JP2022550349A - 細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするtyrB遺伝子の発現が弱化するように改変された腸内細菌目に属する細菌を使用した発酵により２－メチル酪酸を製造する方法を提供する。同方法は、２－メチル酪酸生産能を有する腸内細菌目に属する細菌の発酵中の２－メチル酪酸の副生物質の生産を低減することも可能とする。

Description

本発明は、微生物工業に関し、特に、チロシンアミノトランスフェラーゼ（tyrosine aminotransferase）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化し、２－メ
チル酪酸の副生物質の生産が減少するように改変された腸内細菌目（Enterobacterales）に属する細菌の発酵により２－メチル酪酸を製造する方法に関する。

２－メチル酪酸は、ペンタン酸（「吉草酸」とも呼ばれる）や３－メチル酪酸（「イソ吉草酸」とも呼ばれる）等の化学構造上密接に関連する非分岐および分枝の脂肪酸とは著しく性質が異なる。２－メチル酪酸はマイルドで、ソフトで、ドライフルーツのような特性を有するのに対し、関連する脂肪酸はより強いが、はるかにチーズ様の特性を有する。２－メチル酪酸は、自然界に広く分布しており、フレーバー産業で広く用いられている（Wright J. 2-Methyl butyric acid. Use in berry, fruit, brown, fermented and savory flavors, Perfumer and flavorist, 2011, 36(7):18-19）。また、２－メチル酪酸の低級アルコールエステルは香料の製造に使用され、２－メチル酪酸のポリオールエステルは合成潤滑剤の製造に使用される。

香料やいくつかの潤滑剤の製造等の特定の用途においては、副生物質（例えば、３－メチル酪酸等）の残留量が0.2重量％以下となるような純度の高い２－メチル酪酸が要求さ
れている。そのため、副生成物の含有量が低減された２－メチル酪酸の製造が求められています。

２－メチル酪酸は、化学合成法により、または適切な栄養培地中での微生物の発酵により、製造することができる。商業的には、２－メチル酪酸は、典型的に、２－メチル－ブチルアルデヒド（これは、一般的に、触媒の存在下でのアルコールの脱水素化によって生成する）を酸化することによって化学的に製造されている（Ullmann’s Encyclopedia of
industrial chemistry, 7^thedition, 2011, Wiley-VCH）。アルコールは、安価に、純度のよいものが入手できる場合が多い。遷移金属化合物の存在下でブテンを一酸化炭素と水素の混合ガス（いわゆる「合成ガス」）と反応させる方法であるオキソ法（「ヒドロホルミル化」とも呼ばれる）による２－メチル－ブチルアルデヒドの合成は、得られる生成物の純度が十分でないことが多く、あまり適してない。２－メチル酪酸の純度を高めるために、３－メチル酪酸の含有量が低減された２－メチル酪酸の製造方法が開発された（US20160264503 A1）。この方法は、ブテン供給混合物の組成を制御し、ヒドロホルミル化条件を最適化し、その後、高温高圧下で触媒的水素化還元を実施し、酸化剤で処理することを含む。その結果、３－メチル酪酸の含有量が0.2重量％以下の２－メチル酪酸が得られる
。

細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法としては、例えば、バチルス属に属する細菌を用いて、Ｌ－イソロイシン含有培地で（Ｓ）－２－メチル酪酸を発酵生産する方法が挙げられる（JP5271606 B2）。別の例では、２－メチル酪酸生産菌が、E. coli のＬ－スレオニン生産株ATCC 98082から、rhtAおよびyqhD遺伝子にそれぞれコードされるスレオニンエクスポーター（threonine exporter）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase）を不活性化し、低コピープラスミドに搭載したPLlacO1プロモーター制御下のネイティブthrABCオペロンおよび人工ilvAGMCDオペロンを導入することにより構築された。２－メチル酪酸生産能は、２－メチル酪酸の生合成経路の最後の２段階を担うケト酸デカルボキシラーゼ（ketoacid decarboxylase）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）をコードする遺伝子の発現を増強することにより、上記細菌に
付与された（US20150132813 A1）。

tyrB遺伝子は、チロシン、ロイシン、およびフェニルアラニンの生合成の最終段階を触媒するチロシンアミノトランスフェラーゼ（tyrosine aminotransferase；TyrB）をコー
ドする。この酵素は、ロイシン（Powell J.T. and Morrison J.F., Role of the Escherichia coli aromatic amino acid aminotransferase in leucine biosynthesis, J. Bacteriol., 1978, 136(1):1-4）、チロシン（Collier R.H. and Kohlhaw G., Nonidentity of
the aspartate and the aromatic aminotransferase components of transaminase A in
Escherichia coli, J. Bacteriol., 1972, 112(1):365-371）、および２－ケトイソ吉草酸（CN109402034 A; Vartak N.B. et al., A functional leuABCD operon is required for leucine synthesis by the tyrosine-repressible transaminase in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 1991, 173(12):3864-3871）によりフィーバック阻害される。

活性を高めたチロシンアミノトランスフェラーゼTyrBを用いてＬ－チロシン生産株（(US9540652 B2, KR101869869 B1, CN109266592 A, US20080102499 A1, US7700328 B2; Lutke-Eversloh T. and Stephanopoulos G., Combinatorial pathway analysis for improved
L-tyrosine production in Escherichia coli: identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression, Metabolic engineering, 2008, 10(2):69-77
）、Ｌ－フェニルアラニン生産株（CN104531597 B, CN100352928 C; Zhang C. et al., Rational engineering of multiple module pathways for the production of L-phenylalanine in Corynebacterium glutamicum, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2015, 42(5):787-797; Liu S.P. et al., A systems level engineered E. coli capable of efficiently producing L-phenylalanine, Proc. Biochem., 2014, 49(5):751-757; Wo Y.Q. et al., Co-expression of five genes in E. coli for L-phenylalanine in Brevibacterium flavum, World J. Gastroenterol., 2003, 9(2):342-346）、Ｌ－トリプトファン生産
株（EP2147972 A1）、Ｌ－ホモフェニルアラニン生産株（US6146859 A）、およびＬ－２
－アミノ酪酸生産株（CN106148259 A; Fotheringham I.G. et al., Engineering of a novel biochemical pathway for the biosynthesis of L-2-aminobutyric acid in Escherichia coli K12, Bioorg. Med. Chem., 1999, 7(10):2209-2213）が構築された。

tyrB遺伝子を欠失または弱化させることにより、目的化合物の副生物質の生産を低減する方法が報告されている（例えば、Li F.F. et al., Engineering Escherichia coli for
production of 4-hydroxymandelic acid using glucose-xylose mixture, Microb. Cell
Fact., 2016, 15:90; Zhu Y. et al., Metabolic engineering of indole pyruvic acid
biosynthesis in Escherichia coli with tdiD, Microb. Cell Fact., 2017, 16(1):2; Liu S.P. et al., Heterologous pathway for the production of L-phenylglycine from
glucose by E. coli, J. Biotechnol., 2014, 186:91-97を参照のこと）。

一連の報告において、２－ケトイソカプロン酸の生成に使用され得るロイシン生合成経路の遺伝子の発現が増加し、ilvEおよびtyrB遺伝子を欠失したEscherichia coli株が、細菌の発酵によるアルコール、特に３－メチル－１－ブタノール、の生産方法に利用された（US2009081746 A1, US20100209986 A1, WO2010045629 A2; Connor M.R. and Liao J.C.,
Engineering of an Escherichia coli strain for the production of 3-methyl-1-butanol, App. Env. Microbiol., 2008, 74(18):5769-5775）。ロイシン合成遺伝子ilvEおよ
びtyrBの除去により、２－ケトイソカプロン酸（これは、次いで脱炭酸および還元工程により３－メチル－１－ブタノールに変換され得る）の生産が増加することが明らかとなった。

しかし、腸内細菌目に属する２－メチル酪酸生産細菌の発酵による２－メチル酪酸および２－メチル酪酸の副生物質の生産におけるtyrB遺伝子の発現弱化の影響を記載したデー
タは、これまでに報告されていない。工業生産の観点から、腸内細菌目に属する細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法において２－メチル酪酸の副生物質の量を低減することは、改良された方法により２－メチル酪酸を高純度かつ安価に生産できるため、重要性が極めて高い。

本明細書は、腸内細菌目に属する細菌の発酵によって２－メチル酪酸を製造する、改善された方法を記載するものである。本発明によれば、腸内細菌目に属する細菌の発酵による２－メチル酪酸の生産は、該細菌においてtyrB遺伝子の発現を弱化させ、以て改変された該細菌による２－メチル酪酸の副生物質（例えば、３－メチル酪酸、イソ酪酸、Ｌ－アロイソロイシン、および／またはＤ－アロイソロイシン）の生産を非改変細菌と比較して低減することにより、改善できる。tyrB遺伝子の発現が弱化するように改変された腸内細菌目に属する細菌を培地で培養して２－メチル酪酸を生産する場合、leuABCDオペロン遺
伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現を弱化することにより、２－メチル酪酸の副生物質の量をさらに低減できる。その結果、本明細書に記載の改変細菌を用いない方法と比較して、２－メチル酪酸をより高純度かつ安価に生産できる。

本発明は、下記のものを提供する。

本発明のひとつの態様は、２－メチル酪酸を製造する方法であって、
（i）腸内細菌目（Enterobacterales）に属する２－メチル酪酸生産細菌を培地で培養し
て培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に２－メチル酪酸を生産および蓄積させること、および
（ii）前記培地もしくは前記細菌の菌体、またはその両者から２－メチル酪酸を回収すること
を含み、
前記細菌が、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されている、方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、tyrB遺伝子である、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択される、前記方法を提供することである：
（A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、1～150アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質；および
（C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むタンパク質であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。

本発明の別の態様は、前記遺伝子が、下記からなる群より選択される、前記方法を提供することである：
（a）配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子；
（b）配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を含む遺伝子であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、遺伝子；
（c）配列番号2に示すアミノ酸配列において、1～150アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子であって、
該タンパク質がチロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するものである、遺伝子；および
（d）配列番号1の変異体塩基配列を含む遺伝子であって、該変異体塩基配列が遺伝暗号の縮重によるものである、遺伝子。

本発明の別の態様は、前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、該遺伝子の不活化により弱化している、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、欠失している、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記細菌が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）またはエルビニア科（Erwiniaceae）に属する、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア
（Pantoea）属に属する、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記細菌が、さらに、leuA、leuB、leuC、およびleuD遺伝子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の発現が弱化するように改変されている、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、２－メチル酪酸の副生物質の量が、非改変細菌と比較して低減されている、前記方法を提供することである。

本発明の別の態様は、前記副生物質が、３－メチル酪酸、イソ酪酸、Ｌ－アロイソロイシン、Ｄ－アロイソロイシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的、特徴、および付随する利点は、それに従って構築された実施形態の以下の詳細な説明を読めば当業者に明らかになるであろう。

