CN104685059A - 生物合成途径、重组细胞和方法 - Google Patents

生物合成途径、重组细胞和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容描述了与酯的生物合成相关的工程化的生物合成途径、重组细胞和方法。所述重组细胞可以经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合成增加。可在使所述重组细胞有效产生酯的条件下在包含碳源的培养基中孵育所述重组细胞。本公开内容也描述了通常包括将异源多核苷酸引入宿主细胞的方法，所述异源多核苷酸编码催化将碳源转化为酯的步骤的至少一种多肽，其中所述至少一种多核苷酸与启动子操作性连接，使得所述修饰的宿主细胞催化碳源向酯转化。

Description

生物合成途径、重组细胞和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年5月29日提交的美国临时专利申请顺序号61/652,505的优先权，其通过引用结合到本文中。
概述
本公开内容一方面描述了重组细胞，其经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合成增加。所述重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。在某些情况下，所述微生物细胞可以是光合的。在某些情况下，所述微生物细胞可以是分解纤维素的。在某些实施方案中，所述重组细胞可以表现出与野生型对照相比有机酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比酮酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比醛向有机酸的转化增加，与野生型对照相比醛向醇的转化增加，或与野生型对照相比酰基辅酶A与醇结合形成酯的增加。
另一方面，本公开内容描述了方法，其通常包括在使经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合成增加的重组细胞有效产生酯的条件下在包含碳源的培养基中孵育所述重组细胞，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、CO2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。
另一方面，本公开内容描述了通常包括将异源多核苷酸引入宿主细胞的方法，所述异源多核苷酸编码催化将碳源转化为酯的步骤的至少一种多肽，其中所述至少一种多核苷酸与启动子操作性连接，使得所述修饰的宿主细胞催化碳源向酯转化。在某些实施方案中，所述碳源可包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、CO2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是真核细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞可以是原核细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是光合的。在某些实施方案中，所述宿主细胞可以是分解纤维素的。
本发明的以上概述无意描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施。以下描述更详细地举例说明了说明性的实施方案。在本申请全文的若干处，通过实施例列表提供指导，可以不同组合使用所述实施例。在每种情况下，给出的列表仅作为代表性的群组，而不应视为排他性的列表。
附图简述
图1. (a) 所提出的人工生物合成酯的途径。(b) 实例分子。(c) 用作燃料和化学品的酯的优势。
图2. 酯异丁酸异丁酯的示例性的合成途径。两个独立的途径可导致异丁酰辅酶A的产生。
图3. (a) 质粒和(b) 气相色谱数据结果，显示了异丁酸异丁酯的生物合成。
图4. 产生乙酸异丁酯(IBAC)和乙酸异戊酯(IVAC)的合成途径。所述途径的工程化步骤在框图中显示。NADPH-依赖性酶用虚线圈表示，关键性酶酰基转移酶用虚线长方形表示。缩略语：PDC (丙酮酸脱氢酶复合物), AAT (醇酰基转移酶)；其它酶在图5中说明。
图5. 对于(a) 乙酸异丁酯(IBAC) (b) 乙酸异戊酯(IVAC)的产生的合成的操纵子。缩略语：AAT (醇酰基转移酶)。
图6. 对于(a) 乙酸异丁酯的产生和(b) 乙酸异戊酯的产生，引入5种候选的酰基转移酶(AAT)的发酵结果。误差棒表示标准偏差。这5种AAT及其天然底物见表3。
说明性实施方案的详述
