JP2015515866A - 生合成経路、組換え細胞及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、一般に、増大したペンタン酸生合成を示すように改変された組換え細胞、そのような組換え細胞を作製する方法、及びペンタン酸を産生するように該細胞を誘導する方法を記載する。本開示はまた、一般に、増大した２−メチル酪酸生合成を示すように改変された組換え細胞、そのような組換え細胞を作製する方法、及び２−メチル酪酸を産生するように該細胞を誘導する方法も記載する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６４５，９００号の優先権を主張する。

要約
一態様において、本開示は、野生型対照に比べて増大したペンタン酸生合成を示すように改変された組換え細胞を記載する。別の態様において、本開示は、野生型対照に比べて増大した２−メチル酪酸生合成を示すように改変された組換え細胞を記載する。

各態様において、組換え細胞は、真菌細胞又は細菌細胞であることができる。各態様において、組換え細胞は、光合成を行うものであることができる。各態様において、組換え細胞は、セルロース分解性であることができる。

組換え細胞が増大したペンタン酸生合成を示す態様において、増大したペンタン酸生合成は、Ｌ−アスパラギン酸からＬ−スレオニンへの変換の野生型対照に比べた増大、Ｌ−スレオニンから２−ケト酪酸への変換の野生型対照に比べた増大、２−ケト酪酸伸長活性の野生型対照に比べた増大、２−ケト吉草酸伸長活性の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大、所定の基質に対するケト酸デカルボキシラーゼ選択性の野生型対照に比べた増大、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を含むことができる。

組換え細胞が増大した２−メチル酪酸生合成を示す態様において、増大した２−メチル酪酸生合成は、Ｌ−アスパラギン酸からＬ−スレオニンへの変換の野生型対照に比べた増大、Ｌ−スレオニンから２−ケト酪酸への変換の野生型対照に比べた増大、２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への変換の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大、所定の基質に対するケト酸デカルボキシラーゼ選択性の野生型対照に比べた増大、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を含むことができる。

別の態様において、本開示は、一般に、増大したペンタン酸生合成を示す組換え細胞を、組換え細胞がペンタン酸を産生するために有効な条件下、炭素供給源を含む培地中でインキュベートするステップを含む方法を記載する。いくつかの実施態様において、炭素供給源は、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、バレルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含むことができる。

別の態様において、本開示は、一般に、増大した２−メチル酪酸生合成を示す組換え細胞を、組換え細胞が２−メチル酪酸を産生するために有効な条件下、炭素供給源を含む培地中でインキュベートするステップを含む方法を記載する。いくつかの実施態様において、炭素供給源は、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−メチルブチルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含むことができる。

別の態様において、本開示は、一般に、炭素供給源のペンタン酸への変換を触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを、宿主細胞中に導入するステップを含む方法であって、改変された宿主細胞が炭素供給源のペンタン酸への変換を触媒するように、少なくとも１つのポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に連結される、上記方法を記載する。

別の態様において、本開示は、一般に、炭素供給源の２−メチル酪酸への変換を触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを、宿主細胞中に導入するステップを含む方法であって、改変された宿主細胞が炭素供給源の２−メチル酪酸への変換を触媒するように、少なくとも１つのポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に連結される、上記方法を記載する。

本発明の上記要約は、開示された各実施態様又は本発明の各実施を記載することを目的とするものでない。以下の記載は、例示的な実施態様をより具体的に例解する。本願のいくつかの場所において、例のリストを介してガイダンスが提供され、これらの例は、多様な組合せで使用されることができる。各場合において、挙げられたリストは、代表的な群としての役割のみを果たし、排他的なリストと解釈されるべきでない。

２−メチル酪酸（２ＭＢ）及びペンタン酸（ＰＡ）の生成経路。１−ブテン及び２−ブテンからの２−メチル酪酸及びペンタン酸への化学的プロセス。 ２−メチル酪酸（２ＭＢ）及びペンタン酸（ＰＡ）の生成経路。グルコースからの２−メチル酪酸の合成のための代謝経路。 ２−メチル酪酸（２ＭＢ）及びペンタン酸（ＰＡ）の生成経路。グルコースからのペンタン酸の合成のための代謝経路。 （Ａ）２−メチル酪酸（２ＭＢ）産生のための合成オペロン。（Ｂ）ペンタン酸（ＰＡ）産生のための合成オペロン。ＤＣ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ；ＤＨ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。 異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼによる発酵実験の結果。２−メチル酪酸産生に関するアルデヒドデヒドロゲナーゼの比較。 異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼによる発酵実験の結果。ペンタン酸産生に関するアルデヒドデヒドロゲナーゼの比較。 異なるケト酸デカルボキシラーゼによる発酵実験の結果。２−メチル酪酸産生に関するケト酸デカルボキシラーゼの比較。 異なるケト酸デカルボキシラーゼによる発酵実験の結果。ペンタン酸産生に関するケト酸デカルボキシラーゼの比較。 ケト酸デカルボキシラーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼの組合せに関する発酵実験の結果。２−メチル酪酸産生に関する多様な組合せの比較。 ケト酸デカルボキシラーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼの組合せに関する発酵実験の結果。ペンタン酸産生に関する多様な組合せの比較。

例示的な実施態様の詳細な説明
以下の代表的な実施態様の説明において、一定の代謝酵素及びそれら酵素の天然源が特定される。これらは、好適な酵素及び特定された酵素の好適な供給源の例に過ぎない。同様の触媒活性を有する別の酵素が、異なる微生物種又は菌株から得ることのできるホモログとして考えられる。したがって、本明細書に記載の代表的実施態様は、請求項に反映される微生物及び方法の範囲を限定すると解釈されるべきでない。

ペンタン酸及び２−メチル酪酸は、可塑剤、潤滑剤及び医薬品などの多様な用途のための化学的中間体としての役割を果たす。本開示は、これら２つの酸を生合成するためのエシェリキア・コリ（Escherichia coli）における合成代謝経路の構築を記載し：ペンタン酸を産生するために天然のロイシン生合成経路が改変され；２−メチル酪酸を産生するために天然のイソロイシン生合成経路が改変された。多様なアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び２−ケト酸デカルボキシラーゼが、構築された経路におけるそれらの活性に関して検討された。振とうフラスコ発酵における酵素の最適な組合せによって、２−メチル酪酸については２．５９ｇ／Ｌの最高のタイター及びペンタン酸については２．５８ｇ／Ｌの最高のタイターが達成された。この研究は、大量の脂肪酸の再生可能な生産の実行可能性を実証する。

