MXPA01010151A

MXPA01010151A - Bacterianas que producen l-aminoacido y procedimiento para producir l-aminoacido.

Info

Publication number: MXPA01010151A
Application number: MXPA01010151A
Authority: MX
Inventors: Yoshiya Gunji
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2002-06-21
Also published as: RU2004104198A; AU3674500A; US7223572B1; RU2334794C2; RU2004137825A; JP2008295457A; RU2351653C2; WO2000061723A1; EP1188822A4; JP4273661B2; DE60033151D1; CN1690191A; BR0009550A; CN1210396C; RU2004137824A; DE60033151T2; US20130171700A1; CN1346402A; US20080038825A1; PE20010049A1

Abstract

Se produce un L-aminoacido al cultivar una bacteria Methylophilus la cual puede crecer mediante la utilizacion de metanol como una fuente principal de carbono y que tiene capacidad de produccion de L-aminoacidos, por ejemplo, una bacteria Methylophilus en la cual se mejoran la actividad de dihidropicolinato sintasa y la actividad de aspartocinasa por transformacion a traves de introduccion en las celulas de ADN que codifica para dihidrodipicolinato sintasa que no presenta inhibicion por retroalimentacion por L-lisina, y un ADN que codifica para aspartocinasa que no presenta inhibicion por retroalimentacion por L-tisina, o una bacteria Methylophitus elaborada para ser auxotrofica de casaminoacidos, en un medio que contiene metanol como una fuente principal de carbono, para producir y acumular un L-aminoacido en cultivo, y recolectar el L-aminoacido del cultivo.

Description

BACTERIAS QUE PRODUCEN ..-AMINOÁCIDO Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDO CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con técnicas en el campo de la industria microbiana. En particular, la presente invención se relaciona con un método para producir un L-aminoácido con fermentación y un microorganismo utilizado en el método.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Los aminoácidos tales como L-lisina, ácido L-glutámico, L- treonina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina y L-fenilalanina se producen industrialmente por fermentación mediante la utilización de microorganismos que pertenecen a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida o similares. Para mejorar la productividad, se han utilizado como estos microorganismos cepas aisladas de la naturaleza o mutantes artificiales de los mismos. Se han descrito diversas técnicas para mejorar las actividades de las enzimas biosintéticas de ácido L-glutámico mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante, para incrementar la capacidad productora de ácido L-glutámico. La productividad de L-aminoácidos se ha incrementado considerablemente mediante la crianza de microorganismos tales como los mencionados antes y la mejora de los métodos de producción. Sin embargo, para satisfacer la demanda cada vez mayor en el futuro, aún se desean el desarrollo de métodos para producción más eficiente de L-aminoácidos a un menor costo. Dado que los métodos para producir aminoácidos por fermentación de metanol, el cual es una materia prima de fermentación disponible en gran cantidad a bajo costo, ha habido convencionalmente métodos conocidos que utilizan microorganismos que pertenecen a los géneros Achromobacter o Pseudomonas (Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) No. 45-25273/1970, Protaminobacter (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 49-125590/1974), Protaminobacter o Methanomonas (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 50-25790/1975), Microcyclus (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 52-18886/1977, Methylobacillus (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 4-91793/1992), Bacillus (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 3-505284/1991 ) y así sucesivamente. Sin embargo, hasta ahora no se ha conocido un método para producir L-aminoácidos mediante la utilización de bacterias Methulophilus. Aunque los métodos descritos en EP 0 035 831 A, EP 0 037 273 A y EP 0 066 994 A se han conocido como métodos para transformar bacterias Methylophilus mediante la utilización de ADN recombinante, hasta ahora no se ha conocido la aplicación de técnicas de ADN recombinante para la mejoría en la productividad de aminoácidos de bacterias metilófilus.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objetivo de la presente invención es proporcionar una bacteria productora de L-aminoácido novedosa así como un método para producir un L-aminoácido mediante la utilización de la bacteria productora de L-aminoácido. Como un resultado de los esfuerzos de los presentes inventores realizado para obtener el objetivo mencionado antes, encontraron que la bacteria Methylophilus es adecuada para producir L-aminoácidos. Además, aunque convencionalmente se ha considerado difícil obtener mutantes auxotróficos de bacteria Methylophilus (FEMS Microbiology Rev. 39, 235-258 (1986) y Antonie van Leeuwenhoek 53, 47-53 (1987)), los presentes inventores han tenido éxito en obtener mutantes auxotróficos de tal bacteria. De esta manera se ha llevado a cabo la presente invención. Esto es, la presente invención proporciona lo siguiente: la-l .? A¡¿. »-^ ¿i-l«-< ,.^. ., .«. ...... *^ » *..*.. «*.** I. **...*^ , .^. ^^¡¡¡^gj^ ^jj^ (1 ) Una bacteria Methylophilus que tiene capacidad para producir L-aminoácido. (2) La bacteria de Methylophilus de acuerdo con el inciso • (1 ), es donde el L-aminoácido es L-lisina, L-valina, L-leucina, L- 5 isoleucina o L-treonina. (3) La bacteria Methylophilus de acuerdo con el inciso (1 ), la cual tiene resistencia a un análogo de L-aminoácido o auxotrofía para L-aminoácido. (4) La bacteria Methylophilus de acuerdo con el inciso (1 ), iflO en donde se mejora la actividad de la enzima biosintética del L- aminoácido. (5) La bacteria Methyiophilus de acuerdo con el inciso (1 ), en donde se encuentran mejoradas la actividad de dihidrodipicolinato sintasa y de aspartocinasa, y la bacteria tiene la capacidad de producir 15 L-lisina. (6) La bacteria Methylophilus de acuerdo con el inciso (1 ), en donde se mejora la actividad de dihidrodipicolinato sintasa, y la bacteria tiene la capacidad de producir L-lisina. 20 (7) La bacteria Methyiophilus de acuerdo con el inciso (1 ), en donde se mejora la actividad de aspartocinasa, y la bacteria tiene capacidad productora de L-lisina. (8) La bacteria Methylophil?s de acuerdo con cualquiera de los incisos (5) a (7), en donde la actividad o actividades de 1 , 2 o 3 enzimas seleccionadas de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa, dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato descarboxilasa se mejoran. (9) La bacteria Methylophilus de acuerdo con el inciso (5), en donde se mejoran la actividad de dihidrodipicolinato sintasa y de aspartocinasa por transformación a través de introducción en las células de ADN que codifica para dihidrodipicolinato sintasa que no sufre inhibición por retroalimentación por L-lisina, y ADN que codifica para aspartocinasa que no sufre de inhibición de retroalimentación por L-lisina. (10) La bacteria de acuerdo con el inciso (1 ), en donde se mejoran las actividades de aspartocinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa, y la bacteria tiene una capacidad productora de L-treonina. (1 1 ) La bacteria de acuerdo con cualquiera de los incisos (1 ) a (10), en donde la bacteria Methylophilus es Methylophilus methulotrophus. (12) Un método para producir un L-aminoácido, el cual comprende cultivar una bacteria Methylophilus como se define en cualquiera de los incisos (1 ) a (1 1 ) anteriores en un medio para producir y acumular un L-aminoácido en cultivo y recolectar el L- aminoácido del cultivo. (13) El método de acuerdo con el inciso (12), en donde el medio contiene metanol como una fuente principal de carbono. (14) Un método para producir células bacterianas de una bacteria Methylophilus con un contenido aumentado de un L- aminoácido, el cual comprende cultivar una bacteria de Methylophilus como se define en cualquiera de los incisos (1 ) a (1 1 ) anteriores en un medio para producir un acumulado de L-aminoácido en células bacterianas de la bacteria. (15) El método para producir células bacterianas de bacteria Methylophilus de acuerdo con el inciso (14), en donde el L-aminoácido es L-lisina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina o L-treonina. (16) Un ADN el cual codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (A) o (B): (A) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, o (B) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTI FICACIÓN NO: 6 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y tiene actividad de aspartocinasa. (17) El ADN de acuerdo con el inciso (16), el cual es un ADN definido en los siguientes incisos (a) o (b): (a) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 510 a 1736 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; o (b) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene 5 la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 510 a 1736 de la SECUENCIA DE IDENTI FICACIÓN NO: 5 o una parte de la misma bajo condición rigurosa y codifica para una proteína que tiene actividad de aspartocinasa. (18) Un ADN el cual codifica para una proteína definida en (fcl los siguientes incisos (C) o (D): (C) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, o (D) una proteína la cual tiene las secuencias de los aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8 que incluye 15 sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de ácido aspártico semialdehído f deshidrogenasa. (19) El ADN de acuerdo con el inciso (18), el cual es un ADN como se define en los siguientes incisos (c) o (d): 20 (c) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 98 a 1207 de la SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 7; o l-*, &?*¿ ±*áu t*í&J tl*¿Z * * *<**». J, .*. i - *.*...^. -. ..-...^^-^.^..i,. ^... y. «. .. , .,. «,* A^ .. ...... ; (d) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 98 a 1207 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7 o una parte de la misma bajo • una condición astringente, y que codifica para una proteína que tiene 5 actividad de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa. (20) Un ADN el cual codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (E) o (F): (E) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10, o <É 10 (F) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de dihidrodipicolinato sintasa. (21 ) El ADN de acuerdo con el inciso (20), el cual tiene un 15 ADN definido en los siguientes incisos (e) o (f): (e) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 1268 a 2155 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9; o (f) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene 20 la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 1268 a 2155 de la SECUENCIA DE IDENTI FICACIÓN NO: 9 o una parte de la misma bajo una condición rigurosa, y que codifica para una proteína que tiene actividad de dihidrodipicolinato sintasa.

Il Í?AátA ?i t??'?. ^yaa. - .ma~**i.* i»ar .... *. . ,...* .- . , - ...^, -u.^. t? ^. .*.,* -^. * *** .^-í M. ** -?J ?A* (22) Un ADN el cual codifica para una proteína como se define en los siguientes incisos (G) o (H): (G) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, o 5 (H) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de dihidrodipicolinato reductasa. f.0 (23) El ADN de acuerdo con el inciso (22), el cual es un ADN definido en los siguientes incisos (g) o (h): (g) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 2080 a 2883 de la SECUENCIA DE I DENTI FICACIÓN NO: 1 1 ; o 15 (h) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 2080 a 2883 de la SECUENCIA DE I DENTI FICACIÓN NO: 1 1 o una parte de la misma bajo una condición astringente, y que codifica para una proteína que tiene actividad de dihidrodipicolinato reductasa. 20 (24) Un ADN el cual codifica para una proteína como se define en los siguientes incisos (I) o (J): (I) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, o . ****. M t* ^*.* .*^,**.**!**!****. -**..* ,.. <* - . ^,w <. -. taá ? .

(J) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de diaminopimelato descarboxilasa. (25) El ADN de acuerdo con el inciso (24), el cual es un ADN definido en los siguientes incisos (i) o (j): (i) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 751 a 1995 de la SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 13; o (j) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 751 a 1995 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 o una parte de la misma bajo una condición rigurosa, y que codifica para una proteína que tiene actividad de diaminopimelato descarboxilasa. En la presente especificación, "capacidad productora de L- aminoácido" se refiere a la capacidad para acumular una cantidad significativa de un L-aminoácido en un medio o incrementar el contenido de aminoácido en las células microbianas cuando se cultiva en el medio un microorganismo de la presente invención.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el proceso de producción del plásmido • RSF24P que tiene un mutante dapA. El término "dapA *24" se refiere a 5 un mutante dapA que codifica para un DDPS mutante en donde el residuo 1 18-histidina se ha sustituido con un residuo tirosina. La figura 2 muestra el proceso de producción del plásmido RSFD80 que tiene un mutante dapA y un mutante lysC. El término "lysC*80" se refiere a un mutante lysC que codifica para un mutante AKI II en donde el residuo 352-treonina está sustituido con un residuo •10 isoleucina. La figura 3 muestra la actividad de aspartocinasa de cepas E. coli transformantes que contienen un gen ask. La figura 4 muestra la actividad de ácido aspártico 15 semialdehído deshidrogenasa de cepas de E. coli transformantes que contienen un gen asd. La figura 5 muestra la actividad de dihidrodipicolinato sintasa de cepas E. coli transformantes que contienen un gen dapA. La figura 6 muestra la actividad de dihidrodipicolinato 20 reductasa de una cepa de E. coli transformante que contiene un gen dapB. Ü^ ¿ ife .t wnt »„ü , „ . ..» _,, . , - „,.._,„ ^ ,, .. **.»...«? *. *.*.,- *. . - tiinniM^tititj La figura 7 muestra la actividad de diaminopimelato descarboxilasa de las cepas E. coli transformantes que contienen un gen lysA.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN <1 > Microorganismo de la presente invención El microorganismo de la presente invención es una bacteria que pertenece al género Methylophilus y que tiene capacidad para producir L-aminoácido. La bacteria Methylophilus de la presente invención incluye, por ejemplo, Methylophilus methylotrophus AS1 cepa (NCIMB10515) y así sucesivamente. Methylophilus methylotrophus AS1 cepa (NCIMB10515) está disponible de National Collections of Industrial and Marine Bacteria (dirección: NCIMB Lts. , Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido). Los L-aminoácidos producidos de acuerdo con la presente invención incluyen L-lisina, ácido L-glutámico, L-treonina, L-valina, L- leucina, L-isoleucina, L-triptofano, L-fenilalanina, L-tirosina y así sucesivamente. Se pueden producir uno o más tipos de tales aminoácidos. Las bacterias Methylophilus que tienen actividad productora de L-aminoácidos se pueden obtener al impartir la capacidad productora de L-aminoácidos a cepas silvestres de bacterias Methylophilus. Para impartir la capacidad productora de L-aminoácidos, se pueden utilizar métodos adoptados convencionalmente para la crianza de bacterias corineformes, bacterias Escherichia o similares, tales como los métodos para obtener cepas mutantes auxotróficas, cepas resistentes a análogos de L-aminoácido, o cepas mutantes de control metabólico, y métodos para producir cepas recombinantes en donde se mejoran las actividades de las enzimas biosintéticas de L-aminoácidos (véase "Amino Acid Fermentation", The Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1 st Edition, publicada el 30 de Mayo de 1986, pp. 77 a 100). En la crianza de bacterias productoras de aminoácidos, las características tales como auxotrofía, resistencia a análogos de L-aminoácidos y mutación de control metabólicos se pueden impartir solas o en combinación de dos o más. La actividad de enzima biosintética de L-aminoácidos se pude mejorar sola o en combinación de dos o más. Además el impartir la característica tal como auxotrofía, resistencia a análogo de L-aminoácido y mutación de control metabólicos se pueden combinar con mejoramiento de la actividad de la enzima de biosíntesis de L-aminoácido. Por ejemplo, las bacterias productoras de L-lisina se crían como mutantes que muestran auxotrofía para L-homoserina o L-treonina y L-metionina (Publicaciones de Patentes Japonesas (Kokoku) Nos. 48-28078/1973 y 56-6499/1981 , los mutantes que muestran ?-?-..¿ ..i--Iii.*-t. auxotrofía para inositol o ácido acético (Solicitudes de Patentes Japonesas abiertas al público (Kokai) Nos. 55-9784/1980 y 56- 8692/1981 ), o mutantes que son resistentes a oxalisina, hidroxamato de • lisina, S-(2-aminoetil)-cisteína, ?-metil lisina, a-clorocaprolactama, DL- 5 a-amino-e-caprolactama, a-amino-lauril lactama, análogo de ácido aspártico, medicamento sulfa, quinoide o N-lauroil leucina. Además, las bacterias productoras de ácido L-glutámico se pueden criar como mutantes que muestren auxotrofía para ácido oleico o similar. Las bacterias productoras de L-treonina se pueden criar como 10 mutantes resistentes al ácido a-amino-ß-hidroxivalérico. Las bacterias productoras de L-homoserina se pueden criar como mutantes que muestren auxotrofía para L-treonina o mutantes resistentes a análogos de L-fenilalanina. Las bacterias productoras de L-fenilalanina se pueden criar como mutantes que muestren auxotrofía para L-tirosina. 15 Las bacterias productoras de L-isoleucina se pueden criar como mutantes que muestren auxotrofía para L-leucina. Las bacterias productoras de L-prolina se pueden criar como mutantes que muestren auxotrofía para L-isoleucina. Además, como se menciona en los ejemplos siguientes, se 20 pueden obtener cepas que produzcan una o más clases de aminoácidos ramificados (L-valina, L-leucina y L-isoleucina) como cepas que muestran auxotrofía para casaminoácidos.