在以下示例性的实施方案的描述中，说明了某些代谢酶和这些酶的天然来源。这些仅仅是合适酶和指定酶的合适来源的实例。具有类似催化活性的替代的酶是可能的，作为可得自不同微生物物种或菌株的同系物。因此，本文所述的示例性的实施方案不应视为限制反映在权利要求书中的微生物或方法的范围。对于替代石油的可再生来源的搜寻是对科学、工业和社会的重大挑战。生物合成可从生物质资源提供燃料和化学品的可持续的供应。可影响发酵过程可行性的因素包括例如，原料可用性、发酵性能(例如，收率、效价、生产能力)和回收发酵产物的成本。尽管在原料开发上已经取得巨大进展，但是目前生产醇或有机酸的发酵方法仍不理想。首先，醇和有机酸对细胞具有很大毒性，这可限制这些产物在对培养物中的微生物活力产生有害影响之前在发酵培养基中可积累的浓度。其次，醇和酸在水性介质(例如培养基)中趋于极易溶解，因此可能需要消耗大量能源的蒸馏纯化方案以从水性发酵介质中回收这些产物。结果，尽管作为燃料而言较高级的醇例如丁醇可以提供优于例如乙醇的优势，但是作为商业可用的生物燃料而言较高级的醇难以与乙醇竞争，因为从低的发酵效价(<20 g/L)中高的纯化成本。第三，产生有机酸的发酵通常包括向发酵中加入碱，以中和其中积累有机酸的培养基的pH值。有机酸的回收通常包括随后加入硫酸并处理盐，这每一步都会涉及巨大成本。
为了提供通用溶液，我们已经开发了用于生产醇、有机酸或其它生物燃料的酯平台。如图1(a)所示，该方法的一个实施方案具有3部分：1) 羧酸和随后的酰基辅酶A的生物合成的代谢途径；2) 醇生物合成的平行代谢途径；和3) 从酰基辅酶A和醇生产酯的工程化途径。该平台的成功实践使得基于生物的酯生产成为可能。在某些替代实施方案中，所述方法可包括羧酸(和随后的酰基辅酶A)生物合成的代谢途径以及从生物合成的酰基辅酶A和作为共反应剂而提供(例如在培养基中)的醇中生产酯的工程化途径。在其他替代实施方案中，所述方法可包括醇生物合成的代谢途径以及从生物合成的醇和作为共反应剂而提供(例如在培养基中)的酰基辅酶A中生产酯的工程化途径。
通过使用我们的平台技术产生的酯可用作生物燃料、工业化学品或生产其他化合物的原料。例如，可以容易地水解酯类，制备醇和有机酸。原则上，该方法可用于从按照我们的平台工程化的微生物所产生的合适的酯制备任何醇和/或有机酸。若干示例性的有机酸和醇列于图1(b)。示例性的有机酸产物包括例如，乙酸、异丁酸、3-羟基丙酸、丁酸、乳酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和异戊酸。示例性的醇产物包括例如乙醇、甲醇、丁醇、异丁醇、丙醇、异丙醇、戊醇、异戊醇、己醇、庚醇和辛醇。任何这些酸以及任何这些醇的组合都可产生酯代谢物。
如本文所述而产生的酯可用作生物燃料。一般而言，酯类作为燃料的话，可提供优于例如乙醇的某些优势。如表1所示，酯燃料具有与较高级的醇例如异丁醇和异戊醇类似的能量密度。与相应的醇化合物相比，酯类还可表现出较低的水溶性，允许使用相分离(而非蒸馏)从水性介质中回收酯类。结果，与从发酵中回收醇类相比，回收酯类可以是更简单，更有效和成本更低廉。尽管脂肪酸类和烷烃类也具有非常低的水溶性，但长链脂肪酸通常不有效分泌到胞外环境中，而且从这些化合物中制备的燃料可能在低温时无法顺利使用，因为它们可能易于胶凝。
酯的生物生产可以产生高于较高级醇、烷烃和脂肪酸的生物生产的理论收率。在大肠杆菌中，例如，在发酵期间无原位回收时异丁醇积累可达到大约22 g/L (Baez等人, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 90 (5), 1681‐1690)。相比之下，我们可以生产90 g/L异丁酸，这可与乳酸(Wang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011, 108 (47), 18920‐18925)或琥珀酸发酵(Lin等人, Metab. Eng. 2005, 7 (2), 116‐127)相当，这两者是商业化生产中最有希望的可再生化学品。另外，C5异戊酸可以积累至32 g/L，比异戊醇(4.4 g/L) (Connor等人, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 86 (4), 1155‐1164)和脂肪酸(4.5 g/L) (Liu等人, Metab. Eng. 2010, 12 (4), 378‐386)高得多。最后，酯类对细胞无毒性，允许在发酵肉汤中观察到比其他化合物更高的积累。
表1. 各种化合物的生物合成特征、物理性质和燃料性能的比较。
图2显示了用于生产示例性的酯化合物异丁酸异丁酯的示例性的通用工程化途径。为了酶促催化酯化反应，将羧酸活化为酰基辅酶A。然后，可使酰基辅酶A与醇反应，生成酯。酯化反应是由酰基转移酶催化(图2)。我们已经工程化2种产酯的大肠杆菌菌株，酯菌株1和酯菌株2，其各自利用独立途径产生酰基辅酶A中间体。一个产生酰基辅酶A的途径是通过酰基辅酶A合成酶(Acs)将异丁酸转化为异丁酰辅酶A。我们自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)克隆了FadDx，一种示例性的酰基辅酶A合成酶，以便以此方式催化酰基辅酶A的产生(酯菌株1，见图2中的“途径II”)。产生酰基辅酶A的另一途径是利用来自恶臭假单胞菌的支链酮酸脱氢酶复合物BKDH。我们在单独的菌株(酯菌株2，见图2中的“途径I”)中利用该策略。
我们随后将来自仙女扇(Clarkia breweri)的苯甲酰基-辅酶A (CoA):苯甲醇苯甲酰基转移酶(BEBT或LuxE) (D’Auria等人, Plant Physiol.2002,130(1):466)克隆到酯菌株1和酯菌株2两者中。
依据气相色谱分析，在摇瓶发酵期间，酯1菌株得到3.5 mg/L异丁酸异丁酯，酯2菌株得到200 mg/L异丁酸异丁酯。没有LuxE，在发酵肉汤中未检出异丁酸异丁酯。