原油は、エネルギー及び工業用有機化合物の主な供給源である。しかしながら、原油埋蔵量は活発に消耗されて、燃料及び化学物質への持続可能なルートの開発をより魅力的なものとしている。この課題に取り組むためには、微生物を操作して非天然の化学中間体を生産することを含む生合成アプローチをとることができる。非天然代謝物の生産は、操作及び合成代謝経路の開発を含むことができる。この研究において、グルコース又は他の好適な炭素源からのペンタン酸（ＰＡ）及び２−メチル酪酸（２ＭＢ）の再生可能な生産のための生合成ストラテジーが開発された。

ペンタン酸及び２−メチル酪酸の総米国消費量は、２００５年に約１４，０００メートルトンであった（Ｄｏｗ． Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：Ｉｓｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ． Ｔｈｅ Ｄｏｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｏｐａｎｙ ２００８）。これらの化学物質は、可塑剤、潤滑剤及び医薬品などの様々な用途のための中間体となることができる。それらは、炭化水素からのメルカプタンの抽出のためにも使用される。ペンタン酸のエステルは、それらがガソリン及びディーゼルの両方において非常に高い混合比率で使用可能であるため、ペンタンバイオ燃料として注目されてきている（Ｌａｎｇｅら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄｉｔ ２０１０；４９；４４７９−４４８３）。商業的には、これらの化学物質は、石油ベースの化合物が合成ガスと反応させられるプロセスを通じてそれぞれ作られる、バレルアルデヒド及び／又は２−メチルブチルアルデヒドを酸化することによって典型的に製造される（Ｄｏｗ． Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：Ｉｓｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ Ａｃｉｄ． Ｔｈｅ Ｄｏｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ ２００８）。該プロセスは、合成ガスのような毒性中間体及び非再生可能な石油ベースの原料を使用するため、これらの化学物質への持続可能なルートが必要とされている。これらの化学物質への潜在的な代替ルートとして、生合成が提示される。

操作された生合成経路の１つの利益は、微生物間での天然の生合成経路の保存である。したがって、新たに操作された生合成経路が１つの微生物において確立されたら、それは、他の微生物においてしばしば使用されることができる。この研究において、Ｅ．コリ（E.coli）宿主細胞中に異種（非天然）酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び／又は２−ケト酸デカルボキシラーゼを導入することによって、Ｅ．コリにおける天然のロイシン及びイソロイシン生合成経路が改変された。２−メチル酪酸及びペンタン酸への代表的な合成代謝経路が、図１Ｂ及び図１Ｃにそれぞれ示される。両経路に共通の中間体は、２−ケト酪酸（２ＫＢ）であり、これは、生合成デアミナーゼＩｌｖＡによってスレオニンから得られる。ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ及びｔｈｒＣの過剰発現は、スレオニン生合成へ（Ｚｈａｎａｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０；１０７：６２３４−６２３９）、ひいては合成代謝経路へ炭素流を推進して、ペンタン酸及び／又は２−メチル酪酸を産生することができる。

図１Ｂに示される２−メチル酪酸の合成のためには、２−ケト酪酸が、２−メチル酪酸への最後から２番目の前駆体である２−ケト−３−メチル吉草酸（ＫＭＶ）の合成に推し進められる。２−ケト酪酸とピルビン酸の２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（ＡＨＢ）への縮合は、ＩｌｖＧ及びＩｌｖＭによって触媒される。別の２つの酵素ＩｌｖＣ及びＩｌｖＤは、ＡＨＢのＫＭＶへの変換を触媒することができる。次いで、ＫＭＶは、ケト酸デカルボキシラーゼ（ＤＣ）によって、２−メチルブチルアルデヒドに脱炭酸され、これは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）によって２−メチル酪酸に酸化されることができる。

ペンタン酸の合成のためには、２−ケト酪酸が２サイクルの「＋ｌ」炭素鎖伸長を受けて２−ケトカプロン酸（２ＫＣ）を作ることができる。天然のロイシン生合成経路においては、２−ケトイソ吉草酸が、２−イソプロピルマレートシンテターゼ（ＬｅｕＡ）、イソプロピルマレートイソメラーゼ複合体（ＬｅｕＣ、ＬｅｕＤ）及び３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ）により触媒される３ステップの鎖伸長サイクルを経由して２−ケトイソカプロン酸に変換される。しかしながら、発明者らの合成経路においては、ＬｅｕＡ、ＬｅｕＢ、ＬｅｕＣ、及びＬｅｕＤは、同様に２−ケト酪酸を２−ケト吉草酸に伸長し、次いで、２−ケト吉草酸を２−ケトカプロン酸に伸長するのに十分フレキシブルである（４）。次いで、２−ケトカプロン酸は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＤＣ）によって、バレルアルデヒドに脱炭酸され、これはデヒドロゲナーゼ（ＤＨ）によってペンタン酸に酸化されることができる。

２−メチル酪酸及びペンタン酸の生合成のための代謝経路の構築
２−メチル酪酸（２ＭＢ）及びペンタン酸（ＰＡ）の産生のための生合成スキームを、それぞれ図１Ｂ及び図１Ｃに示す。アスパラギン酸生合成の下流のすべての酵素が、３つの合成オペロンから過剰発現された。１つのオペロンは、ＴｈｒＡ、ＴｈｒＢ及びＴｈｒＣのためのコード領域を含み、そのそれぞれが、スペクチノマイシン耐性マーカーを担持する低コピープラスミドｐＩＰＡ１上のＰ_LｌａｃＯ１プロモーターの制御下でスレオニン合成に関与する。２−メチル酪酸合成のためには（図１Ｂ）、ｉｌｖＡ、ｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＣ及びｉｌｖＤが、カナマイシン耐性マーカーによって低コピープラスミドでクローン化されてｐＩＰＡ２を得る。同様に、ペンタン酸の合成のためには、ｉｌｖＡ、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤが、カナマイシン耐性マーカーを担持する低コピープラスミドｐＩＰＡ３上にクローン化された。多様なアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びケト酸デカルボキシラーゼが、アンピリシン耐性マーカーを担持する高コピープラスミド（ｐＩＰＡ４からｐＩＰＡ１５、表２）上の転写順ＤＣ−ＤＨ（２−ケト酸デカルボキシラーゼ−デヒドロゲナーゼ）でＰＬｌａｃＯ１プロモーター下に存在した。

スレオニンが両経路における共通の中間体であるため、スレオニンを過剰産生するＥ．コリ株ＡＴＣＣ９８０８２を研究において使用した。該株は、スレオニンの高い細胞内レベルを保証するためにスレオニンエクスポーター遺伝子ｒｈｔＡを除去され、並びに各アルコールに導く副反応を除くためにアルコールデヒドロゲナーゼｙｑｈＤ遺伝子の欠失を有した（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０；１０７：６２３４−６２３９）。結果として生じた株は、以下、ＰＡ１株と呼ばれる。

