KR101869869B1 - 타이로신 고생산 균주 및 이를 이용한 타이로신 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 타이로신 생합성 대사 경로 및 균주의 성장을 정교하게 조절하여 타이로신을 대량 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 항시성 프로모터 및 5' UTR 의 치환을 통해 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 대장균 및 이를 이용한 타이로신 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 대장균은 타이로신 생산을 위한 유전자의 발현량을 증가시키는 동시에 세포 성장을 저해하지 않으므로, 유용물질인 타이로신을 대량 생산하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

타이로신 고생산 균주 및 이를 이용한 타이로신 생산방법 {Strain for high production of tyrosine and the method of production of tyrosine using thereof}

본 발명은 타이로신 생합성 대사 경로 및 균주의 성장을 정교하게 조절하여 타이로신을 대량 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 항시성 프로모터 및 5' UTR 의 치환을 통해 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 대장균 및 이를 이용한 타이로신 생산 방법에 관한 것이다.

타이로신은 의약품이나 플라보노이드, 알카노이드 등의 전구체로 사용되는 상업적으로 중요한 아미노산이다. 전통적으로 타이로신을 생산하기 위해서는 식물로부터 추출하는 기법을 사용하였으나 낮은 수율로 인하여 증가하는 타이로신의 요구량을 충족하지 못하고 있다. 미생물을 이용한 타이로신의 생산은 최근 유전 정보에 대한 이해가 깊어지고 다양한 미생물 개량 기법이 개발되고 스케일업 공정이 편리한 이유로 효과적인 타이로신 생산 수단으로써 각광받고 있다.

최근 수십 년간, 타이로신의 생산성으로 높이기 위해 미생물을 이론적 접근법이나 조합적 접근법을 통해서 개량하는 연구들이 집중적으로 진행되어왔다. 이론적 접근법으로는 대사 경로 상의 효소들을 과발현 시키거나, 피드백 저해를 풀어준 효소를 도입하거나 TyrR 단백질과 같은 타이로신 합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 조절인자를 제거하는 등의 연구들을 통해 타이로신의 생산성을 높힐 수 있었다. 그러나 이론적 접근법을 통한 타이로신 생합성에 관여하는 유전자들의 과발현 혹은 제거로는 대사 흐름의 불균형을 초래하며 결국 타이로신의 최대 생산성을 이루지 못하는 문제점을 야기한다. 따라서 타이로신의 최대 생산을 위해서는 유전자 발현량을 정밀하게 조절할 수 있어야 하고 최적 대사 흐름을 유지 시켜주어야 한다.

대사 흐름의 최적화를 위해서 small RNA regulator, global transcriptional machinery engineering(gTME), 또는 멜라닌 기반의 high-throughput screening 등 조합적 접근법을 통한 연구들이 진행되어 왔으며 복잡한 대사 네트워크의 이해 부족으로 인한 이론적 접근법의 한계를 넘어 더 높은 타이로신의 생산성을 보일 수 있었다. 그러나 조합접 접근법을 사용할 때의 스크리닝의 효율성의 문제와 스크리닝 후 균주의 추가적인 engineering이 필요 등의 해결해야 할 과제가 남아있다.

따라서 보다 효율적인 타이로신의 생합성을 위하여 대사 흐름을 정교하게 조절하고, 균주 자체의 성장에도 부정적인 영향을 미치지 않도록 하는 새로운 조작법 및 이를 이용한 타이로신 합성 방법의 개발이 필요하다.

