CN104520426A

CN104520426A - 生物合成途径、重组细胞和方法

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Publication number: CN104520426A
Application number: CN201380035331.2A
Authority: CN
Inventors: K.张; Y.K.汉德
Original assignee: UNVIVERSITY OF MINNESOTA
Current assignee: UNVIVERSITY OF MINNESOTA; University of Minnesota
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2015-04-15
Also published as: SG11201407375XA; EP2847325A1; AU2013260096A1; US20150132813A1; JP2015515866A; WO2013169350A1; KR20150014952A

Abstract

本公开通常描述了经修饰以展示增加的戊酸的生物合成的重组细胞，制成此类重组细胞的方法，和诱导细胞产生戊酸的方法。本公开还通常描述了经修饰以展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重组细胞，制成此类重组细胞的方法，和诱导细胞产生2-甲基丁酸的方法。

Description

生物合成途径、重组细胞和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2012年5月11日提交的美国临时专利申请系列号61/645,900的优先权，其通过引用并入文本。

概述

在一个方面中，本公开描述重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成。在另一个方面中，本公开描述重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合成。

在各方面中，重组细胞可以是真菌细胞或细菌细胞。在各方面中，重组细胞可以是光合的。在各方面中，重组细胞可以是分解纤维素的。

在其中重组细胞展示增加的戊酸的生物合成的方面中，增加的戊酸的生物合成可以包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，相比于野生型对照2-酮丁酸延长活性中的增加，相比于野生型对照2-酮戊酸延长活性中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。

在其中重组细胞展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的方面中，增加的2-甲基丁酸的生物合成可以包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸转化为2-酮-3-甲基戊酸中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。

在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生戊酸有效的条件下孵育展示增加的戊酸的生物合成的重组细胞。在一些实施方案中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生2-甲基丁酸有效的条件下孵育展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重组细胞。在一些实施方案中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括将编码至少一种催化碳源转化为戊酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中至少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化碳源转化为戊酸。

在另一个方面中，本公开描述方法，其通常包括将编码至少一种催化碳源转化为2-甲基丁酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中至少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化碳源转化为2-甲基丁酸。

本发明的上述概述不旨在描述本发明的各公开的实施方案或每种实施。随后更具体的描述示例说明性实施方案。在贯穿本申请的几处，通过实施例的列表提供教导，所述实施例可以以多种组合使用。在每种情况下，描述的列表只能作为代表性的组，并且不应当解释为排他性的列表。

附图简述

图1. 生产2-甲基丁酸（2MB）和戊酸（PA）的途径。（A）从1-丁烯和2-丁烯至2-甲基丁酸和戊酸的化学方法。（B）从葡萄糖合成2-甲基丁酸的代谢途径。（C）从葡萄糖合成戊酸的代谢途径。

图2. 用于（A）2-甲基丁酸（2MB）生产、（B）戊酸（PA）生产的合成操纵子。DC，2-酮酸脱羧酶；DH，醛脱氢酶。

图3. 使用不同醛脱氢酶的发酵实验的结果。（A）用于2-甲基丁酸生产的醛脱氢酶的比较。（B）用于戊酸生产的醛脱氢酶的比较。

图4. 使用不同酮酸脱羧酶的发酵实验的结果。（A）用于2-甲基丁酸生产的酮酸脱羧酶的比较。（B）用于戊酸生产的酮酸脱羧酶的比较。

图5. 酮酸脱羧酶和醛脱氢酶的组合的发酵实验的结果。（A）用于2-甲基丁酸生产的各种组合的比较。（B）用于戊酸生产的各种组合的比较。

说明性实施方案的详述

在以下的示例性实施方案的描述中，指定了某些代谢酶和那些酶的天然来源。这些仅仅是合适的酶和指定酶的合适来源的实例。具有相似催化活性的可选的酶是可以的，如可从不同的微生物物种或菌株中获得的同源物。因此，本文描述的示例性实施方案不应当解释为限制权利要求中反映的微生物或方法的范围。

戊酸和2-甲基丁酸用作多种应用例如增塑剂、润滑剂和药物的化学中间体。本公开描述了在大肠杆菌（Escherichia coli）中生物合成这两种酸的合成代谢途径的构建：修饰天然的亮氨酸生物合成途径以生产戊酸；修饰天然的异亮氨酸生物合成途径以生产2-甲基丁酸。研究多种醛脱氢酶和2-酮酸脱羧酶在构建的途径中的活性。通过在摇瓶发酵中酶的优化组合，实现对2-甲基丁酸2.59g/L和对戊酸2.58g/L的最高滴度(titer)。该工作证明了高体积脂肪酸可再生生产的可行性。

原油是能源和工业有机化学品的主要来源。然而，原油储备正在快速衰竭，使得燃料和化学品的可持续途径的开发更具吸引力。为应对这一挑战，可以使用生物合成的方法，其涉及将微生物工程化以生产非天然的化学中间体。非天然代谢物的生产可以涉及合成代谢途径的工程化和开发。在该工作中，开发了从葡萄糖或其它合适的碳源可再生生产戊酸（PA）和2-甲基丁酸（2MB）的生物合成策略。

2005年美国总消耗的戊酸和2-甲基丁酸约为14,000公吨（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008）。这些化学品可以作为中间体用于多种应用，例如增塑剂、润滑剂和药物。它们同样用于从烃类提取硫醇。戊酸的酯类作为戊酸类生物燃料（pentanoic biofuels）正在获得增加的关注，因为它们可以以非常高的掺合比在汽油和柴油(diesel)中使用（Lange 等, Angew Chem Int Edit 2010;49:4479-4483）。商业上，这些化学品通常通过氧化戊醛和/或2-甲基丁醛生产，其每一种可以通过基于石油的化合物与合成气反应的方法制成（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008）。因为该方法使用有毒性的中间体如合成气和不可再生的基于石油的原料，因此需要这些化学品的可持续途径。本文展示生物合成作为这些化学品的潜在可替代途径。

