JP2001231584A - 変異型ｉｌｖＨ遺伝子及びＬ−バリンの製造法 - Google Patents
変異型ｉｌｖＨ遺伝子及びＬ−バリンの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受けな
いAHAS IIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡを保持する細
菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造法を提供す
る。 【解決手段】 Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を
受けず、かつ、ピルビン酸からα−アセト乳酸を生成す
る反応、及び、α−ケト酪酸及びピルビン酸からα−ア
セト−α−ヒドロキシ酪酸を生成する反応を触媒する活
性を有するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ
酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするＤＮＡを保
持し、Ｌ−バリン生産能を有する細菌を培地に培養し、
該培地中にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ−
バリンを採取することにより、Ｌ−バリンを製造する。
いAHAS IIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡを保持する細
菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造法を提供す
る。 【解決手段】 Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を
受けず、かつ、ピルビン酸からα−アセト乳酸を生成す
る反応、及び、α−ケト酪酸及びピルビン酸からα−ア
セト−α−ヒドロキシ酪酸を生成する反応を触媒する活
性を有するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ
酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするＤＮＡを保
持し、Ｌ−バリン生産能を有する細菌を培地に培養し、
該培地中にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ−
バリンを採取することにより、Ｌ−バリンを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
バリンの製造法に関し、詳しくは、Ｌ−バリンによるフ
ィードバック阻害を受けないアセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼアイソザイムIIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡを
保持する細菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造法
に関する。
バリンの製造法に関し、詳しくは、Ｌ−バリンによるフ
ィードバック阻害を受けないアセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼアイソザイムIIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡを
保持する細菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−バリンは、主としてブレビバ
クテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属
に属するＬ−バリンまたはＬ−ロイシン生産菌またはそ
れらの変異株を用いた発酵法により製造されている（ア
ミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１
９８６年）。従来の方法により、Ｌ−バリン及びＬ−ロ
イシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−
バリン及びＬ−ロイシンの需要の一層の増大に応えるた
めには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求めら
れている。
クテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属
に属するＬ−バリンまたはＬ−ロイシン生産菌またはそ
れらの変異株を用いた発酵法により製造されている（ア
ミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１
９８６年）。従来の方法により、Ｌ−バリン及びＬ−ロ
イシンの生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−
バリン及びＬ−ロイシンの需要の一層の増大に応えるた
めには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求めら
れている。
【０００３】上記の細菌以外の細菌によるＬ−バリン生
産の例としては、エシェリヒア属に属し、生育のために
リポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを
欠損する変異を有するＬ−バリン生産菌、これらの性質
に加えて、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及
びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、スレオニンデアミナー
ゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤ
ＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌が知
られている（ＷＯ９６／０６９２６）。
産の例としては、エシェリヒア属に属し、生育のために
リポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを
欠損する変異を有するＬ−バリン生産菌、これらの性質
に加えて、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及
びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、スレオニンデアミナー
ゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤ
ＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌が知
られている（ＷＯ９６／０６９２６）。
【０００４】Ｌ−バリンの生合成の最終段階の反応は、
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされる酵素群
によって行われる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、ｉｌ
ｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＤ、ｉｌｖＡの各遺
伝子を有しており、各々順に、アセトヒドロキシ酸シン
ターゼのアイソザイムIIの大サブユニット、小サブユニ
ット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラタ
ーゼ及びスレオニンデアミナーゼをコードしている。こ
れらの酵素のうち、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ト
ランスアミナーゼ及びジヒドロキシ酸デヒドラターゼ
は、ピルビン酸からＬ−バリンへの合成経路、及び２−
ケト酪酸からＬ−イソロイシンへの合成経路を触媒し、
スレオニンデアミナーゼはＬ−イソロイシン生合成系の
律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱
アミノ化反応を触媒する。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロ
ンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又
はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエ
ーション）を受ける。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされる酵素群
によって行われる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、ｉｌ
ｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＤ、ｉｌｖＡの各遺
伝子を有しており、各々順に、アセトヒドロキシ酸シン
ターゼのアイソザイムIIの大サブユニット、小サブユニ
ット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラタ
ーゼ及びスレオニンデアミナーゼをコードしている。こ
れらの酵素のうち、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ト
ランスアミナーゼ及びジヒドロキシ酸デヒドラターゼ
は、ピルビン酸からＬ−バリンへの合成経路、及び２−
ケト酪酸からＬ−イソロイシンへの合成経路を触媒し、
スレオニンデアミナーゼはＬ−イソロイシン生合成系の
律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱
アミノ化反応を触媒する。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロ
ンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又
はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエ
ーション）を受ける。
【０００５】ところで、Ｌ−バリン生合成に関与するア
セトヒドロキシ酸シンターゼとしては、アイソザイムII
（以下、「AHAS II」ともいう）の他に、アイソザイムI
II（以下、「AHAS III」ともいう）が知られている。AH
AS IIIは、大サブユニット（触媒サブユニット）をコー
ドするilvIと、小サブユニット（調節サブユニット）を
コードするilvHからなるilvIHオペロンによってコード
されており、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受
ける。
セトヒドロキシ酸シンターゼとしては、アイソザイムII
（以下、「AHAS II」ともいう）の他に、アイソザイムI
II（以下、「AHAS III」ともいう）が知られている。AH
AS IIIは、大サブユニット（触媒サブユニット）をコー
ドするilvIと、小サブユニット（調節サブユニット）を
コードするilvHからなるilvIHオペロンによってコード
されており、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受
ける。
【０００６】前記したように、AHAS IIをコードするＤ
ＮＡは、すでにＬ−バリン生産菌の育種に利用されてい
るが、AHAS IIIについては試みた例は知られていない。
ＮＡは、すでにＬ−バリン生産菌の育種に利用されてい
るが、AHAS IIIについては試みた例は知られていない。
【０００７】尚、Ｌ−バリンに耐性なAHAS IIIを有する
エシェリヒア・コリ変異株からクローニングされた変異
型ilvH遺伝子が、１４位のグリシンからアスパラギン酸
への１アミノ酸置換を有していたことが報告されている
（Vyazmensky, M. et al., Biochemistry, 35, 10339-1
0346 (1996)）。また、AHAS III変異としてilvH612が知
られている（De Felice et al., J Bacteriol., 120, 1
058-1067(1974)）。同変異を有するエシェリヒア・コリ
MI262が持つilvIHオペロン中のilvH遺伝子は、２９位の
AsnがLysに、９２位のGlnが終始コドン（tag）にそれぞ
れ置換される変異を有している（Guardiolae et al.,
J.Bacteriol., 120, 536-538 (1974); De Felice et a
l., J Bacteriol., 120, 1068-1077(1974)）。上記のよ
うに、AHASIIをコードするＤＮＡはＬ−バリン生産菌の
育種に用いられてきたが、AHASIIIについては報告され
ていない。
エシェリヒア・コリ変異株からクローニングされた変異
型ilvH遺伝子が、１４位のグリシンからアスパラギン酸
への１アミノ酸置換を有していたことが報告されている
（Vyazmensky, M. et al., Biochemistry, 35, 10339-1
0346 (1996)）。また、AHAS III変異としてilvH612が知
られている（De Felice et al., J Bacteriol., 120, 1
058-1067(1974)）。同変異を有するエシェリヒア・コリ
MI262が持つilvIHオペロン中のilvH遺伝子は、２９位の
AsnがLysに、９２位のGlnが終始コドン（tag）にそれぞ
れ置換される変異を有している（Guardiolae et al.,
J.Bacteriol., 120, 536-538 (1974); De Felice et a
l., J Bacteriol., 120, 1068-1077(1974)）。上記のよ
うに、AHASIIをコードするＤＮＡはＬ−バリン生産菌の
育種に用いられてきたが、AHASIIIについては報告され
ていない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、Ｌ−バリンによるフィードバック
阻害を受けないAHAS IIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡ
を保持する細菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造
法を提供することを課題とする。
なされたものであり、Ｌ−バリンによるフィードバック
阻害を受けないAHAS IIIをコードするＤＮＡ、同ＤＮＡ
を保持する細菌、及び同細菌を用いたＬ−バリンの製造
法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−バリン耐