Para obtener mutantes de bacterias Methyiophilus, los inventores de la presente invención primero examinaron los detalles de una condición óptima de mutagénesis mediante la utilización de la ^ frecuencia de germinación de cepas resistentes de estreptomicina como 5 un índice. Como un resultado, se obtiene una frecuencia de germinación máxima de cepas resistentes a estreptomicina cuando la tasa de supervivencia después de mutagénesis es de aproximadamente 0.5%, y tuvieron éxito en obtener cepas auxotróficas bajo esta condición. También tuvieron éxito en obtener cepas auxotróficas, las 10 cuales se han considerado, principalmente cuando se trabaja a gran escala para el examen de mutantes en comparación con los conducidos previamente para E. coli y así sucesivamente. Como se describe en lo anterior, puesto que se ha revelado que los mutantes se pueden obtener por bacterias Methylophilus 15 mutagenizadas bajo una condición adecuada, se ha vuelto posible obtener fácilmente los mutantes deseados al ajustar adecuadamente tal condición de manera que la tasa de supervivencia después de la mutagénesis se vuelva de aproximadamente 0.5%, dependiendo del método del mutagénesis. 20 Los métodos de mutagénesis para obtener mutantes de Methylophilus incluyen irradiación UV y tratamientos con agentes mutagénicos utilizados para tratamientos de mutagénesis habitual tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (?TG) o ácido nitroso. Las bacterias de Methylophilus que tienen capacidad para producir L- aminoácidos también pueden obtener al seleccionar mutantes que se presentes de manera natural de las bacterias Methyiophilus. Los mutantes resistentes al análogo de L-aminoácido se puede obtener, por ejemplo, al inocular bacterias Methyiophilus mutagenizadas en un medio de agar que contiene un análogo de L- aminoácido en diversas concentraciones y seleccionar cepas que formen colonias. Los mutantes auxotróficos se pueden obtener al permitir que las bacterias Methyiophilus formen colonias en un medio de agar que contiene un nutriente objetivo (por ejemplo, L-aminoácido), replicar las colonias a un medio de agar que no contiene tal nutriente, y seleccionar cepas que no puedan crecer en el medio de agar que no contiene el nutriente. Los métodos para impartir capacidad productora de L- aminoácidos mejorada al mejorar la actividad de la enzima biosintética de L-aminoácido se ejemplifican en lo siguiente: [L-lisinal. Se puede impartir una capacidad productora de L- lisina, por ejemplo, al mejorar la actividad de dihidrodipicolinato sintasa y/o la actividad de aspartocinasa. La actividad de dihidrodipicolinato sintasa y/o la actividad de aspartocinasa en las bacterias Methylophilus se puede mejorar por ligación de un fragmento de gen que codifica para dihidrodipicolinato sintasa y/o un fragmento de gen que codifica para aspartocinasa con un vector que funciona en bacteria Methylophilus, preferiblemente un ^ vector de tipo de copia múltiple, para crear un ADN recombinante, e 5 introducirlo dentro del hospedador de bacteria Methylophilus para transformar al hospedador. Como un resultado del incremento en el número de copias del gen que codifica para dihidrodipicolinato sintasa y/o el gen que codifica para aspartocinasa en células de la cepa transformante, se mejora la actividad o las actividades de las mismas. ^fc10 En lo siguiente, la dihidrodipicolinato sintasa, aspartocinasa y aspartocinasa l l l también se denominan con las abreviaturas DDPS, AK y AKIll, respectivamente. Como un microorganismo que proporcione un gen que codifica para DDPS y un gen que codifica para AK, se puede utilizar 15 cualquier microorganismo en la medida en que tenga genes que permita la expresión de actividad de DDPS y actividad de AK en • microorganismos que pertenecen a los géneros Methylophilus. Tales microorganismos pueden ser cepas silvestres o cepas mutantes derivadas de las mismas. Específicamente, los ejemplos de tales 20 microorganismos incluyen E. coli (Escherichia coli) cepa K-12, Methylophilus methylotrophus cepa AS1 (NCIMB 10515) y así sucesivamente. Puesto que las secuencias nucleotídicas de un gen que codifica para DDPS (dapA, Richaud, F. Et al., J. Bacteriol., 297, (1986)) y un gen que codifica para AKI I I (lysC, Cassan, M., Parsot, C, Cohén, G.N. y Patte, J.C. , J. Biol. Chem., 261 , 1052 (1986)) derivado de bacterias Escherichia se han mostrado ambos, estos genes se pueden ^ obtener por PCR utilizando cebadores sintetizados en base en las 5 secuencias nucleotídicas de estos genes y el ADN cromosómico del microorganismo tal como E. coli K-12 o similar, como una plantilla. Como ejemplos específicos, se explicarán a continuación dapA y lysC derivados de E. coli. Sin embargo, los genes utilizados para la presente invención no se limitan a estos. A10 Se prefiere que DDPS y AK utilizados para la presente invención no presenten inhibición por retroalimentación por L-lisina. Se ha sabido que DDPS de tipo silvestre de E. coli presenta inhibición de retroalimentación por L-lisina y que AKIII de tipo silvestre derivada de E. coli presenta supresión e inhibición por retroalimentación por L- 15 lisina. Por lo tanto, los genes dapA y lysC que se van a introducir en la bacteria Methylophilus preferiblemente codifican para DDPS y AKI I I que tiene una mutación que desensibiliza la inhibición por retroalimentación, por L-lisina. En lo siguiente, DDPS que tiene una mutación que desensibiliza la inhibición por retroalimentación por L- 20 lisina también se denomina como un "DDPS mutantes", y ADN que codifica para DDPS mutante también se denomina como "dapA mutante". AKIII derivado de E. coli que tiene una mutación que desensibiliza la inhibición por retroalimentación por L-lisina también se ? ^i*&.. - ? . denomina como "AKM I mutante", y ADN que codifica para AKI I I mutante también se denomina como "lysC mutante". De acuerdo con la presente invención, DDPS y AK no ^ necesariamente se requiere que sean mutante. Se ha sabido que, por 5 ejemplo, DDPS derivado de bacterias Corynebacterium originalmente no presenta inhibición por retroalimentación por L-lisina. Una secuencia nucleotídica de dapA de tipo silvestre derivada de E. coli se ejemplifica por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 . La secuencia de aminoácidos de DDPS de ^fe10 tipo silvestre por tal secuencia nucleotídica se ejemplifica por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. Una secuencia nucleotídica de lysC de tipo silvestre derivada de E. coli se ejemplifica por SECUENCIA DE I DENTI FICACIÓN NO: 3. La secuencia de aminoácidos de ATI II de tipo silvestre codificada por tal secuencia nucleotídica se 15 ejemplifica por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4. El ADN que codifica para DDPS mutante que no presenta inhibición por retroalimentación por L-lisina incluye un ADN que codifica para DDPS que tiene la secuencia de aminoácidos que se describe en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2 en donde el residuo 1 18- 20 histidina está sustituido con un residuo tirosina. El ADN que codifica para AKI II mutante que no presenta inhibición por retroalimentación por L-lisina incluye un ADN que codifica para AKI I I tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4 .1* *** ^.. *.**, .» .. ... , .. ?* *..<..** +,?LÍ? A. en donde el residuo 352-treonina está sustituido con un residuo isoleucina. El plásmido utilizado para clonación del gen puede ser cualquier plásmido en la medida en que pueda replicarse en microorganismos tales como bacterias Escherichia o similares, y específicamente incluye pBR322, pTWV228, pMW1 19, pUC19 y así sucesivamente. El vector que funciona en bacteria Methylophilus es, por ejemplo un plásmido que puede replicarse de manera autónoma en bacterias Methylophilus. Específicamente, se pueden mencionar RSF1010, el cual es un vector de espectro de hospedador amplio, y derivados del mismo, por ejemplo, pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161 -167, (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53, (1990)), pRP301 , pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) y así sucesivamente. Para preparar un ADN recombinante por ligación de dapA y lysC a un vector que funciona en bacterias Methylophilus, el vector se digiere con una enzima de restricción que corresponde a la parte terminal del fragmento de ADN que contiene dapA y lysC. La ligación habitualmente se realiza utilizando ligasa tal como T4 DNA ligasa. DapA y lysC se pueden incorporar individualmente en vectores separados o dentro de un solo vector.

Como un plásmido que contiene un mutante de dapA que codifica para DDPS mutante y lysC mutante que codifica para AKI II mutante, se ha conocido un plásmido RSFD80 de espectro de hospedador amplio (2095/16042). E. coli cepa JM109 transformada con este plásmido se designa como AJ12396, y se deposita ante el National institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal 305-8566, 1 -3 Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japón) el 28 de Octubre de 1993 y recibió el número de acceso FERM P-13936, y se transfirió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 1 de Noviembre de 1 994 y recibió el número de acceso FERM BP-4859. Se puede obtener RSFD80 a partir de la cepa AJ 12396 de una manera conocida. El dapA mutante contenido en RSFD80 tiene una secuencia de nucléotidos de dapA de tipo silvestre de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 que incluye la sustitución de C en nucléotido número 597 con T. La DDPS mutante codificada de esta manera tiene una secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 2 que incluye la sustitución del residuo 1 18-histidina con un residuo tirosina. La lysC mutante contenida en RSFD80 tiene una secuencia nucleotídica de lysC de tipo silvestre de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 3 que incluye la sustitución de C en el nucléotido 1638 con T. La AKI II mutante codificada por la misma tiene una secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 4 que incluye la sustitución del residuo 352-treonina con un residuo isoleucina. Para introducir un ADN recombinante preparado como se 5 describe en lo anterior en bacteria Methylophilus, se puede utilizar cualquier método en la medida en que proporcione suficiente eficiencia de transformación. Por ejemplo, se puede utilizar electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). La actividad de DDPS y/o la actividad de AK también se •10 puede mejorar por la presencia de copias múltiples de dapA y/o lysC en el ADN cromosómico de la bacteria Methyiophilus. Para introducir copias múltiples de dapA y/o lysC en al ADN cromosómico de la bacteria Methylophilus, se realiza recombinación homologa mediante la utilización, como un objetivo, de una secuencia que está presente en el 15 ADN cromosómico de la bacteria Methylophilus en un número múltiple de copias. Puesto que la secuencia presente en el ADN cromosómico ^k en el número múltiple de copias, se puede utilizar un ADN repetitivo, secuencias repetidas invertidas presentes al final de un elemento que se puede someter a transposición o similar. Alternativamente, como se 20 describe en la Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 2-109985/1990, se pueden introducir copias múltiples de dapA y/o lysC en el ADN cromosómico al montarlas sobre un transposon para transferirlas. En ambos métodos, como resultado del número de copias aumentado de dapA y/o lysC en cepas transformadas, se debe amplificar la actividad de DDPS y la actividad de AK. Además de la amplificación del gen anterior, la actividad de f DDPS y/o la actividad de AK se pueden amplificar al sustituir una 5 secuencia de control de expresión tal como los promotores de dapA y/o lysC con unos más fuertes (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 1 -215280/1989). Como tales promotores fuertes, se han conocido, por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac, el promotor PR y el promotor P del fago lambda, el A10 promotor tet, el promotor amyE, el promotor spac y así sucesivamente. La sustitución de estos promotores mejora la expresión de dapA y/o lysC y por lo tanto se amplifica la actividad de DDPS y la actividad de AK. El mejoramiento de las secuencias de control de expresión se puede combinar con un incremento en el número de copias de dapA y/o 15 lysC. Para preparar un ADN recombinante por ligación de un • fragmento de gen y un vector, el vector se digiere con una enzima de restricción que corresponde a la parte terminal del fragmento del gen. La ligación habitualmente se realiza por ligasa tal como T4 DNA ligasa. 20 Como métodos para digestión, se pueden utilizar la ligación y otros de ADN, preparación de ADN cromosómico, PCR, preparación de ADN plasmídico, transformación, diseño de oligonucléotidos utilizados como cebadores y así sucesivamente, así como métodos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, • (1989) y así sucesivamente. 5 Además de la mejoría de la actividad de DDPS y/o la actividad AK, también se puede mejorar la actividad de otra enzima involucrada en la biosíntesis de L-lisina. Tales enzimas incluyen las enzimas de la vía diaminopimelato tales como dihidrodipicolinato reductasa, diaminopimelato descarboxilasa, diaminopimelato A10 deshidrogenasa (WO96/40934 para la totalidad de las enzimas anteriores), fosfoenolpiruvato carboxilasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 60-87788/1985), aspartato aminotransferasa (Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) No. 6- 102028/1994), diaminopimelato epimerasa, ácido aspártico 15 semialdehído deshidrogenasa y así sucesivamente, o enzimas de la vía aminoadipato tales como homoaconitato hidratasa y así sucesivamente. Preferiblemente, se mejora la actividad de por lo menos una enzima de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa, dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato descarboxilasa. 20 Se describirán posteriormente aspartosinasa, ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa, dihidrodipicolinato sintasa, dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato descarboxilasa derivadas de Methylophilus methylotrophus. i . í ^L üt tikk v ikí . -= — *^ -*J» M» tt * . ¿.-*.- Además, los microorganismos de la presente invención se pueden disminuir en actividad de una enzima que catalice una reacción para generar un compuesto diferente de L-lisina por eliminación de la f rama de la vía biosintética de L-lisina, o puede ser deficiente en tal 5 enzima. La enzima que cataliza la reacción para generar el compuesto diferente de L-lisina por eliminación de la rama de la vía biosintética para L-lisina incluye homoserina deshidrogenasa (véase WO95/23864). Las técnicas mencionadas antes para mejorar la actividad de una enzima involucrada en la biosíntesis de L-lisina se pueden A10 utilizar similarmente para otros aminoácidos mencionados en lo siguiente. ÍAcido L-glutámico]. La capacidad de producción de ácido L- glutámico se puede impartir a bacterias Methylophilus mediante, por 15 ejemplo introducción de ADN que codifica para cualquiera de las enzimas que incluyen glutamato deshidrogenasa (Solicitud de Patente f Japonesa abierta al público (Kokai) 61 -268185/1986), glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) Nos. 62-166890/1987 y 63- 20 214189/1988), aconitato hidratasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 62-294086/1987), citrato sintasa (Solicitudes de Patentes Japonesas abiertas al público (Kokai) No. 62- 201585/1987 y 63-1 19688/1988), fosfoenolpiruvato carboxilasa . « E. .H 1 „ ~?* ?. A-Í.? * (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 60- 87788/1985 y 62-55089/1987), piruvato deshidrogenasa, piruvato sinasa, fosfoenolpiruvato sintasa, enolasa, fosfogliceromutasa, (( fosfoglicerato sinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, triosa 5 fosfato isomerasa, fructosa bisfosfato aldolasa, fosfofructocinasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 63- 102692/1988), glucosa fosfato isomerasa, glutamina-oxoglutarato aminotransferasa (WO99/07853) y así sucesivamente. Además, los microorganismos de la presente invención A10 pueden presentar actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción para generar un compuesto diferente de ácido L- glutámico por eliminación de rama de la vía biosintética de ácido L- glutámico, o pueden ser deficientes en tal enzima. La enzima que cataliza la reacción para generar el compuesto diferente de ácido L- 15 glutámico por eliminación de ramificación de la vía biosintética de ácido L-glutámico incluye a-cetoglutarato deshidrogenasa (aKGDH), isocitrato liasa, fosfato acetiltransferasa, aceito cinasa, ácido acetohidroxi sintasa, acetolactato sintasa, formiato acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa, 1 -pirrolino deshidrogenasa 20 y así sucesivamente. rL-treonina"). La capacidad para producir L-treonina se puede impartir o mejorar, por ejemplo, al mejorar las actividades de aspartocinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa. Se pueden mejorar las actividades de estas enzimas mediante, por ejemplo, transformación de bacterias Methylophilus fj utilizando un plásmido recombinante que contiene un operón treonina 5 (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) Nos. 55- 131397/1980, 59-31691 /1984 y 56-15696/1981 y Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) No. 3-501682/1991 ). La capacidad de producción también se puede impartir o mejorar al amplificar o introducir un operón treonina que tiene un gen A10 que codifica para aspartocinasa del cual se elimina la sensibilización de inhibición de retroalimentación por L-treonina (Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) No. 1 -29559/1989), un gen que codifica para homoserina deshidrogenasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 60-012995/1985) o un gen que codifica para 15 homoserina cinasa y homoserina deshidrogenasa (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 61 -195695/1986). Además, se puede mejorar la capacidad productora de L- treonina al introducir un ADN que codifica para una fosfoenolpiruvato carboxilasa mutante que tiene una mutación para no responder a la 20 inhibición por retroalimentación por ácido aspártico.

