KR20150014952A - 생합성 경로, 재조합 세포 및 방법 - Google Patents

생합성 경로, 재조합 세포 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 증가된 펜탄산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 세포, 상기 재조합 세포를 제조하는 방법, 및 상기 세포가 펜탄산을 생산하도록 유도하는 방법을 기술한다. 본 개시내용은 또한 일반적으로 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 세포, 상기 재조합 세포를 제조하는 방법, 및 상기 세포가 2-메틸부티르산을 생산하도록 유도하는 방법을 기술한다.

Description

생합성 경로, 재조합 세포 및 방법 {BIOSYNTHETIC PATHWAYS, RECOMBINANT CELLS, AND METHODS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 5월 11일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/645,900을 우선권 주장하며, 이 가출원은 본원에 참조로 포함된다.
개요
한 측면에서, 본 개시내용은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 펜탄산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 세포를 기술한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 세포를 기술한다.
각 측면에서, 재조합 세포는 진균 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 각 측면에서, 재조합 세포는 광합성 세포일 수 있다. 각 측면에서, 재조합 세포는 셀룰로스분해성 세포일 수 있다.
재조합 세포가 증가된 펜탄산 생합성을 보이는 측면에서, 증가된 펜탄산 생합성은 야생형 대조군과 비교하여 L-아스파르테이트에서 L-트레오닌으로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 L-트레오닌에서 2-케토부티레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토부티레이트 신장 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토발레레이트 신장 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 예정된 기질에 대한 케토산 데카르복실라제 선택성의 증가, 또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함할 수 있다.
재조합 세포가 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 보이는 측면에서, 증가된 2-메틸부티르산 생합성은 야생형 대조군과 비교하여 L-아스파르테이트에서 L-트레오닌으로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 L-트레오닌에서 2-케토부티레이트로의 전환의 증가, 2-케토부티레이트에서 2-케토-3-메틸발레레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 예정된 기질에 대한 케토산 데카르복실라제 선택성의 증가, 또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 증가된 펜탄산 생합성을 나타내는 재조합 세포를 상기 재조합 세포가 펜탄산을 생산하는 데 효과적인 조건하에 탄소원을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 탄소원으로는 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트, 발레르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 나타내는 재조합 세포를 상기 재조합 세포가 2-메틸부티르산을 생산하는 데 효과적인 조건하에 탄소원을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 탄소원으로는 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토-3-메틸발레레이트, 2-메틸 부티르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 탄소원에서 펜탄산으로의 전환을 촉매하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 변형된 숙주 세포가 탄소원에서 펜탄산으로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법을 기술한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 탄소원에서 2-메틸부티르산으로의 전환을 촉매하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 변형된 숙주 세포가 탄소원에서 2-메틸부티르산으로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법을 기술한다.
본 발명의 상기 요약이 본 발명의 각 개시된 실시양태 또는 모든 실행을 기술한 것으로 의도되지 않는다. 하기 설명이 예시적인 실시양태를 더욱 특별하게 예시한다. 본 출원 전역에 걸쳐 여러 곳에서는 다양한 조합으로 사용될 수 있는 일례에 관한 목록을 통해 안내를 제공한다. 각각의 경우에서, 언급된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할만을 할 뿐이며, 배타적인 목록으로 해석되지 않아야 한다.
도 1은 2-메틸부티르산 (2MB) 및 펜탄산 (PA)의 제조 경로이다. (A) 1-부텐 및 2-부텐으로부터의 2-메틸부티르산 및 펜탄산에 대한 화학 공정이다. (B) 글루코스로부터의 2-메틸부티르산 합성을 위한 대사 경로이다. (C) 글루코스로부터의 펜탄산 합성을 위한 대사 경로이다.
도 2 (A)는 2-메틸부티르산 (2MB) 제조를 위한 합성 오페론이다. (B)는 펜탄산 (PA) 제조를 위한 합성 오페론이다. DC, 2-케토산 데카르복실라제; DH, 알데히드 데히드로게나제.
도 3은 상이한 알데히드 데히드로게나제를 이용한 발효 실험의 결과이다. (A) 2-메틸부티르산 제조를 위한 알데히드 데히드로게나제 비교이다. (B) 펜탄산 제조를 위한 알데히드 데히드로게나제 비교이다.
도 4는 상이한 케토산 데카르복실라제를 이용한 발효 실험의 결과이다. (A) 2-메틸부티르산 제조를 위한 케토산 데카르복실라제 비교이다. (B) 펜탄산 제조를 위한 케토산 데카르복실라제 비교이다.
도 5는 케토산 데카르복실라제 및 알데히드 데히드로게나제의 조합을 이용한 발효 실험의 결과이다. (A) 2-메틸부티르산 제조를 위한 다양한 조합의 비교이다. (B) 펜탄산 제조를 위한 다양한 조합의 비교이다.
하기 예시적인 실시양태에 관한 설명에서, 특정 대사 효소 및 상기 효소의 천연 공급원이 구체적으로 명시된다. 이들은 단지 적합한 효소, 및 상기 구체적으로 명시된 효소의 적합한 공급원에 대한 일례이다. 상이한 미생물 종 및 균주로부터 수득가능한 상동체와 같이, 촉매 활성이 유사한 대체 효소도 가능하다. 따라서, 본원에 기술된 예시적인 실시양태는 특허청구범위에 반영되는 미생물 또는 방법의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
펜탄산 및 2-메틸부티르산은 다양한 응용, 예를 들어 가소화제, 윤활제 및 약제를 위한 화학적 중간체로서의 역할을 한다. 본 개시내용은, 천연 류신 생합성 경로가 펜탄산을 제조하도록 변형되고; 천연 이소류신 생합성 경로가 2-메틸부티르산을 제조하도록 변형된, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 상기 2가지 산을 생합성하는 합성 대사 경로의 구축을 기술한다. 다양한 알데히드 데히드로게나제 및 2-케토산 데카르복실라제가 구축된 경로에서 그의 활성에 대해 연구되었다. 진탕 플라스크 발효에서의 최적의 효소 조합을 통해 2-메틸부티르산의 경우 2.59 g/L 및 펜탄산의 경우 2.58 g/L인 최고 역가가 달성되었다. 본 연구를 통해 다량의 지방족 산의 재생가능한 제조가 실현가능하다는 것이 입증되었다.
원유는 에너지 및 산업적 유기 화학물질의 주요 공급원이다. 그러나, 원유 매장량은 활발히 고갈되고 있으며, 이로 인해 연료 및 화학물질에 대한 지속가능한 경로 개발이 더욱 관심의 대상이 되어 가고 있다. 이러한 도전 과제를 처리하기 위해, 본 발명자는 비-천연 화학물질 중간체를 생산하도록 미생물을 조작하는 단계를 포함하는 생합성 접근법을 채택할 수 있다. 비-천연 대사산물 제조는 합성 대사 경로의 조작 및 개발을 포함할 수 있다. 이러한 연구에서, 글루코스 또는 다른 적합한 탄소원으로부터 펜탄산 (PA) 및 2-메틸부티르산 (2MB)을 재생가능하게 제조할 수 있는 생합성 전략법이 개발되었다.
2005년 미국내 펜탄산 및 2-메틸부티르산 총 소비량은 대략 14,000 미터 톤에 달하였다 (문헌 [Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008]). 상기 화학물질은 다양한 응용, 예컨대 가소화제, 윤활제 및 약제를 위한 중간체로서의 역할을 할 수 있다. 이는 또한 탄화수소로부터 메르캅탄을 추출하는 데에도 사용된다. 펜탄산의 에스테르는 가솔린 및 디젤 둘 모두에서 매우 높은 블렌드 비율로 사용될 수 있기 때문에 바이오연료로서 점점 더 주목받고 있다 (문헌 [Lange et al., Angew Chem Int Edit 2010;49:4479-4483]). 상업상, 상기 화학물질은 전형적으로 각각은 석유계 화합물을 합성 가스와 반응시켜 합성 가스와 반응시키는 공정을 통해 제조될 수 있는 것인 발레르알데히드 및/또는 2-메틸 부티르알데히드를 산화시킴으로써 제조된다 (문헌 [Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008]). 상기 공정은 독성 중간체, 예컨대 합성 가스 및 비-재생가능한 석유계 공급 원료를 사용하는 바, 상기 화학물질에 대한 지속가능한 경로가 요구된다. 본원에서는 상기 화학물질에 대한 잠재적인 대체 경로로서 생합성이 제시된다.
조작된 생합성 경로의 한가지 이점은 미생물 사이에 천연 생합성 경로가 보존된다는 점이다. 따라서, 일단 새롭게 조작된 생합성 경로가 한 미생물에서 확립되고 나면, 이는 다른 미생물에서도 종종 사용될 수 있다. 본 연구에서, 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포 내로 이종 (비-천연) 효소인 알데히드 데히드로게나제 및/또는 2-케토산 데카르복실라제를 도입함으로써 이. 콜라이에서의 천연 류신 및 이소류신 생합성 경로를 변형시켰다. 2-메틸부티르산 및 펜탄산에 대한 예시적인 합성 대사 경로가 각각 도 1B 및 도 1C에 제시되어 있다. 상기 두 경로에 대한 공통 중간체는, 생합성 데아미나제 IlvA에 의해 트레오닌으로부터 유도된 2-케토부티레이트 (2KB)이다. thrA , thrB, 및 thrC를 과발현시키는 것이 트레오닌 생합성 쪽으로의 (문헌 [Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239]), 따라서 합성 대사 경로로의 탄소 유입을 유도할 수 있고, 이로써 펜탄산 및/또는 2-메틸부티르산이 제조될 수 있다.
도 1B에 제시되어 있는 바와 같이, 2-메틸부티르산 합성의 경우, 2-케토부티레이트는 2-메틸부티르산에 대해 끝에서 2번째의 전구체인 2-케토-3-메틸발레레이트 (KMV)의 합성으로 유도된다. 2-케토부티레이트와 피루베이트의 2-아세토-2-히드록시부티레이트 (AHB)로의 축합은 IlvG 및 IlvM에 의해 촉매된다. 또 다른 두 효소 IlvC 및 IlvD는 AHB의 KMV로의 전환을 촉매할 수 있다. 이어서, KMV는 케토산 데카르복실라제 (DC)에 의해 2-메틸 부티르알데히드로 탈카르복실화되고, 이는 알데히드 데히드로게나제 (DH)에 의해 2-메틸부티르산으로 산화될 수 있다.
