JP2008295457A

JP2008295457A - Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法

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Publication number: JP2008295457A
Application number: JP2008206972A
Authority: JP
Inventors: Yoshiya Gunji; 義哉郡司; Hisashi Yasueda; 寿安枝; Shinichi Sugimoto; 愼一杉本; Nobuharu Tsujimoto; 信晴辻本; Megumi Shimaoka; 恵島岡; Yuri Miyata; 由理宮田; Manami Oba; 麻奈美大場
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2008-08-11
Publication date: 2008-12-11
Also published as: RU2004104198A; AU3674500A; US7223572B1; RU2334794C2; RU2004137825A; RU2351653C2; WO2000061723A1; EP1188822A4; JP4273661B2; DE60033151D1; CN1690191A; BR0009550A; CN1210396C; RU2004137824A; DE60033151T2; US20130171700A1; CN1346402A; US20080038825A1; PE20010049A1; MXPA01010151A

Abstract

【課題】新規なＬ−アミノ酸生産菌及び同生産菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供する。
【解決手段】メタノールを主たる炭素源として生育することができ、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌、例えば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡと、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとが細胞内に導入されて形質転換されたことにより、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強されたメチロフィラス属細菌、又はカザミノ酸要求性となったメチロフィラス属細菌を、メタノールを主たる炭素源とする培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法、及び同製造法に用いる微生物に関するものである。

Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニン等のアミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物としては、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。

上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。

ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりアミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特公昭45-25273号公報）、プロタミノバクター属（特開昭49-125590号公報）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特開昭50-25790号公報）、ミクロサイクラス属（特開昭52-18886号公報）、メチロバチルス属（特開平4-91793号公報）、バチルス属（特開平3-505284号公報）などに属する微生物を用いる方法が知られている。

しかし、これまでメチロフィラス属細菌を用いてＬ−アミノ酸を製造することは知られていない。また、組換えＤＮＡを用いたメチロフィラス属細菌の形質転換方法として、EP
0 035 831 A、EP 0 037 273 A、EP 0 066 994 Aに記載の方法が知られているが、メチロフィラス属細菌のアミノ酸の生産性の改善に組換えＤＮＡ技術が適用された例は知られていない。

本発明は、新規なＬ−アミノ酸生産菌及び同生産菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メチロフィラス属細菌がＬ−アミノ酸の製造に適していることを見出した。さらに、従来、メチロフィラス属細菌の栄養要求性変異株を得ることは困難であるとされてきた（FEMS Microbiology Rev.
39, 235-258 (1986)、Antonie van Leeuwenhoek 53, 47-53 (1987)）が、本発明者らは同細菌の栄養要求性変異株を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌。
（２）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンである（１）のメチロフィラス属細菌。
（３）Ｌ−アミノ酸アナログ耐性又はＬ−アミノ酸要求性を有する（１）のメチロフィラ
ス属細菌。
（４）Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された（１）のメチロフィラス属細菌。
（５）ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（６）ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（７）アスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（８）さらにアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種、２種又は３種の酵素の活性が増強された（５）〜（７）のいずれかのメチロフィラス属細菌。
（９）Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡと、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとが細胞内に導入されて形質転換されたことにより、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強された（５）のメチロフィラス属細菌。
（１０）アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性が増強され、Ｌ−スレオニン生産能を有する（１）のメチロフィラス属細菌。
（１１）メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである（１）〜（１０）のいずれかの細菌。
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１３）前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（１２）の方法。（１４）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載のメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該細菌の菌体中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させることを特徴とする、Ｌ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体の製造法。
（１５）Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンである（１４）記載のメチロフィラス属細菌菌体の製造法。
（１６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１６）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１８）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（１９）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（１８）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２０）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
（２１）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（２０）のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２２）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質。
（２３）下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである（２２）のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２４）下記（Ｉ）又は（Ｊ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｉ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｊ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
（２５）下記（ｉ）又は（ｊ）に示すＤＮＡである（２４）のＤＮＡ。
（ｉ）配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｊ）配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

尚、本明細書において「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−アミノ酸を蓄積する能力、又は菌体中のアミノ酸含量を増加させる能力をいう。

＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌である。本発明のメチロフィラス属細菌としては、例えばメチロフィラス・メチロトロファス（Methylophilus methylotrophus）AS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom）から入手可能である。

本発明により生産されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等が挙げられる。生産されるアミノ酸は１種類でもよく、２種又は３種以上であってもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌は、メチロフィラス属細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、その活性が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。

また、Ｌ−グルタミン酸生産菌はオレイン酸要求変異株等として、Ｌ−スレオニン生産菌はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性変異株として、Ｌ−ホモセリン生産菌はＬ−スレオニン要求変異株又はＬ−フェニルアラニンアナログ耐性変異株として、Ｌ−フェニルアラニン生産菌は、Ｌ−チロシン要求変異株として、Ｌ−イソロイシン生産菌はＬ−ロイシン要求変異株として、Ｌ−プロリン生産菌は、Ｌ−イソロイシン要求変異株として、育種することができる。

さらに、後記実施例に示すように、分岐鎖アミノ酸（Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン）の１種又は２種以上を生産する菌株は、カザミノ酸要求株として取得され得る。

本発明者は、メチロフィラス属細菌から変異株を取得するために、まずストレプトマイシン耐性株の出現頻度を指標に最適な変異処理条件を詳細に検討した。その結果、変異処理後の生存率が約０．５％となる条件のとき、ストレプトマイシン耐性株の出現頻度が最高となり、この条件により栄養要求株を取得することに成功した。また、変異株のスクリーニングもこれまでE. coli等で行われているよりも大幅にスケールアップして行うことにより、困難とされてきた栄養要求株の取得に成功した。

上記のように、変異株取得に好適な条件でメチロフィラス属細菌を変異処理することにより変異株の取得が可能であることが判明したので、変異処理方法に応じて変異処理後の生存率が約０．５％となるような条件を適宜設定することにより、所望の変異株を取得することが容易となる。

メチロフィラス属細菌から変異株を得るための変異処理としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、メチロフィラス属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を得ることできる。

