JP2006075166A - 全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素が不活化された腸内細菌科細菌を用いて異常アミノ酸を生産する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
生理活性ペプチドアナログ製造の為に非タンパク質新生アミノ酸（異常アミノ酸；Ｌ−ノルロイシン，Ｌ−ノルバリン等）の効率の良い発酵方法の提供。
【解決手段】
腸内細菌科の細菌、特に全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）が不活化されたエシェリヒア属に属する細菌を用いた、ノルロイシン及びノルバリンのような異常アミノ酸を生産する方法が提供される。
【選択図】なし

Description

［発明の分野］
本発明は微生物学的工業に関し、具体的には、全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）が不活化されている腸内細菌科細菌を用いて、ノルロイシン及びノルバリン等の異常アミノ酸を生産する方法に関する。

［関連技術の説明］
ノルロイシンは、メチオニンアナログとして作用することが知られている（Lawrence, J. Bacteriol., 109, 8-11 (1972)）。ノルロイシンは、メチオニンの代わりにタンパク質中に取り込まれる能力があることが実証されている（Barker, D.及びBruton, C., J. Mol. Biol., 133, 217-31 (1979)、Munier, R.及びCohen, G., Biochim. Biophys. Acta.,
31, 378-90 (1959)；Bogosyan, G.他, J. Biol. Chem., 264, 1, 531-539, (1989)；米国特許第５，６２２，８４５号；米国特許第５，５９９，６９０号）。エシェリヒア・コリの増殖は、外来性ノルロイシンを供給することによりメチオニン資化と競合阻害することで阻止されることが報告されてきた（Harris, J. S.及びKohn, H. I., J. Pharmacol.,
73, 383-400 (1941)）。またノルロイシン供給は、最適状態に及ばない濃度のメチオニンを含有する培地において、メチオニン栄養要求性エシェリヒア・コリ（E．coli）の増殖を増大させることも観察されてきた（Lampen, J. O.及びJones, M. J., Arch. Biochem. Biophys., 13, 47-53 (1947））。

低濃度のアミノ酸を有する発酵培地において、ロイシンリッチなタンパク質の高レベルな合成能を有するエシェリヒア・コリ株によるノルロイシンを生産する方法が、開示されている（米国特許第５，６２２，８４５号）。

ロイシン生合成酵素が抑制解除されたセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）変異株を選別し、スレオニンデヒドラターゼを欠損したイソロイシン依存性変異株をさらに選別するために用いた。この二重変異株から、フィードバック抵抗性α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素を含有するイソロイシン非依存性変異株が選別された。この最終的な複合変異株は、ノルロイシンの蓄積を起こすことが可能であった（Kisumi他、J. Biochem., 1976, 80, 333-339）。

ノルロイシンは通常、初発基質である２−ケトイソ吉草酸の代わりに、ピルビン酸又は２−ケト酪酸から、セラチア・マルセッセンス（Kisumi他、J. Biochem., 1976, 80, 333-339）及びエシェリヒア・コリ（Bogosyan, G.他, J. Biol. Chem., 264, 1, 531-539, (1989)）におけるロイシン生合成経路（図１）により産出されると考えられている。

タンパク質生産微生物、特にエシェリヒア・コリを、ノルロイシン及びノルバリンを含む非タンパク質アミノ酸を含有する培養培地で培養することにより、非タンパク質アミノ酸を含有するタンパク質を生産する方法が開示されている（米国特許第４，８７９，２２３号）。

また、組換え遺伝子産物へのノルロイシンの取り込みは、ノルロイシンを含有する培地、又はロイシン及び／又はメチオニンを欠く培地で、上記遺伝子産物を発現している細胞を培養することにより、促進され得る。したがって、このようにして、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、γ−インターフェロン及びα−コンセンサスインターフェロンのノルロイシンアナ
ログが生産され得る（米国特許第５，５９９，６９０号）。しかし今日まで、ＡＨＡＳを欠損したエシェリヒア・コリ菌株によるノルロイシン（及びノルバリン）の蓄積は報告されていない。

本発明の目的は、異常アミノ酸生産株を提供することである。本発明のさらなる目的は、これらの株を用いてこのような異常アミノ酸を生産する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、ノルロイシン及びノルバリン等の異常アミノ酸を生産する能力を有する、腸内細菌科の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、細菌の全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）が不活化するように改変された、腸内細菌科の異常アミノ酸生産細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、異常アミノ酸はノルロイシン及び／又はノルバリンである、前記細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、細菌はエシェリヒア属に属する、前記細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、上記アセトヒドロキシ酸合成酵素は、ｉｌｖＢＮ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ Ｉ、ｉｌｖＧＭ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ ＩＩ及びｉｌｖＩＨ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ ＩＩＩを含む、前記細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、細菌は、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現が増強するように改変されている、前記細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、異常アミノ酸を生産する方法であって、
Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度でＬ−バリンを含有する培地で前記細菌を培養して、異常アミノ酸を生産さ、培地中に分泌させ、かつ
上記培地から異常アミノ酸を回収すること、
を含む方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、異常アミノ酸はノルロイシン及び／又はノルバリンである、前記方法を提供することである。