该实施方案建立了一个基础平台，其中可将微生物工程化以产生酯化合物。我们所使用的特定酶仅仅是示例性的，确定所述平台对于酯化合物的生物合成是有效的。可以使用酰基辅酶A-产生酶(酰基辅酶A合成酶或支链酮酸脱氢酶复合物BKDH)和酰基转移酶的任何合适组合，从指定原料生产所需的酯产物。可以用于我们的平台中的示例性的酰基辅酶A合成酶包括例如SEQ ID NO:5-28的任何一个中所示的那些，无论酶的通用名称或天然底物如何。某些示例性的酰基辅酶A合成酶列于表2。可用于我们的平台中的示例性的支链酮酸脱氢酶复合物酶包括例如SEQ ID NO:29和78-80中所示的任何一个或多个氨基酸序列，无论酶的通用名称或天然功能如何。某些示例性的支链酮酸脱氢酶复合物酶列于表2。可用于我们的平台中的示例性的酰基转移酶包括例如SEQ ID NO:30-77的任何一个中所示的那些，无论酶的通用名称或天然功能如何。某些示例性的酰基转移酶包括例如表2中列举的那些。
表2. 示例性的备选酰基辅酶A合成酶和酰基转移酶
图4说明了我们的平台的用于酯生物合成的替代实施方案。在该实施方案中，乙酸异丁酯(IBAC)和/或乙酸异戊酯(IVAC，香蕉油)可以由微生物产生，在所述微生物中天然缬氨酸生物合成途径被修饰。乙酰辅酶A是天然的和容易得到的，例如在大肠杆菌中作为TCA循环的一种组分。为了产生IBAC和IVAC任一个，首先构建了过量表达AlsS和IlvD的微生物，以促进2-酮异戊酸的生物合成。还构建了表达Kivd和Yqhd的微生物，Kivd和Yqhd可共同将2-酮异戊酸转化为异丁醇，后者在酰基转移酶所催化的反应中可被酯化为乙酸异丁酯。为了产生乙酸异戊酯，可构建微生物，以进一步表达“+1”途径(LeuABCD)，其可延长2-酮异戊酸一个碳，形成2-酮-4-甲基戊酸。在这些实施方案中，KivD和Yqhd的组合可将2-酮-4-甲基戊酸转化为异戊醇，后者可被酰基转移酶酯化为乙酸异戊酯。
我们表征了5种示例性的醇酰基转移酶(AAT)、LuxE、ATF1、ATF2、BPBT和SAAT (如表3所示)。克隆了每一种并转化到大肠杆菌菌株BW25113中，用于分析。
表3. 在中链酯生物合成中的示例性的醇酰基转移酶(AAT)。
构建了3个合成的操纵子用于基因表达，以产生乙酸异丁酯和乙酸异戊酯(图5)。构建所有质粒都在PLlacO1启动子的调控之下。为了产生乙酸异丁酯，第一操纵子包括在携带卡那霉素抗性标记的中拷贝质粒上的4个编码区，转录顺序为ilvC-ilvD-alsS-AAT，其中ATT位置被所分析的5个示例性的酰基转移酶(AAT)中的一个的编码区占据(图5(a))。第二操纵子包括在具有氨苄青霉素抗性标记的高拷贝质粒上的2个编码区，转录顺序为kivd-yqhD。对于乙酸异戊酯的合成，将涉及亮氨酸生物合成的leuA、leuB、leuC和leuD的编码区引入第一中拷贝质粒中介于alsS和AAT之间，并使用同样的第二高拷贝质粒。(图5(b))。
我们评价了5个示例性的酰基转移酶的每一个对乙酸异丁酯和乙酸异戊酯的生产效价的作用。通过PCR从酿酒酵母基因组DNA扩增ATF1和ATF2的编码区。通过基于退火的寡核苷酸连接，人工合成LuxE、BPBT和SAAT的编码区。如图2所示，用合成的操纵子构建重组菌株。
如实施例2所述进行摇瓶发酵和产物分析并将3个独立菌落划线接种，以获得标准偏差。所有菌株都是相同的，除了所表达的醇酰基转移酶之外。因此，使用相同的发酵条件，具有靶化合物的最高生产效价的菌株将具有最具活性的醇酰基转移酶。此处的活性代表动力学参数和蛋白表达水平的综合效应。
图6(a)提供了乙酸异丁酯生产的数据。ATF1产生最高效价(2.14 ± 0.17 g/L)。ATF2产生的效价为1.69 ± 0.46 g/L。图6(b)显示了乙酸异戊酯生产数据并揭示了类似趋势。ATF1和ATF2产生最高生产效价。
如果市售可得的话(例如来自美国典型培养物保藏中心)，引入宿主细胞的任何异源酶的编码区都可以从天然宿主的基因组DNA经PCR扩增。否则，可以通过PCR装配，使用多重引物，人工合成编码区。合成的编码区可以经密码子优化，用于在例如大肠杆菌或酿酒酵母等宿主细胞中表达。用带有异源酶编码区的质粒转化的细胞可以在包含羧酸和/或醇前体的培养基中培养。
因此，一方面，本发明提供重组微生物细胞，其经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合成增加。在某些情况下，所述野生型对照可能不能产生酯，因此，酯的生物合成增加可以反映任何可测的酯的生物合成。在某些实施方案中，酯的生物合成增加可包括生物合成足以使微生物细胞培养物积累酯到预定浓度。
所述预定浓度可以是适于指定应用的产物的任何预定浓度。因此，预定浓度可以是例如至少3 mg/L的浓度，例如，至少10 mg/L、至少100 mg/L、至少200 mg/L、至少500 mg/L、至少1.0 g/L、至少2.0 g/L、至少3.0 g/L、至少4.0 g/L、至少5.0 g/L、至少6.0 g/L、至少7.0 g/L、至少8.0 g/L、至少9.0 g/L、至少10 g/L、至少20 g/L、至少50 g/L、至少100 g/L或至少200 g/L。
所述重组细胞可以是或源自任何合适的微生物，包括例如原核微生物或真核微生物。本文使用的术语“或源自”对于微生物而言仅允许“宿主细胞”在进一步修饰以表现出指定的生物合成活性增加之前具有一个或多个遗传修饰。因此，术语““重组细胞”包括在经修饰以表现出指定的生物合成活性之前可含有来自不止一个物种的核酸材料的“宿主细胞”。