図１は、２－メチル酪酸および２－メチル酪酸の副生物質の生合成スキームを示す。KdcA（丸中の「１」としても示す）：E. coliでの発現に最適化されたLactococcus lactis固有のkdcA遺伝子にコードされる２－ケト酸デカルボキシラーゼ（2-ketoacid decarboxylase）（EC 4.1.1.72）, AldH（丸中の「２」としても示す）：アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）（EC 1.2.1.3）, IlvE：分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ, アミノトランスフェラーゼB（branched chain amino acid aminotransferase, aminotransferase B）（EC 2.6.1.42）, TyrB：芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（aromatic amino acid aminotransferase）（EC 2.6.1.57）, LeuA：２－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2-isopropylmalate sythase）（EC 2.3.3.13）, LeuCD：３－イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（3-isopropylmalate dehydratase）（EC 4.2.1.33）, LeuB：３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）（EC 1.1.1.85）, E-4-P：Ｄ－エリスロース－４－リン酸, PEP：ホスホエノールピルビン酸, PhePyr：３－フェニルピルビン酸, hPhePyr：４－ヒドロキシフェニルピルビン酸, Pyr：ピルビン酸, 2-KB：２－ケト酪酸, Prop：プロピオン酸, AHB：２－アセト－２－ヒドロキシ酪酸, (S)-KMV：（Ｓ）－２－ケト－３－メチル吉草酸, (R)-KMV：（Ｒ）－２－ケト－３－メチル吉草酸, alloIle：アロイソロイシン, (S)-2-MB：（Ｓ）－２－メチル酪酸, (R)-2-MB：（Ｒ）－２－メチル酪酸, AL：２－アセト乳酸, KIV：２－ケトイソ吉草酸, isoBut：イソ酪酸, KIC：２－ケトイソカプロン酸, 3-MB：３－メチル酪酸。 図２は、P_tacプロモーターのDNA配列（配列番号69）を示す。P_tacプロモーターの-35および-10配列に下線を付す。lacリプレッサー結合部位を大文字で示す。lacオペレーターの半分を含むP_tac断片の配列を太字で示す。 図３は、E. coliの２－メチル酪酸生産株L1201-1構築スキームを示す。SD1：改変Shine-Dalgarno配列, *：遺伝子の変異型アレル。

以下、例示的な実施形態（あくまで一例である）と付随する図面を参照して本願発明をより詳細に説明する。

１．細菌
本明細書に記載の細菌は、チロシンアミノトランスフェラーゼ（tyrosine aminotransferase）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化するように改変された
腸内細菌目（Enterobacterales）に属する２－メチル酪酸生産菌である。本明細書に記載の細菌は、本明細書に記載の方法で使用できる。よって、同細菌に関する以下の説明は、本明細書に記載の方法で代替可能または等価に使用されるいずれの細菌にも準用できる。

tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化
するように改変された、腸内細菌目に属する任意の２－メチル酪酸生産菌を使用できる。

「２－メチル酪酸生産菌」の用語は、「２－メチル酪酸を生産できる細菌」の用語、「２－メチル酪酸を生産する能力を有する細菌」の用語、または「２－メチル酪酸生産能を有する細菌」の用語と代替可能または等価に使用されてよい。

「２－メチル酪酸生産菌」の用語は、当該細菌を培地で培養したときに、培地及び／又は該細菌の菌体（すなわち細菌菌体）中に２－メチル酪酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する能力を有する腸内細菌目に属する細菌を意味し得る。

また、「２－メチル酪酸生産菌」の用語は、例えば、非改変細菌と比較して、より多い量で２－メチル酪酸を培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する能力を有する細菌も意味し得る。「非改変細菌」の用語は、「非改変株」の用語と代替可能または等価に使用されてよい。「非改変株」の用語は、tyrosine aminotransferase活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されていない対照株を意味し得る。非改変細菌としては、E. coli K-12株（例えば、W3110 (ATCC 27325) やMG1655 (ATCC 47076)）等の野生株または親株が挙げられる。また、「２－メチル酪酸生産菌」の用語は、例えば、0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上の量で２－メチル
酪酸を培地中に蓄積することができる細菌も意味し得る。

また、腸内細菌目に属し、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子（tyrB遺伝子等）の発現が弱化するように改変された、２－メチル酪酸生産能を有する細菌も使用できる。細菌は、本来的に２－メチル酪酸生産能を有していてもよく、２－メチル酪酸生産能を有するように改変されてもよい。そのような改変は、例えば、突然変異法またはDNA組み換え技術により達成できる。前記細菌は、本来的に２－メチ
ル酪酸生産能を有する細菌においてtyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子（tyrB遺伝子等）の発現を弱化させることにより取得できる。あるい
は、前記細菌は、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子（tyrB遺伝子等）の発現が弱化するように既に改変された細菌に２－メチル酪酸生産能を付与することにより取得できる。あるいは、前記細菌は、tyrosine aminotransferase
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（tyrB遺伝子等）の発現が弱化するように改変されたことにより２－メチル酪酸生産能を獲得したものであってもよい。本明細書に記載の細菌は、具体的には、例えば、後述する細菌株を改変することにより取得できる。

「２－メチル酪酸生産能」の用語は、培地及び／又は細菌菌体中に２－メチル酪酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する、腸内細菌目に属する細菌の能力を意味し得る。「２－メチル酪酸生産能」の用語は、具体的には、細菌を培地で培養したときに、２－メチル酪酸を培地及び／又は細菌菌体から回収できる程度に、培地及び／又は細菌菌体中に２－メチル酪酸を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する、細菌の能力を意味し得る。

本明細書に記載の方法に従って生育する細菌について言及される「培養される（cultured）」という用語は、当業者に周知である「培養される（cultivated）」や「生育する（grown）」等の用語と代替可能または等価に使用されてよい。

細菌は、２－メチル酪酸を、２－メチル酪酸のS型またはR型のエナンチオマーとして、あるいは種々の比率のS型およびR型のエナンチオマーの混合物として、生産し得る。中でも、特に、S型エナンチオマーが挙げられる。

細菌は、２－メチル酪酸を、単独で、あるいは２－メチル酪酸と２－メチル酪酸とは異なる１種またはそれ以上の物質の混合物として、生産し得る。例えば、細菌は、２－メチル酪酸を、単独で、あるいは２－メチル酪酸と１種またはそれ以上のアミノ酸（例えばＬ体のアミノ酸（Ｌ－アミノ酸ともいう））の混合物として、生産し得る。さらに、例えば、細菌は、２－メチル酪酸を、単独で、あるいは２－メチル酪酸と２－メチル酪酸とは異なる他の１種またはそれ以上の有機酸（例えばカルボン酸等）の混合物として、生産し得る。

また、腸内細菌目に属し、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子（tyrB遺伝子等）の発現が弱化するように改変され、以て２－メチル酪酸の副生物質の生産が非改変株（例えば、後述する野生株または親株）と比較して低減した、任意の２－メチル酪酸生産菌も使用できる。副生物質は、１種、２種、またはそれ以上の物質からなり得る。すなわち、具体的には、tyrosine aminotransferase活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子（tyrB遺伝子等）の発現が弱化するように改変された、１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質を非改変株と比較して少ない量で生産できる、またはそれにより１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質の副生が非改変株と比較して低減された、細菌を使用できる。２－メチル酪酸の副生物質の量は、絶対値（例えば、グラム／リットル（g/L）等）で表されてもよく、相対値（例え
ば、％等）で表されてもよい。すなわち、絶対値および／または相対値に換算した２－メチル酪酸の副生物質の生産量が低減されてよい。「２－メチル酪酸の副生物質の量が相対値で表される」の用語は、２－メチル酪酸の副生物質の量が対照物質に対する２－メチル酪酸の副生物質の量の比率としてあらわされることを意味し得るものであり、好ましくは、１００％を乗じる。「対照物質」としては、特に、２－メチル酪酸が挙げられる。したがって、本明細書に記載の２－メチル酪酸の製造方法を用いる場合、改変細菌が生産する２－メチル酪酸の副生物質の相対量が非改変細菌と比較して減少する一方で、副生物質の絶対量は非改変細菌と比較して変化しないか、あるいは増加することさえでき、以て本明細書に記載の改変細菌を用いない方法と比較して２－メチル酪酸をより高純度に生産できることも許容される。

細菌について本明細書で言及される「２－メチル酪酸の副生物質を生産できる」の用語は、培地又は細菌菌体中に１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する、腸内細菌目に属する細菌の能力を意味し得る。細菌について本明細書で言及される「２－メチル酪酸の副生物質を生産できる」の用語は、具体的には、細菌を培地で培養したときに、１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質を培地及び／又は細菌菌体から回収できる程度に、培地もしくは細菌菌体、またはその両者中に１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質を生成し、排出もしくは分泌し、且つ／又は蓄積する、腸内細菌目に属する細菌の能力を意味し得る。「２－メチル酪酸の副生物質」の用語については、以下に説明する。

Ｌ－アミノ酸としては、特に制限されないが、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シトルリン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリン、並びにそれらの誘導体が挙げられる。

カルボン酸としては、特に制限されないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、クエン酸、ペンタン酸、およびそれらの誘導体が挙げられる。

「Ｌ－アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、遊離形態のアミノ酸およびカルボン酸に限られず、それらの派生形態（塩、水和物、付加物、またはそれらの組み合わせ、等）も意味し得る。付加物は、アミノ酸またはカルボン酸と別の有機もしくは無機の化合物とで形成された化合物であり得る。すなわち、「Ｌ－アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、遊離形態、派生形態、またはそれらの混合物であるＬ－アミノ酸およびカルボン酸を意味し得る。「Ｌ－アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、特に、遊離形態のＬ－アミノ酸およびカルボン酸、それらの塩、またはそれらの混合物を意味し得る。「Ｌ－アミノ酸」および「カルボン酸」の用語は、例えば、それらの、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、一水和物、二水和物、三水和物、一塩酸塩、二塩酸塩等の塩のいずれも意味し得る。特記しない限り、水和状態について言及しない「Ｌ－アミノ酸」および「カルボン酸」の用語（例えば、「遊離形態のＬ－アミノ酸またはカルボン酸」や「Ｌ－アミノ酸またはカルボン酸の塩」の用語）は、Ｌ－アミノ酸およびカルボン酸の非水和物、Ｌ－アミノ酸およびカルボン酸の水和物、またはそれらの混合物を意味し得る。

「２－メチル酪酸の副生物質」の用語は、１種、２種、またはそれ以上の２－メチル酪酸の副生物質を意味し得るものであり、また、例えば本明細書に記載の細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法において副生物（byproduct）、共産物（co-product）、また
は副産物（side-product）として生産される２－メチル酪酸とは別の有機化合物等の物質を意味し得る。「２－メチル酪酸の副生物質」の用語は、腸内細菌目に属する２－メチル酪酸生産細菌を培地で培養して２－メチル酪酸を生産するときに該細菌により生産され、排出され、または分泌され得る物質であって、以て該細菌を培地で培養したときに副生物質を培地及び／又は細菌菌体から回収できる程度に培地もしくは細菌菌体、またはその両者中に副生物質が蓄積するものも意味し得る。培地及び／又は細菌菌体中の２－メチル酪酸の副生物質の量は、２－メチル酪酸生産能を有する腸内細菌目に属する細菌の発酵により生産される２－メチル酪酸の量より少なく、等しく、または多くなり得る。

２－メチル酪酸の生合成経路はＬ－イソロイシンの生合成経路から分岐するため、２－メチル酪酸の副生物質として、具体的には、制限されないが、２－メチル酪酸の生合成経
路の中間体や２－メチル酪酸の生合成経路が分岐した別の生合成経路の中間体等、およびそれらの組み合わせが挙げられる。中間体は、２－メチル酪酸の生合成経路の中間体に限られず、他の１種、２種、またはそれ以上の物質の代謝経路における前駆体、中間体、または基質であってもよく、例えば、分岐鎖Ｌ－アミノ酸の生合成経路の前駆体、中間体、または基質であってもよい。

「分岐鎖Ｌ－アミノ酸」の用語は、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン等のＬ－アミノ酸を意味し得る。ピルビン酸（「α－ケトプロピオン酸」ともいう）はＬ－バリン、Ｌ－ロイシン、およびＬ－イソロイシンの生合成経路の前駆体であるため、２－メチル酪酸の副生物は、２－メチル酪酸の生合成経路においてピルビン酸から分岐する別の生合成経路の副生物であってよい。２－メチル酪酸の生合成経路においてピルビン酸から分岐する別の生合成経路の副生物としては、特に、２－メチル酪酸の副生物質が挙げられ、また、２－ケトイソ吉草酸（「α－オキソイソ吉草酸」ともいう）を共通の前駆体とする３－メチル酪酸やイソ酪酸、２－ケト－３－メチル吉草酸（「α－オキソメチル吉草酸」ともいう）を共通の前駆体とするＬ－アロイソロイシンやＤ－アロイソロイシンが挙げられ、２－ケトイソ吉草酸および２－ケト－３－メチル吉草酸はピルビン酸を共通の前駆体とする（図１）。