本発明を以下に詳細に説明する。

［発明の詳細な説明］
１．本発明の細菌
上述した目的は、全てのＡＨＡＳの不活化がノルロイシン及びノルバリン等の異常アミノ酸の生産を増強し得るという知見により達成された。さらに、増強されたｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現は、ＡＨＡＳ欠損株によるこのような異常アミノ酸の生産を増大することが示された。かくして本発明を完成するに至った。

本発明の細菌は、腸内細菌科の異常アミノ酸生産細菌であり、全てのＡＨＡＳを不活化するように改変された細菌である。

本発明において、「異常アミノ酸」とは、２０個の基本的なタンパク質新生（proteinogenic）アミノ酸（Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリン）以外のアミノ酸を意味し、「非タンパク質新生アミノ酸（non-proteinogenic）」とも呼ばれる。このような異常（非タンパク質新生）アミノ酸は、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンでコードされるＬ−ロイシン生合成経路に関与する酵素により、２−ケト−前駆体から形成され得る。本発明による「異常アミノ酸」は、例えば、２−ケト吉草酸から形成されるノルバリン及び２−ケト吉草酸から２−ケトカプロン酸を経由して形成されるノルロイシンが挙げられる。本発明による「異常アミノ酸」の他の例としては、Ｌ−ロイシン生合成経路に関与する酵素により、２−ケトイソカプロン酸から形成されるホモロイシン及び２−ケト−３−メチル吉草酸から形成されるホモイソロイシンが挙げられる（例えば、Jakubowski, H. and Goldman, E., Microbiological reviews, v.56, No.3, p.412-429 (1992)を参照)。上記のアミノ酸の他の化学的な相同体も本発明の範囲に包含される。本発明において、異常アミノ酸はＬ−型であることが好ましい。

本発明において、「異常アミノ酸生産細菌」とは、本発明の細菌が培地で培養されるとき、培地中に異常アミノ酸を生産及び分泌する能力を有する細菌を意味する。異常アミノ酸生産能力は、育種により付与又は増強され得る。また「異常アミノ酸生産細菌」という用語は、本明細書中では、エシェリヒア・コリの野生型又は親株、例えば、エシェリヒア・コリ菌株Ｋ−１２、Ｗ３１１０又はＭＧ１６５５と比べて、多量の異常アミノ酸を培養培地中に生産及び分泌することができる細菌を意味する。この用語は、細菌が、少なくとも１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｌの量の標的アミノ酸を、培地中に生産及び分泌することが好ましいことを意味する。

腸内細菌科は、エシェリヒア属、エルヴィニア属（Erwinia）、プロビデンシア属（Providencia）及びセラチア属（Serratia）属に属する細菌を含むが、これらに限定されない。エシェリヒア属が好ましい。

「エシェリヒア属に属する細菌」という用語は、微生物学における当業者に既知の分類により、エシェリヒア属に分類される細菌を意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ)が挙げられる。

本発明に使用できる腸内細菌科の細菌は、特に限定されないが、例えばNeidhardt, F. C.らにより記載された細菌（Escherichia coli及びSalmonella typhimurium、American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208,表１）を包含する。

「ＡＨＡＳが不活化された」という用語は、ＡＨＡＳをコードする遺伝子が改変され、それにより、改変された遺伝子が有意に活性、特に、この活性が従来技術では検出できないような活性、が低下した突然変異タンパク質をコードするか、又はこのような遺伝子が完全に不活性なタンパク質をコードすることを意味する。また、改変ＤＮＡ領域は、遺伝子の一部を欠失すること、遺伝子のリーディング・フレームをシフトすること、またはプロモーター、エンハンサー及びアテニュエーター等のようなオペロンに隣接する領域を改変することに起因する遺伝子を自然では発現することができないものであってもよい。

本発明によるＡＨＡＳは、ＡＨＡＳ Ｉ、ＡＨＡＳ ＩＩ及びＡＨＡＳ ＩＩＩを含む。「全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）」という用語は、通常は、ＡＨＡＳ Ｉ、ＡＨＡＳ ＩＩ及びＡＨＡＳ ＩＩＩを意味する。

ＡＨＡＳ Ｉ（アセトヒドロキシブタン酸合成酵素Ｉ／アセト乳酸合成酵素Ｉ）、ＡＨＡＳ ＩＩ（アセトヒドロキシブタン酸合成酵素ＩＩ／アセト乳酸合成酵素ＩＩ）及びＡＨＡＳ ＩＩＩ（アセト乳酸合成酵素ＩＩＩ／アセトヒドロキシブタン酸合成酵素ＩＩＩ）は、ピルビン酸及び２−オキソブタン酸から２−アセト−２−ヒドロキシ−酪酸、並びにピルビン酸からアセト乳酸を生成する２つの反応を触媒する。

ＡＨＡＳ ＩはｉｌｖＢＮ遺伝子（ｉｌｖＢＮオペロン）によってコードされ、ＡＨＡＳ ＩＩはｉｌｖＧＭ遺伝子（ｉｌｖＧＭオペロン）によってコードされ、ＡＨＡＳ ＩＩＩはｉｌｖＩＨ遺伝子（ｉｌｖＩＨオペロン）によってコードされる。