[L-valinal. Se puede impartir la capacidad productora de L- valina mediante, por ejemplo, introducción en la bacteria Methylophilus i.J íi,£?&A- já*&. t*- «1"J «. - - • L* de un gen para biosíntesis de L-valina cuyo mecanismo de control no es sensible sustancialmente. También se puede introducir una mutación que vuelve sustancialmente insensible a un mecanismo de control de 9 un gen para la biosíntesis de L-valina transportado por un 5 microorganismo que pertenece al género Methylophilus. Los ejemplos de genes para la biosíntesis de L-valina incluyen, por ejemplo, el operón ilvGMEDA de E. coli. La treonina desaminasa codificada por un gen ilvA cataliza la reacción de desaminación que convierte L-treonina en ácido 2-cetobutírico, cual es A10 la etapa de determinación de velocidad de la biosíntesis de L- isoleucina. Por lo tanto, para obtener un progreso eficiente de las reacciones de síntesis de L-valina, es preferible utilizar un operón que no exprese actividad de treonina desaminasa. Los ejemplos de operón ilvGMEDA que no expresan tal actividad de treonina desaminasa 15 incluyen un operón ilvGMEDA en donde se introduce una mutación para eliminar la actividad de treonina desaminasa en ilvA o ilvA se ákk interrumpe, y un operón ilvGMED en donde se suprime ilvA. Puesto que el operón ilvGMEDA presenta control de expresión de operón (atenuación) por L-valina y/o L-isoleucina y/o L- 20 leucina, la región necesaria para la atenuación preferiblemente se remueve o muta para insensibilizar la supresión de expresión por L- valina. íí.?.?.<á*A - ?¡.s.*? -*í ..t..k.te i . , ... | ¡dfa Un operón ilvGMEDA el cual no expresa actividad de treonina desaminasa y en el cual la atenuación se insensibiliza como se describe en lo anterior, se puede obtener al someter un operón f ¡IvGMEDA de tipo silvestre a tratamiento por mutagénesis o 5 modificación del mismo por medio de técnicas de recombinación de genes (véase WO96/06926).

[L-leucinal. La capacidad para producir L-leucina se imparte o se mejora, por ejemplo, al introducir en un microorganismo que •10 pertenece al género Methylophilus un gen para la biosíntesis de L- leucina cuyo mecanismo de control ha sido insensibilizado sustancialmente, además de las características anteriores necesarias para la producción de L-valina. También es posible introducir tal mutación de manera que el mecanismo de control de un gen para la 15 biosíntesis de L-leucina en un microorganismo que pertenece al género Methylophilus se pueda eliminar sustancialmente. Los ejemplos de tal gen incluyen, por ejemplo, un gen leuA el cual proporciona una enzima en la cual se elimina sustancialmente e inhibición por L-leucina. rL-isoleucinal. Se pueden impartir la capacidad productora 20 de L-isoleucina mediante, por ejemplo, introducción del operón thrABC que contiene el gen thrA que codifica para aspartocinasa l/homoserina deshidrogenasa Y derivada de E. coli en donde la inhibición por L- treonina ha sido insensibilizada sustancialmente y un operón ilvGMEDA el cual contiene un gen ilvA que codifica para treonina desaminasa, en donde la inhibición por L-isoleucina se insensibiliza sustancialmente y cuya región requerida para atenuación se ha removido (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) No. 8-47397/1996).

[Otros aminoácidos!. Se puede mejorar la biosíntesis de L- triptofano, L-fenilalanina, L-tirosina, L-treonina y L-isoleucina al incrementar la capacidad productora de fosfoenolpiruvato de las bacterias Methylophilus (WO97/08333). Las capacidades de producción para L-fenilalanina y L- tirosina se mejoran al amplificar o introducir un gen para corismato mutasa-prefenato deshidratasa (CM-PDT) insensibilizada (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) Nos. 5-236947/1993 y 62- 130693/1987) y un gen para 3-desoxi-D-arabinoheptulonato-7-fosfato sintasa (DS) insensibilizado (Solicitudes de Patentes Japonesas abiertas al público (Kokai) Nos. 5-236947/1993 y 61 -124375/1986). La capacidad de producción de L-triptofano se mejora al amplificar o introducir un operón triptofano que contiene un gen que codifica para antranilato sintasa insensibilizada (Solicitudes de Patentes Japonesas abiertas al público (Kokai) Nos. 57-71397/1982, 62-244382/1978 y Patente de E.U.A. No. 4,371 ,614). En la presente especificación, la expresión de que la enzima "la actividad está mejorada" habitualmente se refiere a que la actividad intracelular de la enzima es mayor que la de una cepa de tipo silvestre, y cuando una cepa en la cual la actividad de la enzima se mejora se obtiene por modificación utilizando técnicas recombinantes de genes o tP similares, la actividad intracelular de la enzima es mayor que la de la 5 cepa antes de la modificación. La expresión de que la "actividad" de la enzima "está disminuida" habitualmente se refiere a que la actividad intracelular de la enzima es menor que la de una cepa de tipo silvestre y cuando una cepa en la cual la actividad de la enzima está disminuida se obtiene por modificación utilizando técnicas de gen recombinante o •10 similares, la actividad intracelular de la enzima es menor que la de la cepa antes de la modificación. Los L-aminoácidos que se pueden producir al cultivar bacterias Methylophilus que tienen capacidad productora de L- aminoácidos se obtienen como se describe en lo anterior en un medio 15 para producir L-aminoácidos acumulados en el cultivo y el recolectar los L-aminoácidos del cultivo. Las células bacterianas de bacterias Methylophilus con un • contenido aumentado de L-aminoácidos en comparación con las cepas silvestres de bacterias Methylophilus se pueden elaborar al cultivar 20 bacterias Methylophilus que tengan capacidad para producir L- aminoácidos en un medio para producir y acumular L-aminoácidos en células bacterianas de la bacteria. -jAtjiÁjt Í? *. AA ~-.- I -Jbl?. *^*.

Los microorganismos utilizados para la presente invención se pueden cultivar por métodos habitualmente utilizados para cultivar microorganismos que tengan propiedades de asimilación de metanol. El P medio utilizado para la presente invención puede ser un medio natural o 5 sintético en la medida en que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y otros constituyentes orgánicos en cantidades en trazas, según se requiera. Mediante la utilización de metanol como una fuente principal de carbono, se pueden prepara bajo costo L-aminoácidos. Cuando se ^fc10 utiliza metanol como una fuente principal de carbono, habitualmente se agrega a un medio en una cantidad de 0.001 a 30%. Como la fuente de nitrógeno, se utiliza sulfato de amonio o similar al agregarlo al medio. Además de esto, habitualmente se agregan cantidades pequeñas de constituyentes en cantidades en trazas tales como fosfato de potasio, 15 fosfato de sodio, sulfato de magnesio, sulfato ferroso y sulfato de manganeso. El cultivo habitualmente se realiza bajo una condición aeróbica obtenida, por ejemplo, por agitación o mezclado para aireación, con un pH de 5 a 9 y una temperatura de 20 a 45°C, y 20 habitualmente se completa en las siguientes 24 a 120 horas. La recolección de L-aminoácidos del cultivo se puede llevar a cabo habitualmente mediante una combinación de métodos conocidos i. j **- * A.. kl%¿ - ¡ . ík -.,*..... , ..-...&**... . . *¿^ ... -...-^-. ...^... -?**.. -^ fuf- f rf[ tales como los que utilizan resinas de intercambio iónico, precipitación y otros. Además, se pueden separar células de bacteria f Methylophilus del medio por métodos habituales para separar células 5 microbianas. <2> Gen de la presente invención El ADN de la presente invención es un gen el cual codifica * 10 para una de las enzimas, aspartocinasa (a continuación abreviado también como "AK"), ácido aspártco semialdehído deshidrogenasa (a continuación también abreviado como "ASD"), dihidrodipicolinato sintasa (a continuación también abreviado como "DDPS"), dihidrodipicolinato reductasa (a continuación también abreviado como 15 "DDPR"), y diaminopimelato descarboxilasa (a continuación también abreviado como "DPDC") derivado de Methylophilus methylotrophus. El ADN de la presente invención se puede obtener mediante, por ejemplo, transformación de una cepa mutante de un microorganismo deficiente en AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC 20 utilizando una biblioteca de genes de Methylophilus methylotrophus, y al seleccionar una clona en la cual se recupera auxotrofía. Se puede producir como sigue una biblioteca de genes de Methylophilus methylotrophus, por ejemplo. En primer lugar, se prepara I .Í.Á i .A*-t...