工程化的生物合成途径的一个优点是在微生物间天然生物合成途径的保守。因此，一旦新的工程化的生物合成途径在一种微生物中建立，其通常可以在其它微生物中应用。在该工作中，大肠杆菌中的天然的亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径，通过引入大肠杆菌宿主细胞异源（非天然）酶醛脱氢酶和/或2-酮酸脱羧酶来进行修饰。2-甲基丁酸和戊酸的示例性合成代谢途径分别在图1B和图1C中显示。两种途径的共同中间体是2-酮丁酸（2KB），其通过生物合成的脱氨酶IlvA从苏氨酸衍生。thrA、thrB和thrC的过表达可以驱动碳流朝向苏氨酸生物合成（Zhang 等, Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239），并且因此，进入合成代谢途径以生产戊酸和/或2-甲基丁酸。

对2-甲基丁酸的合成，在图1B中显示，2-酮丁酸被驱动进入2-酮-3-甲基戊酸（KMV）的合成，其是2-甲基丁酸的倒数第二个前体。通过IlvG和IlvM催化2-酮丁酸和丙酮酸缩合成2-乙酰-2-羟基丁酸（AHB）。另两种酶IlvC和IlvD可以催化AHB转化为KMV。KMV随后通过酮酸脱羧酶（DC）脱羧成2-甲基丁醛，其可以通过醛脱氢酶（DH）氧化为2-甲基丁酸。

对于戊酸的合成，2-酮丁酸可以经历2个循环的“+1”碳链延长以产生2-酮己酸（2KC）。在天然的亮氨酸生物合成途径中，2-酮异戊酸通过由2-异丙基苹果酸合酶（LeuA）、异丙基苹果酸异构酶复合体（LeuC、 LeuD）和3-异丙基苹果酸脱氢酶（LeuB）催化的3步链延长循环转化为2-酮异己酸。然而，在我们的合成途径中，LeuA、LeuB、LeuC、和LeuD足够灵活以类似地延长2-酮丁酸至2-酮戊酸，并且随后延长2-酮戊酸至2-酮己酸（4）。2-酮己酸可以随后通过2-酮酸脱羧酶（DC）脱羧至戊醛，其可以通过脱氢酶（DH）氧化至戊酸。

生物合成2-甲基丁酸和戊酸的代谢途径的构建

生产2-甲基丁酸（2MB）和戊酸（PA）的生物合成方案分别在图1B和图1C中显示。天冬氨酸生物合成下游的所有酶从3个合成操纵子过表达。一个操纵子包括ThrA、 ThrB和ThrC的编码区，其每一个均涉及苏氨酸合成，在携带壮观霉素抗性标记物的低拷贝质粒pIPA1上P_LlacO1启动子的控制下。对于2-甲基丁酸的合成（图1B），ilvA、ilvG、ilvM、ilvC和ilvD被克隆至具有卡那霉素抗性标记物的低拷贝质粒上以获得pIPA2。相似地，对于戊酸的合成，ilvA、leuA、leuB、leuC和leuD被克隆至携带卡那霉素抗性标记物的低拷贝质粒pIPA3上。多种醛脱氢酶和酮酸脱羧酶存在于携带氨苄青霉素抗性标记物的高拷贝质粒（pIPA4至pIPA15，表2）上以转录顺序DC-DH（2-酮酸脱羧酶-脱氢酶）在P_LlacO1启动子之下。

由于苏氨酸是两个途径的共同中间体，因此在本研究中使用了苏氨酸过生产菌株大肠杆菌菌株ATCC98082。该菌株移除了苏氨酸输出基因rhtA以确保苏氨酸的细胞内高水平（Zhang 等, Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239），还删除醇脱氢酶yqhD基因以消除导向相应醇的副反应。产生的菌株此后被称为PA1菌株。

在图1B和图1C显示的合成途径被设计为包括将酮酸2-酮-3-甲基戊酸（图1B）和2-酮己酸（2KC，图1C）脱羧为它们相应的醛，随后氧化醛至羧酸。基于我们先前对于生产异丁酸的工作（Zhang 等, ChemSusChem 2011;4:1068-1070），我们从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)克隆野生型2-酮异戊酸脱羧酶KIVD（de la Plaza 等, FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374），从大肠杆菌克隆苯乙醛脱氢酶PadA（Rodríguez-Zavala 等, Protein Sci 2006;15:1387-1396）以检查我们的目标化学品的生产。PA1菌株用质粒pIPA1、pIPA2和pIPA4转化以生产2-甲基丁酸。PA1菌株用质粒pIPA1、pIPA3和pIPA4转化以生产戊酸。使用各重组菌株实施摇瓶发酵。使用这种方法，我们生产出2.26g/L的2-甲基丁酸和2.12g/L的戊酸，证明了我们的生物合成方法的可行性。