펜탄산 합성의 경우, 2-케토부티레이트는 2 사이클의 "+1" 탄소 쇄 신장을 거쳐 2-케토카프로에이트 (2KC)를 제조할 수 있다. 천연 류신 생합성 경로에서, 2-케토이소발레레이트는 2-이소프로필말레이트신타제 (LeuA), 이소프로필 말레이트 이소머라제 복합체 (LeuC, LeuD) 및 3-이소프로필말레이트 데히드로게나제 (LeuB)에 의해 촉매되는 3-단계 쇄 신장 사이클을 거쳐 2-케토이소카프로에이트로 전환된다. 그러나, 본 발명자들의 합성 경로에서, LeuA, LeuB, LeuC, 및 LeuD는 유사하게 2-케토부티레이트를 2-케토발레레이트로 신장시킨 후, 이어서 2-케토발레레이트를 2-케토카프로에이트 (4)로 신장시키는 데 충분할 정도로 유연적이다. 이어서, 2-케토카프로에이트는 2-케토산 데카르복실라제 (DC)에 의해 발레르알데히드로 탈카르복실화될 수 있고, 이는 데히드로게나제 (DH)에 의해 펜탄산으로 산화될 수 있다.
2- 메틸부티르산 및 펜탄산 생합성을 위한 대사 경로 구축
2-메틸부티르산 (2MB) 및 펜탄산 (PA) 제조에 위한 생합성 개략도가 각각 도 1B 및 도 1C에 제시되어 있다. 아스파르테이트 생합성의 하류쪽 효소들 모두 3가지 합성 오페론으로부터 과발현되었다. 한 오페론은 스펙티노마이신 내성 마커를 보유하는 저 카피수의 플라스미드 pIPA1 상의 PLlacO1 프로모터의 제어하에, 각각 트레오닌 합성에 관여하는 것인 ThrA, ThrB, 및 ThrC에 대한 코딩 영역을 포함한다. 2-메틸부티르산 합성을 위해 (도 1B), ilvA , ilvG , ilvM , ilvC , 및 ilvD를 카나마이신 내성 마커를 포함하는 저 카피수의 플라스미드 상에 클로닝하여 pIPA2를 수득하였다. 유사하게, 펜탄산 합성을 위해, ilvA , leuA , leuB , leuC , 및 leuD를 카나마이신 내성 마커를 보유하는 저 카피수의 플라스미드 pIPA3 상에 클로닝하였다. 다양한 알데히드 데히드로게나제 및 케토산 데카르복실라제는 암피실린 내성 마커를 보유하는 고 카피수의 플라스미드 (pIPA4 내지 pIPA15, 하기 표 2) 상에 전사 순서 DC-DH (2-케토산 데카르복실라제-데히드로게나제)로 PLlacO1 프로모터하에 존재하였다.
트레오닌이 상기 두 경로 모두의 공통 중간체이기 때문에, 트레오닌 과생산자인 이. 콜라이 균주 ATCC98082가 본 연구에서 사용되었다. 균주에는 트레오닌의 고도한 세포내 수준을 위해 트레오닌 외수송 인자 유전자 rhtA가 제거되어 있을 뿐만 아니라 (문헌 [Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239]), 각 알콜을 유도하는 부반응을 제거하기 위해 알콜 데히드로게나제 yqhD 유전자가 결실되어 있다. 생성된 균주는 이하 PA1 균주로 지칭된다.
도 1B 및 도 1C에 제시되어 있는 합성 경로는 케토산 2-케토-3-메틸발레레이트 (도 1B) 및 2-케토카프로에이트 (2KC, 도 1C)의 그의 각 알데히드로의 탈카르복실화, 이어서 알데히드의 카르복실산으로의 산화를 포함하도록 디자인된 것이다. 이소부티르산 제조에 관한 본 발명자들의 종전 연구에 기초하여 (문헌 [Zhang et al., ChemSusChem 2011;4: 1068-1070]), 본 발명자들은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 야생형 2-케토이소발레레이트 데카르복실라제 KIVD (문헌 [de la Plaza et al., FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374]) 및 이. 콜라이로부터 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 PadA (문헌 [Rodriguez-Zavala et al., Protein Sci 2006;15:1387-1396])를 클로닝하여 본 발명자들의 표적 화학물질 생산을 체크하였다. PA1 균주를 플라스미드 pIPA1, pIPA2, 및 pIPA4로 형질전환시켜 2-메틸부티르산을 제조하였다. PA1 균주를 플라스미드 pIPA1, pIPA3, 및 pIPA4로 형질전환시켜 펜탄산을 제조하였다. 각 재조합 균주를 사용하여 진탕 플라스크 발효를 수행하였다. 상기 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 2.26 g/L의 2-메틸부티르산 및 2.12 g/L의 펜탄산을 제조하였고, 이를 통해 본 발명자들의 생합성 접근법의 실현가능성이 입증되었다.
알데히드 데히드로게나제 스크리닝
생산 역가 개선을 위해, 상이한 알데히드 데히드로게나제 선택이 미치는 효과에 대해 조사하였다 (도 3A 및 도 3B). 본 연구를 위한 후보 효소로서 6개의 알데히드 데히드로게나제가 선택되었다: 아세트알데히드 데히드로게나제 AldB (문헌 [Ho and Weiner, J Bacteriol 2005;187:1067-1073]), 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제 AldH (문헌 [Jo et al., Appl Microbiol Biotechnol 2008;81:51-60]), 페닐아세트알데히드 데히드로게나제 PadA (문헌 [Rodriguez-Zavala et al., Protein Sci 2006;15:1387-1396]), 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 GabD (문헌 [Bartsch et al., J Bacteriol 1990;172:7035-7042]), 이. 콜라이로부터의 γ-아미노부티르알데히드 데히드로게나제 YdcW (문헌 [Gruez et al., J Mol Biol 2004;343:29-41]), 및 부르크홀데리아 암비파리아(Burkholderia ambifaria)로부터의 α-케토글루타르 세미알데히드 데히드로게나제 KDHba (문헌 [Jo et al., Appl Microbiol Biotechnol 2008;81:51-60]). 도 2에 제시되어 있는 3개의 합성 오페론을 이용하여 박테리아 균주를 구축하였다. 알데히드 데히드로게나제를 제외한, 균주 내로 도입된 이종 효소 모두 균주들 간에 동일하였다. 각 균주에 대한 2-케토산 데카르복실라제로서 야생형 KIVD가 선택되었다. 진탕 플라스크 발효를 30℃에서 수행하고, 샘플을 HPLC에 의해 분석하였다. 발효물을 분석하여 원하는 생성물을 가장 많이 생산한 균주, 및 따라서, 알데히드 데히드로게나제를 확인하였다.
2-메틸부티르산을 제조하는 다양한 알데히드 데히드로게나제의 활성을 비교하기 위해, PA1 균주를 플라스미드 pIPA1, pIPA2, 및 pIPA4 내지 pIPA9 중 어느 하나로 형질전환시켰다. 발효 후, AldH의 경우, 2.51 g/L의 최고 역가를 달성한 반면, AldB, PadA, KDHba, GabD 및 YdcW는 각각 2.31 g/L, 2.26 g/L, 0.67 g/L, 0.14 g/L 및 0.23 g/L로 생산하였다 (도 3A).
펜탄산 제조를 위해, PA1 균주를 플라스미드 pIPA1, pIPA3, 및 pIPA4 내지 pIPA9 중 하나로 형질전환시켰다. 펜탄산을 생산하는 데 있어 KDHba (2.25 g/L)가 가장 활성이 큰 알데히드 데히드로게나제인 것으로 나타난 반면, AldH, AldB, PadA, GabD 및 YdcW는 각각 1.76 g/L, 0.42 g/L, 2.12 g/L, 0.54 g/L, 및 0.22 g/L로 생산하였다 (도 3B).
2- 케토산 데카르복실라제 스크리닝
발효 동안 수개의 대사 부산물, 예컨대 아세테이트, 프로피온산, 부티르산, 및 3-메틸부티르산이 관찰되었다. 락토코쿠스 락티스로 및 그의 수개의 돌연변이체로부터의 야생형 케토산 데카르복실라제 KIVD (문헌 [de la Plaza et al., FEMS Microbiol Lett 2004;238:367-374])를 표적 C5 산의 수율 증가 및 부산물 형성 감소에 대하여 조사하였다. 단일 아미노산 치환 돌연변이 V461A는 KIVD의 더욱 큰 기질 쪽으로의 특이성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 각각 V461A와 조합된 것인, 다른 3개의 돌연변이 M538A, F381L, 및 F542L의 효과를 조사하였다. 이들 돌연변이에서는 중요한 위치에 있는 벌키한 잔기가 보다 작은 소수성 잔기로 치환되어 있다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터의 인돌피루베이트 데카르복실라제 (IPDC)의 효과 또한 연구하였다. 상이한 2-케토산 데카르복실라제를 이용하여 플라스미드들을 구축하였지만, 이들은 모두 동일한 알데히드 데히드로게나제 (PadA) 및 다른 효소를 가졌다.
2-메틸부티르산 합성을 위해 선택된 2-케토산 데카르복실라제의 활성을 비교하기 위하여, 2-메틸부티르산을 위해 PA1 균주를 pIPA1, pIPA2, 및 플라스미드 pIPA10 내지 pIPA13 중 어느 하나로 형질전환시켰다. 펜탄산 합성에 대한 선택된 2-케토산 데카르복실라제의 활성을 비교하기 위하여, 펜탄산 합성을 위해 PA1 균주를 pIPA1, pIPA3, 및 플라스미드 pIPA10 내지 pIPA13 중 어느 하나로 형질전환시켰다. 진탕 플라스크 발효 결과, IPDC가 2-메틸부티르산 (2.5 g/L) 또는 펜탄산 (2.14 g/L)을 생산하는 데 있어서 KIVD 또는 그의 돌연변이체 중 임의의 것보다 더욱 우수한 작용을 보인 것으로 나타났다 (도 4A 및 도 4B).