在某些实施方案中，可以选择具有一种或多种天然生理活性的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是光合的(例如蓝细菌)或可以是分解纤维素的(例如解纤维梭菌)。
在某些实施方案中，所述重组细胞可以是或源自真核微生物，例如真菌细胞。在这些实施方案的某些中，真菌细胞可以是或源自酵母科的成员，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)或白色假丝酵母(Candida albicans)。
在其它实施方案中，所述重组细胞可以是或源自原核微生物，例如细菌。在这些实施方案的某些中，所述细菌可以是变形菌门的成员。示例性的变形菌门的成员包括例如肠杆菌科的成员(例如大肠杆菌(Escherichia coli))和例如假单胞菌科的成员(例如恶臭假单胞菌)。在其他情况下，所述细菌可以是厚壁菌门的成员。示例性的厚壁菌门的成员包括例如芽孢杆菌科的成员(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、梭菌科的成员(例如解纤维梭菌)和例如链球菌科的成员(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))。在其他情况下，所述细菌可以是蓝细菌门的成员。
在某些实施方案中，与野生型对照相比酯的生物合成增加可包括以下一项或多项：与野生型对照相比有机酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比酮酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比醛向有机酸的转化增加，与野生型对照相比醛向醇的转化增加，或与野生型对照相比酰基辅酶A与醇结合形成酯的增加。可以根据一个或多个标准选择特定的酰基辅酶A合成酶、支链酮酸脱氢酶(BKDH)复合物酶和/或酰基转移酶，所述标准例如，所设计途径中的代谢底物、可用的原料和/或酶在宿主微生物中表达的效率。
在其它实施方案中，与野生型对照相比酯的生物合成增加可包括以下一项或多项：2-酮异戊酸向异丁醛的转化增加，和异丁醛向异丁醇的转化增加，异丁醇和酰基辅酶A合成乙酸异丁酯的增加，2-酮异戊酸延长为2-酮-4-甲基戊酸的增加，2-酮-4-甲基戊酸向异戊醛的转化增加，异戊醛向异戊醇的转化增加，或异戊醇和酰基辅酶A合成乙酸异戊酯的增加。
在某些情况下，与野生型对照相比酯的生物合成增加可包括一种或多种酶催化活性的下降，所述酶例如，否则可将所设计途径的中间体转向不导致所需酯生物合成的替代途径的酯酶和/或脂肪酶。
本文使用的术语“活性”对于具体的酶而言是指多肽(无论其通用名称或天然功能如何)催化酶的底物转化为产物的能力，无论所述“活性”小于、等于还是大于所鉴定的酶的天然活性。测定细胞的生物合成活性以及酰基辅酶A合成酶和酰基转移酶的酶活性的方法是常规的并且是本领域技术人员众所周知的。在经遗传修饰的细胞的情况下，术语“活性”是指经遗传修饰的细胞合成所鉴定产物化合物的能力，无论所述“活性”小于、等于还是大于细胞的野生型菌株的天然活性。
如本文所使用的，可以定量测定酶催化活性的增加或经遗传修饰的细胞的生物合成活性的增加并且描述为合适的野生型对照的催化活性的百分率。经遗传修饰的多肽所表现的催化活性或经遗传修饰的细胞的生物合成活性可以是例如合适野生型对照活性的至少110%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200% (2倍)、至少250%、至少300% (3倍)、至少400% (4倍)、至少500% (5倍)、至少600% (6倍)、至少700% (7倍)、至少800% (8倍)、至少900% (9倍)、至少1000% (10倍)、至少2000% (20倍)、至少3000% (30倍)、至少4000% (40倍)、至少5000% (50倍)、至少6000% (60倍)、至少7000% (70倍)、至少8000% (80倍)、至少9000% (90倍)、至少10,000% (100倍)或至少100,000% (1000倍)。
或者，催化活性的增加可以表示为k cat的增加，例如，酶转化的k cat值的至少2倍增加、至少3倍增加、至少4倍增加、至少5倍增加、至少6倍增加、至少7倍增加、至少8倍增加、至少9倍增加、至少10倍增加、至少15倍增加或至少20倍增加。
催化活性的增加也可表示为K m的降低，例如，酶转化的K m值的至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低或至少20倍降低。
可以定量测定酶催化活性的降低或经遗传修饰的细胞的生物合成活性的增加并且描述为合适的野生型对照的催化活性的百分率。经遗传修饰的多肽所表现的催化活性或经遗传修饰的细胞的生物合成活性可以是例如合适野生型对照活性的不超过95%、不超过90%、不超过85%、不超过80%、不超过75%、不超过70%、不超过65%、不超过60%、不超过55%、不超过50%、不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%、不超过5%、不超过4%、不超过3%、不超过2%、不超过1%或0%。