ｉｌｖＢ遺伝子（GenBankaccession番号NC_000913.1の3850411〜3848723番）及びｉｌｖＮ遺伝子（GenBank accession番号NC_000913.1の3848719〜3848429番）は、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ−１２株の染色体上のｕｈｐＡ遺伝子とｉｖｂＬ遺伝子の間に位置し、ＡＨＡＳ Ｉの触媒サブユニット及び調節サブユニットをそれぞれコードしている。

ｉｌｖＧ遺伝子（GenBank accession番号NC_000913.1の連結した番号3948183〜3949163番と3949162〜3949827番）及びｉｌｖＭ遺伝子（GenBank 寄託番号NC_000913.1の3949824〜3950087番）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体上のｉｌｖＬ遺伝子とｉｌｖＥ遺伝子の間に位置し、ＡＨＡＳ ＩＩの大サブユニット及び小サブユニットをそれぞれコードしている。

ｉｌｖＩ遺伝子（GenBank accession番号NC_000913.1の85630〜87354番）及びｉｌｖＨ遺伝子（GenBank accession番号NC_000913.1の87357〜87848番）は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体上のｌｅｕＯ遺伝子とｆｒｕＲ遺伝子の間に位置し、ＡＨＡＳ ＩＩＩの大サブユニット及び小サブユニットをそれぞれコードする。

遺伝子の不活化は、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理を用いた変異誘発処理、部位特異的変異法、相同組換えを用いた遺伝子破壊及び／又は「レッド−ドリブン組込み（Red-driven integration）」と呼ばれる挿入−欠失変異誘発法（Datsenko K. A.及びWanner B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97:12:6640-45）のような通常の方法により行うことができる。

有意に活性が低下した変異タンパク質又は完全に不活性なタンパク質は、例えば、ＡＨＡＳの保存領域に位置するアミノ酸残基の部位特異的変異誘発により得ることができる。多数の種からのＡＨＡＳのアミノ酸配列のアライメント及び構造−機能相関データが、Duggleby, R. G.及びPang, S. S.による概説に提示されている（J. Biochem. Mol. Biol., 33, No. 1, 1-36 (2000)）。例えば、エシェリヒア・コリに由来するＡＨＡＳでは、４７位のグルタミン酸が触媒の役割を果たすことが示されている。したがって、この位置での突然変異又はこの位置を含む欠失は、エシェリヒア・コリに由来するＡＨＡＳの酵素活性にとって重大である。

エシェリヒア・コリ以外の腸内細菌科の細菌のｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン又はｉｌｖＩＨオペロンは、エシェリヒア・コリに由来するｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン若しくはｉｌｖＩＨオペロンのフラグメント又はエシェリヒア・コリのｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン又はｉｌｖＩＨオペロンのホモログであり得る固有のオペロンのフラグメントを用いて、相同組換えにより不活化することができる。このようなオペロンホモログは、エシェリヒア・コリのｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン又はｉｌｖＩＨオペロンに対して、それぞれのコード領域のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％
、最も好ましくは９５％の相同性を有し得る。

本発明の細菌は、例えば野生株又は非改変株と比較して、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現を増強することにより、さらに改善されてもよい。ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、ｌｅｕＡ遺伝子、ｌｅｕＢ遺伝子、ｌｅｕＣ遺伝子及びｌｅｕＤ遺伝子を含む。このうち、ｌｅｕＡ遺伝子はα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードし、ｌｅｕＢ遺伝子はβ−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードし、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤはイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードする。

ｌｅｕＡ遺伝子（GenBank accession番号ＮＣ＿０００９１３．１の８３５２９番〜８１９５８番）、ｌｅｕＢ遺伝子（GenBank accession番号ＮＣ＿０００９１３．１の８１９５８番〜８０８６７番）、ｌｅｕＣ遺伝子（GenBank accession番号ＮＣ＿０００９１３．１の８０８６４番〜７９４６４番）及びｌｅｕＤ遺伝子（GenBank accession番号ＮＣ＿０００９１３．１の７９４５３番〜７８８４８番）は、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ−１２株染色体上のｌｅｕＬ遺伝子とｙａｂＭオープン・リーディング・フレームの間に位置する。

ｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン若しくはｉｌｖＩＨオペロン又はｌｅｕＡ遺伝子、ｌｅｕＢ遺伝子、ｌｅｕＣ遺伝子若しくはｌｅｕＤ遺伝子は、前記の各GenBank accession番号に記載されたアミノ酸配列を有し、且つタンパク質がＡＨＡＳ、α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ又はイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの活性を有する限り、１又は複数の位置に１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を含有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。

「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置または種類に応じて異なる。これは以下の理由による。即ち、いくつかのアミノ酸はお互い高い相同性を有し、このようなアミノ酸における差はタンパク質の三次元構造に大きくは影響しない。したがって、本発明のタンパク質は、全アミノ酸残基に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であり得る。