従って、後述するようにtyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子の発現が弱化するように改変された腸内細菌目に属する細菌の発酵による２－メチル酪酸の製造方法において、２－メチル酪酸の副生基質は、制限されないが、３－メチル酪酸、イソ酪酸、Ｌ－アロイソロイシン、Ｄ－アロイソロイシン、またはそれらの組み合わせであってよい。

なお、腸内細菌科に属する細菌は、近年、1548個のコアタンパク質、53個のリボソームタンパク質、および4個の多遺伝子座配列解析タンパク質に基づく系統樹再構成を含む包
括的な比較ゲノム解析に基づき再分類されている（Adelou M. et al., Genome-based phylogeny and taxonomy of the ‘Enterobacteriales’: proposal for Enterobacterales ord. nov. divided into the families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganellaceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2016, 66:5575-5599）。

再分類に基づき、従来腸内細菌科に分類されていた細菌は、今では、腸内細菌目内の異なる科に入っている。上記解析に基づき、本明細書に記載の方法で使用される腸内細菌目に属する細菌は、エンテロバクター（Enterobacter）、エシェリヒア（Escherichia）、
クレブシエラ（Klebsiella）、サルモネラ（Salmonella）、エルビニア（Erwinia）、パ
ントエア（Pantoea）、モルガネラ（Morganella）、フォトルハブドゥス（Photorhabdus
）、プロビデンシア（Providencia）、イェルシニア（Yersinia）等の属のものであって
よく、２－メチル酪酸を生産する能力を有し得る。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類により腸内細菌目に分類されている細菌を使用することができる。腸内細菌目に属する改変され得る株としては、腸内細菌科またはエルビニア科の細菌が挙げられ、具体的には、Escherichia属、Enterobacter属、またはPantoea属の細菌が挙げられる。

エシェリヒア属細菌の種は特に制限されず、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている種が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. co
li and Salmonella: cellular and molecular biology, 2^nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996）に記載のものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、特に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli (E. coli)）が挙げられる。E. coliとして、具体的に
は、プロトタイプ野生株であるE. coli K-12株（E. coli W3110（ATCC 27325）やE. coli
MG1655（ATCC 47076）等）が挙げられる。

エンテロバクター属細菌は特に制限されず、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている種が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランス株として、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC 12287が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネス株として、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC 13048、NBRC 12010（Sakai S. and Yaqishita
T., Microbial production of hydrogen and ethanol from glycerol-containing wastes discharged from a biodiesel fuel production plant in a bioelectrochemical reactor with thionine, Biotechnol. Bioeng., 2007, 98(2):340-348）、AJ110637（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌株としては、例えば、欧州特許出願公開0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、エンテロバクター・アグ
ロメランスには、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）と分類されてい
るいくつかの株も含まれる。

パントエア属細菌は特に制限されず、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている種が挙げられる。パントエア属細菌種としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis（P. ananatis））、パントエア・スチューア
ルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティス株として、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103、AJ13355（FERM BP-6614）、AJ13356（FERM BP-6615）、AJ13601（FERM BP-7207）、SC17（FERM BP-11091）、SC17(0)（VKPM B-9246）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Mergaert J. et al., Transfer of Erwinia ananas (synonym, Erwinia uredovora) and Erwinia stewartii to the Genus Pantoea emend. as Pantoea ananas (Serrano 1928) comb. nov. and Pantoea stewartii (Smith 1898) comb. nov., respectively, and description of Pantoea stewartii subsp. indologenes subsp. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 1993, 43:162-173）。パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。すなわち各菌株には対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して発注することができる（atcc.org/を参照）。各菌株の登録番号は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

細菌は、本来的に２－メチル酪酸生産能を有するものであってもよく、２－メチル酪酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。２－メチル酪酸生産能を有する細
菌は、例えば、上述したような細菌に２－メチル酪酸生産能を付与することにより、または上述したような細菌の２－メチル酪酸生産能を増強することにより、取得できる。

２－メチル酪酸生産能の付与又は増強は、従来、エシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。そのような方法としては
、例えば、栄養要求性変異株の取得、２－メチル酪酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、２－メチル酪酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。２－メチル酪酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、２－メチル酪酸生産菌の育種において、活性が増強される２－メチル酪酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。

２－メチル酪酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を典型的な変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つ２－メチル酪酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。典型的な変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。

また、２－メチル酪酸生産能の付与又は増強は、目的の２－メチル酪酸の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO0018935やEP1010755 A等に記載されている。

また、２－メチル酪酸生産能の付与又は増強は、２－メチル酪酸の生合成経路から分岐して２－メチル酪酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、「２－メチル酪酸の生合成経路から分岐して２－メチル酪酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、２－メチル酪酸の分解に関与する酵素も包含される。酵素活性は、例えば、酵素をコードする遺伝子が不活化されるように細菌を改変することにより低下させことができる。酵素活性を低下させる方法は後述する。

以下、２－メチル酪酸生産菌、および２－メチル酪酸生産能を付与又は増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するような２－メチル酪酸生産菌が有する性質および２－メチル酪酸生産能を付与又は増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。

２－メチル酪酸生産菌
２－メチル酪酸生産菌および２－メチル酪酸生産菌を誘導するために使用できる親株としては、制限されないが、２－メチル酪酸の生合成経路の最後の２段階を担うタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる（図１）。２－メチル酪酸の生合成経路の最後から２番目の段階を担うタンパク質をコードする遺伝子としては、分岐鎖２－ケト酸デカルボキシラーゼ（branched-chain-2-ketoacid decarboxylase）（KivD）をコードするkivD遺伝子（これは、例えば、Lactococcus lactis固有
のものであり得る）（US20150132813 A1; de la Plaza et al., Biochemical and molecu
lar characterization of alpha-keto-isovalerate decarboxylase, an enzyme involved
in the formation of aldehydes from amino acids by Lactococcus lactis, FEMS Microbiol Lett., 2004, 238(2):367-374）、分岐鎖２－ケト酸デカルボキシラーゼ（branched-chain 2-ketoacid decarboxylase）をコードするkdcA遺伝子（これは、例えば、KivDに対して89.8%の同一性を示すLactococcus lactis B1157固有のものであり得る）（Smit B.A. et al., Identification, cloning, and characterization of a Lactococcus lactis
branched-chain α-ketoacid decarboxylase involved in flavor formation, Appl. Env. Microbiol., 2005, 71(1):303-311; Savrasova E.A. et al., Use of the valine biosynthesis pathway to convert glucose into isobutanol, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2011, 38(9):1287-1294）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（indolepyruvate decarboxylase）をコードするipdC遺伝子（これは、例えば、Salmonella typhimurium固有のものであり得る）（US20150132813 A1）が挙げられる。２－メチル酪酸の生合
成経路の最後の段階を担うタンパク質をコードする遺伝子としては、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（phenylacetaldehyde dehydrogenase）をコードするfeaB遺伝子（別名：padA遺伝子）（これは、例えば、E. coli固有のものであり得る）（US20150132813 A1; Rodriguez-Zavala J.S. et al., Characterization of E. coli tetrameric aldehyde dehydrogenases with atypical properties compared to other aldehyde dehydrogenases, Protein Sci., 2006, 15(6):1387-1396）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）をコードするaldB遺伝子（これは、例えば、E. coli固有のものであり得る）（US20150132813 A1; Ho K.K. and Weiner H., Isolation and characterization of an aldehyde dehydrogenase encoded by the aldB gene of Escherichia coli, J. Bacteriol., 2005, 187(3):1067-1073）、γ－グルタミル－γ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（γ-glutamyl-γ-aminobutyraldehyde dehydrogenase）をコードするpuuC遺伝子（別名：aldH遺伝子）（これは、例えば、E. coli固有のものであり得る）（US20150132813 A1; Kurihara S. et al., A novel putrescine utilization pathway involves γ-glutamylated intermediates of Escherichia coli K-12, J. Biol. Chem., 2005, 280(6):4602-4608; Jo J.-E. et al., Cloning, expression, and characterization of an aldehyde dehydrogenase from Escherichia coli K-12 that utilizes 3-hydroxypropionaldehyde as a substrate, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, 81(1):51-60）
が挙げられる。

２－メチル酪酸の生合成経路はＬ－イソロイシンの生合成経路において２－ケト－３－メチル吉草酸から分岐するため、２－メチル酪酸生産菌および２－メチル酪酸生産菌を誘導するために使用できる親株としては、制限されないが、スレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）（JP 2-458 A）やアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid
synthase）（EP0356739 A1）等のＬ－イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子で形質転換された組み換え株が挙げられる。Ｌ－イソロイシンおよび２－メチル酪酸生産菌を誘導するために使用できる親株としては、他にも、制限されないが、E.
coli AJ12919（特開平8-47397）やE. coli VL1892株およびKX141株（VKPM B-4781）（US5658766）等のEscherichia属に属する株が挙げられる。

Ｌ－イソロイシンの生合成経路はＬ－スレオニンから開始するため、２－メチル酪酸生産菌および２－メチル酪酸生産菌を誘導するために使用できる親株としては、制限されないが、Ｌ－スレオニン生合成酵素をコードするをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株も挙げられる。例えば、スレオニンオペロンthrABCの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエーター領域をオペロンから除去することが望ましい（WO2005049808 A1, WO2003097839 A1）。Ｌ－スレオニン生産菌および２－メチル酪酸生産菌を誘導するために使用できる親株としては、他にも、制限されないが、E. coli TDH-6/pVIC40（VKPM B-3996；US5175107およびUS5705371）、E. coli 472T23/pYN7（ATCC 98081；US5631157）、E. coli NRRL-21593（US5939307）、E. coli MG442（US4278765
; Gusyatiner M.M. et al., Study of relA gene function in the expression of amino
acid operons. II. Effect of the relA gene allelic state on threonine over-production by Escherichia coli K-12 mutants resistant to β-hydroxynorvaline acid, Genetika (Russian), 1978, 14(6):957-968）、E. coli VL643及びVL2055（EP1149911 A2）、E. coli VKPM B-5318（EP0593792 A1）等のEscherichia属に属する株が挙げられる。

上記Ｌ－スレオニン生産株VKPM B-3996を基に、プラスミドpMWD5に搭載された、Ｌ－イソロイシンによる阻害が実質的に解除され、且つアテニュエーションに必要な領域が除去されたスレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）をコードするilvA遺伝子を含むilvGMEDAオペロンを導入することにより、Ｌ－イソロイシン生産株AJ12919が得られた（EP0685555 B1）。

２－メチル酪酸生産菌は、任意のＬ－イソロイシン生産菌から、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase）を不活性化することにより得られる。遺伝子を不活性化する方法については、本明細書に記載されている。

２－メチル酪酸生産菌の育種に用いられる遺伝子およびタンパク質は、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質の公知の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ有していてよい。また、２－メチル酪酸生産菌の育種に用いられる遺伝子およびタンパク質は、元の機能（例えば、タンパク質の場合はそれぞれの酵素活性）が維持されている限り、上記例示した遺伝子およびタンパク質の変異体（variant）（例えば、そのような公知の塩基
配列およびアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質の変異体）であってもよい。遺伝子およびタンパク質の変異体については、本明細書に記載のtyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびそれにコードされるtyrosine aminotransferaseの変異体についての記載を準用できる。

本明細書に記載の腸内細菌目に属する細菌は、少なくとも、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が弱化するように改変されている。