Ｌ−アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したメチロフィラス属細菌を種
々の濃度のＬ−アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。

また、栄養要求性変異株は、メチロフィラス属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ−アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。

次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。

〔Ｌ−リジン〕
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。

メチロフィラス属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メチロフィラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをメチロフィラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。

DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、メチロフィラス属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and
Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、E. coli由来のdapA及びlysCを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。

本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。E. coli由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、E. coli由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メチロフィラス属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPSを「変異型DDPS」、変異型DDPSをコードするＤＮＡを「変異型dapA」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するE. coli由来のAKIIIを「変異型AKIII」、変異型AKIIIをコードするＤＮＡを「変異型lysC」と呼ぶことがある。

尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリ
ネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。

E. coli由来の野生型dapAの塩基配列を配列番号１に、同塩基配列によってコードされる野生型DDPSのアミノ酸配列を配列番号２に例示する。また、E. coli由来の野生型lysCの塩基配列を配列番号３に、同塩基配列によってコードされる野生型AKIIIのアミノ酸配列を配列番号４に例示する。

Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型DDPSをコードするＤＮＡとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するDDPSをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型AKIIIをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる。

遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。

また、メチロフィラス属細菌で機能するベクターとは、例えばメチロフィラス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）、あるいはpMFY42（gene, 44, 53(1990)）、pRP301、pTB70（Nature, 287, 396,
(1980)）等が挙げられる。

dapA及びlysCとメチロフィラス属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。

変異型DDPSをコードする変異型dapA及び変異型AKIIIをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている（WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-13936として寄託され、そして1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号が付与されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。

RSFD80に含まれている変異型dapAは、配列番号１に示す野生型dapAの塩基配列において塩基番号623のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型DDPSは、配列番号２に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、RSFD80に含まれている変異型lysCは、配列番号３に示す野生型lysCの塩基配列において塩基番号1638のＣがＴ変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型AKIIIは、配列番号４に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する。

上記のように調製した組換えＤＮＡをメチロフィラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。

DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをメチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。

DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、Ｐ_Lプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。

遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。

DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、WO96/40934号参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭60-87788号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平6-102028号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。好ましくは、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素の少なくとも１種以上の酵素の活性が増強される。

メチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素については後述する。

さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864参照）。

上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、以下に示す他のアミ
ノ酸についても同様に適用することができる。

〔Ｌ−グルタミン酸〕
メチロフィラス属細菌へのＬ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンターゼ（特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＷＯ９９／０７８５３）等の酵素をコードするＤＮＡを導入することによって、付与することができる。

さらに、本発明の微生物は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。

〔Ｌ−スレオニン〕
Ｌ−スレオニン生産能は、例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性を増強することにより、付与又は増強することができる。これらの酵素の活性は、例えば、スレオニンオペロンを含有した組換えプラスミド（特開昭５５−１３１３９７号公報、特開昭５９−３１６９１号公報、特開昭５６−１５６９６号公報、および特表平３−５０１６８２号公報参照）でメチロフィラス属細菌を形質転換することにより、増強することができる。

また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロン（特公平１−２９５５９号公報）、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６０−０１２９９５号）、又はホモセリンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（特開昭６１−１９５６９５号）を増幅又は導入することによっても、生産性を付与又は増強することができる。

さらに、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡを導入することによって、Ｌ−スレオニン生産能を向上させることができる。
〔Ｌ−バリン〕
Ｌ−バリンの生産能の付与は、例えば、制御機構が実質的に解除されたＬ−バリン生合成系遺伝子をメチロフィラス属細菌に導入することによって行うことができる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するＬ−バリン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。

Ｌ−バリン生合成系遺伝子としては、例えばE. coliのｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙
げられる。尚、ｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する。したがって、Ｌ−バリン合成系の反応を効率よく進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないオペロンを用いることが好ましい。このようなスレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を失うような変異がｉｌｖＡに導入された、又はｉｌｖＡが破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、あるいはｉｌｖＡが欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンが挙げられる。

また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい。

上記のような、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得られる（以上、ＷＯ９６／０６９２６参照）。

〔Ｌ−ロイシン〕
Ｌ−ロイシンの生産能の付与または増強は、例えば、上記Ｌ−バリン生産に必要な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたＬ−ロイシン生合成系遺伝子をメチロフィラス属に属する微生物に導入することによって行われる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するＬ−ロイシン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。このような遺伝子として、例えば、Ｌ−ロイシンによる阻害が実質的に解除されたｌｅｕＡ遺伝子が挙げられる。

〔Ｌ−イソロイシン〕
Ｌ−イソロイシンは、例えば、E. coli由来のＬ−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするｔｈｒＡ遺伝子を含むｔｈｒＡＢＣオペロンと、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとを導入することにより、Ｌ−イソロイシン生産性を付与することができる（特開平８−４７３９７参照）。

〔その他のアミノ酸〕
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンは、メチロフィラス属細菌のホスホエノールピルビン酸の生産能を上昇させることによって、生合成が強化され得る（ＷＯ９７／０８３３３）。

Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンは、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤＴ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６２−１３０６９３号公報参照）、脱感作型３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（ＤＳ）遺伝子（特開平５−２３６９４７号、特開昭６１−１２４３７５号公報参照）を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。

また、Ｌ−トリプトファンは、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロン（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第4,371,614）を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。

なお、本明細書において、酵素の「活性が増強されている」とは、通常には、野生株よ
りも細胞内のその酵素活性が高いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が増強された菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味する。また、酵素の「活性が低下している」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。

上記にようにして得られるＬ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。

また、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該細菌の菌体中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させることにより、メチロフィラス属細菌の野生株に比べてＬ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体を製造することができる。

本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。

メタノールを主たる炭素源として用いると、Ｌ−アミノ酸を安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に通常0.001〜30%添加する。窒素源としては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。

培養は、通常には、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、pH5〜9、温度20〜45℃に保持して行われ、通常24〜120時間で終了する。
培養物からのＬ−アミノ酸の採取は、通常、イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。