KR 10-2013-0001940

본 발명의 발명자는 대장균에서 생합성 경로를 정교하게 조절함으로써, 대장균의 성장이 저해되지 않으면서 타이로신을 대량 생산할 수 있는 새로운 재조합 대장균을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 프로모터 및 타이로신 생산에 관여하는 유전자들의 5' UTR을 특정 서열로 치환하여 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균 및 이를 이용한 타이로신 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 야생형 대장균에 대하여 항시성 프로모터를 도입하는 단계; aroG 의 5' UTR을 서열번호 1의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroB, aroD, aroE, aroL, aroA, aroC, tktA, tyrA, tyrB 의 5' UTR을 각각 서열번호 2 내지 서열번호 10의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 를 통해 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균을 배양 배지에서 배양하는 단계; 를 포함하는 타이로신 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 대장균은 타이로신 생산을 위한 유전자의 발현량은 증가시키는 동시에 세포 성장이 저해되지 않으므로, 유용물질인 타이로신을 대량 생산하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 프로모터의 치환 및 UTR 치환의 모식도 (a) 및 타이로신 생산을 위한 대사 경로의 모식도(b) 이다 (Glc, 글루코오스; PEP, 포스포에놀피루브산; Pyr, 피루브산; AcCoA, 아세틸-CoA; DAHP, 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate; DHQ, 3-dehydroquinate; DHS, 3-dehydroshikimate; SHIK, shikimate; S3P, shikimate-3-phosphate; EPSP, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate; CHA, chorismate; PPA, prephenate; HPP, 3-hydroxyphenylpyruvate; L-tyr, L-타이로신; KPP, keto-phenylpyruvate; L-Phe, L-페닐알라닌)
도 2는 야생형 W3110 균주와 유전자 재조합된 SCK1 균주의 타이로신 생산량을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ppsA 의 발현량 조절에 따른 타이로신 생산 유도에 대한 모식도이다.
도 4는 ppsA 의 5'UTR 치환 서열에 따른 예측 발현량 및 실제 효소 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 ppsA 의 5'UTR 치환 서열에 따른 각 균주의 타이로신 생산성을 나타낸 도이다.
도 6은 야생형 W3110 균주 (개방원) (a) 및 SCK5 (폐쇄원) (b) 의 배양 시간에 따른 글루코오스 및 L-타이로신 농도를 비교한 결과를 나타낸 도이다 (OD₆₀₀(원), 글루코오스(삼각형), L-tyrosine (사각형).

본 발명은 야생형 대장균에 대하여 항시성 프로모터를 도입하는 단계; aroG 의 5' UTR을 서열번호 1의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroB, aroD, aroE, aroL, aroA, aroC, tktA, tyrA, tyrB 의 5' UTR을 각각 서열번호 2 내지 서열번호 10의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 를 통해 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.

본 발명의 재조합 대장균은 타이로신의 생합성 대사에 관여하는 유전자들의 발현이 최적의 5'UTR (비번역 서열; Untraslated region) 서열과 번역 유도 프로모터의 조합을 통해 강하게 유도됨으로써, 야생형 대장균과 비교하여 타이로신 생산능이 현저하게 증가된 대장균임을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 야생형 대장균이란 인공적인 유전자의 재조합, 치환, 돌연변이 등이 가해지지 않은 천연 상태의 대장균을 의미하며, 본 발명에서는 예시적으로 W3110 균주를 이용하였으나, 이에 제한됨 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서는 타이로신 합성 유전자의 발현을 촉진 유도하기 위하여 합성된 프로모터를 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 프로모터는 항시성 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다. 항시성 프로모터(constituitive promoter)란 외부의 자극, 생장단계, 조직등의 특성과 관계없이 언제나 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 의미하며, 본 발명의 항시성 프로모터는 타이로신 합성 유전자의 발현을 지속적으로 유도하기 위한 목적으로 사용된다. 본 발명의 항시성 프로모터는 서열번호 17 (ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc)로 표시된 서열을 포함하는 프로모터인 것이 바람직하며, 상기 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 실질적으로 동질의 역할을 수행할 수 있는 것이라면 당 분야의 전문가들에 의해 적절하게 부가, 결실, 또는 치환되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항시성 프로모터는 예컨대, BBA_J23100 프로모터인 것이 바람직하다. BBA_J23100 프로모터는 고발현 항시성 프로모터이며, http://partsregistry.org/Part:BBa_J23100 에서 이에 대한 구체적인 정보를 확인할 수 있고, 이를 구입하여 도입하거나 합성하여 도입할 수 있다.

또한 본 발명은 타이로신 생합성 단계에 관여하는 유전자들의 발현을 촉진 유도하기 위하여, 비번역 부위의 서열인 UTR 의 치환을 통해, 재조합 대장균이 각 유전자 별로 최대 발현량을 나타내도록 설계하였다. 보다 구체적으로 본 발명은 aroG 의 5' UTR을 서열번호 1의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroB의 5' UTR을 서열번호 2의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroD의 5' UTR을 서열번호 3의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroE의 5' UTR을 서열번호 4의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroL의 5' UTR을 서열번호 5의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroA의 5' UTR을 서열번호 6의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; aroC의 5' UTR을 서열번호 7의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; tktA의 5' UTR을 서열번호 8의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; tyrA의 5' UTR을 서열번호 9의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 및 tyrB 5' UTR을 서열번호 10 의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 를 통해 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.

상기 합성 5' UTR 서열은 이와 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 실질적으로 동질의 역할을 수행할 수 있는 것이라면 당 분야의 전문가들에 의해 적절하게 부가, 결실, 또는 치환되어 사용될 수 있다. 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 합성 5'UTR 서열을 이용하면 타깃 유전자별 최대 발현량을 유도할 수 있으며, 재조합에 의하여 각각의 유전자는 합성 항시발현 프로모터와 5 'UTR 에 의하여 모노시스테릭하게 발현된다. 상기 5' UTR 서열은 상기 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 타깃 유전자에 연결될 수 있다.