「チロシンアミノトランスフェラーゼ（tyrosine aminotransferase）活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子」の用語は、以下の反応：an aromatic amino acid + 2-ketoglutarate ⇔ an aromatic 2-ketoacid + L-glutamate（Enzyme Commission number, EC: 2.6.1.57）およびL-leucine + 2-ketoglutarate ⇔4-methyl-2-keto-pentanoate + L-glutamate（EC: 2.6.1.6）を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
意味し得る。tyrosine aminotransferase活性を有する酵素をコードする遺伝子として、
具体的には、tyrosine aminotransferaseをコードするtyrB遺伝子が挙げられる。tyrosine aminotransferase活性を有する酵素をコードする遺伝子は、tyrB遺伝子およびそのホモログまたは変異体塩基配列であり得る。tyrBおよびそのホモログならびに変異体塩基配列については、より具体的に後述する。

tyrB遺伝子は、tyrosine aminotransferase TyrB（別名：aromatic-amino-acid aminotransferase, leucine aminotransferase）をコードする（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, entry No. b4054; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot,
accession No. P04693）。

tyrB遺伝子（GenBank, accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 4267114 to 4268307, complement; Gene ID: 948563）は、E. coli K-12株の染色体において、同
一鎖上のalr遺伝子と反対鎖上のyjbS遺伝子の間に位置する。E. coli K-12株のtyrB遺伝
子の塩基配列（配列番号1）および同遺伝子にコードされるE. coli K-12株固有のTyrBタ
ンパク質のアミノ酸配列（配列番号2）は公知である。

すなわち、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（tyrB遺伝子等）は配列番号1に示す塩基配列を有する遺伝子（例えば、DNA）であってよく
、tyrosine aminotransferase活性を有するタンパク質（TyrBタンパク質等）は配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。「遺伝子またはタンパク質が塩基配列またはアミノ酸配列を有する」という表現は、特記しない限り、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列をより長い配列中に含むことを意味し得るものであり、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列または当該アミノ酸配列のみを有することも意味し得る。

本明細書に記載の方法に用いることができる細菌による２－メチル酪酸の副生物質の生産は、２－メチル酪酸の生合成経路においてピルビン酸から分岐するＬ－ロイシン生合成経路に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を弱化することにより、非改変細菌と比較してさらに低減することができる。Ｌ－ロイシン生合成経路の第一の段階は、２－ケトイソ吉草酸、アセチルCoA、およびH₂Oからの２－イソプロピルリンゴ酸の生成であり、これはleuA遺伝子がコードする２－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2-isopropylmalate synthase）によって触媒される。Ｌ－ロイシン生合成経路の第二の段階は、２－イソプロピルリンゴ酸の３－イソプロピルリンゴ酸への変換であり、これはleuCD遺伝子がコー
ドする３－イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（3-isopropylmalate dehydratase）に
よって触媒される。次の反応は、３－イソプロピルリンゴ酸からの２－イソプロピル－３－ケトコハク酸の生成であり、これはleuB遺伝子がコードする３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）によって触媒される。合成され
た２－イソプロピル－３－ケトコハク酸は、３－メチル酪酸（これは腸内細菌目に属する２－メチル酪酸生産菌の発酵により２－メチル酪酸を生産する際に生成する副生物質である）の前駆体である２－ケトイソカプロン酸に自然に変化する

leuA、leuB、leuC、および／またはleuD等のＬ－ロイシン生合成経路の１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を弱化することにより、本明細書に記載の方法で使用できる細菌に、leuA、leuB、leuC、および／またはleuD遺伝子が弱化していない細菌と比較してより少ない量で１種またはそれ以上の副生物質を生産する性質を付与することができる。上記遺伝子の発現弱化の結果、改変細菌による１種またはそれ以上の副生物質（例えば３－メチル酪酸等）の生産をさらに低減することができ、２－メチル酪酸を高純度に生産することができる。

「leuA遺伝子」の用語は、2-isopropylmalate synthase活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味し得る。2-isopropylmalate synthase活性を有する酵素をコードする遺伝子として、具体的には、2-isopropylmalate synthaseをコードするleuA遺伝子が挙げられる。2-isopropylmalate synthase活性を有する酵素をコードする遺伝子は、leuA遺伝子およびそのホモログまたは変異体塩基配列であり得る。leuAおよびその変異体塩基配列については、より具体的に後述する。

leuA遺伝子は、2-isopropylmalate synthaseタンパク質LeuAをコードする（KEGG, entry No. b0074; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P09151）。leuA遺伝子（GenBank accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 81958 to 83529, complement; Gene ID: 947465）は、E. coli K-12株の染色体において、同一鎖上のleuL遺伝子とleuB遺伝子の間に位置する。leuA遺伝子は、leuABCDオペロンの一部であ
る。leuA遺伝子の塩基配列およびleuA遺伝子にコードされるLeuAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号3と4に示す。

「２－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2-isopropylmalate synthase）活性」の用語は、以下の反応：3-methyl-2-keto-butanoate + acetyl-CoA + H₂O → (2S)-2-isopropylmalate + coenzyme A + H⁺（EC: 2.3.3.13）を触媒する酵素活性を意味し得る。

「leuB遺伝子」の用語は、3-isopropylmalate dehydrogenase活性を有する酵素をコー
ドする遺伝子を意味し得る。3-isopropylmalate dehydrogenase活性を有する酵素をコー
ドする遺伝子として、具体的には、3-isopropylmalate dehydrogenaseをコードするleuB
遺伝子が挙げられる。3-isopropylmalate dehydrogenase活性を有する酵素をコードする
遺伝子は、leuB遺伝子およびそのホモログまたは変異体塩基配列であり得る。leuBおよびその変異体塩基配列については、より具体的に後述する。

leuB遺伝子は、3-isopropylmalate dehydrogenaseタンパク質LeuB（別名：IMDH, 3-carboxy-2-hydroxy-4-methylpentanoate:NAD⁺oxidoreductase）をコードする（KEGG, entry No. b0073; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P30125）。leuB遺伝子（GenBank accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 80867 to 81958, complement; Gene ID: 944798）は、E. coli K-12株の染色体において、同一鎖上のleuA遺伝子とleuC遺伝子の間に位置する。leuB遺伝子は、leuABCDオペロンの一部である
。leuB遺伝子の塩基配列およびleuB遺伝子にコードされるLeuBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号5と6に示す。

「３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）
活性」の用語は、以下の反応：(2R,3S)-3-isopropylmalate + NAD⁺ → 4-methyl-2-keto-pentanoate + CO₂+ NADH（EC: 1.1.1.85）を触媒する酵素活性を意味し得る。

「leuCD遺伝子」の用語は、3-isopropylmalate dehydratase活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味し得る。3-isopropylmalate dehydratase活性を有する酵素をコードす
る遺伝子として、具体的には、3-isopropylmalate dehydrataseの大サブユニットおよび
小サブユニットをそれぞれコードするleuCおよびleuD遺伝子が挙げられる。3-isopropylmalate dehydratase活性を有する酵素をコードする遺伝子は、leuCおよびleuD遺伝子およ
びそれらのホモログまたは変異体塩基配列であり得る。leuC、leuD、およびそれらの変異体塩基配列については、より具体的に後述する。

leuC遺伝子は、3-isopropylmalate dehydrataseの大サブユニットLeuCをコードする（KEGG, entry No. b0072; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No.
P0A6A6）。leuC遺伝子（GenBank accession No. NC_000913.3; nucleotide positions: 79464 to 80864, complement; Gene ID: 945076）は、E. coli K-12株の染色体において
、同一鎖上のleuB遺伝子とleuD遺伝子の間に位置する。leuC遺伝子は、leuABCDオペロン
の一部である。leuC遺伝子の塩基配列およびleuC遺伝子にコードされるLeuCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号7と8に示す。

leuD遺伝子は、3-isopropylmalate dehydrataseの小サブユニットLeuDをコードする（(KEGG, entry No. b0071; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, accession No. P30126）。leuD遺伝子（GenBank accession No. NC_000913.3; nucleotide positions:
78848 to 79453, complement; Gene ID: 945642）は、E. coli K-12株の染色体において、同一鎖上のleuC遺伝子と反対鎖上のsetA遺伝子の間に位置する。leuD遺伝子は、leuABCDオペロンの一部である。leuD遺伝子の塩基配列およびleuD遺伝子にコードされるLeuDタ
ンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号9と10に示す。

LeuCおよびLeuDは、3-isopropylmalate dehydratase LeuCD（別名：3-isopropylmalate
isomerase）を構成する。

「３－イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（3-isopropylmalate dehydratase）活性
」の用語は、以下の反応：(2R,3S)-3-isopropylmalate ⇔ (2S)-2-isopropylmalate（EC:
4.2.1.33）を触媒する酵素活性を意味し得る。

すなわち、leuA、leuB、leuC、およびleuD遺伝子は配列番号3、5、7、および9に示す塩基配列を有する遺伝子（例えば、DNA）であってよく、LeuA、LeuB、LeuC、およびLeuDタ
ンパク質は配列番号4、6、8、および10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって
よい。

タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（BSA）を標準としてクマシー色素を用いたBradfordタンパク質アッセイまたはLowry法（Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, 72:248-254; Lowry O.H. et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 1951, 193:265-275）またはウエスタンブロット解析（Hirano S., Western blot analysis, Methods Mol. Biol., 2012, 926:87-97）により決定することができる。

例えば、遺伝子発現の弱化、変異体タンパク質、および変異体塩基配列についての以下の説明は、本明細書に記載の任意のタンパク質および遺伝子（制限されないが、TyrB、LeuA、LeuB、LeuC、LeuD、KdcA、およびAldHタンパク質、およびtyrB、leuA、leuB、leuC、leuD、kdcA、およびaldH遺伝子等のそれらをコードする遺伝子、ならびにそれらのホモログを含む）に準用できる。

「細菌が遺伝子の発現が弱化するように改変された」の用語は、改変された細菌において遺伝子の発現が弱化するように、細菌が改変されていることを意味し得る。遺伝子の発現は、例えば、同遺伝子の不活化により弱化し得る。

「遺伝子が不活化される」の用語は、改変された遺伝子が、野生型または非改変型遺伝子と比較して、完全に不活性または機能しないタンパク質をコードすることを意味し得る。改変されたDNA領域は、遺伝子の一部の欠損もしくは遺伝子全体の欠損、遺伝子がコー
ドするタンパク質のアミノ酸置換をもたらす1塩基以上の置換（ミスセンス変異）、終止
コドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームシフトをもたらす1塩
基または2塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子および／もしくは転写終結シグナルの挿入、また
は遺伝子の隣接領域（これは、プロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位、等の遺伝子の発現を制御する配列を含む）の改変により、自然には遺伝子を発現できなくてよい。遺伝子の不活化は、例えば、紫外線照射またはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）を用いた変異処理、部位特異的変異導
入、相同組み換えを用いた遺伝子破壊、および／または「Red/ET-driven integration」
または「λRed/ET-mediated integration」に基づく挿入－欠失変異導入（Yu D. et al.,
An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli, Nature Genet., 1998, 20:123-128）等の常法により実施できる。

「細菌が遺伝子の発現が弱化するように改変された」の用語は、改変された細菌が作動可能に遺伝子に連結された制御領域（これは、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、アテニュエーターと終結シグナル、リボソーム結合部位、およびその他の発現制御エ
レメント、等の遺伝子の発現を制御する配列を含む）であって、遺伝子の発現レベルが弱化するように改変されるものを有すること；およびその他の例（例えば、WO9534672 A1; Carrier T.A. and Keasling J.D., Library of synthetic 5’ secondary structures to
manipulate mRNA stability in Escherichia coli, Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64を参照のこと）を意味し得る。