ADN cromosómico total de una cepa silvestre de Methylophilus methylotrophus, por ejemplo, la Methylophilus methylotrophus AS1 cepa (NCIMB10515), por el método de Saito et al. (Saito, H. y Miura, K., Biochem. Biophys. Acta 72, 19-629, (1963)) o similar, y se digiere 5 parcialmente con una enzima de restricción adecuada, por ejemplo Sau3A\ o Alu\, para obtener una mezcla de varios fragmentos. Al controlar el grado de digestión mediante el ajuste del tiempo de reacción de digestión y similar, se puede utilizar una amplia gama de enzimas de restricción. k10 Subsecuentemente, los fragmentos de ADN cromosómico digeridos se ligan a ADN vector repicable autónomamente en células de Escherichia coli para producir ADN recombinante. Específicamente, se permite que una enzima de restricción que produce la misma secuencia nucleotídica terminal que la producida por la enzima de restricción 15 utilizada para la digestión de ADN cromosómico, que actúe sobre el ADN vector para digerir completamente y separa el vector. Después, la mezcla de los fragmentos de ADN cromosómicos, y el ADN vector digerido y separado se mezcla, y se permite que actúe sobre la mezcla una ligasa, preferiblemente T4 ADN ligasa para obtener ADN 20 recombinante. Se puede obtener una solución de biblioteca de genes al transformar Escherichia coli, por ejemplo, Escherichia coli JM 109 cepa o similar utilizando el ADN recombinante obtenido, y al preparar ADN recombinante del caldo de cultivo del transformante. Esta transformación se puede llevar a cabo por el método de D.M. Morrison (Methods ¡n Enzymology 68, 326 (1979)), el método para tratar células fl receptoras con cloruro de calcio de manera que se incremente la 5 permeabilidad de ADN (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) y así sucesivamente. En los ejemplos que se mencionan en lo siguiente se utiliza electroporación. Como ejemplos del vector mencionado antes, se pueden mencionar pUC19, pUC18, pUC1 18, pUC1 19, pBR322, pHSG299, A10 pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW1 19, pMW 1 18, pMW219, pMW218, pSTV28, pSTV29 y así sucesivamente. También se pueden utilizar vectores de fago. Puesto que pUC1 18 y pUC1 19 contienen un gen de resistencia a ampicilina y pSTV28 y pSTV29 contienen genes de resistencia a cloramfenicol, por ejemplo, 15 únicamente los transformantes que albergan un vector o un ADN recombinante pueden crecer mediante la utilización de un medio de contenga ampicilina o cloramfenicol. Como el método para cultivar los transformantes y recolectar ADN recombinante de células bacterianas, se puede 20 mencionar el método de SDS alcalino y similar. Una cepa microbiana mutante deficiente en AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC se transforma mediante la utilización de una solución de biblioteca de gen de Methylophilus methylotrophus, a a^ rtAt— «a- 4* -1 - ,¡ obtenida como se describe antes, y se seleccionan clonas cuya auxotrofía se recupera. Los ejemplos de una cepa microbiana mutante deficiente en if AK incluyen E. coli deficiente en GT3, en tres clases de genes que 5 codifican para AK (thrA, metLM, lysC). Los ejemplos de una cepa microbiana mutante deficiente en ASD incluyen E. coli Hfr3000 U482 (CGSC cepa 5801 ). Los ejemplos de una cepa microbiana mutante deficiente en DDPS incluyen E. coli AT997 (CGSC cepa 4547), Los ejemplos de una cepa microbiana mutante deficiente en DDPR incluyen A10 E. coli AT 999 (CGSC cepa 4549). Los ejemplos de una cepa microbiana mutante deficiente en DPDC incluyen E. coli AT2453 (CGSC cepa 4505). Estas cepas mutantes se pueden obtener de E. coli Genetic Stock Center (the Yale University, Department fo Biology, Osborn Memorial Labs., P.O. Box 6666, New Haven 0651 1 -7444, Connecticut, 15 E.U.A.). Aunque la totalidad de las cepas mutantes mencionadas ^ antes no pueden crecer en medio mínimo M9, las cepas transformantes las cuales contienen un gen que codifica para AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC pueden crecer en medio mínimo M9 debido a que estos genes 20 funcionan en los transformantes. Por lo tanto, mediante selección de las cepas transformantes que pueden crecer en medio mínimo y recolección del ADN recombinante de las cepas, se pueden obtener fragmentos de ADN que contengan un gen que codifique para cada enzima. E. coli AT999 (CGSC cepa 4549) muestra una velocidad de crecimiento extremadamente baja incluso en un medio completo tal como el medio L cuando no se agrega al medio ácido diaminopimélico. f Sin embargo, se puede observar crecimiento normal para sus cepas 5 transformantes las cuales contienen un gen que codifica para DDPR derivado de Methylophilus methylotrophus, debido a la función del gen. Por lo tanto, una cepa transformante que contiene un gen que codifica para DDPR también se puede obtener al seleccionar una cepa transformante que normalmente crece en medio L. •10 Al extraer un fragmento de ADN insertado del ADN recombinante obtenido y determinar su secuencia nucleotídica, se puede determinar una secuencia de aminoácidos de cada enzima y la secuencia de nucléotidos del gen que codifica para la misma. El gen que codifica para AK de la presente invención (a 15 continuación también denominado como "ask") codifica para AK el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6 que muestra en la lista de secuencias. Como un ejemplo específico del gen ask, se puede mencionar un ADN que tiene la secuencia de nucléotidos la cual consiste de los nucléotidos de 20 la SECUENCIA DE I DENTI FICACIÓN NO: 5. El gen ask de la presente invención puede tener una secuencia en la cual el codón que corresponde a cada uno de los aminoácidos es sustituido con un codón equivalente en la medida en que codifique para la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 6. El gen el cual codifica para ASD de la presente invención (a continuación también denominado como "asd") codifica para ASD el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTI FICACIÓN NO: 8 que se muestra en la lista de secuencias. Como un ejemplo específico del gen asd, se puede mencionar ADN el cual contiene la secuencia de nucléotidos que consiste de los nucléotidos de los nucléotidos números 98-1207 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7. El gen asd de la presente invención puede tener una secuencia en la cual el codón que corresponde a cada u no de los aminoácidos se sustituye con un codón equivalente en la medida en que codifique para la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8. El gen que codifica para DDPS de la presente invención (a continuación denominado también como "dapA") codifica para DDPS el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10 que se muestra en la lista de secuencias. Como un ejemplo específico del gen dapA, se puede mencionar un ADN el cual tiene la secuencia nucleotídica que consiste de los nucléotidos de los números de nucléotido 1268-2155 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9. El gen dapA de la presente invención puede tener una secuencia en la cual un codón que corresponde para cada uno de los aminoácidos se sustituye con un codón equivalente en la medida en que codifica para la misma secuencia de aminoácidos que la f secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 10. El gen el cual codifica para DDPR de la presente invención (a continuación denominado también como "dapB") codifica para DDPR el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12 que se muestra en la lista de secuencias. •^0 Como un ejemplo específico del gen dapB, se puede mencionar un ADN el cual tiene la secuencia nucleotídica que consiste de los nucléotidos de los números de nucléotido 2080-2883 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 1. El gen dapB de la presente invención puede tener una secuencia en la cual el codón que corresponde a cada u no de 15 los aminoácidos se sustituye con un codón equivalente en la medida en que codifica para la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12. • El gen que codifica para DPDC de la presente invención (a continuación denominado también como "lysA") codifica para DPDC el 20 cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14 que se muestra en la lista de secuencias. Como un ejemplo específico del gen lysA, se puede mencionar un ADN el cual tiene la secuencia de nucléotidos que consiste de los nucléotidos de los números de nucléotido 751 -1995 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13. El gen lysA de la presente invención puede tener una secuencia en la cual el codón que corresponde a cada uno de los aminoácidos se sustituye con el codón equivalente en la 5 medida en que codifique para la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 14. El gen para cada enzima de la presente invención puede tener una secuencia de aminoácidos que corresponda a cada secuencia lO de aminoácidos de las SECUENCIA DE IDENTI FICACIÓN NO: 6, 8, 10, 12 o 14 incluyendo sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y puede codificar una proteína que tenga actividad de AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC. La expresión "uno o varios" utilizada en la presente preferiblemente significa un número de 15 1 a 10, de manera más preferible un número de 1 a 5, y de manera más preferible un número de 1 a 2. El ADN el cual codifica para sustancialmente la misma • proteína que AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC tales como las mencionadas antes se puede obtener al modificar cada secuencia 20 nucleotídica de manera que la secuencia de aminoácidos pueda contener sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de un residuo o residuos aminoácidos en un sitio particular, por ejemplo, mediante mutagénesis específica de sitio. Tal ADN modificado, como se menciona en lo anterior, también se puede obtener por un tratamiento de mutagénesis convencional. Los ejemplos del tratamiento de mutagénesis incluyen el tratamiento in vitro de ADN que codifica para • AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC con hidroxilamina o similar, el 5 tratamiento de un microorganismo tal como una bacteria Escherichia que contiene un gen que codifica para AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC por irradiación UV o con agentes de mutagénesis utilizados para tratamientos de mutagénesis habitual tal como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) y ácido nitroso. ^MO La sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de nucléotidos mencionada en lo anterior incluye mutaciones que se presentan de manera natural (mutante o variante), tales como las que se observan dependiendo de las diferencias entre especies o cepas de microorganismos que contienen AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC y así 15 sucesivamente. El ADN el cual codifica para sustancialmente la misma f proteína que AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC se puede obtener al permitir la expresión de un ADN que tenga tal mutación como se menciona en lo anterior en una célula adecuada, y al examinar la 20 actividad de AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC del producto de expresión. El ADN el cual codifica para sustancialmente la misma proteína como AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC también se puede obtener por aislamiento de los ADN que codifican para AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC los cuales tienen mutaciones o células que contienen cada uno de ellos, un ADN hibridizable con una sonda que contiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia de nucléotidos de f los nucléotidos números 510-1736 de la SECUENCIA DE 5 IDENTIFICACIÓN NO: 5, una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 98-1207 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7, una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 1268-2155 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9, una ¿10 secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 2080-2883 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO. 11 , o una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 751 -1995 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13, o una parte de aquellas 15 secuencias nucleotídicas bajo condición rigurosa, y que codifican para una proteína que tiene actividad de AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC. En la presente especificación, el hecho de tener una secuencia • nucleotídica o una parte de la misma significa que se tiene la secuencia nucleotídica o parte de la misma, o un nucléotido complementario a la 20 misma. El término "condición rigurosa" como se utiliza en la presente significa una condición que permite la formación del denominado híbrido específico y no permite la formación de híbridos no Í??mAát ?«- ?.ri*¿ , ¡ -,.„ . . -* -.^V.**^. - *.,*.*., ....^,,.--,. - S. *...**.* , .**.-*..*.*-. ... .*..».. = *. . .. ... .. .... ... .. específicos. Esta condición puede variar en base en la secuencia nucleotídica y la longitud de la sonda. Sin embargo, puede ser por ejemplo una condición que permite la hibridación de ADN altamente fß homólogo tal como ADN que tiene homología de 40% o superior, pero 5 no permite la hibridación de ADN de homología inferior a la definida antes, o una condición que permite la hibridación bajo una condición de lavado de hibridación Southern habitual, de una temperatura de 60° y concentraciones salinas que corresponden a 1 x SSC y SDS 0.1 %, preferiblemente 0.1 x SSC y SDS 0.1 %. ílO Una secuencia parcial de cada gen también se puede • utilizar como la sonda. Tal sonda se puede producir por PCR (reacción en cadena de polimerasa) utilizando oligonucléotidos producidos en base en la secuencia nucleotídica de cada gen como cebadores y un fragmento de ADN que contiene cada gen como una plantilla. Cuando 15 se utiliza como la sonda un fragmento de ADN que tiene una longitud de aproximadamente 300 pb, la condición de lavado para hibridación puede ser, por ejemplo, 50°C, 2 x SSC y SDS 0.1 %. Los genes que hibridizan bajo tal condición como se menciona en lo anterior también incluyen aquellos que tienen un codón 20 de detención que se presenta en su secuencia y aquellos que codifican para una enzima que ya no tiene su actividad debido a una mutación del centro activo. Sin embargo, tales genes se pueden eliminar fácilmente al ligar los genes a un vector de expresión de actividad ltklA? i Á. itá>l*.L . <»<»-. *.*¿ ?**?..*~U**Í*--. - r. ?. . <... „., .A***,* -tAAa . disponible comercialmente, y medir la actividad de AK, ASD, DDPS, DDPR o DPDC. Puesto que las secuencias nucleotídicas de los genes que f codifican para AK, ASD, DDPS, DDPR y DPDC derivados de 5 Methylophilus methylotrophus, se muestran por la presente invención, se pueden obtener secuencias de ADN las cuales codifican para AK, ASD, DDPS, DDPR y DPDC a partir de la biblioteca de genes de ') Methylophilus methylotrophus, por hibridación utilizando sondas oligonucleotídicas producidas en base en las secuencias. Además, las ^KIO secuencias de ADN las cuales codifican para estas enzimas también se pueden obtener al amplificarlas a partir del ADN cromosómico de Methylophilus methylotrophus por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos en base en las secuencias nucleotídicas mencionadas antes. 15 Los genes mencionados antes pueden ser utilizados adecuadamente para mejorar la capacidad de producción de L- lisina de las bacterias Methylophilus.

EJEMPLOS La presente invención se explicará específicamente de • manera adicional con referencia a los siguientes ejemplos mencionados posteriormente. Los reactivos utilizados se obtuvieron de Wako Puré Chemicals de Nakarai Tesque, a menos que se indique de otra manera. Las composiciones de los medios utilizados en cada ejemplo se muestran a continuación. Se ajusta el pH con NaOH o con HCl para ¿10 todos los medios. • (L medio) Bacto triptona (DIFCO) 10 g/l 15 Extracto de levadura (DI FCO) 5 g/l NaCI 5 g/l [Esterilizado por vapor a 120°C durante 20 minutos] • (Medio agar L) 20 Medio L Bacto agar (DI FCO) 15 g/l [Esterilizado por vapor a 120°C durante 20 minutos] (Medio SOC) Bacto triptona (DI FCO) 20 g/l Extracto de levadura (DIFCO) 5 g/l NaCI 10 mM Kcl 2.5 mM MgSO4 10 mM MgCI2 10 mM Glucosa 20 mM [Los constituyentes, excepto para la solución de magnesio y A10 glucosa, se esterilizan con vapor (120°C, 20 minutos), y después la solución concentrada de magnesio 2 M (1 M MgSO4) 1 M MgCI2) y la solución de glucosa 2 M, soluciones las cuales se han hecho pasar a través de un filtro de 0.22 µm, se agregan al mismo, y la mezcla se hace pasar a través de un filtro de 0.22 µm nuevamente]. 15 (Medio 121 M1 ) • K2HPO4 1 .2 g/l 20 NaCI 0.1 g/l (NH4) S04 0.5 g/l MgSO4»7H2O 0.2 g/l CaCI2«6H2O 0.05 g/l t ,?..í*i r* ?, .. ¿Í-'?,.-. Í -* ?kkLí.*-. . -Í..-Í..Í.Í ?. , FeCI3»6H2O 1 .0 mg/l MnS04»5H2O 10 µg/l ZnSO4*»7H2O 70 µg/l NaMoO4*2H2O 10 µg/l CoCI2»6H2O 5 µg/l Metanol 1 % (vol/vol), pH 7.0 [Los constituyentes, excepto el metanol, se esterilizan por S§P0 vapor a 121 °C durante 15 minutos. Después de que los constituyentes se enfrían lo suficiente, se agrega metanol].

(Composición del medio de producción 121 ) 15 Metanol 2% Fosfato dipotásico 0.12% Fosfato de potasio 0.62% Cloruro de calcio hexahidratado 0.005% Sulfato de magnesio heptahidratado 0.02% 20 Cloruro de sodio 0.01 % Cloruro férrico hexahidratado 1 .0 mg/l Sulfato de amonio 0.3% Sulfato cúprico pentahidratado 5 µg/l Sulfato manganoso pentahidratado 10 µg/l Molibdato de sodio dihidratado 10 µg/l Acido bórico 10 µg/l • Sulfato de zinc heptahidratado 70 µg/l Cloruro cobaltoso hexahidratado 5 µg/l Carbonato de calcio (Kanto Kagaku) 3% (pH 7.0) (Medio de agar 121 M 1 ) • 0 Medio 121 M1 Bacto agar (DI FCO) 15 g/l [Los constituyentes, excepto el metanol, se esterilizan por vapor a 121 °C durante 15 minutos. Después de que los constituyentes 15 se enfrían lo suficiente, se agrega metanol].

