-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7723081B1 (en) Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same
EP1477565B1 (en) Method of producing L-lysine by fermentation
CA2214498C (en) Process for producing l-amino acid through fermentation
KR101208480B1 (ko) 말산 효소 활성이 감쇠된 에스케리키아 세균을 사용하는ｌ-라이신 또는 ｌ-트레오닌의 생산방법
KR100823044B1 (ko) 트레오닌 및 이소류신의 제조방법
US7186531B2 (en) L-threonine producing bacterium belonging to the genus Escherichia and method for producing L-threonine
JP3106501B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
EP0857784B1 (en) Method for producing L-lysine
US7439038B2 (en) Method for producing L-amino acid using methylotroph
HU224895B1 (en) Process for producing l-amino acids
EP0864654B1 (en) Stress-tolerant microorganism and method of the production of fermentation product
EP0834559B1 (en) Process for producing l-lysine by fermentation
US8017363B2 (en) Method for production of L-lysine using methanol-utilizing bacterium
US20050106688A1 (en) Method for producing L-amino acid
CN101824392B (zh) 生产l-赖氨酸的方法
ZA200204973B (en) Process for producing L-Lysine.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20130121