制御領域に言及する際の「作動可能に遺伝子に連結された（operably linked to the gene）」の用語は、制御領域が、塩基配列の発現（例えば、増強された、増加した、構成
的な、基底の、抗終結された、弱化した、制御解除された、低下した、または抑制された発現）、具体的には塩基配列にコードされる遺伝子産物の発現を達成できるように、核酸分子または遺伝子の塩基配列に連結されていることを意味し得る。

「細菌が遺伝子の発現が弱化するように改変された」の用語は、改変された細菌において、遺伝子の発現レベル（すなわち発現量）が非改変株（例えば、野生株または親株）と比較して低下するように、細菌が改変されていることも意味し得る。遺伝子の発現レベルの低下は、例えば、細胞当たりの遺伝子の発現レベル（これは細胞当たりの遺伝子の平均発現レベルであってよい）の低下として測定され得る。「遺伝子の発現レベル」または「遺伝子の発現量」の用語は、例えば、遺伝子の発現産物の量（例えば、同遺伝子のmRNAの量または同遺伝子にコードされるタンパク質の量）を意味し得る。細菌は、細胞あたりの遺伝子の発現レベルが、例えば、非改変細菌の50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、ま
たは0%に低下するように改変されてよい。

「細菌がmetJ遺伝子の発現が弱化するように改変された」の用語は、改変された細菌において、非改変細菌と比較して、対応する遺伝子産物（すなわちコードされるタンパク質）の総量および／または総活性低下するように、細菌が改変されていることを意味し得る。タンパク質の総量または総活性の低下は、例えば、細胞当たりのタンパク質の量または活性（これは細胞当たりのタンパク質の平均量または平均活性であってよい）の低下として測定され得る。細菌は、細胞あたりのタンパク質の活性が、例えば、非改変細菌の50%
以下、20%以下、10%以下、5%以下、または0%に低下するように改変され得る。

上記比較に供される非改変細菌としては、E. coli MG1655株（ATCC 47076）やE. coli W3110株（ATCC 27325）等のEscherichia属に属する細菌の野生株またはP. ananatis AJ13355 株（FERM BP-6614）等のPantoea属に属する細菌の野生株等が挙げられる。上記比較
に供される非改変細菌としては、遺伝子の発現が弱化するように改変されていない親株または遺伝子の発現が弱化していない細菌も挙げられる。

遺伝子の発現は、染色体DNA上のプロモーター等の遺伝子の発現制御配列をより弱いも
のに置換することによって弱化させることができる。プロモーターの強度は、RNA合成の
開始作用の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法の例は、Goldstein M.A.
et al.（Goldstein M.A. and Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。また、WO0018935 A1
に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に１つまたはそれ以上の塩基置換を導入することによりプロモーターを弱くなるように改変することもできる。さらに、シャイン・ダルガルノ（SD）配列、及び／又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び／又はリボソーム結合部位（RBS）中の開始コドンの直ぐ上流または下流の配列における数
個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。このRBSの改変は、遺伝子の転写の低下を組み合わせてもよい。

遺伝子の発現は、具体的には、例えば、遺伝子のコード領域（US5175107）もしくは遺
伝子発現を制御する領域にトランスポゾンまたは挿入配列（IS）を挿入することによって
、または紫外線照射またはニトロソグアニジン（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニ
ジン；NTG）による変異導入等の常法によって、弱化させることもできる。さらに、部位
特異的な変異の組み込みは、例えば、λRed/ETを介した組み換え（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）に基づく公知の染
色体編集法により実施できる。

遺伝子のコピー数または遺伝子の存在あるいは不在は、例えば、染色体DNAを制限処理
した後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in
situハイブリダイゼーション（FISH）等を行うことにより、測定することができる。遺
伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。

プラスミドDNAの調製、DNAの切断、DNAの結合、DNAの形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の導入等の、DNAの組み換え分子の操作及び分子クローニ
ングのための方法は、当業者に周知の通常の方法であってよい。そのような方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., “Molecular Cloning: A Laboratory
Manual”, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)またはGreen M.R. and Sambrook J.R., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak and Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4^th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。

組み換えＤＮＡを用いた操作法としては、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、接合、可動等の従来の方法を含め、任意の方法を用いることができる。タンパク質をコードするＤＮＡを用いた細菌の形質転換、トランスフェクション、感染、接合、または可動により、当該細菌に当該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を合成する能力を付与することができる。形質転換、トランスフェクション、感染、接合、および可動の方法としては、任意の方法が挙げられる。例えば、効率的なＤＮＡの形質転換およびトランスフェクションのために、E. coliK-12の細胞のＤＮＡに対する透過性が高まるように受容
細胞を塩化カルシウムで処理する方法が報告されている（Mandel M. and Higa A., Calcium-dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 1970, 53:159-162）。特
殊化および／または一般化された形質転換の方法が記載されている（Morse M.L. et al.,
Transduction in Escherichia coli K-12, Genetics, 1956, 41(1):142-156; Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor La. Press, 1972）。宿主微生物へのＤＮＡのランダムおよび／または標的化された
組み込みのための他の方法、例えば、「Mu-driven integration/amplification」（Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871）、「Red/ET-driven integration」または「λRed/ET-mediated integration」（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128）を適用できる。さらに、所望の遺伝子の多重挿入のためには
、Mu駆動の複製的転移（Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871）や所望の遺伝子の増幅をもたらすrecA依存性相同組み換えに基づく化学的に誘
導可能な染色体進化（Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765）に
加えて、転移、部位特異的および／または相同的なRed/ETを介した組み換え、および／またはP1を介した一般化形質導入の種々の組み合わせを利用する他の方法（例えば、Minaeva N. et al., BMC Biotechnology, 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93(2):815-829を参照のこと）を利用できる。

腸内細菌目に属する科、属、種、または株間でDNA配列に相違があり得る。従って、tyrB、leuA、leuB、leuC、およびleuD遺伝子は、配列番号1、3、5、7、および9に示す塩基配列を有する遺伝子に限定されず、配列番号1、3、5、7、および9に対する変異体塩基配列
を有する、またはそれと相同な遺伝子であって、TyrB、LeuA、LeuB、LeuC、およびLeuDタンパク質の変異体をコードするものを包含してもよい。同様に、TyrB、LeuA、LeuB、LeuC、およびLeuDタンパク質は、配列番号4、6、8、および10に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質に限定されず、配列番号4、6、8、および10の変異体アミノ酸配列を有する、ま
たはそれと相同なタンパク質を包含してもよい。

「変異体タンパク質」の用語は、変異体アミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。

「変異体タンパク質」の用語は、タンパク質の野生型アミノ酸配列と比較して、1また
は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるにせよ、1つ
またはそれ以上の変異をアミノ酸配列中に有するタンパク質であって、野生型タンパク質と同様の活性または機能が維持されているか、その三次元構造が野生型または非改変型タンパク質に対して顕著には変更されていないタンパク質を意味し得る。変異体タンパク質中の変異の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはアミノ酸残基の種類による。変異体タンパク質中の変更の数は、厳密に限定されるものではないが、タンパク質の野生型アミノ酸配列において1～150、別の例では1～100、別の例では1～50、別
の例では1～30、別の例では1～15、別の例では1～10、あるいは別の例では1～5であって
よい。これは、アミノ酸には互いに高い相同性を有するものがあり、そのような変化では活性または機能が影響を受けないか、タンパク質の三次元構造が野生型または非改変型タンパク質に対して顕著には変化しないためである。従って、変異体タンパク質は、活性または機能が維持されているか、タンパク質の三次元構造が野生型または非改変型タンパク質に対して顕著には変更されていない限り、タンパク質の野生型アミノ酸配列全体に対して60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以
上、あるいは99%以上の、コンピュータプログラムblastpを使用する際のパラメーター「
同一性」として定義される相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。本明細書において、「相同性」の用語は、「同一性」（これは、アミノ酸残基間の同一性である）を意味してよい。２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列した際の２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、変異体タンパク質の活性および特徴が維持されるか、タンパク質の三次元構造が非改変型タンパク質（例えば、野生型タンパク質等）に対して顕著には変化しないように、保存的変異が挙げられる。保存的変異の代表的なものは保存的置換である。保存的置換は、制限されないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が
疎水性アミノ酸である場合には、Ala、Leu、Ile、Val間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合にはGlu、Asp、Gln、Asn、Ser、His、Thr間で、置換部位が極性アミノ酸である
場合には、Gln、Asn間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で
、置換部位が酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、置換部位がヒドロキシル基を有するアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で、互いに置換する置換である。保存的置換の例としては、AlaからSerまたはThrへの置換、ArgからGln、HisまたはLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、HisまたはAspへの置換、AspからAsn、GluまたはGlnへの置換、CysからSerまたはAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、AspまたはArgへの置換、GluからAsn、Gln、LysまたはAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Argま
たはTyrへの置換、IleからLeu、Met、ValまたはPheへの置換、LeuからIle、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、Val
またはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。

１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加の例としては、非保存的変異も挙げられるが、ただし、その変異は、アミノ酸配列の異なる位置の1つまた
はそれ以上の第2の変異により、変異体タンパク質の活性または機能が維持されるか、タ
ンパク質の三次元構造が非改変型タンパク質（例えば、野生型タンパク質等）に対して顕著には変化しないように、補償されるものである。

アミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、blastpアルゴリズムにより算出できる。より具体的には、アミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）より提供されるblastpアルゴリズムによりデフォルト設定
のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出できる。塩基配列の同一性のパーセンテージは、blastnアルゴリズムにより算出できる。より具体的には、塩基配列の同一性のパーセンテージは、NCBIより提供されるblastnアルゴリズムによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出できる。

上述の通り、腸内細菌目に属する種々の細菌に固有のtyrosine aminotransferase活性
を有するTyrBのタンパク質ホモログは公知である。そのような腸内細菌目に属する細菌に固有のホモログタンパク質の例を、NCBIデータベース（National Center for Biotechnology Information, ncbi.nlm.nih.gov/protein/）におけるアミノ酸配列のaccession番号
、系統分類データ、相同性の値（アミノ酸の同一性である「同一性」として）の表示と共に表１に示す。

「変異体塩基配列」の用語は、標準遺伝子暗号表（例えば、Lewin B., “Genes VIII”, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458を参照）による任意
の同義のアミノ酸コドンを使用して野生型アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列を意味し得る。従って、野生型アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺
伝子は、遺伝暗号の縮重による変異体塩基配列を有する遺伝子であり得る。

「変異体塩基配列」の用語は、制限されないが、tyrosine aminotransferase活性を有
するタンパク質をコードする限り、野生型塩基配列に相補的な塩基配列または該塩基配列から調製し得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列も意味し得る。「ストリンジェントな条件」の用語は、特異的なハイブリッド、例えばコンピュータプログラムblastnを使用する場合のパラメーター「同一性」として定義される相同性が60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上のハイブリッド、が形成され、非特異的なハイブリッド、例えば上記より相同性が低いハイブリッド、が形成されない条件を包含し得る。ストリンジェントな条件としては、例えば、1×SSC（標準クエン酸ナトリウムまたは標準塩化ナトリウム）、0.1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の塩濃度で、別の例では0.1
×SSC、0.1% SDSの塩濃度で、60℃または65℃において、１回以上、別の例では２または
３回洗浄する条件が挙げられる。洗浄時間は、ブロッティングに使用されたメンブレンの種類に依存するが、一般的には製造者により推奨されるものであり得る。例えば、Amersham Hybond^TM-N+正荷電ナイロンメンブレン（GE Healthcare）のストリンジェントな条件
下での推奨洗浄時間は15分である。洗浄工程は２または３回行うことができる。プローブとしては、野生型塩基配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、野生型塩基配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、塩基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCRによって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨されるが、ハイブリゼーション条件により適切
に選択することができ、通常100 bp ～1 kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、50℃、60℃、または65℃における2×SSC、0.1%SDSの条件が例示され得る。