(Medio mínimo M9) Na2HPO4«12H2O 16 g/l KH2PO4 3 g/l 20 NaCI 0.5 g/l NH4CI 1 g/l MgSO4»7H2O 246.48 mg/l Glucosa 2 g/l pH 7.0 [MgSO y la glucosa se esterilizan por separado (120°C, 20 minutos) y se agregan. Se agrega una cantidad adecuada de f aminoácidos y vitaminas, según se requiera]. 5 (Medio agar mínimo M9) Medio mínimo M9 Bacto agar (DIFCO) 15 g/l Eiemplo 1 0 • Creación de la bacteria (1 ) productora de L-lisina (1 ) Introducción de lysC mutante y dapA mutante en bacteria Methylophilus. Se introduce lysC mutante y dapA mutante dentro de 15 bacteria Methylophilus mediante la utillización del plásmido conocido RSFD80 (véase WO95/16042) que lo contiene. RSFD80 es un plásmido f pVIC40 (Publicación I nternacional WO90/04636, Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) No. 3-501682/1991 ) derivada de un plásmido vector de espectro hospedador amplio pAYC32 20 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D. , Plasmid, 16, 161 -167, (1986)), el cual es un derivado de RSF1010, en el cual se localizan dapA mutante y lysC mutante derivado de E. coli en este orden, corriente abajo del promotor (tetP) del gen de resistencia a tetraciclina de pVIC40 de manera que las direcciones de transcripción de los genes habitualmente son con respecto a tetP. DapA mutante codifica para DDPS mutante en el cual el residuo 1 18-histidina se sustituye con el f residuo tirosina. LysC mutante codifica para el mutante AKI I I en el cual 5 el residuo 352-treonina se sustituye con un residuo isoleucina. Se construye RSFD80 como sigue. DapA mutante en el plásmido pdapAS24 se liga a pVIC40 en una posición hacia el extremo 3' del promotor del gen de resistencia a tetraciclina para obtener RSF24P, como se muestra en la figura 1 . Después, se prepara el A10 plásmido RSFD80 el cual tiene dapA mutante y lysC mutante a partir de RSF24P y pLLC*80 que contiene lysC mutante, como se muestra en la figura 2. Esto es, aunque pVIC40 contiene un operón treonina, este operón treonina se sustituye con un fragmento de ADN que contiene dapA mutante y un fragmento de ADN que contiene lysC mutante en 15 RSFD80. E. coli JM109 transformado con el plásmido RSFD80 se designa como AJ 12396, y se deposita ante National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal 20 305-8566, 1 -3 Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el 28 de Octubre de 1993 y recibe el número de acceso de FERM P-13936, y se transfiere a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 1 de Noviembre de 1994, y recibe el número de acceso de FERM P-4859. Se cultiva E. coli cepa AJ1239 en 30 ml de medio LB que contiene 20 mg/l de estreptomicina a 30°C durante 12 horas, y el plásmido RSFD80 se purifica de las células que se obtienen mediante la utilización del sistema de purificación de ADN WizardMR Plus Midipreps (vendido por Promega). El plásmido RSFD80 producido como se describe antes se introduce dentro de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 (NCIMB10515) por electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Como un control, se suprime una región de ADN que codifica para el operón treonina a partir del plásmido pVIC40 utilizado para producir el plásmido RSFD80 para producir un plásmido pRS que comprende únicamente la región vector (véase la Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) No. 3-501682/1991 ), y se introduce el plásmido pRS dentro de la cepa AS1 de la misma manera que la utilizada para RSFD80. (2) Actividad AKI I I de la bacteria Methylophilus que contiene lysC mutante y dapA mutante derivada de E. coli. Se preparan extractos libres de células de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 que contiene el plásmido RSFD80 (también denominado como "AS 1 /RSFD80" en lo siguiente) y Methylophilus methylotrophus cepa AS1 que contiene el plásmido pRS (también « ^fe-™* denominado como "AS1 /pRS" en lo siguiente), y se mide la actividad AK. Se preparan como sigue los extractos libres de células (soluciones de enzima cruda). Cada una de las cepas AS1 /RSFD80 y AS1 /pRS se f inocula a medio de producción 121 de la composición anterior que 5 contiene mg/l de estreptomicina, cultivado a 37°C durante 34 horas con agitación, y después se remueve el carbonato de calcio y se cosechan las células. Las células bacterianas que se obtienen como se describe en lo anterior se lavan con Kcl 0.2% bajo una condición de 0°C, se - ?O suspenden en amortiguador de fosfato de potasio 20 mM (pH 7) que contiene MgSO4 10 mM, (NH )2SO4 0.8 M y ß-mercaptoetanol 0.03 M, y se rompen por sonicación (0°C, 200 W, 10 minutos). La suspensión de células sonicadas se centrifuga a 33,000 rpm durante 30 minutos bajo una condición de 0°C, y el sobrenadante se separa. Al sobrenadante se 15 le agrega sulfato de amonio hasta 80% de saturación, y la mezcla se deja a 0°C durante 1 hora y se centrifuga. El sedimento se disuelve en amortiguador de fosfato de potasio 20 mM (pH 7) que contiene MgS?4, • 10 mM, (NH4)2SO4 0.8 M y ß-mercaptoetanol 0.03 M. La medición de actividad de AK se realiza de acuerdo con el 20 método de Stadtman (Stadtman, E.R. , Cohén, G.N., LeBras, G., y Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. , 236, 2033 (1961 )). Esto es, se incuba a 30°C durante 45 minutos una solución de reacción de la siguiente composición, y el desarrollo de color es causado al agregar una solución de FeCI3 (Hcl 2.8N: 0.4 ml, TCA 12%: 0.4 ml, FeCI3*6H2O 5%/Hcl 0.1 N : 0.7 ml). La solución de reacción se centrifuga y se mide la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. La actividad se representa en términos de la cantidad de ácido hidroxámico producido en 1 minuto 5 (1 U = 1 µmol/minuto). El coeficiente de extinción molar se establece que es de 600. La solución de reacción que no contiene aspartato de potasio se utiliza como un blanco. Cuando se mide la actividad enzimática, se agrega L-lisina a la solución de reacción ensimática a diversas concentraciones para examinar el grado de inhibición por L- ¡0 lisina. Los resultados se muestran en el cuadro 1 .

(Composición de la solución de reacción) Mezcla de reacción *1 0.3 ml 15 Solución de hidroxilamina *2 0.2 ml Aspartato de potasio 0.1 M (pH 7.0) 0.2 ml Solución de enzima 0.1 ml • Agua (resto) Total, 1 ml *1 : Tris-HCl 1 M (pH 8.1 ): 9 ml, MgSO4 0.3 M: 0.5 ml y ATP 20 0.2 M (pH 7.0): 5 ml *2: solución de hidroxilamina 8 M neutralizada con KOH inmediatamente antes de su uso.

Cuadro 1 • '1 : nmol/minuto/mg de proteína '2: Relación de retención de actividad en presencia de L-lisina 5 mM Como se muestra en el cuadro 1 , la actividad de AK se incrementan aproximadamente 1 .7 veces mediante la introducción del plásmido RSFD80. Además, se confirma que la inhibición por L-lisina se insensibiliza completamente en AK derivado de E. coli que es codificado por el plásmido RSFD80. Además, se encuentra que AK que es retenido originalmente por la cepa AS1 no es inhibido por L-lisina 15 solo. Los inventores de la presente invención han descubierto que AK derivado de la cepa AS 1 se inhibe en 100% cuando están presentes en la solución de reacción 2 mM de cada uno de L-lisina y L-treonina • (inhibición concertada). 20 (3) Producción de L-lisina por bacteria Methylophilus que contiene lysC mutante y dapA mutante, derivado de E. coli Posteriormente, la cepa AS1 /RSFD80 y la cepa AS1 /pRS se inoculan al medio de producción 121 que contiene 20 mg/l de estreptomicina y se cultivan a 37°C durante 34 horas, con agitación. Después de que se completa el cultivo, las células bacterianas y el carbonato de calcio se remueven por centrifugación, y se mide la f concentración de L-lisina en el sobrenadante de cultivo por el 5 analizador de aminoácidos (JASCO Corporation [Nihon Bunko], cromatografía líquida de alta resolución). Los resultados se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 2 0 • Eiemplo 2 15 Creación de bacteria (2) productora de L-lisina (1 ) Introducción de la región promotora tac dentro del vector de espectro de hospedador amplio Para producir una gran cantidad de enzima involucrada en 20 la biosíntesis de L-lisina (Lys) en Methylophilus methylotrophus, se utiliza el promotor rae para expresión del gen de la enzima objetivo. El promotor se utiliza con frecuencia en E. coli. e&uüii**» * ** »*. , fJL?Ú j^^^ _ ^ ^ _a _ .- -.**i..^. i;*-* ,. ?* ....& Í?.? - . *. - Ai..»: .jÉtAsi -i i La región promotora rae se obtiene por amplificación a través de PCR utilizando ADN de pKK233-3 (Pharmacia) como una plantilla, fragmentos ADN que tienen secuencias nucleotídicas de las f SECUENCIA DE I DENTIFICACIÓN NO: 15 y 16 como cebadores, y ADN 5 polimerasa resistente al calor. La PCR se realiza con un ciclo de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos, lo cual se repite 30 veces. Después el fragmento de ADN amplificado se colecta y se trata con enzimas de restricción EcoRI y Psfl . Por otra parte, también se digiere un vector de espectro de ^10 hospedador amplio pRS (véase la Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) No. 3-501682/1991 ) con las mismas enzimas de restricción, y el fragmento de ADN mencionado antes, el cual contiene la región promotora tac se introduce dentro de la parte terminal de digestión por enzima de restricción para construir pRS-fac. 15 (2) Preparación del gen dapA (gen para dihidrodipicolinato sintasa) del plásmido de expresión pRS-dapA24 y el gen lysC (gen para • aspartocinasa) del plásmido de expresión pRS-lysC80 Un gen mutante {dapA *24) que codifica para 20 dihidrodipicolinato sintasa, cuya inhibición por retroalimentación para la actividad de enzima por Lys es insensibilizado parcialmente, se introduce en el plásmido pRS-tac, el cual se prepara por el método que se describe en el inciso (1 ) anterior.

En primer lugar, se obtiene la región del gen dapA *24 por amplificación a través de PCR utilizando ADN de RSFD80 (véase ejemplo 1 ) como una plantilla, y fragmentos ADN que tienen las f secuencias nucleotídicas de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN 5 NOS: 17 y 18 como cebadores. La PCR se realiza con un ciclo de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 90 segundos, lo cual se repite 30 veces. Después, el fragmento se trata con enzimas de restricción Sse8387l y Xba\ para preparar un fragmento de gen dapA *24 que corresponde a la parte terminal separada. Por otra •¡10 parte, también se trata pRS-tac con Sse8387l y se digiere parcialmente con Xbal de la misma manera a lo descrito antes. A este plásmido digerido, se liga el fragmento del gen dapA *24 mencionado antes mediante la utilización de T4 ligasa para obtener pRS.dapA24. De manera similar, el gen (lysC*80) que codifica para 15 aspartocinasa cuya inhibición de retroalimentación para la actividad de la enzima por Lys se sinsibiliza parcialmente, se obtiene por PCR utilizando ADN de RSFD80 como una plantilla, y fragmentos ADN que tienen las secuencias de nucléotidos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 19 y 20 como cebadores. Se realiza la PCR con 20 un ciclo de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72° durante 90 segundos, lo cual se repite 30 veces. Después, el fragmento ADN que se obtiene se trata con enzimas de restricción Sse8387\ y Sa l . Por otra parte, el vector pRS-tac también se trata con Sse8387\ y -- . - ' - -,-í¿**milm*? *~i É i*Áá.^l?*??áM Sapl . A este plásmido digerido, se liga el fragmento del gen lysC*80 mencionado antes mediante la utilización de T4 ligasa para obtener pRS-lysC80. 5 (3) Introducción de pRS-dapA24 o pRS-lysC80 dentro de Methylophilus methylotrophus y evaluación del cultivo Cada uno de pRS-dapA24 y pRS-lysC80 obtenido como se describe antes se introduce en Methylophilus methylotrophus, cepa AS1 (NCI MB10515) por electroporación para obtener AS1 /pRS-dapA24 y ^ AS 1/pRS-lysC80, respectivamente. Cada cepa se inocula a medio de producción 121 que contiene 20 mg/l de estreptomicina y se cultiva a 37°C durante 48 horas, con agitación. Como una cepa control, también se cultiva de una manera similar la cepa AS1 que alberga pRS. Después de que se completa el cultivo, las células y el carbonato de 15 calcio se remueven por centrifugación, y se mide la concentración de L- lisina en el sobrenadante de cultivo por una analizador de aminoácidos (JASCO Corporation [Nihon Bunko], cromatografía líquida de alta • resolución). Los resultados se muestran en el Cuadro 3. 20 Cuadro 3 -.aAA. Bat*feM.¡¿.. - *Mtfa*u"fct j"ált^ ^ ^..J¿*** ?A.M ,t..*.

Eiemplo 3 Creación de la bacteria productora de L-lisina (3) f Se inocula Methylophilus methylotrophus cepa AS1 5 (NCIMB10515) a medio 121 M 1 y se cultiva a 37°C durante 15 horas.

Las células bacterianas que se obtienen se tratan con NTG de una manera convencional (concentración de NTG: 100 mg/l, 37°C, 5 minutos) y se difunden en medio de agar 121 M 1 que contiene 7 g/l de S-(2-aminoetil)-cisteína (AEC) y 3 g/l de L-treonina. Las células se ^^0 cultivan a 37°C durante 2 a 8 días, y las colonias que se forman se toman para obtener cepas resistentes a AEC. Las cepas resistentes a AEC mencionadas antes se inoculan a medio de producción 121 , y se cultivan a 37°C durante 38 horas bajo una condición aeróbica. Después de que se completa el 15 cultivo, las células y el carbonato de calcio se remueven del medio por centrifugación y se mide la concentración de L-lisina en el sobrenadante de cultivo por un analizador de aminoácidos (JASCO • Corporation [Nihon Bunko] , cromatografía líquida de alta resolución). Se selecciona una cepa que muestra capacidad mejorada de 20 producción de L-lisina en comparación con la cepa parental, y se designa como Methylophilus methylotrophus cepa AR-166. Las cantidades de producción de L-lisina de la cepa parental (cepa AS 1 ) y de la cepa AR-166 se muestran en el Cuadro 4. ..-im.

Cuadro 4 • A Methylophilus methylotrophus cepa AR-166 se le proporciona un número privado de AJ13608, y se deposita ante el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and 0 Industry (código postal 305-8566, 1 -3 Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, • Ibaraki-ken, Japón) el 10 de Junio de 1999, y recibe el número de acceso FERM P-17416, y se transfiere a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 31 de Marzo del 2000 y recibie el número de acceso FERM BP-71 12. 15 Eiemplo 4 • Creación de la bacteria productora de L-treonina (1 ) Introducción del plásmido operón de treonina dentro de 20 la bacteria Methylophilus Un plásmido pVIC40 (Publicación Internacional WO90/04636, Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) No. 3-501682/1991 ) que contiene un operón treonina derivado de E. coli se introduce dentro de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 (NCIMB10515) por electroporación (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) para obtener la cepa AS 1 /pVIC40. Como un control, se obtiene pRS (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kohyo) 5 No. 3-501682/1991 ) que tiene únicamente la región vector, por supresión de la región de ADN que codifica para el operón treonina para el plásmido pVIC40, y se introduce dentro de la cepa AS 1 de la misma manera que la utilizada para pVIC40 para obtener la cepa AS1/pRS. k10 (2) Producción de L-treonina por bacteria Methylophilus que contiene operón treonina derivado de E. coli. Cada una de las cepas AS1 /pVIC40 y AS1 /pRS se inocula a medio de producción 121 que contiene 20 mg/l de estreptomicina, 1 g/l de L-valina y 1 g/l de L-leucina, y se cultiva a 37°C durante 50 horas, 15 con agitación. Después de que completa el cultivo, las células y el carbonato de calcio se remueven por centrifugación y se mide la concentración de L-treonina en el sobrenadante de cultivo por el analizador de aminoácidos (JASCO Corporation [Nihon Bunko], cromatografía líquida de alta resolución). Los resultados se muestran 20 en el Cuadro 5.