図１Ｂ及び図１Ｃに示す合成経路は、ケト酸、２−ケト−３−メチル吉草酸（図１Ｂ）及び２−ケトカプロン酸（２ＫＣ、図１Ｃ）のそれらの各アルデヒドへの脱炭酸、続くアルデヒドのカルボン酸への酸化を含むように設計された。イソ酪酸の生成に関する発明者らの先の研究（Ｚｈａｎｇら、ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ ２０１１；４：１０６８−１０７０）に基づき、発明者らは、標的化学物質の産生をチェックするために、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）からの野生型２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼＫＩＶＤ（ｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２００４；２３８：３６７−３７４）及びＥ．コリからのフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＰａｄＡ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｚａｖａｌａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００６；１５：１３８７−１３９６）をクローン化した。ＰＡ１株は、プラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ２及びｐＩＰＡ４で形質転換されて、２−メチル酪酸を産生した。ＰＡ１株は、プラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ３及びｐＩＰＡ４で形質転換されて、ペンタン酸を産生した。各組換え株を用いて振とうフラスコ発酵を実施した。このアプローチを用いて、発明者らは、２．２６ｇ／Ｌの２−メチル酪酸及び２．１２ｇ／Ｌのペンタン酸を生成し、発明者らの生合成アプローチの実行可能性を実証した。

アルデヒドデヒドロゲナーゼのスクリーニング
産生タイターを改善するために、異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼを選ぶことの効果を調べた（図３Ａ及び図３Ｂ）。６つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ：Ｅ．コリからのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｌｄＢ（Ｈｏ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ、 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００５；１８７：１０６７−１０７３）、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｌｄＨ（Ｊｏら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８；８１：５１−６０）、フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼＰａｄＡ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｚａｖａｌａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００６；１５：１３８７−１３９６）、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼＧａｂＤ（Ｂａｒｔｓｃｈら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９０；１７２：７０３５−７０４２）、γ−アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼＹｄｃＷ（Ｇｒｕｅｚら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００４；３４３：２９−４１）及びバークホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria）からのα−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼＫＤＨ_ba（Ｊｏら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ ２００８；８１：５１−６０）をこの研究のための候補酵素として選んだ。図２に示す３つの合成オペロンによって菌株が構築された。菌株に導入された、アルデヒドデヒドロゲナーゼを除くすべての異種酵素は、菌株にわたって同一であった。各菌株について、２−ケト酸デカルボキシラーゼとして野生型ＫＩＶＤが選ばれた。振とうフラスコ発酵が３０℃で実施され、ＨＰＬＣによってサンプルが分析された。最大量の所望の生成物を産生した菌株−すなわちアルデヒドデヒドロゲナーゼ−を同定するために発酵が分析された。

異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼの２−メチル酪酸を産生する活性を比較するために、ＰＡ１株がプラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ２及びｐＩＰＡ４からｐＩＰＡ９のいずれか１つによって形質転換された。発酵後、最高のタイターである２．５１ｇ／Ｌが、ＡｌｄＨによって達成された一方、ＡｌｄＢ、ＰａｄＡ、ＫＤＨ_ba、ＧａｂＤ及びＹｄｃＷは、それぞれ、２．３１ｇ／Ｌ、２．２６ｇ／Ｌ、０．６７ｇ／Ｌ、０．１４ｇ／Ｌ及び０．２３ｇ／Ｌを産生した（図３Ａ）。

ペンタン酸の産生のために、ＰＡ１株がプラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ３及びｐＩＰＡ４からｐＩＰＡ９のいずれか１つによって形質転換された。ＫＤＨ_baが、ペンタン酸の産生に関して最も活性なアルデヒドデヒドロゲナーゼであること（２．２５ｇ／Ｌ）が見出された一方、ＡｌｄＨ、ＡｌｄＢ、ＰａｄＡ、ＧａｂＤ及びＹｄｃＷは、それぞれ、１．７６ｇ／Ｌ、０．４２ｇ／Ｌ、２．１２ｇ／Ｌ、０．５４ｇ／Ｌ、及び０．２２ｇ／Ｌを産生した（図３Ｂ）。

２−ケト酸デカルボキシラーゼのスクリーニング
発酵中に、酢酸、プロピオン酸、酪酸及び３−メチル酪酸などの数種の代謝副産物が観察された。ラクトコッカス・ラクティスからの野生型ケト酸デカルボキシラーゼＫＩＶＤ（ｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２００４；２３８：３６７−３７４）及び数種のその突然変異体が、標的Ｃ５酸の収量の増加及び副産物形成の減少に関して調査された。単一アミノ酸置換突然変異Ｖ４６１Ａが、より大きな基質に対するＫＩＶＤの特異性を増大させることが報告された。Ｖ４６１Ａ突然変異とそれぞれ組み合わせた他の３つの突然変異Ｍ５３８Ａ、Ｆ３８１Ｌ及びＦ５４２Ｌが調査された。これらの突然変異は、重要な位置におけるかさ高い残基をより小さな疎水性残基で置換する。サルモネラ・ティフィムリウムからのインドールピルベートデカルボキシラーゼ（ＩＰＤＣ）も試験した。異なる２−ケト酸デカルボキシラーゼによってプラスミドを構築したが、すべて同じアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＰａｄＡ）及び他の酵素を有した。

２−メチル酪酸合成のために選択された２−ケト酸デカルボキシラーゼの活性を比較するために、ＰＡ１株がプラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ２及びｐＩＰＡ１０からｐＩＰＡ１３のいずれか１つによって２−メチル酪酸に関して形質転換された。ペンタン酸合成のために選択された２−ケト酸デカルボキシラーゼの活性を比較するために、ＰＡ１株がプラスミドｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ３及びｐＩＰＡ１０からｐＩＰＡ１３のいずれか１つによってペンタン酸合成に関して形質転換された。振とうフラスコ発酵は、ＩＰＤＣが２−メチル酪酸（２．５ｇ／Ｌ）又はペンタン酸（２．１４ｇ／Ｌ）のいずれの産生に関しても、ＫＩＶＤ又はそのいずれの突然変異体よりもうまく機能したことを示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。

２−メチル酪酸の産生のためのすべての候補アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び２−ケト酸デカルボキシラーゼの中でも、ＡｌｄＨ及びＩＰＤＣが最高の活性を有することを確立したため、効果が相加的であるか否かを調べるために、それらを一緒に併合した（ｐＩＰＡ１４）。組み合わせると、２−メチル酪酸タイターは２．５９ｇ／Ｌに達し、ＷＴ ＫＩＶＤと一緒のＡｌｄＨについての２．５１ｇ／Ｌｇ／Ｌ又はＩＰＤＣと一緒のＰａｄＡについての２．５ｇ／Ｌよりもわずかに高いだけであった（図５Ａ）。同様に、ペンタン酸産生のために、ＫＤＨ_baがＩＰＤＣと一緒にクローン化された（ｐＩＰＡ１５）。これは、ペンタン酸タイターを２．５８ｇ／Ｌまで増大させた。比較すると、産生タイターは、ＷＴ ＫＩＶＤと一緒のＫＤＨ_baについて２．２５ｇ／Ｌ又はＩＰＤＣと一緒のＰａｄＡについて２．１４ｇ／Ｌであった（図５Ｂ）。