본 발명에 있어서, 타이로신 생산능의 향상은 동일한 배양 조건에서 유전자 재조합을 갖지 않는 야생형의 대장균의 타이로신 생산능과 비교했을 때 타이로신의 생산량이 증가한 것을 의미한다.

또한 본 발명은 항시성 프로모터 및 5'UTR의 변형을 갖는 재조합 대장균에 대하여 추가적으로 ppsA (phosphoenolpyruvate synthetase A)의 5' UTR 서열이 서열번호 12 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 종의 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 더 수행하여 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균을 제공한다.

상기 ppsA는 세포성장과 타이로신 생산의 핵심 노드에 해당하는 단계에 관여하는 효소로, 이의 발현량을 다양하게 변화시킴으로써 타이로신의 생산과 세포성장을 정밀하게 조절하여 타이로신을 보다 다량으로 생산할 수 있도록 하는 타깃이 될 수 있다. 상기 ppsA 의 발현량은 타이로신 생산능을 증가시키기 위한 목적의 합성 5' UTR의 치환을 통해 조절될 수 있으며, 본 발명에서는 서열번호 12 내지 16으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 5' UTR 서열을 이용한 치환을 통해 상기 목적을 달성하였으나, 이와 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 실질적으로 동질의 역할을 수행할 수 있는 것이라면 당 분야의 전문가들에 의해 적절하게 부가, 결실, 또는 치환되어 사용될 수 있고, 서열번호 11의 서열을 바탕으로 3개의 서열을 변이시킨 서열 중 (TTAACTTTAATKAGGAGNMATACAT) 중 특히 타이로신의 고 생산능을 달성할 수 있는 서열이라면 본 발명의 서열에 모두 제한없이 포함되는 것으로 해석될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 대장균이 tyrA^fbr[코리스믹산 뮤타제/프리페닉산 탈수소효소 유전자(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase gene, tyrA)의 피드백-저해-저항성(feedback-inhibition-resistant, fbr) 유전자] 또는 aroG^fbr[3-디옥시-D-아라비노-햅튤로소내이트-7-인산염합성효소 유전자(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP) synthase, aroG)의 피드백-저해-저항성(feedback inhibition-resistant, fbr) 유전자] 가 tyrR(Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor) 조절유전자 부위에 삽입된 것인, 타이로신 생산능이 행상된 재조합 대장균을 제공한다.

상기 피드백-저해 저항성 유전자는 AroG^fbr[D146N], TyrA^fbr[M52I, A354V] 와 같이 표기될 수 있으며, 이는 AroG 효소 폴리펩티드의 146번째 위치의 아스파르트산이 아스파라진으로 점돌연변이 된 것을 의미하고, tyrA 효소 폴리펩티드의 52번째 위치의 메티오닌이 이소류신으로; 또는 354번째 위치의 알라닌이 발린으로 점 돌연변이 된 것을 의미한다. 이와 같은 피드백-저해-저항성 유전자는 Lutke-Eversloh, T., and G. Stephanopoulos. 2007. (L-tyrosine production by deregulated strains of　Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 75:103-110.) 와 같이 당 분야에 널리 알려져 있다. 상기 피드백-저해-저행성 유전자는 TryR 조절 유전자 부위에 삽입되어 조절유전자를 결손시키고, 이를 통해 타이로신 생산에 따른 저해 피드백을 제거할 수 있으므로, 타이로신의 생산이 지속적으로 높게 유지될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 대장균을 배양 배지에서 배양하는 단계; 를 포함하는 타이로신 생산 방법을 제공한다.

타이로신의 생산의 최적화를 위해서는, 대장균 자체의 유전자 전사, 번역의 정교한 조절이 필수적이나 이 외에도 대장균을 배양하고 타이로신의 수득을 최대화 할 수 있는 배양 조건의 설정 또한 필요하다.

이에 따라 본 발명은 타이로신을 고 생산하기 위한 배양 조건을 제공하며, 이를 통해 배치 배양 단계에서 당 분야에 공지된 최대생산능인 2g/L 의 타이로신 생산능과 비교하여 1.5 배 이상 증가된 3g/L의 생산성을 나타내는 타이로신 생산 방법을 제공한다.