AldH 및 IPDC가 2-메틸부티르산 생산에 있어서 모든 후보 알데히드 데히드로게나제 및 2-케토산 데카르복실라제 중에서 가장 높은 활성을 가졌다는 것이 확립되었는 바, 이들을 함께 조합함으로써 (pIPA14) 그 효과가 상가적인지 여부를 조사하였다. 조합시, 2-메틸부티르산 역가는 2.59 g/L에 도달하였고, WT KIVD와 조합된 AldH의 경우에서의 2.51 g/L 또는 IPDC와 조합된 PadA의 경우에서의 2.5 g/L보다 단지 약간 더 높을 뿐이었다 (도 5A). 유사하게, 펜탄산 생산을 위해 KDHba를 IPDC와 함께 클로닝하였다 (pIPA15). 이를 통해 펜탄산 역가는 2.58 g/L까지 증가하였다. 비교 결과, WT KIVD와 조합된 KDHba의 경우, 생산 역가는 2.25 g/L, 또는 IPDC와 조합된 PadA의 경우, 생산 역가는 2.14 g/L였다 (도 5B).
효소 정제 및 특징규명
가장 활성이 큰 케토산 데카르복실라제인 IPDC, 및 가장 활성이 큰 알데히드 데히드로게나제인 AldH 및 KDHba를 구축된 경로에 관여하는 기질에 대한 그의 활성에 대하여 특징규명하였다. AldH를 His-태그 플라스미드로부터 발현시키고, 정제하였다. IPDC 및 KDHba는 이전 연구로부터 이용가능하였다. 340 nm에서 NADH 흡광도를 모니터링함으로써 동역학적 파라미터를 측정하였다. kcat 및 KM에 대한 값은 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
상기 효소들이 실제로 표적 기질에 대하여 우수한 활성을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위해 시험관내 효소 검정을 수행하였다. 340 nm에서 NADH 흡광도를 모니터링함으로써 동역학적 파라미터를 측정하였다. 커플링된 효소 검정 방법을 이용하여 IPDC의 활성을 측정하였다. 촉매 반응 속도 상수 (k cat ) 및 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수 (K M ) 값은 표 1에 제시되어 있다. 2-케토-3-메틸발레레이트에 대한 IPDC의 K M 및 k cat 는 0.85 mM 및 4.13 s-1인 것으로 측정된 반면, 2-케토카프로에이트에 대한 K M 및 k cat 는 각각 0.63 mM 및 1.89 s-1인 것으로 측정되었다. 두 기질 모두에 대한 IPDC의 특이성 상수 k cat /K M 은 매우 유사한 것으로 나타났다. 2-메틸 부티르알데히드에 대한 AldH의 K M 및 k cat 는 1.89 mM 및 3.55 s-1인 것으로 나타났다. KDHba의 K M 은 보다 소형의 또는 분지형인 기질, 예컨대 이소부티르알데히드 (34.5 mM) 및 이소발레르알데히드 (7.62 mM)보다 발레르알데히드 (0.031 mM)에 대하여 유의적으로 더 낮지만, k cat 값은 유사하다 (문헌 [Xiong et al., Sci Rep 2012;2]). 그러므로, 발레르알데히드에 대한 KDHba의 특이성 상수 (k cat /K M )는 이소부티르알데히드 및 이소발레르알데히드에 대한 것보다 1,260배 및 308배 더 높다.
펜탄산 및 2-메틸부티르산은 화학 산업에서 가치가 있는 2개의 화학 중간체이다. 본 연구의 목적은 상기 화학물질을 합성하는 생합성 접근법의 실현가능성에 대해 연구하고자 하는 것이었다. 본 발명자들은 천연 류신 및 이소류신 생합성 경로를 변형시킴으로써 이. 콜라이에서 상기 비-천연 화학물질을 생산하는 데 성공을 거두었다. 상기 경로에 관여하는 이종 효소는 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성 오페론으로 클로닝함으로써 과발현시켰다. 본원에 예시된 디자인된 경로는 케토산 2-케토-3-메틸발레레이트 및 2-케토카프로에이트의 각각의 알데히드로의 탈카르복실화, 이어서 카르복실산으로의 산화를 포함한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 생산량을 개선시키는 상기의 마지막 두 단계에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 야생형 kivD 및 padA를 클로닝하여 본 발명자들의 표적 화학물질의 생산에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 2일 동안의 진탕 플라스크 발효 후, 40 g/L 글루코스로부터의 2-메틸부티르산에 대한 생산 수준은 2.26 g/L이고, 펜탄산에 대한 것은 2.12 g/L인 것을 관찰하게 되었다. 이를 통해 본 발명자들의 생합성 접근법의 실현가능성을 확인할 수 있었다.
이어서, 생성물의 역가를 개선시키기 위해, 본 발명자들은 진탕 플라스크 발효에서 상이한 알데히드 데히드로게나제가 생성물의 역가에 미치는 효과를 조사하였다. KDHba는 연구된 것들 중에서 펜탄산 생산에 있어 가장 효과적인 알데히드 데히드로게나제인 것으로 나타났다. AldH는 연구된 것들 중에서 2-메틸부티르산 생산에 있어 가장 효과적인 알데히드 데히드로게나제인 것으로 입증되었다.
2-메틸부티르산 또는 펜탄산을 생산하는 발효 동안 수개의 부산물, 예컨대 프로피온산, 부티르산, 및 3-메틸부티르산이 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 생합성이 상기 부산물에서 벗어나, 2-메틸부티르산 또는 펜탄산 쪽으로 이루어지도록 유도함으로써 본 발명자들의 표적 생성물의 생산을 추가로 증가시키고자 하였다. KivD의 돌연변이체가 보다 큰 케토산 기질 쪽으로의 탈카르복실화 활성을 증가시킨다는 것이 앞서 밝혀졌다 (문헌 [Bartsch et al., J Bacteriol 1990;172:7035-7042]). 따라서, 본 발명자들은 부산물을 감소시킴으로써 표적 화합물의 생산을 증가시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 KivD를 수개의 KivD 돌연변이체 및 IPDC와 비교하였다. 생합성이 원치않는 부산물에서 벗어나, 원하는 생성물 쪽으로 이루어지도록 유도하는 데 있어 IPDC가 가장 효과적이었다. 따라서, 본 발명자들은 IPDC-AldH의 경우, 2-메틸부티르산에 대하여 2.59 g/L의 생산 역가를, 및 IPDC-KDHba의 경우, 펜탄산에 대하여 2.58 g/L의 생산 역가를 달성할 수 있었다. 상기 생산은 각각 펜탄산 및 2-메틸부티르산에 대한 이론상 최대치 (0.28 g/g (글루코스) 및 0.38 g/g (글루코스))의 22.1% 및 16.6%인 수율에 상응하는 값이었다. 최종적으로, 상기 효소의 활성을 확인하고, 동역학적 파라미터를 찾기 위해 효소 검정을 수행하였다.
본 연구를 통해 상기 화학물질의 재생가능한 생산이 실현가능하다는 것이 입증되었다. 본 발명자들이 아는 한, 이는 C5 모노카르복실산의 합성을 위한 대사 공학에 관해 가장 오래된 보고이다. 본 연구를 통해서는 산 생산을 위한 호기성 공정의 용도 또한 입증되었다. 산을 생산할 수 있는 유기체는 전형적으로 혐기성 조건하에서도 산을 생산할 수 있으며, 이를 통해서는 또한 유의적인 아세테이트 생산이 이루어지고, 이로써 글루코스로부터의 수율은 감소하게 된다. 호기성 공정을 사용함으로써 발효 브로쓰 중 아세테이트 수준을 더욱 잘 조절할 수 있을 것이며, 감소시킬 수 있다. 이는 대기가 탱크를 통과하게 하여 산소를 제공하는 것인, 주의 깊게 작동되는 교반형-탱크 유형의 발효기에서 달성될 수 있다. 상기 발효기는 또한 고도한 세포 밀도로 달성할 수 있는데, 이는 원하는 생성물 화합물 생산 증가를 초래할 수 있다.
본원에 기술된 생합성 전략법은 상기 플랫폼 화학물질의 지속가능한 생산으로의 유망한 진보이다. 또한, 본원에 기술된 생합성 경로는 숙주의 천연 아미노산 생합성 경로의 변형이고, 상기 천연 생합성 경로는 종들 간에 서로 고도로 보존되기 때문에, 본원에 기술된 생합성 변형은 다양한 추가 유기체의 천연 생합성 경로에 적용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 펜탄산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 야생형 대조군과 비교하여 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포를 기술한다. 일부 경우에서, 야생형 대조군은 펜탄산 또는 2-메틸부티르산을 생산하지 못할 수도 있고, 따라서 특정 생성물의 생합성 증가는 상기 생성물의 임의의 측정가능한 생합성을 반영할 수 있다. 특정 실시양태에서, 펜탄산 또는 2-메틸부티르산의 생합성 증가는 미생물 세포 배양물이 펜탄산 또는 2-메틸부티르산을 예정된 농도로 축적시키는 데 충분한 생합성을 포함할 수 있다.
예정된 농도는 주어진 적용에 적합한 생성물의 임의의 예정된 농도일 수 있다. 따라서, 예정된 농도는, 예를 들어 0.1 g/L 이상, 예컨대 0.5 g/L 이상, 1.0 g/L 이상, 2.0 g/L 이상, 3.0 g/L 이상, 4.0 g/L 이상, 5.0 g/L 이상, 6.0 g/L 이상, 7.0 g/L 이상, 8.0 g/L 이상, 9.0 g/L 이상, 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 50 g/L 이상, 100 g/L 이상, 또는 200 g/L 이상인 농도일 수 있다.
재조합 세포는 예를 들어, 원핵 미생물 또는 진핵 미생물을 비롯한, 임의의 적합한 미생물일 수 있거나, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 미생물과 연계하여 "또는 그로부터 유래된 것"이라는 용어는 단순히 "숙주 세포"가 명시된 바와 같은 증가된 생합성 활성을 나타내도록 변형되기 이전에 하나 이상의 유전자 변형을 가지는 것을 허용한다. 따라서, "재조합 세포"라는 용어는 명시된 바와 같은 생합성 활성을 나타내도록 변형되기 이전에 1 초과 종으로부터 유래된 핵산 물질을 함유할 수 있는 "숙주 세포"를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들의 조작된 생합성 경로에 대한 기초가 되는 류신 및 이소류신 생합성 경로는 종간에 고도로 보존된다. 이러한 종간 보존은 이. 콜라이 숙주에서 예시된, 본 발명자들의 경로가 원하는 경우, 다른 숙주 세포 종 내로 도입될 수 있다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 천연 생리학적 활성을 가지는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 광합성 세포일 수 있거나 (예컨대, 시아노박테리아(cyanobacteria)), 또는 셀룰로스분해성 세포일 수 있다 (예컨대, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum)).