酵素の精製及び特徴づけ
最も活性なケト酸デカルボキシラーゼであるＩＰＤＣ及び最も活性なアルデヒドデヒドロゲナーゼであるＡｌｄＨ及びＫＤＨ_baが、構築された経路に関与する基質に対するそれらの活性について特徴づけされた。ＡｌｄＨは、Ｈｉｓ−ｔａｇプラスミドから発現され、精製された。ＩＰＤＣ及びＫＤＨ_baは、先の研究から利用可能であった。反応速度論的パラメータが、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨ吸収をモニターすることによって測定された。Ｋ_cat及びＫ_Mの値が表１に示される。

実際にこれらの酵素が標的基質に対する優れた活性を有することを確認するために、インビトロの酵素アッセイが実施された。３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸収をモニターすることによって、反応速度論的パラメータが測定された。ＩＰＤＣの活性は、共役酵素反応法を用いて測定された。触媒反応速度定数（ｋ_cat）及びミカエリス・メンテン定数（Ｋ_M）の値が表１に示される。２−ケト−３−メチル吉草酸に関するＩＰＤＣのＫ_M及びｋ_catは、０．８５ｍＭ及び４．１３ｓ^-1と決定されたが、２−ケトカプロン酸に関するＫ_M及びｋ_catは、それぞれ０．６３ｍＭ及び１．８９ｓ^-1であった。両基質に関するＩＰＤＣの特異性定数Ｋ_cat／Ｋ_Mは、非常に近似していた。２−メチルブチルアルデヒドに関するＡＬｄＨのＫ_M及びｋ_catは、１．８９ｍＭ及び３．５５ｓ^-1であることがわかった。ＫＤＨ_baは、イソブチルアルデヒド（３４．５ｍＭ）及びイソバレルアルデヒド（７．６２ｍＭ）などのより小さな又は分岐した基質に比べて、バレルアルデヒドに対して顕著に低いＫ_M（０．０３１ｍＭ）を有するが、同様のｋ_cat値を有する（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１２；２）。したがって、ＫＤＨ_baのバレルアルデヒドに対する特異性定数（Ｋ_cat／Ｋ_M）は、イソブチルアルデヒド及びイソバレルアルデヒドに対するそれよりも１２６０倍及び３０８倍高い。

ペンタン酸及び２−メチル酪酸は、化学工業において価値のある２つの化学中間体である。本研究の目的は、これらの化学物質を合成するための生合成アプローチの実行可能性を調査することである。発明者らは、天然のロイシン及びイソロイシン生合成経路を改変して、これらの非天然化学物質をＥ．コリ中で生産することに成功した。該経路に関与する異種酵素は、該酵素をコードするポリヌクレオチドを合成オペロン中にクローニングすることによって、過剰発現された。本明細書中に例示される設計された経路は、ケト酸、２−ケト−３−メチル吉草酸及び２−ケトカプロン酸の各アルデヒドへの脱炭酸、続くカルボン酸への酸化を含む。この研究において発明者らは、産生量を改善するために、これら最後の２つのステップを検討した。発明者らは、その標的化学物質の産生を調査するために、野生型ｋｉｖＤ及びｐａｄＡをクローン化した。発明者らは、２日間の振とうフラスコ発酵後に、４０ｇ／Ｌのグルコースから２−メチル酪酸に関して２．２６ｇ／Ｌ、ペンタン酸に関して２．１２ｇ／Ｌの産生レベルを観察した。これは、発明者らの生合成アプローチの実行可能性を確認した。

次いで、産生タイターを改善するために、発明者らは、産生タイターに対する異なるアルデヒドデヒドロゲナーゼの効果を振とうフラスコ発酵において検討した。ペンタン酸産生に関して検討されたものの中で、ＫＤＨ_baが最も有効なアルデヒドデヒドロゲナーゼであることが見出された。２−メチル酪酸産生に関して検討されたものの中では、ＡｌｄＨが最も有効なアルデヒドデヒドロゲナーゼであると判明した。

２−メチル酪酸又はペンタン酸を生成するための発酵の間に、プロピオン酸、酪酸及び３−メチル酪酸などの数種の副産物が観察された。したがって、発明者らは、生合成をこれらの副産物を離れて２―メチル酪酸又はペンタン酸に向かわせることによって、その標的生成物の産生をさらに増加させようとした。Ｋ_ivＤの突然変異体は、より大きなケト酸基質への脱炭酸活性を増大させることが先に示された（Ｂａｒｔｓｃｈら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９０；１７２：７０３５−７０４２）。したがって、発明者らは、副産物を減少させることによって標的化合物の産生を増加させるそれらの能力に関して、Ｋ_ivＤを数種のＫ_ivＤ突然変異体及びＩＰＤＣと比較した。望ましくない副産物を離れて所望の化合物に生合成を向かわせることにおいて、ＩＰＤＣが最も有効であった。したがって、発明者らは、ＩＰＤＣ−ＡｌｄＨによる２−メチル酪酸に関する２．５９ｇ／Ｌの産生タイター及びＩＰＤＣ−ＫＤＨ_baによるペンタン酸に関する２．５８ｇ／Ｌの産生タイターを達成することができた。この産生は、ペンタン酸及び２−メチル酪酸に関する、２２．１％及び１６．６％の収率の理論的最大値（０．２８ｇ／ｇのグルコース及び０．３８ｇ／ｇのグルコース）にそれぞれ相当する。最後に、これらの酵素の活性を確認するため、及び反応速度論的パラメータを見出すために酵素アッセイを実施した。

この研究は、これら化学物質の再生可能な生産の実行可能性を実証する。発明者らの知る限りでは、これはＣ５モノカルボン酸合成に関する代謝工学の最初の報告である。この研究は、酸の産生のための好気的プロセスの使用も実証する。酸を産生可能な生物は、典型的にそれを嫌気的条件下で行い、これは、大量のアセテート産生ももたらし、グルコースからの収量を減少させる。好気的プロセスの使用は、よりよい制御を可能とし、発酵ブロス中のアセテートレベルを減少させるだろう。これは、タンク中を空気が通過することによって酸素が供給される、撹拌タンク型発酵槽を注意深く操作することによって達成可能である。そのような発酵槽は、高い細胞密度も達成することができ、これは、所望の生成化合物のより大きな産生に導くことができる。