Cuadro 5 Eiemplo 5 Creación de la bacteria productora de aminoácido de cadena ramificada 0 Se inocula Methylophilus methylotrophus cepa AS1 • (NCIMB10515) a medio 121 M1 y se cultiva a 37°C durante 15 horas. Las células bacterianas que se obtienen se tratan con NTG de una manera convencional (concentración de NTG: 100 mg/l, 37°C, 5 minutos) y se difunden en medio de agar 121 M1 que contiene 0.5% de 15 casaminoácido (DIFCO). Se cultivan las células a 37°C durante 2 a 8 días y se permite que formen colonias. Se toman las colonias formadas y se inoculan en medio agar 121 M 1 y medio agar 121 M 1 que contiene • 0.5% de casaminoácido. Las cepas que muestran un mejor crecimiento en este último medio, en comparación con el medio anterior se 20 seleccionan como cepas auxotróficas de casaminoácido. De esta manera, se obtienen 9 cepas auxotróficas de casaminoácido con fuga a partir de cepa de 500 cepas tratadas con NTG. De estas cepas auxotróficas de casaminoácido, se obtiene una cepa que acumula más •- -"*-" L-valina, L-leucina y L-isoleucina en el medio, en comparación con su cepa parental. Esta cepa se desgina como Methylophilus methylotrophus cepa C138. 9 A Methylophilus methylotrophus cepa C138 se le 5 proporciona un número privado de AJ 13609 y se deposita en National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal 305-8566, 1 -3 Higashi 1 -chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japón) el 10 de Junio de 1999 y recibe el número de acceso de •0 FERM P-17417, y se transfirió a un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 31 de Marzo del 2000, y recibe el número de acceso de FERM BP-71 13. La cepa parental (cepa AS1 ) y la cepa C138 se inoculan a medio de producción 121 y se cultivan a 37°C durante 34 horas bajo 15 condiciones aeróbicas. Después de que se completa el cultivo se remuven las células y el carbonato de calcio del medio, por centrifugación y se miden las concentraciones de L-valina, L-leucina y • L-isoleucina en el sobrenadante del cultivo por el analizador de aminoácidos (JASCO Corporation [Nihon Bunko], cromatografía líquida 20 de alta resolución). Los resultados se muestran en el Cuadro 6.

Cuadro 6 • Eiemplo 6 Preparación de una biblioteca de ADN cromosómico de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 O (1 ) Preparación de ADN cromosómico de Methylophilus • methylotrophus cepa AS1 Se inocula un asa de platino de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 (NCIMB10515) a 5 ml de medio 121 M1 en un tubo de prueba, y se cultiva a 37°C durante la noche, con agitación. El 15 caldo de cultivo que se obtiene se inocula a 50 ml de medio 121 M 1 en un matraz Sakaguchi con un volumen de 500 ml en una cantidad de 1 % f y se cultiva a 37°C durante la noche, con agitación. Después, las células se cosechan por centrifugación y se suspenden en 50 ml de solución TEN (solución que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), EDTA 10 20 mM y NaCI 20 mM (pH 8.0)). Las células se recolectan por centrifugación y se suspenden nuevamente en 5 ml de solución TEN que contiene 5 mg/ml de lisozima y 10 µg/ml de RNaseA. La suspensión se mantiene a 37°C durante 30 minutos, y después se agrega td.ij. Aa. i aata.t i. „- j.-. proteinasa K y laurilsulfato de sodio a las concentraciones finales de 10 µg/ml y 0.5% (peso/vol), respectivamente. La suspensión se mantiene a 70°C durante 2 horas y después se agrega una cantidad igual de una solución saturada de 5 fenol (solución de fenol saturada con Tris-HCl 10 mM (pH 8.0)) y se mezcla. La suspensión se centrifuga y el sobrenadante se recolecta. Se agrega y se mezcla una cantidad igual de solución de fenol/cloroformo (fenol: cloroformo; alcohol isoamílico = 25:24: 1 ) y la mezcla se centrifuga, el sobrenadante se recolecta y se agrega a la misma una JÉ cantidad igual de solución de cloroformo (cloroformo: alcohol isoamílico = 24: 1 ) para repetir el mismo procedimiento de extracción. Al sobrenadante, se le agrega un volumen 1 /10 de acetato de sodio 3 M (pH 4.8) y 2.5 veces el volumen de etanol para precipitar el ADN cromosómico. Los precipitados se recolectan por centrifugación, se 15 lavan con etanol 70%, se secan bajo presión reducida y se disuelven en una cantidad adecuada de solución TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM f (pH 8.0)). (2) Preparación de la biblioteca de genes 20 Se permite que reaccionen una porción de 50 µl del ADN cromosómico (1 µg/µl) que se obtiene en el inciso (1 ) anterior, 20 µl de amortiguador H (Tris-HCl 500 mM, MgCI2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCI 1000 mM (pH 7.5)) y 8 unidades de una enzima de restricción I .L-Í.

Sa?/3AI (Takara Shuzo) a 37°C durante 10 minutos en un volumen total de 200 µl, y después se agrega 200 µl de la solución de fenol/cloroformo y se mezcla para detener la reacción. La mezcla de reacción se centrifuga y la capa superior se recolecta y se separa en un gel de agarosa 0.8%. El ADN que corresponde a 2 a 5 pares de kilobases (a continuación denominado como "kbp") se recolecta utilizando el sistema de extracción de gel rápido ConcertMR (equipo de recolección de ADN, GIBCO BRL Co.). De esta manera se obtienen 50 µl de una solución de ADN con tamaño fraccionado. Por otra parte, se permite que reaccionen 2.5 µg del plásmido pUC1 18 (Takara Shuzo), 2 µl de amortiguador K (Tris-HCl 200 mM, MgCI2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, Kcl 1000 mM (pH 8.5)) y 10 unidades de enzima de restricción BamH 1 (Takara Shuzo) a 37°C durante 2 horas en un volumen total de 20 µl, y después se agregan y se mezclan 20 unidades de fosfatasa alcalina de intestino delgado bovino (Takara Shuzo) y se permite que la mezcla reaccione durante 30 minutos adicionales. La mezcla de reacción se mezcla con una cantidad igual a la solución de fenol/cloroformo, y la mezcla se centrifuga. El sobrenadante se recolecta y se agrega al mismo una cantidad igual de la solución de cloroformo para repetir un procedimiento de extracción similar. Al sobrenadante se le agrega 1 /10 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 4.8) y 2.5 veces el volumen de etanol para precipitar ADN. El ADN se recolecta por centrifugación, se lava con etanol 70%, J.?-?,í.:?-* k ^- se seca bajo presión reducida y se disuelve en una cantidad adecuada de solución TE. Un producto de digestión Sa¿/3AI del ADN cromosómico f preparado como se describe antes y un producto de digestión BamHl de 5 pUC1 18 se ligan mediante la utilización del equipo de ligación ver. 2 (Takara Shuzo). A la mezcla de reacción se le agrega 1 /10 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 4.8) y 2.5 veces el volumen de etanol para precipitar ADN. El ADN se recolecta por centrifugación, se lava con etanol 70%, se seca bajo presión reducida y se disuelve en solución TE (solución de ligasa A). De la misma manera que en el procedimiento anterior, los fragmentos obtenidos por digestión parcial del ADN cromosómico con la enzima de restricción Alu\ (Takara Shuzo) y un producto de digestión Smal del plásmido pSTV29 (Takara Shuzo) se ligan (solución de ligasa 15 B). Se inocula un asa de platino de E. coli JM 109 a 5 ml de f medio L en un tubo de prueba, y se cultiva a 37°C durante la noche, con agitación. El caldo de cultivo que se obtiene se inocula a 50 ml de medio L en un matraz Sakaguchi de volumen de 500 ml en una cantidad 20 de 1 %, se cultiva a 37°C hasta que la DOßßo del cultivo se vuelve 0.5 a 0.6, y se enfría en hielo durante 15 minutos. Después las células se cosechan por centrifugación a 4°C. Las células se suspenden en 50 ml de agua enfriada con hielo y se centrifugan para lavar las células. Esta operación se repite una vez más, y las células se suspenden en 50 ml de solución de glicerol 10% enfriada con hielo y se centrifuga para lavar las células. Las células se suspenden en solución de glicerol 10% del mismo volumen que las células, y se dividen en alícuotas de 50 µl. A 5 las células en volumen 50 µl, 1 µl de solución de ligasa A o solución de lagasa A o solución de ligasa B preparada como en lo anterior se agrega. Después, la mezcla se coloca dentro de una cubeta especial (0.1 cm de anchura, enfriada preliminarmente con hielo) para un aparato de electroporación de BioRad. f Q El ajuste del aparato es de 1.8 kV y 25 µF, y el ajuste del controlador de pulso es de 200 ohms. La cubeta se monta en el aparato y se aplican pulsos a la misma. Inmediatamente después de la aplicación del pulso, se agrega a la misma 1 ml de medio SOC enfriado con hielo y la mezcla se transfiere a un tubo de ensayo esterilizado y se 15 cultiva a 37°C durante 1 hora con agitación. Cada caldo de cultivo celular se difunde en medio de agar L que contiene un antibiótico (100 ^ µg/ml de ampicilina cuando se utiliza solución de ligasa A, o 20 µg/ml de cloramfenicol cuando se utiliza solución de ligasa B), y se incuba a 37°C durante la noche. Las colonias que surgen de cada medio de agar 20 se raspan, se inoculan a 50 ml de medio L que contiene el antibiótico respectivo en un matraz Sakaguchi de 500 ml de volumen y se cultiva a 37°C durante 2 horas con agitación. El ADN plasmídico se extrae de cada caldo de cultivo por el método de SDS alcalino para formar la -¿-.-i* -.Jl.-*. *J*.Í. .*ii£?i.s,i¿e: biblioteca del gen de solución A y la biblioteca del gen de la solución B, respectivamente.