醛脱氢酶的筛选

为改进生产滴度，检测选择不同醛脱氢酶的效果（图3A和图3B）。选择6种醛脱氢酶作为该研究的候选酶：来自大肠杆菌的乙醛脱氢酶AldB（Ho和Weiner, J Bacteriol 2005;187:1067-1073）、3-羟基丙醛脱氢酶AldH（Jo 等, Appl Microbiol Biotechnol 2008;81:51-60）、苯乙醛脱氢酶PadA（Rodríguez-Zavala 等, Protein Sci 2006;15:1387-1396）、琥珀酸半醛脱氢酶GabD（Bartsch 等, J Bacteriol 1990;172:7035-7042）、γ-氨基丁醛脱氢酶YdcW（Gruez 等, J Mol Biol 2004;343:29-41）和来自Burkholderia ambifaria的α-酮戊二酸半醛脱氢酶KDH_ba（Jo 等, Appl Microbiol Biotechnol 2008;81:51-60）。细菌菌株使用如图2中显示的3种合成操纵子构建。引入菌株的全部异源酶在菌株间是相同的，除了醛脱氢酶。选择野生型KIVD作为2-酮酸脱羧酶用于各菌株。在30℃实施摇瓶发酵并且样品通过HPLC分析。分析发酵物以鉴定生产最高量的期望产物的菌株——并因而鉴定醛脱氢酶。

为比较用于生产2-甲基丁酸的各种醛脱氢酶的活性，PA1菌株用质粒pIPA1、pIPA2，以及pIPA4至pIPA9中任一个转化。在发酵后，用AldH达到2.51g/L的最高滴度，而AldB、PadA、KDH_ba、GabD和YdcW分别产生2.31 g/L、2.26 g/L、0.67 g/L、0.14 g/L和0.23 g/L（图3A）。

对于戊酸的生产，PA1菌株使用质粒pIPA1、pIPA2，以及pIPA4至pIPA9中任一个转化。发现KDH_ba为生产戊酸的最有活性的醛脱氢酶（2.25g/L），而AldH、AldB、PadA、GabD 和YdcW分别生产1.76 g/L、0.42 g/L、2.12 g/L、0.54 g/L和0.22 g/L（图3B）。

2-酮酸脱羧酶的筛选

在发酵过程中观察到几种代谢副产物例如乙酸、丙酸、丁酸和3-甲基丁酸。来自乳酸乳球菌的野生型酮酸脱羧酶KIVD（de la Plaza等, FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374）和它的突变体的几种被研究用于增加目标C5酸的产量并且降低副产物形成。单一氨基酸取代突变V461A 被报道对于更大的底物增加了KIVD的特异性。其它三个突变M538A、F381L和F542L的效果，各自与V461A突变组合，进行了研究。这些突变通过较小的疏水残基替换了关键位置的庞大残基。还研究了来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的吲哚丙酮酸脱羧酶（IPDC）的效果。用不同的2-酮酸脱羧酶构建质粒，但是均具有相同的醛脱氢酶（PadA）和其它酶。

为比较用于2-甲基丁酸合成的选择的2-酮酸脱羧酶的活性，使用用于2-甲基丁酸的pIPA1、pIPA2，以及质粒pIPA10至pIPA13中任一个转化PA1菌株。为比较用于戊酸合成的选择的2-酮酸脱羧酶的活性，使用用于戊酸合成的pIPA1、pIPA3，以及质粒pIPA10至pIPA13中任一个转化PA1菌株。摇瓶发酵显示IPDC比KIVD或任何其突变体更好地工作以生产2-甲基丁酸（2.5g/L）或戊酸（2.14g/L）（图4A和图4B）。

已确定在用于生产2-甲基丁酸的全部候选的醛脱氢酶和2-酮酸脱羧酶中AldH和IPDC具有最高活性后，将它们组合在一起（pIPA14）以研究效果是否是累加的。在组合中，2-甲基丁酸滴度达到2.59 g/L，只少量地高于AldH与WT KIVD的2.51 g/L 或PadA与IPDC的2.5 g/L （图5A）。类似地，将KDH_ba与IPDC 一同克隆（pIPA15）用于戊酸的生产。这增加戊酸滴度至2.58 g/L。与之相比，KDH_ba与WT KIVD的生产滴度为2.25 g/L或PadA与IPDC的生产滴度为2.14 g/L（图5B）。

酶的纯化和表征

对最具活性的酮酸脱羧酶IPDC，和最具活性的醛脱氢酶AldH和KDH_ba，表征它们对在构建的途径中涉及的底物的活性。AldH 从His-标签质粒表达并纯化。 IPDC和KDH_ba可从先前的研究获得。动力学参数通过监测在340nm的NADH吸光度测量。k_cat和K_M的值在表1中给出。

表1 酶的动力学参数

实施体外的酶测定以确认这些酶确实对目标底物具有良好的活性。动力学参数通过监测在340nm的NADH吸光度测量。IPDC的活性使用偶联的酶测定方法测量。催化速率常数（k _cat）和Michaelis-Menten常数（K _M）的值在表1中给出。IPDC对2-酮-3-甲基戊酸的K _M和k _cat测定为0.85 mM和4.13 s^-1，而对2-酮己酸的K _M和k _cat分别为0.63 mM和1.89 s^-1。IPDC对两种底物的专一性常数k _cat/K _M 被发现非常接近。发现AldH对2-甲基丁醛的K _M和k _cat为1.89 mM和3.55 s^-1。KDH_ba相比于对较小的或支化的底物如异丁醛（34.5 mM）和异戊醛（7.62 mM），对戊醛具有显著地较低的K _M（0.031 mM），但是有相似的k _cat值（Xiong 等, Sci Rep 2012;2）。因此，KDH_ba对戊醛的专一性常数（k _cat/K _M）比对异丁醛和异戊醛的高1260倍和308倍。