また、メチロフィラス属細菌菌体の培地からの分離は、通常の微生物菌体の分離法によって分離することができる。

＜２＞本発明の遺伝子
本発明のＤＮＡは、メチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ（以下「AK」ともいう）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（以下「ASD」ともいう）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下「DDPS」ともいう）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（以下「DDPR」ともいう）、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（以下「DPDC」ともいう）の各々の酵素をコードする遺伝子である。

本発明のＤＮＡは、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリーを用いて、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを欠損した微生物の変異株を形質転換し、栄養要求性が回復したクローンを選択することによって取得することができる。

メチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリーは、例えば以下のように作製することができる。まず、メチロフィラス・メチロトロファス野生株、例えばメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）から全染色体ＤＮＡを、Saitoらの方法（Saito, H.and Miura, K. (1963) Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629）等により調製し、適当な制限酵素、例えばSau3AI又はAluI等で部分分解して、種々の断片混合物を得る。
切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。

ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、大腸菌（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）細胞内で自律複製可能なベクターDNAに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素と同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素をベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて組換えＤＮＡを得る。

得られた組換えＤＮＡを用いて、大腸菌、例えば大腸菌JM109株等を形質転換し、形質転換体の培養液から組換えＤＮＡを調製することによって、遺伝子ライブラリー液が得られる。この形質転換は D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。後記実施例では、エレクトロポレーション法を採用した。

前記ベクターとしては、pUC19、pUC18、pUC118、pUC119、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV29等が挙げられ、その他ファージベクターも使用することができる。例えば、pUC118、pUC119にはアンピシリン耐性遺伝子が、pSTV28及びpSTV29にはクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれているので、培地中にアンピシリン又はクロラムフェニコールを含有させることにより、ベクターあるいは組換えＤＮＡを保持する形質転換体のみを生育させることができる。

形質転換体を培養し、菌体から組換えＤＮＡを回収する方法としては、アルカリSDS法等が挙げられる。
上記のようにして得られたメチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子ライブラリー液を用いて、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを欠損した微生物の変異株を形質転換し、栄養要求性が回復したクローンを選択する。

AKを欠損した微生物の変異株としては、３種類のAKをコードする遺伝子（thrA, metLM,
lysC）を欠損したE. coli GT3が挙げられる。ASDを欠損した微生物の変異株としては、E. coli Hfr3000 U482 (CGSC 5081株)が挙げられる。DDPSを欠損した微生物の変異株としては、E. coli AT997(CGSC 4547株)が挙げられる。DDPRを欠損した微生物の変異株としては、E. coli AT999 (CGSC 4549株)が挙げられる。DPDCを欠損した微生物の変異株としては、E. coli AT2453(CGSC 4505株)が挙げられる。これらの変異株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州ニューヘブン(New Haven)06511-7444、エール大学生物学部オズボーン記念研究所（Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs.）、P.O. Box 6666）から入手できる。

上記変異株は、いずれもM9最少培地では生育できないが、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、これらの遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。したがって、最少培地で生育可能な形質転換株を選択し、同株から組換えＤＮＡを回収すれば、各々の酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。また、E. coli AT999 (CGSC 4549株)は、Ｌ培地等の完全培地であっても、ジアミノピメリン酸を添加しない場合には生育が非常に遅いが、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子を保持する形質転換株は当該遺伝子が機能することにより、正常な生育が観察される。したがって、Ｌ培地で正常に生育する形質転換株を選択することによっても、DDPRをコードする遺伝子を保持する形質転換株が得られる。

得られた組換えＤＮＡから挿入ＤＮＡ断片を取り出し、塩基配列を決定すると、各々の酵素のアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列が決定される。

本発明のAKをコードする遺伝子（以下「ask」ともいう）は、配列表配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するAKをコードする。ask遺伝子として具体的には、配列番号５の塩基番号からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のask遺伝子は、配列番号６に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。

本発明のASDをコードする遺伝子（以下「asd」ともいう）は、配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するASDをコードする。asd遺伝子として具体的には、配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のasd遺伝子は、配列番号８に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。

本発明のDDPSをコードする遺伝子（以下「dapA」ともいう）は、配列表配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するDDPSをコードする。dapA遺伝子として具体的には、配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５から塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のdapA遺伝子は、配列番号１０に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。

本発明のDDPRをコードする遺伝子（以下「dapB」ともいう）は、配列表配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するDDPRをコードする。dapB遺伝子として具体的には、配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のdapB遺伝子は、配列番号１２に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。

本発明のDPDCをコードする遺伝子（以下「lysA」ともいう）は、配列表配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するDPDCをコードする。lysA遺伝子として具体的には、配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明のlysA遺伝子は、配列番号１４に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを等価の他のコドンに置き換えた配列であってもよい。

また、本発明の各酵素遺伝子は、各々配列番号６、８、１０、１２又は１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるものであって、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。ここで「１若しくは複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。

上記のようなAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡ
を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCを保持する微生物の種や菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。

上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物のAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を調べることにより、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号５の塩基番号５１０〜１７３６からなる塩基配列、配列番号７の塩基番号９８〜１２０７からなる塩基配列、配列番号９の塩基番号１２６８〜２１５５からなる塩基配列、配列番号１１の塩基番号２０８０〜２８８３からなる塩基配列、配列番号１３の塩基番号７５１〜１９９５からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。なお、本明細書で、「塩基配列又はその一部を有する」とは、その塩基配列もしくはその一部又はそれに相補的な塩基配列を有することを意味する。

ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、プローブの塩基配列や長さによって異なるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば４０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

プローブとして、各遺伝子の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ（polymerase chain reaction）反応によって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC活性を測定することによって容易に取り除くことができる。

本発明により、メチロフィラス・メチロトロファス由来のAK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDC及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列が明らかにされたので、これらの配列を基に作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、メチロフィラス・メチロトロファス遺伝子ライブラリーから、AK、ASD、DDPS、DDPR又はDPDCをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。また、これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、上記ヌクレオチド配列を基に作製したオリグヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲ法によりメチロフィラス・メチロトロファス染色体ＤＮＡから増幅することによっても得られる。

上記遺伝子は、メチロフィラス属細菌のＬ−リジン生産性を増強するのに好適に利用することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は特に指定しない限り和光純薬、あるいはナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHあるいはHClで調整した。