エシェリヒア・コリのｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン若しくはｉｌｖＩＨオペロン又はｌｅｕＡ遺伝子、ｌｅｕＢ遺伝子、ｌｅｕＣ遺伝子若しくはｌｅｕＤ遺伝子は、エシェリヒア・コリのｉｌｖＢＮオペロン、ｉｌｖＧＭオペロン若しくはｉｌｖＩＨオペロン又はｌｅｕＡ遺伝子、ｌｅｕＢ遺伝子、ｌｅｕＣ遺伝子若しくはｌｅｕＤ遺伝子のヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ対応する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中において、いわゆる特異的ハイブリッドは形成されるが、非特異的ハイブリッドは形成されない条件を意味する。この条件を、任意の数値を用いて正確に表現することは難しいが、ストリンジェントな条件とは、例えば高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、互いに７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士はハイブリダイズするが、互いに上記よりも低い相同性を有するＤＮＡ同士はハイブリダイズしない条件が挙げられる。

タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するためには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索及びＣｒｕｓｔａｌ Ｗ等の複数の計算方法を用いることができる。

ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）は、blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn及びtblastxプログラムを使用するヒューリスティックな（heuristic）検索アルゴリズムである；これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altsc
hulの統計学的方法（「Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68；「Applications and statistics for multiple high-scoring
segments in molecular sequences」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7）を用いて、検出結果に有意差を付与する。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W. R. Pearsonにより記載されている（「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ方法は、Thompson J. D., Higgins D. G.及びGibson T. J.により記載されている（「CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice」、Nucleic Acids
Res. 1994,22:4673-4680）。

あるいは、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、即ち、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、ＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が例示される。洗浄手順の期間は、ブロッティングに用いられる膜の種類に応じ、一般に、業者により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件下における、Ｈｙｂｏｎｄ（商品名）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）に対する推奨される洗浄期間は、１５分間である。遺伝子発現を増強する技術、特に菌体中のタンパク質分子の数を増大する技術は、そのタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変すること及びその遺伝子のコピー数を増大することを含むが、これらに限定されない。

ＤＮＡの発現調節配列を改変することは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを、強力なプロモーターの制御下に置くことにより達成できる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びラムダファージのＰ_Lプロモーターは、全て強力なプロモーターとして知られている。あるいは、プロモーターの活性は、例えば、プロモーター中に変異を導入してプロモーターの下流に位置する遺伝子の転写レベルを増大させることにより、増強することができる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間にあるスペーサー中に変異を導入することにより、ｍＲＮＡ翻訳能を増強することができる。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性質に応じて、２０倍範囲の発現レベルが見られた（Goldら、Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981；Huiら、EMBO J., 3, 623-629, 1984）。

さらに、遺伝子の転写レベルを増大するために、エンハンサーを新たに導入してもよい。染色体ＤＮＡへの、遺伝子又はプロモーターのいずれかを含むＤＮＡの導入は、例えば特開０１−２１５２８０（１９８９年）に記載されている。

あるいは、遺伝子のコピー数は、多コピーベクター中に遺伝子を挿入して組換えＤＮＡを形成し、続いて微生物中へ同組換えＤＮＡを導入することによって上昇させることができる。多コピーベクターを用いることが好ましい。多コピーベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９及びｐＥＴ２２ｂ等が挙げられるが、これらに限定されない。「多コピーベクター」という用語は、１細胞当たり１５〜３０個までのコピー数になるベクターに対して用いられる。形質転換の方法は、当業者に既知の任意の方法が含まれる。例えば、受容細胞を塩化カルシウムで処理し、それによりＤＮＡに対する細胞の透過性を増大することは、エシェリヒア・コリＫ−１２（Mandel, M.及びHiga, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）に関して報告されているが、本発明でも使用され得る。

遺伝子発現の増強は、例えば相同組換え又はＭｕ組込み等を介して、細菌の染色体中に複数の遺伝子コピーを導入することにより達成することもできる。例えば、一回のＭｕ組
込みにより、３つの遺伝子コピーまで、細菌の染色体中に導入することができる。

強力なプロモーター又はエンハンサーを用いる上述の技術は、遺伝子のコピー数又は発現の増大に基づく技術と組み合わせることができる。

本発明の細菌の好ましい実施形態は、すでに不活化されたＡＨＡＳを有する細菌のｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現を増強することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌の好ましい実施形態は、すでにｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現が増強されている細菌のＡＨＡＳの不活化により得ることができる。特に、任意の既知のＬ−ロイシン生産株を、ノルロイシン及びノルバリン等の異常アミノ酸を生産する能力を付加するのに用いることができる。

Ｌ−ロイシンを生産する能力を有する、エシェリヒア属に属する細菌は、４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性であるＨ−９０６８（ＡＴＣＣ２１５３０）、Ｈ−９０７０（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０４）又はＨ−９０７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０６）等のエシェリヒア・コリ菌株、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸合成酵素のフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ菌株（欧州特許第１０７６１９１号）、β−２−チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリＡＪ１１４７８株（米国特許第５，７６３，２３１号）、及びエシェリヒア・コリ５７株（ＶＫＰＭ Ｂ−７３８６、米国特許第６，１２４，１２１号）等が挙げられるが、これらに限定されない。