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 진핵 미생물, 예컨대 진균 세포일 수 있거나, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 실시양태의 일부에서, 진균 세포는 사카로미세타세아에(Saccharomycetaceae) 과의 구성원, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)일 수 있거나, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 세포는 원핵 미생물, 예컨대 박테리아일 수 있거나, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 실시양태의 일부에서, 박테리아는 프로토박테리아(Protobacteria) 문의 구성원일 수 있다. 프로토박테리아 문의 예시적인 구성원으로는 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원 (예컨대, 에스케리키아 콜라이) 및 예를 들어, 슈도모나세아에(Pseudomonaceae) 과의 구성원 (예컨대, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida))을 포함한다. 다른 경우에, 박테리아는 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 구성원일 수 있다. 피르미쿠테스 문의 예시적인 구성원으로는 예를 들어, 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 구성원 (예컨대, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 과의 구성원 (예컨대, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰), 및 예를 들어, 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과의 구성원 (예컨대, 락토코쿠스 락티스)일 수 있다. 다른 경우에, 박테리아는 시아노박테리아(Cyanobacteria) 문의 구성원일 수 있다.
일부 실시양태에서, 야생형 대조군과 비교하여 증가된 펜탄산 생합성은 야생형 대조군과 비교하여 2-케토부티레이트에서 2-케토발레레이트로의 신장 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토발레레이트에서 2-케토카프로에이트로의 신장 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 및/또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 야생형 대조군과 비교하여 증가된 2-메틸부티르산 생합성은 야생형 대조군과 비교하여 트레오닌에서 2-케토부티레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토부티레이트에서 2-케토-3-메틸발레레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 및/또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 증가된 케토산 데카르복실라제 활성 중 적어도 일부는 케토산 데카르복실라제 효소 변형에 기인하는 것일 수 있다. 예를 들어, 락토코쿠스 락티스의 2-케토산 데카르복실라제 (또는 유사체)는 V461A, M538A, 또는 F542L로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산 치환, 또는 유사한 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에, 2-케토산 데카르복실라제는 M528A 치환 (또는 유사한 치환) 또는 V461A 치환 (또는 유사한 치환)과 함께 조합된 V461A 치환 (또는 유사한 치환)을 포함하도록 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유사체"라는 용어는 효소 활성이 유사한, 동일한 또는 상이한 미생물 공급원으로부터의 관련된 효소를 의미한다. 따라서, 유사체는 대개 유의적인 보존을 나타내며, 당업자가 임의의 주어진 효소의 적합한 관련 유사체를 확인하는 것은 사소한 일이다. 또한, 당업자가 유사체의 아미노산 서열을 참조 효소의 아미노산 서열과 정렬하여 "유사한 치환"을 확인하는 것도 사소한 일이다. 따라서, 유사체 효소와 참조 효소 사이의 보존에도 불구하고, 언급된 치환과 유사한 치환 사이에는 위치적 차이 및/또는 아미노산 잔기 차이가 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 인돌피루베이트 데카르복실라제 (IPDC) 활성의 증가를 나타낼 수 있다. IPDC 활성의 증가는 IPDC 효소 발현으로부터 기인하는 것일 수 있다. 예시적인 IPDC 효소로는 예를 들어, 서열 1-21 중 어느 하나에 반영된 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 IPDC 데카르복실라제, 예컨대 서열 1-21 중 어느 하나에 반영된 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 세포는 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 나타낼 수 있다. 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가는 알데히드 데히드로게나제 효소의 발현으로부터 기인하는 것일 수 있다. 예시적인 알데히드 데히드로게나제 효소로는 예를 들어, 서열 22-55 중 어느 하나에 반영된 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 알데히드 데히드로게나제, 예컨대 서열 22-55 중 어느 하나에 반영된 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 특정 효소와 관련하여 "활성"이라는 용어는 그의 일반명 또는 천연 기능과는 상관없이, "활성"이 확인된 효소의 천연 활성보다 적은지, 그와 동일한지, 또는 그보다 큰지 여부와는 상관없이, 효소의 기질의 생성물로의 전환을 촉매할 수 있는 폴리펩티드의 능력을 의미한다. 세포의 생합성 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 통상적이며, 주지되어 있다. 유전적으로 변형된 세포와 관련하여, "활성"이라는 용어는 "활성" 세포의 야생형 균주의 천연 활성보다 적은지, 그와 동일한지, 또는 그보다 큰지 여부와는 상관없이, 확인된 생성물 화합물을 합성할 수 있는 유전적으로 변형된 세포의 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 효소의 촉매 활성의 증가 또는 유전적으로 변형된 세포의 생합성 활성의 증가는 정량적으로 측정되고, 적절한 야생형 대조군의 활성에 대한 상대적인 비율(%)으로서 기술될 수 있다. 유전적으로 변형된 폴리펩티드에 의해 나타나는 촉매 활성 또는 유전적으로 변형된 세포의 생합성 활성은 예를 들어, 적절한 야생형 대조군의 활성의 110% 이상, 125% 이상, 150% 이상, 175% 이상, 200% (2배) 이상, 250% 이상, 300% (3배) 이상, 400% (4배) 이상, 500% (5배) 이상, 600% (6배) 이상, 700% (7배) 이상, 800% (8배) 이상, 900% (9배) 이상, 1,000% (10배) 이상, 2,000% (20배) 이상, 3,000% (30배) 이상, 4,000% (40배) 이상, 5,000% (50배) 이상, 6,000% (60배) 이상, 7,000% (70배) 이상, 8,000% (80배) 이상, 9,000% (90배) 이상, 10,000% (100배) 이상, 또는 100,000% (1,000배) 이상일 수 있다.
대안적으로, 촉매 활성의 증가는 k cat 증가, 예컨대 효소 전환의 k cat 값의 2배 이상 증가, 3배 이상 증가, 4배 이상 증가, 5배 이상 증가, 6배 이상 증가, 7배 이상 증가, 8배 이상 증가, 9배 이상 증가, 10배 이상 증가, 15배 이상 증가, 또는 20배 이상 증가로 표현될 수 있다.
촉매 활성의 증가는 또한 K m 감소, 예컨대 효소 전환의 K m 값의 2배 이상 감소, 3배 이상 감소, 4배 이상 감소, 5배 이상 감소, 6배 이상 감소, 7배 이상 감소, 8배 이상 감소, 9배 이상 감소, 10배 이상 감소, 15배 이상 감소, 또는 20배 이상 감소로 표현될 수 있다.
효소의 촉매 활성의 감소 또는 유전적으로 변형된 세포의 생합성 활성의 증가는 정량적으로 측정되고, 적절한 야생형 대조군의 촉매 활성에 대한 상대적인 비율(%)으로서 기술될 수 있다. 유전적으로 변형된 폴리펩티드에 의해 나타나는 촉매 활성 또는 유전적으로 변형된 세포의 생합성 활성은 예를 들어, 적합한 야생형 대조군의 활성의 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 또는 0%일 수 있다.
대안적으로, 촉매 활성 감소는 k cat 감소, 예컨대 효소 전환의 k cat 값의 2배 이상 감소, 3배 이상 감소, 4배 이상 감소, 5배 이상 감소, 6배 이상 감소, 7배 이상 감소, 8배 이상 감소, 9배 이상 감소, 10배 이상 감소, 15배 이상 감소, 또는 20배 이상 감소로 표현될 수 있다.
촉매 활성 감소는 또한 K m 증가, 예컨대 K m 의 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 75배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 230배 이상, 250배 이상, 300배 이상, 350배 이상, 또는 400배 이상 증가로 표현될 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명자들은 본원에서 펜탄산 또는 2-메틸부티르산 생합성 방법을 기술한다. 일반적으로, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 세포를 상기 재조합 세포가 펜탄산 또는 2-메틸부티르산을 생산하는 데 효과적인 조건하에 탄소원을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 펜탄산을 제조하는 경우, 탄소원으로는 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트, 또는 발레르알데히드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 2-메틸부티르산을 제조하는 경우, 탄소원으로는 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토-3-메틸발레레이트, 또는 2-메틸 부티르알데히드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가로, 관련된 탄소 동화 경로가 조작된 미생물 내로 도입되는 한, 세포 성장을 위한 탄소원은 CO2, 셀룰로스, 글루코스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스, 글리세롤 등일 수 있다.
추가의 또 다른 측면에서, 본원에서 본 발명자들은 숙주 세포에서 탄소원을 펜탄산 또는 2-메틸부티르산으로 전환시킬 수 있는 능력이 증가되어 나타날 수 있도록 세포 내로 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법을 기술한다. 펜탄산을 생산하는 세포의 경우, 이종 폴리뉴클레오티드는 변형된 세포가 탄소원에서 펜탄산으로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 탄소원은 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트, 또는 발레르알데히드 중 하나 이상일 수 있다. 2-메틸 부티르알데히드를 생산하는 세포의 경우, 이종 폴리뉴클레오티드는 변형된 세포가 탄소원에서 2-메틸 부티르알데히드로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 탄소원은 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토-3-메틸발레레이트, 또는 2-메틸 부티르알데히드 중 하나 이상일 수 있다. 상기 방법을 위한 숙주 세포는 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 세포와 관련하여 상기 확인된 미생물 종 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
상기 설명에서 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 열거된 요소들 중 하나 또는 그들 모두, 또는 열거된 요소들 중 임의의 2개 이상의 것의 조합을 의미하고; "포함한다"라는 용어 및 그의 파생어는 설명 및 특허청구범위에서 상기 용어가 출현하는 경우, 제한적 의미를 가지지 않는다; 달리 언급되지 않는 한, "하나"("a," "an"), "그," 및 "1종 이상의"라는 것은 상호교환적으로 사용되고, 이는 하나 또는 1 초과를 의미하고; 종점으로 수치 범위를 언급한 경우, 이는 상기 범위 내에 포함된 모든 수치를 포함한다 (예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).
상기 설명에서, 특정 실시양태는 명확하게 하기 위해 따로따로 기술될 수 있다. 특정 실시양태의 특징이 또 다른 실시양태의 특징과 비상용성이라고 명백하게 언급되지 않는 한, 특정 실시양태는 하나 이상의 실시양태와 연계하여 본원에 기술되는 상용성이 특징들의 조합을 포함할 수 있다.