本明細書に記載の生合成ストラテジーは、そのようなプラットフォーム化学物質の持続可能な生産への有望な進歩である。さらに、本明細書に記載の生合成経路は、宿主の自然のアミノ酸生合成経路の改変形であり、それらの自然の生合成経路は種にわたって高度に保存され、本明細書に記載の生合成の改変は、さらなる様々な生物の自然の生合成経路に適用されうる。

したがって、一態様において、本発明は、野生型対照に比べて増大したペンタン酸生合成を示すように改変された組換え微生物細胞を提供する。別の態様において、本発明は、野生型対照に比べて増大した２−メチル酪酸生合成を示すように改変された組換え微生物細胞を提供する。いくつかの場合において、野生型対照は、ペンタン酸又は２−メチル酪酸を生成することができないかもしれず、したがって、特別な生成物の生合成における増大は、該生成物の任意の測定可能な生合成を反映するかもしれない。ある実施態様において、ペンタン酸又は２−メチル酪酸の生合成の増大は、微生物細胞の培養が所定の濃度までペンタン酸又は２−メチル酪酸を蓄積するのに十分な生合成を包含しうる。

所定の濃度は、所与の用途に好適な生成物の任意の所定の濃度であってよい。したがって、所定の濃度は、例えば、少なくとも０．１ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも５．０ｇ／Ｌ、少なくとも６．０ｇ／Ｌ、少なくとも７．０ｇ／Ｌ、少なくとも８．０ｇ／Ｌ、少なくとも９．０ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも５０ｇ／Ｌ、少なくとも１００ｇ／Ｌ、又は少なくとも２００ｇ／Ｌの濃度であってよい。

組換え細胞は、例えば、原核微生物又は真核微生物を含む、任意の好適な微生物であるか又はそれに由来することができる。本明細書中で使用されるとおり、微生物に関係する用語「又は由来する」は、「宿主細胞」が、表示された増大した生合成活性を示すように改変される前に、１つ又は複数の遺伝子改変を有するのを単純に許容する。したがって、用語「組換え細胞」は、表示された生合成活性を示すように改変される前に、１つ超の種からの核酸材料を含みうる「宿主細胞」を包含する。上記のとおり、発明者らの操作された生合成経路の基礎であるロイシン及びイソロイシン生合成経路は、種にわたって高度に保存されている。種にわたるこの保存は、Ｅ．コリ宿主において例示された発明者らの経路が、所望により他の宿主細胞種に導入されうることを意味する。

いくつかの実施態様において、宿主細胞は光合成を行うもの（シアノバクテリアなど）であってよく、又はセルロース分解性（クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）など）であってもよい。

いくつかの実施態様において、組換え細胞は、例えば、真菌細胞などの真核微生物であるか又はそれに由来してもよい。これらの実施態様のいくつかにおいて、真菌細胞は、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）又はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などのサッカロミセス科（Saccharomycetaceae family）のメンバーであるか又はそれに由来してもよい。

他の実施態様において、組換え細胞は、例えば、細菌などの原核微生物であるか又はそれに由来してもよい。これらの実施態様のいくつかにおいて、細菌は、プロトバクテリア門（phylum Protobacteria）のメンバーであってよい。プロトバクテリア門の代表的メンバーは、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae family）（例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli））のメンバー、及び例えば、シュードモナス科（Pseudomonaceae family）（例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））を包含する。他の場合には、細菌は、ファーミキューテス門（phylum Firmicutes）のメンバーであってよい。ファーミキューテス門の代表的メンバーは、例えば、バシラス科（Bacillaceae family）のメンバー（例えば、バシラス・スブチリス（Bacillus subtilis））、クロストリジウム科（Clostridiaceae family）のメンバー（例えば、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum））及び例えば、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae family）のメンバー（例えば、ラクトコッカス・ラクティス）を包含する。他の場合には、細菌は、シアノバクテリア門（phylum Cyanobacteria）のメンバーであってよい。

いくつかの実施態様において、野生型対照に比べて増大したペンタン酸生合成は、２−ケト酪酸の２−ケト吉草酸への伸長の野生型対照に比べた増大、２−ケト吉草酸の２−ケトカプロン酸への伸長の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を包含することができる。他の実施態様において、野生型対照に比べて増大した２−メチル酪酸生合成は、スレオニンから２−ケト酪酸への変換の野生型対照に比べた増大、２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への変換の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を包含することができる。いくつかの場合には、増大したケト酸デカルボキシラーゼ活性の少なくとも一部は、ケト酸デカルボキシラーゼ酵素の改変によりもたらされることができる。例えば、ラクトコッカス・ラクティス（又は類似体）の２−ケト酸デカルボキシラーゼは、以下の：Ｖ４６１Ａ、Ｍ５３８Ａ又はＦ５４２Ｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換又は類似の置換を含むように改変されてよい。いくつかの場合には、２−ケト酸デカルボキシラーゼは、Ｖ４６１Ａ置換（又は類似の置換）とともにＭ５２８Ａ置換（又は類似の置換）又はＶ４６１Ａ置換（又は類似の置換）を含むように改変されてよい。

本明細書中で使用されるとおり、用語「類似体」は、同じ又は異なる微生物供給源由来の同様の酵素活性を有する関連酵素をさす。よって、類似体はしばしば、顕著な保存を示し、本分野の当業者にとって、任意の所与の酵素の好適な関連類似体を同定するのはありふれたことである。また、類似体のアミノ酸配列を参照酵素のアミノ酸配列と整列化することによって、「類似の置換」を同定するのも、本分野の当業者にとってはありふれたことである。したがって、類似体及び参照酵素の間の保存にも関わらず、位置の相違及び／又はアミノ酸残基の相違が、列挙された置換と類似の置換の間に存在しうる。

いくつかの実施態様において、組換え細胞は、インドールピルベートデカルボキシラーゼ（ＩＰＤＣ）活性の増大を示すことができる。ＩＰＤＣ活性の増大は、ＩＰＤＣ酵素の発現により生じることができる。代表的なＩＰＤＣ酵素は、例えば、配列番号１〜２１のいずれか１つに反映されるポリペプチドのいずれか１つを包含する。したがって、いくつかの実施態様において、組換え細胞は、例えば、配列番号１〜２１のいずれか１つに反映されるポリペプチドのいずれか１つなどのＩＰＤＣデカルボキシラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド配列を包含することができる。

いくつかの実施態様において、組換え細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の増大を示すことができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の増大は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素の発現により生じることができる。代表的なアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、配列番号２２〜５５のいずれか１つに反映されるポリペプチドのいずれか１つを包含する。したがって、いくつかの実施態様において、組換え細胞は、例えば、配列番号２２〜５５のいずれか１つに反映されるポリペプチドのいずれか１つなどのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチド配列を包含することができる。