プラスミドＤＮＡを作製する方法、ＤＮＡを消化及び連結する方法、形質転換法及びプライマーとしてのオリゴヌクレオチドを選択する方法等は、当業者によく知られている普通の方法であってよい。これらの方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F.及びManiatis, T.、「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。

２．本発明の方法
本発明の方法は、異常アミノ酸を生産する方法であって、本発明の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培養培地で培養して、異常アミノ酸を生産させ、培地中に分泌させ、かつ、そのアミノ酸を培地から回収することを含む。より具体的には、本発明の方法は、ノルロイシン及び／又はノルバリンを生産する方法であって、本発明の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培養培地で培養して、ノルロイシン及び／又はノルバリンを生産させ、培地中に分泌させ、かつ、ノルロイシン及び／又はノルバリンを培地から回収することを含む。

ＡＨＡＳ欠損株は、発酵培地において、バリン及びイソロイシンの非存在下では増殖することができない（バリン及びイソロイシン栄養要求性）。発酵培地は、ロイシンオペロン（ｌｅｕＡＢＣＤオペロン）の抑制を避けるため、Ｌ−ロイシンを含有してはならない。細胞増殖に必要なＬ−ロイシンの欠乏は、部分的に脱アミノ化され２−ケトイソ吉草酸（Ｌ−ロイシンの前駆体）となるＬ−バリンの存在により相補される。一方、十分な量のＬ−イソロイシンを添加することが、発酵培地中のＬ−イソロイシン栄養要求性を相補するのに必要である。

「細菌増殖を制限する濃度のバリン」という用語は、発酵培地中に添加されたバリンの濃度が、バリン生合成の非存在下では、バイオマスを増殖させるためのバリン要求を満たすのに不十分であることを意味する。そのため、菌株の増殖は、不十分なバリンにより制限される。

本発明において、培養並びに培地からの異常アミノ酸の回収及び精製等は、細菌を用いてアミノ酸を生産する従来の発酵方法と、同様の手法で実行することができる。

培養に用いる培地は、培地が炭素源、窒素源、ミネラル、及び必要な場合、細菌が増殖するのに必要とする適切な量の栄養素を含む限り、合成培地又は天然培地のどちらでもよい。炭素源は、グルコース及びスクロース等の各種炭水化物及び各種有機酸を含み得る。使用する微生物の同化作用の形態に応じて、エタノール及びグリセロールを包含するアルコールを用いてもよい。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニア等の各種アンモニア塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物及び消化された発酵微生物等の天然窒素源を用いてもよい。ミネラルとしては、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン及び塩化カルシウム等を用いてもよい。ビタミンとしては、チアミン及び酵母エキス等を用いてもよい。

培養は、振とう培養、及び２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で通気しながらの攪拌培養等の好気条件下で行うことが好ましい。培養のｐＨは、通常５〜９であり、６．５〜７．２であることが好ましい。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基及び緩衝液を用いて調整できる。通常、１〜５日間の培養で、液体培地中に目的とするアミノ酸が蓄積される。

培養後、遠心分離又は膜ろ過により、細胞等の固体を液体培地から除去することができ、次いで、イオン交換、濃縮及び結晶化方法によりアミノ酸を回収及び精製することができる。

以下に、下記の非限定的な実施例を参考に、本発明をより具体的に説明する。以下の実施例において、ノルバリン及びノルロイシンはＬ−型である。

実施例１．アセト乳酸合成酵素遺伝子が不活化された菌株の構築
他の野生型エシェリヒア・コリ菌株と異なり、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２は、ｉｌｖＧ遺伝子中に極性フレームシフト突然変異を含有する（Lawther, R. P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:922-925, 1981）。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２から全てのＡＨＡＳが不活化された株を得るためには、ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＩＨの２つのオペロンのみを不活化すればよい。図３を参照。

１．ｉｌｖＢＮオペロンの欠失
ｉｌｖＢＮオペロンの欠失は、Datsenko及びWanner（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97(12), 6640-6645）により最初に開発された「レッド−ドリブン組込み」と呼ばれる方法を用いて構築された。この手順により、ｉｌｖＢＮオペロンに隣接する領域、及び鋳型プラスミド中にあるクロラムフェニコール耐性を示す遺伝子に隣接する領域の両方に相同な、ＰＣＲプライマーｉｌｖＢＮ１（配列番号１）及びｉｌｖＢＮ２（配列番号２）を構築した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（NBL Gene Sciences Ltd., UK）（GenBank／EMBL accssion X06403番）をＰＣＲ反応でのテンプレートとして用いた。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９５℃で３分間の変性工程；初めの２回のサイクルのプロファイル：９５℃で１分、３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルに対するプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終工程：７２℃で５分。

得られた９３５ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号３）をアガロースゲルで精製し、温度感受性複製のプラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリ菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２（ＶＫＰＭ Ｂ−７）をエレクトロポレーションするのに用いた。プラスミドｐＫＤ４６（
Datsenko及びWanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97：12：6640−45）は、ラムダファージ（GenBank accession番号J02459番）の２，１５４ヌクレオチド（31088〜33241）のＤＮＡフラグメントを含み、アラビノース誘導Ｐ_araBプロモーターの制御下にあるラムダＲｅｄ相同組換え系の遺伝子（γ、β及びエキソ遺伝子）を含む。プラスミドｐＫＤ４６は、ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体中に組込むのに必要である。