「変異体塩基配列」の用語は、変異体タンパク質をコードする塩基配列も意味し得る。

E. coli種に固有の野生型タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は既に解明されて
いる（上記参照）ので、野生型タンパク質の変異体タンパク質をコードする変異体塩基配列は、同細菌種のDNAと、野生型遺伝子の塩基配列に基づいて調製したプライマーを用い
たPCR（polymerase chain reaction; refer to White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5(6):185-189）により、または野生型遺伝子を含むDNAを例えばヒドロキシルアミンでin vitro処理する部位特異的突然変異法または野生型
遺伝子を有する微生物、例えばE. coli種、を紫外線（UV）照射もしくはそのような処理
に通常用いられるN-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン（NTG）や亜硝酸等の変異剤で処理する方法により、取得でき、または全長遺伝子構造物として化学合成できる。腸内細菌目に属する他の細菌からのタンパク質またはその変異体タンパク質をコードする遺伝子も同様に取得できる。

タンパク質（例えば、「野生型タンパク質」）および遺伝子（例えば、「野生型遺伝子」）について言及する際の「野生型（wild-type）」の用語（これは、「生来（native）
」および「天然（natural）」の用語と同等であり得る）は、それぞれ、野生型細菌（例
えば、E. coli MG1655株（ATCC 47076）、E. coli W3110株（ATCC 27325）、P. ananatis
AJ13355株（FERM BP-6614）等の腸内細菌科またはエルビニア科等の腸内細菌目に属する細菌の野生株）に、天然に存在し且つ／又は発現する、且つ／又は天然に製造される、生来のタンパク質および遺伝子を意味し得る。タンパク質は遺伝子にコードされるため、「野生型タンパク質」は、野生型細菌のゲノムに天然に生じる「野生型遺伝子」にコードされ得る。

「野生型タンパク質」の用語は、腸内細菌目に属する野生株または親株により、例えば
野生株であるE. coli MG1655株またはP. ananatis AJ13355株により、天然に生産される
生来のタンパク質を意味し得る。野生型タンパク質は、「野生型遺伝子」に、または野生型細菌のゲノムに天然に生じる「非改変遺伝子」にコードされ得る。野生型タンパク質および野生型遺伝子は、したがって、「野生型アミノ酸配列」および「野生型塩基配列」をタンパク質および遺伝子の一次構造として有し得る。

特定の生物（例えば、細菌種等）に固有のタンパク質または核酸に言及する際の「固有の（native to）」の用語は、当該生物に固有のタンパク質または核酸を意味し得る。す
なわち、特定の生物に固有のタンパク質または核酸は、それぞれ、当該生物に天然に存在するタンパク質または核酸を意味し得るものであり、当業者に知られた方法により当該生物から単離して配列解析できる。さらに、タンパク質または核酸が存在する生物からそれぞれ単離されたタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列は容易に決定することができるので、タンパク質または核酸に言及する際の「固有の」の用語は、得られるタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列が結果として当該生物に天然に存在するタンパク質または核酸のアミノ酸配列または塩基配列と同一である限り、例えば、組み換えＤＮＡ技術を含む遺伝子工学的手法または化学合成法等により得られるタンパク質または核酸も意味し得る。特定の生物に固有のアミノ酸配列としては、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド（これは、タンパク質、具体的には酵素を含む）等が挙げられる。特定の生物に固有の塩基配列としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられ、これらは、発現調節配列（これは、プロモーター、アテニュエーター、ターミネーター等を含む）、遺伝子、遺伝子間配列、ならびにシグナルペプチド、タンパク質のプロ部位、および人工アミノ酸配列等をコードする塩基配列には限定されない。アミノ酸配列および塩基配列ならびに各種生物に固有のそれらのホモログの具体例は本明細書に記載されており、これらの例としては、それぞれ配列番号2、4、6、8、および10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（これらは、E. coli種の
細菌に固有であり得るものであり、したがって、配列番号1、3、5、7、および9に示す塩
基配列を有する遺伝子にコードされ得る）。

細菌は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記のような性質に加えて、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性、薬物依存性等の特定の性質を有することができる。

２．方法
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の細菌を用いて２－メチル酪酸を製造する方法を含む。２－メチル酪酸を製造する方法は、前記細菌を培地で培養（cultivating（「culturing」ともいう））して２－メチル酪酸を培地もしくは細菌菌体、またはその両者中に生成させ、排出させ、且つ／又は蓄積させる工程と、培地及び／又は細菌菌体から２－メチル酪酸を回収する工程を含む。同方法は、さらに、任意で（optionally）、培地及び／又は細菌菌体から２－メチル酪酸を精製する工程を含み得る。２－メチル酪酸は、遊離形態、もしくはその塩、またはそれらの混合物として製造され得る。よって、「２－メチル酪酸」の用語は、例えば、遊離形態の２－メチル酪酸、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味し得る。例えば、２－メチル酪酸のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩が、前記方法により製造され得る。これは、カルボン酸（２－メチル酪酸が属する）が発酵条件下で無機または有機物質等の中和剤と典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成し得ることから可能であり、これは当業者に明らかなカルボン酸の化学的特徴である。

細菌の培養、ならびに培地等からの２－メチル酪酸の回収および任意で精製は、微生物を使用してＬ－アミノ酸を製造する従来の発酵法と同様に実施することができる。すなわち、細菌の培養、ならびに培地等からの２－メチル酪酸の回収および精製は、当業者に周知の、細菌の培養に適した条件ならびにＬ－アミノ酸の回収および精製に適した条件を適
用することにより実施してよい。

使用される培地は、少なくとも炭素源を含有し、且つ本明細書に記載の細菌が増殖して２－メチル酪酸を生産できる限り、特に制限されない。培地は、炭素源、窒素源、硫黄源、リン源、無機イオン、並びにその他の有機及び無機成分を必要に応じて含む典型的な培地等の、合成培地あるいは天然培地でよい。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、澱粉加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロール、マンニトール、ソルビトール等のアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸、および脂肪酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、およびアンモニア水等を使用することができる。さらに、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、およびコーンスティープリカー等も使用することができる。培地は、これらの窒素源の1種またはそれ以上を含むことがで
きる。硫黄源としては、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等が挙げられる。培地は、炭素源、窒素源、及び硫黄源に加えて、リン源を含んでもよい。リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、ピロ燐酸等のリン酸ポリマー等を使用することができる。ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビタミンB12等のビタミンや、その他の必要物質、例えばアデニン、RNA等の核酸、アミノ酸、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス等の有機栄養素等を、適当量（痕跡量であってもよい）存在させることができる。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を加えてもよい。

培養は、２－メチル酪酸を製造する方法で使用される細菌の培養に適した条件で実施することができる。例えば、培養は、好気的条件下で16～72時間、または16～65時間実施することができる。培養中の培養温度は、30～45℃、または30～37℃の範囲内に制御することができる。pHは、5～8の間、または6.0～7.5の間に調節することができる。pHは、無機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、例えば、尿素、炭酸カルシウム、またはアンモニアガス、を使用することにより調節することができる。

培養後、培地から２－メチル酪酸を回収することができる。具体的には、菌体外に存在する２－メチル酪酸を培地から回収することができる。また、培養後、細菌の菌体から２－メチル酪酸を回収することができる。具体的には、菌体を破砕し、菌体や菌体破砕懸濁物（細胞デブリともいう）等の固形分を除去して上清を取得し、上清から２－メチル酪酸を回収することができる。菌体の破砕は、例えば、高周波音波を用いた超音波破砕等の周知の方法により実施することができる。固形分の除去は、例えば、遠心分離または膜ろ過により実施することができる。培地や上清等からの２－メチル酪酸の回収は、例えば、濃縮、晶析、膜処理、イオン交換クロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、中圧または高圧の液体クロマトグラフィー等の慣用の技術により実施することができる。これらの方法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて使用してよい。

下記の非限定的な実施例を参照して本発明をより正確に説明する。

実施例１ E. coli L1190-1株の構築
E. coliのＬ－イソロイシン生産株NS1547から２－メチル酪酸生産株を構築した。NS1547株は、MG1655 Δtdh rhtA* mini-Mu::P_lac-laсI-ilvA* P_L-SD1-ilvG*MEDAの遺伝子型を有する。

NS1547株は、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニン（>40 mg/mL）またはホモセリン（>5 mg/mL）に対する耐性を付与しスレオニン生産を向上させる変異（rhtA23）（US20010049126 A1）を有し、tdh遺伝子（配列番号11）の欠失によりスレオニンの分解が阻害されている（Shakalis I.O. and Gusyatiner M.M., Participation of threoninedehydrogenase, threonine desaminase and serine transhydroxymethylase in threonine degradationin
Escherichia coli cells K-12, Biotekhnologiya, 1990, (2):16-17）。NS1547株は、発現カセットmini-Mu::P_lac-laсI-ilvA*-kan（配列番号12）も含み（Sycheva E.V. et al., Aerobic catabolism of threonine in Escherichia coli strain with feedback resistant biosynthetic threonine deaminase, Biotekhnologiya, 2003, (4):22-34）、該カ
セットは、フィードバック耐性のスレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）をコ
ードする変異型ilvA遺伝子とlacIリプレッサー遺伝子をP_lacプロモーターの制御下に含む。このカセットは、threonine deaminase（これは、スレオニンの２－ケト酪酸への変換
等のイソロイシンの生合成経路の最初の段階を実施する）のIPTG誘導性発現を可能とする。２－メチル酪酸生産における２－ケト－３－メチル吉草酸の供給を担保するために、NS1547株は、発現カセットP_L-SD1-ilvG*MEDA（配列番号13）を有し、該カセットは、SD1と
命名された改変型Shine-Dalgarno配列（pET22b(+)プラスミド（Novagen）由来のSD配列）に作動可能に連結されたλファージのP_Lプロモーターの制御下でのilvG*MEDAオペロンの
発現を提供する。この人工オペロン（(ilvG*MEDA）は、変異型ilvG遺伝子（ilvG*）を含
み、該遺伝子は、遺伝子の開始コドンから位置番号981および982の塩基間、すなわち配列TGActggcaの上流、に２つの塩基対（aa）が挿入されており（EP1627884 B1）、それによ
り野生型ilvG遺伝子におけるフレームシフトが回復してフィードバック耐性のアセト乳酸シンターゼII（acetolactate synthase II）が発現する。

カセットdacA::mini-Mu::cat-P_thr-attB-thrA*BC（配列番号14）（これは、アテニュエーションに必要な領域が除去されたスレオニンオペロンの発現を提供する）を、P1トランスダクション（Sambrook J. et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）によりNS1547株に導入した。スレオニンオペロンは、thrA遺伝子の変異（thrA442）（Akhverdyan V.Z. et al., Development of the mini-Mu system providing effective integration and amplification of the genetic material into the Escherichia coli chromosome, Biotekhnologiya, 2007, (3):3-20）を有し、該変異は、アスパルトキナーゼI－ホモセリンデヒドロゲナーゼI（aspartokinase I-homoserine dehydrogenase I）にスレオニンによるフィードバック阻害に対する非感受性を付与する。このカセットは、E. coliのdacA遺伝子に配置され、mini-Mu媒介転移のためのファージのmini-Mu L/R末端で挟まれており（Akhverdyan V.Z. et al., Application of the bacteriophage Mu-driven system for the integration/amplification of target genes in the chromosomes of engineered Gram-negative bacteria
- mini review, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91(4):857-871）、Mu-attL末端にクロラムフェニコール耐性（Cm^R）マーカーが挿入されている。