本明細書中で使用されるとおり、具体的な酵素に関する用語「活性」は、その一般名または天然の機能に関わらず、ポリペプチドが該酵素の基質の生成物への変換を触媒する能力をさし、該「活性」が同定された酵素の天然の活性よりも低い、同等又はより高いかにはかかわらない。細胞の生合成活性を測定するための方法は、日常的なものであり、本分野の当業者に周知である。遺伝子改変細胞に関しては、用語「活性」は、特定された生成物化合物を合成する遺伝子改変細胞の能力をさし、該「活性」が該細胞の野生型株の天然の活性よりも低い、同等又はより高いかにはかかわらない。

本明細書中で使用されるとおり、酵素の触媒活性の増大又は遺伝子改変細胞の生合成活性の増大は、定量的に測定され、適切な野生型対照の活性のパーセンテージとして記述されることができる。遺伝子改変ポリペプチドにより示される触媒活性又は遺伝子改変細胞の生合成活性は、例えば、適切な野生型対照の活性の少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％（２倍）、少なくとも２５０％、少なくとも３００％（３倍）、少なくとも４００％（４倍）、少なくとも５００％（５倍）、少なくとも６００％（６倍）、少なくとも７００％（７倍）、少なくとも８００％（８倍）、少なくとも９００％（９倍）、少なくとも１０００％（１０倍）、少なくとも２０００％（２０倍）、少なくとも３０００％（３０倍）、少なくとも４０００％（４０倍）、少なくとも５０００％（５０倍）、少なくとも６０００％（６０倍）、少なくとも７０００％（７０倍）、少なくとも８０００％（８０倍）、少なくとも９０００％（９０倍）、少なくとも１００００％（１００倍）、又は少なくとも１００，０００％（１０００倍）であることができる。

或いは、触媒活性の増大は、ｋ_catの増大として、例えば、酵素的変換のｋ_cat値における少なくとも２倍の増大、少なくとも３倍の増大、少なくとも４倍の増大、少なくとも５倍の増大、少なくとも６倍の増大、少なくとも７倍の増大、少なくとも８倍の増大、少なくとも９倍の増大、少なくとも１０倍の増大、少なくとも１５倍の増大、又は少なくとも２０倍の増大として表されることができる。

触媒活性の増大は、Ｋ_mの減少の面から、例えば、酵素的変換のＫ_m値における少なくとも２倍の減少、少なくとも３倍の減少、少なくとも４倍の減少、少なくとも５倍の減少、少なくとも６倍の減少、少なくとも７倍の減少、少なくとも８倍の減少、少なくとも９倍の減少、少なくとも１０倍の減少、少なくとも１５倍の減少、又は少なくとも２０倍の減少として表されることができる。

酵素の触媒活性の低下又は遺伝子改変細胞の生合成活性の増大は、定量測定されることができ、適切な野生型対照の触媒活性のパーセンテージとして記述されることができる。遺伝子改変ポリペプチドにより示される触媒活性又は遺伝子改変細胞の生合成活性は、例えば、好適な野生型対照の９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の活性、又は０％の活性であることができる。

或いは、触媒活性の低下は、ｋ_catの減少として、例えば、酵素的変換のｋ_cat値における少なくとも２倍の減少、少なくとも３倍の減少、少なくとも４倍の減少、少なくとも５倍の減少、少なくとも６倍の減少、少なくとも７倍の減少、少なくとも８倍の減少、少なくとも９倍の減少、少なくとも１０倍の減少、少なくとも１５倍の減少、又は少なくとも２０倍の減少として表されることができる。

触媒活性の低下は、Ｋ_mの増大の面から、例えば、酵素的変換のＫ_m値における少なくとも２倍の増大、少なくとも３倍の増大、少なくとも４倍の増大、少なくとも５倍の増大、少なくとも６倍の増大、少なくとも７倍の増大、少なくとも８倍の増大、少なくとも９倍の増大、少なくとも１０倍の増大、少なくとも１５倍の増大、少なくとも２０倍の増大、少なくとも２５倍の増大、少なくとも３０倍の増大、少なくとも３５倍の増大、少なくとも４０倍の増大、少なくとも４５倍の増大、少なくとも５０倍の増大、少なくとも７５倍の増大、少なくとも１００倍の増大、少なくとも１５０倍の増大、少なくとも２００倍の増大、少なくとも２３０倍の増大、少なくとも２５０倍の増大、少なくとも３００倍の増大、少なくとも３５０倍の増大、又は少なくとも４００倍の増大として表されることができる。

したがって、別の態様において、発明者らは、ペンタン酸又は２−メチル酪酸の生合成のための方法を本明細書に記載する。一般に、該方法は、本明細書に記載の組換え細胞を、組換え細胞がペンタン酸又は２−メチル酪酸を産生するのに有効な条件下、炭素供給源を含む培地中でインキュベートするステップを含む。ペンタン酸を産生するためには、炭素供給源は、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、又はバレルアルデヒドのうちの１つ又は複数を含むことができる。２−メチル酪酸の生合成のためには、炭素供給源は、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、又は２−メチルブチルアルデヒドのうちの１つ又は複数を含むことができる。さらに、細胞増殖のための炭素供給源は、関連する炭素同化経路が操作された微生物中に導入される限り、ＣＯ₂、セルロース、グルコース、キシロース、シュークロース、アラビノース、グリセロールなどであることができる。

さらに別の態様において、発明者らは、炭素供給源をペンタン酸又は２−メチル酪酸に変換する能力の増大を宿主細胞が示すように、細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法を本明細書に記載する。細胞がペンタン酸を産生するためには、異種ポリヌクレオチドは、改変細胞が炭素供給源のペンタン酸への変換を触媒するように、プロモーターに操作可能に連結されたポリペプチドをコードすることができる。これらの実施態様のいくつかにおいて、炭素供給源は、グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸又はバレルアルデヒドのうちの１つ又は複数を含むことができる。細胞が２−メチルブチルアルデヒドを産生するためには、異種ポリヌクレオチドは、改変細胞が炭素供給源の２−メチルブチルアルデヒドへの変換を触媒するように、プロモーターに操作可能に連結されたポリペプチドをコードすることができる。これらの実施態様のいくつかにおいて、炭素供給源は、グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、又は２−メチルブチルアルデヒドのうちの１つ又は複数を含むことができる。そのような方法のための宿主細胞は、例えば、本明細書に記載の組換え細胞に関して上で特定された微生物種のいずれかを含むことができる。

先の説明において使用されたとおり、用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又はすべて、或いは、列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味し；用語「含む」及びその変形は、これらの用語が説明及び請求項に登場する場合に限定的な意味を有さず；別段の定めがない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つ又は１つ超を意味し；エンドポイントによる数値範囲の記述は、該範囲内に包含されるすべての数を含む（たとえば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

先の説明において、明確にするために、特別な実施態様が分離して記載されうる。特別な実施態様の特徴が別の実施態様の特徴と適合しないと明示的に特定されない限り、ある実施態様は、１つ以上の実施態様に関連して本明細書に記載された適合性のある特徴の組合せを含むことができる。