（Ｌ培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）10g/L
酵母エキス（ディフコ社製） 5g/L
NaCl 5g/L
［120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。］

（Ｌ寒天培地）
Ｌ培地
バクトアガー（ディフコ社製） 15g/L
［120℃、20分間の蒸気滅菌を行った。］

（SOC培地）
バクトトリプトン（ディフコ社製）20g/L
酵母エキス（ディフコ社製） 5g/L
10mM NaCl
2.5mM KCl
10mM MgSO₄
10mM MgCl₂
20mMグルコース
［マグネシウム溶液及びグルコースを除いて、蒸気滅菌した(120℃、20分間)後、予め0.22μmのフィルターを通した2Mのマグネシム保存液（1M MgSO₄、1M MgCl₂）並びに2Mグルコース溶液を加え、再び0.22μmのフィルターを通した。］

（121M1培地）
K₂HPO₄ 1.2g/L
KH₂PO₄ 0.62g/L
NaCl 0.1g/L
(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L
MgSO₄・7H₂O 0.2g/L
CaCl₂・6H₂O 0.05g/L
FeCl₃・6H₂O 1.0mg/L
H₃BO₃ 10μg/L
CuSO₄・5H₂O 5μg/L
MnSO₄・5H₂O 10μg/L
ZnSO₄・7H₂O 70μg/L
NaMoO₄・2H₂O 10μg/L
CoCl₂・6H₂O 5μg/L
メタノール 1%(vol/vol) pH 7.0
[メタノール以外は121℃、15分間の蒸気滅菌を行った。良く冷めてからメタノールを添加した。］

（121生産培地の組成）
メタノール 2%
リン酸二カリウム 0.12%
リン酸一カリウム 0.062%
塩化カルシウム六水塩 0.005%
硫酸マグネシウム七水塩 0.02%
塩化ナトリウム 0.01%
塩化第二鉄六水塩 1.0mg/L
硫酸アンモニウム 0.3%
硫酸第二銅五水塩 5μg/L
硫酸第一マンガン五水塩 10μg/L
モリブデン酸ナトリウム二水塩 10μg/L
ホウ酸 10μg/L
硫酸亜鉛七水塩 70μg/L
塩化第一コバルト六水塩 5μg/L
炭酸カルシウム（関東化学製） 3%
（pH7.0）

（121M1寒天培地）
121M1培地
バクトアガー（ディフコ社製）15g/L
［メタノール以外は121℃、15分間の蒸気滅菌を行った。良く冷めてからメタノールを添加した。］

（Ｍ９最少培地）
Na₂HPO₄・12H₂O 16g/L
KH₂PO₄ 3g/L
NaCl 0.5g/L
NH₄Cl 1g/L
MgSO₄・7H₂O 246.48mg/L
グルコース 2g/L
pH7.0
［MgSO₄、およびグルコースは別に殺菌(120℃、20分間)して加えた。また、必要に応じて適量のアミノ酸およびビタミンを添加した。］

（Ｍ９最少寒天培地）
Ｍ９最少培地
バクトアガー（ディフコ社製）15g/L

実施例１Ｌ−リジン生産菌の創製（１）
（１）メチロフィラス属細菌への変異型lysC及び変異型dapAの導入
変異型lysC及び変異型dapAは、これらを含む公知のプラスミドRSFD80（WO95/16042号参照）を用いてメチロフィラス属細菌に導入した。RSFD80は、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986,
16, 161-167）に由来するプラスミドpVIC40（WO90/04636国際公開パンプレット、特表平3-501682号公報）のテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター（tetP）の下流に、tetPに対して転写方向が正方向となるようにE. coli由来の変異型dapA及び変異型lysCがこの順序で配置されている。この変異型dapAは、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型DDPSをコードしている。また、前記変異型lysCは、352位のスレオニン残
基がイソロイシン残基に置換された変異型AKIIIをコードしている。

RSFD80は、以下に示すようにして構築された。プラスミドpdapAS24上にある変異型dapAをpVIC40のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの下流に連結し、図１に示す様にしてRSF24Pを得た。次に、このRSF24Pと、変異型lysCを含むpLLC^*80から、変異型dapA及び変異型lysCを有するプラスミドRSFD80を図２に示す様にして作製した。すなわち、pVIC40はスレオニンオペロンを含んでいるが、RSFD80ではこのスレオニンオペロンが変異型dapAを含むＤＮＡ断片及び変異型lysCを含むＤＮＡ断片と置換されている。

RSFD80プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は、1993年10月28日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-13936として寄託され、そして1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号が付与されている。

E. coli AJ1239株を、ストレプトマイシンを20mg/L含む30mlのLB培地で30℃で12時間培養して得た菌体から、Wizard^R Plus Midipreps DNA Purification System(プロメガ社より市販)を用いてRSFD80プラスミドを精製した。

上記のようにして得られたRSFD80プラスミドを、エレクトロポレーション法（Canadian
Journal of Microbiology, 43, 197(1997)）によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）に導入した。なお、対照として、RSFD80プラスミドを作製する際に用いたpVIC40プラスミドよりスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つpRSプラスミド（特表平3-501682号公報参照）を、RSFD80と同様にしてAS1株に導入した。

（２）E. coli由来の変異型lysC及び変異型dapAを保持するメチロフィラス属細菌のAKIII活性
RSFD80プラスミドを保持するメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（以下、「AS1/RSFD80」と略すことがある）と、pRSプラスミドを保持するメチロフィラス・メチロトロファスAS1株（以下、「AS1/pRS」と略すことがある）より、無細胞抽出液を調製し、AK活性を測定した。無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにして調製した。AS1/RSFD80およびAS1/pRS株を、ストレプトマイシン20mg/Lを含む上記組成の121生産培地に植菌し、37℃で34時間振とう培養し、炭酸カルシウムを除いた後、集菌した。