Cm^Rの形質導入体を、LB培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. “Molecular Cloning:
A Laboratory Manual”, 3^rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) に記
載されているようにLuria-Bertani培地ともいう）、寒天（1.5%）、およびCm（20 mg/L）を含むプレート上で選択し、プライマーP1（配列番号15）およびP2（配列番号16）を用いたPCRにより確認した。PCR検証の条件は以下の通りである：94℃で5分の変性ステップ；94℃で30秒、57℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長
。親株NS1547の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片1（配列番号17）の長さは1256 bpであった。NS1547 dacA::mini-Mu::cat-P_thr-attB-thrA*BC株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片2（配列番号18）の長さは2452 bpであった。その後、NS1547 dacA::mini-Mu::cat-P_thr-attB-thrA*BC株のCm^Rマーカーをλ-Int/Xisを介して切り出し
た。その結果、L1178-1株が得られた。切り出しは、上記のようにPCRにより確認した。親
株NS1547 dacA::mini-Mu::cat-P_thr-attB-thrA*BCの菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片2（配列番号18）の長さは2452 bpであった。L1178-1株の菌体のDNAを鋳型とし
た反応で得られたDNA断片3（配列番号19）の長さは842 bpであった。

発現カセットΔcynX::cat-P_L-ilvA*（配列番号20）をP1トランスダクションによりL1178-1株に導入した。このカセットは、E. coliのcynX遺伝子に配置され、変異型ilvA*遺伝
子（ilvA₁₂₃₇）（これは、遺伝子の開始コドンから位置番号1237のgがaに置換されており、その結果、Glu⁴¹²がLysに置換された（Hashiguchi K. et al., Construction of an L-isoleucine overproducing strain of Escherichia coli K-12, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63(4):672-679）、フィードバック耐性のスレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）をλファージのP_Lプロモーターの制御下でコードする）を含む。

Cm^Rの形質導入体を選択し、プライマーP3（配列番号21）およびP4（配列番号22）を用
いたPCRにより確認した。PCR検証の条件は以下の通りである：94℃で5分の変性ステップ
；94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株L1178-1の菌体のDNAを鋳型とした反応ではDNA断片は認められなかった。L1178-1
ΔcynX::cat-P_L-ilvA*株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片4（配列番号23）の長さは2131 bpであった。その後、L1178-1 ΔcynX::cat-P_L-ilvA*株のCm^Rマーカーをλ-Int/Xisを介して切り出した。その結果、L1190-1株が得られた。切り出しは、上記の
ようにPCRにより確認した。親株L1178-1 ΔcynX::cat-P_L-ilvA*の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片4（配列番号23）の長さは2131 bpであった。L1190-1株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片5（配列番号24）の長さは534 bpであった。

実施例２ E. coli L1194-2株の構築
２－メチル酪酸の生合成のため、２－メチル酪酸生合成遺伝子をL1190-1株（実施例１
）の染色体に挿入した。プラスミドpAH162-tetA-tetR-kdcA-aldHを用いたが、該プラスミドは、E. coliでの発現にコドンを最適化したLactococcus lactis固有の異種kdcA遺伝子
（Savrasova E.A. et al., Use of the valine biosynthetic pathway to convert glucose into isobutanol, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2011, 38(9):1287-1294）とE. coli固有のaldH遺伝子を含む。kdcA-aldHの3195 bpのプロモーターなしDNA断片（配列番
号25）をMlsI/SalIで消化した組み込みベクターpAH162-λattL-Tc^R-λattR（Minaeva N.I. et al., Dual-In/Out strategy for genes integration into bacterial chromosome: a novel approach to step-by-step construction of plasmid-less marker-less recombinant E. coli strains with predesigned genome structure, BMC Biotechnol., 2008, 8:63）に挿入した。組み換えプラスミドpAH162-tetA-tetR-kdcA-aldHを保持するE. coli CC118 λpir⁺株（Herrero M. et al., Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria, J. Bacteriol., 1990, 172:6557-6567）の形質転換体をテトラサイクリン（Tc）を添加した培地上で選択した。挿入が正しく実施されたことは、制限解析と、プライマーP5（配列番号26）およびP6（配列番号27）ならびにP7（配列番号28）およびP8（配列番号29）を用いたPCRにより確認した。PCR検証の条件は以下の通りである：94℃で5分の変性ステップ；94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株CC118 λpir⁺の菌体のDNAを鋳型とした反応ではDNA断片は認められなかった。CC118 λpir⁺ pAH162-tetA-tetR-kdcA-aldH株の菌体のDNAを鋳型としてプライマーP5（配列番号26）およびP6（配列番号27）を用いた反応
で得られたDNA断片6（配列番号30）の長さは1045 bpであった。CC118 λpir⁺pAH162-tetA-tetR-kdcA-aldH株の菌体のDNAを鋳型としてプライマーP7（配列番号28）およびP8（配列番号29）を用いた反応で得られたDNA断片7（配列番号31）の長さは865 bpであった。

次いで、プラスミドpAH162-tetA-tetR-kdcA-aldHを、プラスミドpAH123を含むE. coli
MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::φ80-attB株（Minaeva N.I. et al., Dual-In/Out strategy for genes integration into bacterial chromosome: a novel approach to step-by-step construction of plasmid-less marker-less recombinant E. coli strains with
predesigned genome structure, BMC Biotechnol., 2008, 8:63）の人工ローカスtrs5-10::φ80-attBにφ80-driven integrationにより組み込んだ。trs5-10::pAH162-tetA-tetR-kdcA-aldHカセットを保持するMG1655 Δ(φ80-attB)株の菌体を、LB培地、寒天（1.5%）、およびTc（40 mg/L）を含むプレート上で選択した。組み込みが正しく実施されたこと
は、プライマーP9（配列番号32）およびP10（配列番号33）を用いたPCRにより確認した。PCR検証の条件は以下の通りである：94℃で5分の変性；94℃で30秒、57℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::φ80-attBの菌体のDNAを鋳型とした反応ではDNA断片は認められなかった。MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::pAH162-tetA-tetR-kdcA-aldH株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片8（配列番号34）の長さは1629 bpであった。組み込まれたプラスミドの
ベクター部分をλ-Int/Xisを介して切り出し、MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::kdcA-aldH株が得られた。Tc^Rマーカーの切り出しは、プライマーP9（配列番号32）およびP11（配
列番号35）を用いたPCRにより確認した。PCR検証の条件は以下の通りである：94℃で5分
の変性；94℃で30秒、57℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::pAH162-tetA-tetR-kdcA-aldH株の菌体のDNA
を鋳型とした反応で得られたDNA断片9（配列番号36）の長さは4603 bpであった。MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::kdcA-aldH株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片10（配列番号37）の長さは1312 bpであった。

次いで、高レベルの構成的発現を確保するために、lacリプレッサー結合部位（図２）
の半分を含む、cat遺伝子で標識されたP_tacプロモーターの制御領域（De Boer H.A. et al., The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80(1): 21-25）を、DatsenkoとWannerが開発した「λRed-dependent integration」と呼ばれる方法（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）によってkdcA-aldHオペロンの上
流に導入した。この手順にしたがって、鋳型染色体中のkdcA遺伝子の隣接領域とcat遺伝
子およびP_tacプロモーターの隣接領域の両方に相同なPCRプライマーP12（配列番号38）およびP13（配列番号39）を構築した。E. coli MG1655 cat-P_tac-lacZ株（Katashkina J.I.
et al., Tuning of expression level of the genes of interest located in the bacterial chromosome, Mol. Biol. (Mosk.), 2005, 39(5):719-726）をPCR反応の鋳型として用いた。PCRの条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95℃で1分、34℃で30秒、72
℃で80秒の最初の2サイクルのプロファイル；95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で80秒の最
後の28サイクルのプロファイル；72℃で5分の最終ステップ。得られた1768 bpのDNA断片11（配列番号40）を、Silica Bead DNA Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）で精製し、プラスミドpKD46を含むMG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::kdcA-aldH株のエレクトロポレーションに用いた。プラスミドpKD46（Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）は、ファージλ（GenBank, accession No. J02459）の2154 bp（位置番号31088～33241）のDNA断片を含み、λRed相同組み換えシステムの遺伝子（gamma, beta, exo遺伝子）をアラビノース誘導性のP_araBプロモーターの制
御下に含む。プラスミドpKD46は、DNA断片を細菌の染色体に組み込むために必要である。

エレクトロコンピテントセルを以下の手順で調製した。pKD46プラスミドを含むMG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::kdcA-aldH株をアンピシリン（100 mg/L）を含むLB培地で30℃で一晩培養し、アンピシリン（100 mg/L）とＬ－アラビノース（1 mM）を添加した5 mLのSOB培地（Sambrook J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で培養液を100倍に希釈した。菌体をOD600が約0.6になるまで通気（250 rpm）しながら30℃で培養し、次いで100倍に濃縮し、氷
冷した脱イオン水で3回洗浄してエレクトロコンピテント化した。200 mkLの菌体と約100 ngのDNA断片11（配列番号40）を用いてエレクトロポレーションを実施した。次いで、菌
体を1 mLのSOC培地（Sambrook J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）で37℃で2.5時間培養し、LB
培地、寒天（1.5%）、およびクロラムフェニコール（20 μg/mL）を含むプレート上に移
し、37℃で培養してクロラムフェニコール耐性の組み換え体を選択した。次いで、pKD46
プラスミドを除去するため、Cm（20 μg/mL）を添加したL-寒天培地で42℃で1回継代し、得られた個々のコロニーについてアンピシリンに対する感受性を試験した。このようにして、MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::cat-Ptac-kdcA-aldH株を選択した。P_tacプロモーターの導入は、プライマーP14（配列番号41）およびP6（配列番号27）を用いたPCRにより確認した。PCRの条件は以下の通りである：94℃で5分の変性；94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株MG1655 Δ(φ80-attB)
trs5-10::kdcA-aldHの菌体のDNAを鋳型とした反応ではDNA断片は認められなかった。MG1655 Δ(φ80-attB) trs5-10::cat-P_tac-kdcA-aldH株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片12（配列番号42）の長さは1030 bpであった。

最後に、発現カセットtrs5-10::cat-P_tac-kdcA-aldHをP1トランスダクションによりL1190-1株（実施例１）の染色体に導入した。trs5-10::cat-Ptac-kdcA-aldHカセットを保持
するL1190-1株の菌体を、LB培地、寒天（1.5%）、およびCm（20 mg/L）を含むプレート上で選択した。trs5-10::cat-P_tac-kdcA-aldHカセットの導入は、上記のようにPCRにより検証した。Cm^Rマーカーをλ-Int/Xisを介して切り出し、L1194-2株が得られた。切り出しは、プライマーP15（配列番号43）およびP11（配列番号35）を用いたPCRにより確認した。
親株L1190-1 trs5-10::cat-P_tac-kdcA-aldHの菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA
断片13（配列番号44）の長さは2777 bpであった。L1194-2株の菌体のDNAを鋳型とした反
応で得られたDNA断片14（配列番号45）の長さは1167 bpであった。

実施例３ E. coliの２－メチル酪酸生産株L1201-1の構築
発現カセットP_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DAをL1194-2株（実施例２）に導入した。P_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DAの改変を有するMG1655株を、上記のRed-dependent integration法により構築した。この手順にしたがって、鋳型プラスミド中のilvE遺伝子の隣接領域とクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP16（配列番号46）およびP17（配列番号47）を構築した。プラスミドpMW118-attL-cat-attR（Katashkina J.I.
et al., Tuning of expression level of the genes of interest located in the bacterial chromosome, Mol. Biol. (Mosk), 2005, 39(5):719-726）をPCR反応の鋳型として
用いた。PCRの条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95℃で1分、34℃で30秒、72
℃で80秒の最初の2サイクルのプロファイル；95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で80秒の最
後の28サイクルのプロファイル；72℃で5分の最終伸長。得られたDNA断片15（1713 bp）
（配列番号48）を、Silica Bead DNA Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）で精製
し、プラスミドpKD46を含むMG1655 P_L-SD1-ilvG*MEDA株のエレクトロポレーションに用いた。Cm^Rの組み換え体を選択し、ilvE遺伝子の欠失を、プライマーP18（配列番号49）およびP19（配列番号50）を用いたPCRにより検証した。PCR検証の条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95℃で30秒、59℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72
℃で7分の最終伸長。親株MG1655 P_L-SD1-ilvG*MEDAの菌体のDNAを鋳型とした反応で得ら
れたDNA断片16（配列番号51）の長さは1354 bpであった。MG1655 P_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DA株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片17（配列番号52）の長さは2015 bpであった。