개별 단계를 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법의 경우, 상기 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있다. 또한, 적절할 경우, 2 이상의 단계의 임의의 조합은 동시에 수행될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 예, 물질, 양 및 방법은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 범주 및 정신에 따라 광범위하게 해석되어야 한다는 것을 이해하여야 한다.
실시예
실시예 1
박테리아 균주, 시약, 배지 및 배양
본 연구에서 사용된 이. 콜라이 균주는 트레오닌의 고도한 세포내 수준을 위해 트레오닌 및 호모세린 외수송 인자 유전자 rhtA가 녹아웃되어 있는 것인 트레오닌 과생산자 균주 ATCC98082였다 (문헌 [Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239]). yqhD 유전자 결실 균주를 게이오 콜렉션(Keio collection)으로부터 입수하였다 (문헌 [Baba et al., Mol Syst Biol 2006;2:2006.0008]). 카나마이신 내성 마커를 제거하기 위해 플라스미드 pCP20으로 형질전환시켰다. 2-메틸부티르산 생산을 위해, 상기 균주를 플라스미드 pIPA1, pIPA2 및 pIPA4 내지 pIPA15 중 하나로 형질전환시켰다. 펜탄산 생산을 위해, 상기 균주를 pIPA1, pIPA3 및 pIPA4 내지 pIPA15 중 어느 하나로 형질전환시켰다.
플라스미드 증식에 사용된 XL1-블루(XL1-Blue) 및 XL10-골드(XL10-Gold) 적격 세포는 스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)으로부터 입수한 반면, 단백질 발현에 사용된 BL21 적격 세포는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs: 미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 입수한 것이었다. 제한 효소, 퀵 라이게이션(QUICK LIGATION) 키트 및 퓨전(PHUSION) 고성능 PCR 키트들 모두 이 또한 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수한 것이었다.
2x YT가 풍부한 배지 (16 g/L 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 10 g/L 효모 추출물 및 5 g/L NaCl)를 사용하여 이. 콜라이 균주를 37℃ 및 250 rpm에서 배양하였다. 필요에 따라 항생제 (100 mg/L 암피실린, 25 mg/L 카나마이신 및 25 mg/L 스펙티노마이신)를 첨가하였다.
발효 절차 및 HPLC 분석
발효 실험을 3중으로 수행하고, 데이터는 평균 값과, 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 제시하였다. 5 g/L 효모 추출물, 40 g/L 글루코스, 10 mg/L 티아민, 100 mg/L 암피실린, 25 mg/L 카나마이신 및 25 mg/L 스펙티노마이신으로 보충된 5 mL M9 배지를 함유하는 125 mL 삼각 플라스크 내로 밤새도록 배양된 배양물 250 ㎕를 옮겨 놓았다. 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 생산된 산을 중화시키기 위해 0.2 g CaCO3을 플라스크 내로 첨가하였다. 30℃ 및 250 rpm에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 수집하고, 굴절률 검출기가 장착된 아미넥스(Aminex) HPX 87H 칼럼 (바이오-래드 라보라토리즈 인코퍼레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.: 미국 캘리포니아주 허큘리스))을 함유하는 애질런트 1260 인피니티 HPLC(Agilent 1260 Infinity HPLC)를 사용하여 분석하였다. 이동상은 5 mM H2SO4이고, 유량은 0.6 mL/분이었다. 칼럼 온도는 35℃이고, 검출 온도는 50℃였다.
단백질 발현 및 정제
유전자를 N-말단 6x His-태그를 코딩하는 플라스미드 내로 클로닝하여 pIPA16을 수득함으로써 AldH를 정제하였다. 이어서, 상기 플라스미드를 이. 콜라이 균주 BL21 내로 형질전환시켰다. 밤새도록 배양된 사전 배양물로부터 1/300 희석률로 세포에 접종하고, 100 ㎍/L 암피실린을 함유하는 2x YT가 풍부한 배지 300 ml 중에 30℃에서 성장시켰다. OD가 0.6에 도달하였을 때, IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 250 mM NaCl, 2 mM DTT, 5 mM 이미다졸 및 50 mM 트리스를 함유하는 완충제 (pH 9.0) 중에서 초음파처리하여 세포 펠릿을 용해시켰다. Ni-NTA 칼럼 크로마토그래피를 통해 조 세포 용해물로부터 효소를 정제하고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심 필터 (EMD 밀리포어 코포레이션(EMD Millipore Corp.: 미국 매사추세츠주 빌러리카))를 이용하여 완충제 교환을 수행하였다. 50 μM 트리스 완충제, 1 mM MgSO4 및 20% 글리세롤을 함유하는 보관용 완충제 (pH 8.0)가 AldH용으로 사용되었다. 100 ㎕의 단백질 농축액을 PCR 튜브에 분취시키고, 장기간 보관을 위해 -80℃에서 급냉시켰다. 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 정제된 KDHba 및 IPDC는 종래 연구로부터 이용가능하였다 (문헌 [Xiong et al., Sci Rep 2012;2]).
효소 검정
KDHba에 대한 효소 검정은 총 부피 78 ㎕로 검정용 완충제 (50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 1 mM DTT) 중 0.5 mM NAD+ 및 50 μM 내지 400 μM 범위의 발레르알데히드로 구성되었다. 반응을 개시시키기 위해, 2 ㎕의 1 μM KDHba를 첨가하고, 340 nm에서 NADH 생성에 대해 모니터링하였다 (흡광 계수, 6.22 mM-1 cm-1). AldH에 대해서는 농도 범위가 1 mM 내지 6 mM인 2-메틸 부티르알데히드를 이용하는 유사한 프로토콜을 사용하였다.
커플링된 효소 검정 방법을 사용하여 IPDC 활성을 측정하였다. 과량의 적절한 알데히드 데히드로게나제 (2-케토-3-메틸발레레이트에 대해 AldH 및 2-케토카프로에이트에 대해 KDHba)를 사용하여 알데히드를 산으로 산화시켰고, 동시에, 보조인자 NAD+는 NADH로 환원되었다. 검정용 혼합물은 총 부피 78 ㎕로 검정용 완충제 (50 mM NaH2PO4 (pH 6.8), 1 mM MgSO4, 0.5 mM ThDP) 중 0.5 mM NAD+, 0.1 μM 적절한 알데히드 데히드로게나제 및 1 mM 내지 8 mM 범위의 상응하는 2-케토산을 함유하였다. 반응을 개시시키기 위해, 2 ㎕의 1 μM IPDC를 첨가하고, 340 nm에서 NADH 생성에 대해 모니터링하였다. 초기 속도 데이터를 미카엘리스-멘텐 방정식에 피팅하여 동역학적 파라미터 (kcat 및 KM)를 측정하였다.
Figure pct00002
본원에서 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 문헌, 및 전자적으로 이용가능한 자료 (예를 들어, 예컨대 진뱅크(GenBank) 및 RefSeq의 뉴클레오티드 서열 제출물, 및 예컨대, 스위스프로트(SwissProt), PIR, PRF, PDB의 아미노산 서열 제출물, 및 진뱅크 및 RefSeq의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역물 포함)의 전체 개시내용은 그 전문이 참조로 포함한다. 본 출원의 개시내용과, 본원에 포함된 임의 문헌의 개시내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재할 경우, 본 출원의 개시내용이 지배하도록 한다. 상기 상세한 설명 및 실시예는 단지 명확한 이해를 위해 제공되었다. 그로부터의 어떠한 불필요한 제한도 이해하지 않도록 한다. 본 발명은 제시되고 기술된 정확한 상세한 설명으로 제한되지 않으며, 당업자에게 자명한 변형의 경우, 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다.
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된, 성분, 분자량 등에 대한 정량을 표현하는 수치들은 모두 모든 경우에서 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 달리 반대로 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 특허청구범위에 기재된 수치 파라미터는 근사치로서, 이는 본 발명이 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 및 등가물의 이론을 특허청구범위의 범주로 제한하고자 하는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자 수치에 비추어, 및 일반 반올림 기법을 적용시킴으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 광범위한 범주를 기재하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 기재되는 수치 값은 가능한 정확하게 기록된 것이다. 그러나, 모든 수치 값은 본질적으로는 반드시 그의 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 형성되는 범위를 포함한다.