戊酸和2-甲基丁酸是化学工业中的两种有价值的化学中间体。本研究的目的是研究合成这些化学品的生物合成方法的可行性。我们成功修饰了天然的亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径，以在大肠杆菌中生产这些非天然的化学品。途径中涉及的异源酶通过克隆编码酶的多核苷酸至合成操纵子中进行过表达。本文示例的设计的途径包括酮酸2-酮-3-甲基戊酸和2-酮己酸脱羧为相应的醛，随后氧化至羧酸。在该工作中，我们研究这最后两个步骤以改进生产量。我们克隆野生型kivD和padA以研究我们的目标化学品的生产。我们观察到在摇瓶发酵2天后从40g/L葡萄糖中2-甲基丁酸2.26 g/L和戊酸2.12 g/L的生产水平。这确认了我们的生物合成方法的可行性。

为了改进生产滴度，我们随后在摇瓶发酵中检测了不同醛脱氢酶对生产滴度的效果。发现KDH_ba是检测的用于戊酸生产的那些中最有效的醛脱氢酶。证实AldH是检测的用于2-甲基丁酸生产的那些中最有效的醛脱氢酶。

在生产2-甲基丁酸或戊酸的发酵期间观察到一些副产物，如丙酸、丁酸和3-甲基丁酸。我们因此寻求通过引导生物合成远离这些副产物并朝向2-甲基丁酸或戊酸，进一步增加我们的目标产物的生产。KivD的突变体先前显示出对较大的酮酸底物增加脱羧活性(Bartsch 等, J Bacteriol 1990;172:7035-7042)。因此，我们比较KivD对几种KivD突变体和IPDC通过减少副产物增加目标化合物生产的能力。IPDC在引导生物合成远离不期望的副产物并朝向期望化合物中最有效。因此，我们能够使用IPDC-AldH达到对2-甲基丁酸2.59 g/L的生产滴度，和使用IPDC-KDH_ba对戊酸2.58 g/L的生产滴度。该生产分别对应戊酸和2-甲基丁酸理论最大值的22.1%和16.6%的产量（0.28 g/g葡萄糖和0.38 g/g葡萄糖）。最后，实施酶测定以确认这些酶的活性并得到动力学参数。

该工作证明了这些化学品可再生生产的可行性。据我们所知，这是对C5一元羧酸的合成的代谢工程最早的报道。该工作同样证明了对酸的生产的好氧方法的使用。能够生产酸的生物通常在厌氧条件下这么做，这还导致显著的乙酸产生，因此减少了从葡萄糖的产量。使用好氧方法会允许在发酵液中更好地控制和减少乙酸水平。这可以在搅拌罐式(stirred-tank type)发酵罐中小心地操作实现，其中氧气通过使空气穿过罐来提供。这样的发酵罐同样能够达到高细胞密度，其能够导致期望的产物化合物更多生产。

本文描述的生物合成策略是对这样的平台化学品的可持续生产的有希望的进步。此外，因为本文描述的生物合成途径是对宿主天然氨基酸生物合成途径的修饰，并且那些天然生物合成途径在物种间高度保守，所以本文描述的生物合成修饰可以应用于多种其它生物的天然生物合成途径。

因此，在一个方面中，本发明提供的重组微生物细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成。在另一个方面中，本发明提供的重组微生物细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合成。在一些情况中，野生型对照可以不能生产戊酸或2-甲基丁酸，并因此，特定产物的生物合成中的增加可以反映该产物的任何可测量的生物合成。在某些实施方案中，戊酸或2-甲基丁酸的生物合成中的增加可以包括足以对于微生物细胞的培养物积累戊酸或2-甲基丁酸至预定浓度的生物合成。

预定的浓度可以是适合于给定应用的产物的任何预定的浓度。因此，预定的浓度可以是，例如，浓度为至少0.1g/L，例如，至少0.5g/L、至少1.0 g/L、至少2.0 g/L、至少3.0 g/L、至少4.0 g/L、至少5.0 g/L、至少6.0 g/L、至少7.0 g/L、至少8.0 g/L、至少9.0 g/L、至少10 g/L、至少20 g/L、至少50 g/L、至少100 g/L或至少200 g/L。

重组细胞可以是，或来源于任何合适的微生物，包括，例如，原核微生物或真核微生物。如本文使用的，与微生物有关的术语“或来源于”简单地允许“宿主细胞”在修饰以展示说明的增加的生物合成活性之前，具有一种或多种遗传修饰。因此，术语“重组细胞”包括可以在修饰以展示说明的生物合成活性之前含有来自多于一个物种的核酸材料的“宿主细胞”。如上文所提及的，作为我们的工程化的生物合成途径基础的亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径在物种间是高度保守的。物种间的这种保守性意味着在大肠杆菌中示例的该途径，如果期望，可以被引入其它宿主细胞物种中。

在一些实施方案中，宿主细胞可以选择以具有一种或多种天然的生理活性。例如，宿主细胞可以是光合的（例如蓝细菌）或可以是分解纤维素的（例如解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)）。

在一些实施方案中，重组细胞可以是或来源于真核微生物，例如，真菌细胞。在这些实施方案中的一些中，真菌细胞可以是或来源于酵母科（Saccharomycetaceae family）的成员，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、皱落假丝酵母（Candida rugosa）或白色念珠菌（Candida albicans）。

在其它实施方案中，重组细胞可以是或来源于原核微生物，例如细菌。在这些实施方案中的一些中，细菌可以是变形菌门（phylum Protobacteria）的成员。变形菌门的示例性成员包括，例如肠杆菌科（Enterobacteriaceae family）的成员（例如大肠杆菌）和例如假单胞菌科（Pseudomonaceae family）的成员（例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)）。在其它的情况中，细菌可以是厚壁菌门（phylum Firmicutes）的成员。厚壁菌门的示例性成员包括，例如芽孢杆菌科（Bacillaceae family）的成员（例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）），梭菌科（Clostirdiaceae family）的成员（例如解纤维梭菌（Clostirdium cellulolyticum））和例如链球菌科（Streptococcaceae family）的成员（例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)）。在其它的情况中，细菌可以是蓝细菌门（phylum Cyaobacteria）的成员。