Eiemplo 7 5 Clonación del gen de biosíntesis de licina de Methylophilus methylotrophus cepa AS1 (1 ) Clonación de un gen que codifica para aspartocinasa (AK) E. coli deficiente en GT3 en los tres genes que codifican • para AK (thrA, metLM y lysC) se transforma con la biblioteca del gen de solución B por el mismo procedimiento de electroporación como se menciona antes. El medio SOC que tiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico se agrega a la solución de transformación, y se cultiva 15 a 37°C con agitación. Después, el caldo de cultivo se difunde en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y 20 µg/ml de f cloramfenicol para obtener colonias germinadas. Esto se duplica como una placa maestra a medio de agar M9 que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol, y el replicado se incuba a 37°C durante 2 a 3 días. El 20 hospedador no puede crecer en medio mínimo M9 que no contiene ácido diaminopimélico puesto que no tiene actividad de AK. En contraste, se espera que la cepa transformante que contiene el gen que i ? &.&, .?~ ÍÍ¿,?., -*.-**&, ¿£ k, . Í -t: codifica para AK derivada de Methylophilus methylotrophus pueda crecer en medio mínimo M9 debido a la función del gen. Dos transformantes de aproximadamente 3000 9 transformantes forman colonias en medio M9. Los plásmidos se extraen 5 de las colonias germinadas en medio M9 y se analiza. Como un resultado, se confirma la presencia de un fragmento insertado en los plásmidos. Los plásmidos se denominan como pMMASK-1 y pMMASK- 2, respectivamente. Mediante la utilización de estos plásmidos, se transforma nuevamente a E. coli GT3. Los transformantes obtenidos ?íO pueden crecer en medio mínimo M9. Además, el transformante el cual contiene cada uno de estos plásmidos se cultiva durante la noche en medio L que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol y las células se recolectan por centrifugación del caldo de cultivo. Los extractos libres de células se preparan al sonicar las células, y se mide la actividad de 15 AK de acuerdo con el método de Miyajima et al. (Journal of Biochemistry (Tokyo), vol. 63, 139-148 (1968)) (Fig. 3: pMMASK-1 , fk pMMASK-2). Además, una cepa GT3 que alberga el vector pSTV29 se cultiva similarmente en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y 20 µg/ml de cloramfenicol, y se mide la actividad AK 20 (figura 3: vector). Como un resultado, se observa un incremento en la actividad AK en dos de las clonas que contienen los fragmentos insertados en comparación con el transformante que alberga únicamente al vector. Por lo tanto, se confirma que el gen puede ser clonado en pSTV29 es un gen que codifica para AK derivado de Methylophilus methylotrophus. Este gen se denomina como ask. Se determina la secuencia nucleotídica del ADN del gen ask por el método didesoxi. Se encontró que pMMASK-1 y pMMASK-2 5 contienen un fragmento común. La secuencia nucleotídica del fragmento de ADN que contiene el gen ask derivado de Methylophilus methylotrophus se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5. Una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por la secuencia nucleotídica se muestra en las SECUENCIAS DE O IDENTI FICACIÓN NOS: 5 y 6. (2) Clonación del gen que codifica para ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa (ASD) Se transforma por electroporación E. coli Hfr3000 U482 5 (CGSC cepa 5081 ) deficiente en el gen asaí utilizando la solución de biblioteca de gen B de la misma manera a la descrita antes. A la solución de transformación, se le agrega medio SOC que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y la mezcla se cultiva a 37°C con agitación. Las células se cosechan por centrifugación. Las células se 0 lavan al suspenderlas en medio L y centrifugar la suspensión. La misma operación d# ¿avado se repite una vez más, y las células se suspenden en medio L. í*á*.í .?.I¿*í, ¡-.¿jíii- itJi? -*.--. -. - ^. ?*~ * *j . . . M. - . . x~,.j - *a-tJlat¿S,h±?b xlK. * , . t | -fjj¡f¡ |f j) [Htf)H Jjft_J[J||¿Jj Después, la suspensión se difunde en medio agar L que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol, y se incuba durante la noche a 37°C. El hospedador muestra crecimiento extremadamente lento en • medio L que no contiene ácido diaminopimélico puesto que carece del 5 gen asd. En contraste, se espera que se observe crecimiento normal para una cepa transformante la cual contiene el gen que codifica para ASD derivado de Methylophilus methylotrophus incluso en medio L debido a la función del gen. Además, E. coli hospedador no puede crecer en medio mínimo M9, pero una cepa transformante que contiene f O el gen que codifica para ASD derivado de Methyiophilus methylotrophus se espera que sea capaz de crecer en medio mínimo M9 debido a la función del gen. Por lo tanto, se toman colonias de los transformantes que normalmente crecen en medio L, se siembran por estrías y se cultivan en medio de agar M9. Como resultado, se observa crecimiento. 15 De esta manera, se confirma que el gen que codifica para ASD funciona en estas cepas transformantes, como se esperaba. Se extraen los plásmidos de 3 cepas transformantes germinadas en medio M9, y se confirma la presencia del fragmento insertado en los plásmidos. Los plásmidos se denominan como 20 pMMASD-1 , pMMASD-2 y PMASD-3, respectivamente. Cuando se transforma E. coli Hfr3000 U482 nuevamente mediante la utilización de estos plásmidos, cada transformante crece en medio mínimo M9. Además, cada transformante se cultiva durante la noche en medio L que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol, y las células se recolectan por centrifugación del caldo de cultivo. Las células se sonican para preparar una solución de enzima cruda, y se mide la actividad ASD de 9 acuerdo con el método de Boy et al. (Journal of Bacteriology, vol. 1 12 5 (1 ), 84-92 (1972)) (Figura 4: pMMASD-1 , pMMASD-2, pMMASD-3). Además, el hospedador que alberga al vector se cultiva similarmente en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diamino pimélico y 20 µg/ml de cloramfenicol, y se mide la actividad de ASD como un experimento control (figura 4: vector). Como un resultado, no se puede detectar la ff actividad enzimática para el transformante que alberga únicamente el vector, mientras que la actividad de ASD se puede detectar en tres de las clonas que tienen un fragmento insertado. Por lo tanto, se conforma que el gen obtenido es un gen que codifica para ASD derivado de Methylophilus methylotrophus (denominado como asd). 15 Se determina la secuencia de nucléotido de ADN del gen asd por el método didesoxi. Se encuentra que la totalidad de las tres f^ clonas obtenidas contienen un fragmento común. En la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7 se muestra la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN que contiene el gen asd derivado de Methylophilus 20 methylotrophus. En las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 7 y 8 se muestra una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por la secuencia nucleotídica. <s ? ***.Mt **l . „ L» . S - « .1, . a «»^tHt»«,_¿fc¿faj<r.^«jaj>»»- * _s iJh -ÉcJL í i i. (3) clonación del gen que codifica para dihidrodipicolinato sintasa (DDPS) Se transforma E. coli AT997 (CGSC cepa 4547) deficiente f en el gen dapA por el mismo procedimiento de electroporación utilizado 5 para la solución de biblioteca de gen A. A la solución de transformación, se le agrega medio SOC que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico, y la mezcla se cultiva a 37°C con agitación. Posteriormente, el caldo de cultivo se difunde en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y 100 µg/ml de ampicilina para f¡ obtener las colonias germinadas. Esto se replica como una placa maestra a medio de agar mínimo M9 que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y el replicado se incuba a 37°C durante 2 a 3 días. El huésped no puede crecer en medio mínimo M9 que no contenga ácido diaminopimélico puesto que está deficiente del gen dapA. En contraste, 15 se espera que una cepa transformante que contiene el gen que codifica para DDPS derivado de Methylophilus methylotrophus pueda crecer en fP medio mínimo M9 debido a la función de ese gen. Se extraen plásmidos de las colonias de dos cepas germinadas en medio M9, y se analizan. Como un resultado, se 20 confirma la presencia de un fragmento insertado en los plásmidos. Los plásmidos se denominan como pMMDAPA-1 y PMMDAPA-2, respectivamente. Cuando se transforma nuevamente E. coli AT997 utilizando estos plásmidos, cada transformante se hace crecer en medio mínimo M9. Además, cada transformante que contiene cada plásmido se cultiva durante la noche en medio L que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y las células se recolectan por centrifugación del caldo de cultivo. Las células se sonican para preparar un extracto celular, y se mide la actividad de DDPS de acuerdo con el método de Yugari et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 240, y p .4710 (1965)) (figura 5: pMMDAPA.1 , pMMDAPA.2). Además, el hospedador que alberga al vector se cultiva similarmente en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y 100 µg/ml de ampicilina, y se mide la actividad de DDPS con un experimento control (figura 5: vector). Como un resultado, no se puede detectar la actividad enzimática para el transformante que alberga únicamente al vector, mientras que se puede detectar actividad de DDPS en cada uno de los transformantes que albergan a los plásmidos que tienen el fragmento insertado. Por lo tanto, se confirma que el gen obtenido es un gen que codifica para DDPS derivado de Methylophilus methylotrophus (denominado como dap A). Se determina la secuencia nucleotídica de ADN del gen dapA por el método didesoxi. Se encuentra que dos de los fragmentos insertados contienen un fragmento común. En SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9 se muestra una secuencia nucleotídica del fragmento ADN que contiene el gen dapA derivado de Methylophilus methylotrophus. En las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 9 y 10 se muestra una secuencia de aminoácidos que se puede codificar por la secuencia nucleotídica. (4) clonación del gen que codifica para dihidrodipicolinato f reductasa (DDPR) 5 Se transforma E. coli AT999 (CGSC cepa 4549) deficiente en el gen dapB transformado por el mismo procedimiento de electroporación como se describe antes utilizando la solución de biblioteca de gen A. A la solución de transformación se le agrega medio SOC que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y la mezcla se 0 cultiva a 37°C con agitación. Posteriormente, las células se cosechan por centrifugación. Las células se lavan al suspenderlas en med io L y centrifugar la solución. Se repite la misma operación de lavado una vez más, y las células se suspenden en medio L. Posteriormente, la suspensión se difunde en medio de agar L que contiene 100 µg/ml de 15 ampicilina, y se incuba durante la noche a 37°C. El hospedador muestra un crecimiento extremadamente lento en medio L que no contiene ácido ^ diaminopimélico puesto que está deficiente en el gen dapB. En contraste, se espera que se pueda observar crecimiento normal para una cepa transformante que contiene el gen que codifica para DDPR 20 derivado de Methylophilus methylotrophus incluso en medio L debido a la función del gen. Además, E. coli hospedador no puede crecer en medio mínimo M9, pero se espera que una cepa transformante la cual contiene el gen que codifica para DDPR derivada de Methylophilus methylotrophus pueda crecer en medio mínimo M9 debido a la fu nción del gen. Por lo tanto, una colonia de transformante que normal mente • crece en medio L se siembra por estrías y se cultiva en medio de agar 5 M9. Posteriormente, también se observa crecimiento en M9. Por lo tanto, se confirma que el gen que codifica para DDPR funciona en la cepa transformante. Se extrae un plásmido de la colonia germinada en medio M9, y se confirma la presencia de un fragmento insertado en el plásmido. Cuando se transforma nuevamente E. coli AT999 mediante la O utilización del plásmido (pMMDAPB), los transformantes crecen en medio mínimo M9. Además, el transformante que contiene el plásmido se cultiva durante la noche en medio L, y las células se recolectan por centrifugación del caldo de cultivo. Las células se sonican para preparar una extracto celular, y se mide la actividad de DDPR de 15 acuerdo con el método de Tamir et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 249, p. 3034 (1974)) (figura 6: pMMDAPB). Además, el huésped fk que alberga al vector se cultiva similarmente en medio L que contiene 20 µg/ml de ácido diaminopimélico y 100 µg/ml de ampicilina, y se mide la actividad de DDPR como un experimento control (figura 6: vector). 20 Como un resultado, no se puede detectar la actividad enzimática para el transformante que alberga únicamente al vector, mientras que se puede detectar actividad DDPR para el transformante que alberga a pMMDPB. Por lo tanto, se confirma que el gen que se obtiene es un ... , .foA, s . gen que codifica para DDPR derivado de Methylophilus methylotrophus (designado como dapB). La secuencia nucleotídica de ADN del gen dapB se determina por el método didesoxi. En la SECUENCIA DE 5 IDENTIFICACIÓN NO: 1 1 se muestra la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN que contiene el gen dapB derivado de Methylophilus methylotrophus. En las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 1 1 y 12 se muestra una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por la secuencia nucleotídica. f (5) Clonación del gen que codifica para diaminopimelato descarboxilasa (DPDC). Se transforma E. coli AT2453 (CGSC cepa 4505) deficiente en el gen lysA por el mismo procedimiento de electroporación al descrito antes utilizando la solución de biblioteca de gen A. La solución 15 de transformación, se le agrega medio SOC y la mezcla se cultiva a 37°C con agitación. Las células se cosechan por centrifugación. Las f células se lavan al suspenderlas en 5 ml de agua esterilizada y se centrifuga la suspensión. La misma operación de lavado se repite una vez más, y las células se suspenden en 500 µl de agua eterilizada. 20 Después, la suspensión se difunde en medio de agar mínimo M9 que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol, y se incuba a 37°C durante 2 a 3 días. El hospedador no puede crecer en medio mínimo M9 que no contiene lisina puesto que es deficiente en el gen lysA. En contraste, se espera que una cepa transformante que contiene el gen que codifica para DPDC derivada de Methylophilus methylotrophus pueda crecer en medio mínimo M9 debido a la función del gen. • Por lo tanto, los plásmidos se extraen de tres cepas 5 transformantes germinadas en medio M9 y se analizan. Como un resultado, se confirma la presencia de un fragmento insertado en los plásmidos. Los plásmidos se designan como pMMLYSA-1 , pMMLYSA.2 y pMMLYSA-3, respectivamente. Cuando se transforma nuevamente E. coli AT2453 mediante la utilización de cada uno de estos plásmidos, O cada transformante crece en medio mínimo M9. Además, cada transformante que contiene cada plásmido se cultiva durante la noche en medio L que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol y las células se recolectan por centrifugación del caldo de cultivo. Las células se sonican para preparar un extracto celular y se mide la actividad de 15 DPDC, de acuerdo con el método de Cremer et al. (Journal of General Microbiology, vol. 134, 3221 -3229 (1988)) (figura. 7: pMMLYSA-1 , f pMMLYSA-2, pMMLYSA-3). Además, el hospedador que alberga al vector se cultiva de manera similar en medio L que contiene 20 µg/ml de cloramfenicol y se mide la actividad de DPDC como un 20 experimento control (figura 7: vector). Como un resultado, no se puede detectar la actividad enzimática para el transformante que alberga únicamente el vector, mientras que se puede detectar la actividad de DPDC en tres de las clonas que tienen un fragmento de inserción. Por lo tanto, se confirma que el gen obtenido es un gen que codifica para DPDC derivado de Methylophilus methylotrophus (designado como lys A). • Se determina la secuencia de nucléotido de ADN del gen 5 lysA por el método didesoxi. Se encuentra que la totalidad de las tres fragmentos insertados contienen un fragmento de ADN común. En la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 se muestra la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN que contiene el gen lysA derivado de Methylophilus methylotrophus. En las SECUENCIAS DE O IDENTIFICACIÓN NOS: 13 y 14 se muestra una secuencia de aminoácidos que puede ser codificada por la secuencia nucleotídica.

Aplicabilidad industrial 15 De acuerdo con la presente invención, se proporciona una bacteria Methylophilus que tiene capacidad de producir L- f) aminoácidos, un método para producir un L-aminoácido utilizando la bacteria Methylophilus y células bacterianas Methylophilus con un contenido aumentado de L-aminoácido. Por medio del método de la 20 presente invención se permite la producción de L-aminoácido utilizando metanol como materia prima. Además, se proporcionan por la presente invención genes para la enzima para la biosíntesis de L-lisina novedosos, derivados de las bacterias Methylophilus. <213> Escherichia coli <220> f <221> CDS 5 <222> (272) .. (1147) <400> 1 ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca 60 caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag 120 0 tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca 180 k tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca 240 ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc 292 Met Phe Thr Gly Ser He Val 1 5 5 gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct age 340 Ala He Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 10 15 20 ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc age ggt act tcg gcg ate 388 Leu Lys Lys Leu He Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala He 0 25 30 35 gtt tet gtt ggc acc act ggc gag tec gct acc tta aat cat gac gaa 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu 40 45 50 55 cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg gat ctg gct gat ggg cgc att 484 5 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg He 60 65 70 i.t.it ,i i-.-. j . - ..,. ?¿.lu = LISTA DE SECUENCIAS <110> A] inomoto Co., Ine, • 5 <120> BACTERIAS QUE PRODUCEN L-AMINOACIDO Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDO <130> B-591MSOP975 10 <150> JP 11-103143 <151> 1999-04-09 <150> JP 11-169447 <151> 1999-06-16 15 <150> JP 11-368097 <151> 1999-12-24 • <160> 20 20 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1197 25 <212> ADN ki ái? t?.-1--* - ^-^- -.t- .? ¡ * . ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac gct act gcg gaa gcc att age 532 Pro val He Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala He Ser 75 80 85 ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt ate gtc ggc tgc ctg acg gta 580 • F Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly He Val Gly Cys Leu Thr Val 90 95 100 acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa gaa ggt ttg tat cag cat ttc 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe 105 110 115 10 aaa gcc ate gct gag cat act gac ctg ccg caa att ctg tat aat gtg 676 Lys Ala He Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln He Leu Tyr Asn Val • 120 125 130 135 ccg tec cgt act ggc tgc gat ctg etc ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 15 140 145 150 gcg aaa gta aaa aat att ate a ate aaa gag gca acá ggg aac tta 772 Ala Lys Val Lys Asn He He Gly He Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 acg cgt gta aac cag ate aaa gag ctg gtt tea gat gat ttt gtt ctg 820 • Thr Arg Val Asn Gln He Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180 ctg age ggc gat gat gcg age gcg ctg gac ttc atg caa ttg ggc ggt 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly 185 190 195 25 cat 999 gtt att tec gtt acg act aac gtc gca gcg cgt gat atg gcc 916 His Gly Val He Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215 ki?sA.á.á?í. itÁ i. * , ±k >..3> .. i-u^aaa Ajfcjii. cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa gaa cat ttt gcc gag gca cgc gtt 964 Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230 att aat cag cgt ctg atg cca tta cac aac aaa cta ttt gtc gaa ccc 1012 5 He Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245 aat cca ate ccg gtg aaa tgg gca tgt aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg 1060 Asn Pro He Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260 10 acc gat acg ctg cgc ctg cca atg acá cca ate acc gac agt ggt cgt 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro He Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275 gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat gcc ggt ttg ctg taaagtttag 1157 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 15 280 285 290 ggagatttga tggcttactc tgttcaaaag tcgcgcctgg 1197 <210> 2 <213> Escherichia coli <400> 2 Met Phe Thr Gly Ser He Val Ala He Val Thr Pro Met Asp Glu Lys 25 1 5 10 15 Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu He Asp Tyr His Val .S&' t.? 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(1930) <400> 3 tcgaagtgtt tctgtagtgc ctgccaggca gcggtctgcg ttggattgat gtttttcatt 60 ageaataetc ttetgatttt gagaattgtg actttggaag attgtagcgc cagtcacaga 120 aaaatgtgat ggttttagtg ccgttagcgt aatgttgagt gtaaaccctt agcgcagtga 180 ageatttatt agctgaacta ctgaccgcca ggagtggatg aaaaatccgc atgaccccat 240 cgttgacaac cgccccgctc accetttatt tataaatgta ctacctgcgc tagcgcaggc 300 cagaagaggc gcgttgccca agtaacggtg ttggaggage cagtcctgtg ataacaectg 360 agggggtgca tcgccgaggt gattgaaegg ctggccacgt tcatcatcgg ctaagggggc 420 .3* . -*. ,i*?. i ¿..,3.-4.Safa ¿?i.í -, * ,. tgaatcccct gggttgtcac cagaagegtt cgcagtcggg cgtttcgcaa gtggtggagc 480 aettetgggt gaaaatagta gcgaagtatc gctctgcgcc cacccgtctt ccgctcttcc 540 cttgtgccaa ggctgaaaat ggatcccctg acacgaggta gtt atg tet gaa att 595 Met Ser Glu He • 5 1 gtt gtc tec aaa ttt ggc ggt acc age gta gct gat ttt gac gcc atg 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met 5 10 15 20 aac cgc age gct gat att gtg ctt tet gat gcc aac gtg cgt tta gtt 691 10 Asn Arg Ser Ala Asp He Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val 25 30 35 • gtc etc tcg gct tet gct ggt ate act aat ctg ctg gtc gct tta gct 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala 40 45 50 15 gaa gga ctg gaa cct ggc gag cga ttc gaa aaa etc gac gct ate cgc 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala He Arg 55 60 65 aac ate cag ttt gcc att ctg gaa cgt ctg cgt tac ccg aac gtt ate 835 Asn He Gln Phe Ala He Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val He ^^ 70 75 80 cgt gaa gag att gaa cgt ctg ctg gag aac att act gtt ctg gca gaa 883 Arg Glu Glu He Glu Arg Leu Leu Glu Asn He Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100 gcg gcg gcg ctg gca acg tet ccg gcg ctg acá gat gag ctg gtc age 931 5 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser 105 110 115 cac ggc gag ctg atg tcg acc ctg ctg ttt gtt gag ate ctg cgc gaa 979 His" Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu He Leu Arg Glu 120 125 130 cgc gat gtt cag gca cag tgg ttt gat gta cgt aaa gtg atg cgt acc 1027 Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr 135 140 145 aac gac cga ttt ggt cgt gca gag cca gat ata gcc gcg ctg gcg gaa 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp He Ala Ala Leu Ala Glu 150 155 160 ctg gcc gcg ctg cag ctg etc cca cgt etc aat gaa ggc tta gtg ate 1123 Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val He 165 170 175 180 acc cag gga ttt ate ggt age gaa aat aaa ggt cgt acá acg acg ctt 1171 Thr Gln Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 ggc cgt gga ggc age gat tat acg gca gcc ttg ctg gcg gag gct tta 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu 200 205 210 cac gca tet cgt gtt gat ate tgg acc gac gtc ccg ggc ate tac acc 1267 His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro Gly He Tyr Thr 215 220 225 acc gat cca cgc gta gtt tec gca gca aaa cgc att gat gaa ate gcg 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He Asp Glu He Ala 230 235 240 ttt gcc gaa gcg gca gag atg gca act ttt ggt gca aaa gta ctg cat 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His 245 250 255 260 ccg gca acg ttg cta ccc gca gta cgc age gat ate ccg gtc ttt gtc 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp He Pro Val Phe Val 265 270 275 ggc tec age aaa gac cca cgc gca ggt ggt acg ctg gtg tgc aat aaa 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys • 280 285 290 act gaa aat ccg ccg ctg ttc cgc gct ctg gcg ctt cgt cgc aat cag 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln 295 300 305 act ctg etc act ttg cac age ctg aat atg ctg cat tet cgc ggt ttc 1555 10 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe 310 315 320 • etc gcg gaa gtt ttc ggc ate etc gcg cgg cat aat att tcg gta gac 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly He Leu Ala Arg His Asn He Ser Val Asp 325 330 335 340 15 tta ate acc acg tea gaa gtg age gtg gca tta acc ctt gat acc acc 1651 Leu He Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr 345 350 355 ggt tea acc tec act ggc gat acg ttg ctg acg caa tet ctg ctg atg 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met gag ctt tec gca ctg tgt cgg gtg gag gtg gaa gaa ggt ctg gcg ctg 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu 375 380 385 gtc gcg ttg att ggc aat gac ctg tea aaa gcc tgc ggc gtt ggc aaa 1795 25 Val Ala Leu He Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys 390 395 400 gag gta ttc ggc gta ctg gaa ccg ttc aac att cgc atg att tgt tat 1843 1.4.1.» ?. -ÍÍ..Í I...H-.? ...

Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn He Arg Met He Cys Tyr 405 410 415 420 ggc gca tec age cat aac ctg tgc ttc ctg gtg ccc ggc gaa gat gcc 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala 5 425 430 435 gag cag gtg gtg caa aaa ctg cat agt aat ttg ttt gag taaatactgt 1940 Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu 440 445 atggcctgga agetatattt cgggccgtat tgattttctt gtcactatgc tcatcaataa 2000 10 acgagcctgt actctgttaa ccagcgtctt tatcggagaa taattgcctt taattttttt 2060 atctgcatct ctaattaatt atcgaaagag ataaatagtt aagagaaggc aaaatgaata 2120 • ttatcagttc tgctcgcaaa ggaatte 2147 <210> 4 15 <211> 449 <212> PRT <213> Escherichia coli t <400> 4 0 Met Ser Glu He Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp He Val Leu Ser Asp Ala Asn 20 25 30 Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly He Thr Asn Leu Leu 5 35 40 45 Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu 50 55 60 Asp Ala He Arg Asn He Gln Phe Ala He Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Pro Asn Val He Arg Glu Glu He Glu Arg Leu Leu Glu Asn He Thr 5 85 90 95 Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu 115 120 125 10 He Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys 130 135 140 • Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp He Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu 15 165 170 175 Gly Leu Val He Thr Gln Gly Phe He Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg 180 185 190 Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu 195 200 205 • Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp He Trp Thr Asp Val Pro 210 215 220 Gly He Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg He 225 230 235 240 Asp Glu He Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala 25 245 250 255 Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp He 260 265 270 í¡Í.-L -í.tí-?.?.4....& . . -?.-? . 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(1736) <400> 5 gtttaacgcg gccagtgaat ttgactcggt cccctgcctg gcaaaatcgc acaggtgatg 60 gacaacgtga aatcgcttga aaaagaattg gcacgcctca agtccaagct ggcctcctca 120 10 cagggggatg acctcgcgac gcaagcgcag gaegtcaaeg gcgccaaagt actggcagcc 180 ^fc accctcgacg gggcggatgc caatgeettg cgtgaaacca tggataagct caaagataaa 240 ctcaaatctg cagtcattgt gctggcgagc gtggctgacg gtaaagtcag cctggctgcg 300 ggtgtcacta ctgacttgac tggcaaggtc aaagcaggcg aagttggtca atcatgtggc 360 tggtcaggtc ggtggcaaag gtggtggtaa accggatatg gcgatggcag gtggtactga 420 15 gcccgctaat ttgccgcagg ctttggcaag tgtgaaggct tgggtagaaa caaaactaaa 480 ttaatttaat tgattaacag agcgaaata atg gca tta ate gta caa aaa tat 533 Met Ala Leu He Val Gln Lys Tyr 1 5 ^fc ggt ggt acc tcg gtg gct aat ccc gag cgt ate cgt aat gtg gcg cgt 581 20 Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Pro Glu Arg He Arg Asn Val Ala Arg 10 15 20 cgc gtg gcg cgt tac aag gca ttg ggc cac cag gtg gtg gtt gtg gta 629 Arg Val Ala Arg Tyr Lys Ala Leu Gly His Gln Val Val Val Val Val 25 30 35 40 25 tec gca atg tet ggt 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Asp Ala Phe Thr Lys Ala Arg 100 105 110 He Leu Asp He Asp Glu His Asn Leu Lys Lys Asp Leu Asp Asp Gly 115 120 125 Tyr Val Cys Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asp Ala Asn Gly Asn 130 135 140 He Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Gly Val Ala Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Leu Lys Ala Asp Glu Cys Gln He Tyr Thr Asp Val Asp 165 170 175 Gly Val Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Pro Glu Ala Arg Arg Leu 180 185 190 Asp Lys He Thr Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ser Gln Gly Ser 195 200 205 Lys Val Leu Gln He Arg Ser Val Glu Phe Ala Gly Lys Tyr Lys Val 210 215 220 Lys Leu Arg Val Leu Ser Ser Phe Glu Glu Glu Gly Asp Gly Thr Leu 245 250 255 Gly He Ala Phe Asn Arg Asp Glu Ala Lys He Thr Val Thr Gly Val 260 265 270 Pro Asp Lys Pro Gly He Ala Tyr Gln He Leu Gly Pro Val Ala Asp 10 275 280 285 Ala Asn He Asp Val Asp Met He He Gln Asn Val Gly Ala Asp Gly • 290 295 300 Thr Thr Asp Phe Thr Phe Thr Val His Lys Asn Glu Met Asn Lys Ala 305 310 315 320 15 Leu Ser He Leu Arg Asp Lys Val Gln Gly His 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(1995) <400> 13 5 tgetttaggg ggaacctaga ggatccccct acccgaggaa gaagtgagee aacatgtact 60 tccagtcgta ccatcaaaag tagaagtttt cggcgttatc ctgatteaca gtaaaegaaa 120 aattgeccat attctgaccg gatttaccgg tggcttttaa ggtataagtg gtegetgact 180 ggttctcaat gctgtaatca aaaaatttgg catcactggg gacacaggca aatcccacat 240 atgtgaagtt gtcctgataa aactgttcgg cctgcacacg gcaattggca agattggcag 300 ^** gcgcttccgc ggcattaccg cttttgatgt aatcctgata gcctggtatg gcgatgctgg 360 5 ccaagatacc cataatggcc accacgacca tgaettetat caggctgaat ccgtactgat 420 ttgaggactt cattatcaaa ccccttttta gatageetta tcatgcaaac aggcagctgt 480 catgtccagc atcagccgac caatggtcag gattaccega cgaacggtca aaccactaaa 540 acgcccagtc actggtgcca tgagcaactg caggtttaat gataaaatgg caetcaattt 600 acattggact gtgaacatgt ttteetteta taegagatta ttggcggttg ccctgctatt 660 10 ggcacaattg agtgcctgtg gtctcaaagg ggacctgtat attcctgagc gccaataccc 720 tcaaacgcct caacaagata agtetteate gtg acc gct ttt tea ate caa caa 774 ^ Val Thr Ala Phe Ser He Gln Gln 1 5 ggc cta cta cat gcc gag aat 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gtttgcacag aggatggccc atgtt 35 <210> 18 <211> 36 <212> ADN • <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador para amplificación del gen dapA*24 15 <400> 18 cattctagat ccctaaactt tacagcaaac cggcat 36 • <210> 19 20 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> j&é-ikákA i?u i.... , ?* ^^- . .i-i&.iii ^i <223> Iniciador para amplificación del gen lysC*80 <400> 19 gaacctgcag gccctgacac gaggtagatt atgtc 35 <210> 20 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial • <220> <223> Iniciador para amplificación del gen lysC*80 <400> 20 15 ctttcggcta gaagagcgag atgcagataa aaaaattaaa ggcaattatt ctccg 55 ^^

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una bacteria Methylophilus, caracterizada porque tiene capacidad de producir L-aminoácido.

2.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el L-aminoácido es L- lisina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina o L-treonina.

3.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque muestra resistencia a un análogo de L-aminoácido o auxotrofía a L-aminoácido.

4.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se mejora la actividad de la enzima biosintética de L-aminoácido.

5.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se mejora la actividad de dihidrodipicolinato sintasa y la actividad de aspartocinasa, y la bacteria tiene capacidad para producir L-lisina.

6.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se mejora la actividad de dihidrodipicolinato sintasa, y ia bacteria tiene capacidad de producción de L-lisina.

7.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se mejora la actividad de aspartocinasa y la bacteria tiene capacidad de producción de L-lisina.

8.- La bacteria Methylophilus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizada además porque se mejora la actividad o actividades de una, dos o tres de las enzimas que se seleccionan de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa, dihidrodipicolinato reductasa y diaminopimelato descarboxilasa.

9.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque se mejora la actividad de dihidrodipicolinato sintasa y la actividad de aspartocinasa por transformación a través de introducción en las células, de un ADN que codifica para dihidrodipicolinato sintasa que no sufre inhibición por retroalimentación por L-lisina y un ADN que codifica para aspartocinasa que no sufre de inhibición por retroalimentación por L- lisina.

10.- La bacteria Methylophilus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se mejoran las actividades de aspartocinasa, homoserina deshidrogenasa, homserina cinasa y treonina sintasa, y la bacteria tiene capacidad para producir L-treonina.

11.- La bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada además porque la bacteria Methylophilus es Methylophilus methylotrophus. •

12.- Un método para producir un L-aminoácido, 5 caracterizado porque comprende cultivar una bacteria Methylophilus como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un medio para producir y acumular un L-aminoácido en cultivo y recolectar el L-aminoácido del cultivo.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, • 10 caracterizado además porque el medio contiene metanol como una fuente principal de carbono.

14.- Un método para producir células bacterianas de una bacteria Methylophilus con un contenido aumentado de un L- aminoácido, caracterizado porque comprende cultivar una bacteria 15 Methylophilus, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en un medio para producir y acumular un L-aminoácido en ^ células bacterianas de la bacteria.

15.- El método para producir células bacterianas de bacteria Methylophilus, de conformidad con la reivindicación 14, 20 caracterizado además porque el L-aminoácido es L-lisina, L- valina, L-leucina, L-isoleucina o L-treonina.

16.- Un ADN el cual codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (A) o (B): (A) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6, o (B) una proteína la cual tiene las secuencias de • aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 6 que 5 incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y tiene actividad de aspartocinasa.

17.- El ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque es un ADN definido en los siguientes incisos (a) o (b): 10 (a) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 510 a 1736 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5; o. (b) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tenga la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 510 a 15 1736 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 5 o una parte de la misma bajo condición rigurosa, y que codifica para una proteína que tiene actividad de aspartocinasa.

18. Un ADN, caracterizado porque codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (C) o (D): 20 (C) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8, o (D) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 8 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa.

19.- El ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque es un ADN definido en los siguientes incisos (c) o (d): (c) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 98 a 1207 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7; o (d) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tenga la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 98 a 1207 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 7 o una parte de la misma bajo una condición rigurosa, y que codifique para una proteína que tiene actividad de ácido aspártico semialdehído deshidrogenasa.

20.- Un ADN, caracterizado porque codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (E) o (F): (E) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10, o (F) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno Ía *AAJ-* 4ÉXUÁXtA,4*, «», ; -.A^...,*.. . * ^^ j. , JM,,.^.aJJ. ... ..,<,.», „.. „.. ^ . -.^ -j i í.-í o varios aminoácidos, y que tiene actividad de dihidrodipicolinato sintasa.

21.- El ADN de conformidad con la reivindicación 20, • caracterizado además porque es un ADN definido en los siguientes 5 incisos (e) o (f): (e) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 1268 a 2155 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9; o (f) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que 10 tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 1268 a 2155 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9 o una parte de la misma bajo una condición astringente, y que codifica para una proteína que tiene actividad de dihidrodipicolinato sintasa.

22.- Un ADN, caracterizado porque codifica para una 15 proteína definida en los siguientes incisos (G) o (H): (G) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12, o (H) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 12 que 20 incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de dihidrodipicolinato reductasa. iAAAJ ^ .tat^^. ^^ L,

23.- El ADN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque es un ADN definido en los siguientes incisos (g) o (h): (g) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 2080 a 2883 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 1 ; o (h) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 2080 a 2883 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11 o una parte de la misma bajo una condición astringente, y que codifica para una proteína que tiene actividad de dihidrodipicolinato reductasa.

24.- Un ADN, caracterizado porque codifica para una proteína definida en los siguientes incisos (I) o (J)- (I) una proteína la cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 14, o (J) una proteína la cual tiene las secuencias de aminoácidos de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO" 14 que incluye sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene actividad de diaminopimelato descarboxilasa

25.- El ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque es un ADN definido en los siguientes incisos (i) o (j): J.ii. -t.-i L?.t.JLAi?±l. -¿.. ^ .. ».t >IA^. (i) un ADN el cual tiene una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia de nucléotidos de los nucléotidos números 751 a 1995 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13; o (j) un ADN el cual es hibridizable con una sonda que 5 tiene la secuencia nucleotídica de los nucléotidos números 751 a 1995 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13 o una parte de la misma bajo una condición rigurosa, y que codifica para una proteína que tiene actividad de diaminopimelato descarboxilasa. ^iW ?-Í.*,?? .¡¡ÍÍ¡-. - . .