상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여, 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 배지는 타이로신 발현을 용이하게 조절할 수 있는 배지인 것이 바람직하며, 복합 배지, 초산이나 숙신산이 유일탄소원인 최소 배지, 또는 포도당이나 글리세롤이 유일탄소원인 최소 배지 중에서 선택하여 사용할 수 있고, M9 배지 (M9 salt solutions; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 는 5 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 5 또는 40 g/L 글루코오스 및 적절한 항생제를 포함하고 복합배지는 6.75 g KH₂PO₄, 2 g (NH₄)₂HPO₄, 0.85 g 시트르산, 3 g 효모 추출물, 40 g 글루코오스, 10 mL 미량금속 용액/L [10 g FeSO₄.7H₂O, 2.2 g ZnSO₄.7H₂O, 0.58 g MnSO₄.4H₂O, 1 g CuSO₄.5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O, 0.2 g Na₂B₄O_{7 .}10H₂O, 및 10 mL 35% HCl/L], 및 적절한 항생제;를 포함하는 pH 6.8 인 배지 일 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 예로는 M9 배지 또는 복합 배지를 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 배양이 pH 5 내지 pH 8 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 타이로신 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 대장균을 배양하여 타이로신의 생산을 유도하는 경우, 배양에 의하여 발생하는 배양산물에 의하여 pH 와 같은 외부 조건이 변화될 수 있으며, pH 변화는 균주의 성장을 저해시킬 수 있다. 따라서 이와 같은 외부 조건을 조절하고 타이로신의 생산능을 보다 증가시키기 위하여, 당 분야의 통상의 기술을 이용하여 pH를 일정하게 조절할 수 있으며, pH는 5 내지 pH 8, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 7, 가장 바람직하게는 pH 6.8이 유지되도록 조절될 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 타이로신 고생산 균주 제조 및 타이로신 생산

대장균에서 타이로신 생합성 대사경로는 11개의 효소들로 구성되어 있다. 먼저 DAHP synthase(AroG)에 의해서 erythrose-4-phosphate(E4P)와 PEP가 축합하여 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP)를 생성한다. 합성된 DAHP는 3-dehydroquinate synthase (AroB), 3-dehydroquinate dehydratase (AroD), shikimate dehydrogenase (AroE), shikimate kinase II (AroL), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (AroA), 및 CHA synthase (AroC) 의 6가 효소 반응에 의해서 chorismate (CHA)로 전환된다. CHA는 chorismate mutase, prephenate dehydrogenase (TyrA), 및 transaminase (TyrB)에 의해 최종적으로 타이로신으로 전환된다. 이 타이로신 생합성 경로에서 AroG, AroB, TyrA는 생성된 타이로신에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)을 받게 되고 TyrR 단백질은 타이로신 농도를 감지하여 AroL과 TyrA, TyrB의 유전자 발현량을 조절하는 역할을 한다.

타이로신 고생산 균주인 SCK1을 제작하기 위하서 강한 항시발현 프로모터(strong constitutive promotor) 인 BBA_J23100 프로모터 (http://partsregistry.org) 를 원래 야생형이 가지고 있는 오리지널 프로모터와 바꾸어 전사단계에서 타이로신 생합성에 관여하는 유전자의 발현량을 높여주었으며, 각 유전자 별로 최대 발현량을 갖도록 5' UTR 서열을 설계하여 치환하여 타이로신 생합성의 대사 흐름이 최대가 될 수 있도록 조절하였다. 실험에 사용한 폴리머라아제와 제한 효소들은 각각 TaKaRa, New England Biolabs에서 구매하였으며, 실험에 사용한 대장균, 플라스미드 및 올리고뉴클레이티드는 모두 Genotech과 Bioneer에서 합성하여 사용하였다. 실험에 사용한 균주 및 플라스미드의 구체적인 정보는 표 1과 같다.

[표 1]

보다 구체적으로 대장균의 유전자 조작은 모두 pKD46, pcp20 벡터를 이용한 레드 재조합 시스템을 이용하여 진행하였다. SCK1 균주를 제작하기 위해서 먼저 FRT-Kan ^R -FRT 를 D-tyrR-F/D-tyrR-R 프라이머를 이용한 PCR 후에 재조합하여 야생형 W3110 균주의 tyrR 유전자를 제거해 주었다. 그리고 tyrR이 제거된 야생형 W3110 균주의 tktA , aroA, aroB, aroC , aroD , aroE , aroL 과 tyrB 의 야생 프로모터와 5' UTR은 인공적인 BBA_J23100 프로모터와 UTR 디자이너를 통해 재설계된 5'UTR로 재조합을 통해 치환해주었다. 야생형 aroG와 tyrA는 피드백 저해가 제거된 aroG ^fbr 와 tyrA ^fbr 에 BBA_J23100 프로모터, 재설계된 5' UTR 서열, FRT-KanR-FRT 서열이 합쳐진 절편을 O-aroG-F/O-aroG-R 와 O-tyrA-F/O-tyrA-R 프라이머 각각으로 증폭 후 재조합하여 치환해 주었다. 앞의 모든 재조합 공정 후 서열분석을 통해 서열이 제대로 바뀌었는지 확인하였다. 재조합에 사용된 프라이머 각각의 서열 정보는 하기 표 2와 같다.