모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이며, 그렇게 언급되지 않는 한, 표제 다음에 오는 텍스트의 의미를 제한하는 것으로 사용되지 않아야 한다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 1
SeqID: YP_004731039.1 GI:340000155
단백질 명칭: 추정 데카르복실라제 [살모넬라 본고리 ( Salmonella bongori ) NCTC 12419]
Figure pct00003
서열 2
SeqID: ZP_03365331.1 GI:213583505
단백질 명칭: 추정 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 변이주 티피 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Typhi str . ) E98-0664]
Figure pct00004
서열 3
SeqID: YP_001569550.1 GI:161502438
단백질 명칭: 가상 단백질 SARI _00479 [살모넬라 엔테리카 아종. 아리조나에 혈청형 변이주 62: z4 , z23 :--균주( Salmonella enterica subsp . arizonae serovar 62:z4,z23:-- str. ) RSK2980 ]
Figure pct00005
서열 4
SeqID: YP_149772.1 GI:56412697
단백질 명칭: 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 파라티피 A 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Paratyphi A str. ) ATCC 9150]
Figure pct00006
서열 5
SeqID: ZP_02654846.1 GI:168229788
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 켄터키 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Kentucky str . ) CDC 191]
Figure pct00007
서열 6
SeqID: ZP_03220347.1 GI:204929204
단백질 명칭: 인돌-3- 피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 자비아나 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Javiana str . ) GA _ MM04042433 ]
Figure pct00008
서열 7
SeqID: NP_456948.1 GI:16761331
단백질 명칭: 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종 . 엔테리카 혈청형 변이주 티피 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Typhi str . ) CT18 ]
Figure pct00009
서열 8
SeqID: ZP_03215433.1 GI:200388821
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 비르초우 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Virchow str . ) SL491 ]
Figure pct00010
서열 9
SeqID : EFY11092.1 GI:322614157
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 몬테비데오 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Montevideo str . ) 315996572]
Figure pct00011
서열 10
SeqID: ZP_02662493.1 GI:168237435
단백질 명칭: 인돌-3- 피루베이트 데카르복실라제 ( 인돌피루베이트데카르복실 라제) [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 슈와젠그룬드 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Schwarzengrund str . ) SL480 ]
Figure pct00012
서열 11
SeqID: YP_217395.1 GI:62180978
단백질 명칭: 추정 티아민 피로포스페이트 효소 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 콜레라에수이스 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Choleraesuis str . ) SC -B67]
Figure pct00013
서열 12
SeqID: ZP_02829849.1 GI:168817849
단백질 명칭: 인돌-3- 피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 웰테브레덴 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Weltevreden str . ) HI _ N05 -537]
Figure pct00014
서열 13
SeqID: ZP_02683535.1 GI:168261562
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 하다르 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Hadar str . ) RI _05 P066 ]
Figure pct00015
서열 14
SeqID: YP_002227320.1 GI:205353519
단백질 명칭: 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 갈리나룸 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Gallinarum str. ) 287/91]
Figure pct00016
서열 15
SeqID: YP_002636855.1 GI:224583057
단백질 명칭: 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 파라티피 C 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Paratyphi C strain ) RKS4594 ]
Figure pct00017
서열 16
SeqID: ZP_04656662.1 GI:238912825
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 테네시 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Tennessee str . ) CDC07 -0191]
Figure pct00018
서열 17
SeqID: CBW18475.1 GI:301158962
단백질 명칭: 추정 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종 . 엔테리카 혈청형 변이주 티피무리움 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Typhimurium str . ) SL1344 ]
Figure pct00019
서열 18
SeqID: YP_002147363.1 GI:197247765
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 아고나 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Agona str . ) SL483 ]
Figure pct00020
서열 19
SeqID: ZP_02667483.1 GI:168242551
단백질 명칭: 인돌-3-피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 헤이델베르그 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Heidelberg str . ) SL486 ]
Figure pct00021
서열 20
SeqID: YP_001586815.1 GI:161612850
단백질 명칭: 가상 단백질 SPAB_ 00555 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔테리카 혈청형 변이주 파라티피 B 균주( Salmonella enterica subsp . enterica serovar Paratyphi B str . ) SPB7 ]
Figure pct00022
서열 21
SeqID: NP_461346.1 GI:16765731
단백질 명칭: 인돌피루베이트 데카르복실라제 [살모넬라 엔테리카 아종. 엔 테리카 혈청형 변이주 티피무리움 균주 LT2 ]
Figure pct00023
서열 22
SeqID: YP_004156811.1 GI:319795171
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [ 바리오보락스 파라독수스( Variovorax paradoxus ) EPS ]
Figure pct00024
서열 23
SeqID: YP_002945800.1 GI:239816890
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 ( NAD (+)) [ 바리오보락스 파라독수스 S110]
Figure pct00025
서열 24
SeqID: ZP_03268788.1 GI:209520010
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종( Burkholderia sp . ) H160]
Figure pct00026
서열 25
SeqID: YP_004022361.1 GI:312602516
단백질 명칭: 6- 옥소헥사노에이트 데히드로게나제 [부르크홀데리아 리족시니 카( Burkholderia rhizoxinica ) HKI 454]
Figure pct00027
서열 26
SeqID: YP_003605215.1 GI:295676691
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종 CCGE1002 ]
Figure pct00028
서열 27
SeqID: YP_558960.1 GI:91783754
단백질 명칭: 2,5- 디옥소펜타노에이트 데히드로게나제 ( NAD +) [부르크홀데리아 크세노보란스( Burkholderia xenovorans ) LB400 ]
Figure pct00029
서열 28
SeqID: ZP_06846085.1 GI:296163325
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종 Ch1 -1]
Figure pct00030
서열 29
SeqID: YP_001895827.1 GI:187924185
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 피토피르만스( Burkholderia phytofirmans ) PsJN ]
Figure pct00031
서열 30
SeqID: YP_003907074.1 GI:307729850
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종 CCGE1003 ]
Figure pct00032
서열 31
SeqID: ZP_02887443.1 GI:170696312
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 그라미니스( Burkholderia graminis ) C4D1M ]
Figure pct00033
서열 32
SeqID: YP_001861563.1 GI:186474221
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 피마툼( Burkholderia phymatum ) STM815 ]
Figure pct00034
서열 33
SeqID: YP_004228054.1 GI:323525901
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종 CCGE1001 ]
Figure pct00035
서열 34
SeqID : YP_004361425.1 GI:330817720
단백질 명칭: NAD -의존성 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 글라디올리( Burkholderia gladioli ) BSR3 ]
Figure pct00036
서열 35
SeqID: YP_002912305.1 GI:238028074
단백질 명칭: NAD -의존성 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 글루마 에( Burkholderia glumae ) BGR1 ]
Figure pct00037
서열 36
SeqID: ZP_04941711.1 GI:254248391
단백질 명칭: 숙시네이트- 세미알데히드 데히드로게나제 ( NAD (P)+) [부르크홀데리아 세노세파시아 ( Burkholderia cenocepacia ) PC184 ]
Figure pct00038
서열 37
SeqID: ZP_02382650.1 GI:167590262
단백질 명칭: 숙시네이트- 세미알데히드 데히드로게나제 ( NAD (P)(+)) [부르크홀데리아 우보넨시스 ( Burkholderia ubonensis ) Bu ]
Figure pct00039
서열 38
SeqID: YP_372358.1 GI:78062450
단백질 명칭: 2,5- 디옥소펜타노에이트 데히드로게나제 ( NAD +) [부르크홀데리아 종 383]
Figure pct00040
서열 39
SeqID: ZP_04947381.1 GI:254254064
단백질 명칭: NAD -의존성 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 돌로사( Burkholderia dolosa ) AUO158 ]
Figure pct00041
서열 40
SeqID: BAE94276.1 GI:95102056
단백질 명칭: 알파- 케토글루타르 세미알데히드 데히드로게나제 [아조스피릴룸 브라실렌세( Azospirillum brasilense )]
Figure pct00042
서열 41
SeqID: ZP_03583019.1 GI:221210038
단백질 명칭: 숙시네이트 - 세미알데히드 데히드로게나제 [ NADP +] ( ssdh ) [ 부르크홀데리아 멀티보란스 ( Burkholderia multivorans ) CGD1 ]
Figure pct00043
서열 42
SeqID: YP_001779559.1 GI:170738299
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 세노세파시아 MC0 -3]
Figure pct00044
서열 43
SeqID: YP_001584188.1 GI:161520761
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 멀티보란스 ATCC 17616]
Figure pct00045
서열 44
SeqID: EGD03606.1 GI:325525897
단백질 명칭: NADP -의존성 숙시네이트 - 세미알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 종 TJI49 ]
Figure pct00046
서열 45
SeqID: YP_002234153.1 GI:206563390
단백질 명칭: 추정 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 세노세파시아 J2315]
Figure pct00047
서열 46
SeqID: ZP_03569460.1 GI:221196413
단백질 명칭: 숙시네이트- 세미알데히드 데히드로게나제 [ NADP +] ( ssdh ) [부르크홀데리아 멀티보란스 CGD2M ]
Figure pct00048
서열 47
SeqID: YP_001117385.1 GI:134293649
단백질 명칭: 2,5- 디옥소펜타노에이트 데히드로게나제 ( NAD +) [부르크홀데리아 비에트나미엔시스( Burkholderia vietnamiensis ) G4 ]
Figure pct00049
서열 48
SeqID: YP_623820.1 GI:107026309
단백질 명칭: 숙시네이트- 세미알데히드 데히드로게나제 ( NAD (P)+) [부르크홀데리아 세노세파시아 AU 1054]
Figure pct00050
서열 49
SeqID: ZP_02891604.1 GI:170700605
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 암비파리아 IOP40 -10]
Figure pct00051
서열 50
SeqID: YP_001810977.1 GI:172063326
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 [부르크홀데리아 암비파리아 MC40 -6]
Figure pct00052
서열 51
SeqID: ZP_02911594.1 GI:171322894
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제_ [부르크홀데리아 암비파리아 MEX -5]
Figure pct00053
서열 52
SeqID: YP_775718.1 GI:115358580
단백질 명칭: 숙시네이트- 세미알데히드 데히드로게나제 ( NAD (P)(+)) [부르크홀데리아 암비파리아 AMMD ]
Figure pct00054
서열 53
SeqID: NP_015264.1 GI:6325196
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 , ALD6 [ 사카로미세스 세레비지아에 ]
Figure pct00055
서열 54
SeqID: NP_013893.1 GI:6323822
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 , ALD2 [ 사카로미세스 세레비지아에 ]
Figure pct00056
서열 55
SeqID: NP_013892.1 GI:6323821
단백질 명칭: 알데히드 데히드로게나제 , ALD3 [ 사카로미세스 세레비지아에 ]
Figure pct00057
SEQUENCE LISTING <110> REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA Zhang, Kechun Dhande, Yogesh <120> BIOSYNTHETIC PATHWAYS, RECOMBINANT CELLS, AND METHODS <130> 110.03690201 <150> US 61/645,900 <151> 2012-05-11 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 550 <212> PRT <213> Salmonella bongori <400> 1 Met Gln Thr Pro Tyr Thr Val Ala Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu Ala 1 5 10 15 Gly Cys Gly Ile Asp His Leu Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu 20 25 30 Gln Phe Leu Asp His Val Ile Asp His Pro Thr Leu Arg Trp Val Gly 35 40 45 Cys Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg 50 55 60 Met Ser Gly Ala Gly Ala Leu Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ile Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Tyr Val Pro Val 85 90 95 Leu His Ile Val Gly Ala Pro Cys Ser Asp Ala Gln Gln Arg Gly Glu 100 105 110 Leu Met His His Thr Leu Gly Asp Gly Asp Phe Arg His Phe Tyr Arg 115 120 125 Met Ser Gln Ala Ile Ser Ala Ala Ser Ala Val Leu Asn Glu Gln Asn 130 135 140 Ala Cys Tyr Glu Ile Asp 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Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg Leu Thr 325 330 335 Ala Met Ala Ser Val Val Asp Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Ser Ile 340 345 350 Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ala Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Glu Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu 370 375 380 Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Glu Asp 385 390 395 400 Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala 405 410 415 Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Gln Arg Leu Glu 420 425 430 Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Ala Thr Pro Trp Pro Glu Met 435 