上記のようにして得られた菌体を、０℃の条件下で0.2% KClで洗浄し、10mM MgSO₄, 0.8M (NH₄)₂SO₄および0.03M β−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に懸濁し、超音波処理（０℃、２００Ｗ、１０分）で菌体を破砕した。菌体破砕液を0℃の条件下で、33,000rpmで３０分間遠心し、上清をとってこれに80%飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、0℃で１時間放置した後遠心し、ペレットを10mM MgSO₄, 0.8M (NH₄)₂SO₄および0.03Ｍ β−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に溶解した。

AK活性の測定はスタットマンらの方法（Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G.,
and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033(1961)）に従った。すなわち、下記組成の反応液を30℃で45分インキュベートし、FeCl₃溶液（2.8N HCl: 0.4ml, 12%TCA: 0.4ml, 5% FeCl₃・6H₂O/0.1N HCl: 0.7ml）を加えて発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量で表示（1U=1mmol/分）した。モル吸光係数は600とした。なお、反応液からアスパラギン酸カリウムをのぞいたものをブランクとした。酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃度
のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害の度合いを調べた。結果を表１に示した。

（反応液組成）
reaction mixture ^*1 0.3ml
ヒドロキシルアミン溶液 ^*2 0.2ml
0.1Mアスパラギン酸カリウム(pH7.0) 0.2ml
酵素液 0.1ml
水（バランス）計 1ml
*1：1M Tris-HCl(pH8.1) 9ml, 0.3M MgSO₄ 0.5ml, 0.2M ATP(pH7.0) 5ml
*2：8Mヒドロキシルアミン溶液を直前にKOHで中和したもの

表１に示すように、RSFD80プラスミドの導入によりAK活性が約1.7倍に上昇した。また、RSFD80プラスミドにコードされるE. coli由来のAKはＬ−リジンにより阻害が完全に解除されていることが確認された。また、AS1株が元来保持するAKは、Ｌ−リジン単独では阻害を受けないことがわかった。尚、本発明者らは、AS1株由来のAKは、Ｌ−リジンとＬ−スレオニンが反応液中に各2mMずつ存在するときに、100%阻害されることを発見している（協奏阻害）。

（３）E. coli由来の変異型lysC及び変異型dapAを保持するメチロフィラス属細菌によるＬ−リジンの製造
次に、AS1/RSFD80およびAS1/pRS株をストレプトマイシン20mg/Lを含む121生産培地に植菌し、37℃で34時間振とう培養した。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表２に示す。

実施例２Ｌ−リジン生産菌の創製（２）
（１）広宿主域ベクターへのtacプロモーター領域の組込み
Ｌ−リジン(Lys)の生合成に関与する酵素をメチロフィラス・メチロトロファス内で高
生産させる為に、E.coliで多用されるtacプロモーターを、目的酵素の遺伝子発現用に用いた。

tacプロモーター領域は、pKK233-3(ファルマシア社製)のDNAをPCRの鋳型に用い、配列番号１５及び１６の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとして、耐熱性DNAポリメラーゼによるPCRにて増幅し取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-60秒のサイクルを30回という条件で行った。その後、その増幅DNA断片を回収し、制限酵素EcoRI及びPstIにて処理した。一方、広宿主域ベクターpRS（特表平3-501682号公報参照）も同じ制限酵素にて切断し、それぞれの制限酵素切断端に、上記のtacプロモーター領域を含むDNA断片を組み入れ、pRS-tacを作成した。

（２）dapA遺伝子（ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子）発現プラスミドpRS-dapA24およびlysC遺伝子(アスパルトキナーゼ遺伝子)発現プラスミドpRS-lysC80の作成
Lysによる酵素活性のフィードバック阻害が幾分解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素の変異型遺伝子(dapA^*24)を（１）に記載した方法にて作成したプラスミドpRS-tacに組み入れた。

まずdapA^*24遺伝子領域はRSFD80(実施例１参照)のDNAを鋳型に、配列番号１７及び１８の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとしてPCRにて増幅して取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-90秒のサイクルを30回という条件で行った。その断片を制限酵素Sse8387I及びXbaIにて処理し、それぞれの切断端をもつdapA^*24遺伝子断片を調製した。一方、pRS-tacも、同様にSse8387Iで処理し、XbaIにて部分消化した。そこへ上記のdapA^*24遺伝子断片をT4-DNAリガーゼにて連結することでpRS-dapA24を得た。

また同様に、Lysによる酵素活性のフィードバック阻害が幾分解除されたアスパルトキナーゼの遺伝子（lysC^*80）も、RSFD80のDNAを鋳型にし、配列番号１９及び２０の塩基配列をもつDNA断片をプライマーとしたPCRにて取得した。PCRは、94℃-20秒、60℃-30秒及び72℃-90秒のサイクルを30回という条件で行った。得られたDNA断片は制限酵素Sse8387I及びSapIにて処理した。一方、ベクターであるpRS-tacも制限酵素Sse8387I及びSapIにて処理し、これに、上記のlysC^*80遺伝子断片をT4 DNAリガーゼにて連結することで、pRS-lysC80を作成した。

（３）pRS-dapA24またはpRS-lysC80のメチロフィラス・メチロトロファスへの導入と培養評価
上記のようにして得られたpRS-dapA24及びpRS-lysC80を、それぞれ、エレクトロポレーション法によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)に導入し、AS1/pRS-dapA24及びAS1/pRS-lysC80を得た。それぞれストレプトマイシン20mg/Lを含む121生産培地に植菌し、37℃で48時間振とう培養した。同様に対照株としてpRSを有するAS1株も培養した。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表３に示す。

実施例３Ｌ−リジン生産菌の創製（３）
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を、121M1培地に植菌し37℃で15時間培養した。得られた菌体を常法によりNTG処理（NTG濃度100mg/L、37℃、５分）し、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（AEC）7g/L、及びＬ−スレオニン3g/Lを含有する121M1寒天培地に塗布した。これを、37℃で２〜８日間培養し、生じたコロニーを釣菌分離して、AEC耐性株を取得した。

上記のAEC耐性株を、121生産培地に植菌し、好気的に37℃で38時間培養した。培養終了後、培地から菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。親株よりＬ−リジン生産能が向上した株を選択し、メチロフィラス・メチロトロファスAR-166株と命名した。親株（AS1株）及びAR-166株のＬ−リジン生産量を表４に示す。