[표 2]

유전자별 최대 발현량을 유도하기 위한 5' UTR의 합성 변형서열에 대한 정보는 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

표 3에 표시된 유전자 aroB 는 음성 코딩 서열로부터 최대 발현량을 가지는 서열을 찾기가 어려워 같은 코돈 선호를 갖는 다른 서열로 치환하여 최대 발현량을 가지는 서열을 확보할 수 있었다. 상기와 같은 재조합에 의하여 각각의 유전자는 합성 항시발현 프로모터와 5' UTR 에 의해서 모노시스테릭하게 발현된다.

또한 타이로신 합성 과정에서 글로벌하게 전사단계에서 조절하는 TyrR 의 유전자 서열을 제거해 주었고 타이로신에 의해서 피드백 저해를 받는 AroG와 TyrA의 경우는 이와 같은 피드백에 저항성을 갖도록 AroG^fbr[D146N], TyrA^fbr[M52I,A354V]로 치환해 주었다. 모든 유전자 변경은 대장균의 염색체 상에서 수행하였으며, 이를 통해 플라스미드 기원의 부적합성이나 항생제, 인듀서(inducer)의 필요와 같은 문제점들을 배제할 수 있었다. 보다 구체적으로 pTyrA ^fbr 플라스미드를 만들기 위하여, tyrA유전자를 V-tyrA-F/R 프라이머 셋트를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였고 pMD20-T 벡터에 클로닝하였다. TyrA ^fbr 은 M-tyrA-F1/R1과 F2/R2 프라이머를 이용하여 위치 특이적 변이(site-directed metagenesis)를 수행하여 확보하고 P-tyrA-F/R 과 P-FKF-F/R 프라이머를 이용하여 FRT-KanR-FRT PCR 절편과 오버랩 PCR을 하여 최종적으로 tyrA ^fbr -FRT - Kan ^R - FRT 를 제작하였다. 만들어진 절편을 pMD20 T 벡터에 클로닝 후 재조합을 위한 주형에 사용하였다. pAroG ^fbr 를 만들기 위해서, aroG유전자를 V-aroG-F/R 프라이머로 PCR 한 뒤 pMD20 T 벡터에 클로닝 하였다. AroG에 피드백 저해를 제거하기 위해서 M-aroG-F/R 프라이머를 이용하여 위치 특이적 변이를 수행하였고 pGFKF2 벡터의 SacI과 KpnI 제한효소자리에 클로닝하였다.

상기와 같이 유전자 변형된 대장균을 SCK1으로 명명하였고, SCK1에서의 타이로신 합성 공정을 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 타이로신 고생산 균주는 합성 항시발현 프로모터와 표적 특이적 발현을 증가시키는 재조합 5'UTR 서열을 가지게 되며, 타이로신 생산에 의한 피드백 저해의 영향을 받지 않으므로, 야생형 균주와 비교하여 타이로신의 생산량이 증가하게 될 것임을 예측할 수 있었다.

SCK1 대장균과 야생형 균주의 타이로신 생산을 비교하기 위하여 각 균주를 배양하고 타이로신 생산량을 분석하였다. 균주의 배양에는 M9 배지 (M9 salt solutions; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 5 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 5 또는 40 g/L 글루코오스 및 적절한 항생제)와 복합 배지(6.75 g KH₂PO₄, 2 g (NH₄)₂HPO₄, 0.85 g 시트르산, 3 g 효모 추출물, 40 g 글루코오스, 10 mL 미량금속 용액/L [10 g FeSO₄.7H₂O, 2.2 g ZnSO₄.7H₂O, 0.58 g MnSO₄.4H₂O, 1 g CuSO₄.5H₂O, 0.1 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O, 0.2 g Na₂B₄O_{7 .}10H₂O, 및 10 mL 35% HCl/L], 및 적절한 항생제; pH 6.8)를 사용하였다. 세포는 37도, 200 rpm 조건에서 배양하였고 대장균의 셀농도는 UV-1700 분광기를 이용하여 600nm 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 타이로신 생산을 위한 배양은 3ml의 M9 혹은 복합배지에서 하룻밤동안 배양을 진행한 후, 같은 배지 3ml에서 한번 더 배양을 하는 방식으로 수행하였다. 이차 배양에서 셀농도(OD₆₀₀)가 0.8-1.0 일 때 25ml의 M9 배지 혹은 50ml의 복합배지에 셀농도(OD₆₀₀)가 0.05가 되도록 접종하였다. 모든 실험은 세번 반복적으로 수행하였다. 이와 같은 방식으로 배양을 수행하고 SCK1 과 야생형 균주에서의 타이로신 생산량을 비교한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 타이로신 특이적 생산량을 비교한 결과, 본 발명의 SCK1 균주는 M9 배지를 통해 타이로신을 생산했을 때 0.0014g/h/g dry cell weight(DCW)의 생산성을 보였으나, 야생형인 W3110 균주는 타이로신이 측정되지 않았다. 이를 통해 타이로신의 생합성에 관여하는 효소들의 전사와 번역 단계에서의 발현량을 증가시킨 SCK1 균주가 타이로신 생합성 대사 흐름을 증가시키고, 야생형 균주에 비하여 타이로신의 생산을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. ppsA 발현량 조절을 통한 타이로신 대사 최적화