在一些实施方案中，相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成，可以包括相比于野生型对照延长2-酮丁酸至2-酮戊酸中的增加，相比于野生型对照延长2-酮戊酸至2-酮己酸中的增加，相比于野生型对照增加的酮酸脱羧酶活性，和/或相比于野生型对照增加的醛脱氢酶活性。在其它实施方案中，相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合成，可以包括相比于野生型对照转化苏氨酸至2-酮丁酸的增加，相比于野生型对照转化2-酮丁酸至2-酮-3-甲基戊酸的增加，相比于野生型对照增加的酮酸脱羧酶活性，和/或相比于野生型对照增加的醛脱氢酶活性。在一些情况中，至少一部分的增加的酮酸脱羧酶活性可以来自酮酸脱羧酶的修饰。例如，乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶（或类似物）可以被修饰为包括选自V461A、M538A或F542L的至少一种氨基酸取代，或类似的取代。在一些情况中，2-酮酸脱羧酶可以被修饰为包括V461A取代（或类似的取代）与M528A取代（或类似的取代）或V461A取代（或类似的取代）的组合。

如本文使用的，术语“类似物”指来自相同或不同的微生物来源的具有相似酶活性的相关酶。因此，类似物通常显示出显著的保守性并且鉴定任何给出的酶的合适的相关类似物对本领域普通技术人员而言是容易的。同样，通过将类似物的氨基酸序列与参考酶的氨基酸序列比对来鉴定“类似的取代”对本领域普通技术人员而言是容易的。因此，尽管类似物和参考酶之间存在保守性，但位置差异和/或氨基酸残基差异可以存在于所述的取代和类似的取代之间。

在一些实施方案中，重组细胞可以展示出吲哚丙酮酸脱羧酶（IPDC）活性中的增加。IPDC活性中的增加可以由IPDC酶的表达产生。示例性IPDC酶包括，例如在SEQ ID NO:1-21中任一个中反映的多肽的任一个。因此，在一些实施方案中，重组细胞可以包括编码IPDC脱羧酶的异源多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1-21中任一个中反映的多肽的任一个。

在一些实施方案中，重组细胞可以展示醛脱氢酶活性中的增加。醛脱氢酶活性中的增加可以由于醛脱氢酶的表达产生。示例性醛脱氢酶包括，例如在SEQ ID NO:22-55中任一个中反映的多肽的任一个。因此，在一些实施方案中，重组细胞可以包括编码醛脱氢酶的异源多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:22-55中任一个中反映的多肽的任一个。

如本文使用的，关于特定的酶的术语“活性”指多肽（不管它的通用名或天然功能）催化酶的底物转化为产物的能力，而不管“活性”是否小于、等于或大于鉴定的酶的天然活性。测量细胞生物合成活性的方法是常规的并且是本领域普通技术人员熟知的。在遗传修饰的细胞的背景下，术语“活性”指遗传修饰的细胞合成鉴定的产物化合物的能力，而不管“活性”是否小于、等于或大于该细胞野生型株的天然活性。

如本文使用的，酶的催化活性中的增加或遗传修饰的细胞的生物合成活性中的增加可以量化地测量，并且描述为合适的野生型对照的活性的百分比。通过遗传修饰的多肽展示的催化活性或遗传修饰的细胞的生物合成活性可以是，例如，合适的野生型对照的活性的至少110%、至少125%、至少 150%、至少 175%、至少 200% （2倍）、至少 250%、至少 300% （3倍）、至少 400% （4倍）、至少 500% （5倍）、至少 600% （6倍）、至少 700% （7倍）、至少 800% （8倍）、至少 900% （9倍）、至少 1000% （10倍）、至少 2000% （20倍）、至少 3000% （30倍）、至少 4000% （40倍）、至少 5000% （50倍）、至少 6000% （60倍）、至少 7000% （70-fold）、至少 8000% （80倍）、至少 9000% （90倍）、至少 10,000% （100倍）或至少 100,000% （1000倍）。

可选地，催化活性中的增加可以表示为k _cat中的增加，例如酶转化的k _cat值中的至少2倍增加、至少3倍增加、至少4倍增加、至少5倍增加、至少6倍增加、至少7倍增加、至少8倍增加、至少9倍增加、至少10倍增加、至少15倍增加、或至少20倍增加。

催化活性中的增加也可以以K _m中的降低的方式来表示，例如酶转化的K _m值中的至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低、或至少20倍降低。

酶的催化活性中的降低或遗传修饰的细胞的生物合成活性中的增加可以量化地测量，并且描述为合适的野生型对照的催化活性的百分比。通过遗传修饰的多肽展示的催化活性或遗传修饰的细胞的生物合成活性可以是，例如合适的野生型对照的活性的不高于95%、不高于90%、不高于85%、不高于80%、不高于75%、不高于70%、不高于65%、不高于60%、不高于55%、不高于50%、不高于45%、不高于40%、不高于35%、不高于30%、不高于25%、不高于20%、不高于15%、不高于10%、不高于5%、不高于4%、不高于3%、不高于2%、不高于1%，或活性的0%。

可选地，催化活性中的降低可以表示为k _cat中的降低，例如酶转化的k _cat值中至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低、或至少20倍降低。

催化活性中的降低还可以以K _m中的增加的方式来表示，例如K _m中增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少230倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍或至少400倍。