メチロフィラス・メチロトロファスAR-166株は、プライベートナンバーAJ13608が付与され、1999年6月10日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-17416として寄託され、そして2000年3月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7112が付与されている。

実施例４Ｌ−スレオニン生産菌の創製
（１）メチロフィラス属細菌へのスレオニンオペロンプラスミドの導入
E.coli由来のスレオニンオペロンを搭載したプラスミドpVIC40 (WO90/04636国際公開パンフレット、特表平3-501682号公報)をエレクトロポレーション法 (Canadian Journal of
Microbiology, 43, 197(1997))によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株 (NCIMB10515) に導入し、AS1/pVIC40株を得た。対照として、pVIC40プラスミドよりスレオニンオペロンをコードするDNA領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドpRSプラスミド(特表平3-501682号公報)をpVIC40と同様にしてAS1株に導入し、AS1/pRS株を得た。

（２）E.coli由来のスレオニンオペロンを保持するメチロフィラス属細菌によるＬ−スレオニンの製造
AS1/pVIC40及びAS1/pRS株を、ストレプトマイシン20mg/L、Ｌ−バリン1g/l及びＬ−ロイシン1g/lを含む121生産培地に植菌し、37℃で50時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−スレオニン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表５に示す。

実施例５分岐鎖アミノ酸生産菌の創製
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を、121M1培地に植菌し、37℃で15時間培養した。得られた菌体を常法によりNTG処理（NTG濃度100mg/L、37℃、５分）し、カザミノ酸（DIFCO社製）0.5%を含有する121M1寒天培地に塗布した。これを37℃で２〜８日間培養し、コロニーを形成させた。これらのコロニーを釣菌分離して、121M1寒天培地及びカザミノ酸0.5%を含有する121M1寒天培地に植菌し、前者に比べて後者で生育がよい株を選択し、これをカザミノ酸要求株とした。こうして、５００株のNTG処理株から９株のリーキーなカザミノ酸要求株を得た。これらのカザミノ酸要求株から、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンを親株よりも多く培地中に蓄積する株を１株得た。これをメチロフィラス・メチロトロファスC138株と命名した。

メチロフィラス・メチロトロファスC138株は、プライベートナンバーAJ13609が付与され、1999年6月10日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-17417として寄託され、そして2000年3月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7113が付与されている。

親株（AS1株）及びC138株を、121生産培地に植菌し、好気的に37℃で34時間培養した。培養終了後、培地から菌体及び炭酸カルシウムを遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−バリン、Ｌ−ロイシン及びＬ−イソロイシンの濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表６に示す。

実施例６メチロフィラス・メチロトロファスAS1株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製
（１）メチロフィラス・メチロトロファスAS1株からの染色体DNAの調製
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株（NCIMB10515）を試験管内5mlの121M1培地に一白金耳植菌し、37℃一晩振盪培養した。得られた培養液を500ml容坂口フラスコ内の50mlの121M1培地に1%となるように接種し、37℃にて一晩振盪培養した後、遠心分離にて集菌した。50mlのTEN溶液（50mM Tris-HCl (pH8.0), 10mM EDTA及び20mM NaClからなる溶液 (pH8.0)）に懸濁し、遠心分離して集菌後、5mg/mlのリゾチームおよび10μg/mlのリボヌクレアーゼＡを含む5mlのTEN溶液に再懸濁した。37℃で30分間保温後、プロテイナーゼＫ及
びラウリル硫酸ナトリウムを終濃度が各々10μg/ml及び0.5 %(wt/vol)となるように添加した。

70℃で２時間保温後、等量の飽和フェノール溶液（10mM Tris-HCl (pH 8.0) で飽和したフェノール溶液）を加えて混合した後、遠心分離して上清を回収し、等量のフェノール・クロロホルム溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝25：24：1）を加えて混合し、遠心分離した。上清を回収後、等量のクロロホルム溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝24：1）を加えて同様の抽出操作を繰り返した。上清に1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)と2.5容のエタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 8.0)）適量に溶解した。

（２）遺伝子ライブラリーの調製
（１）で得られた染色体DNA（1μg/μl）50μl、H緩衝液（500mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM ジチオスレイトール, 1000mM NaCl (pH7.5)）20μl、制限酵素Sau3AI（宝酒造製）8単位を、全容200μl中で37℃において10分間反応させた後、200μlのフェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、0.8%アガロースゲルにて分離し、2〜5キロベースペア（以下「kbp」と記載）に相当するDNAを、Concert^TM Rapid Gel Extraction System（DNA回収キット、GIBCO BRL社製）を用いて回収した。このようにして分画したサイズをもつDNAの溶液を50μl得た。

一方、プラスミドpUC118（宝酒造製）2.5μg、K緩衝液（200mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM ジチオスレイトール, 1000mM KCl (pH8.5)）2μl、制限酵素BamHI（宝酒造製）10単位を、全容20μl中で37℃において２時間反応させた後、子牛小腸アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）20単位を添加して、さらに30分間反応させた。等量のフェノール・クロロホルム溶液を加えて混合、遠心分離し、上清を回収後、等量のクロロホルム溶液を加えて同様の抽出操作を繰り返した。上清に1/10量の3M酢酸ナトリウム(pH4.8)と2.5容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。このDNAを遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液に溶解した。

以上のように調製した染色体DNAのSau3AI消化物と、pUC118のBamHI消化物を、Ligation
Kit ver.2（宝酒造製）を用いて連結させた。反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウム (pH4.8)と2.5容のエタノールを加えてDNAを沈殿させた。これを遠心分離して回収後、70%のエタノールで洗浄し、真空乾燥させ、TE溶液に溶解した（リガーゼ液Ａ）。

上記の操作と同様にして、染色体DNAを制限酵素AluI(宝酒造製)にて部分消化した断片とプラスミドpSTV29(宝酒造製)をSmaIにて消化した断片を連結したものも調製した（リガーゼ液Ｂ）。