SCK1 균주가 타이로신의 생산성을 증가시키는 것을 확인하였으나, 세포 성장과 타이로신 생산간의 대사 불균형으로 인해 최대 생산성에는 도달하지 못하는 것으로 예측되었다. 이에 따라 세포성장과 타이로신 생산의 대사흐름 최적화를 위하여 두 대사 흐름이 나눠지는 PEP 노드(node) 에서 대사흐름을 조절하기 위한 실험을 수행하였다. PEP 노드에서 대사흐름을 조절하기 위하여 ppsA (PEP synthetase) 유전자를 조절대상 유전자로 선정하였다. PpsA 는 피루브산(pyruvate)을 PEP로 전환시켜주는 효소이나, ppsA의 과발현이 피루브산의 양을 감소시켜 TCA 사이클로의 대사 흐름의 감소를 유도하게 되어 세포 성장속도를 감소시킨다는 문제점이 있다. 세포 성장 속도가 감소되면 결국 타이로신의 생산성이 감소되게 되므로 ppsA 발현량을 조절하여 타이로신 생산과 세포성장을 조절하는 것은 타이로신의 고생산을 유도할 수 있다.

ppsA의 발현량 조절을 위하여 먼저 UTR 디자이너를 통해 다양한 UTR 서열을 구축하고 ppsA 유전자의 발현량이 최대가 되는 서열 (TTAACTTTAATGAGGAGAAATACAT: 서열번호 11) 을 확보하였다. 서열번호 11의 서열을 바탕으로 세개의 서열을 무작위 돌연변이시켰으며, 발현량이 다양한 16가지의 변이서열을 설계(TTAACTTTAATKAGGAGNMATACAT) 한 후, 그 중 5개의 서열을 확보 하였다. 합성된 UTR 서열을 표 4에 나타내었다.

[표 4]

표 4에 나타낸 바와 같이, 확보된 5개의 서열을 서열번호 12 내지 16으로 표시하였으며, 각 클론은 pPpsA-V1 내지 pPpsA-V5로 명명하였다. ppsA 발현 조절을 위한 타깃 경로 및 UTR 변형에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다. J23100은 강한 항시발현 프로모터를 나타낸다 (Registry of Standard Biological Parts, BBa_J23100;http://partsregistry.org).

각각의 5'UTR 서열과 합성 프로모터 서열에 의하여 ppsA가 발현되도록 재조합을 수행하였으며, SCK1 균주의 원래 프로모터 5'UTR 서열과 치환을 수행하였다. ppsA의 실제 발현량이 달라지는 것을 확인하기 위하여 보다 구체적으로 다음과 같은 과정을 수행하였다. ppsA의 활성을 측정하기 위하여 ppsA 유전자의 발현량이 다른 세포들을 각각 배양 후, mid-log phase에서 수확 후 차가운 PBS 로 세척하였다. 원심분리를 통해 얻어진 세포 펠렛은 Bug Buster Master Mix(EMD Bioscience, San Diego, CA, USA)를 통해 용해시켰으며, 프로테아제 억제제 칵테일을 첨가해 주었다. 총 단백질의 농도는 브래드포드 어세이를 이용하고 BSA 를 기준으로 하여 정량하였다. ppsA 의 활성 측정은 다음과 같이 진행하였다. 먼저 4 μmol/L의 피루브산, 10μmol/L ATP, 10μmol/L MgCl₂, 및 100 μmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 의 반응 혼합물을 제작 후, 40ul의 용해물을 첨가하여 30분에서 5분간 반응을 진행시켰다. 반응은 분취된 20μl의 반응 혼합물과 0.066ml의 2,4-dinitrophenylhydrazine 1% 용액, 그리고 0.18ml의 물을 섞어 30도에서 10분간 배양하여 종료시킨다. 반응이 종료된 반응 혼합물은 0.334 ml 의 NaOH 10% 용액과 섞어서 30도에서 10분 간 추가적으로 배양 후에 445nm 파장에서 흡광도를 측정하여 피루브산의 감소량을 통해 PpsA 의 활성을 정량하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이 UTR 디자인을 통해 예측된 발현량과 실제 ppsA 변이 서열에 따른 활성도가 비슷한 양상을 나타내는 것을 확인하였다.