或者，催化活性的降低可以表示为k cat的降低，例如，酶转化的k cat值的至少2倍降低、至少3倍降低、至少4倍降低、至少5倍降低、至少6倍降低、至少7倍降低、至少8倍降低、至少9倍降低、至少10倍降低、至少15倍降低或至少20倍降低。
催化活性的降低也可表示为K m的增加，例如，K m值增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少230倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍或至少400倍。
因此，另一方面，我们在本文中描述了酯生物合成的方法。所述酯可以是任何所需酯。如上所述，酯可以用作生物燃料、工业化学品或生产其他化合物的原料。我们的方法可用于将任何有机酸例如图1(b)中鉴定的示例性的有机酸与任何醇例如图1(b)中鉴定的示例性的醇结合在一起而制备酯。任何这些酸和任何这些醇的组合都可产生酯代谢物。在多种不同应用中，有机酸、醇或这两者都可以由细胞合成。在这些实施方案的某些中，所述细胞可以经遗传修饰以促进有机酸或醇的生物合成。另外在多种不同应用中，可在培养基中提供有机酸或醇，使得无需其生物合成就可产生酯。
在某些情况下，所述酯可以是具有不超过12个碳原子(C12)的酯，例如C11酯、C10酯、C9酯、C8酯、C7酯、C6酯、C5酯、C4酯或C3酯。在其他情况下，所述酯可以是具有任何数量的碳和预定分支程度的酯。分支程度可以表征为分支碳的数量和/或一个或多个或累积所有分支的长度。如本文使用，分支是指与至少3个其他碳共价结合的碳的数量。在某些具体的实施方案中，所述酯可以是例如，异丁酸异丁酯、异戊酰基异戊酸酯(isovaleryl isovalerate)或乳酸乙酯。
通常，所述方法包括在本文所述的重组细胞有效产生酯的条件下在包含碳源的培养基中孵育所述重组细胞。因此，所述碳源可包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸或酮缬氨酸。另外，用于细胞生长的碳源可以是CO2、纤维素、葡萄糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘油、藻酸、葡萄糖二酸、半乳糖醛酸等，只要在工程化微生物中引入相关碳同化途径。另外，所述碳源可包括有机酸或有机酸的代谢前体，其可被活化而产生所需酯。在图2所示的示例性的途径中，所述有机酸是异丁酸。在自不同的有机酸形成酯的其它途径中，不同的有机酸可以是培养基的组分。同样，所述碳源可包括醇或醇的代谢前体，从中合成所需酯。在图2所示的示例性的途径中，所述醇是异丁醇，代谢前体包括例如异丁醛和酮缬氨酸。在自不同的醇形成酯的其它途径中，不同的醇和/或不同的醇的前体可以是培养基的组分。
如上所述，所述酯可以是所需的终端产物或可以用作产生其它化合物的前体。在某些情况下，所述酯可以被水解为醇和有机酸，所述酯正是从所述醇和有机酸生物合成。用这种方式，可以使用本文所述的平台来产生比可以积累的更大数量的醇或有机酸，如果醇和/或有机酸是发酵终端产物的话。所述酯可以经生物合成并通过相分离而从水性培养物中回收，相分离是比通过例如蒸馏而从水性介质中回收醇和/或有机酸而言更简单、更有效和/或成本更低廉的工艺。回收的酯可以在控制体积的水中水解，在大部分情况下无需任何额外的酶或活化处理，得到组分醇和有机酸。
再一方面，我们在本文中描述了将异源多核苷酸引入细胞的方法，使得宿主细胞表现出碳源向酯转化的能力增加。异源多核苷酸可以编码与启动子操作性连接的多肽，使得修饰的细胞催化碳源向酯转化。在这些实施方案的某些中，所述碳源可包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸和有机酸(其前体)或醇(或其前体)。用于所述方法的宿主细胞可包括例如以上对于本文所述重组细胞而鉴定的任何微生物物种。
正如前述所用，术语“和/或”是指一个或所有列举的要素或者任何两个或更多个列举的要素的组合；术语“包括”及其变体在说明书和权利要求书中出现时不具有限制性含义；除非另有说明，否则“a”、“an”、“the”和“至少一个”可互换使用，意指一个或不止一个；并且由端点叙述的数值范围包括包含在该范围内的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
在先前的描述中，为了清楚起见，可以单独描述具体的实施方案。除非另有明确说明具体实施方案的特征与另一实施方案的特征不相容，否则某个实施方案可包括本文所述的一个或多个实施方案的相容特征的组合。
对于本文公开的包括不连续步骤的任何方法，可以以任何可行的顺序进行所述步骤。并且，如果合适的话，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
以下实施例说明了本发明。应当知道，具体的实施例、材料、数量和程序被视为广泛地依照本文所提出的本发明的范围和精神。
实施例
实施例1
质粒构建
自恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA扩增BKDH酶复合物编码区和fadDX，分别使用引物bkdh_ecofwd (TgcatcgaattcAGGAGAAATT AACTatgAACGAGTACGCCC CCCTGCGTTTGC, SEQ ID NO:1)和bkdh_hindrev (Tgcatc aagcttTCAGATATGCAAGGCGTGGCCCAG, SEQ ID NO:2), fadDXsalI-F (tgtacggtat taatgtcgac AGGAGAAATTAACTATGCTTCAACTCCAAAAACAAGAAAC, SEQ ID NO:3)和fadDXbam-R (TGATCATGCGCCATAGTTAATTTCTCCTGGATCCTTAGACGC TGGCAGGGGTGGCCTGTT, SEQ ID NO:4)。然后用EcoRI和HindIII消化BKDH的PCR产物，并插入到pZE12中，得到pIBA16。为了构建质粒pESTER1，通过DNAworks合成来自仙女扇的BEBT编码区(Hoover和Lubkowski, Nucleic Acids Res 2002, 30 (10), e43)，然后在XbaI消化后得到pIBA7的线性质粒。最终，通过以下文献所述，在fadDX、BEBT和线性pIBA7组合后形成pESTER1质粒：Gibson等人, Nat Meth 2009, 6(5):343‐345。BEBT编码区，用Acc65I和HindIII消化，然后插入到pZS质粒的相应位置，以形成质粒pESTER2。
发酵结果
大肠杆菌宿主BW25113用于发酵。一个菌株酯1是用pIBA1 (国际专利公布号WO 2012/109534)和pESTER1转化的BW25113，而另一菌株酯2是用pIBA1、pIBA16和pESTER2转化的BW25113。
将在LB培养基中孵育的过夜培养物在125-mL锥形瓶中，在补充有0.5%酵母提取物和4%葡萄糖的5 mL M9培养基中稀释25倍。适当地添加抗生素(氨苄青霉素100 mg/L和卡那霉素25 mg/L)。加入0.1 mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白表达。通过加入0.5 g CaCO3缓冲培养基。将培养物放入30℃摇床(250 rpm)上并孵育48小时。通过HPLC或GC分析定量测定发酵产物。结果见图2(b)。
实施例2
从仙女扇中扩增酰基转移酶LuxE、ATF1、ATF2、BPBT和SAAT，使用引物：
luxEalsS-F (gaaaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGCGCAT GATCAGAGCCT, SEQ ID NO:81)和
luxEvec-R (agcctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA CAGGCTGCTC TGGGTGAAATG, SEQ ID NO:82)，其来自酿酒酵母；
ATF1alsS-F (cgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGAATGAA ATCGATGAGAAAAATC, SEQ ID NO:83)和
ATF1vec-R (agcctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AGGGCCTAAA AGGAGAGCTTT, SEQ ID NO:84)，其来自酿酒酵母；
ATF2alsS-F (cgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGAAGAT ATAGAAGGAT ACGAAC, SEQ ID NO:85)和
ATF2vec-R (cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AAGCGACGCA AATTCGCCGA TGG, SEQ ID NO:86)，其来自矮牵牛；
BPBTalsS-F (aaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGACAGC AAACAGAGCA GCG, SEQ ID NO:87)和
BPBTvec-R (cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA AAGCGCTGGG GTGATGAACG CAT, SEQ ID NO:88)，其来自草莓；和
SAATalsS-F (aaacgaaagctctctaa GCTGAGCAGG AGAAATTAAC TATGGAGAAA ATAGAAGTGA GCA, SEQ ID NO:89)和
SAATvec-R (cctttcgttttatttgatgcctctaga GCTCAGCTTA GATCAGCGTC TTTGGACTCG CCA,, SEQ ID NO:90)，其来自草莓。
按照Gibson等人, Nat Meth 2009, 6(5):343‐345所述，将不同的酰基转移酶与BlpI消化的pIBA1质粒(国际专利公布号WO 2012/109534)和pIVC1质粒连接(Xiong等人. Sci Rep 2012, 2:311)，分别形成质粒pZA-ilvD-alsS-LuxE、pZA-ilvD-alsS-ATF1、pZA-ilvD-alsS-ATF2、pZA-ilvD-alsS-BTBT、pZA-ilvD-alsS-SAAT、pZA-leuABCD-ilvD-alsS-LuxE、pZA-leuABCD-ilvD-alsS-ATF1、pZA-leuABCD-ilvD-alsS-ATF2、pZA-leuABCD-ilvD-alsS-BTBT和pZA-leuABCD-ilvD-alsS-SAAT。为了构建质粒pZE-KivD-yqhD，将yqhD经PCR扩增，使用引物yqhDSphI-F (GGGCCCgcatgc AGGAGAAATT AACTATGAAC AACTTTAATC TGCACACCCC, SEQ ID NO:91)和yqhDXbaI-R (GGGCCCtctaga TTAGCGGGCG GCTTCGTATA TACGGC, SEQ ID NO:92)，然后取代质粒pIBA7的padA (国际专利公布号WO 2012/109534)，形成pZE-KivD-yqhD。