E. coli JM109を試験管内5mlのＬ培地に一白金耳植菌し、37℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を500ml容坂口フラスコ内の50mlのＬ培地に1%となるように接種し、37℃にて、OD₆₆₀が0.5〜0.6となるまで培養した後、15分間氷冷した。4℃で遠心分離して集菌した。菌体を50mlの氷冷した水に懸濁し、遠心分離して菌を洗浄した。この操作をもう一度繰り返した後、50mlの氷冷した10%グリセロール溶液に懸濁し、遠心分離して菌を洗浄した。菌体と同じ容量の10%グリセロール溶液に懸濁して50μlずつ分注した。各50μl容量分の細胞に対して、上記で調製したリガーゼ液Ａあるいはリガーゼ液Ｂをそれぞれ１μl加え、BioRad社製のエレクトロポレーション装置専用（0.1cm幅)のキュベット（予め氷冷）に混合液を移した。

装置の設定を1.8kV、25μF、パルスコントローラーの設定を200Ωにした。キュベット
を装置にセットし、パルスを印加した。印加後、直ちに氷冷したSOC培地1mlを加え、滅菌した試験管に移し、37℃で１時間振盪培養した。抗生物質を含むＬ寒天培地（リガーゼ液Ａを用いた場合は100μg/mlのアンピシリン、リガーゼ液Ｂを用いた場合は20μg/mlクロラムフェニコール）にそれぞれの菌体培養液を塗布し、37℃で一晩保温した。各寒天培地上に出現したコロニーを各々掻き集め、500ml容坂口フラスコ内の、各々の抗生物質を含むＬ培地50mlに各々接種し、37℃で２時間振盪培養した。アルカリSDS法にて各々の培養液からプラスミドDNAを抽出し、それぞれ遺伝子ライブラリー液Ａおよび遺伝子ライブラリー液Ｂとした。

実施例７メチロフィラス・メチロトロファスAS1株のリジン生合成遺伝子のクローニング
（１）アスパルトキナーゼ（AK）をコードする遺伝子のクローニング
３つのAKをコードする遺伝子(thrA, metLM, lysC)を欠損したE. coli GT3を、上記と同じエレクトロポレーション法で、遺伝子ライブラリー液Ｂを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、培養液を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地に塗布しコロニーを出現させた。これをマスタープレートとして、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9寒天培地へのレプリカを行い、37℃にて２〜３日間保温した。宿主はAK活性を有さないためにジアミノピメリン酸を含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のAKをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。

約3000個の形質転換体から２個がM9培地にコロニーを形成した。M9培地で出現したコロニーよりプラスミドを抽出し、解析を行ったところ、プラスミド上に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMASK-1、pMMASK-2と命名した。これらのプラスミドを用いて、再度E. coli GT3を形質転換したところ、形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらにこれらのプラスミドを各々含む形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離して集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Miyajimaらの方法（Journal of Biochemistry (Tokyo), vol.63, 139-148 (1968)）に従いAK活性を測定した（図３、pMMASK-1、pMMASK-2）。なお、ベクターpSTV29を保持するGT3株を、20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養し、AK活性を測定した（図３、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体に比べて、挿入断片を有する２つのクローンには有意にAK活性の増加が認められたので、pSTV29上にクローニングできた遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のAKをコードする遺伝子であることが判明した。この遺伝子をaskと命名した。

ask遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。pMMASK-1とpMMASK-2は共通の断片を含んでいることがわかった。このようにして得られたメチロフィラス・メチロトロファス由来ask遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号５に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号５及び６に示す。

（２）アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ASD）をコードする遺伝子のクローニング
asd遺伝子を欠損したE. coli Hfr3000 U482 (CGSC 5081株)を、上記と同様にして、エレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ｂを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離にて集菌した。菌体をL培地に懸濁後、遠心分離にて洗浄を行った。同様の洗浄操作をもう一度繰り返し、菌体をL培地に懸濁後、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。宿主はasd遺伝子を欠損しているために、ジアミ
ノピメリン酸を含んでいないＬ培地では生育が非常に遅い。これに対してメチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりＬ培地においても正常な生育が観察されると予想される。さらにM9最少培地において、宿主E. coliは生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。そこでＬ培地で正常に生育してきた形質転換体のコロニーを釣上げ、これをM9寒天培地に画線培養したところ生育が認められ、予想どおりこれら形質転換株においてASDをコードする遺伝子が機能していることを確認した。

M9培地で出現した形質転換体３株よりプラスミドを抽出し、それらプラスミドの中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMASD-1、pMMASD-2、pMMASD-3と命名した。これらのプラスミドを用いて再度E. coli Hfr3000 U482を形質転換したところ、各形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに各形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一晩培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて粗酵素液を調製し、Boyらの方法（Journal of Bacteriology, vol.112(1), 84-92(1972)）に準じてASD活性を測定した（図４、pMMASD-1、pMMASD-2、pMMASD-3）。なお、コントロール実験についてはベクターを保持する宿主を、20μg/mlのジアミノピメリン酸及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養しASD活性を測定した（図４、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性を検出できなかったのに対して、挿入断片を有する３つのクローンにはASD活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のASDをコードする遺伝子（asdと命名）であることが判明した。

asd遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。そして得られた３つのクローンは全て共通の断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来asd遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号７に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。

（３）ジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS)をコードする遺伝子のクローニング
dapA遺伝子を欠損したE. coli AT997(CGSC 4547株)を、上記と同じエレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、培養液を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地に塗布しコロニーを出現させた。これをマスタープレートとして100μg/mlのアンピシリンを含むM9最少寒天培地へのレプリカを行い37℃にて2〜3日間保温した。宿主はdapA遺伝子を欠損しているために、ジアミノピメリン酸を含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPSをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。

M9培地で出現したコロニー２株よりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMDAPA-1、pMMDAPA-2と命名した。これらのプラスミドを用いてE. coli AT997をあらためて形質転換したところ、各形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらにこれらのプラスミドを含む形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Yugariらの方法（Journal of Biological Chemistry, vol.240, p.4710(1965)）に従いDDPS活性を測定した（図５、pMMDAPA-1、pMMDAPA-2）。なお、コントロール実験についてはベクターを保持する宿主を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて同様に培養し、DDPS活性を測定した（図５、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性を検出できなかったのに対して、挿入断片を有するプラスミドをもつ各形質転換体にはDDPS活性を検出すること
ができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPSをコードする遺伝子（dapAと命名）であることが判明した。

dapA遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。２つの挿入断片中には共通するDNA断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来dapA遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号９に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号９及び１０に示す。