因此，在另一个方面中，我们在此描述用于戊酸或2-甲基丁酸的生物合成的方法。通常，该方法包括在包含碳源的培养基中在对于重组细胞生产戊酸或2-甲基丁酸有效的条件下孵育如本文描述的重组细胞。对于生产戊酸，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸或戊醛。对于生产2-甲基丁酸，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸或2-甲基丁醛。此外，用于细胞生长的碳源可以是CO₂、纤维素、葡萄糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘油等，只要引入相关的碳同化途径至工程化的微生物中。

在还另一个方面中，我们在此描述引入异源多核苷酸至细胞中，从而使得宿主细胞展示转化碳源至戊酸或2-甲基丁酸的增加的能力的方法。对于生产戊酸的细胞，异源多核苷酸可以编码可操作地连接于启动子的多肽，从而使得经修饰的细胞催化碳源转化为戊酸。在这些实施方案中的一些中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸或戊醛。对于生产2-甲基丁醛的细胞，异源多核苷酸可以编码可操作地连接于启动子的多肽，从而使得经修饰的细胞催化碳源转化为2-甲基丁醛。在这些实施方案中的一些中，碳源可以包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、或2-甲基丁醛。用于这些方法的宿主细胞可以包括，例如关于本文描述的重组细胞的以上鉴定的任何微生物物种。

如在前文描述中使用的，术语“和/或”意为所列要素中一个或全部或所列要素中任何两个或多个的组合；在术语“包含”及其变化出现于说明书和权利要求中之处，这些术语不具有限制性含义；除非另有说明，“一个（a）”、“一个（an）”、“所述（the）”和“至少一个”可以互换使用并且意为一个或多于一个；并且通过端点详述的数值范围包括该范围内包含的全部数值（例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。

在前文描述中，具体的实施方案可以为了清楚而单独描述。除非另有明确地表明具体的实施方案的特征与另一实施方案的特征是不相容的，否则某些实施方案可以包括与一个或多个实施方案有关的本文描述的相容特征的组合。

对任何本文公开的包括分开的步骤的方法，所述步骤可以以任何可行的顺序实施。并且，合适的话，两个或多个步骤的任何组合可以同时实施。

本发明通过以下实施例进行说明。其应理解为具体的实施例、材料、量和程序被广泛地解释为与本文陈述的本发明的范围和精神一致。

实施例

实施例1

细菌菌株、试剂、培养基和培养

在该研究中使用的大肠杆菌菌株是苏氨酸过生产菌株ATCC98082，其敲除了苏氨酸和高丝氨酸输出基因（exporter gene）rhtA以确保苏氨酸的高细胞内水平（Zhang 等, Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239）。yqhD基因删除的菌株从Keio保藏中心(Keio collection)中获得（Baba 等, Mol Syst Biol 2006;2:2006.0008）。将其用质粒pCP20转化以去除卡那霉素抗性标记物。将该菌株用质粒pIPA1、pIPA2以及pIPA4至pIPA15中的一个转化，用于2-甲基丁酸的生产。对于戊酸的生产，将其用pIPA1、pIPA3以及pIPA4至pIPA15中的任一个转化。

用于增殖质粒的XL1-Blue和XL10-Gold感受态细胞来自Stratagene（La Jolla, CA），而用于蛋白质表达的 BL21感受态细胞来自New England Biolabs（Ipswich, MA）。全部限制性酶、QUICK LIGATION试剂盒和PHUSION高保真PCR试剂盒同样来自New England Biolabs。

使用2×YT丰富培养基（16 g/L细菌用胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl）在 37℃和250 rpm培养大肠杆菌菌株。抗生素按需要添加（100 mg/L氨苄青霉素、25 mg/L卡那霉素和25 mg/L壮观霉素）。

发酵程序和HPLC分析

发酵实验一式三份实施，并且数据以平均值呈现，具有指示标准误差的误差棒。250 μL过夜培养物转移至含有5 mL M9培养基的125 mL锥形瓶，所述培养基使用5 g/L酵母提取物、40 g/L葡萄糖、10 mg/L硫胺素、100 mg/L氨苄青霉素、25 mg/L卡那霉素和25 mg/L壮观霉素补充。蛋白质表达通过添加0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。添加0.2g CaCO₃至锥形瓶中用于中和产生的酸。在30℃和250 rpm孵育48小时后，收集样品并使用含有Aminex HPX 87H柱（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）配备有折射率检测器的Agilent 1260 Infinity HPLC分析。流动相为5mM H₂SO₄，流速0.6 mL/分钟。柱温为35℃并且检测温度为50℃。

蛋白质表达和纯化

通过克隆基因至编码N-端6×His-标签的表达质粒以获得pIPA16来纯化AldH。该质粒随后转化至大肠杆菌菌株BL21中。以1/300稀释度从过夜预培养物接种细胞并且在30℃在含有100 μg/L氨苄青霉素的2×YT富培养基中生长。当OD达到0.6时，加入IPTG以诱导蛋白质表达。细胞沉淀通过超声处理在含有250 mM NaCl、 2 mM DTT、 5 mM咪唑和50 mM Tris的缓冲液（pH 9.0）中裂解。酶通过Ni-NTA柱层析从粗细胞裂解物中纯化，并且使用Amicon Ultra离心滤器（EMD Millipore Corp., Billerica, MA）进行缓冲液交换。将含有50 μM tris缓冲液、1 mM MgSO₄和20%甘油的储存缓冲液（pH 0.8）用于AldH。将100 μL浓缩的蛋白质溶液等分入PCR管中并且在-80℃急速冷冻用于长期保存。蛋白质浓度通过测量在280 nm的UV吸光度进行测定。纯化的KDH_ba和IPDC可从先前的研究得到（Xiong 等, Sci Rep 2012;2）。