性変異株から単離した変異を有する変異を有するAHAS I
IIをコードするＤＮＡをエシェリヒア・コリに導入する
と、Ｌ−バリン生産能が向上することを見い出し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおり
である。
を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｌ−バリン耐
性変異株から単離した変異を有する変異を有するAHAS I
IIをコードするＤＮＡをエシェリヒア・コリに導入する
と、Ｌ−バリン生産能が向上することを見い出し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおり
である。
【０００９】（１）配列表の配列番号２に示すアミノ酸
配列において、アミノ酸番号１７のセリン残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変異、又
はアミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基に置換する変異及びアミノ酸番号
１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の両方の変
異が他のアミノ酸残基に置換する変異の両方の変異を有
するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ酸シン
ターゼアイソザイムIIIの小サブユニットをコードする
ＤＮＡ。 （２）アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換であり、
アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残
基の変異がアスパラギン酸残基への置換である（１）の
ＤＮＡ。 （３）Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受けず、
かつ、ピルビン酸からα−アセト乳酸を生成する反応、
及び、α−ケト酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α
−ヒドロキシ酪酸を生成する反応の２つの反応を触媒す
る活性を有するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロ
キシ酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするＤＮ
Ａ。 （４）前記ＤＮＡは、アセトヒドロキシ酸シンターゼア
イソザイムIIIの大サブユニット及び小サブユニットを
コードするＤＮＡであって、前記小サブユニットは、配
列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ
酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換する変異、アミノ酸番号２９のアス
パラギン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残
基に置換する変異、アミノ酸番号９１より下流のＣ末端
側領域を欠失する変異、又はこれらの変異及びアミノ酸
番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換する変異から選ばれる２又は３以上
の変異の任意の組み合わせを有する（３）のＤＮＡ。 （５）アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換であり、
アミノ酸番号２９のアスパラギン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がリジン残基又はチロシン残基への置換で
あり、アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するアミ
ノ酸残基の変異がアスパラギン酸残基への置換である
（４）のＤＮＡ。
配列において、アミノ酸番号１７のセリン残基に相当す
るアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変異、又
はアミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸残
基が他のアミノ酸残基に置換する変異及びアミノ酸番号
１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の両方の変
異が他のアミノ酸残基に置換する変異の両方の変異を有
するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ酸シン
ターゼアイソザイムIIIの小サブユニットをコードする
ＤＮＡ。 （２）アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換であり、
アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残
基の変異がアスパラギン酸残基への置換である（１）の
ＤＮＡ。 （３）Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を受けず、
かつ、ピルビン酸からα−アセト乳酸を生成する反応、
及び、α−ケト酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α
−ヒドロキシ酪酸を生成する反応の２つの反応を触媒す
る活性を有するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロ
キシ酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするＤＮ
Ａ。 （４）前記ＤＮＡは、アセトヒドロキシ酸シンターゼア
イソザイムIIIの大サブユニット及び小サブユニットを
コードするＤＮＡであって、前記小サブユニットは、配
列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ
酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換する変異、アミノ酸番号２９のアス
パラギン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残
基に置換する変異、アミノ酸番号９１より下流のＣ末端
側領域を欠失する変異、又はこれらの変異及びアミノ酸
番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換する変異から選ばれる２又は３以上
の変異の任意の組み合わせを有する（３）のＤＮＡ。 （５）アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換であり、
アミノ酸番号２９のアスパラギン残基に相当するアミノ
酸残基の変異がリジン残基又はチロシン残基への置換で
あり、アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するアミ
ノ酸残基の変異がアスパラギン酸残基への置換である
（４）のＤＮＡ。
【００１０】（６）前記（１）又は（３）のＤＮＡを染
色体ＤＮＡ上又はプラスミド上に保持し、かつ、Ｌ−バ
リン生産能を有する細菌。 （７）前記ＤＮＡの発現が強化された（６）の細菌。 （８）発現の強化が、前記ＤＮＡを強力なプロモーター
の制御下に置くこと、又は前記ＤＮＡのコピー数を高め
ることによるものである（７）の細菌。 （９）前記（６）の細菌を培地に培養し、該培地中にＬ
−バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ−バリンを採取
することを特徴とするＬ−バリンの製造法。
色体ＤＮＡ上又はプラスミド上に保持し、かつ、Ｌ−バ
リン生産能を有する細菌。 （７）前記ＤＮＡの発現が強化された（６）の細菌。 （８）発現の強化が、前記ＤＮＡを強力なプロモーター
の制御下に置くこと、又は前記ＤＮＡのコピー数を高め
ることによるものである（７）の細菌。 （９）前記（６）の細菌を培地に培養し、該培地中にＬ
−バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ−バリンを採取
することを特徴とするＬ−バリンの製造法。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一のＤＮＡは、AHAS IIIの大サブユニットと
ともにＬ−バリンによる阻害を受けずにアセトヒドロキ
シ酸シンターゼ活性を示すエシェリヒア・コリ由来のAH
AS IIIの小サブユニットをコードするＤＮＡである。こ
こで、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性とは、ピルビ
ン酸からα−アセト乳酸を生成する反応、及び、α−ケ
ト酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α−ヒドロキシ
酪酸を生成する反応の２つの反応を触媒する活性をい
う。エシェリヒア・コリ野生株のAHAS III小サブユニッ
トは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有す
る。
本発明の第一のＤＮＡは、AHAS IIIの大サブユニットと
ともにＬ−バリンによる阻害を受けずにアセトヒドロキ
シ酸シンターゼ活性を示すエシェリヒア・コリ由来のAH
AS IIIの小サブユニットをコードするＤＮＡである。こ
こで、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性とは、ピルビ
ン酸からα−アセト乳酸を生成する反応、及び、α−ケ
ト酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α−ヒドロキシ
酪酸を生成する反応の２つの反応を触媒する活性をい
う。エシェリヒア・コリ野生株のAHAS III小サブユニッ
トは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有す
る。
【００１２】上記変異は、配列表の配列番号２に示すア
ミノ酸配列において、アミノ酸番号１７のセリン残基に
相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変
異、又はアミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変異及びアミノ
酸番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の両
方の変異が他のアミノ酸残基に置換する変異の両方の変
異である。前記変異としては、アミノ酸番号１７のセリ
ン残基に相当するアミノ酸残基においてはフェニルアラ
ニン残基への置換、アミノ酸番号１４のグリシン残基に
相当するアミノ酸残基においてはアスパラギン酸残基へ
の置換が好ましい。
ミノ酸配列において、アミノ酸番号１７のセリン残基に
相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変
異、又はアミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミ
ノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変異及びアミノ
酸番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の両
方の変異が他のアミノ酸残基に置換する変異の両方の変
異である。前記変異としては、アミノ酸番号１７のセリ
ン残基に相当するアミノ酸残基においてはフェニルアラ
ニン残基への置換、アミノ酸番号１４のグリシン残基に
相当するアミノ酸残基においてはアスパラギン酸残基へ
の置換が好ましい。
【００１３】また、本発明の第二のＤＮＡは、Ｌ−バリ
ンによるフィードバック阻害を受けず、かつ、ピルビン
酸からα−アセト乳酸を生成する反応、及び、α−ケト
酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α−ヒドロキシ酪
酸を生成する反応の２つの反応を触媒する活性を有する
AHAS IIIをコードするＤＮＡである。同ＤＮＡは、AHAS
IIIの大サブユニット及び小サブユニットをともにコー
ドする。また、前記小サブユニットは、配列表の配列番
号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７の
セリン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
に置換する変異、アミノ酸番号２９のアスパラギン残基
に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する
変異、アミノ酸番号９１より下流のＣ末端側領域を欠失
する変異、又はこれらの変異及びアミノ酸番号１４のグ
リシン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
に置換する変異から選ばれる２又は３以上の変異の任意
の組み合わせを有する。以下、これらの変異を有するAH
AS III小サブユニットを、変異型AHAS III小サブユニッ
トともいう。前記変異としては、アミノ酸番号１４のグ
リシン残基に相当するアミノ酸残基においてはアスパラ
ギン酸残基への置換、アミノ酸番号１７のセリン残基に
相当するアミノ酸残基においてはフェニルアラニン残基
への置換、アミノ酸番号２９のアスパラギン残基に相当
するアミノ酸残基においてはリジン残基又はチロシン残
基への置換が好ましい。
ンによるフィードバック阻害を受けず、かつ、ピルビン
酸からα−アセト乳酸を生成する反応、及び、α−ケト
酪酸及びピルビン酸からα−アセト−α−ヒドロキシ酪
酸を生成する反応の２つの反応を触媒する活性を有する
AHAS IIIをコードするＤＮＡである。同ＤＮＡは、AHAS
IIIの大サブユニット及び小サブユニットをともにコー
ドする。また、前記小サブユニットは、配列表の配列番
号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１７の
セリン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
に置換する変異、アミノ酸番号２９のアスパラギン残基
に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する
変異、アミノ酸番号９１より下流のＣ末端側領域を欠失
する変異、又はこれらの変異及びアミノ酸番号１４のグ
リシン残基に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