エレクトロコンピテント細胞を以下のように作製した：アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ培地で、３０℃で一晩培養したエシェリヒア・コリＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２を、アンピシリン及びＬ−アラビノース（１ｍＭ）を有する５ｍｌのＳＯＢ培地（Sambrookら、「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition」、Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)）で１００倍に希釈した。得られた培養物を３０℃で通気しながらＯＤ₆₀₀が約０．６になるまで増殖させ、次に１００倍に濃縮すること及び氷冷した脱イオンＨ₂Ｏを用いて３回洗浄することにより、エレクトロコンピテントにした。７０μｌの細胞及び約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションに続いて、細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地（Sambrookら、"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で３７℃で２．５時間インキュベートし、次にＬ−寒天培地上で培養してて３７℃で増殖させ、Ｃｍ^R組換え株を選別した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、４２℃でＣｍを用いてＬ−寒天培地上で２回継代を行い、得られたコロニーのアンピシリンに対する感受性を試験した。

２．ＰＣＲによるｉｌｖＢＮオペロン欠失の検証
Ｃｍ耐性遺伝子で標識されたｉｌｖオペロンの欠失を含む変異株を、ＰＣＲにより検証した。検証するためのＰＣＲには、遺伝子座特異的プライマーｉｌｖＢＮＣ３（配列番号４）及びｉｌｖＢＮＣ４（配列番号５）を用いた。ＰＣＲ検証の条件は、以下の通りであった：９４℃で３分の変性工程；３０サイクルに対するプロファイル：９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分；最終工程：７２℃で７分。鋳型として、親株であるｉｌｖＢＮ⁺株Ｋ−１２の染色体ＤＮＡを用いた反応により得られたＰＣＲ産物は、２，１３７ヌクレオチドの長さであった（図４）。鋳型としてＢ−７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ株と名付けられたｉｌｖＢＮ欠失変異株の染色体ＤＮＡを用いた反応により得られたＰＣＲ産物は、１，０８０ヌクレオチドの長さであった（図４、配列番号６）。

３．ｉｌｖＩＨオペロンの欠失
ｉｌｖＩＨオペロンの欠失は、第１節に記載したｉｌｖＢＮオペロンの欠失と同じアプローチにより行った。この手順にしたがって、鋳型プラスミドのｉｌｖＩＨオペロン及びカナマイシン耐性を付与する遺伝子の両方に近接する領域と相同なＰＣＲプライマーｉｌｖＩＨＩ１（配列番号７）及びｉｌｖＩＨＩ２（配列番号８）を構築した。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（NBL Gene Sciences Ltd., UK）（GenBank/EMBL accssion X06402番）を鋳型としてＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９５℃で３分の変性工程；初めの２回のサイクルのプロファイル：９５℃で１分；３４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の３０サイクルのプロファイル：９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終工程：７２℃で５分。

得られた１，３７０ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号９）をアガロースゲルで精製し、アラビノース誘導Ｐ_araBプロモーターの制御下にある、ラムダＲｅｄ相同組換え系の遺伝子（γ、β及びエキソ遺伝子）を有する温度感受性プラスミドｐＫＤ４６を含むエシェリヒア・コリＢ−７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔ株をエレクトロポレーションするのに用いた。カナマイシン耐性組換え株をエレクトロポレーションの後選別し、遺伝子座特異的プライマーｉｌｖＩＨＣ３（配列番号１０）及びｉｌｖＩＨＣ４（配列番号１１）を用いたＰＣＲにより検証した。ＰＣＲ検証の条件は以下の通りであった：９４℃で３分の変性工程；３０
サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分２０秒；最終工程：７２℃で７分。鋳型として親株であるＩｌｖＩＨ⁺株Ｂ−７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔの染色体ＤＮＡを用いた反応により得られたＰＣＲ産物は、２，４８６ヌクレオチドの長さであった。鋳型として変異株Ｂ−７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔΔｉｌｖＩＨ：：ＫｍＲ株からの染色体ＤＮＡを用いた反応により得られたＰＣＲ産物は、１，４７５ヌクレオチドの長さであった（配列番号１２）。結果として株Ｂ−７ΔｉｌｖＢＮ：：ｃａｔΔｉｌｖＩＨ：：ＫｍＲが得られ、ＮＳ１１１８と名付けた。株ＮＳ１１１８は、イソロイシン及びバリン栄養要求性を示す。

実施例２．エシェリヒア・コリＮＳ１１１８株による、ノルロイシン及びノルバリンの生産及び分泌
エシェリヒア・コリＫ−１２株及びＮＳ１１１８株を、Ｌ−寒天培地上で３７℃で１８時間増殖させた。次に約０．５ｃｍ²の培地表面からの細胞を、発酵培地（２ｍｌ）中に導入し、３２℃で７２時間培養した。蓄積されたノルバリン及びノルロイシンの量を、ＨＰＬＣにより測定した。測定の詳細な説明については、実施例６を参照。表１に結果を示す。

発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ６０．０
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １８．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０
ＣａＣＯ₃ ２５．０
チアミン ０．０２