이에 따라 각 균주 pPpsA-V1 내지 pPpsA-V5 가 도입된 균주에 대응되는 SCK2 내지 SCK6과 ppsA의 활성도를 변화시키지 않은 실시예 1의 SCK1 의 타이로신 생산성을 M9 배지에서 실시예 1과 같은 방법으로 배양하고 측정하였으며, 그 결과를 도 5 및 표 5 에 나타내었다.

[표 5]

도 5 및 표 5 에 나타낸 바와 같이, ppsA 변이 균주들의 타이로신 생산성은 SCK1보다 높았으나 ppsA 발현량과 타이로신의 생산성의 상관관계는 다르게 나타났다. SCK6의 경우 ppsA 발현량이 제일 높지만 실제 타이로신의 생산성은 SCK5보다 낮은 것으로 나타났으며, 최대 타이로신 생산능은 SCK5에서 나타났다. 이와 같은 결과는 타이로신 생산성이 최대가 되는 최적의 ppsA 발현량이 존재하며 기존의 기술과 같은 단순 과별한 또는 넉아웃만으로는 최적의 타이로신 생산을 유도하기 어려우며 정밀한 발현 조절이 필요하다는 것을 시사한다.

실시예 3. 타이로신 최대 생산을 위한 배양 조건 최적화

PpsA 의 발현량을 조절하는 것에 더하여, 타이로신의 생산성을 극대화하기 위해서 배양 조건의 최적화를 수행하였다. 균주를 배양하면, 균주에 의해 아세트산, 타이로신 등의 산물이 생산되어 pH 가 낮아지게 되며, 이와 같은 pH 변화가 세포 성장을 저해하는 방해 요인으로 작용될 수 있다. 이에 따라 pH 의 변화를 조절하고 각 실험군에 따른 타이로신 생산량을 확인하였다. 먼저 M9 배지에서 실시예 2에서 제조된 SCK5 균주를 pH 조절없이 배양한 경우, 0.3265 g/L 타이로신만이 생산되었다. 실시예 1 의 배양방법에 더하여 배양 중 6시간 마다 pH를 측정하고 NaOH를 첨가하여 pH를 6.8로 유지시키는 것을 pH 조절실험군으로 두었으며, pH 조절 여부에 따른 환경에서의 타이로신 생산량을 비교하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

표 6에 나타낸 바와 같이, pH 를 6.8로 조절한 배양 환경에서 SCK5 균주는 0.5155g/L 의 타이로신 생산량을 나타내어, pH 조절이 없는 SCK5 배양과 비교하여 생산량이 증가되었다.