酶测定

KDH_ba的酶测定由在具有总体积78 μL的测定缓冲液（50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0、1mM DTT）中的0.5 mM NAD+和在50 μM至400 μM的范围内的戊醛组成。为起始该反应，加入2 μL 1 μM KDH_ba并且在340nm（消光系数6.22 mM^-1 cm^-1）监测NADH的生成。类似的方案用于AldH，使用在1 mM至6 mM范围内的2-甲基丁醛浓度。

IPDC活性使用偶联的酶测定方法测量。过量的合适的醛脱氢酶（AldH用于2-酮-3-甲基戊酸和KDH_ba用于2-酮己酸）用于氧化醛至酸，而辅因子 NAD+被还原至NADH。测定混合物含有在具有总体积78 μL的测定缓冲液（50 mM NaH₂PO₄,pH 6.8、1 mM MgSO4、0.5 mM ThDP）中的0.5 mM NAD+、0.1 μM合适的醛脱氢酶和在1 mM至8 mM范围内相应的2-酮酸。为起始该反应，加入2 μL 1μM IPDC并且在340nm监测NADH的生成。动力学参数（k_cat和K_M）通过将初始速度数据对Michaelis–Menten方程进行拟合来测定。

表2. 研究中使用的菌株和引物。

本文引用的全部专利、专利申请和出版物和电子可获得的材料（包括，例如提交于例如GenBank和RefSeq的核苷酸序列，和提交于例如SwissProt、PIR、PRF、PDB的氨基酸序列，和从GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译）的完整的公开，以其整体通过引用并入。在本申请的公开与通过引用并入本文的任何文件的公开之间存在任何不一致的情况下，应以本申请的公开为准。已给出先前的详述和实施例，仅用于清楚理解的目的。从中不应理解出不必要的限制。本发明不限于显示和描述的准确细节，对于本领域技术人员显而易见的变化包括在通过权利要求限定的本发明之内。

除非另有说明，说明书和权利要求中所用的所有表示组分的量、分子量等的数值应理解为在所有情况下通过术语“约”进行修饰。因此，除非另有说明为相反，否则在说明书和权利要求中陈述的数值参数是近似值，其可以根据寻求通过本发明获得的期望特性而改变。至少，并且不试图限制权利要求范围的等同方案的声明(doctrine)，各数值参数应当至少在所报道的有效数字的位数的教导下并通过应用常规约数技术进行解释。

尽管描述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中描述的数值报道为尽可能精确。然而，所有数值固有地包含从它们各自测试测量中发现的标准差必然产生的范围。

所有标题是为了读者的便利，并且不应当用于限制标题后文本的含义，除非有此说明。

序列表自由文本

蛋白质名称：假定的脱羧酶 [邦戈尔沙门氏菌（Salmonella bongori） NCTC 12419]

蛋白质名称：假定的脱羧酶[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）菌株(str.) E98-0664]

蛋白质名称：假设的蛋白质SARI_00479 [肠沙门氏菌亚利桑那亚种（Salmonella enterica subsp. arizonae）血清型62:z4,z23:-- 菌株RSK2980]

蛋白质名称：脱羧酶[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种甲型副伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A）菌株ATCC 9150]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种肯塔基血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Kentucky）菌株CDC 191]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种爪哇岛血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Javiana）菌株GA_MM04042433]

蛋白质名称：脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种伤寒血清型菌株CT18]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种Virchow血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Virchow）菌株SL491]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种蒙得维的亚血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Montevideo）菌株315996572]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶（吲哚丙酮酸脱羧酶）[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种Schwarzengrund血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund）菌株SL480]

蛋白质名称：假定的硫胺素焦磷酸酶[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种猪霍乱血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis）菌株SC-B67]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种Weltevreden血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Weltevreden）菌株HI_N05-537]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种Hadar血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Hadar）菌株RI_05P066]

蛋白质名称：脱羧酶[猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种鸡血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Gallinarum）菌株287/91]

蛋白质名称：脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种丙型副伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C）菌株RKS4594]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种塔拉哈西血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Tennessee）菌株CDC07-0191]

蛋白质名称：假定的脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）菌株SL1344]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种Agona血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Agona）菌株SL483]

蛋白质名称：吲哚-3-丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种海德尔堡血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Heidelberg）菌株SL486]

蛋白质名称：假设的蛋白质SPAB_00555 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种乙型副伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B）菌株SPB7]

蛋白质名称：吲哚丙酮酸脱羧酶 [猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种鼠伤寒血清型菌株LT2]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [争论贪噬菌（Variovorax paradoxus） EPS]

蛋白质名称：醛脱氢酶（NAD（+）） [争论贪噬菌 S110]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种（Burkholderia sp.） H160]

蛋白质名称： 6-氧代己酸脱氢酶 [Burkholderia rhizoxinica HKI 454]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种 CCGE1002]

蛋白质名称： 2,5-二氧代戊酸脱氢酶（NAD+）[Burkholderia xenovorans LB400]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种 Ch1-1]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [Burkholderia phytofirmans PsJN]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种 CCGE1003]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [Burkholderia graminis C4D1M]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [Burkholderia phymatum STM815]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种 CCGE1001]

蛋白质名称：NAD依赖型醛脱氢酶 [唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli） BSR3]

蛋白质名称：NAD依赖型醛脱氢酶[荚壳伯克霍尔德氏菌（Burkholderia glumae） BGR1]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶（NAD（P）+） [新洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia）PC184]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶（NAD（P）（+））[Burkholderia ubonensis Bu]