表１に見られるように、全ＡＨＡＳが不活性なエシェリヒア・コリＮＳ１１１８株は、野生型の親株Ｋ−１２と異なり、ノルバリン及びノルロイシンを生産及び分泌した。ロイシンの添加は、異常アミノ酸の生産及び分泌を妨げたが、イソプロピルリンゴ酸合成酵素阻害のためと推定される。

増殖制限濃度でのバリンの添加は、異常アミノ酸の生産に必要である。この筋書きにおいては、アセト乳酸欠乏の結果、２−ケト酪酸はわずかしか上昇しない。バリンの量を制限すると、２−ケトイソ吉草酸欠乏が起こり、次に、ロイシン合成の低減を引き起こした。ロイシンの量を制限すると、ロイシンオペロンの抑制が解除された。２−ケト酪酸は、（２−ケトイソ吉草酸の代わりの）代替的基質としてイソプロピルリンゴ酸合成に利用され、さらにロイシンオペロンによりコードされる他の酵素によりノル−バリン及びノル−ロイシンに代謝された（図２）。また、初発の発酵培地中でバリンの濃度を増加させると、ケトイソ吉草酸／２−ケト酪酸比が増加することにより、ノルロイシン及びノルバリン合成が防たげられた。

したがって、このような異常アミノ酸合成には、発酵培地中のロイシンの非存在及びバリンの存在という、特異的な増殖条件が必要である。また、バリンは、細菌増殖を制限する濃度でなければならない。

実施例３．ＡＨＡＳ ＩＩＩのクローニング
ｉｌｖＩＨオペロンを、２７６４ｂｐのＰＣＲ産物として、ｐＭＷ１１８ベクター上でクローニングした。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＣＧＡＣ６３００）の染色体ＤＮＡを、鋳型としてＰＣＲ反応に用いた。合成オリゴヌクレオチドｉｌｖＩＨＬ５８（配列番号１３）及び合成オリゴヌクレオチドｉｌｖＩＨＲ６０（配列番号１４）を、プライマーとして用いた。プライマーｉｌｖＩＨＬ５８は、その５’末端にＳａｃＩ制限部位が導入され、プライマーｉｌｖＩＨＲ６０は、その５’末端にＸｂａＩ制限部位が導入されている。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９４℃で３分の変性工程；３０サイクルのプロファイル：９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で２分；最終工程：７２℃で７分。得られた２，７７８ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、ＳａｃＩ及びＸｂａＩで消化し、同じ制限酵素で予め消化したｐＭＷ１１８ベクター中にクローニングした。株ＮＳ１１１８を、クローニングの受容体として用いた。結果として得られたプラスミドｐＭＷ１１８−ｉｌｖＩＨ（図５）は、ＮＳ１１１８株のＡＨＡＳ^-表現型を相補した。

実施例４．ロイシンオペロンのクローニング
ショットガン法により、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを、ｐＢＲ３２２ベクター上でクローニングした。この目的のため、ＭＧ１６５５株の染色体をＭｆｅＩにより消化し、クレノウフラグメントで平滑末端化して、ＥｃｏＲＶで線状化したｐＢＲ３２２プラスミドと連結させた。エシェリヒア・コリｌｅｕ：：Ｔｎ１０株（ＶＫＰＭ Ｂ−６０３８）を、クローニングの受容体として用いた。その結果、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンを含む、６．９ｋｂの染色体フラグメントを含むｐＢＲ−ｌｅｕＡＢＣＤプラスミドが得られた（図６）。

実施例５．ＮＳ１１１８株の誘導体による、ノルロイシン及びノルバリンの生産及び分泌
エシェリヒア・コリＮＳ１１１８株及びその誘導体を、プラスミド株の場合、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−アガープレート上で、３７℃で１８時間増殖させた。次に約０．５ｃｍ²の平板培地表面からの細胞を発酵培地（２ｍｌ、実施例２）中に導入し、３２℃で７２時間培養した。蓄積されたノルバリン及びノルロイシンの量を、ＨＰＬＣにより測定した。測定の詳細な説明については、実施例６を参照。表２に結果を示す。

表２に見られるように、ｉｌｖＩＨ遺伝子（ＡＨＡＳ ＩＩＩをコードする）を持つプラスミドｐＭＷ１１８−ｉｌｖＩＨを導入することによりＡＨＡＳ活性を回復すると、ＡＨＡＳ欠損株ＮＳ１１１８によるノルバリン及びノルロイシンの生産及び分泌が妨げられた。プラスミドｐＢＲ−ｌｅｕＡＢＣＤの一部として野生型ロイシンオペロンを増幅すると、培地中のノルロイシン蓄積が増大した。