別々のステップを含む、本明細書に記載の任意の方法のために、該ステップは任意の実行可能な順番で実施されてよい。そして、適宜、２つ以上のステップの任意の組合せが同時に実施されてよい。

本発明は、以下の例によって例解される。特別な例、材料、量及び手順は、本明細書に示される発明の範囲及び精神に従って広く解釈されると理解される。

実施例１
菌株、試薬、培地及び培養
本研究において使用されるＥ．コリ株は、スレオニンの高い細胞内レベルを保証するためにスレオニン及びホモセリンエクスポーター遺伝子ｒｈｔＡをノックアウトしたスレオニン過剰産生株、ＡＴＣＣ９８０８２であった（Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０；１０７：６２３４−６２３９）。ｙｑｈＤ遺伝子欠失株を、Ｋｅｉｏコレクションから得た（Ｂａｂａら、Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ ２００６；２：２００６．０００８）。カナマイシン耐性マーカーを除去するために、これをプラスミドｐＣＰ２０で形質転換した。２−メチル酪酸の産生のために、この株を、ｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ２及びｐＩＰＡ４からｐＩＰＡ１５のいずれか１つによって形質転換した。ペンタン酸の合成のために、これを、ｐＩＰＡ１、ｐＩＰＡ３及びｐＩＰＡ４からｐＩＰＡ１５のいずれか１つによって形質転換した。

プラスミドの増殖のために使用したＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１０−Ｇｏｌｄコンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から、一方、タンパク質発現のために使用したＢＬ２１コンピテント細胞は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手した。すべての制限酵素、ＱＵＩＣＫ ＬＩＧＡＴＩＯＮキット及びＰＨＵＳＩＯＮ高忠実度ＰＣＲキットも、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。

２×ＹＴ富栄養培地（１６ｇ／ＬのＢａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物及び５ｇ／ＬのＮａＣｌ）を、３７℃及び２５０ｒｐｍでＥ．コリ株を培養するために使用した。抗生物質を必要に応じて添加した（１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン）。

発酵手順及びＨＰＬＣ分析
発酵実験を３回反復して実施し、データを、標準誤差を示すエラーバーとともに平均値として示した。２５０μＬの一夜培養物を、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、４０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍｇ／Ｌのチアミン、１００ｍｇ／Ｌのアンピリシン、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２５ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを補充した５ｍＬのＭ９培地を入れた１２５ｍＬの三角フラスコに移した。０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによってタンパク質発現を誘導した。生成した酸の中和のために、０．２ｇのＣａＣＯ₃をフラスコに添加した。３０℃及び２５０ｒｐｍで４８時間インキュベーション後、サンプルを集め、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈカラムを含み、屈折率検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣを用いて分析した。移動相は、０．６ｍＬ／分の流速の５ｍＭ Ｈ₂ＳＯ₄であった。カラム温度は３５℃であり、検出温度は５０℃であった。

タンパク質の発現及び精製
Ｎ−末端６×Ｈｉｓ−ｔａｇをコードする発現プラスミド中に遺伝子をクローニングすることによって、ＡｌｄＨを精製して、ｐＩＰＡ１６を得た。次いで、このプラスミドをＥ．コリ株ＢＬ２１に形質転換した。１／３００の希釈率の一夜プレカルチャーから細胞を播種し、３００ｍｌの１００μｇ／Ｌアンピリシン含有２×ＹＴ富栄養培地中、３０℃で増殖させた。ＯＤが０．６に達したときに、ＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのイミダゾール及び５０ｍＭのＴｒｉｓを含むバッファー（ｐＨ９．０）中で超音波処理することによって、細胞ペレットを溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー及びＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）を用いるバッファー交換によって粗細胞ライセートから酵素を精製した。５０μＭのトリスバッファー、１ｍＭのＭｇＳＯ₄及び２０％のグリセロールを含む貯蔵用バッファー（ｐＨ８．０）をＡｌｄＨのために使用した。１００μＬの濃縮タンパク質溶液をＰＣＲ管に等分に取り、長期貯蔵のために−８０℃で瞬間凍結した。２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。精製したＫＤＨ_ba及びＩＰＤＣは、先の研究から利用可能であった（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１２；２）。

酵素アッセイ
ＫＤＨ_baの酵素アッセイは、総体積７８μＬの、アッセイバッファー（５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴ）中、０．５ｍＭのＮＡＤ＋及び５０μＭから４００μＭのバレルアルデヒドから構成された。反応を開始するために、２μＬの１μＭ ＫＤＨ_baを添加し、ＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍでモニターした（吸光係数、６．２２ｍＭ^-1ｃｍ^-1）。同様のプロトコールを、ＡｌｄＨと１ｍＭから６ｍＭの範囲の濃度の２−メチルブチルアルデヒドのために使用した。

共役酵素反応法を用いて、ＩＰＤＣの活性を測定した。アルデヒドを酸に酸化するために、過剰の好適なアルデヒドデヒドロゲナーゼ（２−ケト−３−メチル吉草酸のためのＡｌｄＨ及び２−ケトカプロン酸のためのＫＤＨ_ba）を使用し、一方、補因子ＮＡＤ＋はＮＡＤＨに還元された。このアッセイ混合物は、総体積７８μＬの、アッセイバッファー（５０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ６．８、１ｍＭのＭｇＳＯ₄、０．５ｍＭのＴｈＤＰ）中、０．５ｍＭのＮＡＤ＋、０．１μＭの適切なアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び１ｍＭから８ｍＭの範囲の対応する２−ケト酸を含有した。反応を開始するために、２μＬの１μＭ ＩＰＤＣを添加し、ＮＡＤＨの生成を３４０ｎｍでモニターした。初速度データをミカエリス・メンテン式にあてはめることによって、反応速度論的パラメータ（ｋ_cat及びＫ_M）を決定した。

本明細書に引用された、すべての特許、特許出願及び文献、並びに（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどにおけるヌクレオチド配列の登録、並びにＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどにおけるアミノ酸配列の登録、並びにＧｅｎｂａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおいてアノテートされたコード領域からの翻訳物を含む）電子的に利用可能な材料の完全な開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本願の開示と参照することにより本明細書に組み込まれる任意の文書の開示の間に不一致がある場合には、本願の開示が支配する。上記の詳細な説明及び例は、理解の明確性のためにのみ与えられる。そこから不必要な制限が理解されるものではない。本分野の当業者に明らかな変形が請求項に定義された発明の内に包含されるため、本発明は、示され記述された詳細そのものに限定されない。

別段の指示がない限り、明細書及び請求項において使用される構成要素、分子量などの量を表すすべての数は、用語「約」によってすべての場合において修飾されると理解される。したがって、別段の逆の指示がない限り、明細書及び請求項に述べる数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に依存して変化しうる近似値である。せめて、そして請求項の範囲に等価な理論を制限しようとするのでなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字に照らし、そして通常の丸め技法を適用することによって解釈されなくてはならない。