发酵结果
对于重组菌株，进行摇瓶发酵。将细胞接种在试管中过夜并将200 μL细胞移入在150-mL螺旋盖的锥形瓶中的10 mL发酵培养基中。发酵培养基由在M9基本培养基(5 g/L酵母提取物)中的20 g/L葡萄糖组成，所述培养基中补充有硫胺素(10 mg/L)、氨苄青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(25 μg mL)和用于中和的0.5 g碳酸钙。通过加入0.1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。将瓶用石蜡膜封闭，然后开始发酵，以创造微好氧环境(micor-aerobic environment)。在30℃在旋转摇床(250 r.p.m.)上孵育48小时后收集样品。通过GC-FID (气相色谱-火焰离子化检测器)分析，定量测定所产生的中链酯化合物。通过HPLC-RID (高效液相色谱-折光率检测器)分析来鉴定它们的副产物和残余葡萄糖。结果见图6。
本文引用的全部专利、专利申请和出版物及电子可获取材料(包括例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及从GenBank和RefSeq中注释的编码区得到的翻译)的完整公开内容都通过引用以其整体结合到本文中。如果本申请的公开内容与通过引用结合到本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性时，则应以本申请的公开内容为准。前面的发明详述和实施例仅仅为了清楚理解而提供。不应从其中理解为不必要的限制。本发明不限于已显示和描述的确切细节，因为对本领域技术人员而言明显的改变将包括在由权利要求书所限定的本发明范围内。
除非另有说明，否则用于本说明书和权利要求书的表示组分的量、分子量等的所有数值，要理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书所示数值参数是近似值，其可随本发明欲寻求的所需性质而改变。丝毫无企图限制相当于权利要求书范围的教义，每个数值参数至少应根据所报告的有效数字的数目并应用普通舍入技术来解释。
尽管本发明的宽范围给出的数值范围和参数是近似值，但是要尽可能准确地报告具体实施例给出的数值。然而，所有数值固有地包含必然产生于在其各自测量中存在的标准差的范围。
所有标题出于读者便利，不应用来限制该标题下的文本的含义，除非另有说明。

Claims (49)

1. 重组细胞，其经修饰而表现出与野生型对照相比酯的生物合成增加。
2. 权利要求1的重组微生物细胞，其中所述微生物细胞是真菌细胞。
3. 权利要求2的重组细胞，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。
4. 权利要求2的重组细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母、皱褶假丝酵母或白色假丝酵母。
5. 权利要求1的重组细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞。
6. 权利要求5的重组细胞，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。
7. 权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。
8. 权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
9. 权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。
10. 权利要求9的重组细胞，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。
11. 权利要求5的重组细胞，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。
12. 权利要求11的重组细胞，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科的成员。
13. 权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。
14. 权利要求11的重组细胞，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。
15. 权利要求14的重组细胞，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。
16. 权利要求11的重组细胞，其中所述细菌细胞是梭菌科的成员。