実施例６．発酵後の培地におけるノルバリン及びノルロイシンの分析のためのクロマトグラフィー条件
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇ（登録商標）法を分析に用いた。ＡｃｃＱ−Ｔａｇ法は、アミノ酸決定のためのプレカラム誘導化技術である。１１００シリーズの蛍光検出器（Agilent Technologies）を備えたＨＰＬＣシステム アライアンス２６９０勾配システム（Waters Corp．）を、「ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ Ａ．０８．０４」クロマトグラフィーソフト（Agilent Technologies）がロードされたコンピュータに接続して用いた。検出器の設定は以下の通りであった：励起波長−２５０ｎｍ、発光波長−３９５ｎｍ。全てのランに、５μｌのサンプル注入ループを使用した。ガードカラムを備えたＷａｔｅｒｓ
ＡｃｃＱ−Ｔａｇアミノ酸分析カラムで、Ａｃｃｑ−蛍光誘導化反応により生成したアミノ酸誘導体を分離した。カラムを、３７℃でカラムオーブン内で調温した。移動相の流速は１ｍｌ／分に設定した。移動相は、（Ｂ）水性緩衝液「Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ−Ｔａｇ溶出液Ａ」、（Ｃ）ＨＰＬＣ級アセトニトリル、及び（Ｄ）Ｍｉｌｉ−Ｑ水からなる。

アミノ酸のクロマトグラフィー分析に関する勾配プログラムを表３に示す。アミノ酸のクロマトグラフィー分析プロファイルを図７に示す。

好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記載してきたが、本発明の精神を逸脱することなく、様々な変形が作製され得、且つ等価物が採用されることが、当業者には明白であろう。外国の優先権書類ＲＵ２００４１２７０１１を含む上述した各文献は、引用により本明細書中にそのまま取込まれる。

ケト酸鎖伸長過程を経る、ノルロイシン及びノルバリン生合成の概略図である。 ＡＨＡＳ欠損エシェリヒア・コリ菌株における、異常アミノ酸生合成の推定概略図である。ＫＩＶ＝２−ケトイソ吉草酸；ＰＹＲ＝ピルビン酸；ＫＢ＝２−ケト酪酸；ＫＶ＝２−ケト吉草酸；ＫＩＣ＝２−ケトイソカプロン酸；ＫＣ＝２−ケトカプロン酸；ＩＰＭＳ＝イソプロピルリンゴ酸合成酵素；ＩＰＭＩ＝イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ；ＩＰＭＤ＝イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ。 プラスミドｐＡＣＹＣ１８４上での、プライマーｉｌｖＢＮ１及びプライマーｉｌｖＢＮ２の相対的な位置を示す図である。 不活性型ｉｌｖＢＮオペロンを含む染色体ＤＮＡフラグメントの構築の概略図である。 プラスミドｐＭＷ１１８−ｉｌｖＩＨを示す図である。 プラスミドｐＢＲ−ｌｅｕＡＢＣＤを示す図である。 ａ）アミノ酸の標準混合物、ｂ）各々０．０６ｍＭのノルバリン及びノルロイシンを含有するアミノ酸の標準混合物、及びｃ）発酵ブロスのＨＰＬＣ分離を示す図である。

Claims (15)

1. 全てのアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＨＡＳ）が不活化されている、腸内細菌科の異常アミノ酸生産細菌。
2. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項１に記載の細菌。
3. 前記細菌は、エシェリヒア属に属する、請求項１に記載の細菌。
4. 前記アセトヒドロキシ酸合成酵素は、ｉｌｖＢＮ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ Ｉ、ｉｌｖＧＭ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ ＩＩ及びｉｌｖＩＨ遺伝子によりコードされるＡＨＡＳ ＩＩＩを含む、請求項３に記載の細菌。
5. 前記細菌は、ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの発現が増強するように改変されている、請求項４に記載の細菌。
6. 異常アミノ酸を生産する方法であって、
   請求項１に記載の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培地で培養して、前記異常アミノ酸を生産させ、該培地中に分泌させ、かつ
   前記異常アミノ酸を、該培地から回収すること、
   を含む、異常アミノ酸を生産する方法。
7. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項６に記載の方法。
8. 異常アミノ酸を生産する方法であって、
   請求項２に記載の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培地で培養して、前記異常アミノ酸を生産させ、該培地中に分泌させ、かつ
   前記異常アミノ酸を、該培地から回収すること、
   を含む、異常アミノ酸を生産する方法。
9. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項８に記載の方法。
10. 異常アミノ酸を生産する方法であって、
    請求項３に記載の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培地で培養して、前記異常アミノ酸を生産させ、該培地中に分泌させ、かつ
    前記異常アミノ酸を、該培地から回収すること、
    を含む、異常アミノ酸を生産する方法。
11. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項１０に記載の方法。
12. 異常アミノ酸を生産する方法であって、
    請求項４に記載の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培地で培養して、前記異常アミノ酸を生産させ、該培地中に分泌させ
    、かつ
    前記異常アミノ酸を、該培地から回収すること、
    を含む、異常アミノ酸を生産する方法。
13. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項１２に記載の方法。
14. 異常アミノ酸を生産する方法であって、
    請求項５に記載の細菌を、Ｌ−ロイシンは含有しないが、細菌増殖を制限する濃度のＬ−バリンを含有する培地で培養して、前記異常アミノ酸を生産させ、該培地中に分泌させ、かつ
    前記異常アミノ酸を、該培地から回収すること、
    を含む、異常アミノ酸を生産する方法。
15. 前記異常アミノ酸は、ノルロイシン及び／又はノルバリンである、請求項１４に記載の方法。

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