本発明の広い範囲を示す数の範囲及びパラメータが近似値であるにも関わらず、特定の例において述べる数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、すべての数値は、それらの各試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含む。

すべての項目は、読者の便宜のためであり、そのように特定されない限り、該項目に続く本文の意味を制限するために使用されてはならない。

Claims (48)

1. 野生型対照に比べて増大したペンタン酸生合成を示すように改変された組換え細胞。
2. 野生型対照に比べて増大した２−メチル酪酸生合成を示すように改変された組換え微生物細胞。
3. 前記微生物細胞が真菌細胞である、請求項１又は２に記載の組換え微生物細胞。
4. 前記真菌細胞がサッカロミセス科のメンバーである、請求項３に記載の組換え細胞。
5. 前記真菌細胞がサッカロミセス・セレビシアエ、カンジダ・ルゴサ又はカンジダ・アルビカンスである、請求項３に記載の組換え細胞。
6. 前記微生物細胞が細菌細胞である、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
7. 前記細菌細胞がプロトバクテリア門のメンバーである、請求項６に記載の組換え細胞。
8. 前記細菌細胞が腸内細菌科のメンバーである、請求項７に記載の組換え細胞。
9. 前記細菌細胞がエシェリキア・コリである、請求項８に記載の組換え細胞。
10. 前記細菌細胞がシュードモナス科のメンバーである、請求項７に記載の組換え細胞。
11. 前記細菌細胞がシュードモナス・プチダである、請求項１０に記載の組換え細胞。
12. 前記細菌細胞がファーミキューテス門のメンバーである、請求項６に記載の組換え細胞。
13. 前記細菌細胞がバシラス科のメンバーである、請求項１２に記載の組換え細胞。
14. 前記細菌細胞がバシラス・スブチリスである、請求項１３に記載の組換え細胞。
15. 前記細菌細胞がストレプトコッカス科のメンバーである、請求項１２に記載の組換え細胞。
16. 前記細菌細胞がラクトコッカス・ラクティスである、請求項１５に記載の組換え細胞。
17. 前記細菌細胞がクロストリジウム科のメンバーである、請求項１２に記載の組換え細胞。
18. 前記細菌細胞がクロストリジウム・セルロリティカムである、請求項１７に記載の組換え細胞。
19. 前記細菌細胞がシアノバクテリア門のメンバーである、請求項６に記載の組換え細胞。
20. 前記微生物細胞が光合成を行うものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組換え細胞。
21. 前記微生物細胞がセルロース分解性である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組換え細胞。
22. 前記野生型対照に比べて増大したペンタン酸生合成が、Ｌ−アスパラギン酸からＬ−スレオニンへの変換の野生型対照に比べた増大、Ｌ−スレオニンから２−ケト酪酸への変換の野生型対照に比べた増大、２−ケト酪酸伸長活性の野生型対照に比べた増大、２−ケト吉草酸伸長活性の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大、所定の基質に対するケト酸デカルボキシラーゼ選択性の野生型対照に比べた増大、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を含む、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の組換え細胞。
23. 前記野生型対照に比べて増大した２−メチル酪酸生合成が、Ｌ−アスパラギン酸からＬ−スレオニンへの変換の野生型対照に比べた増大、Ｌ−スレオニンから２−ケト酪酸への変換の野生型対照に比べた増大、２−ケト酪酸から２−ケト−３−メチル吉草酸への変換の野生型対照に比べた増大、ケト酸デカルボキシラーゼ活性の野生型対照に比べた増大、所定の基質に対するケト酸デカルボキシラーゼ選択性の野生型対照に比べた増大、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の野生型対照に比べた増大を含む、請求項２〜２１のいずれか１項に記載の組換え細胞。
24. 請求項３〜２３のいずれか１項に記載の組換え細胞を、前記組換え細胞がペンタン酸を産生するために有効な条件下、炭素供給源を含む培地中でインキュベートするステップを含む方法であって、前記炭素供給源が、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、バレルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含む、前記方法。
25. 請求項２〜２３のいずれか１項に記載の組換え細胞を、前記組換え細胞が２−メチル酪酸を産生するために有効な条件下、炭素供給源を含む培地中でインキュベートするステップを含む方法であって、前記炭素供給源が、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−メチルブチルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含む、前記方法。
26. 炭素供給源のペンタン酸への変換を触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを、宿主細胞中に導入するステップを含む方法であって、前記改変された宿主細胞が前記炭素供給源のペンタン酸への変換を触媒するように、少なくとも１つの前記ポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に連結される、前記方法。
27. 前記炭素供給源が、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトカプロン酸、バレルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース、又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 炭素供給源の２−メチル酪酸への変換を触媒する少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを、宿主細胞中に導入するステップを含む方法であって、前記改変された宿主細胞が前記炭素供給源の２−メチル酪酸への変換を触媒するように、少なくとも１つの前記ポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に連結される、前記方法。
29. 前記炭素供給源が、以下の：グルコース、ピルビン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−スレオニン、２−ケト酪酸、２−ケト−３−メチル吉草酸、２−メチルブチルアルデヒド、ＣＯ₂、セルロース、キシロース、シュークロース、アラビノース、又はグリセロールのうちの１つ又は複数を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記真菌細胞がサッカロミセス科のメンバーである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記真菌細胞がサッカロミセス・セレビシアエ、カンジダ・ルゴサ又はカンジダ・アルビカンスである、請求項３１に記載の方法。
33. 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記細菌細胞がプロトバクテリア門のメンバーである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記細菌細胞が腸内細菌科のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
36. 前記細菌細胞がエシェリキア・コリである、請求項３５に記載の方法。
37. 前記細菌細胞がシュードモナス科のメンバーである、請求項３４に記載の方法。
38. 前記細菌細胞がシュードモナス・プチダである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記細菌細胞がファーミキューテス門のメンバーである、請求項３３に記載の方法。
40. 前記細菌細胞がバシラス科のメンバーである、請求項３９に記載の方法。
41. 前記細菌細胞がバシラス・スブチリスである、請求項４０に記載の方法。
42. 前記細菌細胞がストレプトコッカス科のメンバーである、請求項３９に記載の方法。
43. 前記細菌細胞がラクトコッカス・ラクティスである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記細菌細胞がクロストリジウム科のメンバーである、請求項３９に記載の方法。
45. 前記細菌細胞がクロストリジウム・セルロリティカムである、請求項４４に記載の方法。
46. 前記細菌細胞がシアノバクテリア門のメンバーである、請求項３３に記載の方法。
47. 前記宿主細胞が光合成を行うものである、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記宿主細胞がセルロース分解性である、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。

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