に置換する変異から選ばれる２又は３以上の変異の任意
の組み合わせを有する。以下、これらの変異を有するAH
AS III小サブユニットを、変異型AHAS III小サブユニッ
トともいう。前記変異としては、アミノ酸番号１４のグ
リシン残基に相当するアミノ酸残基においてはアスパラ
ギン酸残基への置換、アミノ酸番号１７のセリン残基に
相当するアミノ酸残基においてはフェニルアラニン残基
への置換、アミノ酸番号２９のアスパラギン残基に相当
するアミノ酸残基においてはリジン残基又はチロシン残
基への置換が好ましい。
【００１４】本発明のＤＮＡは、エシェリヒア・コリの
Ｌ−バリン耐性変異株から得られたものであるが、野生
型のAHAS IIIをコードするＤＮＡに、上記変異を部位特
異的変異法によって導入することによって、取得するこ
とができる。AHAS IIIは、ilvIHオペロンによってコー
ドされている。ilvIHオペロンは、例えば、エシェリヒ
ア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４
に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRによ
り、ilvIHオペロンのプロモーター領域からilvH遺伝子
の３’末端までのＤＮＡ断片を増幅することにより取得
することができる。エシェリヒア・コリ野生株のilvIH
オペロンの塩基配列は知られている（Genbank/EMBL/DDB
J accession X55034）。配列番号１に、ilvH遺伝子のコ
ード領域の塩基配列を示す。
Ｌ−バリン耐性変異株から得られたものであるが、野生
型のAHAS IIIをコードするＤＮＡに、上記変異を部位特
異的変異法によって導入することによって、取得するこ
とができる。AHAS IIIは、ilvIHオペロンによってコー
ドされている。ilvIHオペロンは、例えば、エシェリヒ
ア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４
に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCRによ
り、ilvIHオペロンのプロモーター領域からilvH遺伝子
の３’末端までのＤＮＡ断片を増幅することにより取得
することができる。エシェリヒア・コリ野生株のilvIH
オペロンの塩基配列は知られている（Genbank/EMBL/DDB
J accession X55034）。配列番号１に、ilvH遺伝子のコ
ード領域の塩基配列を示す。
【００１５】本発明のＤＮＡによってコードされる変異
型AHAS IIIの小サブユニットは、大サブユニットととも
にＬ−バリンによる阻害を受けずにアセトヒドロキシ酸
シンターゼ活性を示す限り、上記変異の他に、１若しく
は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。
型AHAS IIIの小サブユニットは、大サブユニットととも
にＬ−バリンによる阻害を受けずにアセトヒドロキシ酸
シンターゼ活性を示す限り、上記変異の他に、１若しく
は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００１６】上記のような変異型AHAS III小サブユニッ
トと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、
例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ
酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるように塩基配
列を改変することによって得られる。また、上記のよう
な改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理
によっても取得され得る。突然変異処理としては、AHAS
III小サブユニットをコードするＤＮＡをヒドロキシル
アミン等でインビトロ変異処理する方法、及びAHAS III
小サブユニットをコードするＤＮＡを保持するエシェリ
ヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の
通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。
トと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、
例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ
酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるように塩基配
列を改変することによって得られる。また、上記のよう
な改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理
によっても取得され得る。突然変異処理としては、AHAS
III小サブユニットをコードするＤＮＡをヒドロキシル
アミン等でインビトロ変異処理する方法、及びAHAS III
小サブユニットをコードするＤＮＡを保持するエシェリ
ヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の
通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。
【００１７】上記のようにしてインビトロ変異処理した
ＤＮＡを、適当な細胞でマルチコピーで発現させ、その
細胞のＬ−バリンに対する耐性を調べ、耐性が上昇した
ものを選択することにより、変異型AHAS III小サブユニ
ットと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが
得られる。また、一般にタンパク質のアミノ酸配列及び
それをコードする塩基配列は、株間、変異体、変種間で
わずかに異なることが知られているので、実質的に同一
のタンパク質をコードするＤＮＡは、エシェリヒア属の
Ｌ−バリン耐性の種、株、変異体、変種から得ることが
可能である。
ＤＮＡを、適当な細胞でマルチコピーで発現させ、その
細胞のＬ−バリンに対する耐性を調べ、耐性が上昇した
ものを選択することにより、変異型AHAS III小サブユニ
ットと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが
得られる。また、一般にタンパク質のアミノ酸配列及び
それをコードする塩基配列は、株間、変異体、変種間で
わずかに異なることが知られているので、実質的に同一
のタンパク質をコードするＤＮＡは、エシェリヒア属の
Ｌ−バリン耐性の種、株、変異体、変種から得ることが
可能である。
【００１８】具体的には、変異処理したエシェリヒア属
細菌、又はエシェリヒア属細菌の自然突然変異株若しく
は変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を示す
タンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって
も、変異型AHAS III小サブユニットと実質的に同一のタ
ンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同
士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイ
ブリダイズしない条件が挙げられる。
細菌、又はエシェリヒア属細菌の自然突然変異株若しく
は変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を示す
タンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって
も、変異型AHAS III小サブユニットと実質的に同一のタ
ンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同
士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイ
ブリダイズしない条件が挙げられる。
【００１９】本発明の細菌は、本発明の第一のＤＮＡ又
は第二のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上に保
持し、かつ、Ｌ−バリン生産能を有する細菌である。細
菌としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼが関与する
Ｌ−バリン生合成系を有するものであれば特に制限され
ないが、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、セラチア
属細菌等が挙げられる。エシェリヒア属細菌として具体
的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。
は第二のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上に保
持し、かつ、Ｌ−バリン生産能を有する細菌である。細
菌としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼが関与する
Ｌ−バリン生合成系を有するものであれば特に制限され
ないが、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、セラチア
属細菌等が挙げられる。エシェリヒア属細菌として具体
的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。
【００２０】本発明のＤＮＡを細菌に導入するには、本
発明のＤＮＡを含むプラスミドで細菌を形質転換する方
法、又は本発明のＤＮＡを相同組換えにより染色体ＤＮ
Ａに組み込む方法等がある。
発明のＤＮＡを含むプラスミドで細菌を形質転換する方
法、又は本発明のＤＮＡを相同組換えにより染色体ＤＮ
Ａに組み込む方法等がある。
【００２１】本発明のＤＮＡは、発現が強化されている
ことが好ましい。発現の強化は、本発明のＤＮＡを強力
なプロモーターの制御下に置くこと、又は同ＤＮＡのコ
ピー数を高めることによって、行うことができる。強力
なプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐ
プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモータ
ー、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモータ
ー、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐ
ａｃプロモーター等が知られている。本発明のＤＮＡの
コピー数を高めることは、マルチコピーベクター上に保
持させること、又は本発明のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによって、達成できる。マルチ
コピーベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２
８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
ことが好ましい。発現の強化は、本発明のＤＮＡを強力
なプロモーターの制御下に置くこと、又は同ＤＮＡのコ
ピー数を高めることによって、行うことができる。強力
なプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐ
プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモータ
ー、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモータ
ー、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐ
ａｃプロモーター等が知られている。本発明のＤＮＡの
コピー数を高めることは、マルチコピーベクター上に保
持させること、又は本発明のＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによって、達成できる。マルチ
コピーベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２
８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００２２】本発明のＤＮＡを含むベクターを宿主細菌
に導入するには、これまでに報告されている形質転換法
に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ
−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ma
ndel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (197
0)）、あるいはバチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母に
ついて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組
換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフ
ェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報
参照）も応用できる。
に導入するには、これまでに報告されている形質転換法
に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ
−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ma
ndel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (197
0)）、あるいはバチルス・ズブチリスについて報告され
ているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを
調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母に
ついて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組
換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフ
ェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌
に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen.
Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Ho
pwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報
参照）も応用できる。
【００２３】また、細菌の染色体ＤＮＡ上に本発明のＤ
ＮＡを導入するには、直鎖ＤＮＡを用いる方法や、温度
感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがあ
る。また、本発明のＤＮＡを染色体上に保持する細菌か
ら、形質導入によって他の細菌の染色体に本発明のＤＮ
Ａを導入することもできる。本発明のＤＮＡを染色体Ｄ
ＮＡ上に多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより
行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列として
は、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在する
インバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、
特開平2-109985号公報に開示されているように、本発明
のＤＮＡをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
ＮＡを導入するには、直鎖ＤＮＡを用いる方法や、温度
感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがあ
る。また、本発明のＤＮＡを染色体上に保持する細菌か
ら、形質導入によって他の細菌の染色体に本発明のＤＮ
Ａを導入することもできる。本発明のＤＮＡを染色体Ｄ
ＮＡ上に多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより
行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列として
は、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在する
インバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、
特開平2-109985号公報に開示されているように、本発明
のＤＮＡをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
【００２４】本発明のＤＮＡを導入する細菌は、元来Ｌ
−バリン生産能を有するものであってもよいし、本発明
のＤＮＡが導入されることによってＬ−バリン生産能を
獲得したものであってもよい。
−バリン生産能を有するものであってもよいし、本発明
のＤＮＡが導入されることによってＬ−バリン生産能を
獲得したものであってもよい。
【００２５】Ｌ−バリン生産能を有する細菌としては、
例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,
766）等が挙げられる。また、ＷＯ９６／０６９２６に
記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する
変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有
するＬ−バリン生産菌、あるいは、少なくともｉｌｖ
Ｇ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現
し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞
内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明に好適に
使用することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン
は、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又は
Ｌ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエー
ション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現
抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領
域が除去又は変異されていることが好ましい。他のアプ
ローチとして、各々相当するアミノ酸に対する親和性が
低下した（Kmが増加した）アミノアシルtRNAシンターゼ
の変異（ileS or valS）を導入することも有効であると
考えられる。また、前記オペロンは、スレオニンデアミ
ナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,
766）等が挙げられる。また、ＷＯ９６／０６９２６に
記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する
変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有
するＬ−バリン生産菌、あるいは、少なくともｉｌｖ
Ｇ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現
し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞
内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明に好適に
使用することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン
は、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又は
Ｌ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエー
ション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現
抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領
域が除去又は変異されていることが好ましい。他のアプ
ローチとして、各々相当するアミノ酸に対する親和性が
低下した（Kmが増加した）アミノアシルtRNAシンターゼ
の変異（ileS or valS）を導入することも有効であると
考えられる。また、前記オペロンは、スレオニンデアミ
ナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
【００２６】上記のような、アテニュエーションが解除
されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、
ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタ
リー GNIIgenetika（RussianNational Collection of I
ndustrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIge
netika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Mo
scow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託され
ている。
されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、
ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダス
トリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタ
リー GNIIgenetika（RussianNational Collection of I
ndustrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIge
netika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Mo
scow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託され
ている。
【００２７】染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーシ
ョン、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断
及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌ
クレオチドの設定等の方法は、Sambrook, J., Fritsch,
E. F., and Maniatis, T.,"Molecular Cloning", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1.2 (1989)等に記
載されている。
ョン、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断
及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌ
クレオチドの設定等の方法は、Sambrook, J., Fritsch,
E. F., and Maniatis, T.,"Molecular Cloning", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1.2 (1989)等に記
載されている。
【００２８】本発明のＤＮＡを保持し、Ｌ−バリン生産
能を有する細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−バリン
を生成蓄積させ、該培地よりＬ−バリンを採取すること
により、Ｌ−バリンを製造することができる。
能を有する細菌を培地に培養し、該培地中にＬ−バリン
を生成蓄積させ、該培地よりＬ−バリンを採取すること
により、Ｌ−バリンを製造することができる。
【００２９】本発明における細菌の培養および培養液か
らのＬ−バリン採取、精製等は、従来の微生物を用いた
発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよ
い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無
機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する
栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地で
も天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシ
ュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸
があげられる。また使用する微生物の資化性によっては
エタノールやグリセロール等のアルコールを用いること
が出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモ
ニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他
の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体
分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物と
しては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等
が用いられる。
らのＬ−バリン採取、精製等は、従来の微生物を用いた
発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよ
い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無
機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する
栄養源を適当量含有するするものであれば、合成培地で
も天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシ
ュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸
があげられる。また使用する微生物の資化性によっては
エタノールやグリセロール等のアルコールを用いること
が出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモ
ニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他
の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体
分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物と
しては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等
が用いられる。
【００３０】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
に目的とするＬ−バリンが蓄積する。
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
に目的とするＬ−バリンが蓄積する。
【００３１】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするＬ−バリンを採取、精
製することができる。
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするＬ−バリンを採取、精
製することができる。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３３】＜１＞エシェリヒア・コリW3350株由来の
Ｌ−バリン耐性株 エシェリヒア・コリの野生株W3350株から、０．１ｍｇ
／ｍｌのＬ−バリンを含む最少培地上で、Ｌ−バリン耐
性を有する変異株を選択した（W3350 Val0.1 R）。この
変異株のＬ−バリン耐性は、１ｍｇ／ｍｌ以下であっ
た。
Ｌ−バリン耐性株 エシェリヒア・コリの野生株W3350株から、０．１ｍｇ
／ｍｌのＬ−バリンを含む最少培地上で、Ｌ−バリン耐
性を有する変異株を選択した（W3350 Val0.1 R）。この
変異株のＬ−バリン耐性は、１ｍｇ／ｍｌ以下であっ
た。
【００３４】次に、W3350 Val0.1 R株に、エシェリヒア
・コリVKPM B-513株に由来する、内部にトランスポゾン
Tn10が挿入されたロイシンオペロン（leuABCD）(leu::T
n10)を、Ｐ１形質導入した。この形質導入株W3350 Val
0.1 R leu::Tn10から、20mg/mlのＬ−バリン及び0.05mg/
mlのＬ−ロイシンを含む最少培地上で生育するようにな
った二重変異株を誘導した。
・コリVKPM B-513株に由来する、内部にトランスポゾン
Tn10が挿入されたロイシンオペロン（leuABCD）(leu::T
n10)を、Ｐ１形質導入した。この形質導入株W3350 Val
0.1 R leu::Tn10から、20mg/mlのＬ−バリン及び0.05mg/
mlのＬ−ロイシンを含む最少培地上で生育するようにな
った二重変異株を誘導した。
【００３５】＜２＞Ｌ−バリン生産株VL1991の育種 Ｌ−バリン生産性を有するエシェリヒア・コリ VL1970
（VKPM B-4411)）（米国特許第5,658,766）に、高濃度
のスレオニン（＞40mg/ml）又はホモセリン（＞5mg/m
l）に対する耐性に関与する変異（rhtA23）を有する変
異株B3996から単離した前記耐性に関与する遺伝子（米
国特許第5,705,371）を形質導入し、VL1971株を得た。
（VKPM B-4411)）（米国特許第5,658,766）に、高濃度
のスレオニン（＞40mg/ml）又はホモセリン（＞5mg/m
l）に対する耐性に関与する変異（rhtA23）を有する変
異株B3996から単離した前記耐性に関与する遺伝子（米
国特許第5,705,371）を形質導入し、VL1971株を得た。
【００３６】次に、VL1971株に、エシェリヒア・コリVL
478株のシュクロース資化遺伝子群をＰ１ファージを用
いて形質導入し、VL1972株を得た。さらに、VL1972株か
ら親株よりも生育のよい自然突然変異株VL1991株を誘導
した。
478株のシュクロース資化遺伝子群をＰ１ファージを用
いて形質導入し、VL1972株を得た。さらに、VL1972株か
ら親株よりも生育のよい自然突然変異株VL1991株を誘導
した。
【００３７】＜３＞VL1991株へのＬ−バリン耐性の導入 VL1991株に、前記のＬ−バリン耐性の二重変異株が有す
る変異をＰ１形質導入し、さらに、形質導入株からLeu+
となった自然変異株を選択し、VL1997株を得た。次に、
VL1997株に、Tn10が挿入されたilvD遺伝子（ilvD::Tn1
0）をＰ１形質導入してVL1997 ilvD::Tn10を得た。さら
に、VL1997 ilvD::Tn10にエシェリヒア・コリＢ株由来
のilvGMEDAオペロンを形質導入した。こうして得られた
VL1998株から、同株よりも生育のよい自然変異株VL1999
株を選択した。
る変異をＰ１形質導入し、さらに、形質導入株からLeu+
となった自然変異株を選択し、VL1997株を得た。次に、
VL1997株に、Tn10が挿入されたilvD遺伝子（ilvD::Tn1
0）をＰ１形質導入してVL1997 ilvD::Tn10を得た。さら
に、VL1997 ilvD::Tn10にエシェリヒア・コリＢ株由来
のilvGMEDAオペロンを形質導入した。こうして得られた
VL1998株から、同株よりも生育のよい自然変異株VL1999
株を選択した。
【００３８】＜４＞Ｌ−バリン生産株VL1999/pVL715 VL1999株をプラスミドpVL715で形質転換して、Ｌ−バリ
ン生産組換え体VL1999/pVL715を得た。プラスミドpVL71
5は、次のようにして構築した。ilv遺伝子群（ilvGMEDA
YC）を含むBamHI-XmaIII DNA断片を、これらの遺伝子を
含むプラスミドpVR12（Gavrilova et al., Biotechnolo
gy (in Russian), 4,No.5, 600-608 (1988)）から切り
出し、続いてRSF1010の誘導体であるpAYC32（Chistoser
dov and Tsygankov, Plasmid,1986, v.16, pp.161-16
7）に挿入し、pAYC32のBamHI-XmaIII DNA断片と置き換
え、プラスミドpVS712を得た。次に、pVS712からプラス
ミドpVL715を、次のようにして誘導した。このプラスミ
ドは、valyl-tRNAシンセターゼに影響を与えるvalS91変
異（米国特許第5,658,766）を抑制する。pVS712をvalS9
1変異株に導入した。得られた株ValS91/pVS712は、受容
株としてバリン栄養要求性を保持している。次に、バリ
ンを含まない最少培地で生育できる「復帰変異株」を選
択した。それらのいくつかの株では、この性質はプラス
ミドpVS712に含まれるilvGMEDAYC遺伝子の変異が原因と
なっていた。復帰変異株のうちの一株からプラスミドpV
L715を単離した。pVL715を保持するエシェリヒア・コリ
は、pVS712を保持するエシェリヒア・コリに比べて、少
なくともAHAS活性が増強されている。
ン生産組換え体VL1999/pVL715を得た。プラスミドpVL71
5は、次のようにして構築した。ilv遺伝子群（ilvGMEDA
YC）を含むBamHI-XmaIII DNA断片を、これらの遺伝子を
含むプラスミドpVR12（Gavrilova et al., Biotechnolo
gy (in Russian), 4,No.5, 600-608 (1988)）から切り
出し、続いてRSF1010の誘導体であるpAYC32（Chistoser
dov and Tsygankov, Plasmid,1986, v.16, pp.161-16
7）に挿入し、pAYC32のBamHI-XmaIII DNA断片と置き換
え、プラスミドpVS712を得た。次に、pVS712からプラス
ミドpVL715を、次のようにして誘導した。このプラスミ
ドは、valyl-tRNAシンセターゼに影響を与えるvalS91変
異（米国特許第5,658,766）を抑制する。pVS712をvalS9
1変異株に導入した。得られた株ValS91/pVS712は、受容
株としてバリン栄養要求性を保持している。次に、バリ
ンを含まない最少培地で生育できる「復帰変異株」を選
択した。それらのいくつかの株では、この性質はプラス
ミドpVS712に含まれるilvGMEDAYC遺伝子の変異が原因と
なっていた。復帰変異株のうちの一株からプラスミドpV
L715を単離した。pVL715を保持するエシェリヒア・コリ
は、pVS712を保持するエシェリヒア・コリに比べて、少
なくともAHAS活性が増強されている。
【００３９】＜５＞Ｌ−バリン耐性変異の同定 W3350 Val0.1 R株及びVL1997株からilvIH遺伝子をクロー
ニングし、塩基配列を決定した。ilvIH遺伝子のクロー
ニングは、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用いたPCRによりilvIHオペロンのプロモータ
ー領域からilvH遺伝子の３’末端までのＤＮＡ断片を増
幅することにより行った。PCRは、94℃60秒、48℃30
秒、72℃90秒を30サイクル行った。増幅されたilvIH遺
伝子をクレノーフラグメントで処理し、pUC19ベクター
のHincII部位にクローン化し、pILVIH1及びpILVIH1,2を
得た。同様にして、W3350株から野生型ilvIHオペロンを
pUC19中にクローニングして、pILVIHを得た。
ニングし、塩基配列を決定した。ilvIH遺伝子のクロー
ニングは、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプ
ライマーを用いたPCRによりilvIHオペロンのプロモータ
ー領域からilvH遺伝子の３’末端までのＤＮＡ断片を増
幅することにより行った。PCRは、94℃60秒、48℃30
秒、72℃90秒を30サイクル行った。増幅されたilvIH遺
伝子をクレノーフラグメントで処理し、pUC19ベクター
のHincII部位にクローン化し、pILVIH1及びpILVIH1,2を