440 445 Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala 465 470 475 480 Val <210> 49 <211> 481 <212> PRT <213> Burkholderia ambifaria <400> 49 Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu 1 5 10 15 Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Ala Ile Gly Lys Val Ala His 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Leu Gly Gly 245 250 255 His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu Ala Val 260 265 270 Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile 275 280 285 Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu Phe Thr 290 295 300 Arg Ala Leu Val Gln His Ala Glu Gly Leu Lys Ile Gly Asn Gly Leu 305 310 315 320 Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg Leu Thr 325 330 335 Ala Met Val Ser Val Val Asp Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Arg Ile 340 345 350 Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Glu Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu 370 375 380 Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Asp Asp 385 390 395 400 Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala 405 410 415 Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Gln Arg Leu Glu 420 425 430 Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Ala Thr Pro Trp Pro Glu Met 435 440 445 Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala 465 470 475 480 Val <210> 50 <211> 481 <212> PRT <213> Burkholderia ambifaria <400> 50 Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu 1 5 10 15 Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Ala Ile Gly Lys Val Ala His Ala Gly Ile Ala Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Leu Val Ala Ala Gln Arg Gly Phe Glu Ala Trp Arg Lys 50 55 60 Val Pro Ala Asn Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Arg Ala Asp Thr Ile Ala Gln Leu Met Thr Gln Glu Gln 85 90 95 Gly Lys Pro Leu Thr Glu Ala Arg Val Glu Val Leu Ser Ala Ala Asp 100 105 110 Ile Ile Glu Trp Phe Ala Asp Glu Gly Arg Arg Val Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Val Pro Pro Arg Asn Leu Gly Ala Gln Gln Met Val Val Lys Glu Pro 130 135 140 Val Gly Pro Val Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 Val Val Arg Lys Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Gly Cys Ser Phe Leu 165 170 175 Val Lys Ala Pro Glu Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Leu Leu Arg 180 185 190 Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Tyr 195 200 205 Gly Asp Pro Ala Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Ile Ala His Pro Val Ile 210 215 220 Arg Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ala Gly Gln His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly Gly 245 250 255 His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu Ala Val 260 265 270 Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile 275 280 285 Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu Phe Thr 290 295 300 Arg Ala Leu Val Gln His Ala Glu Gly Leu Lys Ile Gly Asn Gly Leu 305 310 315 320 Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg Leu Thr 325 330 335 Ala Met Ala Ser Val Val Asp Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Ser Ile 340 345 350 Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Glu Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu 370 375 380 Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Glu Asp 385 390 395 400 Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala 405 410 415 Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Gln Arg Leu Glu 420 425 430 Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Ala Thr Pro Trp Pro Glu Met 435 440 445 Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala 465 470 475 480 Val <210> 51 <211> 481 <212> PRT <213> Burkholderia ambifaria <400> 51 Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu 1 5 10 15 Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Ala Ile Gly Lys Val Ala His Ala Gly Ile Ala Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Leu Ala Ala Ala Gln Arg Gly Phe Glu Ala Trp Arg Lys 50 55 60 Val Pro Ala Asn Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Gln Leu Met Thr Gln Glu Gln 85 90 95 Gly Lys Pro Leu Thr Glu Ala Arg Val Glu Val Leu Ser Ala Ala Asp 100 105 110 Ile Ile Glu Trp Phe Ala Asp Glu Gly Arg Arg Val Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Val Pro Pro Arg Asn Leu Gly Ala Gln Gln Met Val Val Lys Glu Pro 130 135 140 Val Gly Pro Val Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 Val Val Arg Lys Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Gly Cys Ser Phe Leu 165 170 175 Val Lys Ala Pro Glu Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Leu Leu Arg 180 185 190 Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Tyr 195 200 205 Gly Asp Pro Ala Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Ile Ala His Pro Val Ile 210 215 220 Arg Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ala Gly Gln His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly Gly 245 250 255 His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu Ala Val 260 265 270 Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile 275 280 285 Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu Phe Thr 290 295 300 Arg Ala Leu Val Gln His Ala Glu Gly Leu Lys Ile Gly Asn Gly Leu 305 310 315 320 Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg Leu Thr 325 330 335 Ala Met Ala Ser Val Val Glu Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Ser Ile 340 345 350 Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Glu Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu 370 375 380 Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Glu Asp 385 390 395 400 Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala 405 410 415 Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Gln Arg Leu Glu 420 425 430 Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Ala Thr Pro Trp Pro Glu Met 435 440 445 Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala 465 470 475 480 Val <210> 52 <211> 481 <212> PRT <213> Burkholderia ambifaria <400> 52 Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu 1 5 10 15 Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Ala Ile Gly Lys Val Ala His Ala Gly Ile Ala Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Leu Ala Ala Ala Gln Arg Gly Phe Glu Ala Trp Arg Lys 50 55 60 Val Pro Ala Asn Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Gln Leu Met Thr Gln Glu Gln 85 90 95 Gly Lys Pro Leu Thr Glu Ala Arg Val Glu Val Leu Ser Ala Ala Asp 100 105 110 Ile Ile Glu Trp Phe Ala Asp Glu Gly Arg Arg Val Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Val Pro Pro Arg Asn Leu Gly Ala Gln Gln Met Val Val Lys Glu Pro 130 135 140 Val Gly Pro Val Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 Val Val Arg Lys Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Gly Cys Ser Phe Leu 165 170 175 Val Lys Ala Pro Glu Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Leu Leu Arg 180 185 190 Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val Tyr 195 200 205 Gly Glu Pro Ala Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Ile Ala His Pro Val Ile 210 215 220 Arg Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Lys Gln Leu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ala Gly Gln His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly Gly 245 250 255 His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu Ala Val 260 265 270 Lys Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val Cys Ile 275 280 285 Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu Phe Thr 290 295 300 Arg Ala Leu Val Gln His Ala Glu Gly Leu Lys Ile Gly Asn Gly Leu 305 310 315 320 Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg Leu Thr 325 330 335 Ala Met Ala Ser Val Val Glu Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala Ser Ile 340 345 350 Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe Ala Pro 355 360 365 Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Glu Ala Asp Val Phe Asn Asn Glu 370 375 380 Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu Glu Asp 385 390 395 400 Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Tyr Ala 405 410 415 Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Ser Gln Arg Leu Glu 420 425 430 Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Ala Thr Pro Trp Pro Glu Met 435 440 445 Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Gly Gly Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr Val Met Ala 465 470 475 480 Val <210> 53 <211> 500 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 53 Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu 1 5 10 15 Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly Lys Thr Tyr Pro Val Glu Asp Pro 35 40 45 Ser Thr Glu Asn Thr Val Cys Glu Val Ser Ser Ala Thr Thr Glu Asp 50 55 60 Val Glu Tyr Ala Ile Glu Cys Ala Asp Arg Ala Phe His Asp Thr Glu 65 70 75 80 Trp Ala Thr Gln Asp Pro Arg Glu Arg Gly Arg Leu Leu Ser Lys Leu 85 90 95 Ala Asp Glu Leu Glu Ser Gln Ile Asp Leu Val Ser Ser Ile Glu Ala 100 105 110 Leu Asp Asn Gly Lys Thr Leu Ala Leu Ala Arg Gly Asp Val Thr Ile 115 120 125 Ala Ile Asn Cys Leu Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ala Asp Lys Val Asn 130 135 140 Gly Arg Thr Ile Asn Thr Gly Asp Gly Tyr Met Asn Phe Thr Thr Leu 145 150 155 160 Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Ile 165 170 175 Met Met Leu Ala Trp Lys Ile Ala Pro Ala Leu Ala Met Gly Asn Val 180 185 190 Cys Ile Leu Lys Pro Ala Ala Val Thr Pro Leu Asn Ala Leu Tyr Phe 195 200 205 Ala Ser Leu Cys Lys Lys Val Gly Ile Pro Ala Gly Val Val Asn Ile 210 215 220 Val Pro Gly Pro Gly Arg Thr Val Gly Ala Ala Leu Thr Asn Asp Pro 225 230 235 240 Arg Ile Arg Lys Leu Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Ser 245 250 255 Val Ala Val Asp Ser Ser Glu Ser Asn Leu Lys Lys Ile Thr Leu Glu 260 265 270 Leu Gly Gly Lys Ser Ala His Leu Val Phe Asp Asp Ala Asn Ile Lys 275 280 285 Lys Thr Leu Pro Asn Leu Val Asn Gly Ile Phe Lys Asn Ala Gly Gln 290 295 300 Ile Cys Ser Ser Gly Ser Arg Ile Tyr Val Gln Glu Gly Ile Tyr Asp 305 310 315 320 Glu Leu Leu Ala Ala Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Thr Glu Ile Lys Val 325 330 335 Gly Asn Pro Phe Asp Lys Ala Asn Phe Gln Gly Ala Ile Thr Asn Arg 340 345 350 Gln Gln Phe Asp Thr Ile Met Asn Tyr Ile Asp Ile Gly Lys Lys Glu 355 360 365 Gly Ala Lys Ile Leu Thr Gly Gly Glu Lys Val Gly Asp Lys Gly Tyr 370 375 380 Phe Ile Arg Pro Thr Val Phe Tyr Asp Val Asn Glu Asp Met Arg Ile 385 390 395 400 Val Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Thr Val Ala Lys Phe Lys 405 410 415 Thr Leu Glu Glu Gly Val Glu Met Ala Asn Ser Ser Glu Phe Gly Leu 420 425 430 Gly Ser Gly Ile Glu Thr Glu Ser Leu Ser Thr Gly Leu Lys Val Ala 435 440 445 Lys Met Leu Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asp Phe 450 455 460 Asp Ser Arg Val Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Tyr Gly