（４）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（DDPR）をコードする遺伝子のクローニング
dapB遺伝子を欠損したE. coli AT999 (CGSC 4549株)を、上記と同じエレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液に、20μg/mlのジアミノピメリン酸を含むSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離にて集菌した。菌体をL培地に懸濁後、遠心分離にて洗浄を行った。同様の洗浄操作をもう一度繰り返しL培地に懸濁後、100μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天培地に培養液を塗布し、37℃一晩保温した。宿主はdapB遺伝子を欠損しているためにジアミノピメリン酸を含んでいないＬ培地では生育が非常に遅い。メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子をもつプラスミドを保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりＬ培地においても正常な生育が観察される。さらにM9最少培地において宿主E. coliは生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPR遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。

Ｌ培地で正常に生育してきた形質転換体をＭ９寒天培地に画線培養したところ、M9培地上でも生育してきた。こうしてこのDDPRをコードする遺伝子が機能していることを確認した。M9培地で出現したコロニーよりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。当該プラスミド（pMMDAPB）を用いて、再度E. coli AT999を形質転換したところ、当該形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに当該プラスミドを含む形質転換体をL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Tamirらの方法（Journal of Biological Chemistry, vol.249, p.3034(1974)）に従いDDPR活性を測定した（図６、pMMDAPB）。なお、コントロール実験については、ベクターを保持する宿主を20μg/mlのジアミノピメリン酸及び100μg/mlのアンピシリンを含むL培地にて同様に培養し、DDPR活性を測定した（図６、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性は検出できなかったのに対して、pMMDAPBを有する形質転換体にはDDPR活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDDPRをコードする遺伝子（dapBと命名）であることが判明した。

dapB遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。メチロフィラス・メチロトロファス由来dapB遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１１に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１１及び１２に示す。

（５）ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(DPDC)をコードする遺伝子のクローニング
lysA遺伝子を欠損したE. coli AT2453(CGSC 4505株)を、上記と同じエレクトロポレーション法で遺伝子ライブラリー液Ａを用いて形質転換した。形質転換液にSOC培地を添加し、37℃にて振盪培養後、遠心分離し、菌体を5mlの滅菌水に懸濁しさらに遠心分離し洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、菌体を500μlの滅菌水に懸濁し、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9最少寒天培地に培養液を塗布し、37℃にて2〜3日間保温した。宿主はlysA遺伝子を欠損しているためにリジンを含んでいないM9最少培地において生育できないのに対し、メチロフィラス・メチロトロファス由来のDPDCをコードする遺伝子を保持する形質転換株は、当該遺伝子が機能することによりM9最少培地で生育可能となる。

M9培地で出現した形質転換体３株よりプラスミドを抽出し調べたところ、プラスミド中に挿入断片の存在を確認した。各々のプラスミドをpMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3と命名した。これらのプラスミドを用いてE. coli AT2453をあらためて形質転換したところ、各プラスミドの形質転換体はM9最少培地にて生育した。さらに各当該プラスミドを含む形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて一夜培養し、培養液を遠心分離にて集菌後、超音波破砕にて細胞抽出液を調製し、Cremerらの方法（Journal of General Microbiology, vol.134, 3221-3229(1988)）に従いDPDC活性を測定した（図７、pMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3）。なお、コントロール実験については、ベクターを保持する宿主を20μg/mlのクロラムフェニコールを含むL培地にて同様に培養しDPDC活性を測定した（図７、Vector）。その結果、ベクターのみを保持する形質転換体には酵素活性は検出できなかったのに対して、挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転換体3株からはいずれもDPDC活性を検出することができたので、取得した遺伝子はメチロフィラス・メチロトロファス由来のDPDCをコードする遺伝子（lysAと命名）であることが判明した。

lysA遺伝子のDNA塩基配列はダイデオキシ法にて決定した。３つの挿入断片は全て共通のDNA断片を含んでいることがわかった。メチロフィラス・メチロトロファス由来lysA遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１３に示した。また、同塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を、配列番号１３及び１４に示す。

本発明により、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌、同細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法、及びＬ−アミノ酸含量が増加したメチロフィラス属細菌菌体が提供される。本発明の方法によれば、メタノールを原料としてＬ−アミノ酸を製造することが可能となる。また、本発明により、メチロフィラス属細菌の新規なＬ−リジン生合成酵素遺伝子が提供される。

変異型ｄａｐＡを有するプラスミドＲＳＦ２４Ｐの製造工程を示す図。「ｄａｐＡ^*２４」は、１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型ＤＤＰＳをコード変異型ｄａｐＡを表す。変異型ｄａｐＡ及び変異型ｌｙｓＣを有するプラスミドＲＳＦＤ８０の製造工程を示す図。「ｌｙｓＣ^*８０」は、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異型ＡＫＩＩＩをコード変異型ｌｙｓＣを表す。ａｓｋ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のアスパルトキナーゼ活性を示す図。ａｓｄ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を示す図。ｄａｐＡ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を示す図。ｄａｐＢ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を示す図。ｌｙｓＡ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ形質転換株のジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活性を示す図。

Claims

Ｌ−アミノ酸生産能を有するメチロフィラス属細菌。
Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−スレオニンである請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
Ｌ−アミノ酸アナログ耐性又はＬ−アミノ酸要求性を有する請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
アスパルトキナーゼ活性が増強され、Ｌ−リジン生産能を有する請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
さらにアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素から選ばれる１種、２種又は３種の酵素の活性が増強された請求項５〜７のいずれか一項に記載のメチロフィラス属細菌。
アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性が増強され、Ｌ−スレオニン生産能を有する請求項１記載のメチロフィラス属細菌。
メチロフィラス属細菌がメチロフィラス・メチロトロファスである請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のメチロフィラス属細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする請求項１１記載の方法。