得た。同様にして、W3350株から野生型ilvIHオペロンを
pUC19中にクローニングして、pILVIHを得た。
【００４０】配列の比較から、W3350 Val0.1 Rの変異型i
lvIHオペロンは、配列番号１中、塩基番号５０における
ＣからＴ、VL1997のそれでは配列番号１中、塩基番号５
０におけるＣからＴ及び塩基番号４１におけるＧからＡ
への２つの置換を含むことが判明した。これらの変異に
より、１７位のSerからPhe、１４位のGlyからAspへのア
ミノ酸置換が生じている。１７位のSerからPheへの変異
部位をilvH1変異、１４位のGlyからAspへの変異部位をi
lvH2変異という。また、これらの変異を有するilvH遺伝
子をそれぞれilvH1、ilvH2、両変異を含む遺伝子をilvH
1,2という。
lvIHオペロンは、配列番号１中、塩基番号５０における
ＣからＴ、VL1997のそれでは配列番号１中、塩基番号５
０におけるＣからＴ及び塩基番号４１におけるＧからＡ
への２つの置換を含むことが判明した。これらの変異に
より、１７位のSerからPhe、１４位のGlyからAspへのア
ミノ酸置換が生じている。１７位のSerからPheへの変異
部位をilvH1変異、１４位のGlyからAspへの変異部位をi
lvH2変異という。また、これらの変異を有するilvH遺伝
子をそれぞれilvH1、ilvH2、両変異を含む遺伝子をilvH
1,2という。
【００４１】＜６＞ilvH1,2変異遺伝子のilvH1変異とil
vH2変異の分離 ilvH1,2のそれぞれの変異の作用を明らかにするため
に、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発によってそ
れらの変異を分離した。
vH2変異の分離 ilvH1,2のそれぞれの変異の作用を明らかにするため
に、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発によってそ
れらの変異を分離した。
【００４２】１４位のGlyからAspへの変異のみを含む変
異型ilvH遺伝子を得るために、この変異が唯一のMluI部
位を生じるという事実を利用した（図１）。かくして、
配列番号５及び６に示す２つのプライマーを合成した。
異型ilvH遺伝子を得るために、この変異が唯一のMluI部
位を生じるという事実を利用した（図１）。かくして、
配列番号５及び６に示す２つのプライマーを合成した。
【００４３】上記プライマーを利用して、ilvH1,2遺伝
子がpUC19にクローン化されたプラスミドpILVIH1,2をPC
Rにより増幅した。その結果、両端にMluI部位を持つ約5
kbの直鎖状DNA断片が生成した。このPCR断片をMluIで切
断した後連結して、目的とする変異のみを含む環状プラ
スミドpILVIH2を得た。これについても、塩基配列解析
によって確認した。
子がpUC19にクローン化されたプラスミドpILVIH1,2をPC
Rにより増幅した。その結果、両端にMluI部位を持つ約5
kbの直鎖状DNA断片が生成した。このPCR断片をMluIで切
断した後連結して、目的とする変異のみを含む環状プラ
スミドpILVIH2を得た。これについても、塩基配列解析
によって確認した。
【００４４】一方、１７位のＳｅｒからＰｈｅへの変異
のみを含む変異型ilvH遺伝子を得るために、配列番号７
及び８に示す塩基配列を有する２つのプライマーをデザ
インした（図２）。
のみを含む変異型ilvH遺伝子を得るために、配列番号７
及び８に示す塩基配列を有する２つのプライマーをデザ
インした（図２）。
【００４５】これらのプライマーを利用して、野生型il
vIHオペロンを含むプラスミドpILVIHを増幅した。生成
したＰＣＲ断片は、ATT（Ileをコードする）が適当なコ
ドンATAに置換されることによって両端にStuI部位を有
する。この断片をStuIで切断した後連結し、新たに導入
された変異部位である１７位のＳｅｒからＰｈｅへの変
異を含む環状プラスミドpILVIH1'を得た。これについて
も、プラスミド中のilvH1遺伝子の塩基配列決定によっ
て実証された。
vIHオペロンを含むプラスミドpILVIHを増幅した。生成
したＰＣＲ断片は、ATT（Ileをコードする）が適当なコ
ドンATAに置換されることによって両端にStuI部位を有
する。この断片をStuIで切断した後連結し、新たに導入
された変異部位である１７位のＳｅｒからＰｈｅへの変
異を含む環状プラスミドpILVIH1'を得た。これについて
も、プラスミド中のilvH1遺伝子の塩基配列決定によっ
て実証された。
【００４６】＜７＞他のＬ−バリン耐性変異の同定 前記と同様にして得られたエシェリヒア・コリW3350株
由来のＬ−バリン耐性変異株２株からilvH遺伝子をクロ
ーニングし、塩基配列を決定した。その結果、一方の株
では配列番号１において塩基番号８５のａからｔへの置
換が、及び、他方の株では塩基番号８７のｃからａへの
置換が生じていることが判明した。これらの変異によ
り、２９位のAsnがTyr又はLysにそれぞれ置換する。２
９位のAsnからTyrへの変異をilvH3、２９位のAsnからLy
sへの変異をilvH4と名付けた。上記変異株からilvIHオ
ペロンをpUC19中にクローニングし、pILVIH3及びpILVIH
4を得た。
由来のＬ−バリン耐性変異株２株からilvH遺伝子をクロ
ーニングし、塩基配列を決定した。その結果、一方の株
では配列番号１において塩基番号８５のａからｔへの置
換が、及び、他方の株では塩基番号８７のｃからａへの
置換が生じていることが判明した。これらの変異によ
り、２９位のAsnがTyr又はLysにそれぞれ置換する。２
９位のAsnからTyrへの変異をilvH3、２９位のAsnからLy
sへの変異をilvH4と名付けた。上記変異株からilvIHオ
ペロンをpUC19中にクローニングし、pILVIH3及びpILVIH
4を得た。
【００４７】また、公知のAHAS III変異であるilvH612
（Guardiolae et al., J. Bacteriol., 120, 536-538
(1974); De Felice et al., J Bacteriol., 120, 1068-
1077(1974)）を有するエシェリヒア・コリMI262 (Ilv
I-, IlvB-, IlvG-)（E. coli Genetic Stock Centerか
ら入手）からilvIHオペロンをpUC19中にクローニング
し、pILVIH262を得た。pILVIH262にクローン化された同
オペロン中のilvH遺伝子は、配列番号１において塩基番
号８７のｃからａへの置換、及び塩基番号２７４のｃか
らｔへの置換の２つの変異を有している(ilvH612)。こ
れらの変異により、２９位のAsnがLysに、９２位のGln
が終始コドン（tag）にそれぞれ置換されている。ま
た、前記ilvIHオペロン中のilvI遺伝子は変異（ilvI61
4）を有し、同遺伝子産物は酵素活性を有しない。変異
型ilvI遺伝子を含むpILVIH262のBamHI断片は、pILVIHの
野生型ilvI遺伝子を含むBamHI断片で置換し、pILVIH612
を得た。
（Guardiolae et al., J. Bacteriol., 120, 536-538
(1974); De Felice et al., J Bacteriol., 120, 1068-
1077(1974)）を有するエシェリヒア・コリMI262 (Ilv
I-, IlvB-, IlvG-)（E. coli Genetic Stock Centerか
ら入手）からilvIHオペロンをpUC19中にクローニング
し、pILVIH262を得た。pILVIH262にクローン化された同
オペロン中のilvH遺伝子は、配列番号１において塩基番
号８７のｃからａへの置換、及び塩基番号２７４のｃか
らｔへの置換の２つの変異を有している(ilvH612)。こ
れらの変異により、２９位のAsnがLysに、９２位のGln
が終始コドン（tag）にそれぞれ置換されている。ま
た、前記ilvIHオペロン中のilvI遺伝子は変異（ilvI61
4）を有し、同遺伝子産物は酵素活性を有しない。変異
型ilvI遺伝子を含むpILVIH262のBamHI断片は、pILVIHの
野生型ilvI遺伝子を含むBamHI断片で置換し、pILVIH612
を得た。
【００４８】＜８＞エシェリヒア・コリ野生株へのilvH
1遺伝子の導入 変異遺伝子ilvH1を、既に記載されている方法（Parker
and Marinus, Gene, 73, 531-535, 1988）を用いて、エ
シェリヒア・コリ野生株W3350の染色体に導入し、W3350
ilvH1株を得た。この株は、Ｌ−バリン耐性が1mg/mlま
で上昇した。すなわち、同株はW3350 Val0.1 R株と同レ
ベルのＬ−バリン耐性を示した。
1遺伝子の導入 変異遺伝子ilvH1を、既に記載されている方法（Parker
and Marinus, Gene, 73, 531-535, 1988）を用いて、エ
シェリヒア・コリ野生株W3350の染色体に導入し、W3350
ilvH1株を得た。この株は、Ｌ−バリン耐性が1mg/mlま
で上昇した。すなわち、同株はW3350 Val0.1 R株と同レ
ベルのＬ−バリン耐性を示した。
【００４９】このように、ilvH1遺伝子と、部位特異的
突然変異誘発によりilvH1,2変異株のilvH2変異から分離
したilvH1変異の塩基配列解析により、細胞に低レベル
のＬ−バリン耐性を与える変異が１７位のＳｅｒからＰ
ｈｅへの置換であることを確認した。
突然変異誘発によりilvH1,2変異株のilvH2変異から分離
したilvH1変異の塩基配列解析により、細胞に低レベル
のＬ−バリン耐性を与える変異が１７位のＳｅｒからＰ
ｈｅへの置換であることを確認した。
【００５０】＜９＞AHASIIIのＬ−バリンによる阻害に
対する耐性へのilvH変異の影響 IlvH1（17Ser→Phe）、ilvH2（14Gly→Asp）、ilvH3（
29Asn→Lys）、ilvH4（ 29Asn→Tyr）、及びilvH612（29
Asn→Lys、及び92Asn→終始コドンTAG）の変異は、以下
のようにAHASIIIのＬ−バリンによる阻害に対する耐性
を付与する。すなわち、AHAS活性を欠損したエシェリヒ
ア・コリMI262株は、種々のilvIH遺伝子が導入される
と、様々なレベルのＬ−バリンに対する耐性で酵素活性
を示す（表１）。また、pILVIH2又はpILVIH612を保持す
る株のAHASは、最も高いＬ−バリン耐性を示した。
対する耐性へのilvH変異の影響 IlvH1（17Ser→Phe）、ilvH2（14Gly→Asp）、ilvH3（
29Asn→Lys）、ilvH4（ 29Asn→Tyr）、及びilvH612（29
Asn→Lys、及び92Asn→終始コドンTAG）の変異は、以下
のようにAHASIIIのＬ−バリンによる阻害に対する耐性
を付与する。すなわち、AHAS活性を欠損したエシェリヒ
ア・コリMI262株は、種々のilvIH遺伝子が導入される
と、様々なレベルのＬ−バリンに対する耐性で酵素活性
を示す（表１）。また、pILVIH2又はpILVIH612を保持す
る株のAHASは、最も高いＬ−バリン耐性を示した。
【００５１】
【表１】
【００５２】＜１０＞Ｌ−バリン生産に対する種々のil
vH変異の作用 Ｌ−バリン生産に対する種々のilvH変異の作用を調べ
た。各変異は、前記と同様にして、VL1970株及びVL1999
/pVL715の染色体に導入した。尚、VL1970株及びVL1999