Arg 465 470 475 480 Glu Met Gly Glu Glu Val Tyr His Ala Tyr Thr Glu Val Lys Ala Val 485 490 495 Arg Ile Lys Leu 500 <210> 54 <211> 506 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 54 Met Pro Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Pro Gln Leu Lys Ile Ser 1 5 10 15 Leu Lys Gln Pro Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Cys Pro Ser 20 25 30 Ser Asp Gly Lys Thr Ile Glu Thr Val Asn Pro Ala Thr Gly Glu Pro 35 40 45 Ile Thr Ser Phe Gln Ala Ala Asn Glu Lys Asp Val Asp Lys Ala Val 50 55 60 Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Asp Asn Val Trp Ser Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80 Glu Gln Arg Gly Ile Tyr Leu Ser Asn Leu Leu Lys Leu Ile Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Ala Gly Lys Pro 100 105 110 Tyr His Ser Asn Ala Lys Gly Asp Leu Ala Gln Ile Leu Gln Leu Thr 115 120 125 Arg Tyr Phe Ala Gly Ser Ala Asp Lys Phe Asp Lys Gly Ala Thr Ile 130 135 140 Pro Leu Thr Phe Asn Lys Phe Ala Tyr Thr Leu Lys Val Pro Phe Gly 145 150 155 160 Val Val Ala Gln Ile Val Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ala Cys 165 170 175 Trp Lys Leu Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn Thr Val Ile Ile Lys 180 185 190 Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Phe Ala Thr Leu Ile 195 200 205 Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly Tyr 210 215 220 Gly Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Ala Ser His Met Asp Ile Asp Lys 225 230 235 240 Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly Phe Val Leu Glu Ala 245 250 255 Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Val Thr Leu Glu Cys Gly Gly Lys 260 265 270 Ser Pro Ala Leu Val Phe Glu Asp Ala Asp Leu Asp Lys Ala Ile Asp 275 280 285 Trp Ile Ala Ala Gly Ile Phe Tyr Asn Ser Gly Gln Asn Cys Thr Ala 290 295 300 Asn Ser Arg Val Tyr Val Gln Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Val Glu 305 310 315 320 Lys Phe Lys Glu Thr Ala Lys Lys Glu Trp Asp Val Ala Gly Lys Phe 325 330 335 Asp Pro Phe Asp Glu Lys Cys Ile Val Gly Pro Val Ile Ser Ser Thr 340 345 350 Gln Tyr Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Arg Glu Glu 355 360 365 Lys Leu Asp Met Phe Gln Thr Ser Glu Phe Pro Ile Gly Gly Ala Lys 370 375 380 Gly Tyr Phe Ile Pro Pro Thr Ile Phe Thr Asp Val Pro Gln Thr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Leu Gln Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Val Val Ser Lys 405 410 415 Phe Thr Asn Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Asp Thr Cys Tyr 420 425 430 Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys Lys Ala His Met 435 440 445 Phe Ala Arg Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Ser Ser Asn 450 455 460 Asp Glu Asp Val Thr Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Ile 465 470 475 480 Gly Arg Glu Leu Gly Gln Ser Gly Val Asp Thr Tyr Leu Gln Thr Lys 485 490 495 Ala Val His Ile Asn Leu Ser Leu Asp Asn 500 505 <210> 55 <211> 506 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 55 Met Pro Thr Leu Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Pro Gln Leu Lys Ile Ser 1 5 10 15 Leu Lys Gln Pro Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Cys Pro Ser 20 25 30 Ser Asp Gly Lys Thr Ile Glu Thr Val Asn Pro Ala Thr Gly Glu Pro 35 40 45 Ile Thr Ser Phe Gln Ala Ala Asn Glu Lys Asp Val Asp Lys Ala Val 50 55 60 Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Asp Asn Val Trp Ser Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80 Glu Gln Arg Gly Ile Tyr Leu Ser Asn Leu Leu Lys Leu Ile Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Ala Gly Lys Pro 100 105 110 Phe His Ser Asn Ala Lys Gln Asp Leu Ala Gln Ile Ile Glu Leu Thr 115 120 125 Arg Tyr Tyr Ala Gly Ala Val Asp Lys Phe Asn Met Gly Glu Thr Ile 130 135 140 Pro Leu Thr Phe Asn Lys Phe Ala Tyr Thr Leu Lys Val Pro Phe Gly 145 150 155 160 Val Val Ala Gln Ile Val Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Ala Met Ala Cys 165 170 175 Arg Lys Met Gln Gly Ala Leu Ala Ala Gly Asn Thr Val Ile Ile Lys 180 185 190 Pro Ala Glu Asn Thr Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Phe Ala Thr Leu Ile 195 200 205 Lys Lys Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Val Ile Pro Gly Tyr 210 215 220 Gly Ser Val Val Gly Lys Ala Leu Gly Thr His Met Asp Ile Asp Lys 225 230 235 240 Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Lys Val Gly Gly Ser Val Leu Glu Ala 245 250 255 Ser Gly Gln Ser Asn Leu Lys Asp Ile Thr Leu Glu Cys Gly Gly Lys 260 265 270 Ser Pro Ala Leu Val Phe Glu Asp Ala Asp Leu Asp Lys Ala Ile Glu 275 280 285 Trp Val Ala Asn Gly Ile Phe Phe Asn Ser Gly Gln Ile Cys Thr Ala 290 295 300 Asn Ser Arg Val Tyr Val Gln Ser Ser Ile Tyr Asp Lys Phe Val Glu 305 310 315 320 Lys Phe Lys Glu Thr Ala Lys Lys Glu Trp Asp Val Ala Gly Lys Phe 325 330 335 Asp Pro Phe Asp Glu Lys Cys Ile Val Gly Pro Val Ile Ser Ser Thr 340 345 350 Gln Tyr Asp Arg Ile Lys Ser Tyr Ile Glu Arg Gly Lys Lys Glu Glu 355 360 365 Lys Leu Asp Met Phe Gln Thr Ser Glu Phe Pro Ile Gly Gly Ala Lys 370 375 380 Gly Tyr Phe Ile Pro Pro Thr Ile Phe Thr Asp Val Pro Glu Thr Ser 385 390 395 400 Lys Leu Leu Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Val Val Ser Lys 405 410 415 Phe Thr Asn Tyr Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn Asp Thr Cys Tyr 420 425 430 Gly Leu Ala Ser Ala Val Phe Thr Lys Asp Val Lys Lys Ala His Met 435 440 445 Phe Ala Arg Asp Ile Lys Ala Gly Thr Val Trp Ile Asn Gln Thr Asn 450 455 460 Gln Glu Glu Ala Lys Val Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Ile 465 470 475 480 Gly Arg Glu Ser Gly Asp Thr Gly Val Asp Asn Tyr Leu Gln Ile Lys 485 490 495 Ser Val His Val Asp Leu Ser Leu Asp Lys 500 505

Claims (48)

  1. 야생형 대조군과 비교하여 증가된 펜탄산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 세포.
  2. 야생형 대조군과 비교하여 증가된 2-메틸부티르산 생합성을 나타내도록 변형된 재조합 미생물 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물 세포가 진균 세포인 재조합 미생물 세포.
  4. 제3항에 있어서, 진균 세포가 사카로미세타세아에(Saccharomycetaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  5. 제3항에 있어서, 진균 세포가 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)인 재조합 세포.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물 세포가 박테리아 세포인 재조합 세포.
  7. 제6항에 있어서, 박테리아 세포가 프로토박테리아(Protobacteria) 문의 구성원인 재조합 세포.
  8. 제7항에 있어서, 박테리아 세포가 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  9. 제8항에 있어서, 박테리아 세포가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인 재조합 세포.
  10. 제7항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나세아에(Pseudomonaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  11. 제10항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)인 재조합 세포.
  12. 제6항에 있어서, 박테리아 세포가 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 구성원인 재조합 세포.
  13. 제12항에 있어서, 박테리아 세포가 바실라세아에(Bacillaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  14. 제13항에 있어서, 박테리아 세포가 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 재조합 세포.
  15. 제12항에 있어서, 박테리아 세포가 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  16. 제15항에 있어서, 박테리아 세포가 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)인 재조합 세포.
  17. 제12항에 있어서, 박테리아 세포가 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 과의 구성원인 재조합 세포.
  18. 제17항에 있어서, 박테리아 세포가 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum)인 재조합 세포.
  19. 제6항에 있어서, 박테리아 세포가 시아노박테리아(Cyanobacteria) 문의 구성원인 재조합 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포가 광합성 세포인 재조합 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 세포가 셀룰로스분해성 세포인 재조합 세포.
  22. 제1항 및 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 대조군과 비교하여 증가된 펜탄산 생합성이 야생형 대조군과 비교하여 L-아스파르테이트에서 L-트레오닌으로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 L-트레오닌에서 2-케토부티레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토부티레이트 신장 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 2-케토발레레이트 신장 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 예정된 기질에 대한 케토산 데카르복실라제 선택성의 증가, 또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함하는 것인 재조합 세포.
  23. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 대조군과 비교하여 증가된 2-메틸부티르산 생합성이 야생형 대조군과 비교하여 L-아스파르테이트에서 L-트레오닌으로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 L-트레오닌에서 2-케토부티레이트로의 전환의 증가, 2-케토부티레이트에서 2-케토-3-메틸발레레이트로의 전환의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 케토산 데카르복실라제 활성의 증가, 야생형 대조군과 비교하여 예정된 기질에 대한 케토산 데카르복실라제 선택성의 증가, 또는 야생형 대조군과 비교하여 알데히드 데히드로게나제 활성의 증가를 포함하는 것인 재조합 세포.
  24. 제1항 및 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 상기 재조합 세포가 펜탄산을 생산하는 데 효과적인 조건하에 탄소원을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 탄소원은 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트, 발레르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  25. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 세포를 상기 재조합 세포가 2-메틸부티르산을 생산하는 데 효과적인 조건하에 탄소원을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 탄소원은 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토-3-메틸발레레이트, 2-메틸 부티르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 탄소원에서 펜탄산으로의 전환을 촉매하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 변형된 숙주 세포가 탄소원에서 펜탄산으로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 탄소원이 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트, 발레르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  28. 탄소원에서 2-메틸부티르산으로의 전환을 촉매하는 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 1종 이상의 폴리뉴클레오티드는 변형된 숙주 세포가 탄소원에서 2-메틸부티르산으로의 전환을 촉매하도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 탄소원이 글루코스, 피루베이트, L-아스파르테이트, L-트레오닌, 2-케토부티레이트, 2-케토-3-메틸발레레이트, 2-메틸 부티르알데히드, CO2, 셀룰로스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 진균 세포인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 진균 세포가 사카로미세타세아에 과의 구성원인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 진균 세포가 사카로미세스 세레비지아에, 칸디다 루고사 또는 칸디다 알비칸스인 방법.
  33. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아 세포인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 박테리아 세포가 프로토박테리아 문의 구성원인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 박테리아 세포가 엔테로박테리아세아에 과의 구성원인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 박테리아 세포가 에스케리키아 콜라이인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나세아에 과의 구성원인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 박테리아 세포가 슈도모나스 푸티다인 방법.
  39. 제33항에 있어서, 박테리아 세포가 피르미쿠테스 문의 구성원인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 박테리아 세포가 바실라세아에 과의 구성원인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 박테리아 세포가 바실루스 서브틸리스인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 박테리아 세포가 스트렙토코카세아에 과의 구성원인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 박테리아 세포가 락토코쿠스 락티스인 방법.
  44. 제39항에 있어서, 박테리아 세포가 클로스트리디아세아에 과의 구성원인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 박테리아 세포가 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰인 방법.
  46. 제33항에 있어서, 박테리아 세포가 시아노박테리아 문의 구성원인 방법.
  47. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 광합성 세포인 방법.
  48. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 셀룰로스분해성 세포인 방법.
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