17. 权利要求16的重组细胞，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌。
18. 权利要求5的重组细胞，其中所述细菌细胞是蓝细菌门的成员。
19. 前述权利要求中任一项的重组细胞，其中所述微生物细胞是光合的。
20. 前述权利要求中任一项的重组细胞，其中所述微生物细胞是分解纤维素的。
21. 前述权利要求中任一项的重组细胞，其中与野生型对照相比酯的生物合成增加包括异丁酸异丁酯、异戊酰基异戊酸酯、乙酸异丁酯或乙酸异戊酯的产量增加。
22. 前述权利要求中任一项的重组细胞，其中与野生型对照相比酯的生物合成增加包括与野生型对照相比有机酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比酮酸向酰基辅酶A的转化增加，与野生型对照相比醛向有机酸的转化增加，与野生型对照相比醛向醇的转化增加，或与野生型对照相比酰基辅酶A与醇结合形成酯的增加。
23. 权利要求1-21中任一项的重组细胞，其中与野生型对照相比酯的生物合成增加包括2-酮异戊酸向异丁醛的转化增加，和异丁醛向异丁醇的转化增加，异丁醇和酰基辅酶A合成乙酸异丁酯增加，2-酮异戊酸延长为2-酮-4-甲基戊酸的增加，2-酮-4-甲基戊酸向异戊醛的转化增加，异戊醛向异戊醇的转化增加，或异戊醇和酰基辅酶A合成乙酸异戊酯的增加。
24. 前述权利要求中任一项的重组细胞，其包含经修饰以增加所需酯合成的酰基转移酶。
25. 权利要求24的重组细胞，其中与修饰前的酰基转移酶所产生的酯相比，所述修饰的酰基转移酶增加具有更多碳的酯的合成。
26. 方法，包括：
在使权利要求1-22中任一项的重组细胞有效产生酯的条件下在包含碳源的培养基中孵育所述重组细胞，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、CO2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘油、藻酸、葡萄糖二酸或半乳糖醛酸。
27. 权利要求26的方法，其中所述培养基进一步包含羧酸。
28. 权利要求26的方法，其中所述培养基进一步包含醇。
29. 方法，包括：
将异源多核苷酸引入宿主细胞，所述异源多核苷酸编码催化将碳源转化为酯的步骤的至少一种多肽，其中所述至少一种多核苷酸与启动子操作性连接，使得所述修饰的宿主细胞催化碳源向酯转化。
30. 权利要求29的方法，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、丙酮酸、酮缬氨酸、CO2、纤维素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘油、藻酸、葡萄糖二酸或半乳糖醛酸。
31. 权利要求29或30的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
32. 权利要求28的方法，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。
33. 权利要求32的方法，其中所述真菌细胞是酿酒酵母、皱褶假丝酵母或白色假丝酵母。
34. 权利要求29或27的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
35. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。
36. 权利要求35的方法，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。
37. 权利要求36的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
38. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。
39. 权利要求38的方法，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。
40. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。
41. 权利要求40的方法，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌科的成员。
42. 权利要求41的方法，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。
43. 权利要求40的方法，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。
44. 权利要求43的方法，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。
45. 权利要求40的方法，其中所述细菌细胞是梭菌科的成员。
46. 权利要求45的方法，其中所述细菌细胞是解纤维梭菌。
47. 权利要求34的方法，其中所述细菌细胞是蓝细菌门的成员。
48. 权利要求23-47中任一项的方法，其中所述宿主细胞是光合的。
49. 权利要求23-47中任一项的方法，其中所述宿主细胞是分解纤维素的。
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