株の親株（W3350）は、ilvG遺伝子がフレームシフト変
異をもっているために活性のあるアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼのアイソザイムII（AHAS II）を発現していな
い。一方、VL1970株及びVL1999株は活性のあるAHAS II
を発現している。
vH変異の作用 Ｌ−バリン生産に対する種々のilvH変異の作用を調べ
た。各変異は、前記と同様にして、VL1970株及びVL1999
/pVL715の染色体に導入した。尚、VL1970株及びVL1999
株の親株（W3350）は、ilvG遺伝子がフレームシフト変
異をもっているために活性のあるアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼのアイソザイムII（AHAS II）を発現していな
い。一方、VL1970株及びVL1999株は活性のあるAHAS II
を発現している。
【００５３】VL1970に種々のilvH変異を導入し、新規菌
株VL1970 ilvH1、VL1970 ilvH1,2、VL1970 ilvH3、VL19
70 ilvH4、VL1970 ilvH612株を得た。さらに、VL1999/p
VL715に種々のilvH変異を導入し、新規菌株VL1999 ilvH
1,2/pVL715、VL1999 ilvH3/pVL715、VL1999 ilvH612/pV
L715を得た。これらの菌株及び各々の親株を、ニュート
リエントブロスで３７℃で１８時間培養した。得られた
培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中の下
記組成の発酵培地３ｍｌに接種し、３７℃で７２時間、
ロータリーシェーカー（250 r.p.m.）で培養した。培養
後、培地中のＬ−バリンの蓄積量及び560nmにおける吸
光度を公知の方法で測定した。結果を表２及び表３に示
す。表中、ilvH+は野生型ilvH遺伝子を表す。
株VL1970 ilvH1、VL1970 ilvH1,2、VL1970 ilvH3、VL19
70 ilvH4、VL1970 ilvH612株を得た。さらに、VL1999/p
VL715に種々のilvH変異を導入し、新規菌株VL1999 ilvH
1,2/pVL715、VL1999 ilvH3/pVL715、VL1999 ilvH612/pV
L715を得た。これらの菌株及び各々の親株を、ニュート
リエントブロスで３７℃で１８時間培養した。得られた
培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中の下
記組成の発酵培地３ｍｌに接種し、３７℃で７２時間、
ロータリーシェーカー（250 r.p.m.）で培養した。培養
後、培地中のＬ−バリンの蓄積量及び560nmにおける吸
光度を公知の方法で測定した。結果を表２及び表３に示
す。表中、ilvH+は野生型ilvH遺伝子を表す。
【００５４】（発酵培地の組成(g/L)） グルコース 80 (NH4)2SO4 22 K2HPO4 2 NaCl 0.8 MgSO4・7H2O 0.8 FeSO4・7H2O 0.02 MnSO4・5H20 0.02 チアミン塩酸塩 0.2 酵母エキス（Sigma） 1.0 CaCO3 30 （CaCO3は別殺菌した。)
【００５５】
【表２】表２ VL1970によるＬ−バリン生産に対する各
種ilvH変異の作用 ──────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ──────────────────── VL1970 19.4 10.2 VL1970 ilvH1 20.1 11.4 VL1970 ilvH1,2 19.5 12.6 VL1970 ilvH3 18.2 12.62 VL1970 ilvH4 17.2 11.7 VL1970 ilvH612 18.4 12.8 ────────────────────
種ilvH変異の作用 ──────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ──────────────────── VL1970 19.4 10.2 VL1970 ilvH1 20.1 11.4 VL1970 ilvH1,2 19.5 12.6 VL1970 ilvH3 18.2 12.62 VL1970 ilvH4 17.2 11.7 VL1970 ilvH612 18.4 12.8 ────────────────────
【００５６】
【表３】表３ VL1999/pVL715によるＬ−バリン生産に対
する各種ilvH変異の作用 ─────────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ─────────────────────── VL1999 ilvH+/pVL715 17.6 18.7 VL1999 ilvH1,2/pVL715 18.9 23.4 VL1999 ilvH3/pVL715 19.4 20.6 VL1999 ilvH612/pVL715 17.7 20.2 ───────────────────────
する各種ilvH変異の作用 ─────────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ─────────────────────── VL1999 ilvH+/pVL715 17.6 18.7 VL1999 ilvH1,2/pVL715 18.9 23.4 VL1999 ilvH3/pVL715 19.4 20.6 VL1999 ilvH612/pVL715 17.7 20.2 ───────────────────────
【００５７】表２及び表３から、上記のilvH変異は、そ
れぞれ対応するＬ−バリン生産株のＬ−バリン生産性を
改善することがわかる、また、ilvH1及びilvH2変異を組
み合わせると、最もよい結果が得られた。
れぞれ対応するＬ−バリン生産株のＬ−バリン生産性を
改善することがわかる、また、ilvH1及びilvH2変異を組
み合わせると、最もよい結果が得られた。
【００５８】各種変異を有するilvH遺伝子を含むilvIH
オペロンを含むpUC19誘導体を、W3350株に導入した。
尚、W3350株は、ilvG遺伝子がフレームシフト変異をも
っているために、活性のあるAHAS IIが発現していな
い。得られた形質転換株はＬ−バリンを生産し、プラス
ミドpILVIH1,2を含む株が最も生産能が高いことが、表
４から判る。
オペロンを含むpUC19誘導体を、W3350株に導入した。
尚、W3350株は、ilvG遺伝子がフレームシフト変異をも
っているために、活性のあるAHAS IIが発現していな
い。得られた形質転換株はＬ−バリンを生産し、プラス
ミドpILVIH1,2を含む株が最も生産能が高いことが、表
４から判る。
【００５９】
【表４】表４ 各種ilvH変異遺伝子を有するプラスミド
を持つW3350によるＬ−バリン生産 ───────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ───────────────────── W3350 21.4 0 W3350/pILVIH1 13.8 2.3 W3350/pILVIH1,2 10.5 8.2 W3350/pILVIH3 11.7 5.9 W3350/pILVIH4 16.4 5.5 ─────────────────────
を持つW3350によるＬ−バリン生産 ───────────────────── 菌株 ＯＤ560 L-ハ゛リン g/L ───────────────────── W3350 21.4 0 W3350/pILVIH1 13.8 2.3 W3350/pILVIH1,2 10.5 8.2 W3350/pILVIH3 11.7 5.9 W3350/pILVIH4 16.4 5.5 ─────────────────────
【００６０】本発明者らは、以前、Ｌ−バリン生産菌中
のAHASの活性（主にAHAS IIにより示される）が、Ｌ−
バリン発酵中に徐々に減少していることに気づいてい
る。４５℃でのAHAS IIIの半減期は144分であり、AHAS
IIの半減期は44分であることが示されている（Alexande
r-Caudle et al., J. Bacteriol. 172, 3060-3065 (199
0)）。このAHAS IIIの高い熱安定性は、AHASの全体的な
熱安定性の増加に反映することが示唆される。従って、
Ｌ−バリン耐性のAHAS IIIは、AHAS IIと比べてその高
い安定性のために、Ｌ−バリン生産に対して明らかに正
の作用を有すると考えられる。
のAHASの活性（主にAHAS IIにより示される）が、Ｌ−
バリン発酵中に徐々に減少していることに気づいてい
る。４５℃でのAHAS IIIの半減期は144分であり、AHAS
IIの半減期は44分であることが示されている（Alexande
r-Caudle et al., J. Bacteriol. 172, 3060-3065 (199
0)）。このAHAS IIIの高い熱安定性は、AHASの全体的な
熱安定性の増加に反映することが示唆される。従って、
Ｌ−バリン耐性のAHAS IIIは、AHAS IIと比べてその高
い安定性のために、Ｌ−バリン生産に対して明らかに正
の作用を有すると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−バリンによる阻害が
解除されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ及びそれをコ
ードする遺伝子が提供される。同遺伝子を保持する微生
物は、高いＬ−バリン生産能を有する。
解除されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ及びそれをコ
ードする遺伝子が提供される。同遺伝子を保持する微生
物は、高いＬ−バリン生産能を有する。