추가적으로 M9 배지 대신 타이로신 생산에 최적화된 복합배지를 이용하여 타이로신을 생산하고 타이로신 생산량을 비교하였다. 대사산물의 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 배지 내 남아있는 글루코스 농도는 HPLC와 Aminex HPX-87H column을 이용하여 정량하였다. 측정은 65도 온도에서 flow rate 0.6 mL/min, 5mM의 H₂SO₄ 이동상에서 진행하였고 Shodex RI-101 detextor를 이용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 타이로신의 농도는 pre-cloumn o-phthalaldehyde derivatization 방법과 역상 액체컬럼크로마토그래피를 이용하여 HPLC를 통해 측정하였다. Derivatized된 타이로신은 flow rate 1.5ml/min에서 아세토니트릴, 메탄올, 물 (45:45:10; %[v/v]) 용액과 50mM 소듐 아세테이트 완충액 조건에서 진행하였고 UV-Vis diode array detector를 이용하여 338nm 파장에서 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, SCK5 균주는 M9 배지에서와 같이 pH 를 조절하지 않은 경우 최종 1 g/L, pH 를 조절한 경우 최대 3g/L 의 타이로신 생산량을 나타내어 pH 가 pH 6.8 로 조절된 환경에서의 재조합 대장균 균주의 배양이 타이로신의 생산량을 약 3배나 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 상기와 같은 결과를 통해, 타이로신 생산량을 극대화 할 수 있는 대장균 및 이의 배양 조건을 확립하였다. 본 발명의 재조합 균주는 PEP 노드, 5' UTR 과 프로모터의 재조합을 이용한 유전자 전사, 발현의 조절 및 대사 흐름 조절을 통해 기존보다 높은 타이로신 생산성을 확보할 수 있도록 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Strain for high production of tyrosine and the method of production of tyrosine using thereof <130> P1-23p-1 <150> KR 10-2015-0158200 <151> 2015-11-11 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroG Synthetic 5'-UTR <400> 1 gactatttca aaaggagcat cacga 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroB Synthetic 5'-UTR <400> 2 gaagcagagt taaggaggag aacat 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroD Synthetic 5'-UTR <400> 3 aggcccgaaa taaggaggat cattc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroE Synthetic 5'-UTR <400> 4 gccgatcaaa taaggaggaa ctcga 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroL Synthetic 5'-UTR <400> 5 gaaccagcaa taaggaggaa ctcgc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroA Synthetic 5'-UTR <400> 6 cacccctaga taaggagcat ctcat 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroC Synthetic 5'-UTR <400> 7 cacgatagga gaaggaggta gatat 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tktA Synthetic 5'-UTR <400> 8 cacgctaaat taaggagccc caaac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrA Synthetic 5'-UTR <400> 9 ccgaagacgc taaggaggta cgaga 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrB Synthetic 5'-UTR <400> 10 ttctgaacct cctttgctat agtac 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA Synthetic 5'-UTR <400> 11 ttaactttaa tgaggagaaa tacat 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA-v1 Synthetic 5'-UTR <400> 12 ttaactttaa tgaggagagc tacat 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA-v2 Synthetic 5'-UTR <400> 13 ttaactttaa ttaggagaca tacat 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA-v3 Synthetic 5'-UTR <400> 14 ttaactttaa ttaggagacc tacat 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA-v4 Synthetic 5'-UTR <400> 15 ttaactttaa ttaggagaaa tacat 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppsA-v5 Synthetic 5'-UTR <400> 16 ttaactttaa tgaggagaga tacat 25 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBA_J23100 constituitive promoter <400> 17 ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

Claims (9)

1. 야생형 대장균에 대하여
   하기 유전자들의 야생형 프로모터를 항시성 프로모터(constituitive promoter)로 치환하는 단계;
   aroG(DAHP synthase) 의 5' UTR을 서열번호 1의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroB(3-dehydroquinate synthase)의 5' UTR을 서열번호 2의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroD(3-dehydroquinate dehydratase)의 5' UTR을 서열번호 3의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroE(shikimate dehydrogenase)의 5' UTR을 서열번호 4의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroL(shikimate kinase II)의 5' UTR을 서열번호 5의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroA(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)의 5' UTR을 서열번호 6의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   aroC(CHA synthase)의 5' UTR을 서열번호 7의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   tktA(Transketolase A)의 5' UTR을 서열번호 8의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계;
   tyrA(prephenate dehydrogenase)의 5' UTR을 서열번호 9의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 및
   tyrB(transaminase)의 5' UTR을 서열번호 10 의 합성 5' UTR 서열로 치환하는 단계; 를 통해 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 항시성 프로모터는 서열번호 17로 표시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
3. 제1항에 있어서, ppsA (phosphoenolpyruvate synthetase A)의 5' UTR 서열을 서열번호 12 내지 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 5' UTR 서열로 치환하는 단계;를 더 포함하여 제조되는 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 대장균은 tyrA^fbr[코리스믹산 뮤타제/프리페닉산 탈수소효소 유전자(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase gene, tyrA)의 피드백-저해-저항성(feedback-inhibition-resistant, fbr) 유전자] 또는 aroG^fbr[3-디옥시-D-아라비노-햅튤로소내이트-7-인산염합성효소 유전자(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP) synthase, aroG)의 피드백-저해-저항성(feedback inhibition-resistant, fbr) 유전자] 가 tyrR(Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor) 조절유전자 부위에 삽입된 것인, 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 aroG^fbr는 AroG 효소 폴리펩티드의 146번째 위치의 아스파르트산이 아스파라진으로 점 돌연변이된 것을 특징으로 하는, 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 tyrA^fbr는 tyrA 효소 폴리펩티드의 52번째 위치의 메티오닌이 이소류신으로; 또는 354번째 위치의 알라닌이 발린으로; 점 돌연변이된 것을 특징으로 하는, 타이로신 생산능이 향상된 재조합 대장균.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 배양 배지에서 배양하는 단계; 를 포함하는 타이로신 생산 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 배양 배지는 M9 배지 또는 복합 배지인 것을 특징으로 하는 타이로신 생산 방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 배양은 pH 5 내지 pH 8 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 타이로신 생산방법.
   
   

Images