次いで、発現カセットP_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DAをP1トランスダクションによりL1194-2株に導入した。カセットP_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DAを保持するL1194-2株のCm^R菌体を選
択した。L1194-2株においてカセットP_L-SD1-ilvG*MEDAがカセットP_L-ilvG*M-ΔilvE::cat
-DAで置換されていることは、上記のようにPCRにより確認した。Cm^Rマーカーをλ-Int/Xisを介して切り出し、IlvE欠損株L1201-1が得られた。切り出しは、上記のようにプライマーP18（配列番号49）およびP19（配列番号50）を用いたPCRにより確認した。親株L1194-2
P_L-ilvG*M-ΔilvE::cat-DAの菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片17（配列番
号52）の長さは2015 bpであった。L1201-1株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片18（配列番号53）の長さは405 bpであった。

実施例４ E. coli L1201-1 ΔtyrB::cat株の構築
E. coli MG1655株（ATCC 47076）の染色体におけるtyrB遺伝子の欠失を、上記のRed-dependent integration法により構築した。この手順にしたがって、鋳型プラスミド中のtyrB遺伝子の隣接領域とクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP20（配列番号54）およびP21（配列番号55）を構築した。プラスミドpMW118-attL-cat-attRをPCR反応の鋳型として用いた。PCRの条件は以下の通りである：95℃で3分の変
性；95℃で1分、34℃で30秒、72℃で80秒の最初の2サイクルのプロファイル；95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で80秒の最後の28サイクルのプロファイル；72℃で5分の最終伸長。
得られたDNA断片19（1713 bp）（配列番号56）を、Silica Bead DNA Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）で精製し、プラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株のエレクトロポレーションに用いた。Cm^Rの組み換え体を選択し、選択した変異体におけるCm^R遺伝子で標識されたtyrB遺伝子の欠失を、プライマーP22（配列番号57）およびP23（配列番号58）を用いたPCRにより検証した。PCR検証の条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95
℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株MG1655の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片20（配列番号59）の長さは1430 bpであった。MG1655 ΔtyrB::cat株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片21（配列番号60）の長さは1894 bpであった。このようにして、MG1655 ΔtyrB::cat株が得られた。

MG1655 ΔtyrB::cat株を、L1201-1株（実施例３）へのtyrB遺伝子の欠失のP1トランス
ダクションのドナーとして用いた。Cm^Rの組み換え体を選択し、選択した変異体におけるtyrB遺伝子の欠失を上記のようにPCRにより検証した。その結果、L1201-1 ΔtyrB::cat株
が得られた。

実施例５ E. coli L1201-1 ΔtyrB::cat株を用いた２－メチル酪酸および副生物質の生
産
改変株L1201-1 ΔtyrB::catと対照株L1201-1を、それぞれ、LB培地で37℃で6時間培養
した。次いで、得られた培養液0.1 mLを、20 × 200-mmの試験管内の2 mLの発酵培地（L1201-1株についてはIle、Val、およびLeu（各200 mg/L）を添加したもの；L1201-1 ΔtyrB::cat株についてはIle、Val、Leu、Tyr、およびPhe（各200 mg/L）を添加したもの）に植菌し、238 rpmのロータリーシェイカー上で30℃で66時間培養した。培養後、蓄積した２
－メチル酪酸およびイソ酪酸をGC（ガスクロマトグラフィー）分析（予備実施例１）により測定した。蓄積した３－メチル酪酸をGC-MS（ガスクロマトグラフィー質量分析法）分
析（予備実施例２）により測定した。

独立した３つの試験管発酵の結果を表２に示す。表２から分かるように、改変株L1201-1 ΔtyrB::catは、対照株L1201-1と比較して少ない量で３－メチル酪酸（3-MB）を蓄積することができた。表２から分かるように、改変株L1201-1 ΔtyrB::catは、対照株L1201-1と比較して少ない量でイソ酪酸（IBA）を蓄積することができた。

実施例６ E. coli L1201-1 ΔtyrB ΔleuABCD::cat株の構築
E. coli MG1655株の染色体におけるleuABCDオペロンの欠失を、上記のRed-dependent integration法により構築した。この手順にしたがって、鋳型プラスミド中のleuABCDオペ
ロンの隣接領域とクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子の両方に相同なPCRプライ
マーP24（配列番号61）およびP25（配列番号62）を構築した。プラスミドpMW118-attL-cat-attRをPCR反応の鋳型として用いた。PCRの条件は以下の通りである：95℃で3分の変性
；95℃で1分、34℃で30秒、72℃で80秒の最初の2サイクルのプロファイル；95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で80秒の最後の28サイクルのプロファイル；72℃で5分の最終伸長。得
られたDNA断片22（1713 bp）（配列番号63）を、Silica Bead DNA Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）で精製し、プラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株のエレクトロポレーションに用いた。Cm^Rの組み換え体を選択し、選択した変異体におけるCm^R遺伝子で標識されたleuABCDオペロンの欠失を、プライマーP26（配列番号64）およびP27（配列番号65）を用いたPCRにより検証した。PCR検証の条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株MG1655の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片23（配列番号66）の長さは5172 bpであった。MG1655 ΔleuABCD::cat株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片24（配列番号67）の長さは1868 bpであった。このようにして、MG1655 ΔleuABCD::cat株が得られた。

MG1655 ΔleuABCD::cat株を、L1201-1 ΔtyrB株へのleuABCDオペロンの欠失のP1トランスダクションのドナーとして用いた。λ-Int/Xisを介したCm^Rマーカーの切り出しにより
、L1201-1 ΔtyrB::cat株（実施例４）からL1201-1 ΔtyrB株を得た。切り出しは、プラ
イマーP22（配列番号57）およびP23（配列番号58）を用いたPCRにより確認した。PCRの条件は以下の通りである：95℃で3分の変性；95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分の25サイクルのプロファイル；72℃で7分の最終伸長。親株L1201-1 ΔtyrB::catの菌体のDNAを鋳
型とした反応で得られたDNA断片21（配列番号60）の長さは1894 bpであった。L1201-1 ΔtyrB株の菌体のDNAを鋳型とした反応で得られたDNA断片25（配列番号68）の長さは284 bpであった。Cm^Rの組み換え体を取得し、選択した変異体におけるleuABCDオペロンの欠失を上記のようにPCRにより検証した。このようにして、L1201-1 ΔtyrB ΔleuABCD::cat株が得られた。

実施例７ E. coli L1201-1 ΔtyrB ΔleuABCD::cat株を用いた２－メチル酪酸および副
生物質の生産
改変株L1201-1 ΔtyrB ΔleuABCD::catと対照株L1201-1 ΔtyrB::catを、それぞれ、LB
培地で37℃で6時間培養した。次いで、得られた培養液0.1 mLを、20 × 200-mmの試験管
内の2 mLの発酵培地（Ile、Val、Leu、Tyr、およびPhe（各200 mg/L）を添加したもの）
に植菌し、238 rpmのロータリーシェイカー上で30℃で66時間培養した。培養後、蓄積し
た２－メチル酪酸をGC分析（予備実施例１）により測定した。蓄積した３－メチル酪酸をGC-MS分析（予備実施例２）により測定した。

独立した３つの試験管発酵の結果を表３に示す。表３から分かるように、改変株L1201-1 ΔtyrB ΔleuABCD::catは、対照株L1201-1と比較して少ない量で３－メチル酪酸を蓄積することができた。

予備実施例１ ２－メチル酪酸およびイソ酪酸のGC分析
炎イオン化検出器（FID）を備えたShimadzu GC-2014ガスクロマトグラフィー装置を発
酵培地中の２－メチル酪酸およびイソ酪酸の分析に用いた。試料をエタノール中の1% (v/v)ギ酸溶液に再懸濁して混合した。次いで、試料をボルテックスで3分間撹拌し、13,000 rpmで5分間遠心分離した。上清を直接２－メチル酪酸およびイソ酪酸の分析に用いた。標準物質は、エタノールと1% (v/v)ギ酸の混合溶媒に直接溶解した。検量線の範囲は、5～160 mg/Lとした。他のパラメータは以下の通りである：
カラム: InertCap Pure-WAX（GL science Inc.）
カラムサイズ: I.D. 0.25 mm, length 30 m, film thickness 0.5 μm
カラムグラジエント: 65°C（5 min hold） - 5°C/min - 200°C - 10°C/min - 240
°C
インジェクター温度: 240°C
インジェクション量: 1.0 μL
インジェクション分割モード: 1:10
キャリアガス: He
制御モード: 線速度
圧力: 89.0 kPa
総流量: 14.0 mL/min
カラム流量: 1.0 mL/min
線速度: 26.1 cm/sec
パージ流量: 3.0 mL/min
検出器: FID 260°C
インジェクション前: 試料で洗浄, 8 μL（3回）
インジェクション後: エタノールで洗浄, 8 μL（3回）

予備実施例２ ３－メチル酪酸のGC-MS分析
2本のチューブから発酵培地の上清を採取して2 mLにまとめ、ポアサイズ0.2 μmのフィルターで濾過して菌体を除去した。次いで、希釈した試料1 mLをGC-MS分析に用いた。GC-FID分析は、SUPELCO β-DEX 120カラムを備えたAgilent 7890Aクロマトグラフで実施した。カラムサイズは以下の通りである：I.D. 0.25 mm, length 30 m, film thickness 0.25
μm; limit of detection（LOD）0.05 mg/L。

本発明を例示的な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更や等価物の採用が可能であることは当業者に明らかであろう。

本発明の方法は、細菌の発酵により２－メチル酪酸を高純度に製造するのに有用である。

Claims (12)

1. ２－メチル酪酸を製造する方法であって、
   （i）腸内細菌目（Enterobacterales）に属する２－メチル酪酸生産細菌を培地で培養し
   て培地もしくは該細菌の菌体、またはその両者中に２－メチル酪酸を生産および蓄積させること、および
   （ii）前記培地もしくは前記細菌の菌体、またはその両者から２－メチル酪酸を回収すること
   を含み、
   前記細菌が、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化するように改変されている、方法。
2. 前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、tyrB遺伝子である、請求項１に記載の方法。
3. 前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、下記からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法：
   （A）配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
   （B）配列番号2に示すアミノ酸配列において、1～50アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
   および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質；および
   （C）配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列
   を含むタンパク質であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。
4. 前記遺伝子が、下記からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法：
   （a）配列番号1に示す塩基配列を含む遺伝子；
   （b）配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を含む遺伝子であって、チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、遺伝子；
   （c）配列番号2に示すアミノ酸配列において、1～50アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
   および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子であって、該タンパク質がチロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するものである、遺伝子；および
   （d）配列番号1の変異体塩基配列を含む遺伝子であって、該変異体塩基配列が遺伝暗号の縮重によるものである、遺伝子。
5. 前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、該遺伝子の不活化により弱化している、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記チロシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、欠失している、請求項５に記載の方法。
7. 前記細菌が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）またはエルビニア科（Erwiniaceae）
   に属する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属またはパントエア（Pantoea）属に属する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）またはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である、請求項８に記載の方法。
10. 前記細菌が、さらに、leuA、leuB、leuC、およびleuD遺伝子からなる群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子の発現が弱化するように改変されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. ２－メチル酪酸の副生物質の量が、非改変細菌と比較して低減されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記副生物質が、３－メチル酪酸、イソ酪酸、Ｌ－アロイソロイシン、Ｄ－アロイソロイシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。

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