蛋白质名称： 2,5-二氧代戊酸脱氢酶（NAD+） [伯克霍尔德氏菌属种383]

蛋白质名称： NAD依赖型醛脱氢酶 [Burkholderia dolosa AUO158]

蛋白质名称： α-酮戊二酸半醛脱氢酶 [巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶 [NADP+] （ssdh） [多噬伯克霍尔德氏菌（Burkholderia multivorans） CGD1]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [新洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cenocepacia） MC0-3]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [多噬伯克霍尔德氏菌（Burkholderia multivorans） ATCC 17616]

蛋白质名称： NADP依赖型琥珀酸半醛脱氢酶 [伯克霍尔德氏菌属种 TJI49]

蛋白质名称：假定的醛脱氢酶 [新洋葱伯克霍尔德氏菌 J2315]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶 [NADP+] （ssdh） [多噬伯克霍尔德氏菌（Burkholderia multivorans） CGD2M]

蛋白质名称： 2,5-二氧代戊酸脱氢酶（NAD+）[越南伯克霍尔德氏菌（Burkholderia vietnamiensis） G4]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶（NAD（P）+）[新洋葱伯克霍尔德氏菌AU 1054]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [Burkholderia ambifaria IOP40-10]

蛋白质名称：醛脱氢酶 [Burkholderia ambifaria MC40-6]

蛋白质名称：醛脱氢酶_ [Burkholderia ambifaria MEX-5]

蛋白质名称：琥珀酸半醛脱氢酶（NAD（P）（+）） [Burkholderia ambifaria AMMD]

蛋白质名称：醛脱氢酶，ALD6[酿酒酵母]

蛋白质名称：醛脱氢酶，ALD2 [酿酒酵母]

蛋白质名称：醛脱氢酶，ALD3 [酿酒酵母]

Claims

1.重组细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成。

2.重组微生物细胞，其经修饰以展示相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合成。

3.任何前述权利要求的重组微生物细胞，其中所述微生物细胞是真菌细胞。

4.权利要求3的重组细胞，其中所述真菌细胞是酵母科（Saccharomycetaceae family）的成员。

5.权利要求3的重组细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、皱落假丝酵母（Candida rugosa）或白色念珠菌（Candida albicans）。

6.权利要求1或权利要求2的重组细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞。

7.权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是变形菌门（phylum Protobacteria）的成员。

8.权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是肠杆菌科（Enterobacteriaceae family）的成员。

9.权利要求8的重组细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）。

10.权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是假单胞菌科（Pseudomonaceae family）的成员。

11.权利要求10的重组细胞，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。

12.权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是厚壁菌门（phylum Firmicutes）的成员。

13.权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科（Bacillaceae family）的成员。

14.权利要求13的重组细胞，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

15.权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是链球菌科（Streptococcaceae family）的成员。

16.权利要求15的重组细胞，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

17.权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是梭菌科（Clostridiaceae family）的成员。

18.权利要求17的重组细胞，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌（Clostridium cellulolyticum）。

19.权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是蓝细菌门（phylum Cyanobacteria）的成员。

20.任何前述权利要求的重组细胞，其中所述微生物细胞是光合的。

21.任何前述权利要求的重组细胞，其中所述微生物细胞是分解纤维素的。

22.权利要求1和3-21中任一项的重组细胞，其中相比于野生型对照增加的戊酸的生物合成包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，相比于野生型对照2-酮丁酸延长活性中的增加，相比于野生型对照2-酮戊酸延长活性中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。

23.权利要求2-21中任一项的重组细胞，其中相比于野生型对照增加的2-甲基丁酸的生物合成包括相比于野生型对照L-天冬氨酸转化为L-苏氨酸中的增加，相比于野生型对照L-苏氨酸转化为2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸转化为2-酮-3-甲基戊酸中的增加，相比于野生型对照酮酸脱羧酶活性中的增加，相比于野生型对照对预定底物的酮酸脱羧酶选择性中的增加，或相比于野生型对照醛脱氢酶活性中的增加。

24.方法，其包括：

在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生戊酸有效的条件下孵育权利要求1和3-23中任一项的重组细胞，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

25.方法，其包括：

在包含碳源的培养基中在对于重组细胞产生2-甲基丁酸有效的条件下孵育权利要求2-23中任一项的重组细胞，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

26.方法，其包括：

将编码至少一种催化碳源转化为戊酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中将至少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化所述碳源转化为戊酸。

27.权利要求26的方法，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

28.方法，其包括：

将编码至少一种催化碳源转化为2-甲基丁酸的多肽的异源多核苷酸引入宿主细胞，其中将至少一种多核苷酸可操作地连接于启动子，从而使得经修饰的宿主细胞催化所述碳源转化为2-甲基丁酸。

29.权利要求28的方法，其中所述碳源包含以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO₂、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。

30.权利要求24-29中任一项的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。

31.权利要求30的方法，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。

32.权利要求31的方法，其中所述真菌细胞是酿酒酵母、皱落假丝酵母或白色念珠菌。

33.权利要求24-29中任一项的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。

34.权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。

35.权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。

36.权利要求35的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。

37.权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。

38.权利要求37的方法，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。

39.权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。

40.权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科的成员。

41.权利要求40的方法，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。

42.权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。

43.权利要求42的方法，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。

44.权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是梭菌科的成员。

45.权利要求44的方法，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌。

46.权利要求33的方法，其中所述细菌细胞是蓝细菌门的成员。

47.权利要求24-46中任一项的方法，其中所述宿主细胞是光合的。

48.权利要求24-46中任一项的方法，其中所述宿主细胞是分解纤维素的。