【００６２】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 変異型ｉｌｖＨ遺伝子及びＬ−バリンの製造法 <130> P-6425F <141> 2001-01-19 <150> RU-2000101678 <151> 2000-01-26 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００６３】 <210> 1 <211> 492 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 1 atg cgc cgg ata tta tca gtc tta ctc gaa aat gaa tca ggc gcg tta 48 Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu 1 5 10 15 tcc cgc gtg att ggc ctt ttt tcc cag cgt ggc tac aac att gaa agc 96 Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser 20 25 30 ctg acc gtt gcg cca acc gac gat ccg aca tta tcg cgt atg acc atc 144 Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile 35 40 45 cag acc gtg ggc gat gaa aaa gta ctt gag cag atc gaa aag caa tta 192 Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu 50 55 60 cac aaa ctg gtc gat gtc ttg cgc gtg agt gag ttg ggg cag ggc gcg 240 His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala 65 70 75 80 cat gtt gag cgg gaa atc atg ctg gtg aaa att cag gcc agc ggt tac 288 His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Ser Gly Tyr 85 90 95 ggg cgt gac gaa gtg aaa cgt aat acg gaa ata ttc cgt ggg caa att 336 Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile 100 105 110 atc gat gtc aca ccc tcg ctt tat acc gtt caa tta gca ggc acc agc 384 Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser 115 120 125 ggt aag ctt agt gca ttt tta gca tcg att cgc gat gtg gcg aaa att 432 Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile 130 135 140 gtg gag gtt gct cgc tct ggt gtg gtc gga ctt tcg cgc ggc gat aaa 480 Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys 145 150 155 160 ata atg cgt tga 492 Ile Met Arg
【００６４】 <210> 2 <211> 163 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Arg Arg Ile Leu Ser Val Leu Leu Glu Asn Glu Ser Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Arg Val Ile Gly Leu Phe Ser Gln Arg Gly Tyr Asn Ile Glu Ser 20 25 30 Leu Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp Pro Thr Leu Ser Arg Met Thr Ile 35 40 45 Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Val Leu Glu Gln Ile Glu Lys Gln Leu 50 55 60 His Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Val Ser Glu Leu Gly Gln Gly Ala 65 70 75 80 His Val Glu Arg Glu Ile Met Leu Val Lys Ile Gln Ala Ser Gly Tyr 85 90 95 Gly Arg Asp Glu Val Lys Arg Asn Thr Glu Ile Phe Arg Gly Gln Ile 100 105 110 Ile Asp Val Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Val Gln Leu Ala Gly Thr Ser 115 120 125 Gly Lys Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Ile Arg Asp Val Ala Lys Ile 130 135 140 Val Glu Val Ala Arg Ser Gly Val Val Gly Leu Ser Arg Gly Asp Lys 145 150 155 160 Ile Met Arg
【００６５】 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 3 gacatgaatg tctggttt 18
【００６６】 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 4 tcaacgcatt attttatcg 19
【００６７】 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 5 taaacgcgtt atcccgcgtg attg 24
【００６８】 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 6 gccacgcgtc tgattcattt tcga 24
【００６９】 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 7 ctcgaggcct tttttcccag cgtgg 25
【００７０】 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 8 ctcgaggcct atcacgcgga aataacg 27
【図１】 １４位のGlyからAspへの変異のみを含む変異
型ilvH遺伝子を得るためのＰＣＲプライマー。
型ilvH遺伝子を得るためのＰＣＲプライマー。
【図２】 １７位のSerからPheへの変異のみを含む変異
型ilvH遺伝子を得るためのＰＣＲプライマー。
型ilvH遺伝子を得るためのＰＣＲプライマー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ナタリヤ ヴァシリエヴナ ゴルシュコヴ ァ ロシア連邦，117454，モスクワ市、コシュ トヤンツァ通り７番地、23号室 (72)発明者 アーラ ヴァレンチノヴナ ベラリョヴァ ロシア連邦，125252，モスクワ市、ノヴォ ペスチャンナヤ通り17／７番地、159号室 (72)発明者 リリナ ヴァレリエヴナ イヴァノフスカ ヤ ロシア連邦，113525，モスクワ市、ドニエ プロペトロフスカヤ通り29番地、124号室 (72)発明者 エヴゲーニ モイセエヴィッチ フルゲス ロシア連邦，109651，モスクワ市、バタイ スキ通り５番地、48号室 (72)発明者 ヴァレリ ザヴェノヴィッチ アフヴェル ジャン ロシア連邦，117593，モスクワ市、ソロヴ ィヌイ通り２番地、274号室 (72)発明者 ミハイル マルコヴィッチ グシャチネル ロシア連邦、113535、モスクワ市、ロソシ ャンスカヤ通り11番地、３号棟、59号室 (72)発明者 ユーリー イヴァノヴィッチ コズロフ ロシア連邦、117574、モスクワ市、ゴルビ ンスカヤ通り７番地、178号室
Claims (9)
- 【請求項１】 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列
において、アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するア
ミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換する変異、又はア
ミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に置換する変異及びアミノ酸番号１４
のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の両方の変異が
他のアミノ酸残基に置換する変異の両方の変異を有する
エシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ酸シンター
ゼアイソザイムIIIの小サブユニットをコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 アミノ酸番号１７のセリン残基に相当す
るアミノ酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換
であり、アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するア
ミノ酸残基の変異がアスパラギン酸残基への置換である
請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 Ｌ−バリンによるフィードバック阻害を
受けず、かつ、ピルビン酸からα−アセト乳酸を生成す
る反応、及び、α−ケト酪酸及びピルビン酸からα−ア
セト−α−ヒドロキシ酪酸を生成する反応を触媒する活
性を有するエシェリヒア・コリ由来のアセトヒドロキシ
酸シンターゼアイソザイムIIIをコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 前記ＤＮＡは、アセトヒドロキシ酸シン
ターゼアイソザイムIIIの大サブユニット及び小サブユ
ニットをコードするＤＮＡであって、前記小サブユニッ
トは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列におい
て、アミノ酸番号１７のセリン残基に相当するアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基に置換する変異、アミノ酸番号
２９のアスパラギン残基に相当するアミノ酸残基が他の
アミノ酸残基に置換する変異、アミノ酸番号９１より下
流のＣ末端側領域を欠失する変異、又はこれらの変異及
びアミノ酸番号１４のグリシン残基に相当するアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基に置換する変異から選ばれる２
又は３以上の変異の任意の組み合わせを有する請求項３
記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 アミノ酸番号１７のセリン残基に相当す
るアミノ酸残基の変異がフェニルアラニン残基への置換
であり、アミノ酸番号２９のアスパラギン残基に相当す
るアミノ酸残基の変異がリジン残基又はチロシン残基へ
の置換であり、アミノ酸番号１４のグリシン残基に相当
するアミノ酸残基の変異がアスパラギン酸残基への置換
である請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１又は３記載のＤＮＡを染色体Ｄ
ＮＡ上又はプラスミド上に保持し、かつ、Ｌ−バリン生
産能を有する細菌。 - 【請求項７】 前記ＤＮＡの発現が強化された請求項６
記載の細菌。 - 【請求項８】 発現の強化が、前記ＤＮＡを強力なプロ
モーターの制御下に置くこと、又は前記ＤＮＡのコピー
数を高めることによるものである請求項７記載の細菌。 - 【請求項９】 請求項６記載の細菌を培地に培養し、該
培地中にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ−バ
リンを採取することを特徴とするＬ−バリンの製造法。
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